Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Þú ert að nota vafraútgáfu með takmörkuðum CSS-stuðningi. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Til að tryggja áframhaldandi stuðning sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Sýnir hringekju með þremur glærum í einu. Notaðu hnappana Fyrri og Næsta til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu, eða notaðu rennihnappana í lokin til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu.
Blóð-heila þröskuldurinn og blóð-heila þröskuldurinn koma í veg fyrir að líftæknilyf nái markmiðum sínum í miðtaugakerfinu og hindrar þannig árangursríka meðferð taugasjúkdóma. Til að uppgötva ný heilaflutningsprótein in vivo kynntum við T7 faga peptíðasafn og söfnuðum blóði og heila- og mænuvökva (CSF) í röð með því að nota rörlaga meðvitaða stóra rottulaugarlíkan. Sérstakir fagaklónar voru mjög auðgaðir í CSF eftir fjórar umferðir af vali. Prófanir á einstökum peptíðum leiddu í ljós meira en 1000-falda auðgun í CSF. Líffræðileg virkni peptíðmiðlaðs afhendingar til heilans var staðfest með 40% lækkun á magni amyloid-β í heila- og mænuvökvanum með því að nota BACE1 peptíðhemil sem tengdist nýja flutningspeptíðinu sem greint var. Þessar niðurstöður benda til þess að peptíðin sem greind voru með in vivo fagavalsaðferðum geti verið gagnleg farartæki fyrir kerfisbundna afhendingu stórsameinda til heilans með meðferðaráhrifum.
Rannsóknir á markvissri meðferð miðtaugakerfisins hafa að mestu leyti beinst að því að bera kennsl á bestu lyf og efni sem sýna eiginleika sem beinast að miðtaugakerfinu, með minni fyrirhöfn í að uppgötva þá ferla sem knýja virka lyfjaflutninga til heilans. Þetta er farið að breytast núna þar sem lyfjaflutningur, sérstaklega stórra sameinda, er óaðskiljanlegur hluti af nútíma lyfjaþróun í taugavísindum. Umhverfi miðtaugakerfisins er vel varið af heilaæðakerfinu, sem samanstendur af blóð-heilaþröskuldinum (BBB) ​​og blóð-heilaþröskuldinum (BCBB)1, sem gerir það krefjandi að flytja lyf til heilans1,2. Talið er að næstum öll stór sameinda lyf og meira en 98% af smáum sameinda lyfjum séu skilgreind úr heilanum3. Þess vegna er mjög mikilvægt að bera kennsl á ný flutningskerfi heilans sem veita skilvirka og sértæka flutning lyfja til miðtaugakerfisins4,5. Hins vegar bjóða BBB og BCSFB einnig upp á frábært tækifæri til lyfjaflutninga þar sem þau komast inn í allar byggingar heilans í gegnum víðtækar æðar hans. Þannig byggjast núverandi viðleitni til að nota óinngripandi aðferðir til að flytja lyfið til heilans að miklu leyti á viðtakamiðlaðri flutningsaðferð (PMT) með því að nota innræna BBB6 viðtakann. Þrátt fyrir nýlegar mikilvægar framfarir með því að nota transferrínviðtakaferilinn7,8 er þörf á frekari þróun nýrra flutningskerfa með bættum eiginleikum. Í þessu skyni var markmið okkar að bera kennsl á peptíð sem geta miðlað flutningi í heila- og mænuvökva, þar sem þau gætu í grundvallaratriðum verið notuð til að flytja stórsameindir til miðtaugakerfisins eða til að opna nýjar viðtakaferla. Sérstaklega geta sértækir viðtakar og flutningsprótein í heila- og æðakerfinu (BBB og BSCFB) þjónað sem hugsanleg markmið fyrir virka og sértæka afhendingu líftæknilyfja. Heila- og mænuvökvi (CSF) er seytingarafurð æðuplexus (CS) og er í beinni snertingu við millivefsvökva heilans í gegnum köngulóarholið og sleglaholið4. Nýlega hefur verið sýnt fram á að köngulóarholsvökvi dreifist óhóflega inn í millivef heilans9. Við vonumst til að fá aðgang að vefjavökvanum með því að nota þennan innstreymisveg undir kjúklingablóðrásina eða beint í gegnum breiðholsheila (BH). Til að ná þessu höfum við innleitt öfluga in vivo fagavalsaðferð sem best greinir peptíð sem eru flutt með annarri hvorri þessara tveggja aðskildu leiða.
Við lýsum nú raðbundinni skimunaraðferð fyrir faga in vivo með sýnatöku í heila- og mænuvökva ásamt háafköstaröðun (HTS) til að fylgjast með upphaflegum valumferðum með mestri fjölbreytni í bókasafni. Skimun var framkvæmd á meðvitaðri rottum með varanlega ígrædda stóra holpípu (CM) kanúlu til að forðast blóðmengun. Mikilvægt er að þessi aðferð velur bæði peptíð sem miða á heila og peptíð með flutningsvirkni yfir heilaæðaþröskuldinn. Við notuðum T7 faga vegna smæðar þeirra (~60 nm)10 og lögðum til að þeir henti til flutnings blöðra sem leyfa frumuflutning yfir æðaþels- og/eða þekjuvefs-mergþröskuldinn. Eftir fjórar umferðir af pönnun voru fagastofnar einangraðir sem sýndu sterka in vivo heila- og mænuvökvaauðgun og tengsl við öræðar í heila. Mikilvægt er að við gátum staðfest niðurstöður okkar með því að sýna fram á að bestu peptíðin, sem eru æskileg og efnafræðilega mynduð, geta flutt próteinfarm út í heila- og mænuvökvann. Í fyrsta lagi voru lyfhrif miðtaugakerfisins staðfest með því að sameina leiðandi flutningspeptíð við hemil á BACE1 peptíðinu. Auk þess að sýna fram á að in vivo virknisskimunaraðferðir geta greint ný flutningspeptíð í heila sem áhrifaríka próteinflutningsaðila, búumst við við að svipaðar virknivalsaðferðir verði einnig mikilvægar við að greina nýjar flutningsleiðir í heila.
Byggt á plakkmyndandi einingum (PFU), eftir föga-pökkunarskrefið, var bókasafn af handahófskenndum 12-mer línulegum T7 faga peptíðum með fjölbreytileika upp á um það bil 109 hannað og búið til (sjá Efni og Aðferðir). Mikilvægt er að hafa í huga að við greindum þetta bókasafn vandlega áður en við pönnuðum in vivo. PCR mögnun á föga bókasafnssýnum með breyttum praimerum myndaði amplikón sem voru beint nothæf fyrir HTS (Viðbótarmynd 1a). Vegna a) HTS11 raðgreiningarvillna, b) áhrifa á gæði praimera (NNK)1-12, og c) nærveru villtra (wt) faga (beinagrindarinnskota) í biðbókasafninu, var raðsíun innleidd til að draga aðeins út staðfestar raðupplýsingar (Viðbótarmynd 1b). Þessi síunarskref eiga við um öll HTS raðgreiningarbókasöfn. Fyrir staðlaða bókasafnið fengust samtals 233.868 lestrar, þar af stóðust 39% síunarviðmiðin og voru notuð til bókasafnsgreiningar og vals fyrir síðari umferðir (Viðbótarmynd 1c-e). Lestursniðurstöðurnar voru að mestu leyti margfeldi af 3 basapörum að lengd með hámarki við 36 núkleótíð (viðbótarmynd 1c), sem staðfestir bókasafnshönnunina (NNK) 1-12. Athyglisvert er að um það bil 11% af bókasafnsmeðlimum innihéldu 12-víddar villta gerð (wt) hryggjarsúlu PAGISRELVDKL innskot, og næstum helmingur raðanna (49%) innihélt innskot eða eyðingar. HTS bókasafnsins staðfesti mikla fjölbreytni peptíða í bókasafninu: meira en 81% af peptíðröðum fundust aðeins einu sinni og aðeins 1,5% komu fyrir í ≥4 eintökum (viðbótarmynd 2a). Tíðni amínósýra (aa) á öllum 12 stöðum í safninu samsvaraði vel tíðninni sem búist var við fyrir fjölda kóða sem myndaðir voru af úrkynjaða NKK safninu (viðbótarmynd 2b). Mæld tíðni aa leifanna sem þessi innskot kóðuðu til samsvaraði vel útreiknaða tíðninni (r = 0,893) (viðbótarmynd 2c). Undirbúningur fagasafna til inndælingar felur í sér skrefin mögnun og fjarlægingu innri eiturefna. Þetta hefur áður verið sýnt fram á að geta hugsanlega dregið úr fjölbreytileika fagasafna12,13. Þess vegna raðgreindum við fagasafn sem hafði verið magnað á plötu og hafði verið fjarlægt innri eiturefna og bárum það saman við upprunalega safnið til að meta tíðni AA. Sterk fylgni (r = 0,995) sást milli upprunalega safnsins og magnaða og hreinsaða safnsins (viðbótarmynd 2d), sem bendir til þess að samkeppni milli klóna sem voru magnaðar á plötum með T7 faga olli ekki verulegum skekkjum. Þessi samanburður byggist á tíðni þrípeptíðmótífa í hverju safni, þar sem fjölbreytileika bókasafna (~109) er ekki hægt að fanga að fullu, jafnvel með HTS. Tíðnigreining á aa í hverri stöðu leiddi í ljós litla staðsetningarháða skekkju í síðustu þremur stöðum innflutta safnsins (viðbótarmynd 2e). Að lokum komumst við að þeirri niðurstöðu að gæði og fjölbreytileiki bókasafnsins væru ásættanleg og aðeins minniháttar breytingar á fjölbreytileika sáust vegna mögnunar og undirbúnings fagasafna milli nokkurra valumferða.
Raðsýnataka úr heila- og mænuvökva er hægt að framkvæma með því að græða skurðaðgerð á nál í CM hjá meðvituðum rottum til að auðvelda auðkenningu T7 faga sem sprautað var í bláæð (iv) í gegnum BBB og/eða BCSFB (Mynd 1a-b). Við notuðum tvo óháða valarma (arma A og B) í fyrstu þremur umferðum in vivo valsins (Mynd 1c). Við jukum smám saman ákefð valsins með því að minnka heildarmagn faga sem kynntur var í fyrstu þremur umferðum valsins. Í fjórðu umferð pönnunar sameinum við sýni úr greinum A og B og framkvæmdum þrjár óháðar viðbótarval. Til að rannsaka in vivo eiginleika T7 faga agna í þessari gerð var villigerð faga (PAGISRELVDKL master insert) sprautað í rottur í gegnum halaæð. Endurheimt faga úr heila- og mænuvökva og blóði á mismunandi tímapunktum sýndi að tiltölulega litlir T7 tvíhliða fagar höfðu hraða upphafsúthreinsunarfasa úr blóðhólfinu (Viðbótarmynd 3). Byggt á gefnum títrum og blóðrúmmáli rottanna reiknuðum við út að aðeins um það bil 1% af þyngd faga úr gefnum skammti greindist í blóði 10 mínútum eftir inndælingu í bláæð. Eftir þessa upphaflegu hröðu lækkun mældist hægari úthreinsun með helmingunartíma upp á 27,7 mínútur. Mikilvægt er að aðeins mjög fáir fagar voru endurheimtir úr heila- og mænuvökvahólfinu, sem bendir til lágs bakgrunns fyrir flutning villtra faga inn í heila- og mænuhólfið (viðbótarmynd 3). Að meðaltali greindust aðeins um 1 x 10-3% títrar af T7 faga í blóði og 4 x 10-8% af upphaflega gefnum fögum í heila- og mænuvökva yfir allt sýnatökutímabilið (0-250 mínútur). Athyglisvert er að helmingunartími (25,7 mínútur) villtra faga í heila- og mænuvökva var svipaður og sást í blóði. Þessi gögn sýna að hindrunin sem aðskilur heila- og mænuhólfið frá blóðinu er óskemmd í rottum með CM-kanúleringu, sem gerir kleift að velja fagasöfn in vivo til að bera kennsl á klóna sem flytjast auðveldlega úr blóðinu í heila- og mænuhólfið.
(a) Aðferð til að endurtaka sýni úr heila- og mænuvökva (CSF) úr stórum potti. (b) Skýringarmynd sem sýnir staðsetningu frumna í miðtaugakerfishindruninni og valaðferðina sem notuð er til að bera kennsl á peptíð sem fara yfir blóð-heilaþröskuldinn og blóð-heilaþröskuldinn. (c) Flæðirit fyrir skimun á fögum in vivo. Í hverri valumferð voru fögar (dýraauðkenni innan örvanna) sprautaðir í bláæð. Tvær óháðar greinar (A, B) eru geymdar aðskildar þar til fjórðu valumferðinni. Fyrir valumferð 3 og 4 var hver fögaklón sem var dreginn út úr CSF raðgreindur handvirkt. (d) Hvörf föga sem einangraður var úr blóði (rauðir hringir) og heila- og mænuvökva (grænir þríhyrningar) í fyrstu valumferðinni í tveimur rottum með rör eftir inndælingu T7 peptíðasafnsins í bláæð (2 x 1012 fögar/dýr). Bláir ferningar gefa til kynna meðal upphafsþéttni föga í blóði, reiknað út frá magni sprautaðs föga, að teknu tilliti til heildarblóðrúmmáls. Svörtu ferningarnir gefa til kynna skurðpunkt y-línunnar, sem er útreiknuð út frá blóðfögaþéttni. (e,f) Sýna hlutfallslega tíðni og dreifingu allra mögulegra þrípeptíðmynda sem skarast í peptíðinu. Fjöldi myndefna sem fundust í 1000 mælingum er sýndur. Marktækt (p < 0,001) eru auðguð myndefni merkt með rauðum punktum. (e) Fylgnidreifirit sem ber saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmyndar sprautaðs safns við blóðfög úr dýrum #1.1 og #1.2. (f) Fylgnidreifirit sem ber saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmynda dýraföga #1.1 og #1.2 sem einangruð voru í blóði og heila- og mænuvökva. (g, h) Raðkenni föga auðgaðs í blóði (g) samanborið við sprautaðar bókasöfn og föga auðgaðs í mænuvökva (h) samanborið við blóð eftir umferð af in vivo vali í báðum dýrunum. Stærð eins bókstafs kóðans gefur til kynna hversu oft amínósýran kemur fyrir á þeirri staðsetningu. Grænt = póllitað, fjólublátt = hlutlaust, blátt = basískt, rautt = súrt og svart = vatnsfælnar amínósýrur. Mynd 1a og b var hönnuð og framleidd af Eduard Urich.
Við sprautuðum fögapeptíðasafni í tvær CM-rottur (klaðir A og B) og einangruðum föga úr heila- og mænuvökva og blóði (Mynd 1d). Upphafleg hröð úthreinsun safnsins var minna áberandi samanborið við villta gerð fögans. Meðal helmingunartími sprautaða safnsins í báðum dýrunum var 24,8 mínútur í blóði, svipað og villta gerð föga, og 38,5 mínútur í mænuvökva. Blóð- og heila- og mænuvökva fögasýni frá hvoru dýri voru sett í HTS og öll peptíð sem greind voru voru greind fyrir nærveru stutts þrípeptíðmótífs. Þrípeptíðmótíf voru valin vegna þess að þau veita lágmarks grunn fyrir byggingarmyndun og peptíð-prótein víxlverkun14,15. Við fundum góða fylgni í dreifingu mótífa milli sprautaðs föga safnsins og klóna sem unnir voru úr blóði beggja dýranna (Mynd 1e). Gögnin benda til þess að samsetning safnsins sé aðeins lítillega auðguð í blóðhólfinu. Amínósýrutíðni og samhljóðaröð voru frekar greindar á hverri staðsetningu með því að nota aðlögun að Weblogo16 hugbúnaðinum. Athyglisvert er að við fundum mikla auðgun á glýsínleifum í blóði (Mynd 1g). Þegar blóð var borið saman við klóna sem valdir voru úr heila- og mænuvökva, sást sterkt val og einhver afval á mótífum (Mynd 1f) og ákveðnar amínósýrur voru helst til staðar á fyrirfram ákveðnum stöðum í 12-liða raðgreiningunni (Mynd 1h). Athyglisvert er að einstök dýr voru marktækt ólík í heila- og mænuvökva, en glýsínauðgun í blóði sást hjá báðum dýrunum (Viðbótarmynd 4a-j). Eftir stranga síun á raðgögnum í heila- og mænuvökva dýranna #1.1 og #1.2, fengust samtals 964 og 420 einstök 12-liða peptíð (Viðbótarmynd 1d-e). Einangruðu fagaklónarnir voru magnaðir upp og settir í aðra umferð af in vivo vali. Fögum sem voru teknir út úr annarri umferð valsins var beitt með HTS í hverju dýri og öll peptíð sem greind voru voru notuð sem inntak í mótífagreiningarforrit til að greina tilvist þrípeptíðmótífa (Mynd 2a, b, ef). Í samanburði við fyrsta hring fagans sem endurheimtur var úr heila- og mænuvökva, sáum við frekara val og afval á mörgum mótífum í heila- og mænuvökva í greinum A og B (Mynd 2). Netgreiningarreiknirit var notað til að ákvarða hvort þau táknuðu mismunandi mynstur af samræmdri röð. Greinilegt líkindi sáust á milli 12-víddarraðanna sem endurheimt var af heila- og mænuvökva í annarri grein A (Mynd 2c, d) og grein B (Mynd 2g, h). Sameinuð greining í hverri grein leiddi í ljós mismunandi valsnið fyrir 12-mer peptíð (Viðbótarmynd 5c, d) og aukningu á títerhlutfalli heila- og mænuvökva/blóðs með tímanum fyrir sameinaða klóna eftir aðra valumferðina samanborið við fyrstu valumferðina (Viðbótarmynd 5e).
Auðgun mótífa og peptíða í heila- og mænuvökva með tveimur umferðum í röð af in vivo virkni fagasýningarvali.
Öllum heila- og mænuvökvafagum sem endurheimtust úr fyrstu umferð hvers dýrs (dýr #1.1 og #1.2) voru sameinaðar, magnaðar upp, HT-raðgreindar og sprautaðar aftur saman (2 x 1010 fagar/dýr) 2 SM kanúleraðar rottur (#1.1 → #). 2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4). (a, b, e, f) Fylgnidreifingarrit sem bera saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmynda allra heila- og mænuvökvafaga í fyrstu og annarri valumferð. Hlutfallsleg tíðni og dreifing myndefna sem tákna öll möguleg skörun þrípeptíð sem finnast í peptíðum í báðum stefnumörkunum. Fjöldi myndefna sem fundust í 1000 lestum er sýndur. Myndefni sem voru marktækt (p < 0,001) valin eða útilokuð í einu af samanburðarbókasöfnunum eru auðkennd með rauðum punktum. (c, d, g, h) Raðmerki fyrir allar raðir sem eru ríkar af heila- og mænuvökva og eru 12 amínósýrur að lengd, byggt á umferðum 2 og 1 af in vivo vali. Stærð eins bókstafs kóðans gefur til kynna hversu oft amínósýran kemur fyrir á þeirri stöðu. Til að tákna merkið er tíðni heila- og mænuvökvaraða sem dregnar eru úr einstökum dýrum á milli tveggja valumferða borin saman og auðguðu raðirnar í annarri umferð eru sýndar: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4. Auðguðustu amínósýrurnar á tiltekinni stöðu í (c, d) dýrum nr. 2.1 og nr. 2.2 eða (g, h) í dýrum nr. 2.3 og nr. 2.4 eru sýndar í lit. Grænt = skautað, fjólublátt = hlutlaust, blátt = basískt, rautt = súrt og svart = vatnsfæln amínósýrur.
Eftir þriðju umferð valsins greindum við 124 einstakar peptíðraðir (#3.1 og #3.2) úr 332 heila- og mænuvökva-endurgerðum fagaklónum sem einangraðir voru úr tveimur dýrum (viðbótarmynd 6a). Röðin LGSVS (18,7%) hafði hæsta hlutfallið, þar á eftir komu villtu gerðirnar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) og SARGSWREIVSLS (2,2%). Í síðustu fjórðu umferðinni sameinuðum við tvær sjálfstætt valdar greinar frá þremur aðskildum dýrum (mynd 1c). Af þeim 925 raðgreindu fagaklónum sem endurheimtust úr heila- og mænuvökva fundum við 64 einstakar peptíðraðir í fjórðu umferðinni (viðbótarmynd 6b), þar af lækkaði hlutfall villtu gerðarinnar af fagum niður í 0,8%. Algengustu CSF klónarnir í fjórðu umferðinni voru LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) og RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Lengdarbil valinna peptíða stafar af núkleótíðainnsetningum/eyðingum eða ótímabærum stöðvunarkóðum í praimerum bókasafnsins þegar úrkynjaðir kóðar eru notaðir fyrir NNK bókasafnshönnun. Ótímabærir stöðvunarkóðar mynda styttri peptíð og eru valdir vegna þess að þeir innihalda hagstæða aa mótífið. Lengri peptíð geta stafað af innsetningum/eyðingum í praimerum tilbúinna bókasafna. Þetta staðsetur hannaða stöðvunarkóðann utan rammans og les hann þar til nýr stöðvunarkóði birtist niðurstreymis. Almennt reiknuðum við auðgunarstuðla fyrir allar fjórar valumferðirnar með því að bera saman inntaksgögnin við úttaksgögn sýnisins. Fyrir fyrstu umferð skimunarinnar notuðum við villta gerð fagtítra sem ósértækan bakgrunnsviðmiðun. Athyglisvert er að neikvæð fögaval var mjög sterkt í fyrsta heila- og mænuvökvahringrásinni, en ekki í blóði (Mynd 3a), sem gæti stafað af lágum líkum á óvirkri dreifingu flestra meðlima peptíðasafnsins inn í heila- og mænuhólfið eða að hlutfallslegir fagar hafa tilhneigingu til að vera skilvirkari haldnir eða fjarlægðir úr blóðrásinni en bakteríufagar. Hins vegar, í annarri umferð pönnunar, sást sterkt val á fögum í heila- og mænuvökva í báðum klösum, sem bendir til þess að fyrri umferðin hafi verið auðguð af fögum sem sýndu peptíð sem stuðla að upptöku í heila- og mænuvökva (Mynd 3a). Aftur, án marktækrar blóðauðgunar. Einnig í þriðju og fjórðu umferð voru fögaklónarnir marktækt auðgaðir af heila- og mænuvökva. Við samanburð á hlutfallslegri tíðni hverrar einstakrar peptíðraðar milli síðustu tveggja valumferðanna komumst við að því að raðirnar voru enn auðgaðar í fjórðu valumferðinni (Mynd 3b). Alls voru 931 þrípeptíðmótíf dregin út úr öllum 64 einstöku peptíðraðunum með því að nota báðar peptíðstefnur. Þau myndefni sem fengu mesta auðgun í fjórðu umferðinni voru skoðuð nánar með tilliti til auðgunarprófíla þeirra í öllum umferðum samanborið við sprautaða safnið (viðmiðunarmörk: 10% auðgun) (Viðbótarmynd 6c). Almenn valmynstur sýndu að flest rannsökuð myndefni voru auðguð í öllum fyrri umferðum beggja valgreina. Hins vegar voru sum myndefni (t.d. SGL, VSG, LGS GSV) aðallega frá öðrum flokki A, en önnur (t.d. FGW, RTN, WGF, NTR) voru auðguð í öðrum flokki B.
Staðfesting á flutningi peptíða auðgaðra faga-sýndra í heila- og mænuvökva og bíótínýleraðra leiðapeptíða tengd streptavíðín-magni.
(a) Auðgunarhlutföll reiknuð út í öllum fjórum umferðum (R1-R4) byggt á sprautuðum (inntak = I) faga (PFU) títrum og ákvörðuðum faga títrum í heila- og mænuvökva (úttak = O). Auðgunarþættir fyrir síðustu þrjár umferðirnar (R2-R4) voru reiknaðir með samanburði við fyrri umferð og fyrstu umferð (R1) með þyngdargögnum. Opnar súlur eru heila- og mænuvökvi, skyggðu súlurnar eru plasma. (***p<0,001, byggt á Student's t-prófi). (b) Listi yfir algengustu faga peptíðin, raðað eftir hlutfalli þeirra við alla faga sem safnað var í heila- og mænuvökva eftir 4. umferð valsins. Sex algengustu fagaklónarnir eru auðkenndir í lit, númeraðir og auðgunarþættir þeirra milli 3. og 4. umferðar valsins (innskot). (c,d) Sex auðguðust fagaklónarnir, tómir fagar og foreldrafaga peptíðasöfn úr 4. umferð voru greind hvert fyrir sig í heila- og mænuvökva sýnatökulíkani. Heila- og mænuvökva- og blóðsýni voru tekin á tilgreindum tímapunktum. (c) Jafnt magn af 6 tilvonandi fagaklónum (2 x 1010 fagar/dýr), tómum fagum (#1779) (2 x 1010 fagar/dýr) og stofnfögum af fagapeptíðum (2 x 1012 fagar/dýr). Að minnsta kosti 3 ml af sprautu eru gefin dýrinu sem sprautað var með rör sérstaklega í gegnum halaæð. Sýnt er lyfjahvörf hvers sprautaðs fagaklóns og fagapeptíðsafns í heila- og mænuvökva með tímanum. (d) sýnir meðalhlutfall heila- og mænuvökva/blóðs fyrir alla endurheimta faga/ml yfir sýnatökutímann. (e) Fjögur tilbúin leiðtogapeptíð og eitt blandað samanburðarpróf voru tengd bíótíni við streptavíðín í gegnum N-enda þeirra (fjórþáttarsýn) og síðan sprautað (halaæð í bláæð, 10 mg af streptavíðíni/kg). Að minnsta kosti þrjár öndunarpípulagðar rottur (N = 3). Heila- og mænuvökvasýni voru tekin á tilgreindum tímapunktum og streptavíðínþéttni mæld með ELISA prófi gegn streptavíðíni í heila- og mænuvökva (nd = ekki greint). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, byggt á ANOVA prófi). (f) Samanburður á amínósýruröð auðgaða fagapeptíðklóna #2002 (fjólublá) við aðra valda fagapeptíðklóna úr 4. valumferð. Eins og svipuð amínósýrubrot eru litakóðuð.
Af öllum auðguðum fögum í fjórðu umferð (mynd 3b) voru sex tilvonandi klónar valdir til frekari einstaklingsgreiningar í sýnatökulíkani fyrir heila- og mænuvökva. Jöfn magn af sex tilvonandi fögum, tómum fögum (engum innskoti) og prófága peptíðbókasöfnum var sprautað í þrjú dýr með rörlagaða CM og lyfjahvörf voru ákvörðuð í heila- og mænuvökvaprófum (mynd 3c) og blóði (viðbótarmynd 7). Allir prófaðir fagaklónar beindust að heila- og mænuhólfinu á stigi sem var 10-1000 sinnum hærra en hjá tóma samanburðarfaganum (#1779). Til dæmis höfðu klónar #2020 og #2077 um 1000 sinnum hærri heila- og mænuvökvatítra en samanburðarfagarnir. Lyfjahvarfaprófíl hvers valins peptíðs er mismunandi, en allir hafa þeir mikla getu til að finna heila- og mænuvökva. Við sáum stöðuga lækkun með tímanum fyrir klóna #1903 og #2011, en fyrir klóna #2077, #2002 og #2009 gæti aukning á fyrstu 10 mínútunum bent til virks flutnings en þarf að staðfesta það. Klónar #2020, #2002 og #2077 náðu háu stigi, en heila- og mænuþéttni klóns #2009 lækkaði hægt eftir upphaflega aukningu. Við bárum síðan saman hlutfallslega tíðni hvers heila- og mænuvökvaframbjóðanda við blóðþéttni hans (Mynd 3d). Fylgni meðaltítra hvers heila- og mænuvökvaframbjóðanda við blóðtítra hans á öllum sýnatökutímum sýndi að þrír af sex frambjóðendunum voru marktækt auðgaðir af heila- og mænuvökva í blóði. Athyglisvert er að klón #2077 sýndi meiri stöðugleika í blóði (Viðbótarmynd 7). Til að staðfesta að peptíðin sjálf séu fær um að flytja virkan annan farm en fagaagnir inn í heila- og mænuvökvahólfið, mynduðum við fjögur leiðandi peptíð sem voru afleidd með bíótíni við N-enda þar sem peptíðin tengjast fagaögninni. Bíótínýleruð peptíð (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) voru tengd við streptavíðín (SA) til að fá fjölliðuform sem líktu nokkuð eftir fagalögunum. Þetta snið gerði okkur einnig kleift að mæla SA útsetningu í blóði og heila- og mænuvökva sem próteinpeptíð sem flytja farm. Mikilvægt er að fá fagagögn sem oft var hægt að endurtaka þegar tilbúin peptíð voru gefin í þessu SA-tengda sniði (Mynd 3e). Blandaðar peptíð höfðu minni upphafsútsetningu og hraðari úthreinsun úr heila- og mænuvökva með ógreinanlegu magni innan 48 klukkustunda. Til að fá innsýn í afhendingarleiðir þessara peptíðfagaklóna inn í heila- og mænuvökvarýmið greindum við staðsetningu einstakra fagapeptíðshögga með því að nota ónæmisvefjaefnafræði (IHC) til að greina beint fagaagnir 1 klukkustund eftir inndælingu í bláæð in vivo. Athyglisvert er að hægt var að greina klóna #2002, #2077 og #2009 með sterkri litun í háræðum heilans, en samanburðarfagi (#1779) og klón #2020 greindust ekki (viðbótarmynd 8). Þetta bendir til þess að þessi peptíð stuðli að áhrifum á heilann einmitt með því að fara yfir höfuðhár (BH). Ítarlegri greiningu er nauðsynleg til að prófa þessa tilgátu, þar sem BSCFB leiðin gæti einnig átt við. Þegar amínósýruröð auðgaðasta klónsins (#2002) var borin saman við önnur valin peptíð kom í ljós að sum þeirra hafa svipaða amínósýrulengingu, sem gæti bent til svipaðs flutningsferlis (mynd 3f).
Vegna einstakrar plasmauppsetningar sinnar og verulegrar aukningar á heila- og mænuvökva með tímanum var fagaklón #2077 rannsakaður frekar yfir lengra 48 klukkustunda tímabil og gat endurtekið hraða aukningu á heila- og mænuvökva sem sást í tengslum við viðvarandi SA gildi (Mynd 4a). Hvað varðar aðra greinda fagaklóna litaði #2077 sterkt fyrir háræðar heila og sýndi marktæka samstaðsetningu með háræðamerkislektíni þegar það var skoðað í hærri upplausn og hugsanlega einhverja litun í vefjavökvarýminu (Mynd 4b). Til að kanna hvort hægt væri að fá peptíðmiðlað lyfjafræðileg áhrif í miðtaugakerfinu framkvæmdum við tilraun þar sem bíótínýleraðar útgáfur af i) #2077 flutningspeptíðinu og ii) BACE1 hemli peptíðinu voru blandaðar við SA í tveimur mismunandi hlutföllum. Fyrir aðra samsetninguna notuðum við aðeins BACE1 peptíðhemilinn og fyrir hina notuðum við 1:3 hlutfall af BACE1 peptíðhemli á móti #2077 peptíði. Báðum sýnunum var gefið í bláæð og magn beta-amyloid peptíðs 40 (Abeta40) í blóði og heila- og mænuvökva var mælt með tímanum. Abeta40 var mælt í mænuvökva þar sem það endurspeglar BACE1 hömlun í heilavef. Eins og búist var við lækkuðu bæði flétturnar verulega magn Abeta40 í blóði (Mynd 4c, d). Hins vegar ollu aðeins sýni sem innihéldu blöndu af peptíði nr. 2077 og hemli á BACE1 peptíðinu sem er tengt SA marktækri lækkun á Abeta40 í heila- og mænuvökvanum (Mynd 4c). Gögnin sýna að peptíð nr. 2077 er fær um að flytja 60 kDa SA próteinið inn í miðtaugakerfið og veldur einnig lyfjafræðilegum áhrifum með SA-tengdum hemlum á BACE1 peptíðinu.
(a) Klónal innspýting (2 × 10 fagar/dýr) af T7 faga sem sýnir langtíma lyfjahvarfafræðileg einkenni CSF peptíðs #2077 (RLSSVDSDLSGC) og ósprautaðs samanburðarfags (#1779) í að minnsta kosti þremur CM-innsprautuðum rottum. (b) Smásjármynd af dæmigerðum öræðum í heilaberki í rottum sem fengu sprautu í faga (2 × 10 10 fagar/dýr) sem sýnir mótlitun á peptíði #2077 og æðum (lektíni). Þessir fagaklónar voru gefnir 3 rottum og leyfðir að streyma í 1 klukkustund fyrir blóðflæði. Heilinn var skorinn í sneiðar og litaður með fjölklóna FITC-merktum mótefnum gegn T7 faga hylki. Tíu mínútum fyrir blóðflæði og síðari festingu var DyLight594-merkt lektín gefið í bláæð. Flúrljómandi myndir sem sýna lektínlitun (rauð) á lumenhlið öræðanna og faganna (græn) í lumeni háræða og heilavefs í kringum æðar. Kvarðastikan samsvarar 10 µm. (c, d) Bíótínýlerað BACE1 hömlunarpeptíð eitt sér eða í samsetningu við bíótínýlerað flutningspeptíð #2077 var tengt streptavidíni og síðan gefið í bláæð að minnsta kosti þremur CM rottum með rörlaga inndælingu (10 mg streptavidín/kg). BACE1 peptíðhemil-miðlað minnkun á Aβ40 var mæld með Aβ1-40 ELISA í blóði (rautt) og heila- og mænuvökva (appelsínugult) á tilgreindum tímapunktum. Til að auðvelda skýrleika er punktalína teiknuð á grafinu á kvarðanum 100%. (c) Hlutfallsleg minnkun á Aβ40 í blóði (rauðir þríhyrningar) og heila- og mænuvökva (appelsínugular þríhyrningar) hjá rottum sem meðhöndlaðar voru með streptavidíni tengt flutningspeptíð #2077 og BACE1 hömlunarpeptíði í 3:1 hlutfalli. (d) Hlutfallsleg lækkun á Aβ40 í blóði (rauðir hringir) og heila- og mænuvökva (appelsínuguli hringir) hjá rottum sem meðhöndlaðar voru með streptavíðíni eingöngu tengt BACE1-hömlunarpeptíði. Aβ-þéttni í samanburðarhópnum var 420 pg/ml (staðalfrávik = 101 pg/ml).
Fögasýning hefur verið notuð með góðum árangri á ýmsum sviðum lífeðlisfræðilegra rannsókna17. Þessi aðferð hefur verið notuð í in vivo rannsóknum á fjölbreytileika æða18,19 sem og rannsóknum sem beinast að heilaæðum20,21,22,23,24,25,26. Í þessari rannsókn útvíkkuðum við notkun þessarar valaðferðar ekki aðeins til að greina peptíð beint sem beinast að heilaæðum, heldur einnig til að uppgötva peptíð með virka flutningseiginleika til að fara yfir blóð-heilaþröskuldinn. Við lýsum nú þróun in vivo valaðferðar í rottum sem hafa verið öndunarfæraþræðir með CM og sýnum fram á möguleika hennar til að bera kennsl á peptíð með eiginleika til að finna heila- og mænuvökva. Með því að nota T7 fagann sem sýnir bókasafn af 12-mer handahófskenndum peptíðum gátum við sýnt fram á að T7 faginn er nógu lítill (u.þ.b. 60 nm í þvermál)10 til að aðlagast blóð-heilaþröskuldinum og þar með fara beint yfir blóð-heilaþröskuldinn eða æðuplexusinn. Við komumst að því að uppskera heila- og mænuvökva úr rottum með rörlaga CM var vel stýrð in vivo virknisgreiningaraðferð og að útdregna fagan batt ekki aðeins við æðakerfið heldur virkaði einnig sem flutningsprótein yfir blóð-heilaþröskuldinn. Ennfremur, með því að safna blóði og beita HTS á heila- og mænuvökva og blóðfengna faga samtímis, staðfestum við að val okkar á heila- og mænuvökva var ekki undir áhrifum af blóðauðgun eða hæfni til útbreiðslu milli vallota. Hins vegar er blóðhólfið hluti af valferlinu, þar sem fagar sem geta náð til heila- og mænuhólfsins verða að lifa af og streyma í blóðrásinni nógu lengi til að auðga sig í heilanum. Til að draga áreiðanlegar upplýsingar um röð úr hráum HTS gögnum, innleiddum við síur sem voru aðlagaðar að raðgreiningarvillum á hverjum vettvangi í greiningarvinnuflæðinu. Með því að fella hvarfhraðabreytur inn í skimunaraðferðina staðfestum við hraða lyfjahvörf villtra T7 faga (t½ ~ 28 mín) í blóði24, 27, 28 og ákvörðuðum einnig helmingunartíma þeirra í heila- og mænuvökva (t½ ~ 26 mín) á mínútu. Þrátt fyrir svipaða lyfjahvarfafræðilega eiginleika í blóði og heila- og mænuvökva, var aðeins hægt að greina 0,001% af blóðþéttni faga í heila- og mænuvökva, sem bendir til lítillar bakgrunnshreyfanleika villtra T7 faga yfir blóð-heilaþröskuldinn. Þessi vinna undirstrikar mikilvægi fyrstu umferðar valsins þegar notaðar eru in vivo pönnunaraðferðir, sérstaklega fyrir fagakerfi sem hverfa hratt úr blóðrásinni, þar sem fáir klónar ná til miðtaugakerfisins. Þannig var minnkun á fjölbreytileika bókasafnsins mjög mikil í fyrstu umferðinni, þar sem aðeins takmarkaður fjöldi klóna var að lokum safnað í þessari mjög ströngu heila- og mænuvökvalíkani. Þessi in vivo pönnunaraðferð fól í sér nokkur valskref eins og virka uppsöfnun í heila- og mænuvökvahólfinu, lifun klóna í blóðhólfinu og hraða fjarlægingu T7 fagaklóna úr blóðinu innan fyrstu 10 mínútna (Mynd 1d og viðbótarmynd 4M). Þannig, eftir fyrstu umferðina, voru mismunandi fagaklónar greindir í heila- og mænuvökva, þó að sama upphaflega safnið hafi verið notað fyrir einstök dýr. Þetta bendir til þess að mörg ströng valskref fyrir upprunabókasöfn með miklum fjölda bókasafnsmeðlima leiði til verulegrar minnkunar á fjölbreytileika. Þess vegna munu handahófskenndir atburðir verða óaðskiljanlegur hluti af upphaflegu valferlinu og hafa mikil áhrif á niðurstöðuna. Það er líklegt að margir klónar í upprunalega bókasafninu hafi haft mjög svipaða tilhneigingu til að auðga heila- og mænuvökva. Hins vegar, jafnvel við sömu tilraunaaðstæður, geta niðurstöður valsins verið mismunandi vegna þess hve fáir klónar eru í upphafssafninu.
Myndefnin sem eru auðguð í heila- og mænuvökva eru frábrugðin þeim sem eru í blóði. Athyglisvert er að við tókum eftir fyrstu breytingunni í átt að glýsínríkum peptíðum í blóði einstakra dýra. (Mynd 1g, viðbótarmyndir 4e, 4f). Fög sem innihalda glýsínpeptíð geta verið stöðugri og ólíklegri til að vera tekin úr blóðrásinni. Hins vegar greindust þessi glýsínríku peptíð ekki í sýnum úr heila- og mænuvökva, sem bendir til þess að söfnin sem voru valin hafi farið í gegnum tvö mismunandi valskref: eitt í blóðinu og annað sem var leyft að safnast fyrir í heila- og mænuvökvanum. Klónar sem auðgaðir voru í heila- og mænuvökva og komu út úr fjórðu valumferðinni hafa verið ítarlega prófaðir. Næstum allir klónarnir sem prófaðir voru einstaklega reyndist vera auðgaðir í heila- og mænuvökva samanborið við auða samanburðarfög. Eitt peptíðpróf (#2077) var skoðað nánar. Það sýndi lengri helmingunartíma í plasma samanborið við önnur próf (mynd 3d og viðbótarmynd 7), og áhugavert er að þetta peptíð innihélt cysteinleifar á C-endanum. Nýlega hefur verið sýnt fram á að viðbót cysteins við peptíð getur bætt lyfjahvarfaeiginleika þeirra með því að bindast albúmíni 29. Þetta er óþekkt fyrir peptíð #2077 og þarfnast frekari rannsókna. Sum peptíð sýndu gildisháðni í mænuvökvaauðgun (gögn ekki sýnd), sem gæti tengst yfirborðsgeómetríu T7 hylkisins. T7 kerfið sem við notuðum sýndi 5-15 eintök af hverju peptíði í hverri fögaögn. IHC var framkvæmt á mögulegum aðalföguklónum sem sprautaðir voru í bláæð í heilaberki rottna (viðbótarmynd 8). Gögnin sýndu að að minnsta kosti þrír klónar (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) höfðu samskipti við BBB. Það á eftir að ákvarða hvort þessi BBB samskipti leiða til uppsöfnunar mænuvökva eða flutnings þessara klóna beint til BCSFB. Mikilvægt er að við sýnum fram á að valin peptíð halda flutningsgetu sinni í mænuvökva þegar þau eru mynduð og bundin próteinfarminum. Binding N-enda bíótínýleraðra peptíða við SA endurtekur í raun niðurstöðurnar sem fengust með viðkomandi fagaklónum þeirra í blóði og heila- og mænuvökva (Mynd 3e). Að lokum sýnum við fram á að leiðandi peptíð #2077 er fær um að stuðla að heilastarfsemi bíótínýleraðs peptíðhemils BACE1 tengt SA, sem veldur áberandi lyfhrifum í miðtaugakerfinu með því að draga verulega úr Abeta40 magni í mænuvökva (Mynd 4). Við gátum ekki greint neina samsvarandi peptíð í gagnagrunninum með því að framkvæma peptíðraðarlíkindaleit á öllum niðurstöðum. Mikilvægt er að hafa í huga að stærð T7 bókasafnsins er um það bil 109, en fræðileg bókasafnsstærð fyrir 12-mera er 4 x 1015. Þess vegna völdum við aðeins lítinn hluta af fjölbreytileikarými 12-mera peptíðbókasafnsins, sem gæti þýtt að hægt sé að bera kennsl á fleiri bjartsýni peptíð með því að meta aðliggjandi raðrými þessara greindu niðurstaðna. Samkvæmt tilgátu gæti ein af ástæðunum fyrir því að við höfum ekki fundið neina náttúrulega samsvarandi peptíða verið afval í þróunarferlinu til að koma í veg fyrir stjórnlausa innkomu ákveðinna peptíðmynda inn í heilann.
Niðurstöður okkar samanlagt veita grunn að framtíðarvinnu til að bera kennsl á og lýsa flutningskerfum heilaæðahindrunar in vivo nánar. Grunnuppsetning þessarar aðferðar byggist á virknivalsstefnu sem ekki aðeins greinir klóna með bindingareiginleika í heilaæðum, heldur felur einnig í sér mikilvægt skref þar sem vel heppnaðir klónar hafa innri virkni til að fara yfir líffræðilegar hindranir in vivo inn í miðtaugakerfið. Aðferðin er að skýra flutningsferli þessara peptíða og kjör þeirra til að bindast öræðum sem eru sértækar fyrir heilasvæðið. Þetta gæti leitt til uppgötvunar nýrra leiða fyrir flutning blóðþynningarheilans (BH) og viðtaka. Við búumst við að peptíðin sem greind eru geti bundist beint við heilaæðaviðtaka eða við blóðrásarbindla sem fluttir eru í gegnum BH eða BCSFB. Peptíðvigrarnir með flutningsvirkni í heila og mænu sem uppgötvast í þessari vinnu verða rannsakaðir frekar. Við erum nú að rannsaka heilasértækni þessara peptíða með tilliti til getu þeirra til að fara yfir BH og/eða BCSFB. Þessi nýju peptíð verða afar verðmæt verkfæri til mögulegrar uppgötvunar nýrra viðtaka eða ferla og til þróunar nýrra, mjög skilvirkra palla fyrir afhendingu stórsameinda, svo sem líftæknilyfja, til heilans.
Settu inn kanyl í stóru holhólfið (CM) með breytingu á aðferðinni sem áður hefur verið lýst. Svæfðar Wistar rottur (200-350 g) voru settar á stereotaxískt tæki og miðlægur skurður var gerður yfir rakaðan og sótthreinsaðan hársvörð til að afhjúpa höfuðkúpuna. Boraðu tvö göt á svæðinu við efri hylki og festu festingarskrúfurnar í götin. Viðbótar gat var borað í hliðlæga hnakkabeinskammtinn til að leiða ryðfría stálkanylu inn í CM með stereotactic. Settu tannsement í kringum kanyluna og festu hana með skrúfum. Eftir ljósherðingu og sementsherðingu var húðsárinu lokað með 4/0 súpramíð sauma. Rétt staðsetning kanylunnar er staðfest með sjálfkrafa leka á heila- og mænuvökva (CSF). Fjarlægðu rottuna úr stereotaxíska tækinu, fáðu viðeigandi umönnun eftir aðgerð og verkjastillingu og láttu hana jafna sig í að minnsta kosti eina viku þar til merki um blóð sjást í heila- og mænuvökvanum. Wistar rottur (Crl:WI/Han) voru fengnar frá Charles River (Frakklandi). Allar rotturnar voru haldnar við tilteknar sýklafríar aðstæður. Allar dýratilraunir voru samþykktar af dýralæknastofu Baselborgar í Sviss og framkvæmdar í samræmi við dýraleyfisnúmer 2474 (Mat á virkum heilaflutningi með því að mæla magn lækningaefna í heila- og mænuvökva og heila rottna).
Haldið rottunni varlega meðvitaðri með CM-kanúluna í hendinni. Fjarlægið Datura úr kanúlunni og safnið 10 µl af sjálfrennandi heila- og mænuvökva. Þar sem opnun kanúlunnar var að lokum í hættu voru aðeins tær sýni af heila- og mænuvökva, sem ekki voru merki um blóðmengun eða mislitun, tekin með í þessa rannsókn. Samhliða voru um það bil 10–20 µl af blóði tekin úr litlu skurði á oddi halans í rör með heparíni (Sigma-Aldrich). Heila- og mænuvökva og blóði var safnað á ýmsum tímapunktum eftir inndælingu T7-faga í bláæð. Um það bil 5–10 µl af vökva var fargað áður en hvert heila- og mænuvökvasýni var safnað, sem samsvarar dauðarúmmáli leggsins.
Bókasöfn voru búin til með T7Select 10-3b vektornum eins og lýst er í handbók T7Select kerfisins (Novagen, Rosenberg o.fl., InNovations 6, 1-6, 1996). Í stuttu máli var handahófskennd 12-mer DNA innsetning mynduð á eftirfarandi sniði:
NNK kóðonið var notað til að forðast tvöfalda stöðvunarkóða og ofurtjáningu amínósýru í innskotinu. N er handvirkt blandað jafnmólhlutfall hvers núkleótíðs og K er handvirkt blandað jafnmólhlutfall adeníns og cýtósín núkleótíða. Einþátta svæði voru breytt í tvíþátta DNA með frekari ræktun með dNTP (Novagen) og Klenow ensími (New England Biolabs) í Klenow stuðpúða (New England Biolabs) í 3 klukkustundir við 37°C. Eftir viðbrögðin var tvíþátta DNA endurheimt með EtOH útfellingu. DNA-ið sem myndaðist var melt með takmörkunarensímunum EcoRI og HindIII (bæði frá Roche). Klofinn og hreinsaði (QIAquick, Qiagen) innskotið (T4 lígasi, New England Biolabs) var síðan tengt innan ramma í forklofinn T7 vektor eftir amínósýru 348 í 10B kapsíðgeninu. Límingsviðbrögðin voru ræktuð við 16°C í 18 klukkustundir fyrir in vitro pökkun. Fögapökkun in vitro var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum sem fylgja T7Select 10-3b klónunarsettinu (Novagen) og pökkunarlausnin var mögnuð einu sinni til lýsu með Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lýsatin voru skilvinduð, títruð og fryst við -80°C sem stofnlausn af glýseróli.
Bein PCR-fögnun á breytilegum svæðum föga sem magnað er upp í seyði eða plötu með því að nota sérframleidda 454/Roche-amplicon samrunagrunnsræma. Framvirki samrunagrunnsræminn inniheldur raðir sem umlykja breytilegt svæði (NNK) 12 (sértækt fyrir sniðmát), GS FLX Titanium Adapter A og fjögurra basa bókasafnslykilröð (TCAG) (viðbótarmynd 1a):
Öfug samrunagrunnurinn inniheldur einnig bíótín sem er fest við fangperlur og GS FLX títan millistykki B sem þarf til klónamagnunar við emulsíu-PCR:
Amplikonarnir voru síðan gerðir að 454/Roche hitaröðun samkvæmt 454 GS-FLX Titanium samskiptareglunni. Fyrir handvirka Sanger raðgreiningu (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) var T7 faga DNA magnað með PCR og raðgreint með eftirfarandi praimerpörum:
Innskot úr einstökum flekkjum voru PCR-magnuð með Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda). Framkvæmið heitstart (10 mínútur við 95°C) og 35 örvunarlotur (50 sekúndur við 95°C, 1 mínúta við 50°C og 1 mínúta við 72°C).
Fögum úr bókasöfnum, villigerð faga, faga bjargað úr heila- og mænuvökva og blóði, eða einstökum klónum var magnað upp í Escherichia coli BL5615 í berklaseyði (Sigma Aldrich) eða í 500 cm2 skálum (Thermo Scientific) í 4 klst. við 37°C. Fögum var eytt af plötunum með því að skola þær með Tris-EDTA stuðpúða (Fluka Analytical) eða með því að safna flekkjunum með dauðhreinsuðum pípettuoddum. Fögum var einangrað úr ræktunaryfirborði eða útdráttarstuðpúða með einni umferð af pólýetýlen glýkól (PEG 8000) útfellingu (Promega) og enduruppleyst í Tris-EDTA stuðpúða.
Magnaða faganum var fjarlægt í 2-3 umferðir með eiturefnafjarlægingarperlum (Miltenyi Biotec) áður en hann var gefinn í bláæð (IV) (500 μl/dýr). Í fyrstu umferðinni voru 2×1012 fagar settir inn í sýnurnar; í þeirri annarri 2×1010 fagar; í þriðju og fjórðu valumferðinni voru 2×109 fagar á dýr. Fögainnihald í heila- og mænuvökva- og blóðsýnum sem tekin voru á tilgreindum tímapunktum var ákvarðað með talningu plakka samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (handbók T7Select kerfisins). Fögaval var framkvæmt með inndælingu hreinsaðra safna í bláæð í halabláæð eða með endurinndælingu á faga sem unninn var úr heila- og mænuvökva frá fyrri valumferð, og síðari uppskerur voru framkvæmdar eftir 10 mínútur, 30 mínútur, 60 mínútur, 90 mínútur, 120 mínútur, 180 mínútur og 240 mínútur, talið í heila- og mænuvökva- og blóðsýni. Alls voru framkvæmdar fjórar umferðir af in vivo pönnun þar sem tvær valdar greinar voru geymdar sérstaklega og greindar á fyrstu þremur umferðum valsins. Öllum fögainnskotum sem teknar voru úr heila- og mænuvökva úr fyrstu tveimur umferðum valsins var raðgreint handvirkt með 454/Roche hitagreiningu, en öllum klónum sem teknir voru út úr heila- og mænuvökva úr síðustu tveimur umferðum valsins var einnig raðgreint handvirkt með 454/Roche hitagreiningu. Til inndælingar á fögaklónum voru valdir fagar magnaðir upp í E. coli (BL5615) á 500 cm2 plötum við 37°C í 4 klukkustundir. Einstaklingsvaldir og handvirkt raðgreindir klónar voru ræktaðir í berklavökvamiðli. Eftir fögaútdrátt, hreinsun og fjarlægingu innri eiturefna (eins og lýst er hér að ofan) voru 2×1010 fagar/dýr í 300 μl sprautaðir í bláæð í eina halabláæð.
Forvinnsla og eigindleg síun raðgagna. Óunnin 454/Roche gögn voru breytt úr tvíundastaðlaðri straumkortssnið (sff) í Pearson mannalesanlegt snið (fasta) með hugbúnaði frá framleiðanda. Frekari vinnsla á núkleótíðaröðinni var framkvæmd með sérhönnuðum C forritum og forskriftum (óútgefið hugbúnaðarpakki) eins og lýst er hér að neðan. Greining frumgagna felur í sér strangar fjölþrepa síunaraðferðir. Til að sía út lestur sem innihélt ekki gilda 12mer innskots DNA röð, voru lestur raðað í röð við upphafsmerki (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stöðvunarmerki (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) og bakgrunnsinnskot (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) með því að nota alþjóðlega Needleman-Wunsch prófið. Röðun sem leyfir allt að 2 ósamræmi í hverri röðun31. Því voru lestur án upphafs- og stöðvunarmerkja og lestur sem inniheldur bakgrunnsinnskot, þ.e. röðanir sem fara yfir leyfilegan fjölda ósamræmi, fjarlægð úr bókasafninu. Hvað varðar eftirstandandi lestraröðina var N-mer DNA röðin sem nær frá upphafsmerkinu og endar fyrir stöðvunarmerkið skorin út úr upprunalegu lestraröðinni og unnin frekar (hér eftir nefnd „innsetning“). Eftir þýðingu innsetningarinnar er hlutinn eftir fyrsta stöðvunarkóðonið á 5′ enda praimersins fjarlægður úr innsetningunni. Að auki voru núkleótíð sem leiða til ófullkominna kóða á 3′ enda praimersins einnig fjarlægð. Til að útiloka innsetningar sem innihalda aðeins bakgrunnsraðir voru þýddar innsetningar sem byrja á amínósýrumynstrinu „PAG“ einnig fjarlægðar. Peptíð með eftirþýðingarlengd styttri en 3 amínósýrur voru fjarlægð úr bókasafninu. Að lokum var umframmagn í innsetningarlauginni fjarlægt og tíðni hverrar einstakrar innsetningar ákvörðuð. Niðurstöður þessarar greiningar innihéldu lista yfir núkleótíðaraðir (innsetningar) og (lestrar)tíðni þeirra (viðbótarmyndir 1c og 2).
Flokkun N-mer DNA innsetninga eftir raðlíkindum: Til að útrýma 454/Roche-sértækum raðgreiningarvillum (eins og vandamálum með raðgreiningu einsleitra fjölliða framlenginga) og fjarlægja minna mikilvægar umframgildi, eru áður síaðar N-mer DNA raðinnsetningar (innsetningar) flokkaðar eftir líkindum. Innsetningar (allt að 2 ósamsvörun basar leyfðir) með því að nota endurtekna reiknirit sem skilgreint er á eftirfarandi hátt: innsetningar eru fyrst flokkaðar eftir tíðni þeirra (hæsta til lægsta), og ef þær eru eins, eftir aukaröðun þeirra eftir lengd (lengsta til stysta). Þannig skilgreina algengustu og lengstu innsetningarnar fyrsta „hópinn“. Tíðni hópsins er stillt á lykiltíðnina. Síðan var reynt að bæta hverri innsetningu sem eftir var í flokkaða listanum við hópinn með paraðri Needleman-Wunsch röðun. Ef fjöldi ósamræmis, innsetninga eða eyðinga í röðun fer ekki yfir þröskuld 2, er innsetning bætt við hópinn og heildartíðni hópsins er aukin um það hversu oft innsetningin var bætt við. Innsetningar sem bætt er við hóp eru merktar sem notaðar og útilokaðar frá frekari vinnslu. Ef ekki er hægt að bæta innsetningarröðinni við þegar fyrirliggjandi hóp, er innsetningarröðin notuð til að búa til nýjan hóp með viðeigandi innsetningartíðni og merkt sem notuð. Ítrekuninni lýkur þegar hver innsetningarröð hefur annað hvort verið notuð til að mynda nýjan hóp eða hefur verið felld inn í þegar fyrirliggjandi hóp. Þegar öllu er á botninn hvolft eru flokkaðar innsetningar sem samanstanda af núkleótíðum að lokum þýddar í peptíðraðir (peptíðbókasöfn). Niðurstaða þessarar greiningar er safn innsetninga og samsvarandi tíðni þeirra sem mynda fjölda samfelldra lestra (Viðbótarmynd 2).
Myndun mótífa: Byggt á lista yfir einstök peptíð var búið til bókasafn sem innihélt öll möguleg amínósýrumynstur (aa) eins og sýnt er hér að neðan. Hvert mögulegt mynstur af lengd 3 var dregið út úr peptíðinu og öfugt mynstur þess bætt við ásamt sameiginlegu mótífabókasafni sem innihélt öll mynstrin (trípeptíð). Bókasöfn með mjög endurteknum mótífum voru raðgreind og afritun fjarlægð. Síðan, fyrir hvert þrípeptíð í mótífabókasafninu, athuguðum við tilvist þess í bókasafninu með tölvureiknitólum. Í þessu tilviki er tíðni peptíðsins sem inniheldur fundna mótífatrípeptíðið bætt við og úthlutað mótífinu í mótífabókasafninu („fjöldi mótífa“). Niðurstaða myndunar mótífa er tvívíddarfylki sem inniheldur öll tilvik þrípeptíða (mótífa) og viðkomandi gildi þeirra, sem er fjöldi raðlestra sem leiða til samsvarandi mótífs þegar lestrin eru síuð, flokkuð og þýdd. Mæligildi eins og lýst er ítarlega hér að ofan.
Stöðlun fjölda myndefna og samsvarandi dreifingarmyndir: Fjöldi myndefna fyrir hvert úrtak var staðlaður með
þar sem ni er fjöldi lestra sem innihalda viðfangsefni i. Þannig táknar vi prósentu tíðni lestra (eða peptíða) sem innihalda viðfangsefni i í úrtakinu. P-gildi fyrir óstöðluðan fjölda viðfangsefna voru reiknuð með nákvæmnisprófi Fishers. Varðandi fylgnimyndir fjölda viðfangsefna voru Spearman-fylgni reiknaðar með staðluðum fjölda viðfangsefna með R.
Til að sjá fyrir sér innihald amínósýra á hverri stöðu í peptíðasafninu voru veflogógrömm 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) búin til. Fyrst er innihald amínósýra á hverri stöðu 12-mer peptíðsins geymt í 20×12 fylki. Síðan er sett af 1000 peptíðum sem innihalda sama hlutfallslega amínósýruinnihald á hverri stöðu búið til í fasta-raðsniði og sent sem inntak í veflogo 3, sem býr til grafíska framsetningu á hlutfallslegu amínósýruinnihaldi á hverri stöðu fyrir tiltekið peptíðasafn. Til að sjá fyrir sér fjölvíddar gagnasöfn voru hitakort búin til með því að nota innbyggt þróað tól í R (biosHeatmap, R pakki sem enn á eftir að gefa út). Dendrogrammin sem kynnt eru í hitakortunum voru reiknuð með stigveldisþyrpingaraðferð Ward með fjarlægðarmælikvarða Evklíðs. Fyrir tölfræðilega greiningu á mótífsstigunargögnum voru P-gildi fyrir óstöðluð stigagjöf reiknuð með nákvæmnisprófi Fishers. P-gildi fyrir önnur gagnasöfn voru reiknuð í R með því að nota t-próf ​​Student eða ANOVA.
Valdir fagaklónar og fagar án innskota voru sprautaðir í bláæð um halaæð (2×1010 fagar/dýr í 300 μl af PBS). Tíu mínútum fyrir gegndreypi og síðari festingu voru sömu dýrin sprautuð í bláæð með 100 μl af DyLight594-merktum lektíni (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 mínútum eftir fagainndreypingu voru rottur sprautaðar í gegnum hjartað með 50 ml af PBS og síðan með 50 ml af 4% PFA/PBS. Heilasýni voru einnig fest yfir nótt í 4% PFA/PBS og lögð í bleyti í 30% súkrósa yfir nótt við 4°C. Sýnin eru fryst í OCT blöndunni. Ónæmisvefjafræðileg greining á frosnum sýnum var framkvæmd við stofuhita á 30 µm frystisneiðum sem voru blokkaðar með 1% BSA og ræktaðar með fjölklóna FITC-merktum mótefnum gegn T7 faga (Novus NB 600-376A) við 4°C. Ræktað yfir nótt. Að lokum voru sneiðarnar þvegnar þrisvar sinnum með PBS og skoðaðar með confocal leysismásjá (Leica TCS SP5).
Öll peptíð með lágmarkshreinleika 98% voru mynduð með GenScript USA, bíótíneruð og frostþurrkað. Bíótín er bundið með viðbótar þreföldum glýsín millilegg við N-enda. Athugið öll peptíð með massagreiningu.
Streptavidín (Sigma S0677) var blandað saman við 5-falt jafnmólara umframmagn af bíótínýleruðu peptíði, bíótínýleruðu BACE1 hömlunarpeptíði eða blöndu (3:1 hlutfall) af bíótínýleruðu BACE1 hömlunarpeptíði og BACE1 hömlunarpeptíði í 5–10% DMSO/ræktað í PBS. 1 klukkustund við stofuhita fyrir inndælingu. Streptavidín-tengd peptíð voru sprautuð í bláæð í skammti sem nemur 10 mg/kg í eina af halaæðum rottna með heilahol.
Styrkur streptavidín-peptíð fléttna var metinn með ELISA. Nunc Maxisorp örtítraplötur (Sigma) voru húðaðar yfir nótt við 4°C með 1,5 μg/ml músar-streptavidín mótefni (Thermo, MA1-20011). Eftir blokkun (blokkunarlausn: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatín, 1% BSA) við stofuhita í 2 klukkustundir, þvegnar plöturnar með 0,05% Tween-20/PBS (þvottalausn) í 3 sekúndur, heila- og mænuvökva og plasmasýni voru bætt í holur þynntar með blokkunarlausn (plasma 1:10.000, heila- og mænuvökvi 1:115). Platan var síðan ræktuð yfir nótt við 4°C með greiningarmótefni (1 μg/ml, streptavidín-HRP, Novus NB120-7239). Eftir þrjú þvottaskref greindist streptavíðín með ræktun í TMB hvarfefnislausn (Roche) í allt að 20 mínútur. Eftir að litþróun með 1M H2SO4 var stöðvuð, mælt var gleypni við 450 nm.
Virkni streptavíðín-peptíð-BACE1 hemilfléttunnar var metin með Aβ(1-40) ELISA samkvæmt verklagsreglum framleiðanda (Wako, 294-64701). Í stuttu máli voru sýni úr heila- og mænuvökva þynnt í venjulegu þynningarefni (1:23) og ræktuð yfir nótt við 4°C í 96 hols plötum húðuðum með BNT77 mótefni. Eftir fimm þvottaskref var HRP-tengt BA27 mótefni bætt við og ræktað í 2 klukkustundir við 4°C, og síðan fimm þvottaskref. Aβ(1–40) var greint með ræktun í TMB lausn í 30 mínútur við stofuhita. Eftir að litþróun hefur verið stöðvuð með stöðvunarlausn, skal mæla gleypni við 450 nm. Plasmasýni voru útdregin í fastfasa áður en Aβ(1–40) ELISA var framkvæmd. Plasma var bætt við 0,2% DEA (Sigma) í 96 hols plötum og ræktað við stofuhita í 30 mínútur. Eftir að SPE plöturnar (Oasis, 186000679) höfðu verið þvegnar ítrekað með vatni og 100% metanóli, voru plasmasýni bætt á SPE plöturnar og allur vökvi fjarlægður. Sýnin voru þvegin (fyrst með 5% metanóli og síðan 30% metanóli) og skoluð út með 2% NH4OH/90% metanóli. Eftir að skolvökvinn var þurrkaður við 55°C í 99 mínútur við stöðugan N2 straum, voru sýnin afoxuð í stöðluðum þynningarvökvum og Aβ(1–40) var mælt eins og lýst er hér að ofan.
Hvernig á að vitna í þessa grein: Urich, E. o.fl. Flutningur farms til heilans með því að nota flutningspeptíð sem greind voru in vivo. vísindin. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Dreifing stórsameindalyfja til heilans með markvissri meðferð. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., og Martinez-Martinez, P. Flutningur peptíð- og próteinlyfja yfir blóð-heilaþröskuldinn. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blóð-heilaþröskuldurinn: flöskuháls í þróun lyfja í heilanum. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, og Byrd, A. Horfur á bættri lyfjagjöf og markmiðun til heilans um æðuplexus-CSF leiðina. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nútímavæðing líftæknilyfja með sameinda-Trójuhestum til afhendingar í heila. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Flutningur peptíða með WM viðtaka yfir blóð-heilaþröskuldinn. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. o.fl. Auka gegndræpi og virkni meðferðarmótefna í heila með því að nota eingildar sameindaflutninga. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. o.fl. Flutningur transferrínviðtaka (TfR) ákvarðar upptöku heilans á sækniafbrigðum TfR mótefna. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).