Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel se třemi snímky najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet tři snímky najednou nebo pomocí posuvníků na konci můžete procházet tři snímky najednou.
Hematoencefalická bariéra a hematoencefalická bariéra brání bioterapeutickým látkám v dosažení jejich cílů v centrálním nervovém systému, a tím brání účinné léčbě neurologických onemocnění. Abychom objevili nové mozkové transportéry in vivo, zavedli jsme knihovnu fágových peptidů T7 a sériově jsme odebírali krev a mozkomíšní mok (CSF) pomocí kanulovaného modelu krys s velkým množstvím vzorků při vědomí. Specifické fágové klony byly po čtyřech kolech selekčního výběru vysoce obohaceny v CSF. Testování jednotlivých kandidátních peptidů odhalilo více než 1000násobné obohacení v CSF. Bioaktivita peptidem zprostředkovaného podávání do mozku byla potvrzena 40% snížením hladiny amyloidu-β v mozkomíšním moku za použití inhibitoru peptidu BACE1 vázaného na identifikovaný nový tranzitní peptid. Tyto výsledky naznačují, že peptidy identifikované metodami fágové selekční metody in vivo mohou být užitečnými vehikuly pro systémové podávání makromolekul do mozku s terapeutickým účinkem.
Výzkum terapie cílené na centrální nervový systém (CNS) se do značné míry zaměřil na identifikaci optimalizovaných léků a látek, které vykazují vlastnosti cílené na CNS, s menším úsilím vynaloženým na objevování mechanismů, které řídí aktivní podávání léků do mozku. To se nyní začíná měnit, protože podávání léků, zejména velkých molekul, je nedílnou součástí moderního vývoje léků v neurovědách. Prostředí centrálního nervového systému je dobře chráněno cerebrovaskulárním bariérovým systémem, který se skládá z hematoencefalické bariéry (HEB) a hematoencefalické bariéry (HEB)1, což ztěžuje podávání léků do mozku1,2. Odhaduje se, že téměř všechny léky s velkými molekulami a více než 98 % léků s malými molekulami je z mozku eliminováno3. Proto je velmi důležité identifikovat nové transportní systémy mozku, které zajišťují efektivní a specifické podávání terapeutických léků do CNS4,5. HEB a HEB/CSFB však také představují vynikající příležitost pro podávání léků, protože pronikají a vstupují do všech struktur mozku prostřednictvím jeho rozsáhlé vaskulatury. Současné úsilí o využití neinvazivních metod podávání do mozku je tedy z velké části založeno na mechanismu transportu zprostředkovaného receptory (PMT) s využitím endogenního receptoru BBB6. Navzdory nedávným klíčovým pokrokům v oblasti využití dráhy transferinového receptoru7,8 je zapotřebí další vývoj nových systémů podávání s vylepšenými vlastnostmi. Za tímto účelem bylo naším cílem identifikovat peptidy schopné zprostředkovat transport v mozkomíšním moku (CSF), protože by v principu mohly být použity k podávání makromolekul do CNS nebo k otevření nových receptorových drah. Zejména specifické receptory a transportéry cerebrovaskulárního systému (BBB a BSCFB) mohou sloužit jako potenciální cíle pro aktivní a specifické podávání bioterapeutických léčiv. Mozkomíšní mok (CSF) je sekreční produkt choroidálního plexu (CS) a je v přímém kontaktu s intersticiální tekutinou mozku přes subarachnoidální prostor a ventrikulární prostor4. Nedávno bylo prokázáno, že subarachnoidální mozkomíšní mok nadměrně difunduje do intersticia mozku9. Doufáme, že se nám podaří dostat do parenchymálního prostoru pomocí tohoto subarachnoidálního přítokového traktu nebo přímo přes hematoencefalickou bariéru (HBB). Abychom toho dosáhli, implementovali jsme robustní strategii selekce fágů in vivo, která ideálně identifikuje peptidy transportované jednou z těchto dvou odlišných drah.
Nyní popisujeme metodu sekvenčního in vivo screeningu fágového displeje se vzorkováním mozkomíšního moku (CSF) v kombinaci s vysokokapacitním sekvenováním (HTS) pro monitorování počátečních selekčních kol s nejvyšší diverzitou knihovny. Screening byl proveden na bdělých krysách s permanentně implantovanou kanylou velké cisterny (CM), aby se zabránilo kontaminaci krve. Důležité je, že tento přístup vybírá jak peptidy cílící na mozek, tak peptidy s transportní aktivitou přes cerebrovaskulární bariéru. Použili jsme fágy T7 kvůli jejich malé velikosti (~60 nm)10 a naznačili jsme, že jsou vhodné pro transport vezikul, které umožňují transcelulární přechod endoteliální a/nebo epiteliálně-dřeňovou bariérou. Po čtyřech kolech panningu byly izolovány fágové populace, které vykazovaly silné in vivo obohacení CSF a asociaci s mozkovými mikrocévami. Důležité je, že jsme byli schopni potvrdit naše zjištění demonstrací, že preferované a chemicky syntetizované nejlepší kandidátní peptidy jsou schopny transportovat proteinový náklad do mozkomíšního moku. Nejprve byly stanoveny farmakodynamické účinky CNS kombinací vedoucího tranzitního peptidu s inhibitorem peptidu BACE1. Kromě toho, že prokázali, že strategie funkčního screeningu in vivo mohou identifikovat nové peptidy pro transport do mozku jako účinné nosiče proteinového nákladu, očekáváme, že podobné přístupy k funkčnímu výběru se stanou důležitými i při identifikaci nových drah transportu do mozku.
Na základě jednotek tvořících plaky (PFU) byla po kroku fágového balení navržena a vytvořena knihovna náhodných 12merních lineárních fágových peptidů T7 s diverzitou přibližně 109 (viz Materiály a metody). Je důležité poznamenat, že jsme tuto knihovnu před in vivo panningem pečlivě analyzovali. PCR amplifikace vzorků fágových knihoven s použitím modifikovaných primerů generovala amplikony, které byly přímo použitelné pro HTS (doplňkový obrázek 1a). Vzhledem k a) chybám v sekvenování HTS11, b) dopadu na kvalitu primerů (NNK)1-12 a c) přítomnosti fága divokého typu (wt) (skeletové inzerty) v záložní knihovně byl implementován postup filtrování sekvencí pro extrakci pouze ověřených informací o sekvenci (doplňkový obrázek 1b). Tyto kroky filtrování platí pro všechny sekvenční knihovny HTS. Pro standardní knihovnu bylo získáno celkem 233 868 přečtení, z nichž 39 % splnilo kritéria filtru a bylo použito pro analýzu a výběr knihovny pro následná kola (doplňkový obrázek 1c–e). Čtení byla převážně násobky 3 párů bází s vrcholem na 36 nukleotidech (doplňkový obrázek 1c), což potvrzuje design knihovny (NNK) 1-12. Je pozoruhodné, že přibližně 11 % členů knihovny obsahovalo 12rozměrný inzert PAGISRELVDKL s divokým typem (wt) a téměř polovina sekvencí (49 %) obsahovala inzerce nebo delece. HTS knihovny potvrdil vysokou diverzitu peptidů v knihovně: více než 81 % peptidových sekvencí bylo nalezeno pouze jednou a pouze 1,5 % se vyskytovalo v ≥4 kopiích (doplňkový obrázek 2a). Frekvence aminokyselin (aa) na všech 12 pozicích v repertoáru dobře korelovaly s frekvencemi očekávanými pro počet kodonů generovaných degenerovaným repertoárem NKK (doplňkový obrázek 2b). Pozorovaná frekvence zbytků aa kódovaných těmito inzerty dobře korelovala s vypočítanou frekvencí (r = 0,893) (doplňkový obrázek 2c). Příprava fágových knihoven pro injekci zahrnuje kroky amplifikace a odstranění endotoxinu. Bylo dříve prokázáno, že to potenciálně snižuje diverzitu fágových knihoven12,13. Proto jsme sekvenovali fágovou knihovnu amplifikovanou na destičce, která prošla odstraněním endotoxinů, a porovnali ji s původní knihovnou, abychom odhadli frekvenci aminokyselinových aminokyselin (AA). Mezi původním souborem a amplifikovaným a purifikovaným souborem byla pozorována silná korelace (r = 0,995) (doplňkový obrázek 2d), což naznačuje, že konkurence mezi klony amplifikovanými na destičkách s použitím fága T7 nezpůsobila zásadní zkreslení. Toto srovnání je založeno na frekvenci tripeptidových motivů v každé knihovně, protože diverzitu knihoven (~109) nelze plně zachytit ani pomocí HTS. Frekvenční analýza aminokyselinových aminokyselin v každé pozici odhalila malou na poloze závislou zkreslení v posledních třech pozicích zadaného repertoáru (doplňkový obrázek 2e). Závěrem jsme dospěli k závěru, že kvalita a diverzita knihovny byly přijatelné a v důsledku amplifikace a přípravy fágových knihoven mezi několika cykly selekce byly pozorovány pouze drobné změny v diverzitě.
Sériové odběry mozkomíšního moku lze provádět chirurgickou implantací kanyly do mozkomíšního moku bdělých krys, aby se usnadnila identifikace fága T7 injikovaného intravenózně (iv) přes hematologickou bariéru (HBB) a/nebo BCSFB (obr. 1a-b). V prvních třech kolech in vivo selekce jsme použili dvě nezávislá selekční ramena (ramena A a B) (obr. 1c). Postupně jsme zvyšovali přísnost selekce snižováním celkového množství fágu zavedeného v prvních třech kolech selekce. Pro čtvrté kolo panningu jsme zkombinovali vzorky z větví A a B a provedli tři další nezávislé selekce. Pro studium in vivo vlastností fágových částic T7 v tomto modelu byl krysám injikován fág divokého typu (hlavní inzert PAGISRELVDKL) přes ocasní žílu. Získání fágů z mozkomíšního moku a krve v různých časových bodech ukázalo, že relativně malé ikosaedrické fágy T7 měly rychlou počáteční fázi clearance z krevního kompartmentu (doplňkový obr. 3). Na základě podaných titrů a objemu krve potkanů ​​jsme vypočítali, že 10 minut po intravenózní injekci bylo v krvi detekováno pouze přibližně 1 % hmotnostních fágů z podané dávky. Po tomto počátečním rychlém poklesu byla naměřena pomalejší primární clearance s poločasem rozpadu 27,7 minuty. Důležité je, že z mozkomíšního moku bylo získáno jen velmi málo fágů, což naznačuje nízké pozadí pro migraci fágů divokého typu do mozkomíšního moku (doplňkový obrázek 3). V průměru bylo v mozkomíšním moku během celého období odběru vzorků (0-250 min) detekováno pouze asi 1 x 10-3 % titrů fágů T7 v krvi a 4 x 10-8 % původně infundovaných fágů. Je pozoruhodné, že poločas rozpadu (25,7 min) fágů divokého typu v mozkomíšním moku byl podobný poločasu pozorovanému v krvi. Tato data ukazují, že bariéra oddělující mozkomíšní mok od krve je u potkanů ​​s kanylovanou kongenitální mikroklíčovou kulturou neporušená, což umožňuje in vivo selekci fágových knihoven k identifikaci klonů, které jsou snadno transportovány z krve do mozkomíšního moku.
(a) Nastavení metody pro opětovný odběr vzorků mozkomíšního moku (CSF) z velkého množství vzorku. (b) Diagram znázorňující buněčnou lokalizaci bariéry centrálního nervového systému (CNS) a selekční strategii použitou k identifikaci peptidů, které procházejí hematoencefalickou bariérou (HEB) a hematoencefalickou bariérou. (c) Vývojový diagram fágového displeje in vivo. V každém kole selekce byly fágy (identifikátory zvířat uvnitř šipek) injikovány intravenózně. Dvě nezávislé alternativní větve (A, B) jsou uchovávány odděleně až do 4. kola selekce. Pro selekční kola 3 a 4 byl každý fágový klon extrahovaný z CSF manuálně sekvenován. (d) Kinetika fága izolovaného z krve (červené kruhy) a mozkomíšního moku (zelené trojúhelníky) během prvního kola selekce u dvou kanylovaných krys po intravenózní injekci knihovny peptidů T7 (2 x 1012 fágů/zvíře). Modré čtverce označují průměrnou počáteční koncentraci fága v krvi, vypočtenou z množství injikovaného fága, s přihlédnutím k celkovému objemu krve. Černé čtverce označují průsečík osy y extrapolované z koncentrací fágů v krvi. (e,f) Uvádějí relativní frekvenci a distribuci všech možných překrývajících se tripeptidových motivů nalezených v peptidu. Je zobrazen počet motivů nalezených v 1000 měřeních. Signifikantně (p < 0,001) obohacené motivy jsou označeny červenými tečkami. (e) Korelační bodový graf porovnávající relativní frekvenci tripeptidového motivu injektované knihovny s fágem odvozeným z krve od zvířat č. 1.1 a č. 1.2. (f) Korelační bodový graf porovnávající relativní frekvence tripeptidových motivů zvířecích fágů č. 1.1 a č. 1.2 izolovaných v krvi a mozkomíšním moku. (g, h) Reprezentace sekvenčního ID fágu obohaceného krví (g) oproti injektovaným knihovnám a fágu obohacenému mozkomíšním mokem (h) oproti krvi po kole selekce in vivo u obou zvířat. Velikost jednopísmenného kódu udává, jak často se daná aminokyselina vyskytuje v dané pozici. Zelená = polární, fialová = neutrální, modrá = bazická, červená = kyselá a černá = hydrofobní aminokyseliny. Obrázek 1a, b navrhl a vyrobil Eduard Urich.
Dvěma potkanům s chromozomální chromozomální kůrou (klady A a B) jsme injekčně aplikovali knihovnu fágových peptidů a izolovali fág z mozkomíšního moku a krve (obrázek 1d). Počáteční rychlá clearance knihovny byla méně výrazná ve srovnání s fágem divokého typu. Průměrný poločas rozpadu injekčně aplikované knihovny u obou zvířat byl v krvi 24,8 minuty, podobně jako u fága divokého typu, a v mozkomíšním moku 38,5 minuty. Vzorky fágů krve a mozkomíšního moku od každého zvířete byly podrobeny HTS a všechny identifikované peptidy byly analyzovány na přítomnost krátkého tripeptidového motivu. Tripeptidové motivy byly vybrány, protože poskytují minimální základ pro tvorbu struktury a interakce peptid-protein14,15. Zjistili jsme dobrou korelaci v distribuci motivů mezi injekčně aplikovanou fágovou knihovnou a klony extrahovanými z krve obou zvířat (obr. 1e). Data naznačují, že složení knihovny je v krevním kompartmentu obohaceno pouze nepatrně. Frekvence aminokyselin a konsenzuální sekvence byly dále analyzovány v každé poloze pomocí adaptace softwaru Weblogo16. Je zajímavé, že jsme zjistili silné obohacení krve o zbytky glycinu (obr. 1g). Při porovnání krve s klony vybranými z mozkomíšního moku byla pozorována silná selekce a určitá deselekce motivů (obr. 1f) a určité aminokyseliny byly přednostně přítomny na předem určených pozicích v 12členném řetězci (obr. 1h). Je pozoruhodné, že se jednotlivá zvířata významně lišila v mozkomíšním moku, zatímco obohacení krve o glycin bylo pozorováno u obou zvířat (doplňkový obr. 4a–j). Po přísné filtraci sekvenčních dat v mozkomíšním moku zvířat č. 1.1 a č. 1.2 bylo získáno celkem 964 a 420 unikátních 12merních peptidů (doplňkový obr. 1d–e). Izolované fágové klony byly amplifikovány a podrobeny druhému kolu selekce in vivo. Fágy extrahované z druhého kola selekce byly u každého zvířete podrobeny HTS a všechny identifikované peptidy byly použity jako vstup do programu rozpoznávání motivů k analýze výskytu tripeptidových motivů (obr. 2a, b, ef). Ve srovnání s prvním cyklem fága získaného z mozkomíšního moku (CSF) jsme pozorovali další selekci a deselekci mnoha motivů v CSF ve větvích A a B (obr. 2). K určení, zda představují různé vzory konzistentní sekvence, byl použit algoritmus síťové identifikace. Byla pozorována jasná podobnost mezi 12rozměrnými sekvencemi získanými pomocí CSF v alternativním kladu A (obr. 2c, d) a kladu B (obr. 2g, h). Souhrnná analýza v každé větvi odhalila odlišné selekční profily pro 12merní peptidy (doplňkový obr. 5c, d) a zvýšení poměru titrů v CSF/krevi v průběhu času u shromážděných klonů po druhém kole selekce ve srovnání s prvním kolem selekce (doplňkový obr. 5e).
Obohacení motivů a peptidů v mozkomíšním moku dvěma po sobě jdoucími koly in vivo funkční fágové selekce.
Všechny fágy z mozkomíšního moku získané z prvního kola každého zvířete (zvířata č. 1.1 a č. 1.2) byly sloučeny, amplifikovány, HT-sekvenovány a znovu injikovány společně (2 x 1010 fágů/zvíře) dvěma SM kanylovaným krysám (č. 1.1 → č.). 2.1 a 2.2, 1.2 → 2.3 a 2.4). (a,b,e,f) Korelační bodové grafy porovnávající relativní frekvenci tripeptidových motivů všech fágů odvozených z mozkomíšního moku v prvním a druhém kole výběru. Relativní frekvence a distribuce motivů představujících všechny možné překrývající se tripeptidy nalezené v peptidech v obou orientacích. Je zobrazen počet motivů nalezených v 1000 odečtech. Motivy, které byly v jedné z porovnávaných knihoven významně (p < 0,001) selektovány nebo vyloučeny, jsou zvýrazněny červenými tečkami. (c, d, g, h) Znázornění loga sekvence všech sekvencí bohatých na mozkomíšní mok (CSF) o délce 12 aminokyselin na základě 2. a 1. kola selekce in vivo. Velikost jednopísmenného kódu udává, jak často se daná aminokyselina v dané pozici vyskytuje. Pro znázornění loga je porovnána frekvence sekvencí CSF extrahovaných z jednotlivých zvířat mezi dvěma koly selekčních kol a jsou zobrazeny obohacené sekvence ve druhém kole: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4. Nejvíce obohacené aminokyseliny v dané pozici u (c, d) zvířat č. 2.1 a č. 2.2 nebo (g, h) u zvířat č. 2.3 a č. 2.4 jsou zobrazeny barevně. Zelená = polární, fialová = neutrální, modrá = bazická, červená = kyselá a černá = hydrofobní aminokyseliny.
Po třetím kole selekce jsme identifikovali 124 unikátních peptidových sekvencí (č. 3.1 a č. 3.2) z 332 fágových klonů rekonstituovaných v mozkomíšním moku (CSF) izolovaných ze dvou zvířat (doplňkový obr. 6a). Sekvence LGSVS (18,7 %) měla nejvyšší relativní podíl, následovaná inzerty divokého typu PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) a SARGSWREIVSLS (2,2 %). V posledním čtvrtém kole jsme spojili dvě nezávisle vybrané větve ze tří samostatných zvířat (obr. 1c). Z 925 sekvenovaných fágových klonů získaných z CSF jsme ve čtvrtém kole našli 64 unikátních peptidových sekvencí (doplňkový obr. 6b), mezi nimiž relativní podíl fágu divokého typu klesl na 0,8 %. Nejčastějšími klony CSF ve čtvrtém kole byly LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) a RLSSVDSDLSGC (3,2 %). Rozsah délek vybraných peptidů je způsoben inzercemi/delecemi nukleotidů nebo předčasnými stop kodony v primerech knihovny při použití degenerovaných kodonů pro návrh knihovny NNK. Předčasné stop kodony generují kratší peptidy a jsou vybrány, protože obsahují příznivý motiv aminokyseliny (aa). Delší peptidy mohou být výsledkem inzercí/delecí v primerech syntetických knihoven. To umístí navržený stop kodon mimo rámec a načte jej, dokud se neobjeví nový stop kodon za ním. Obecně jsme vypočítali faktory obohacení pro všechna čtyři selekční kola porovnáním vstupních dat s výstupními daty vzorku. Pro první kolo screeningu jsme použili titry fágů divokého typu jako nespecifickou referenční hodnotu pozadí. Je zajímavé, že negativní fágová selekce byla velmi silná v prvním cyklu CSF, ale ne v krvi (obr. 3a), což může být způsobeno nízkou pravděpodobností pasivní difúze většiny členů peptidové knihovny do kompartmentu CSF nebo relativními fágy, které mají tendenci být efektivněji zadržovány nebo odstraňovány z krevního oběhu než bakteriofágy. Ve druhém kole panningu však byla pozorována silná selekce fágů v CSF v obou kladech, což naznačuje, že předchozí kolo bylo obohaceno o fágy vykazující peptidy, které podporují příjem v CSF (obr. 3a). Opět bez významného obohacení krve. Také ve třetím a čtvrtém kole byly fágové klony významně obohaceny v CSF. Porovnáním relativní frekvence každé unikátní peptidové sekvence mezi posledními dvěma koly selekce jsme zjistili, že sekvence byly ve čtvrtém kole selekce ještě obohacenější (obr. 3b). Celkem bylo ze všech 64 unikátních peptidových sekvencí extrahováno 931 tripeptidových motivů s použitím obou peptidových orientací. Nejvíce obohacené motivy ve čtvrtém kole byly podrobněji zkoumány z hlediska jejich profilů obohacení napříč všemi koly ve srovnání s injektovanou knihovnou (hranice: 10% obohacení) (doplňkový obr. 6c). Obecné vzorce selekce ukázaly, že většina studovaných motivů byla obohacena ve všech předchozích kolech obou selekčních větví. Některé motivy (např. SGL, VSG, LGS GSV) však pocházely převážně z alternativní kladu A, zatímco jiné (např. FGW, RTN, WGF, NTR) byly obohaceny v alternativním kladu B.
Validace transportu fágově prezentovaných peptidů obohacených o CSF ​​a biotinylovaných vedoucích peptidů konjugovaných s užitečným zatížením streptavidinu v mozkomíšním moku.
(a) Poměry obohacení vypočítané ve všech čtyřech kolech (R1-R4) na základě titrů injektovaných (vstup = I) fágů (PFU) a stanovených titrů fágů v mozkomíšním moku (výstup = O). Faktory obohacení pro poslední tři kola (R2-R4) byly vypočteny porovnáním s předchozím kolem a prvním kolem (R1) s údaji o hmotnosti. Prázdné sloupce představují mozkomíšní mok, stínované sloupce plazmu. (***p<0,001, na základě Studentova t-testu). (b) Seznam nejhojnějších fágových peptidů, seřazených podle jejich relativního podílu ke všem fágům odebraným v mozkomíšním moku po 4. kole selekce. Šest nejběžnějších fágových klonů je zvýrazněno barevně, očíslováno a jejich faktory obohacení mezi 3. a 4. kolem selekce (vložky). (c,d) Šest nejvíce obohacených fágových klonů, prázdné fágy a knihovny rodičovských fágových peptidů ze 4. kola byly analyzovány jednotlivě v modelu odběru vzorků v mozkomíšním moku. Vzorky mozkomíšního moku a krve byly odebrány v uvedených časových bodech. (c) Stejné množství 6 kandidátních fágových klonů (2 x 1010 fágů/zvířata), prázdných fágů (#1779) (2 x 1010 fágů/zvířata) a zásobních fágových peptidových knihoven (2 x 1012 fágů/zvířata). Kanulovanému zvířeti se samostatně podá injekčně alespoň 3 CM přes ocasní žílu. Je znázorněna farmakokinetika každého injikovaného fágového klonu a fágové peptidové knihovny v mozkomíšním moku v čase. (d) ukazuje průměrný poměr CSF/krev pro všechny získané fágy/ml během doby odběru vzorků. (e) Čtyři syntetické vedoucí peptidy a jeden scrambledovaný kontrolní peptid byly navázány biotinem na streptavidin prostřednictvím jejich N-konce (tetramerový displej) a následně podány injekce (ocasní žíla i.v., 10 mg streptavidinu/kg). Nejméně tři intubované krysy (N = 3). Vzorky mozkomíšního moku (CSF) byly odebrány v uvedených časových bodech a koncentrace streptavidinu byly měřeny pomocí ELISA testu s anti-streptavidinem v CSF (nd = nedetekováno). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na základě ANOVA testu). (f) Porovnání aminokyselinové sekvence nejvíce obohaceného klonu fágového peptidu č. 2002 (fialová) s dalšími vybranými klony fágového peptidu ze 4. kola selekce. Identické a podobné aminokyselinové fragmenty jsou barevně kódovány.
Ze všech obohacených fágů ve čtvrtém kole (obr. 3b) bylo vybráno šest kandidátních klonů pro další individuální analýzu v modelu odběru vzorků mozkomíšního moku (CSF). Třem kanylovaným zvířatům s kongenitální melanocitní kulturou (CM) bylo injikováno stejné množství šesti kandidátních fágových, prázdných fágových (bez inzertu) a profágových peptidových knihoven a farmakokinetika byla stanovena v testech CSF (obr. 3c) a krve (doplňkový obr. 7). Všechny testované fágové klony cílily na kompartment CSF na úrovni 10–1000krát vyšší než u prázdného kontrolního fága (#1779). Například klony #2020 a #2077 měly přibližně 1000krát vyšší titry v CSF než kontrolní fág. Farmakokinetický profil každého vybraného peptidu je odlišný, ale všechny mají vysokou schopnost homingu v CSF. U klonů č. 1903 a 2011 jsme pozorovali neustálý pokles v průběhu času, zatímco u klonů č. 2077, 2002 a 2009 by nárůst během prvních 10 minut mohl naznačovat aktivní transport, ale je třeba jej ověřit. Klony č. 2020, 2002 a 2077 se stabilizovaly na vysokých úrovních, zatímco koncentrace klonu č. 2009 v mozkomíšním moku (CSF) se po počátečním nárůstu pomalu snižovala. Poté jsme porovnali relativní frekvenci každého kandidáta v CSF s jeho koncentrací v krvi (obr. 3d). Korelace průměrného titru každého kandidáta v CSF s jeho titrem v krvi ve všech časech odběru vzorků ukázala, že tři ze šesti kandidátů byly významně obohaceny o krevní CSF. Je zajímavé, že klon č. 2077 vykazoval vyšší stabilitu v krvi (doplňkový obrázek 7). Abychom potvrdili, že samotné peptidy jsou schopny aktivně transportovat jiný náklad než fágové částice do kompartmentu CSF, syntetizovali jsme čtyři vedoucí peptidy derivatizované biotinem na N-konci, kde se peptidy vážou na fágovou částici. Biotinylované peptidy (č. 2002, 2009, 2020 a 2077) byly konjugovány se streptavidinem (SA) za účelem získání multimerních forem do jisté míry napodobujících geometrii fága. Tento formát nám také umožnil měřit expozici SA v krvi a mozkomíšním moku jako proteinových peptidů transportujících náklad. Důležité je, že fágová data bylo možné často reprodukovat, když byly syntetické peptidy podány v tomto formátu konjugovaném s SA (obr. 3e). Míchané peptidy měly menší počáteční expozici a rychlejší clearance z mozkomíšního moku s nedetekovatelnými hladinami do 48 hodin. Abychom získali přehled o drahách doručení těchto peptidových fágových klonů do mozkomíšního moku, analyzovali jsme lokalizaci jednotlivých zásahů fágových peptidů pomocí imunohistochemie (IHC) pro přímou detekci fágových částic 1 hodinu po intravenózní injekci in vivo. Je pozoruhodné, že klony #2002, #2077 a #2009 mohly být detekovány silným barvením v mozkových kapilárách, zatímco kontrolní fág (#1779) a klon #2020 detekovány nebyly (doplňkový obrázek 8). To naznačuje, že tyto peptidy přispívají k účinku na mozek právě křížením hematopoetické bariéry (HBB). Pro ověření této hypotézy je nutná další podrobná analýza, protože může být zapojena i cesta BSCFB. Při porovnání aminokyselinové sekvence nejvíce obohaceného klonu (#2002) s jinými vybranými peptidy bylo zjištěno, že některé z nich mají podobné aminokyselinové prodloužení, což může naznačovat podobný transportní mechanismus (obr. 3f).
Vzhledem ke svému jedinečnému plazmatickému profilu a významnému nárůstu mozkomíšního moku v průběhu času byl fágový klon #2077 dále zkoumán po delší 48hodinovou dobu a byl schopen reprodukovat rychlý nárůst mozkomíšního moku pozorovaný ve spojení s trvalými hladinami sacharózy (obr. 4a). Pokud jde o další identifikované fágové klony, #2077 se silně barvil na mozkové kapiláry a vykazoval významnou kolokalizaci s kapilárním markerem lektinem při pozorování s vyšším rozlišením a pravděpodobně i určité barvení v parenchymálním prostoru (obrázek 4b). Abychom zjistili, zda lze v CNS dosáhnout farmakologických účinků zprostředkovaných peptidy, provedli jsme experiment, ve kterém byly biotinylované verze i) tranzitního peptidu #2077 a ii) inhibitoru BACE1 peptidu smíchány se sacharózou ve dvou různých poměrech. Pro jednu kombinaci jsme použili pouze inhibitor peptidu BACE1 a pro druhou jsme použili poměr 1:3 inhibitoru peptidu BACE1 k peptidu #2077. Oba vzorky byly podány intravenózně a v průběhu času byly měřeny hladiny beta-amyloidního peptidu 40 (Abeta40) v krvi a mozkomíšním moku. Abeta40 byl měřen v mozkomíšním moku, protože odráží inhibici BACE1 v mozkovém parenchymu. Jak se očekávalo, oba komplexy významně snížily hladiny Abeta40 v krvi (obr. 4c, d). Avšak pouze vzorky obsahující směs peptidu č. 2077 a inhibitoru peptidu BACE1 konjugovaného s kyselinou askorbovou (SA) způsobily významný pokles Abeta40 v mozkomíšním moku (obr. 4c). Data ukazují, že peptid č. 2077 je schopen transportovat 60 kDa peptidový protein SA do CNS a také indukuje farmakologické účinky s inhibitory peptidu BACE1 konjugovanými s kyselinou askorbovou.
(a) Klonální injekce (2 × 10 fágů/zvíře) fága T7 ukazující dlouhodobé farmakokinetické profily peptidu CSF č. 2077 (RLSSVDSDLSGC) a neinjikovaného kontrolního fága (č. 1779) u alespoň tří CM-intubovaných krys. (b) Konfokální mikroskopický snímek reprezentativních kortikálních mikrocév u krys s injekcí fágů (2 × 1010 fágů/zvíře) ukazující kontrastní barvení peptidu č. 2077 a cév (lektin). Tyto fágové klony byly podány 3 krysám a ponechány cirkulovat 1 hodinu před perfuzí. Mozky byly nařezány a obarveny polyklonálními protilátkami značenými FITC proti kapsidě fága T7. Deset minut před perfuzí a následnou fixací byl intravenózně podán lektin značený DyLight594. Fluorescenční snímky ukazující barvení lektinem (červeně) luminální strany mikrocév a fágů (zeleně) v lumen kapilár a perivaskulární mozkové tkáně. Měřítko odpovídá 10 µm. (c, d) Biotinylovaný BACE1 inhibiční peptid samostatně nebo v kombinaci s biotinylovaným tranzitním peptidem #2077 byl navázán na streptavidinem a následně podán intravenózní injekcí alespoň třem kanylovaným CM krysám (10 mg streptavidinu/kg). Snížení Aβ40 zprostředkované inhibitorem BACE1 peptidu bylo měřeno pomocí Aβ1-40 ELISA v krvi (červená) a mozkomíšním moku (oranžová) v uvedených časových bodech. Pro lepší přehlednost je na grafu nakreslena tečkovaná čára v měřítku 100 %. (c) Procentuální snížení Aβ40 v krvi (červené trojúhelníky) a mozkomíšním moku (oranžové trojúhelníky) u krys léčených streptavidinem konjugovaným s tranzitním peptidem #2077 a BACE1 inhibičním peptidem v poměru 3:1. (d) Procentuální snížení Aβ40 v krvi (červené kruhy) a mozkomíšním moku (oranžové kruhy) u krys léčených streptavidinem navázaným pouze na BACE1 inhibiční peptid. Koncentrace Aβ v kontrole byla 420 pg/ml (směrodatná odchylka = 101 pg/ml).
Fágový displej byl úspěšně aplikován v několika oblastech biomedicínského výzkumu17. Tato metoda byla použita pro in vivo studie vaskulární diverzity18,19 a také pro studie zaměřené na mozkové cévy20,21,22,23,24,25,26. V této studii jsme rozšířili aplikaci této selekční metody nejen na přímou identifikaci peptidů cílících na mozkové cévy, ale také na objev kandidátů s aktivními transportními vlastnostmi pro překračování hematoencefalické bariéry. Nyní popisujeme vývoj in vivo selekčního postupu u intubovaných krys s kongenitální mozkovou kulturou (CM) a demonstrujeme jeho potenciál identifikovat peptidy s vlastnostmi homingu v mozkomíšním moku (CSF). Pomocí fága T7 zobrazujícího knihovnu 12merních náhodných peptidů jsme byli schopni prokázat, že fág T7 je dostatečně malý (přibližně 60 nm v průměru)10, aby se adaptoval na hematoencefalickou bariéru, a tím přímo překročil hematoencefalickou bariéru nebo chorioideální plexus. Zjistili jsme, že odběr mozkomíšního moku (CSF) z kanulovaných krys CM byl dobře kontrolovanou metodou funkčního screeningu in vivo a že extrahovaný fág se nejen vázal na cévy, ale také fungoval jako transportér přes hematoencefalickou bariéru. Současným odběrem krve a aplikací HTS na CSF a fágy odvozené z krve jsme dále potvrdili, že náš výběr CSF nebyl ovlivněn obohacením krve ani vhodností pro expanzi mezi cykly selekčního procesu. Krevní kompartment je však součástí selekčního postupu, protože fágy schopné dosáhnout kompartmentu CSF musí přežít a cirkulovat v krevním řečišti dostatečně dlouho, aby se obohatily v mozku. Abychom získali spolehlivé informace o sekvenci z nezpracovaných dat HTS, implementovali jsme do analytického pracovního postupu filtry přizpůsobené chybám sekvenování specifickým pro danou platformu. Začleněním kinetických parametrů do screeningové metody jsme potvrdili rychlou farmakokinetiku fágů divokého typu T7 (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 a také jsme stanovili jejich poločas rozpadu v mozkomíšním moku (t½ ~ 26 min) za minutu. Navzdory podobným farmakokinetickým profilům v krvi a mozkomíšním moku bylo v mozkomíšním moku detekováno pouze 0,001 % krevní koncentrace fága, což naznačuje nízkou mobilitu fága divokého typu T7 přes hematoencefalickou bariéru. Tato práce zdůrazňuje důležitost prvního kola selekce při použití strategií panningu in vivo, zejména u fágových systémů, které jsou rychle odstraňovány z oběhu, protože jen málo klonů je schopno dosáhnout kompartmentu CNS. V prvním kole bylo tedy snížení diverzity knihovny velmi velké, protože v tomto velmi striktním modelu CSF byl nakonec shromážděn pouze omezený počet klonů. Tato strategie panningu in vivo zahrnovala několik selekčních kroků, jako je aktivní akumulace v kompartmentu CSF, přežití klonů v krevním kompartmentu a rychlé odstranění klonů fága T7 z krve během prvních 10 minut (obr. 1d a doplňkový obr. 4M). Po prvním kole byly tedy v CSF identifikovány různé fágové klony, ačkoli pro jednotlivá zvířata byl použit stejný počáteční soubor. To naznačuje, že více kroků striktního selekce pro zdrojové knihovny s velkým počtem členů knihovny vede k významnému snížení diverzity. Náhodné události se proto stanou nedílnou součástí počátečního selekčního procesu a výrazně ovlivní výsledek. Je pravděpodobné, že mnoho klonů v původní knihovně mělo velmi podobný sklon k obohacení mozkomíšního moku (CSF). I za stejných experimentálních podmínek se však výsledky selekce mohou lišit v důsledku malého počtu jednotlivých klonů v počátečním souboru.
Motivy obohacené v mozkomíšním moku (CSF) se liší od motivů v krvi. Je zajímavé, že jsme u jednotlivých zvířat zaznamenali první posun směrem k peptidům bohatým na glycin v krvi (obr. 1g, doplňkové obrázky 4e, 4f). Fágy obsahující glycinové peptidy mohou být stabilnější a s menší pravděpodobností vyloučeny z oběhu. Tyto peptidy bohaté na glycin však nebyly detekovány ve vzorcích mozkomíšního moku, což naznačuje, že kurátorované knihovny prošly dvěma různými kroky selekčního výběru: jedním v krvi a druhým, který se nechal akumulovat v mozkomíšním moku. Klony obohacené o CSF, které vznikly ve čtvrtém kole selekčního výběru, byly rozsáhle testovány. Bylo potvrzeno, že téměř všechny jednotlivě testované klony jsou obohaceny o CSF ​​ve srovnání s fágem slepé kontroly. Jeden peptidový zásah (#2077) byl zkoumán podrobněji. Vykazoval delší plazmatický poločas ve srovnání s ostatními zásahy (obrázek 3d a doplňkový obrázek 7) a zajímavé je, že tento peptid obsahoval na C-konci cysteinový zbytek. Nedávno bylo prokázáno, že přidání cysteinu k peptidům může zlepšit jejich farmakokinetické vlastnosti vazbou na albumin 29. Toto je v současné době u peptidu č. 2077 neznámé a vyžaduje další studium. Některé peptidy vykazovaly valenční závislost v obohacení mozkomíšního moku (data nejsou uvedena), což může souviset s zobrazenou geometrií povrchu kapsidy T7. Námi použitý systém T7 vykazoval 5–15 kopií každého peptidu na fágovou částici. IHC byla provedena na kandidátských klonech vedoucích fágů injikovaných intravenózně do mozkové kůry potkanů ​​(doplňkový obrázek 8). Data ukázala, že alespoň tři klony (č. 2002, č. 2009 a č. 2077) interagovaly s hematopoéznou bariérou (HBB). Zbývá určit, zda tato interakce s HBB vede k akumulaci CSF nebo k přesunu těchto klonů přímo do BCSFB. Důležité je, že ukazujeme, že vybrané peptidy si zachovávají svou transportní kapacitu v CSF, když jsou syntetizovány a navázány na proteinový náklad. Vazba N-terminálních biotinylovaných peptidů na SA v podstatě opakuje výsledky získané s jejich příslušnými fágovými klony v krvi a mozkomíšním moku (obr. 3e). Nakonec ukazujeme, že hlavní peptid #2077 je schopen podporovat mozkové působení biotinylovaného peptidového inhibitoru BACE1 konjugovaného se SA, což způsobuje výrazné farmakodynamické účinky v CNS významným snížením hladin Abeta40 v mozkomíšním moku (obr. 4). Nebyli jsme schopni identifikovat žádné homology v databázi provedením vyhledávání homologie peptidové sekvence všech zásahů. Je důležité poznamenat, že velikost knihovny T7 je přibližně 109, zatímco teoretická velikost knihovny pro 12mery je 4 x 1015. Proto jsme vybrali pouze malý zlomek prostoru diverzity knihovny 12merních peptidů, což může znamenat, že optimalizovanější peptidy lze identifikovat vyhodnocením sousedního prostoru sekvencí těchto identifikovaných zásahů. Hypoteticky by jedním z důvodů, proč jsme nenašli žádné přirozené homology těchto peptidů, mohla být deselekce během evoluce, která měla zabránit nekontrolovanému vstupu určitých peptidových motivů do mozku.
Naše výsledky dohromady poskytují základ pro budoucí práci, jejímž cílem je podrobnější identifikaci a charakterizaci transportních systémů cerebrovaskulární bariéry in vivo. Základní nastavení této metody je založeno na strategii funkční selekční strategie, která nejen identifikuje klony s vazebnými vlastnostmi pro mozkové cévy, ale také zahrnuje kritický krok, ve kterém úspěšné klony mají intrinzickou aktivitu pro překračování biologických bariér in vivo do kompartmentu CNS. Cílem je objasnit mechanismus transportu těchto peptidů a jejich preferenci pro vazbu na mikrovaskulaturu specifickou pro oblast mozku. To může vést k objevu nových cest pro transport hematopoetické bariéry (HBB) a receptorů. Očekáváme, že identifikované peptidy se mohou přímo vázat na cerebrovaskulární receptory nebo na cirkulující ligandy transportované přes HBB nebo BCSFB. Peptidové vektory s transportní aktivitou v CSF objevené v této práci budou dále zkoumány. V současné době zkoumáme mozkovou specificitu těchto peptidů z hlediska jejich schopnosti překračovat HBB a/nebo BCSFB. Tyto nové peptidy budou mimořádně cennými nástroji pro potenciální objev nových receptorů nebo drah a pro vývoj nových vysoce účinných platforem pro dodávání makromolekul, jako jsou biologické látky, do mozku.
Velká cisterna (VC) byla kanylována modifikací dříve popsané metody. Anestetizovaní potkani kmene Wistar (200-350 g) byli namontováni na stereotaktický přístroj a přes oholenou a asepticky připravenou pokožku hlavy byl proveden střední řez, aby se odhalila lebka. V oblasti horní části lebky byly vyvrtány dva otvory a do otvorů byly upevněny fixační šrouby. V laterálním okcipitálním hřebenu byl vyvrtán další otvor pro stereotaktické vedení kanyly z nerezové oceli do VC. Kolem kanyly byl nanesen dentální cement a zajištěn šrouby. Po fotopolymeraci a vytvrzení cementu byla kožní rána uzavřena stehem 4/0 supramidu. Správné umístění kanyly je potvrzeno spontánním únikem mozkomíšního moku (CSF). Potkana vyjměte ze stereotaktického přístroje, zajistěte mu odpovídající pooperační péči a léčbu bolesti a nechte ho zotavovat se alespoň jeden týden, dokud se v mozkomíšním moku neobjeví známky krve. Potkani kmene Wistar (Crl:WI/Han) byli získáni od společnosti Charles River (Francie). Všechny krysy byly chovány za specifických podmínek bez patogenů. Všechny experimenty na zvířatech byly schváleny veterinárním úřadem města Basileje ve Švýcarsku a byly provedeny v souladu s licencí pro zvířata č. 2474 (Hodnocení aktivního transportu do mozku měřením hladin terapeutických kandidátů v mozkomíšním moku a mozku krysy).
Jemně udržujte krysu při vědomí s kanylou CM v ruce. Vyjměte durman z kanyly a odeberte 10 µl spontánně tekoucí mozkomíšního moku. Vzhledem k tomu, že průchodnost kanyly byla nakonec narušena, byly do této studie zahrnuty pouze čiré vzorky mozkomíšního moku bez známek kontaminace krví nebo změny barvy. Souběžně bylo z malého řezu na špičce ocasu odebráno přibližně 10–20 μl krve do zkumavek s heparinem (Sigma-Aldrich). Mozkomíšní mok a krev byly odebrány v různých časových bodech po intravenózní injekci fága T7. Před každým odběrem vzorku mozkomíšního moku bylo odstraněno přibližně 5–10 μl tekutiny, což odpovídá mrtvému ​​objemu katétru.
Knihovny byly generovány s použitím vektoru T7Select 10-3b, jak je popsáno v manuálu k systému T7Select (Novagen, Rosenberg a kol., InNovations 6, 1-6, 1996). Stručně řečeno, náhodný 12merní inzert DNA byl syntetizován v následujícím formátu:
Kodon NNK byl použit k zamezení dvojitých stop kodonů a nadměrné exprese aminokyselin v inzertu. N je ručně smíchaný ekvimolární poměr každého nukleotidu a K je ručně smíchaný ekvimolární poměr adeninových a cytosinových nukleotidů. Jednovláknové oblasti byly převedeny na dvouvláknovou DNA další inkubací s dNTP (Novagen) a Klenowovým enzymem (New England Biolabs) v Klenowově pufru (New England Biolabs) po dobu 3 hodin při 37 °C. Po reakci byla dvouvláknová DNA získána precipitací EtOH. Výsledná DNA byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a HindIII (oba od Roche). Rozštěpený a purifikovaný (QIAquick, Qiagen) inzert (T4 ligáza, New England Biolabs) byl poté ligován in-frame do předštěpeného vektoru T7 za aminokyselinou 348 kapsidového genu 10B. Ligační reakce byly inkubovány při 16 °C po dobu 18 hodin před in vitro balením. Balení fágů in vitro bylo provedeno podle pokynů dodaných s klonovací soupravou T7Select 10-3b (Novagen) a balicí roztok byl jednou amplifikován pro lýzu za použití Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lyzáty byly centrifugovány, titrovány a zmrazeny při -80 °C jako zásobní roztok glycerolu.
Přímá PCR amplifikace fágových variabilních oblastí amplifikovaných v bujónu nebo na plotně za použití patentovaných fúzních primerů 454/Roche-amplicon. Primer pro dopřednou fúzi obsahuje sekvence lemující variabilní oblast (NNK) 12 (specifická pro templát), GS FLX Titanium Adapter A a klíčovou sekvenci knihovny se čtyřmi bázemi (TCAG) (doplňkový obrázek 1a):
Primer pro reverzní fúzi obsahuje také biotin připojený k záchytným kuličkám a adaptér GS FLX Titanium Adapter B potřebný pro klonální amplifikaci během emulzní PCR:
Amplikony byly následně podrobeny pyrosekvenování pomocí 454/Roche podle protokolu 454 GS-FLX Titanium. Pro manuální Sangerovo sekvenování (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) byla DNA fága T7 amplifikována pomocí PCR a sekvenována s následujícími páry primerů:
Vložky z jednotlivých plaků byly podrobeny PCR amplifikaci za použití soupravy Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (dle pokynů výrobce). Provedl se horký start (10 min při 95 °C) a 35 boost cyklů (50 s při 95 °C, 1 min při 50 °C a 1 min při 72 °C).
Fágy z knihoven, fágy divokého typu, fágy získané z mozkomíšního moku a krve nebo jednotlivé klony byly amplifikovány v Escherichia coli BL5615 v TB bujónu (Sigma Aldrich) nebo v miskách o objemu 500 cm2 (Thermo Scientific) po dobu 4 hodin při 37 °C. Fágy byly z destiček extrahovány opláchnutím destiček pufrem Tris-EDTA (Fluka Analytical) nebo odběrem plaků sterilními pipetovacími špičkami. Fágy byly izolovány z kultivačního supernatantu nebo extrakčního pufru jedním kolem precipitace polyethylenglykolem (PEG 8000) (Promega) a resuspendovány v pufru Tris-EDTA.
Amplifikovaný fág byl před intravenózní (IV) injekcí (500 μl/zvíře) podroben 2–3 kolům odstranění endotoxinů pomocí kuliček pro odstranění endotoxinů (Miltenyi Biotec). V prvním kole bylo zavedeno 2×1012 fágů; ve druhém 2×1010 fágů; ve třetím a čtvrtém selekčním kole 2×109 fágů na zvíře. Obsah fágů ve vzorcích mozkomíšního moku a krve odebraných v uvedených časových bodech byl stanoven počítáním plaků podle pokynů výrobce (příručka k systému T7Select). Selekce fágů byla provedena intravenózní injekcí purifikovaných knihoven do ocasní žíly nebo opětovnou injekcí fágu extrahovaného z mozkomíšního moku z předchozího selekčního kola a následné odběry byly provedeny po 10 minutách, 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 120 minutách, 180 minutách a 240 minutách ve vzorcích mozkomíšního moku a krve. Celkem byla provedena čtyři kola in vivo panningu, ve kterých byly dvě vybrané větve odděleně uloženy a analyzovány během prvních tří kol selekce. Všechny fágové vložky extrahované z mozkomíšního moku z prvních dvou kol selekce byly podrobeny pyrosekvenování 454/Roche, zatímco všechny klony extrahované z mozkomíšního moku z posledních dvou kol selekce byly sekvenovány manuálně. Všechny krevní fágy z prvního kola selekce byly také podrobeny pyrosekvenování 454/Roche. Pro injekci fágových klonů byly vybrané fágy amplifikovány v E. coli (BL5615) na 500 cm2 plotnách při 37 °C po dobu 4 hodin. Jednotlivě vybrané a ručně sekvenované klony byly množeny v TB médiu. Po extrakci fágů, purifikaci a odstranění endotoxinu (jak je popsáno výše) bylo intravenózně do jedné ocasní žíly injikováno 2×1010 fágů/zvíře ve 300 μl.
Předzpracování a kvalitativní filtrování sekvenčních dat. Nezpracovaná data 454/Roche byla převedena z binárního standardního formátu stream map (sff) do Pearsonova formátu čitelného pro člověka (fasta) pomocí softwaru od dodavatele. Další zpracování nukleotidové sekvence bylo provedeno pomocí proprietárních programů a skriptů v jazyce C (nevydaný softwarový balíček), jak je popsáno níže. Analýza primárních dat zahrnuje striktní vícestupňové filtrační postupy. Pro filtrování čtení, které neobsahovaly platnou 12merní inzertovou sekvenci DNA, byly čtení sekvenčně zarovnána na počáteční značku (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop značku (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) a inzert na pozadí (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) pomocí globálního Needleman-Wunschova testu. zarovnání umožňující až 2 nekonzistence na zarovnání31. Proto byly z knihovny odstraněny čtení bez počátečních a stop značek a čtení obsahující inzerty na pozadí, tj. zarovnání, která překračují povolený počet neshod. Co se týče zbývajících čtení, byla z původní čtené sekvence vystřižena a dále zpracována sekvence N-mer DNA sahající od počáteční značky a končící před stop značkou (dále jen „inzert“). Po translaci inzertu byla z inzertu odstraněna část za prvním stop kodonem na 5′ konci primeru. Dále byly odstraněny nukleotidy vedoucí k neúplným kodonům na 3′ konci primeru. Aby se vyloučily inzerty obsahující pouze sekvence pozadí, byly odstraněny také translatované inzerty začínající aminokyselinovým vzorem „PAG“. Z knihovny byly odstraněny peptidy s posttranslační délkou kratší než 3 aminokyseliny. Nakonec byla odstraněna redundance ve skupině inzertů a stanovena frekvence každého unikátního inzertu. Výsledky této analýzy zahrnovaly seznam nukleotidových sekvencí (inzertů) a jejich (čtených) frekvencí (doplňkové obrázky 1c a 2).
Seskupení N-mer DNA inzertů podle sekvenční podobnosti: Aby se eliminovaly chyby sekvenování specifické pro 454/Roche (například problémy se sekvenováním homopolymerních extenzí) a odstranily méně důležité redundance, jsou předem filtrované N-mer DNA inzerty (inzerty) seřazeny podle podobnosti. inzerce (povoleny jsou až 2 neshodné báze) pomocí iteračního algoritmu definovaného následovně: inzerce jsou seřazeny nejprve podle jejich frekvence (od nejvyšší po nejnižší), a pokud jsou stejné, podle jejich sekundárního seřazení podle délky (od nejdelší po nejkratší). Nejčastější a nejdelší inzerce tedy definují první „skupinu“. Frekvence skupiny je nastavena na klíčovou frekvenci. Poté byla každá inzerce zbývající v seřazeném seznamu pokusena o přidání do skupiny pomocí párového Needleman-Wunschova zarovnání. Pokud počet neshod, inzercí nebo delecí v zarovnání nepřesáhne prahovou hodnotu 2, je do skupiny přidána inzerce a celková frekvence skupiny se zvýší o to, jak často byla inzerce přidána. Inzerty přidané do skupiny jsou označeny jako použité a vyloučeny z dalšího zpracování. Pokud nelze inzertní sekvenci přidat do již existující skupiny, použije se inzertní sekvence k vytvoření nové skupiny s odpovídající frekvencí inzertu a označí se jako použitá. Iterace končí, když je každá inzertní sekvence buď použita k vytvoření nové skupiny, nebo může být zahrnuta do již existující skupiny. Seskupené inzerty sestávající z nukleotidů jsou nakonec přeloženy do peptidových sekvencí (peptidových knihoven). Výsledkem této analýzy je sada inzercí a jejich odpovídajících frekvencí, které tvoří počet po sobě jdoucích čtení (doplňkový obrázek 2).
Generování motivů: Na základě seznamu unikátních peptidů byla vytvořena knihovna obsahující všechny možné aminokyselinové vzory (aa), jak je znázorněno níže. Každý možný vzor o délce 3 byl extrahován z peptidu a jeho inverzní vzor byl přidán spolu se společnou knihovnou motivů obsahující všechny vzory (tripeptidy). Knihovny vysoce repetitivních motivů byly sekvenovány a redundance odstraněna. Poté jsme pro každý tripeptid v knihovně motivů pomocí výpočetních nástrojů zkontrolovali jeho přítomnost v knihovně. V tomto případě je přičtena frekvence peptidu obsahujícího nalezený motiv tripeptid a přiřazena k motivu v knihovně motivů („počet motivů“). Výsledkem generování motivu je dvourozměrné pole obsahující všechny výskyty tripeptidů (motivů) a jejich příslušné hodnoty, což je počet sekvenčních čtení, která vedou k odpovídajícímu motivu, když jsou čtení filtrována, seskupena a přeložena. Metriky jsou podrobně popsány výše.
Normalizace počtu motivů a odpovídajících bodových grafů: Počet motivů pro každý vzorek byl normalizován pomocí
kde ni je počet čtení obsahujících téma i. Vi tedy představuje procentuální frekvenci čtení (nebo peptidů) obsahujících motiv i ve vzorku. P-hodnoty pro nenormalizovaný počet motivů byly vypočteny pomocí Fisherova exaktního testu. Pokud jde o korelogramy počtu motivů, Spearmanovy korelace byly vypočteny pomocí normalizovaného počtu motivů s R.
Pro vizualizaci obsahu aminokyselin v každé pozici v peptidové knihovně byly vytvořeny webové logogramy 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Nejprve je obsah aminokyselin v každé pozici 12merního peptidu uložen v matici 20×12. Poté je sada 1000 peptidů obsahujících stejný relativní obsah aminokyselin v každé pozici vygenerována ve formátu fasta-sequence a poskytnuta jako vstup pro web-logo 3, který generuje grafické znázornění relativního obsahu aminokyselin v každé pozici pro danou peptidovou knihovnu. Pro vizualizaci vícerozměrných datových sad byly vytvořeny tepelné mapy pomocí interně vyvinutého nástroje v jazyce R (biosHeatmap, balíček R, který dosud nebyl vydán). Dendrogramy prezentované v tepelných mapách byly vypočítány pomocí Wardovy hierarchické shlukovací metody s euklidovskou metrikou vzdálenosti. Pro statistickou analýzu dat bodování motivů byly hodnoty P ​​pro nenormalizované bodování vypočítány pomocí Fisherova exaktního testu. P-hodnoty pro ostatní datové sady byly vypočítány v R pomocí Studentova t-testu nebo ANOVA.
Vybrané fágové klony a fágy bez inzertů byly injikovány intravenózně do ocasní žíly (2×1010 fágů/zvíře ve 300 μl PBS). Deset minut před perfuzí a následnou fixací bylo stejným zvířatům intravenózně injikováno 100 μl lektinu značeného DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minut po injekci fágu byly krysy perfuzovány přes srdce 50 ml PBS a následně 50 ml 4% PFA/PBS. Vzorky mozku byly navíc fixovány přes noc ve 4% PFA/PBS a namočené přes noc do 30% sacharózy při 4 °C. Vzorky byly rychle zmrazeny v OCT směsi. Imunohistochemická analýza zmrazených vzorků byla provedena při pokojové teplotě na 30 µm kryořezech blokovaných 1% BSA a inkubovaných s polyklonálními protilátkami značenými FITC proti fágu T7 (Novus NB 600-376A) při 4 °C. Inkubace přes noc. Nakonec byly řezy třikrát promyty PBS a zkoumány konfokálním laserovým mikroskopem (Leica TCS SP5).
Všechny peptidy s minimální čistotou 98 % byly syntetizovány společností GenScript USA, biotinylovány a lyofilizovány. Biotin je vázán prostřednictvím dalšího trojitého glycinového spaceru na N-konci. Všechny peptidy zkontrolujte pomocí hmotnostní spektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) byl smíchán s 5násobným ekvimolárním nadbytkem biotinylovaného peptidu, biotinylovaného inhibičního peptidu BACE1 nebo kombinací (poměr 3:1) biotinylovaného inhibičního peptidu BACE1 a inhibičního peptidu BACE1 v 5–10% DMSO/inkubováno v PBS. Před injekcí byla provedena 1 hodina při pokojové teplotě. Peptidy konjugované se streptavidinem byly injikovány intravenózně v dávce 10 mg/kg do jedné z ocasních žil krys s mozkovou dutinou.
Koncentrace komplexů streptavidin-peptid byla stanovena metodou ELISA. Mikrotitrační destičky Nunc Maxisorp (Sigma) byly přes noc při 4 °C potaženy 1,5 μg/ml myší protilátkou proti streptavidinu (Thermo, MA1-20011). Po blokování (blokovací pufr: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatina, 1% BSA) při pokojové teplotě po dobu 2 hodin byly destičky promyty 0,05% Tween-20/PBS (promývací pufr) po dobu 3 sekund. Do jamek byly přidány vzorky mozkomíšního moku a plazmy zředěné blokovacím pufrem (plazma 1:10 000, mozkomíšní mok 1:115). Destička byla poté inkubována přes noc při 4 °C s detekční protilátkou (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Po třech promytích byl streptavidin detekován inkubací v roztoku substrátu TMB (Roche) po dobu až 20 minut. Po zastavení vývoje barvy pomocí 1M H2SO4 byla změřena absorbance při 450 nm.
Funkce komplexu streptavidin-peptid-inhibitor BACE1 byla hodnocena pomocí ELISA testu Aβ(1-40) dle protokolu výrobce (Wako, 294-64701). Stručně řečeno, vzorky mozkomíšního moku byly zředěny standardním ředidlem (1:23) a inkubovány přes noc při 4 °C v 96jamkových destičkách potažených záchytnou protilátkou BNT77. Po pěti promytích byla přidána protilátka BA27 konjugovaná s HRP a inkubována 2 hodiny při 4 °C, následovalo pět promytí. Aβ(1–40) byl detekován inkubací v roztoku TMB po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Po zastavení vývoje barvy stop roztokem byla změřena absorbance při 450 nm. Vzorky plazmy byly před ELISA testem Aβ(1–40) podrobeny extrakci na pevné fázi. Plazma byla přidána k 0,2% DEA (Sigma) v 96jamkových destičkách a inkubována při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po postupném promytí SPE destiček (Oasis, 186000679) vodou a 100% methanolem byly na SPE destičky přidány vzorky plazmy a veškerá kapalina byla odstraněna. Vzorky byly promyty (nejprve 5% methanolem a poté 30% methanolem) a eluovány 2% NH4OH/90% methanolem. Po sušení eluátu při 55 °C po dobu 99 minut za konstantního proudu N2 byly vzorky redukovány ve standardních ředidlech a Aβ(1–40) byl měřen výše popsaným způsobem.
Jak citovat tento článek: Urich, E. a kol. Doprava nákladu do mozku pomocí tranzitních peptidů identifikovaných in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Dodávání makromolekulárních léčiv do mozku pomocí cílené terapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. a Martinez-Martinez, P. Podávání peptidových a proteinových léčiv přes hematoencefalickou bariéru. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoencefalická bariéra: úzké hrdlo ve vývoji léků pro mozkové funkce. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG a Byrd, A. Perspektivy zlepšeného podávání léků a jejich cílení do mozku cestou choroidálního plexu-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizace biofarmaceutik s využitím molekulárních trojských koní pro podávání do mozku. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorem zprostředkovaný transport peptidů přes hematoencefalickou bariéru. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. a kol. Zvýšení penetrace mozku a účinnosti terapeutických protilátek pomocí monovalentních molekulárních kyvadlových systémů. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. a kol. Transport přes transferinový receptor (TfR) určuje vychytávání afinitních variant protilátek proti TfR v mozku. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).