Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). વધુમાં, ચાલુ સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
એકસાથે ત્રણ સ્લાઇડ્સનું કેરોયુઝલ દર્શાવે છે. એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પહેલાના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો, અથવા એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડર બટનોનો ઉપયોગ કરો.
બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર અને બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર બાયોથેરાપ્યુટિક એજન્ટોને સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમમાં તેમના લક્ષ્યો સુધી પહોંચતા અટકાવે છે, જેના કારણે ન્યુરોલોજીકલ રોગોની અસરકારક સારવારમાં અવરોધ આવે છે. વિવોમાં નવલકથા મગજ ટ્રાન્સપોર્ટર્સ શોધવા માટે, અમે T7 ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી રજૂ કરી અને ઉંદરોના કેન્યુલેટેડ સભાન મોટા પૂલ મોડેલનો ઉપયોગ કરીને ક્રમિક રીતે એકત્રિત રક્ત અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) રજૂ કર્યું. પસંદગીના ચાર રાઉન્ડ પછી ચોક્કસ ફેજ ક્લોન્સ CSF માં ખૂબ સમૃદ્ધ થયા. વ્યક્તિગત ઉમેદવાર પેપ્ટાઇડ્સના પરીક્ષણમાં CSF માં 1000 ગણાથી વધુ સંવર્ધન જોવા મળ્યું. ઓળખાયેલ નવલકથા ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ સાથે જોડાયેલા BACE1 પેપ્ટાઇડ ઇન્હિબિટરનો ઉપયોગ કરીને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડમાં એમીલોઇડ-β ના સ્તરમાં 40% ઘટાડો કરીને મગજમાં પેપ્ટાઇડ-મધ્યસ્થી ડિલિવરીની બાયોએક્ટિવિટીની પુષ્ટિ થઈ. આ પરિણામો સૂચવે છે કે ઇન વિવો ફેજ પસંદગી પદ્ધતિઓ દ્વારા ઓળખાયેલા પેપ્ટાઇડ્સ ઉપચારાત્મક અસર સાથે મગજમાં મેક્રોમોલેક્યુલ્સના પ્રણાલીગત ડિલિવરી માટે ઉપયોગી વાહનો હોઈ શકે છે.
સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમ (CNS) લક્ષિત ઉપચાર સંશોધન મોટાભાગે ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ દવાઓ અને એજન્ટોને ઓળખવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે જે CNS-લક્ષ્ય ગુણધર્મો દર્શાવે છે, મગજમાં સક્રિય દવા પહોંચાડવાની પદ્ધતિઓ શોધવા પર ઓછા પ્રયત્નો સાથે. આ હવે બદલાવાનું શરૂ થઈ રહ્યું છે કારણ કે ડ્રગ ડિલિવરી, ખાસ કરીને મોટા અણુઓ, આધુનિક ન્યુરોસાયન્સ ડ્રગ ડેવલપમેન્ટનો એક અભિન્ન ભાગ છે. સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમનું વાતાવરણ સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર અવરોધ પ્રણાલી દ્વારા સારી રીતે સુરક્ષિત છે, જેમાં બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર (BBB) ​​અને બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર (BCBB)1નો સમાવેશ થાય છે, જે મગજમાં દવાઓ પહોંચાડવાનું પડકારજનક બનાવે છે1,2. એવો અંદાજ છે કે લગભગ બધી મોટી પરમાણુ દવાઓ અને 98% થી વધુ નાના પરમાણુ દવાઓ મગજમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે3. તેથી જ નવી મગજ પરિવહન પ્રણાલીઓને ઓળખવી ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે જે CNS 4,5 ને ઉપચારાત્મક દવાઓની કાર્યક્ષમ અને ચોક્કસ ડિલિવરી પૂરી પાડે છે. જો કે, BBB અને BCSFB પણ ડ્રગ ડિલિવરી માટે એક ઉત્તમ તક રજૂ કરે છે કારણ કે તેઓ તેના વ્યાપક વેસ્ક્યુલેચર દ્વારા મગજના તમામ માળખામાં પ્રવેશ કરે છે અને પ્રવેશ કરે છે. આમ, મગજમાં ડિલિવરીની બિન-આક્રમક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવાના વર્તમાન પ્રયાસો મોટાભાગે એન્ડોજેનસ BBB6 રીસેપ્ટરનો ઉપયોગ કરીને રીસેપ્ટર-મધ્યસ્થી પરિવહન (PMT) ની પદ્ધતિ પર આધારિત છે. ટ્રાન્સફરિન રીસેપ્ટર પાથવે7,8 નો ઉપયોગ કરીને તાજેતરના મુખ્ય પ્રગતિઓ છતાં, સુધારેલા ગુણધર્મો સાથે નવી ડિલિવરી સિસ્ટમ્સનો વધુ વિકાસ જરૂરી છે. આ માટે, અમારું લક્ષ્ય CSF પરિવહનમાં મધ્યસ્થી કરવા સક્ષમ પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવાનું હતું, કારણ કે તેનો ઉપયોગ સૈદ્ધાંતિક રીતે CNS ને મેક્રોમોલેક્યુલ્સ પહોંચાડવા અથવા નવા રીસેપ્ટર માર્ગો ખોલવા માટે થઈ શકે છે. ખાસ કરીને, સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર સિસ્ટમ (BBB અને BSCFB) ના ચોક્કસ રીસેપ્ટર્સ અને ટ્રાન્સપોર્ટર્સ બાયોથેરાપ્યુટિક દવાઓના સક્રિય અને ચોક્કસ ડિલિવરી માટે સંભવિત લક્ષ્યો તરીકે સેવા આપી શકે છે. સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) એ કોરોઇડ પ્લેક્સસ (CS) નું સ્ત્રાવ ઉત્પાદન છે અને સબરાક્નોઇડ સ્પેસ અને વેન્ટ્રિક્યુલર સ્પેસ4 દ્વારા મગજના ઇન્ટરસ્ટિશલ પ્રવાહી સાથે સીધા સંપર્કમાં છે. તાજેતરમાં એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે સબરાક્નોઇડ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી મગજના ઇન્ટરસ્ટિશિયમમાં વધુ પડતું ફેલાય છે. અમે આ સબરાક્નોઇડ ઇનફ્લો ટ્રેક્ટનો ઉપયોગ કરીને અથવા સીધા BBB દ્વારા પેરેનકાઇમલ સ્પેસ સુધી પહોંચવાની આશા રાખીએ છીએ. આ હાંસલ કરવા માટે, અમે એક મજબૂત ઇન વિવો ફેજ પસંદગી વ્યૂહરચના અમલમાં મૂકી છે જે આદર્શ રીતે આ બે અલગ અલગ માર્ગોમાંથી કોઈપણ દ્વારા પરિવહન કરાયેલા પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખે છે.
હવે અમે ઉચ્ચતમ લાઇબ્રેરી વિવિધતા સાથે પ્રારંભિક પસંદગી રાઉન્ડનું નિરીક્ષણ કરવા માટે CSF નમૂના સાથે ઉચ્ચ થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ (HTS) સાથે ક્રમિક ઇન વિવો ફેજ ડિસ્પ્લે સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિનું વર્ણન કરીએ છીએ. રક્ત દૂષણ ટાળવા માટે કાયમી રીતે ઇમ્પ્લાન્ટેડ મોટા સિસ્ટર્ના (CM) કેન્યુલા સાથે સભાન ઉંદરો પર સ્ક્રીનીંગ કરવામાં આવ્યું હતું. મહત્વપૂર્ણ રીતે, આ અભિગમ મગજ-લક્ષ્યીકરણ અને સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર અવરોધમાં પરિવહન પ્રવૃત્તિ સાથે પેપ્ટાઇડ્સ બંને પસંદ કરે છે. અમે તેમના નાના કદ (~60 nm)10 ને કારણે T7 ફેજનો ઉપયોગ કર્યો અને સૂચવ્યું કે તેઓ વેસિકલ્સના પરિવહન માટે યોગ્ય છે જે એન્ડોથેલિયલ અને/અથવા ઉપકલા-મેડુલા અવરોધના ટ્રાન્સસેલ્યુલર ક્રોસિંગને મંજૂરી આપે છે. પેનિંગના ચાર રાઉન્ડ પછી, ફેજ વસ્તીને અલગ કરવામાં આવી હતી જે મજબૂત ઇન વિવો CSF સંવર્ધન અને મગજના માઇક્રોવેસલ જોડાણ દર્શાવે છે. મહત્વપૂર્ણ રીતે, અમે અમારા તારણોની પુષ્ટિ કરવામાં સક્ષમ હતા કે પસંદગીના અને રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત શ્રેષ્ઠ ઉમેદવાર પેપ્ટાઇડ્સ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં પ્રોટીન કાર્ગોનું પરિવહન કરવામાં સક્ષમ છે. સૌપ્રથમ, BACE1 પેપ્ટાઇડના અવરોધક સાથે અગ્રણી ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડને જોડીને CNS ની ફાર્માકોડાયનેમિક અસરો સ્થાપિત કરવામાં આવી હતી. ઇન વિવો ફંક્શનલ સ્ક્રીનીંગ વ્યૂહરચનાઓ નવા મગજ પરિવહન પેપ્ટાઇડ્સને અસરકારક પ્રોટીન કાર્ગો કેરિયર્સ તરીકે ઓળખી શકે છે તે દર્શાવવા ઉપરાંત, અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે નવા મગજ પરિવહન માર્ગોને ઓળખવામાં સમાન કાર્યાત્મક પસંદગી અભિગમો પણ મહત્વપૂર્ણ બનશે.
પ્લેક-ફોર્મિંગ યુનિટ્સ (PFU) ના આધારે, ફેજ પેકેજિંગ સ્ટેપ પછી, લગભગ 109 ની વિવિધતા સાથે રેન્ડમ 12-mer રેખીય T7 ફેજ પેપ્ટાઇડ્સની લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન અને બનાવવામાં આવી હતી (સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ જુઓ). એ નોંધવું મહત્વપૂર્ણ છે કે અમે ઇન વિવો પેનિંગ પહેલાં આ લાઇબ્રેરીનું કાળજીપૂર્વક વિશ્લેષણ કર્યું હતું. સંશોધિત પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને ફેજ લાઇબ્રેરી નમૂનાઓના PCR એમ્પ્લીફિકેશનથી એમ્પ્લીકોન્સ ઉત્પન્ન થયા જે સીધા HTS પર લાગુ પડતા હતા (પૂરક આકૃતિ 1a). a) HTS11 સિક્વન્સિંગ ભૂલો, b) પ્રાઇમર્સની ગુણવત્તા પર અસર (NNK)1-12, અને c) સ્ટેન્ડબાય લાઇબ્રેરીમાં વાઇલ્ડ-ટાઇપ (wt) ફેજ (સ્કેલેટન ઇન્સર્ટ્સ) ની હાજરીને કારણે, ફક્ત ચકાસાયેલ સિક્વન્સ માહિતી કાઢવા માટે સિક્વન્સ ફિલ્ટરિંગ પ્રક્રિયા લાગુ કરવામાં આવી હતી (પૂરક આકૃતિ 1b). આ ફિલ્ટર પગલાં બધી HTS સિક્વન્સિંગ લાઇબ્રેરીઓને લાગુ પડે છે. સ્ટાન્ડર્ડ લાઇબ્રેરી માટે, કુલ 233,868 રીડ મેળવવામાં આવ્યા હતા, જેમાંથી 39% ફિલ્ટર માપદંડો પાસ કરે છે અને અનુગામી રાઉન્ડ માટે લાઇબ્રેરી વિશ્લેષણ અને પસંદગી માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે (પૂરક આકૃતિ 1c–e). વાંચન મુખ્યત્વે 3 બેઝ જોડીઓના ગુણાકાર હતા જેની ટોચ 36 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (પૂરક આકૃતિ 1c) હતી, જે લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન (NNK) 1-12 ની પુષ્ટિ કરે છે. નોંધનીય છે કે, લગભગ 11% લાઇબ્રેરી સભ્યોમાં 12-પરિમાણીય વાઇલ્ડ-ટાઇપ (wt) બેકબોન PAGISRELVDKL ઇન્સર્ટ હતું, અને લગભગ અડધા સિક્વન્સ (49%) માં ઇન્સર્ટેશન અથવા ડિલીશન હતા. લાઇબ્રેરી લાઇબ્રેરીના HTS એ લાઇબ્રેરીમાં પેપ્ટાઇડ્સની ઉચ્ચ વિવિધતાની પુષ્ટિ કરી: 81% થી વધુ પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ ફક્ત એક જ વાર મળી આવ્યા હતા અને ફક્ત 1.5% ≥4 નકલોમાં જોવા મળ્યા હતા (પૂરક આકૃતિ 2a). રિપેરટોયરમાં તમામ 12 સ્થાનો પર એમિનો એસિડ (aa) ની ફ્રીક્વન્સીઝ ડિજનરેટ NKK રિપરટોયર (પૂરક આકૃતિ 2b) દ્વારા ઉત્પન્ન થતા કોડોનની સંખ્યા માટે અપેક્ષિત ફ્રીક્વન્સીઝ સાથે સારી રીતે સંબંધિત હતી. આ ઇન્સર્ટ દ્વારા એન્કોડ કરેલા aa અવશેષોની અવલોકન કરેલ આવર્તન ગણતરી કરેલ ફ્રીક્વન્સી (r = 0.893) (પૂરક આકૃતિ 2c) સાથે સારી રીતે સંબંધિત હતી. ઇન્જેક્શન માટે ફેજ લાઇબ્રેરીઓની તૈયારીમાં એન્ડોટોક્સિનના એમ્પ્લીફિકેશન અને દૂર કરવાના પગલાંનો સમાવેશ થાય છે. આ અગાઉ ફેજ લાઇબ્રેરીઓની વિવિધતાને સંભવિત રીતે ઘટાડવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે12,13. તેથી, અમે એક પ્લેટ-એમ્પ્લીફાઇડ ફેજ લાઇબ્રેરીનું અનુક્રમણિકાકરણ કર્યું જે એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવામાં આવ્યું હતું અને AA ની આવર્તનનો અંદાજ કાઢવા માટે તેની મૂળ લાઇબ્રેરી સાથે સરખામણી કરી. મૂળ પૂલ અને એમ્પ્લીફાઇડ અને શુદ્ધ પૂલ (પૂરક આકૃતિ 2d) વચ્ચે એક મજબૂત સહસંબંધ (r = 0.995) જોવા મળ્યો હતો, જે દર્શાવે છે કે T7 ફેજનો ઉપયોગ કરીને પ્લેટો પર એમ્પ્લીફાઇડ ક્લોન્સ વચ્ચેની સ્પર્ધા મુખ્ય પૂર્વગ્રહનું કારણ બની નથી. આ સરખામણી દરેક લાઇબ્રેરીમાં ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની આવર્તન પર આધારિત છે, કારણ કે HTS સાથે પણ લાઇબ્રેરીઓની વિવિધતા (~109) સંપૂર્ણપણે કેપ્ચર કરી શકાતી નથી. દરેક પોઝિશન પર aa ના ફ્રીક્વન્સી વિશ્લેષણથી દાખલ કરેલા રેપરટોયર (પૂરક આકૃતિ 2e) ના છેલ્લા ત્રણ સ્થાનોમાં એક નાનો પોઝિશન-આધારિત પૂર્વગ્રહ જાહેર થયો. નિષ્કર્ષમાં, અમે તારણ કાઢ્યું કે લાઇબ્રેરીની ગુણવત્તા અને વિવિધતા સ્વીકાર્ય હતી અને પસંદગીના ઘણા રાઉન્ડ વચ્ચે ફેજ લાઇબ્રેરીઓના એમ્પ્લીફિકેશન અને તૈયારીને કારણે વિવિધતામાં માત્ર નાના ફેરફારો જોવા મળ્યા હતા.
BBB અને/અથવા BCSFB (આકૃતિ 1a-b) દ્વારા નસમાં ઇન્જેક્ટ કરાયેલ T7 ફેજની ઓળખને સરળ બનાવવા માટે સભાન ઉંદરોના CM માં કેન્યુલાનું સર્જિકલ ઇમ્પ્લાન્ટ કરીને સીરીયલ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ સેમ્પલિંગ કરી શકાય છે. ઇન વિવો સિલેક્શન (આકૃતિ 1c) ના પહેલા ત્રણ રાઉન્ડમાં અમે બે સ્વતંત્ર પસંદગી આર્મ (આર્મ્સ A અને B) નો ઉપયોગ કર્યો. પસંદગીના પહેલા ત્રણ રાઉન્ડમાં રજૂ કરાયેલ ફેજની કુલ માત્રા ઘટાડીને અમે ધીમે ધીમે પસંદગીની કડકતા વધારી. પેનિંગના ચોથા રાઉન્ડ માટે, અમે શાખાઓ A અને B માંથી નમૂનાઓ ભેગા કર્યા અને ત્રણ વધારાના સ્વતંત્ર પસંદગીઓ કરી. આ મોડેલમાં T7 ફેજ કણોના ઇન વિવો ગુણધર્મોનો અભ્યાસ કરવા માટે, વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ (PAGISRELVDKL માસ્ટર ઇન્સર્ટ) ને પૂંછડીની નસ દ્વારા ઉંદરોમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ અને લોહીમાંથી ફેજને અલગ અલગ સમયે પુનઃપ્રાપ્ત કરવાથી જાણવા મળ્યું કે પ્રમાણમાં નાના T7 આઇકોસાહેડ્રલ ફેજમાં લોહીના કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી ઝડપી પ્રારંભિક ક્લિયરન્સ તબક્કો હતો (પૂરક આકૃતિ 3). ઉંદરોને આપવામાં આવેલા ટાઇટર્સ અને લોહીના જથ્થાના આધારે, અમે ગણતરી કરી કે ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી 10 મિનિટ પછી લોહીમાં ઇન્જેક્ટેડ ડોઝમાંથી માત્ર 1% wt. ફેજ મળી આવ્યું હતું. આ પ્રારંભિક ઝડપી ઘટાડા પછી, 27.7 મિનિટના અર્ધ-જીવન સાથે ધીમી પ્રાથમિક ક્લિયરન્સ માપવામાં આવી હતી. મહત્વપૂર્ણ રીતે, CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી ખૂબ જ ઓછા ફેજ મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં જંગલી-પ્રકારના ફેજ સ્થળાંતર માટે નીચી પૃષ્ઠભૂમિ દર્શાવે છે (પૂરક આકૃતિ 3). સરેરાશ, સમગ્ર નમૂનાના સમયગાળા (0-250 મિનિટ) દરમિયાન સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં લોહીમાં T7 ફેજના લગભગ 1 x 10-3% ટાઇટર્સ અને શરૂઆતમાં ઇન્ફ્યુઝ્ડ ફેજના 4 x 10-8% મળી આવ્યા હતા. નોંધપાત્ર રીતે, સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં જંગલી-પ્રકારના ફેજનું અર્ધ-જીવન (25.7 મિનિટ) લોહીમાં જોવા મળતા જેવું જ હતું. આ ડેટા દર્શાવે છે કે CM-કેન્યુલેટેડ ઉંદરોમાં CSF કમ્પાર્ટમેન્ટને લોહીથી અલગ કરતો અવરોધ અકબંધ રહે છે, જે ફેજ લાઇબ્રેરીઓની ઇન વિવો પસંદગીને મંજૂરી આપે છે જેથી લોહીમાંથી CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સરળતાથી પરિવહન થતા ક્લોન્સ ઓળખી શકાય.
(a) મોટા પૂલમાંથી સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) ના ફરીથી નમૂના લેવા માટે એક પદ્ધતિ સેટ કરવી. (b) સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમ (CNS) અવરોધનું સેલ્યુલર સ્થાન અને બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર (BBB) ​​અને બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયરને પાર કરતા પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પસંદગી વ્યૂહરચના દર્શાવતો ડાયાગ્રામ. (c) ઇન વિવો ફેજ ડિસ્પ્લે સ્ક્રીનીંગ ફ્લોચાર્ટ. પસંદગીના દરેક રાઉન્ડમાં, ફેજ (તીરની અંદર પ્રાણી ઓળખકર્તાઓ) નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડ સુધી બે સ્વતંત્ર વૈકલ્પિક શાખાઓ (A, B) અલગથી રાખવામાં આવે છે. પસંદગી રાઉન્ડ 3 અને 4 માટે, CSF માંથી કાઢવામાં આવેલા દરેક ફેજ ક્લોનને મેન્યુઅલી ક્રમ આપવામાં આવ્યો હતો. (d) T7 પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી (2 x 1012 ફેજ/પ્રાણી) ના ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી બે કેન્યુલેટેડ ઉંદરોમાં પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડ દરમિયાન લોહી (લાલ વર્તુળો) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (લીલા ત્રિકોણ) થી અલગ કરાયેલ ફેજના ગતિશાસ્ત્ર. વાદળી ચોરસ લોહીમાં ફેજની સરેરાશ પ્રારંભિક સાંદ્રતા દર્શાવે છે, જે ઇન્જેક્ટેડ ફેજની માત્રાથી ગણતરી કરવામાં આવે છે, જે કુલ રક્ત જથ્થાને ધ્યાનમાં લેતા હોય છે. કાળા ચોરસ રક્ત ફેજ સાંદ્રતામાંથી એક્સ્ટ્રાપોલેટેડ y રેખાના આંતરછેદ બિંદુ દર્શાવે છે. (e,f) પેપ્ટાઇડમાં જોવા મળતા તમામ શક્ય ઓવરલેપિંગ ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની સંબંધિત આવર્તન અને વિતરણ રજૂ કરે છે. 1000 રીડિંગ્સમાં મળેલા મોટિફ્સની સંખ્યા દર્શાવેલ છે. નોંધપાત્ર રીતે (p < 0.001) સમૃદ્ધ મોટિફ્સ લાલ બિંદુઓથી ચિહ્નિત થયેલ છે. (e) પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2 માંથી લોહીથી મેળવેલા ફેજ સાથે ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીના ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરતી સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ. (f) રક્ત અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં અલગ કરાયેલ પ્રાણી ફેજ ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સ #1.1 અને #1.2 ની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરતી સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ. (g, h) બંને પ્રાણીઓમાં ઇન વિવો પસંદગીના રાઉન્ડ પછી લોહીમાં સમૃદ્ધ ફેજ (g) વિરુદ્ધ ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીઓ અને CSF (h) માં સમૃદ્ધ ફેજ વિરુદ્ધ લોહીનું સિક્વન્સ ID પ્રતિનિધિત્વ. એક-અક્ષર કોડનું કદ સૂચવે છે કે તે એમિનો એસિડ તે સ્થાન પર કેટલી વાર થાય છે. લીલો = ધ્રુવીય, જાંબલી = તટસ્થ, વાદળી = મૂળભૂત, લાલ = એસિડિક અને કાળો = હાઇડ્રોફોબિક એમિનો એસિડ. આકૃતિ 1a, b એડ્યુઅર્ડ યુરિચ દ્વારા ડિઝાઇન અને ઉત્પાદિત કરવામાં આવી હતી.
અમે બે CM ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ ઉંદરો (ક્લેડ A અને B) માં ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી ઇન્જેક્ટ કરી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી અને લોહીમાંથી ફેજને અલગ કર્યું (આકૃતિ 1d). વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજની તુલનામાં લાઇબ્રેરીનું પ્રારંભિક ઝડપી ક્લિયરન્સ ઓછું સ્પષ્ટ હતું. બંને પ્રાણીઓમાં ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીનું સરેરાશ અર્ધ-જીવન લોહીમાં 24.8 મિનિટ હતું, જે વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ જેવું જ હતું, અને CSF માં 38.5 મિનિટ હતું. દરેક પ્રાણીમાંથી લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી ફેજના નમૂનાઓ HTS ને આધિન હતા અને બધા ઓળખાયેલા પેપ્ટાઇડ્સનું ટૂંકા ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફની હાજરી માટે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા કારણ કે તે રચના રચના અને પેપ્ટાઇડ-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે ન્યૂનતમ આધાર પૂરો પાડે છે14,15. અમને ઇન્જેક્ટેડ ફેજ લાઇબ્રેરી અને બંને પ્રાણીઓના લોહીમાંથી કાઢવામાં આવેલા ક્લોન્સ વચ્ચેના મોટિફ્સના વિતરણમાં સારો સહસંબંધ મળ્યો (આકૃતિ 1e). ડેટા સૂચવે છે કે લાઇબ્રેરીની રચના રક્ત કમ્પાર્ટમેન્ટમાં ફક્ત નજીવી રીતે સમૃદ્ધ છે. Weblogo16 સોફ્ટવેરના અનુકૂલનનો ઉપયોગ કરીને દરેક સ્થાન પર એમિનો એસિડ ફ્રીક્વન્સીઝ અને સર્વસંમતિ ક્રમનું વધુ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમને રક્ત ગ્લાયસીન અવશેષોમાં મજબૂત સંવર્ધન જોવા મળ્યું (આકૃતિ 1g). જ્યારે CSF માંથી પસંદ કરાયેલા ક્લોન્સ સાથે લોહીની સરખામણી કરવામાં આવી, ત્યારે મજબૂત પસંદગી અને કેટલાક મોટિફ્સનું ડિસેલેક્શન જોવા મળ્યું (આકૃતિ 1f), અને 12-સભ્યો (આકૃતિ 1h) માં પૂર્વનિર્ધારિત સ્થાનો પર ચોક્કસ એમિનો એસિડ પ્રાધાન્ય રૂપે હાજર હતા. નોંધપાત્ર રીતે, વ્યક્તિગત પ્રાણીઓમાં સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં નોંધપાત્ર રીતે તફાવત હતો, જ્યારે બંને પ્રાણીઓમાં બ્લડ ગ્લાયસીન સંવર્ધન જોવા મળ્યું (પૂરક આકૃતિ 4a-j). પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2 ના સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં ક્રમ ડેટાના કડક ફિલ્ટરિંગ પછી, કુલ 964 અને 420 અનન્ય 12-મેર પેપ્ટાઇડ્સ મેળવવામાં આવ્યા હતા (પૂરક આકૃતિ 1d-e). અલગ ફેજ ક્લોન્સને વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા અને ઇન વિવો પસંદગીના બીજા રાઉન્ડને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા. પસંદગીના બીજા રાઉન્ડમાંથી કાઢવામાં આવેલા ફેજને દરેક પ્રાણીમાં HTS ને આધીન કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની ઘટનાનું વિશ્લેષણ કરવા માટે બધા ઓળખાયેલા પેપ્ટાઇડ્સનો ઉપયોગ મોટિફ ઓળખ કાર્યક્રમમાં ઇનપુટ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 2a, b, ef). CSF માંથી પુનઃપ્રાપ્ત થયેલા ફેજના પ્રથમ ચક્રની તુલનામાં, અમે શાખાઓ A અને B (આકૃતિ 2) માં CSF માં ઘણા મોટિફ્સની વધુ પસંદગી અને ડિસેલેક્શન અવલોકન કર્યું. તેઓ સુસંગત ક્રમના વિવિધ પેટર્નનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે કે કેમ તે નક્કી કરવા માટે નેટવર્ક ઓળખ અલ્ગોરિધમ લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું. વૈકલ્પિક ક્લેડ A (આકૃતિ 2c, d) અને ક્લેડ B (આકૃતિ 2g, h) માં CSF દ્વારા પુનઃપ્રાપ્ત કરાયેલા 12-પરિમાણીય સિક્વન્સ વચ્ચે સ્પષ્ટ સમાનતા જોવા મળી હતી. દરેક શાખામાં પૂલ્ડ વિશ્લેષણમાં 12-મેર પેપ્ટાઇડ્સ (પૂરક આકૃતિ 5c, d) માટે અલગ અલગ પસંદગી પ્રોફાઇલ્સ અને પસંદગીના બીજા રાઉન્ડ પછી પૂલ્ડ ક્લોન્સ માટે સમય જતાં CSF/બ્લડ ટાઇટર રેશિયોમાં વધારો જોવા મળ્યો હતો. પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડની તુલનામાં (પૂરક આકૃતિ 5e).
ઇન વિવો ફંક્શનલ ફેજ ડિસ્પ્લે સિલેક્શનના બે ક્રમિક રાઉન્ડ દ્વારા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં મોટિફ્સ અને પેપ્ટાઇડ્સનું સંવર્ધન.
દરેક પ્રાણી (પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2) ના પહેલા રાઉન્ડમાંથી પ્રાપ્ત થયેલા બધા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ ફેજેસને એકઠા કરવામાં આવ્યા હતા, એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા, HT-સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યા હતા અને એકસાથે ફરીથી ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા (2 x 1010 ફેજેસ/પ્રાણી) 2 SM કેન્યુલેટેડ ઉંદરો (#1.1 → #). 2.1 અને 2.2, 1.2 → 2.3 અને 2.4). (a,b,e,f) પ્રથમ અને બીજા પસંદગી રાઉન્ડમાં બધા CSF-વ્યુત્પન્ન ફેજેસના ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરતા સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ્સ. બંને ઓરિએન્ટેશનમાં પેપ્ટાઇડ્સમાં જોવા મળતા તમામ સંભવિત ઓવરલેપિંગ ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા મોટિફ્સની સંબંધિત આવર્તન અને વિતરણ. 1000 રીડિંગ્સમાં મળેલા મોટિફ્સની સંખ્યા બતાવવામાં આવી છે. તુલનાત્મક લાઇબ્રેરીઓમાંથી એકમાં નોંધપાત્ર રીતે (p < 0.001) પસંદ કરાયેલા અથવા બાકાત રાખવામાં આવેલા મોટિફ્સને લાલ બિંદુઓથી પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા છે. (c, d, g, h) ઇન વિવો પસંદગીના રાઉન્ડ 2 અને 1 પર આધારિત તમામ CSF-સમૃદ્ધ 12 એમિનો એસિડ લાંબા ક્રમનું સિક્વન્સ લોગો પ્રતિનિધિત્વ. એક-અક્ષર કોડનું કદ સૂચવે છે કે તે એમિનો એસિડ તે સ્થાન પર કેટલી વાર થાય છે. લોગોનું પ્રતિનિધિત્વ કરવા માટે, બે પસંદગી રાઉન્ડ વચ્ચે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓમાંથી કાઢવામાં આવેલા CSF ક્રમની આવર્તનની તુલના કરવામાં આવે છે અને બીજા રાઉન્ડમાં સમૃદ્ધ ક્રમ બતાવવામાં આવે છે: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 અને (h) #1.2–#2.4. (c, d) પ્રાણીઓ નં. 2.1 અને નં. 2.2 અથવા (g, h) પ્રાણીઓ નં. 2.3 અને નં. 2.4 માં આપેલ સ્થાન પર સૌથી વધુ સમૃદ્ધ એમિનો એસિડ રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. લીલો = ધ્રુવીય, જાંબલી = તટસ્થ, વાદળી = મૂળભૂત, લાલ = એસિડિક અને કાળો = હાઇડ્રોફોબિક એમિનો એસિડ.
પસંદગીના ત્રીજા રાઉન્ડ પછી, અમે બે પ્રાણીઓમાંથી અલગ કરાયેલા 332 CSF-પુનઃરચિત ફેજ ક્લોનમાંથી 124 અનન્ય પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ (#3.1 અને #3.2) ઓળખ્યા (પૂરક આકૃતિ 6a). LGSVS (18.7%) ક્રમમાં સૌથી વધુ સંબંધિત પ્રમાણ હતું, ત્યારબાદ જંગલી-પ્રકારના ઇન્સર્ટ્સ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), અને SARGSWREIVSLS (2.2%) આવ્યા. અંતિમ ચોથા રાઉન્ડમાં, અમે ત્રણ અલગ પ્રાણીઓમાંથી બે સ્વતંત્ર રીતે પસંદ કરેલી શાખાઓને એકત્રિત કરી (આકૃતિ 1c). CSFમાંથી પ્રાપ્ત થયેલા 925 ક્રમવાળા ફેજ ક્લોનમાંથી, ચોથા રાઉન્ડમાં અમને 64 અનન્ય પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ (પૂરક આકૃતિ 6b) મળ્યા, જેમાંથી જંગલી-પ્રકારના ફેજનું સંબંધિત પ્રમાણ ઘટીને 0.8% થયું. ચોથા રાઉન્ડમાં સૌથી સામાન્ય CSF ક્લોન્સ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) અને RLSSVDSDLSGC (3, 2%. %) હતા. NNK લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન માટે ડિજનરેટ કોડોનનો ઉપયોગ કરતી વખતે પસંદ કરેલા પેપ્ટાઇડ્સની લંબાઈ શ્રેણી લાઇબ્રેરી પ્રાઇમર્સમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ ઇન્સર્શન/ડિલીશન અથવા અકાળ સ્ટોપ કોડોનને કારણે છે. અકાળ સ્ટોપ કોડોન ટૂંકા પેપ્ટાઇડ્સ ઉત્પન્ન કરે છે અને પસંદ કરવામાં આવે છે કારણ કે તેમાં અનુકૂળ aa મોટિફ હોય છે. સિન્થેટિક લાઇબ્રેરીઓના પ્રાઇમર્સમાં ઇન્સર્શન/ડિલીશનથી લાંબા પેપ્ટાઇડ્સ પરિણમી શકે છે. આ ડિઝાઇન કરેલા સ્ટોપ કોડોને ફ્રેમની બહાર રાખે છે અને જ્યાં સુધી નવો સ્ટોપ કોડોન ડાઉનસ્ટ્રીમ દેખાય નહીં ત્યાં સુધી તેને વાંચે છે. સામાન્ય રીતે, અમે નમૂના આઉટપુટ ડેટા સાથે ઇનપુટ ડેટાની તુલના કરીને ચારેય પસંદગી રાઉન્ડ માટે સંવર્ધન પરિબળોની ગણતરી કરી. સ્ક્રીનીંગના પ્રથમ રાઉન્ડ માટે, અમે બિન-વિશિષ્ટ પૃષ્ઠભૂમિ સંદર્ભ તરીકે વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ ટાઇટર્સનો ઉપયોગ કર્યો. રસપ્રદ વાત એ છે કે, પ્રથમ CSF ચક્રમાં નકારાત્મક ફેજ પસંદગી ખૂબ જ મજબૂત હતી, પરંતુ લોહીમાં નહીં (આકૃતિ 3a), જે પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીના મોટાભાગના સભ્યોના CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં નિષ્ક્રિય પ્રસરણની ઓછી સંભાવનાને કારણે હોઈ શકે છે અથવા સંબંધિત ફેજ બેક્ટેરિયોફેજ કરતાં લોહીના પ્રવાહમાંથી વધુ કાર્યક્ષમ રીતે જાળવી રાખવામાં અથવા દૂર કરવામાં આવે છે. જો કે, પેનિંગના બીજા રાઉન્ડમાં, બંને ક્લેડમાં CSF માં ફેજની મજબૂત પસંદગી જોવા મળી હતી, જે સૂચવે છે કે પાછલો રાઉન્ડ CSF શોષણને પ્રોત્સાહન આપતા પેપ્ટાઇડ્સ દર્શાવતા ફેજમાં સમૃદ્ધ હતો (આકૃતિ 3a). ફરીથી, નોંધપાત્ર રક્ત સંવર્ધન વિના. ત્રીજા અને ચોથા રાઉન્ડમાં પણ, ફેજ ક્લોન્સ CSF માં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતા. પસંદગીના છેલ્લા બે રાઉન્ડ વચ્ચેના દરેક અનન્ય પેપ્ટાઇડ ક્રમની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરતા, અમને જાણવા મળ્યું કે પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડમાં સિક્વન્સ વધુ સમૃદ્ધ હતા (આકૃતિ 3b). બંને પેપ્ટાઇડ ઓરિએન્ટેશનનો ઉપયોગ કરીને તમામ 64 અનન્ય પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સમાંથી કુલ 931 ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સ કાઢવામાં આવ્યા હતા. ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરી (કટ-ઓફ: 10% સંવર્ધન) (પૂરક આકૃતિ 6c) ની તુલનામાં ચોથા રાઉન્ડમાં સૌથી વધુ સમૃદ્ધ મોટિફ્સનું તમામ રાઉન્ડમાં તેમના સંવર્ધન પ્રોફાઇલ્સ માટે વધુ નજીકથી પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પસંદગીના સામાન્ય પેટર્ન દર્શાવે છે કે અભ્યાસ કરાયેલા મોટાભાગના હેતુઓ બંને પસંદગી શાખાઓના અગાઉના તમામ રાઉન્ડમાં સમૃદ્ધ હતા. જો કે, કેટલાક મોટિફ્સ (દા.ત. SGL, VSG, LGS GSV) મુખ્યત્વે વૈકલ્પિક ક્લેડ A માંથી હતા, જ્યારે અન્ય (દા.ત. FGW, RTN, WGF, NTR) વૈકલ્પિક ક્લેડ B માં સમૃદ્ધ હતા.
સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન પેલોડ્સ સાથે જોડાયેલા CSF-સમૃદ્ધ ફેજ-પ્રદર્શિત પેપ્ટાઇડ્સ અને બાયોટીનાઇલેટેડ લીડર પેપ્ટાઇડ્સના CSF પરિવહનનું માન્યતા.
(a) ઇન્જેક્ટેડ (ઇનપુટ = I) ફેજ (PFU) ટાઇટર્સ અને નિર્ધારિત CSF ફેજ ટાઇટર્સ (આઉટપુટ = O) ના આધારે ચારેય રાઉન્ડ (R1-R4) માં ગણતરી કરાયેલ સંવર્ધન ગુણોત્તર. છેલ્લા ત્રણ રાઉન્ડ (R2-R4) માટે સંવર્ધન પરિબળોની ગણતરી વજન ડેટા સાથે પાછલા રાઉન્ડ અને પ્રથમ રાઉન્ડ (R1) ની સરખામણી દ્વારા કરવામાં આવી હતી. ખુલ્લા બાર સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી છે, છાંયડાવાળા બાર પ્લાઝ્મા છે. (***p<0.001, વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટ પર આધારિત). (b) પસંદગીના રાઉન્ડ 4 પછી CSF માં એકત્રિત કરાયેલા તમામ ફેજના સંબંધિત પ્રમાણ અનુસાર ક્રમાંકિત સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં ફેજ પેપ્ટાઇડ્સની સૂચિ. છ સૌથી સામાન્ય ફેજ ક્લોન્સ પસંદગીના રાઉન્ડ 3 અને 4 (ઇનસેટ્સ) વચ્ચે રંગ, ક્રમાંકિત અને તેમના સંવર્ધન પરિબળોમાં પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા છે. (c,d) રાઉન્ડ 4 માંથી છ સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ફેજ ક્લોન્સ, ખાલી ફેજ અને પેરેંટલ ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓનું CSF નમૂના મોડેલમાં વ્યક્તિગત રીતે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર CSF અને લોહીના નમૂના એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. (c) 6 ઉમેદવાર ફેજ ક્લોન (2 x 1010 ફેજ/પ્રાણીઓ), ખાલી ફેજ (#1779) (2 x 1010 ફેજ/પ્રાણીઓ) અને સ્ટોક ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓ (2 x 1012 ફેજ/પ્રાણીઓ) ની સમાન માત્રામાં. પૂંછડીની નસ દ્વારા કેન્યુલેટેડ પ્રાણીને ઓછામાં ઓછું 3 CM ઇન્જેક્ટ કરો. સમય જતાં દરેક ઇન્જેક્ટેડ ફેજ ક્લોન અને ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીના CSF ફાર્માકોકાઇનેટિક્સ બતાવવામાં આવ્યા છે. (d) નમૂના લેવાના સમય દરમિયાન બધા પુનઃપ્રાપ્ત ફેજ/mL માટે સરેરાશ CSF/રક્ત ગુણોત્તર દર્શાવે છે. (e) ચાર કૃત્રિમ લીડર પેપ્ટાઇડ્સ અને એક સ્ક્રેમ્બલ્ડ કંટ્રોલને તેમના N-ટર્મિનસ (ટેટ્રામર ડિસ્પ્લે) દ્વારા બાયોટિન સાથે સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ ઇન્જેક્શન (પૂંછડીની નસ iv, 10 મિલિગ્રામ સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન/કિલો) દ્વારા આપવામાં આવ્યું હતું. ઓછામાં ઓછા ત્રણ ઇન્ટ્યુબેટેડ ઉંદરો (N = 3). CSF નમૂનાઓ દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાંદ્રતા CSF એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન ELISA દ્વારા માપવામાં આવી હતી (nd = શોધાયેલ નથી). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA પરીક્ષણ પર આધારિત). (f) પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડમાંથી સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ફેજ પેપ્ટાઇડ ક્લોન #2002 (જાંબલી) ના એમિનો એસિડ ક્રમની અન્ય પસંદ કરેલા ફેજ પેપ્ટાઇડ ક્લોન સાથે સરખામણી. સમાન અને સમાન એમિનો એસિડ ટુકડાઓ રંગ-કોડેડ છે.
ચોથા રાઉન્ડ (આકૃતિ 3b) માં બધા સમૃદ્ધ ફેજેસમાંથી, CSF સેમ્પલિંગ મોડેલમાં વધુ વ્યક્તિગત વિશ્લેષણ માટે છ ઉમેદવાર ક્લોન પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. છ ઉમેદવાર ફેજ, ખાલી ફેજ (કોઈ ઇન્સર્ટ નહીં) અને પ્રોફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓની સમાન માત્રા ત્રણ કેન્યુલેટેડ CM પ્રાણીઓમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવી હતી, અને CSF (આકૃતિ 3c) અને રક્ત (પૂરક આકૃતિ 7) પરીક્ષણોમાં ફાર્માકોકાઇનેટિક્સ નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. પરીક્ષણ કરાયેલા બધા ફેજ ક્લોન્સે ખાલી નિયંત્રણ ફેજ (#1779) કરતા 10-1000 ગણા ઊંચા સ્તરે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટને લક્ષ્ય બનાવ્યું હતું. ઉદાહરણ તરીકે, ક્લોન્સ #2020 અને #2077 માં નિયંત્રણ ફેજ કરતા લગભગ 1000 ગણા વધારે CSF ટાઇટર્સ હતા. દરેક પસંદ કરેલા પેપ્ટાઇડની ફાર્માકોકાઇનેટિક પ્રોફાઇલ અલગ છે, પરંતુ તે બધામાં ઉચ્ચ CSF હોમિંગ ક્ષમતા છે. ક્લોન્સ #1903 અને #2011 માટે અમે સમય જતાં સતત ઘટાડો જોયો, જ્યારે ક્લોન્સ #2077, #2002 અને #2009 માટે પ્રથમ 10 મિનિટ દરમિયાન વધારો સક્રિય પરિવહન સૂચવી શકે છે પરંતુ તેની ચકાસણી કરવાની જરૂર છે. ક્લોન્સ #2020, #2002, અને #2077 ઉચ્ચ સ્તરે સ્થિર થયા, જ્યારે ક્લોન #2009 ની CSF સાંદ્રતા પ્રારંભિક વધારા પછી ધીમે ધીમે ઘટી. ત્યારબાદ અમે દરેક CSF ઉમેદવારની સંબંધિત આવર્તનની તુલના તેના રક્ત સાંદ્રતા સાથે કરી (આકૃતિ 3d). દરેક CSF ઉમેદવારના સરેરાશ ટાઇટર અને તેના રક્ત ટાઇટરનો તમામ નમૂના સમય પર સહસંબંધ દર્શાવે છે કે છ ઉમેદવારોમાંથી ત્રણ રક્ત CSFમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતા. રસપ્રદ વાત એ છે કે, ક્લોન #2077 ઉચ્ચ રક્ત સ્થિરતા દર્શાવે છે (પૂરક આકૃતિ 7). પેપ્ટાઇડ્સ પોતે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં ફેજ કણો સિવાયના કાર્ગોને સક્રિય રીતે પરિવહન કરવા સક્ષમ છે તેની પુષ્ટિ કરવા માટે, અમે N-ટર્મિનસ પર બાયોટિન સાથે વ્યુત્પન્ન ચાર લીડર પેપ્ટાઇડ્સનું સંશ્લેષણ કર્યું જ્યાં પેપ્ટાઇડ્સ ફેજ કણ સાથે જોડાય છે. બાયોટીનિલેટેડ પેપ્ટાઇડ્સ (નંબર 2002, 2009, 2020 અને 2077) ને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન (SA) સાથે સંયોજિત કરવામાં આવ્યા હતા જેથી ફેજ ભૂમિતિનું અનુકરણ કરતા મલ્ટિમેરિક સ્વરૂપો પ્રાપ્ત થાય. આ ફોર્મેટથી અમને લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં SA એક્સપોઝરને કાર્ગો-ટ્રાન્સપોર્ટિંગ પ્રોટીન પેપ્ટાઇડ્સ તરીકે માપવાની પણ મંજૂરી મળી. મહત્વપૂર્ણ વાત એ છે કે, જ્યારે આ SA-કન્જુગેટેડ ફોર્મેટ (આકૃતિ 3e) માં કૃત્રિમ પેપ્ટાઇડ્સનું સંચાલન કરવામાં આવ્યું ત્યારે ફેજ ડેટા ઘણીવાર પુનઃઉત્પાદન કરી શકાય છે. સ્ક્રેમ્બલ્ડ પેપ્ટાઇડ્સમાં પ્રારંભિક એક્સપોઝર ઓછું હતું અને 48 કલાકની અંદર શોધી ન શકાય તેવા સ્તર સાથે ઝડપી CSF ક્લિયરન્સ હતું. CSF જગ્યામાં આ પેપ્ટાઇડ ફેજ ક્લોન્સના ડિલિવરી માર્ગોમાં સમજ મેળવવા માટે, અમે વિવોમાં ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી 1 કલાક પછી ફેજ કણોને સીધા શોધવા માટે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી (IHC) નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત ફેજ પેપ્ટાઇડ હિટના સ્થાનિકીકરણનું વિશ્લેષણ કર્યું. નોંધપાત્ર રીતે, મગજની રુધિરકેશિકાઓમાં મજબૂત સ્ટેનિંગ દ્વારા ક્લોન્સ #2002, #2077, અને #2009 શોધી શકાયા હતા, જ્યારે કંટ્રોલ ફેજ (#1779) અને ક્લોન #2020 શોધી શકાયા ન હતા (પૂરક આકૃતિ 8). આ સૂચવે છે કે આ પેપ્ટાઇડ્સ BBB ને પાર કરીને મગજ પર અસરમાં ચોક્કસ ફાળો આપે છે. આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે વધુ વિગતવાર વિશ્લેષણ જરૂરી છે, કારણ કે BSCFB માર્ગ પણ સામેલ હોઈ શકે છે. સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ક્લોન (#2002) ના એમિનો એસિડ ક્રમની અન્ય પસંદ કરેલા પેપ્ટાઇડ્સ સાથે સરખામણી કરતી વખતે, તે નોંધવામાં આવ્યું હતું કે તેમાંના કેટલાકમાં સમાન એમિનો એસિડ એક્સટેન્શન છે, જે સમાન પરિવહન પદ્ધતિ સૂચવી શકે છે (આકૃતિ 3f).
તેની અનન્ય પ્લાઝ્મા પ્રોફાઇલ અને સમય જતાં CSF માં નોંધપાત્ર વધારાને કારણે, ફેજ ડિસ્પ્લે ક્લોન #2077 ને 48-કલાકના લાંબા સમયગાળા દરમિયાન વધુ શોધવામાં આવ્યું હતું અને સતત SA સ્તરો (આકૃતિ 4a) સાથે જોડાણમાં જોવા મળતા CSF માં ઝડપી વધારાને પુનઃઉત્પાદિત કરવામાં સક્ષમ હતું. અન્ય ઓળખાયેલા ફેજ ક્લોન્સ વિશે, #2077 મગજની રુધિરકેશિકાઓ માટે મજબૂત રીતે રંગીન હતું અને ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન પર જોવામાં આવે ત્યારે કેશિકા માર્કર લેક્ટીન સાથે નોંધપાત્ર કોલોકલાઇઝેશન અને સંભવતઃ પેરેનકાઇમલ સ્પેસમાં કેટલાક સ્ટેનિંગ દર્શાવ્યું હતું (આકૃતિ 4b). CNS માં પેપ્ટાઇડ-મધ્યસ્થી ફાર્માકોલોજિકલ અસરો મેળવી શકાય છે કે કેમ તેની તપાસ કરવા માટે, અમે એક પ્રયોગ કર્યો જેમાં i) #2077 ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ અને ii) BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડના બાયોટીનાઇલેટેડ સંસ્કરણોને SA સાથે બે અલગ અલગ ગુણોત્તરમાં મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. એક સંયોજન માટે અમે ફક્ત BACE1 પેપ્ટાઇડ અવરોધકનો ઉપયોગ કર્યો અને બીજા માટે અમે BACE1 પેપ્ટાઇડ અવરોધકનો #2077 પેપ્ટાઇડ સાથે 1:3 ગુણોત્તરનો ઉપયોગ કર્યો. બંને નમૂનાઓ નસમાં આપવામાં આવ્યા હતા અને સમય જતાં બીટા-એમિલોઇડ પેપ્ટાઇડ 40 (Abeta40) ના લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી સ્તરનું માપન કરવામાં આવ્યું હતું. Abeta40 ને CSF માં માપવામાં આવ્યું હતું કારણ કે તે મગજના પેરેનકાઇમામાં BACE1 અવરોધને પ્રતિબિંબિત કરે છે. અપેક્ષા મુજબ, બંને સંકુલોએ Abeta40 ના રક્ત સ્તરમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો હતો (આકૃતિ 4c, d). જો કે, ફક્ત પેપ્ટાઇડ નં. 2077 અને SA સાથે જોડાયેલા BACE1 પેપ્ટાઇડના અવરોધકના મિશ્રણ ધરાવતા નમૂનાઓએ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં Abeta40 માં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો હતો (આકૃતિ 4c). ડેટા દર્શાવે છે કે પેપ્ટાઇડ નં. 2077 60 kDa SA પ્રોટીનને CNS માં પરિવહન કરવામાં સક્ષમ છે અને BACE1 પેપ્ટાઇડના SA-સંયુક્ત અવરોધકો સાથે ફાર્માકોલોજિકલ અસરો પણ પ્રેરિત કરે છે.
(a) ઓછામાં ઓછા ત્રણ CM-ઇન્ટ્યુબેટેડ ઉંદરોમાં CSF પેપ્ટાઇડ #2077 (RLSSVDSDLSGC) અને અનઇન્જેક્ટેડ કંટ્રોલ ફેજ (#1779) ના લાંબા ગાળાના ફાર્માકોકાઇનેટિક પ્રોફાઇલ્સ દર્શાવતા T7 ફેજના ક્લોનલ ઇન્જેક્શન (2 × 10 ફેજ/પ્રાણી). (b) ફેજ-ઇન્જેક્ટેડ ઉંદરોમાં પ્રતિનિધિ કોર્ટિકલ માઇક્રોવેસેલ્સની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપિક છબી (2 × 10 10 ફેજ/પ્રાણી) પેપ્ટાઇડ #2077 અને વાહિનીઓ (લેક્ટીન) ના કાઉન્ટરસ્ટેનિંગ દર્શાવે છે. આ ફેજ ક્લોન્સ 3 ઉંદરોને આપવામાં આવ્યા હતા અને પરફ્યુઝન પહેલાં 1 કલાક માટે પરિભ્રમણ કરવા દેવામાં આવ્યા હતા. મગજને T7 ફેજ કેપ્સિડ સામે પોલીક્લોનલ FITC-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝથી વિભાજીત કરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા. પરફ્યુઝન અને ત્યારબાદ ફિક્સેશનના દસ મિનિટ પહેલા, DyLight594-લેબલવાળા લેક્ટિનને નસમાં આપવામાં આવ્યું હતું. રુધિરકેશિકાઓ અને પેરીવાસ્ક્યુલર મગજ પેશીઓના લ્યુમેનમાં માઇક્રોવેસેલ્સ અને ફેજેસ (લીલો) ના લ્યુમિનલ બાજુના લેક્ટીન સ્ટેનિંગ (લાલ) દર્શાવતી ફ્લોરોસન્ટ છબીઓ. સ્કેલ બાર 10 µm ને અનુરૂપ છે. (c, d) બાયોટીનાઇલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ એકલા અથવા બાયોટીનાઇલેટેડ ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ #2077 સાથે સંયોજનમાં સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ ઓછામાં ઓછા ત્રણ કેન્યુલેટેડ CM ઉંદરો (10 મિલિગ્રામ સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન/કિલો) ના નસમાં ઇન્જેક્શન આપવામાં આવ્યું હતું. Aβ40 માં BACE1 પેપ્ટાઇડ અવરોધક-મધ્યસ્થી ઘટાડો Aβ1-40 ELISA દ્વારા સૂચવેલ સમય બિંદુઓ પર રક્ત (લાલ) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી) માં માપવામાં આવ્યો હતો. વધુ સારી સ્પષ્ટતા માટે, ગ્રાફ પર 100% ના સ્કેલ પર ડોટેડ લાઇન દોરવામાં આવી છે. (c) સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે સારવાર કરાયેલા ઉંદરોમાં લોહીમાં Aβ40 (લાલ ત્રિકોણ) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી ત્રિકોણ) માં 3:1 ગુણોત્તરમાં ઘટાડો, જે ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ #2077 અને BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ સાથે જોડાયેલ છે. (d) સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે સારવાર કરાયેલા ઉંદરોમાં લોહીમાં Aβ40 (લાલ વર્તુળો) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી વર્તુળો) માં ટકાવારી ઘટાડો, જે ફક્ત BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ સાથે જોડાયેલ છે. નિયંત્રણમાં Aβ સાંદ્રતા 420 pg/ml (માનક વિચલન = 101 pg/ml) હતી.
બાયોમેડિકલ સંશોધનના અનેક ક્ષેત્રોમાં ફેજ ડિસ્પ્લે સફળતાપૂર્વક લાગુ કરવામાં આવ્યું છે17. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ ઇન વિવો વેસ્ક્યુલર ડાયવર્સિટી સ્ટડીઝ18,19 તેમજ સેરેબ્રલ વેસલ્સને લક્ષ્ય બનાવતા અભ્યાસો20,21,22,23,24,25,26 માટે કરવામાં આવ્યો છે. આ અભ્યાસમાં, અમે આ પસંદગી પદ્ધતિનો ઉપયોગ ફક્ત સેરેબ્રલ વેસલ્સને લક્ષ્ય બનાવતા પેપ્ટાઇડ્સની સીધી ઓળખ માટે જ નહીં, પરંતુ રક્ત-મગજ અવરોધને પાર કરવા માટે સક્રિય પરિવહન ગુણધર્મો ધરાવતા ઉમેદવારોની શોધ માટે પણ વિસ્તૃત કર્યો છે. હવે અમે CM ઇન્ટ્યુબેટેડ ઉંદરોમાં ઇન વિવો પસંદગી પ્રક્રિયાના વિકાસનું વર્ણન કરીએ છીએ અને CSF હોમિંગ ગુણધર્મો સાથે પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવાની તેની ક્ષમતા દર્શાવીએ છીએ. 12-મેર રેન્ડમ પેપ્ટાઇડ્સની લાઇબ્રેરી દર્શાવતા T7 ફેજનો ઉપયોગ કરીને, અમે દર્શાવવામાં સક્ષમ હતા કે T7 ફેજ પૂરતું નાનું છે (આશરે 60 nm વ્યાસ)10 રક્ત-મગજ અવરોધ સાથે અનુકૂલિત થવા માટે, ત્યાંથી સીધા રક્ત-મગજ અવરોધ અથવા કોરોઇડ પ્લેક્સસને પાર કરે છે. અમે જોયું કે કેન્યુલેટેડ CM ઉંદરોમાંથી CSF લણણી એક સારી રીતે નિયંત્રિત ઇન વિવો ફંક્શનલ સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિ હતી, અને કાઢવામાં આવેલ ફેજ માત્ર વેસ્ક્યુલેચર સાથે બંધાયેલ જ નહીં પણ રક્ત-મગજ અવરોધ પાર કરીને ટ્રાન્સપોર્ટર તરીકે પણ કાર્ય કરે છે. વધુમાં, એકસાથે રક્ત એકત્રિત કરીને અને CSF અને રક્ત-વ્યુત્પન્ન ફેજ પર HTS લાગુ કરીને, અમે પુષ્ટિ કરી કે CSF ની અમારી પસંદગી રક્ત સંવર્ધન અથવા પસંદગીના રાઉન્ડ વચ્ચે વિસ્તરણ માટે ફિટનેસથી પ્રભાવિત નથી. જો કે, રક્ત કમ્પાર્ટમેન્ટ પસંદગી પ્રક્રિયાનો એક ભાગ છે, કારણ કે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટ સુધી પહોંચવા માટે સક્ષમ ફેજ મગજમાં પોતાને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે લાંબા સમય સુધી લોહીના પ્રવાહમાં ટકી રહેવા અને પરિભ્રમણ કરવા જોઈએ. કાચા HTS ડેટામાંથી વિશ્વસનીય ક્રમ માહિતી કાઢવા માટે, અમે વિશ્લેષણ વર્કફ્લોમાં પ્લેટફોર્મ-વિશિષ્ટ ક્રમ ભૂલો માટે અનુકૂલિત ફિલ્ટર્સ લાગુ કર્યા. સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિમાં ગતિ પરિમાણોનો સમાવેશ કરીને, અમે રક્ત24, 27, 28 માં જંગલી-પ્રકારના T7 ફેજ (t½ ~ 28 મિનિટ) ના ઝડપી ફાર્માકોકેનેટિક્સની પુષ્ટિ કરી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (t½ ~ 26 મિનિટ) પ્રતિ મિનિટમાં તેમનું અર્ધ-જીવન પણ નક્કી કર્યું. લોહી અને CSF માં સમાન ફાર્માકોકાઇનેટિક પ્રોફાઇલ્સ હોવા છતાં, CSF માં ફેજના લોહીના સાંદ્રતાના માત્ર 0.001% શોધી શકાયા, જે રક્ત-મગજ અવરોધમાં જંગલી-પ્રકારના T7 ફેજની ઓછી પૃષ્ઠભૂમિ ગતિશીલતા દર્શાવે છે. આ કાર્ય ઇન વિવો પેનિંગ વ્યૂહરચનાઓનો ઉપયોગ કરતી વખતે પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડના મહત્વ પર ભાર મૂકે છે, ખાસ કરીને ફેજ સિસ્ટમ્સ માટે જે ઝડપથી પરિભ્રમણમાંથી સાફ થાય છે, કારણ કે થોડા ક્લોન્સ CNS કમ્પાર્ટમેન્ટ સુધી પહોંચવામાં સક્ષમ હોય છે. આમ, પ્રથમ રાઉન્ડમાં, લાઇબ્રેરી વિવિધતામાં ઘટાડો ખૂબ મોટો હતો, કારણ કે આ ખૂબ જ કડક CSF મોડેલમાં આખરે મર્યાદિત સંખ્યામાં ક્લોન્સ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. આ ઇન વિવો પેનિંગ વ્યૂહરચનામાં CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સક્રિય સંચય, રક્ત કમ્પાર્ટમેન્ટમાં ક્લોન સર્વાઇવલ અને પ્રથમ 10 મિનિટમાં લોહીમાંથી T7 ફેજ ક્લોન્સને ઝડપી દૂર કરવા જેવા ઘણા પસંદગીના પગલાં શામેલ હતા (આકૃતિ 1d અને પૂરક આકૃતિ 4M). આમ, પ્રથમ રાઉન્ડ પછી, CSF માં વિવિધ ફેજ ક્લોન્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જોકે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓ માટે સમાન પ્રારંભિક પૂલનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. આ સૂચવે છે કે મોટી સંખ્યામાં લાઇબ્રેરી સભ્યો ધરાવતી સ્રોત લાઇબ્રેરીઓ માટે બહુવિધ કડક પસંદગી પગલાં વિવિધતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે. તેથી, રેન્ડમ ઘટનાઓ પ્રારંભિક પસંદગી પ્રક્રિયાનો એક અભિન્ન ભાગ બનશે, જે પરિણામને ખૂબ પ્રભાવિત કરશે. સંભવ છે કે મૂળ લાઇબ્રેરીમાં ઘણા ક્લોન્સમાં ખૂબ સમાન CSF સંવર્ધન વલણ હતું. જો કે, સમાન પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ પણ, પ્રારંભિક પૂલમાં દરેક ચોક્કસ ક્લોનની ઓછી સંખ્યાને કારણે પસંદગીના પરિણામો અલગ હોઈ શકે છે.
CSF માં સમૃદ્ધ થયેલા મોટિફ્સ લોહીમાં રહેલા મોટિફ્સ કરતા અલગ છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓના લોહીમાં ગ્લાયસીન-સમૃદ્ધ પેપ્ટાઇડ્સ તરફનો પ્રથમ ફેરફાર નોંધ્યો. (આકૃતિ 1g, પૂરક આકૃતિ 4e, 4f). ગ્લાયસીન પેપ્ટાઇડ્સ ધરાવતા ફેજ વધુ સ્થિર હોઈ શકે છે અને પરિભ્રમણમાંથી બહાર કાઢવાની શક્યતા ઓછી હોઈ શકે છે. જો કે, સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓમાં આ ગ્લાયસીન-સમૃદ્ધ પેપ્ટાઇડ્સ શોધી કાઢવામાં આવ્યા ન હતા, જે સૂચવે છે કે ક્યુરેટેડ લાઇબ્રેરીઓ બે અલગ અલગ પસંદગીના પગલાંમાંથી પસાર થઈ હતી: એક લોહીમાં અને બીજાને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં એકઠા થવા દેવામાં આવ્યા હતા. પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડમાંથી પરિણમેલા CSF-સમૃદ્ધ ક્લોન્સનું વ્યાપક પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું છે. ખાલી નિયંત્રણ ફેજની તુલનામાં લગભગ તમામ વ્યક્તિગત રીતે પરીક્ષણ કરાયેલા ક્લોન્સ CSF માં સમૃદ્ધ હોવાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. એક પેપ્ટાઇડ હિટ (#2077) ની વધુ વિગતવાર તપાસ કરવામાં આવી હતી. તે અન્ય હિટ (આકૃતિ 3d અને પૂરક આકૃતિ 7) ની તુલનામાં લાંબુ પ્લાઝ્મા હાફ-લાઇફ દર્શાવે છે, અને રસપ્રદ વાત એ છે કે, આ પેપ્ટાઇડમાં C-ટર્મિનસ પર સિસ્ટીન અવશેષ હતો. તાજેતરમાં એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે પેપ્ટાઇડ્સમાં સિસ્ટીન ઉમેરવાથી આલ્બ્યુમિન 29 સાથે જોડાઈને તેમના ફાર્માકોકાઇનેટિક ગુણધર્મોમાં સુધારો થઈ શકે છે. પેપ્ટાઇડ #2077 માટે આ હાલમાં અજ્ઞાત છે અને વધુ અભ્યાસની જરૂર છે. કેટલાક પેપ્ટાઇડ્સે CSF સંવર્ધનમાં સંયોજકતા-નિર્ભરતા દર્શાવી હતી (ડેટા બતાવેલ નથી), જે T7 કેપ્સિડની પ્રદર્શિત સપાટી ભૂમિતિ સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે. અમે જે T7 સિસ્ટમનો ઉપયોગ કર્યો હતો તે ફેજ કણ દીઠ દરેક પેપ્ટાઇડની 5-15 નકલો દર્શાવે છે. IHC ઉંદરોના મગજના કોર્ટેક્સમાં નસમાં ઇન્જેક્ટ કરાયેલા ઉમેદવાર લીડ ફેજ ક્લોન્સ પર કરવામાં આવ્યું હતું (પૂરક આકૃતિ 8). ડેટા દર્શાવે છે કે ઓછામાં ઓછા ત્રણ ક્લોન્સ (નં. 2002, નં. 2009 અને નં. 2077) એ BBB સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી હતી. તે નક્કી કરવાનું બાકી છે કે આ BBB ક્રિયાપ્રતિક્રિયા CSF ના સંચયમાં પરિણમે છે કે આ ક્લોન્સની સીધી BCSFB માં હિલચાલમાં પરિણમે છે. મહત્વપૂર્ણ રીતે, અમે બતાવીએ છીએ કે પસંદ કરેલા પેપ્ટાઇડ્સ પ્રોટીન કાર્ગોમાં સંશ્લેષણ અને બંધન દરમિયાન તેમની CSF પરિવહન ક્ષમતા જાળવી રાખે છે. N-ટર્મિનલ બાયોટીનાઇલેટેડ પેપ્ટાઇડ્સનું SA સાથે જોડાણ મૂળભૂત રીતે લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં તેમના સંબંધિત ફેજ ક્લોન્સ સાથે મેળવેલા પરિણામોનું પુનરાવર્તન કરે છે (આકૃતિ 3e). અંતે, અમે બતાવીએ છીએ કે લીડ પેપ્ટાઇડ #2077 SA સાથે જોડાયેલા BACE1 ના બાયોટીનાઇલેટેડ પેપ્ટાઇડ અવરોધકની મગજની ક્રિયાને પ્રોત્સાહન આપવા સક્ષમ છે, જે CSF માં Abeta40 સ્તરને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડીને CNS માં ઉચ્ચારણ ફાર્માકોડાયનેમિક અસરોનું કારણ બને છે (આકૃતિ 4). અમે બધા હિટ્સના પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ હોમોલોજી શોધ કરીને ડેટાબેઝમાં કોઈપણ હોમોલોગ્સને ઓળખવામાં અસમર્થ હતા. એ નોંધવું મહત્વપૂર્ણ છે કે T7 લાઇબ્રેરીનું કદ આશરે 109 છે, જ્યારે 12-મર્સ માટે સૈદ્ધાંતિક લાઇબ્રેરીનું કદ 4 x 1015 છે. તેથી, અમે 12-મર્સ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીની વિવિધતા જગ્યાનો માત્ર એક નાનો ભાગ પસંદ કર્યો છે, જેનો અર્થ એ થઈ શકે છે કે આ ઓળખાયેલ હિટ્સના અડીને આવેલા સિક્વન્સ જગ્યાનું મૂલ્યાંકન કરીને વધુ ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ પેપ્ટાઇડ્સ ઓળખી શકાય છે. કાલ્પનિક રીતે, આ પેપ્ટાઇડ્સના કોઈ કુદરતી સમાનતાઓ ન મળ્યાનું એક કારણ ઉત્ક્રાંતિ દરમિયાન મગજમાં ચોક્કસ પેપ્ટાઇડ મોટિફ્સના અનિયંત્રિત પ્રવેશને રોકવા માટે ડિસેલેક્શન હોઈ શકે છે.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારા પરિણામો ભવિષ્યમાં સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર અવરોધની પરિવહન પ્રણાલીઓને વધુ વિગતવાર ઓળખવા અને લાક્ષણિકતા આપવા માટે એક આધાર પૂરો પાડે છે. આ પદ્ધતિનો મૂળભૂત સેટઅપ એક કાર્યાત્મક પસંદગી વ્યૂહરચના પર આધારિત છે જે ફક્ત સેરેબ્રલ વેસ્ક્યુલર બંધનકર્તા ગુણધર્મો ધરાવતા ક્લોન્સને ઓળખે છે, પરંતુ એક મહત્વપૂર્ણ પગલું પણ શામેલ છે જેમાં સફળ ક્લોન્સ સીએનએસ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં વિવોમાં જૈવિક અવરોધોને પાર કરવા માટે આંતરિક પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે. આ પેપ્ટાઇડ્સના પરિવહનની પદ્ધતિ અને મગજના પ્રદેશ માટે વિશિષ્ટ માઇક્રોવાસ્ક્યુલેચર સાથે બંધન માટે તેમની પસંદગીને સ્પષ્ટ કરવાનો છે. આનાથી BBB અને રીસેપ્ટર્સના પરિવહન માટે નવા માર્ગોની શોધ થઈ શકે છે. અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે ઓળખાયેલા પેપ્ટાઇડ્સ સીધા સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર રીસેપ્ટર્સ અથવા BBB અથવા BCSFB દ્વારા પરિવહન કરાયેલા ફરતા લિગાન્ડ્સ સાથે જોડાઈ શકે છે. આ કાર્યમાં શોધાયેલ CSF પરિવહન પ્રવૃત્તિ ધરાવતા પેપ્ટાઇડ વેક્ટર્સની વધુ તપાસ કરવામાં આવશે. અમે હાલમાં BBB અને/અથવા BCSFB ને પાર કરવાની તેમની ક્ષમતા માટે આ પેપ્ટાઇડ્સની મગજ વિશિષ્ટતાની તપાસ કરી રહ્યા છીએ. આ નવા પેપ્ટાઇડ્સ નવા રીસેપ્ટર્સ અથવા માર્ગોની સંભવિત શોધ માટે અને મગજમાં બાયોલોજિક્સ જેવા મેક્રોમોલેક્યુલ્સ પહોંચાડવા માટે નવા અત્યંત કાર્યક્ષમ પ્લેટફોર્મના વિકાસ માટે અત્યંત મૂલ્યવાન સાધનો બનશે.
અગાઉ વર્ણવેલ પદ્ધતિમાં ફેરફાર કરીને મોટા સિસ્ટર્ના (CM) ને કેન્યુલેટ કરો. એનેસ્થેટાઇઝ્ડ વિસ્ટાર ઉંદરો (200-350 ગ્રામ) ને સ્ટીરિયોટેક્સિક ઉપકરણ પર માઉન્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ખોપરીનો ભાગ બહાર કાઢવા માટે મુંડાવેલા અને એસેપ્ટિકલી તૈયાર કરેલા ખોપરી ઉપર એક મધ્ય ચીરો બનાવવામાં આવ્યો હતો. ઉપલા ખેસના વિસ્તારમાં બે છિદ્રો ડ્રિલ કરો અને છિદ્રોમાં ફિક્સિંગ સ્ક્રૂ બાંધો. સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કેન્યુલાના CM માં સ્ટીરિયોટેક્ટિક માર્ગદર્શન માટે લેટરલ ઓસિપિટલ ક્રેસ્ટમાં એક વધારાનો છિદ્ર ડ્રિલ કરવામાં આવ્યો હતો. કેન્યુલાની આસપાસ ડેન્ટલ સિમેન્ટ લગાવો અને સ્ક્રૂથી સુરક્ષિત કરો. ફોટો-ક્યુરિંગ અને સિમેન્ટ સખત થયા પછી, ત્વચાના ઘાને 4/0 સુપ્રામિડ સિવેનથી બંધ કરવામાં આવ્યો હતો. સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) ના સ્વયંભૂ લિકેજ દ્વારા કેન્યુલાનું યોગ્ય સ્થાન પુષ્ટિ થાય છે. સ્ટીરિયોટેક્સિક ઉપકરણમાંથી ઉંદરને દૂર કરો, યોગ્ય પોસ્ટઓપરેટિવ સંભાળ અને પીડા વ્યવસ્થાપન મેળવો, અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડમાં લોહીના ચિહ્નો જોવા મળે ત્યાં સુધી તેને ઓછામાં ઓછા એક અઠવાડિયા સુધી સ્વસ્થ થવા દો. વિસ્ટાર ઉંદરો (Crl:WI/Han) ચાર્લ્સ રિવર (ફ્રાન્સ) માંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. બધા ઉંદરોને ચોક્કસ રોગકારક-મુક્ત પરિસ્થિતિઓમાં રાખવામાં આવ્યા હતા. બધા પ્રાણી પ્રયોગો સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડના બેસલ શહેરના પશુચિકિત્સા કાર્યાલય દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવ્યા હતા અને એનિમલ લાઇસન્સ નંબર 2474 (ઉંદરના સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી અને મગજમાં ઉપચારાત્મક ઉમેદવારોના સ્તરને માપીને સક્રિય મગજ પરિવહનનું મૂલ્યાંકન) અનુસાર કરવામાં આવ્યા હતા.
ઉંદરને CM કેન્યુલા હાથમાં રાખીને ધીમેધીમે સભાન રાખો. કેન્યુલામાંથી દાતુરા કાઢો અને સ્વયંભૂ વહેતા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના 10 μl એકત્રિત કરો. કેન્યુલાની પેટન્સી આખરે નબળી પડી ગઈ હોવાથી, આ અભ્યાસમાં ફક્ત સ્પષ્ટ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો જેમાં લોહીના દૂષણ અથવા વિકૃતિકરણનો કોઈ પુરાવો નહોતો. સમાંતર રીતે, પૂંછડીના છેડા પરના નાના ચીરામાંથી હેપરિન (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) સાથે નળીઓમાં આશરે 10-20 μl રક્ત લેવામાં આવ્યું હતું. T7 ફેજના નસમાં ઇન્જેક્શન પછી વિવિધ સમયે CSF અને રક્ત એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. દરેક CSF નમૂના એકત્રિત કરવામાં આવે તે પહેલાં આશરે 5-10 μl પ્રવાહી કાઢી નાખવામાં આવ્યું હતું, જે કેથેટરના મૃત જથ્થાને અનુરૂપ છે.
T7Select સિસ્ટમ મેન્યુઅલ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) માં વર્ણવ્યા મુજબ T7Select 10-3b વેક્ટરનો ઉપયોગ કરીને પુસ્તકાલયો બનાવવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, નીચેના ફોર્મેટમાં રેન્ડમ 12-mer DNA ઇન્સર્ટનું સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું:
NNK કોડોનનો ઉપયોગ ઇન્સર્ટમાં ડબલ સ્ટોપ કોડોન અને એમિનો એસિડ ઓવરએક્સપ્રેશન ટાળવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. N એ દરેક ન્યુક્લિયોટાઇડનો મેન્યુઅલી મિશ્રિત સમકક્ષ ગુણોત્તર છે, અને K એ એડેનિન અને સાયટોસિન ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો મેન્યુઅલી મિશ્રિત સમકક્ષ ગુણોત્તર છે. 37°C તાપમાને 3 કલાક માટે ક્લેનો બફર (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) માં dNTP (નોવાજેન) અને ક્લેનોવ એન્ઝાઇમ (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) સાથે વધુ ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ પ્રદેશોને ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ DNAમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રતિક્રિયા પછી, EtOH અવક્ષેપ દ્વારા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યું હતું. પરિણામી DNA ને પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો EcoRI અને HindIII (બંને રોશેમાંથી) સાથે પાચન કરવામાં આવ્યું હતું. ક્લીવ્ડ અને પ્યુરિફાઇડ (QIAquick, Qiagen) ઇન્સર્ટ (T4 ligase, New England Biolabs) પછી 10B કેપ્સિડ જનીનના એમિનો એસિડ 348 પછી ફ્રેમમાં પૂર્વ-ક્લીવ્ડ T7 વેક્ટરમાં બંધ કરવામાં આવ્યું હતું. ઇન વિટ્રો પેકેજિંગ પહેલાં 18 કલાક માટે લિગેશન પ્રતિક્રિયાઓ 16° સેલ્સિયસ પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવી હતી. T7Select 10-3b ક્લોનિંગ કીટ (નોવાજેન) સાથે પૂરી પાડવામાં આવેલી સૂચનાઓ અનુસાર ઇન વિટ્રોમાં ફેજ પેકેજિંગ કરવામાં આવ્યું હતું અને એસ્ચેરીચીયા કોલી (BLT5615, નોવાજેન) નો ઉપયોગ કરીને પેકેજિંગ સોલ્યુશનને એકવાર લિસિસ માટે એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યું હતું. ગ્લિસરોલના સ્ટોક સોલ્યુશન તરીકે -80° સેલ્સિયસ પર લાઇસેટ્સને સેન્ટ્રીફ્યુજ, ટાઇટ્રેટેડ અને સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા.
પ્રોપ્રાઇટરી 454/રોશે-એમ્પ્લીકોન ફ્યુઝન પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને બ્રોથ અથવા પ્લેટમાં એમ્પ્લીફાઇડ ફેજ વેરિયેબલ રિજનનું ડાયરેક્ટ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન. ફોરવર્ડ ફ્યુઝન પ્રાઈમરમાં વેરિયેબલ રિજન (NNK) 12 (ટેમ્પલેટ-વિશિષ્ટ), GS FLX ટાઇટેનિયમ એડેપ્ટર A, અને ચાર-બેઝ લાઇબ્રેરી કી સિક્વન્સ (TCAG) (પૂરક આકૃતિ 1a) ની બાજુમાં આવેલા સિક્વન્સ હોય છે:
રિવર્સ ફ્યુઝન પ્રાઈમરમાં કેપ્ચર બીડ્સ સાથે જોડાયેલ બાયોટિન અને ઇમલ્શન પીસીઆર દરમિયાન ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન માટે જરૂરી GS FLX ટાઇટેનિયમ એડેપ્ટર B પણ હોય છે:
ત્યારબાદ એમ્પ્લીકોન્સને 454 GS-FLX ટાઇટેનિયમ પ્રોટોકોલ અનુસાર 454/રોશે પાયરોસિક્વન્સિંગ કરવામાં આવ્યું. મેન્યુઅલ સેન્જર સિક્વન્સિંગ (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ હિટાચી 3730 xl DNA એનાલાઇઝર) માટે, T7 ફેજ DNA ને PCR દ્વારા એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યું હતું અને નીચેના પ્રાઇમર જોડીઓ સાથે સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યું હતું:
રોશ ફાસ્ટ સ્ટાર્ટ ડીએનએ પોલિમરેઝ કિટ (ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર) નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત તકતીઓમાંથી ઇન્સર્ટ્સને પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન આપવામાં આવ્યું હતું. હોટ સ્ટાર્ટ (95 °C પર 10 મિનિટ) અને 35 બુસ્ટ સાયકલ (95 °C પર 50 સેકન્ડ, 50 °C પર 1 મિનિટ અને 72 °C પર 1 મિનિટ) કરો.
લાઇબ્રેરીઓમાંથી ફેજ, વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ, CSF અને લોહીમાંથી બચાવેલ ફેજ, અથવા વ્યક્તિગત ક્લોન્સને એસ્ચેરીચીયા કોલી BL5615 માં ટીબી બ્રોથ (સિગ્મા એલ્ડ્રિચ) માં અથવા 500 cm2 ડીશ (થર્મો સાયન્ટિફિક) માં 37°C પર 4 કલાક માટે એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્લેટોને ટ્રિસ-EDTA બફર (ફ્લુકા એનાલિટીકલ) થી ધોઈને અથવા જંતુરહિત પીપેટ ટીપ્સ સાથે પ્લેક એકત્રિત કરીને પ્લેટોમાંથી ફેજ કાઢવામાં આવ્યા હતા. પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ (PEG 8000) પ્રિસિપિટેશન (પ્રોમેગા) ના એક રાઉન્ડ સાથે કલ્ચર સુપરનેટન્ટ અથવા એક્સટ્રેક્શન બફરમાંથી ફેજને અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રિસ-EDTA બફરમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.
એમ્પ્લીફાઇડ ફેજને ઇન્ટ્રાવેનસ (IV) ઇન્જેક્શન (500 μl/પ્રાણી) પહેલાં એન્ડોટોક્સિન રિમૂવલ બીડ્સ (મિલ્ટેની બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવાના 2-3 રાઉન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રથમ રાઉન્ડમાં, 2×1012 ફેજ રજૂ કરવામાં આવ્યા હતા; બીજામાં, 2×1010 ફેજ; ત્રીજા અને ચોથા પસંદગી રાઉન્ડમાં, પ્રતિ પ્રાણી 2×109 ફેજ. CSF અને સૂચવેલ સમય બિંદુઓ પર એકત્રિત કરાયેલા રક્ત નમૂનાઓમાં ફેજ સામગ્રી ઉત્પાદકની સૂચનાઓ (T7Select સિસ્ટમ મેન્યુઅલ) અનુસાર પ્લેક ગણતરી દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી. ફેજ પસંદગી પૂંછડીની નસમાં શુદ્ધ લાઇબ્રેરીઓના ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન દ્વારા અથવા પાછલા પસંદગી રાઉન્ડમાંથી CSFમાંથી કાઢવામાં આવેલા ફેજના ફરીથી ઇન્જેક્શન દ્વારા કરવામાં આવી હતી, અને ત્યારબાદ લણણી 10 મિનિટ, 30 મિનિટ, 60 મિનિટ, 90 મિનિટ, 120 મિનિટ, 180 મિનિટ અને 240 મિનિટ અનુક્રમે CSF અને રક્ત નમૂનાઓ પર કરવામાં આવી હતી. ઇન વિવો પેનિંગના કુલ ચાર રાઉન્ડ હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા જેમાં પસંદગીના પહેલા ત્રણ રાઉન્ડ દરમિયાન બે પસંદ કરેલી શાખાઓને અલગથી સંગ્રહિત અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવી હતી. પસંદગીના પહેલા બે રાઉન્ડમાંથી CSFમાંથી કાઢવામાં આવેલા બધા ફેજ ઇન્સર્ટ્સને 454/રોશે પાયરોસેક્વન્સિંગને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે પસંદગીના છેલ્લા બે રાઉન્ડમાંથી CSFમાંથી કાઢવામાં આવેલા બધા ક્લોન્સને મેન્યુઅલી સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યા હતા. પસંદગીના પહેલા રાઉન્ડમાંથી બધા બ્લડ ફેજને પણ 454/રોશે પાયરોસેક્વન્સિંગને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા. ફેજ ક્લોન્સના ઇન્જેક્શન માટે, પસંદ કરેલા ફેજને E. coli (BL5615) માં 500 cm2 પ્લેટો પર 37°C પર 4 કલાક માટે એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા. વ્યક્તિગત રીતે પસંદ કરેલા અને મેન્યુઅલી સિક્વન્સ કરેલા ક્લોન્સને TB માધ્યમમાં ફેલાવવામાં આવ્યા હતા. ફેજ નિષ્કર્ષણ, શુદ્ધિકરણ અને એન્ડોટોક્સિન દૂર કર્યા પછી (ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ), 300 μl માં 2×1010 ફેજ/પ્રાણીને એક પૂંછડીની નસમાં નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.
સિક્વન્સ ડેટાનું પ્રીપ્રોસેસિંગ અને ગુણાત્મક ફિલ્ટરિંગ. રો 454/રોશે ડેટાને બાયનરી સ્ટાન્ડર્ડ સ્ટ્રીમ મેપ ફોર્મેટ (sff) માંથી વેન્ડર સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને પીયર્સન હ્યુમન રીડેબલ ફોર્મેટ (fasta) માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યો હતો. નીચે વર્ણવ્યા મુજબ માલિકીના C પ્રોગ્રામ્સ અને સ્ક્રિપ્ટ્સ (અપ્રકાશિત સોફ્ટવેર પેકેજ) નો ઉપયોગ કરીને ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સની વધુ પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. પ્રાથમિક ડેટાના વિશ્લેષણમાં કડક મલ્ટી-સ્ટેજ ફિલ્ટરિંગ પ્રક્રિયાઓ શામેલ છે. માન્ય 12mer ઇન્સર્ટ DNA સિક્વન્સ ન હોય તેવા રીડ્સને ફિલ્ટર કરવા માટે, રીડ્સને ગ્લોબલ નીડલમેન-વુન્સ ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને સ્ટાર્ટ લેબલ (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT), સ્ટોપ લેબલ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) અને બેકગ્રાઉન્ડ ઇન્સર્ટ (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGAC) સાથે ક્રમિક રીતે ગોઠવવામાં આવ્યા હતા. સંરેખણ પ્રતિ સંરેખણ 31 સુધી 2 અસંગતતાઓને મંજૂરી આપે છે. તેથી, સ્ટાર્ટ અને સ્ટોપ ટૅગ્સ વિના વાંચન અને બેકગ્રાઉન્ડ ઇન્સર્ટ ધરાવતા વાંચન, એટલે કે, અનુરૂપ સંખ્યા કરતાં વધુ ગોઠવણીઓ, લાઇબ્રેરીમાંથી દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. બાકીના વાંચનો સંદર્ભ લો, N-mer DNA ક્રમ જે શરૂઆતના ચિહ્નથી શરૂ થાય છે અને સ્ટોપ માર્ક પહેલાં સમાપ્ત થાય છે તેને મૂળ વાંચન ક્રમમાંથી કાઢી નાખવામાં આવે છે અને વધુ પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે (ત્યારબાદ "ઇન્સર્ટ" તરીકે ઓળખવામાં આવે છે). ઇન્સર્ટના અનુવાદ પછી, પ્રાઈમરના 5′ છેડે પ્રથમ સ્ટોપ કોડોન પછીનો ભાગ ઇન્સર્ટમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે. વધુમાં, પ્રાઈમરના 3′ છેડે અપૂર્ણ કોડોન તરફ દોરી જતા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પણ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. ફક્ત પૃષ્ઠભૂમિ ક્રમ ધરાવતા ઇન્સર્ટને બાકાત રાખવા માટે, એમિનો એસિડ પેટર્ન "PAG" થી શરૂ થતા અનુવાદિત ઇન્સર્ટ પણ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. લાઇબ્રેરીમાંથી 3 થી ઓછી એમિનો એસિડની પોસ્ટ-ટ્રાન્સલેશનલ લંબાઈવાળા પેપ્ટાઇડ્સ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. અંતે, ઇન્સર્ટ પૂલમાં રિડન્ડન્સી દૂર કરો અને દરેક અનન્ય ઇન્સર્ટની આવર્તન નક્કી કરો. આ વિશ્લેષણના પરિણામોમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સ (ઇન્સર્ટ) અને તેમની (વાંચન) ફ્રીક્વન્સીઝની સૂચિ શામેલ છે (પૂરક આકૃતિઓ 1c અને 2).
ક્રમ સમાનતા દ્વારા જૂથ N-mer DNA દાખલ કરે છે: 454/Roche-વિશિષ્ટ ક્રમ ભૂલો (જેમ કે ક્રમ હોમોપોલિમર એક્સટેન્શન સાથે સમસ્યાઓ) દૂર કરવા અને ઓછી મહત્વપૂર્ણ રીડન્ડન્સી દૂર કરવા માટે, અગાઉ ફિલ્ટર કરેલ N-mer DNA ક્રમ દાખલ (ઇન્સર્ટ) સમાનતા દ્વારા સૉર્ટ કરવામાં આવે છે. નીચે પ્રમાણે વ્યાખ્યાયિત પુનરાવર્તિત અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને નિવેશ (2 બિન-મેળ ખાતા પાયા સુધી મંજૂરી): નિવેશને પહેલા તેમની આવર્તન (સૌથી વધુથી ન્યૂનતમ) દ્વારા સૉર્ટ કરવામાં આવે છે, અને જો તે સમાન હોય, તો તેમના ગૌણ સૉર્ટ દ્વારા લંબાઈ (સૌથી લાંબીથી ટૂંકી) દ્વારા) દ્વારા સૉર્ટ કરવામાં આવે છે. આમ, સૌથી વધુ વારંવાર અને સૌથી લાંબી નિવેશ પ્રથમ "જૂથ" વ્યાખ્યાયિત કરે છે. જૂથ આવર્તન કી આવર્તન પર સેટ કરવામાં આવે છે. પછી, સૉર્ટ કરેલી સૂચિમાં બાકી રહેલા દરેક નિવેશને જોડી મુજબ નીડલમેન-વુન્શ સંરેખણ દ્વારા જૂથમાં ઉમેરવાનો પ્રયાસ કરવામાં આવ્યો હતો. જો ગોઠવણીમાં મેળ ખાતી નથી, નિવેશ અથવા કાઢી નાખવાની સંખ્યા 2 ની થ્રેશોલ્ડ કરતાં વધુ ન હોય, તો જૂથમાં એક નિવેશ ઉમેરવામાં આવે છે, અને એકંદર જૂથ આવર્તન કેટલી વાર નિવેશ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું તેના દ્વારા વધારવામાં આવે છે. જૂથમાં ઉમેરવામાં આવેલા નિવેશને વપરાયેલ તરીકે ચિહ્નિત કરવામાં આવે છે અને આગળની પ્રક્રિયામાંથી બાકાત રાખવામાં આવે છે. જો ઇન્સર્ટ સિક્વન્સ પહેલાથી અસ્તિત્વમાં રહેલા જૂથમાં ઉમેરી શકાતો નથી, તો ઇન્સર્ટ સિક્વન્સનો ઉપયોગ યોગ્ય ઇન્સર્ટ ફ્રીક્વન્સી સાથે એક નવું ગ્રુપ બનાવવા માટે થાય છે અને વપરાયેલ તરીકે ચિહ્નિત કરવામાં આવે છે. જ્યારે દરેક ઇન્સર્ટ સિક્વન્સનો ઉપયોગ કાં તો નવા ગ્રુપ બનાવવા માટે કરવામાં આવે છે અથવા પહેલાથી અસ્તિત્વમાં રહેલા જૂથમાં સમાવી શકાય છે ત્યારે પુનરાવર્તન સમાપ્ત થાય છે. છેવટે, ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ ધરાવતા જૂથબદ્ધ ઇન્સર્ટને આખરે પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ (પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓ) માં અનુવાદિત કરવામાં આવે છે. આ વિશ્લેષણનું પરિણામ ઇન્સર્ટેશનનો સમૂહ અને તેમની અનુરૂપ ફ્રીક્વન્સીઝ છે જે સળંગ વાંચનની સંખ્યા બનાવે છે (પૂરક આકૃતિ 2).
મોટિફ જનરેશન: અનન્ય પેપ્ટાઇડ્સની સૂચિના આધારે, નીચે બતાવ્યા પ્રમાણે બધા શક્ય એમિનો એસિડ પેટર્ન (aa) ધરાવતી એક લાઇબ્રેરી બનાવવામાં આવી હતી. લંબાઈ 3 ની દરેક શક્ય પેટર્ન પેપ્ટાઇડમાંથી કાઢવામાં આવી હતી અને તેની વ્યસ્ત પેટર્ન એક સામાન્ય મોટિફ લાઇબ્રેરી સાથે ઉમેરવામાં આવી હતી જેમાં બધા પેટર્ન (ટ્રિપેપ્ટાઇડ્સ) હતા. ખૂબ પુનરાવર્તિત મોટિફ્સની લાઇબ્રેરીઓને ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવી હતી અને રીડન્ડન્સી દૂર કરવામાં આવી હતી. પછી, મોટિફ લાઇબ્રેરીમાં દરેક ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ માટે, અમે કોમ્પ્યુટેશનલ ટૂલ્સનો ઉપયોગ કરીને લાઇબ્રેરીમાં તેની હાજરી તપાસી. આ કિસ્સામાં, મળેલા મોટિફ ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ ધરાવતા પેપ્ટાઇડની આવર્તન ઉમેરવામાં આવે છે અને મોટિફ લાઇબ્રેરીમાં મોટિફને સોંપવામાં આવે છે ("મોટિફ્સની સંખ્યા"). મોટિફ જનરેશનનું પરિણામ બે-પરિમાણીય એરે છે જેમાં ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ્સ (મોટિફ્સ) ની બધી ઘટનાઓ અને તેમના સંબંધિત મૂલ્યો શામેલ છે, જે સિક્વન્સિંગ રીડ્સની સંખ્યા છે જે રીડ્સને ફિલ્ટર, જૂથબદ્ધ અને અનુવાદિત કરવામાં આવે ત્યારે અનુરૂપ મોટિફમાં પરિણમે છે. ઉપર વિગતવાર વર્ણવ્યા મુજબ મેટ્રિક્સ.
મોટિફ્સ અને અનુરૂપ સ્કેટરપ્લોટ્સની સંખ્યાનું સામાન્યીકરણ: દરેક નમૂના માટે મોટિફ્સની સંખ્યાનો ઉપયોગ કરીને સામાન્યીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું
જ્યાં ni એ વિષય i ધરાવતા વાંચનોની સંખ્યા છે. આમ, vi એ નમૂનામાં મોટિફ i ધરાવતા વાંચનો (અથવા પેપ્ટાઇડ્સ) ટકાવારી આવર્તન દર્શાવે છે. ફિશરના ચોક્કસ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને બિન-સામાન્યકૃત સંખ્યાના મોટિફ્સ માટે P-મૂલ્યોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. હેતુઓની સંખ્યાના સહસંબંધો અંગે, સ્પીયરમેનના સહસંબંધોની ગણતરી R સાથેના સામાન્યકૃત સંખ્યાના હેતુઓનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીમાં દરેક સ્થાન પર એમિનો એસિડની સામગ્રીની કલ્પના કરવા માટે, વેબ લોગોગ્રામ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) બનાવવામાં આવ્યા હતા. પ્રથમ, 12-મેર પેપ્ટાઇડના દરેક સ્થાન પર એમિનો એસિડની સામગ્રી 20×12 મેટ્રિક્સમાં સંગ્રહિત થાય છે. પછી, દરેક સ્થાન પર સમાન સંબંધિત એમિનો એસિડ સામગ્રી ધરાવતા 1000 પેપ્ટાઇડ્સનો સમૂહ ફાસ્ટા-સિક્વન્સ ફોર્મેટમાં જનરેટ કરવામાં આવે છે અને વેબ-લોગો 3 માં ઇનપુટ તરીકે પ્રદાન કરવામાં આવે છે, જે દરેક સ્થાન પર સંબંધિત એમિનો એસિડ સામગ્રીનું ગ્રાફિકલ પ્રતિનિધિત્વ ઉત્પન્ન કરે છે. આપેલ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી માટે. બહુપરીમાણીય ડેટાસેટ્સને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવા માટે, R (બાયોસહીટમેપ, હજુ સુધી રિલીઝ ન થયેલ R પેકેજ) માં આંતરિક રીતે વિકસિત ટૂલનો ઉપયોગ કરીને હીટ મેપ્સ બનાવવામાં આવ્યા હતા. હીટ મેપ્સમાં રજૂ કરાયેલા ડેન્ડ્રોગ્રામની ગણતરી યુક્લિડિયન અંતર મેટ્રિક સાથે વોર્ડની હાયરાર્કિકલ ક્લસ્ટરિંગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. મોટિફ સ્કોરિંગ ડેટાના આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે, ફિશરના ચોક્કસ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને અસાધારણ સ્કોરિંગ માટે P મૂલ્યોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. અન્ય ડેટાસેટ્સ માટે P-મૂલ્યોની ગણતરી વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટ અથવા ANOVA નો ઉપયોગ કરીને R માં કરવામાં આવી હતી.
પસંદ કરેલા ફેજ ક્લોન્સ અને ઇન્સર્ટ્સ વગરના ફેજને પૂંછડીની નસ (300 μl PBS માં 2×1010 ફેજ/પ્રાણી) દ્વારા નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. પરફ્યુઝન અને ત્યારબાદ ફિક્સેશનના દસ મિનિટ પહેલા, તે જ પ્રાણીઓને DyLight594-લેબલવાળા લેક્ટીન (વેક્ટર લેબોરેટરીઝ ઇન્ક., DL-1177) ના 100 μl નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. ફેજ ઇન્જેક્શનના 60 મિનિટ પછી, ઉંદરોને 50 મિલી PBS અને ત્યારબાદ 50 મિલી 4% PFA/PBS સાથે હૃદયમાં પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા. મગજના નમૂનાઓને 4% PFA/PBS માં રાતોરાત વધારામાં ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા અને 4°C પર રાતોરાત 30% સુક્રોઝમાં પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાઓને OCT મિશ્રણમાં ફ્લેશ ફ્રીઝ કરવામાં આવે છે. ફ્રોઝન સેમ્પલનું ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ વિશ્લેષણ ઓરડાના તાપમાને 1% BSA સાથે બ્લોક કરેલા 30 µm ક્રાયોસેક્શન પર કરવામાં આવ્યું હતું અને 4 °C પર T7 ફેજ (નોવસ NB 600-376A) સામે પોલીક્લોનલ FITC-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું. રાતોરાત ઇન્ક્યુબેશન કરો. અંતે, વિભાગોને PBS વડે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને કોન્ફોકલ લેસર માઇક્રોસ્કોપ (Leica TCS SP5) વડે તપાસવામાં આવ્યા હતા.
98% ની ન્યૂનતમ શુદ્ધતા ધરાવતા બધા પેપ્ટાઇડ્સને GenScript USA દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા, બાયોટીનાઇલેટેડ અને લ્યોફિલાઇઝ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. બાયોટિન N-ટર્મિનસ પર વધારાના ટ્રિપલ ગ્લાયસીન સ્પેસર દ્વારા બંધાયેલ છે. માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને બધા પેપ્ટાઇડ્સ તપાસો.
સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન (સિગ્મા S0677) ને 5-ગણા સમકક્ષ બાયોટીનાઇલેટેડ પેપ્ટાઇડ, બાયોટીનાઇલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ, અથવા બાયોટીનાઇલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ અને BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડના મિશ્રણ (3:1 ગુણોત્તર) સાથે 5-10% DMSO/PBS માં ઇન્ક્યુબેટેડમાં મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. ઇન્જેક્શન પહેલાં 1 કલાક ઓરડાના તાપમાને. સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-સંયુક્ત પેપ્ટાઇડ્સને મગજની પોલાણવાળા ઉંદરોની પૂંછડીની નસોમાં 10 મિલિગ્રામ/કિલોના ડોઝ પર નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.
ELISA દ્વારા સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-પેપ્ટાઇડ સંકુલની સાંદ્રતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. Nunc Maxisorp માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ (સિગ્મા) ને 4°C પર 1.5 μg/ml માઉસ એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન એન્ટિબોડી (થર્મો, MA1-20011) સાથે રાતોરાત કોટ કરવામાં આવી હતી. બ્લોકિંગ (બ્લોકિંગ બફર: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% જિલેટીન, 1% BSA) ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક માટે કર્યા પછી, પ્લેટને 0.05% Tween-20/PBS (વોશ બફર) થી 3 સેકન્ડ માટે ધોઈ લો, CSF અને પ્લાઝ્મા નમૂનાઓ બ્લોકિંગ બફર (પ્લાઝ્મા 1:10,000, CSF 1:115) સાથે ભળેલા કુવામાં ઉમેરવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ પ્લેટને ડિટેક્શન એન્ટિબોડી (1 μg/ml, એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-HRP, Novus NB120-7239) સાથે 4°C પર રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવી હતી. ત્રણ ધોવાના પગલાં પછી, TMB સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન (રોશે) માં 20 મિનિટ સુધી ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન શોધી કાઢવામાં આવ્યું. 1M H2SO4 સાથે રંગ વિકાસ બંધ કર્યા પછી, શોષણ 450 nm પર માપો.
સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-પેપ્ટાઇડ-BACE1 અવરોધક સંકુલનું કાર્ય ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ (વાકો, 294-64701) અનુસાર Aβ(1-40) ELISA દ્વારા મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, CSF નમૂનાઓને પ્રમાણભૂત ડાયલ્યુઅન્ટ (1:23) માં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને BNT77 કેપ્ચર એન્ટિબોડી સાથે કોટેડ 96-વેલ પ્લેટોમાં 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. ધોવાના પાંચ પગલાં પછી, HRP-સંયુક્ત BA27 એન્ટિબોડી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને 4°C પર 2 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ પાંચ ધોવાના પગલાં લેવામાં આવ્યા હતા. ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે TMB દ્રાવણમાં ઉકાળવા દ્વારા Aβ(1–40) શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું. સ્ટોપ સોલ્યુશન સાથે રંગ વિકાસ બંધ કર્યા પછી, 450 nm પર શોષણ માપો. Aβ(1–40) ELISA પહેલાં પ્લાઝ્મા નમૂનાઓને ઘન તબક્કાના નિષ્કર્ષણને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા. પ્લાઝ્મા 96-વેલ પ્લેટોમાં 0.2% DEA (સિગ્મા) માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને 30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. SPE પ્લેટો (Oasis, 186000679) ને પાણી અને 100% મિથેનોલથી ક્રમિક રીતે ધોવા પછી, SPE પ્લેટોમાં પ્લાઝ્મા નમૂનાઓ ઉમેરવામાં આવ્યા અને બધા પ્રવાહી દૂર કરવામાં આવ્યા. નમૂનાઓ ધોવામાં આવ્યા (પહેલા 5% મિથેનોલ પછી 30% મિથેનોલ સાથે) અને 2% NH4OH/90% મિથેનોલથી એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા. સતત N2 પ્રવાહ પર 99 મિનિટ માટે 55°C પર એલ્યુએટ સૂકવ્યા પછી, નમૂનાઓને પ્રમાણભૂત મંદકોમાં ઘટાડવામાં આવ્યા અને ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ Aβ(1–40) માપવામાં આવ્યા.
આ લેખ કેવી રીતે ટાંકવો: યુરિચ, ઇ. એટ અલ. વિવોમાં ઓળખાયેલા ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ્સનો ઉપયોગ કરીને મગજમાં કાર્ગો ડિલિવરી. ધ સાયન્સ. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
લિખોટા જે., સ્કજોરીંજ ટી., થોમસેન એલબી અને મૂસ ટી. લક્ષિત ઉપચારનો ઉપયોગ કરીને મગજમાં મેક્રોમોલેક્યુલર દવાઓની ડિલિવરી. જર્નલ ઓફ ન્યુરોકેમિસ્ટ્રી 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
બ્રાસ્નજેવિક, આઇ., સ્ટેઇનબુશ, એચડબ્લ્યુ, શ્મિટ્ઝ, સી., અને માર્ટિનેઝ-માર્ટિનેઝ, પી. રક્ત-મગજ અવરોધમાં પેપ્ટાઇડ અને પ્રોટીન દવાઓની ડિલિવરી. પ્રોગ ન્યુરોબાયોલ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
પાર્ડ્રિજ, ડબલ્યુએમ રક્ત-મગજ અવરોધ: મગજની દવાના વિકાસમાં અવરોધ. ન્યુરોઆરએક્સ 2, 3–14, 10.1602/ન્યુરોરએક્સ.2.1.3 (2005).
જોહાન્સન, કેઇ, ડંકન, જેએ, સ્ટોપા, ઇજી, અને બાયર્ડ, એ. કોરોઇડ પ્લેક્સસ-સીએસએફ માર્ગ દ્વારા મગજમાં ડ્રગ ડિલિવરી અને લક્ષ્યીકરણમાં સુધારો કરવાની સંભાવનાઓ. ફાર્માસ્યુટિકલ રિસર્ચ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
પાર્ડ્રિજ, ડબલ્યુએમ મગજ ડિલિવરી માટે મોલેક્યુલર ટ્રોજન હોર્સ સાથે બાયોફાર્માસ્યુટિકલ્સનું આધુનિકીકરણ. બાયોકોન્જુગ કેમ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
પાર્ડ્રિજ, WM રીસેપ્ટર-મધ્યસ્થી પેપ્ટાઇડ પરિવહન રક્ત-મગજ અવરોધમાં. એન્ડોકર રેવ. 7, 314–330 (1986).
નિવોહેનર, જે. એટ અલ. મોનોવેલેન્ટ મોલેક્યુલર શટલનો ઉપયોગ કરીને મગજના પ્રવેશ અને ઉપચારાત્મક એન્ટિબોડીઝની અસરકારકતામાં વધારો. ન્યુરોન 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
બિએન-લી, એન. એટ અલ. ટ્રાન્સફરિન રીસેપ્ટર (TfR) પરિવહન TfR એન્ટિબોડીઝના એફિનિટી વેરિઅન્ટ્સના મગજના શોષણને નક્કી કરે છે. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).