Tankewol foar jo besite oan Nature.com. Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of Kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útskeakelje). Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Toant in karrousel fan trije dia's tagelyk. Brûk de knoppen Foarige en Folgjende om troch trije dia's tagelyk te gean, of brûk de skúfknoppen oan 'e ein om troch trije dia's tagelyk te gean.
De bloed-harsensbarrière en de bloed-harsensbarrière foarkomme dat bioterapeutyske aginten har doelen yn it sintrale senuwstelsel berikke, wêrtroch't effektive behanneling fan neurologyske sykten hindere wurdt. Om nije harsenstransporters yn vivo te ûntdekken, hawwe wy in T7-faagpeptidebibleteek yntrodusearre en serieel bloed en serebrospinale floeistof (CSF) sammele mei in kanylearre bewust grut poolmodel fan rotten. Spesifike faagklonen waarden nei fjouwer seleksjerûndes tige ferrike yn CSF. Testen fan yndividuele kandidaatpeptiden lieten mear as 1000-fâldige ferriking yn CSF sjen. De bioaktiviteit fan 'e peptide-bemiddelde levering oan' e harsens waard befêstige troch in 40% reduksje yn it nivo fan amyloïde-β yn 'e serebrospinale floeistof mei in BACE1-peptideremmer keppele oan it identifisearre nije transitpeptide. Dizze resultaten suggerearje dat de peptiden identifisearre troch yn vivo faagseleksjemetoaden nuttige ferfiermiddels kinne wêze foar systemyske levering fan makromolekulen oan' e harsens mei in terapeutysk effekt.
Undersyk nei rjochte terapy foar it sintrale senuwstelsel (CNS) hat him foar in grut part rjochte op it identifisearjen fan optimalisearre medisinen en aginten dy't CNS-rjochte eigenskippen fertoane, mei minder ynspanning op it ûntdekken fan 'e meganismen dy't aktive medisynlevering oan 'e harsens oandriuwe. Dit begjint no te feroarjen, om't medisynlevering, benammen grutte molekulen, in yntegraal ûnderdiel is fan 'e moderne ûntwikkeling fan neurowittenskiplike medisinen. De omjouwing fan it sintrale senuwstelsel wurdt goed beskerme troch it serebrovaskulêre barriêresysteem, besteande út 'e bloed-harsensbarrière (BBB) ​​en de bloed-harsensbarrière (BCBB)1, wêrtroch it in útdaging is om medisinen oan 'e harsens te leverjen1,2. Der wurdt rûsd dat hast alle medisinen mei grutte molekulen en mear as 98% fan 'e medisinen mei lytse molekulen út 'e harsens eliminearre wurde3. Dêrom is it tige wichtich om nije harsenstransportsystemen te identifisearjen dy't in effisjinte en spesifike levering fan terapeutyske medisinen oan it CNS leverje4,5. De BBB en BCSFB biede lykwols ek in poerbêste kâns foar medisynlevering, om't se alle struktueren fan 'e harsens penetrearje en yngeane fia syn wiidweidige vaskulatuer. Sa binne de hjoeddeiske ynspanningen om net-invasive metoaden foar levering oan 'e harsens te brûken foar in grut part basearre op it meganisme fan reseptor-bemiddelde transport (PMT) mei de endogene BBB6-reseptor. Nettsjinsteande resinte wichtige foarútgong mei it transferrine-reseptorpaad7,8 is fierdere ûntwikkeling fan nije leveringssystemen mei ferbettere eigenskippen nedich. Hjirfoar wie ús doel om peptiden te identifisearjen dy't by steat binne om CSF-transport te bemiddeljen, om't se yn prinsipe brûkt wurde kinne om makromolekulen oan it CNS te leverjen of om nije reseptorpaden te iepenjen. Yn it bysûnder kinne spesifike reseptors en transporters fan it serebrovaskulêre systeem (BBB en BSCFB) tsjinje as potinsjele doelen foar de aktive en spesifike levering fan bioterapeutyske medisinen. Serebrospinale floeistof (CSF) is in sekretorysk produkt fan 'e choroïde plexus (CS) en is yn direkt kontakt mei de ynterstitiële floeistof fan 'e harsens fia de subarachnoïdale romte en ventrikulêre romte4. Koartlyn is oantoand dat subarachnoïdale serebrospinale floeistof oermjittich diffundearret yn it ynterstitium fan 'e harsens9. Wy hoopje tagong te krijen ta de parenchymale romte mei help fan dit subarachnoïdale ynstreamkanaal of direkt fia de BBB. Om dit te berikken, hawwe wy in robuste in vivo faagseleksjestrategy ymplementearre dy't ideaal peptiden identifisearret dy't troch ien fan dizze twa ûnderskate paden ferfierd wurde.
Wy beskriuwe no in sekwinsjele in vivo faagdisplay-screeningmetoade mei CSF-sampling keppele oan hege trochputsekwinsje (HTS) om earste seleksjerûndes mei de heechste bibleteekferskaat te kontrolearjen. Screening waard útfierd op bewuste rotten mei in permanint ymplantearre grutte cisterna (CM) kanyle om bloedfersmoarging te foarkommen. Wichtich is dat dizze oanpak sawol harsens-rjochte as peptiden selektearret mei transportaktiviteit oer de serebrovaskulêre barriêre. Wy brûkten T7-fagen fanwegen har lytse grutte (~ 60 nm)10 en suggerearren dat se geskikt binne foar it transport fan fesikels dy't transsellulêre krusing fan 'e endotheel- en/of epitheliaal-medulla-barriêre mooglik meitsje. Nei fjouwer rûndes fan panning waarden faagpopulaasjes isolearre dy't sterke in vivo CSF-ferriking en assosjaasje mei serebrale mikrofet sjen lieten. Wichtich is dat wy ús befiningen befêstigje koene troch oan te toanen dat de foarkommende en gemysk synthetisearre bêste kandidaatpeptiden yn steat binne om proteïnelading yn 'e serebrospinale floeistof te ferfieren. Earst waarden de farmakodynamyske effekten fan it sintrale senuwstelsel fêststeld troch it kombinearjen fan in liedend transitpeptide mei in remmer fan it BACE1-peptide. Neist it oantoanen dat yn vivo funksjonele screeningstrategyen nije harsenstransportpeptiden kinne identifisearje as effektive proteïnefrachtdragers, ferwachtsje wy dat ferlykbere funksjonele seleksjebenaderingen ek wichtich wurde by it identifisearjen fan nije harsenstransportpaden.
Op basis fan plaque-foarmjende ienheden (PFU) waard nei de faagferpakkingsstap in bibleteek fan willekeurige 12-mer lineêre T7-faagpeptiden mei in ferskaat fan sawat 109 ûntworpen en makke (sjoch Materialen en Metoaden). It is wichtich om te notearjen dat wy dizze bibleteek sekuer analysearre hawwe foar in vivo panning. PCR-amplifikaasje fan faagbibleteekmonsters mei modifisearre primers generearre amplikons dy't direkt fan tapassing wiene op HTS (Oanfoljende Fig. 1a). Fanwegen a) HTS11-sekwinsjefouten, b) ynfloed op 'e kwaliteit fan primers (NNK)1-12, en c) de oanwêzigens fan wildtype (wt) faag (skeletinserts) yn 'e standby-bibleteek, waard in sekwinsjefilterproseduere ymplementearre om allinich ferifiearre sekwinsje-ynformaasje te ekstrahearjen (Oanfoljende Fig. 1b). Dizze filterstappen jilde foar alle HTS-sekwinsjebibleteken. Foar de standertbibleteek waarden yn totaal 233.868 lêzingen krigen, wêrfan 39% oan 'e filterkritearia foldie en waarden brûkt foar bibleteekanalyse en seleksje foar folgjende rûndes (Oanfoljende Fig. 1c-e). De lêzingen wiene foaral mearfâlden fan 3 basispearen yn lingte mei in pyk by 36 nukleotiden (Oanfoljende Fig. 1c), wat it bibleteekûntwerp (NNK) 1-12 befêstiget. It is opmerklik dat sawat 11% fan 'e bibleteekleden in 12-diminsjonale wild-type (wt) rêchbonke PAGISRELVDKL-ynfoeg befette, en hast de helte fan 'e sekwinsjes (49%) befette ynfoegings of deleasjes. De HTS fan 'e bibleteekbibleteek befêstige de hege ferskaat oan peptiden yn 'e bibleteek: mear as 81% fan 'e peptidesekwinsjes waarden mar ien kear fûn en mar 1,5% kaam foar yn ≥4 kopyen (Oanfoljende Fig. 2a). De frekwinsjes fan aminosoeren (aa) op alle 12 posysjes yn it repertoire korrelearren goed mei de ferwachte frekwinsjes foar it oantal kodons generearre troch it degenerearre NKK-repertoire (Oanfoljende Fig. 2b). De waarnommen frekwinsje fan aa-residuen kodearre troch dizze ynfoegings korrelearren goed mei de berekkene frekwinsje (r = 0,893) (Oanfoljende Fig. 2c). De tarieding fan faagbibleteken foar ynjeksje omfettet de stappen fan amplifikaasje en ferwidering fan endotoxine. Dit is earder oantoand dat it potinsjeel de ferskaat fan faagbibleteken ferminderet12,13. Dêrom hawwe wy in plaat-amplifisearre faagbibleteek sekwinsjearre dy't endotoxineferwidering ûndergien hie en fergelike mei de orizjinele bibleteek om de frekwinsje fan AA te skatten. In sterke korrelaasje (r = 0.995) waard waarnommen tusken de orizjinele pool en de amplifisearre en suvere pool (Oanfoljende Fig. 2d), wat oanjout dat konkurrinsje tusken klonen amplifisearre op platen mei T7-faag gjin grutte bias feroarsake. Dizze fergeliking is basearre op 'e frekwinsje fan tripeptidemotiven yn elke bibleteek, om't de ferskaat fan bibleteken (~ 109) net folslein fêstlein wurde kin, sels mei HTS. Frekwinsje-analyze fan aa op elke posysje liet in lytse posysje-ôfhinklike bias sjen yn 'e lêste trije posysjes fan it ynfierde repertoire (Oanfoljende Fig. 2e). Konklúzjend konkludearren wy dat de kwaliteit en ferskaat fan 'e bibleteek akseptabel wiene en allinich lytse feroaringen yn ferskaat waarden waarnommen fanwegen amplifikaasje en tarieding fan faagbibleteken tusken ferskate seleksjerûndes.
Seriële sampling fan harsensfloeistof kin útfierd wurde troch sjirurgysk in kanyle yn 'e CM fan bewuste rotten te ymplantearjen om de identifikaasje fan T7-faag dy't intraveneus (iv) ynjeksjeare is fia de BBB en/of BCSFB te fasilitearjen (Fig. 1a-b). Wy brûkten twa ûnôfhinklike seleksjearmen (armen A en B) yn 'e earste trije rondes fan in vivo seleksje (Fig. 1c). Wy hawwe de stringensje fan 'e seleksje stadichoan ferhege troch de totale hoemannichte faag dy't yn 'e earste trije rondes fan seleksje ynfierd is te ferminderjen. Foar de fjirde ronde fan panning hawwe wy samples fan tûken A en B kombineare en trije ekstra ûnôfhinklike seleksjes útfierd. Om de in vivo eigenskippen fan T7-faagpartikels yn dit model te bestudearjen, waard wildtype faag (PAGISRELVDKL masterinsert) ynjeksjeare yn rotten fia de sturtader. Herstel fan fagen út harsensfloeistof en bloed op ferskate tiidpunten liet sjen dat relatyf lytse T7 ikosaëdryske fagen in rappe earste klaringfaze hienen út it bloedkompartimint (Oanfoljende Fig. 3). Op basis fan 'e administrearre titers en it bloedvolume fan 'e rotten, hawwe wy berekkene dat mar sawat 1% gewichtsfaag fan 'e administrearre doasis 10 minuten nei intraveneuze ynjeksje yn it bloed waard ûntdutsen. Nei dizze earste rappe delgong waard in stadiger primêre klaring metten mei in healweardetiid fan 27,7 minuten. Wichtich is dat mar in pear fagen út it CSF-kompartimint waarden helle, wat in lege eftergrûn foar migraasje fan wildtypefagen yn it CSF-kompartimint oanjout (Oanfoljende Fig. 3). Gemiddeld waarden mar sawat 1 x 10-3% titers fan T7-faag yn it bloed en 4 x 10-8% fan yn earste ynstânsje ynfusearre fagen yn 'e serebrospinale floeistof ûntdutsen oer de heule samplingperioade (0-250 min). It is opmerklik dat de healweardetiid (25,7 min) fan wildtypefaag yn serebrospinale floeistof fergelykber wie mei dy waarnommen yn bloed. Dizze gegevens litte sjen dat de barriêre dy't it CSF-kompartimint fan it bloed skiedt yntakt is yn CM-kanulearre rotten, wêrtroch't in vivo seleksje fan faagbibleteken mooglik is om klonen te identifisearjen dy't maklik fan it bloed nei it CSF-kompartimint transportearre wurde.
(a) Ynstellen fan in metoade foar it opnij samplen fan serebrospinale floeistof (CSF) út in grutte pool. (b) Diagram dat de sellulêre lokaasje fan 'e sintrale senuwstelsel (CNS) barriêre sjen lit en de seleksjestrategy dy't brûkt wurdt om peptiden te identifisearjen dy't de bloed-harsensbarriêre (BBB) ​​en de bloed-harsensbarriêre oerstekke. (c) Flowchart foar in vivo faagdisplayscreening. Yn elke seleksjeronde waarden fagen (dieridentifikatoaren binnen de pylken) intraveneus ynjektearre. Twa ûnôfhinklike alternative tûken (A, B) wurde apart hâlden oant de 4e seleksjeronde. Foar seleksjerondes 3 en 4 waard elke faagkloon dy't út CSF ekstrahearre waard, mei de hân sekwinsjearre. (d) Kinetyk fan faag isolearre út bloed (reade sirkels) en serebrospinale floeistof (griene trijehoeken) tidens de earste seleksjeronde yn twa kanulearre rotten nei intraveneuze ynjeksje fan 'e T7-peptidebibleteek (2 x 1012 fagen/dier). Blauwe fjouwerkanten jouwe de gemiddelde begjinkonsintraasje fan faag yn it bloed oan, berekkene út 'e hoemannichte ynjektearre faag, rekken hâldend mei it totale bloedvolume. De swarte fjouwerkanten jouwe it snijpunt oan fan 'e y-line ekstrapolearre út bloedfaagkonsintraasjes. (e,f) Presintearje de relative frekwinsje en ferdieling fan alle mooglike oerlappende tripeptidemotiven fûn yn it peptide. It oantal motiven fûn yn 1000 lêzingen wurdt werjûn. Signifikant (p < 0.001) binne ferrike motiven markearre mei reade stippen. (e) Korrelaasje-spriedingsdiagram dat de relative frekwinsje fan it tripeptidemotief fan 'e ynjeksjeare bibleteek fergeliket mei bloed-ôflaatte faag fan bisten #1.1 en #1.2. (f) Korrelaasje-spriedingsdiagram dat de relative frekwinsjes fan dierfaag-tripeptidemotiven #1.1 en #1.2 fergeliket isolearre yn bloed en harsenfloeistof. (g, h) Sekwinsje-ID-representaasje fan faag ferrike yn bloed (g) versus ynjeksjeare bibleteken en faag ferrike yn CSF (h) versus bloed nei in ronde fan in vivo seleksje yn beide bisten. De grutte fan 'e ien-letterkoade jout oan hoe faak dat aminosoer op dy posysje foarkomt. Grien = poal, pears = neutraal, blau = basisch, read = soer en swart = hydrofobe aminosoeren. Figuer 1a, b is ûntwurpen en produsearre troch Eduard Urich.
Wy hawwe in faagpeptidebibleteek yn twa CM-ynstrumintrotten ynjektearre (kladen A en B) en faag isolearre út serebrospinale floeistof en bloed (figuer 1d). De earste rappe klaring fan 'e bibleteek wie minder útsprutsen yn ferliking mei de wildtypefaag. De gemiddelde healweardetiid fan 'e ynjektearre bibleteek yn beide bisten wie 24,8 minuten yn bloed, fergelykber mei wildtypefaag, en 38,5 minuten yn CSF. Bloed- en serebrospinale floeistoffaagmonsters fan elk bist waarden ûnderwurpen oan HTS en alle identifisearre peptiden waarden analysearre op 'e oanwêzigens fan in koart tripeptidemotief. Tripeptidemotiven waarden keazen om't se in minimale basis leverje foar struktuerfoarming en peptide-proteïne-ynteraksjes14,15. Wy fûnen in goede korrelaasje yn 'e ferdieling fan motiven tusken de ynjektearre faagbibleteek en klonen dy't ekstrahearre binne út it bloed fan beide bisten (figuer 1e). De gegevens jouwe oan dat de gearstalling fan 'e bibleteek mar marzjinaal ferrike is yn it bloedkompartimint. Aminosoerfrekwinsjes en konsensussekwinsjes waarden fierder analysearre op elke posysje mei in oanpassing fan 'e Weblogo16-software. Nijsgjirrich is dat wy in sterke ferriking fûnen yn bloedglycineresiduen (Fig. 1g). Doe't bloed fergelike waard mei klonen selektearre út CSF, waarden sterke seleksje en wat deseleksje fan motiven waarnommen (Fig. 1f), en bepaalde aminosoeren wiene by foarkar oanwêzich op foarôf bepaalde posysjes yn 'e 12-lid (Fig. 1h). Opmerklik wie dat yndividuele bisten signifikant ferskillen yn serebrospinale floeistof, wylst bloedglycinferriking waard waarnommen yn beide bisten (Oanfoljende Fig. 4a-j). Nei strang filterjen fan sekwinsjegegevens yn 'e serebrospinale floeistof fan bisten #1.1 en #1.2, waarden yn totaal 964 en 420 unike 12-mer peptiden krigen (Oanfoljende Fig. 1d-e). De isolearre faagklonen waarden amplifisearre en ûnderwurpen oan in twadde ronde fan in vivo seleksje. Faag ekstrahearre út 'e twadde ronde fan seleksje waarden ûnderwurpen oan HTS yn elk bist en alle identifisearre peptiden waarden brûkt as ynput foar in motiefherkenningsprogramma om it foarkommen fan tripeptidemotiven te analysearjen (Fig. 2a, b, ef). Yn ferliking mei de earste syklus fan 'e faag dy't weromhelle is út CSF, hawwe wy fierdere seleksje en deseleksje fan in protte motiven yn CSF waarnommen yn tûken A en B (Ofb. 2). In netwurkidentifikaasje-algoritme waard tapast om te bepalen oft se ferskillende patroanen fan konsekwinte sekwinsje fertsjintwurdigen. In dúdlike oerienkomst waard waarnommen tusken de 12-diminsjonale sekwinsjes dy't weromhelle waarden troch CSF yn alternative klade A (Ofb. 2c, d) en klade B (Ofb. 2g, h). De gearfoege analyze yn elke tûke liet ferskillende seleksjeprofilen sjen foar 12-mer peptiden (Oanfoljende Ofb. 5c, d) en in tanimming fan 'e CSF/bloedtiterferhâlding oer tiid foar gearfoege klonen nei de twadde seleksjeronde yn ferliking mei de earste seleksjeronde (Oanfoljende Ofb. 5e).
Ferriking fan motiven en peptiden yn serebrospinale floeistof troch twa opienfolgjende rûndes fan yn vivo funksjonele faagdisplayseleksje.
Alle fagen út 'e harsensfloeistof dy't út 'e earste ronde fan elk bist helle waarden (bisten #1.1 en #1.2) waarden byinoar brocht, amplifisearre, HT-sekwinsjearre en opnij ynjeksjeare (2 x 1010 fagen/bist) 2 SM-kanulearre rotten (#1.1 → #). 2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4). (a, b, e, f) Korrelaasje-spriedingsdiagrammen dy't de relative frekwinsje fan tripeptidemotiven fan alle CSF-ôflaatte fagen yn 'e earste en twadde seleksjerûnde fergelykje. Relative frekwinsje en ferdieling fan motiven dy't alle mooglike oerlappende tripeptiden fertsjintwurdigje dy't fûn binne yn peptiden yn beide oriïntaasjes. It oantal motiven fûn yn 1000 lêzingen wurdt werjûn. Motiven dy't signifikant (p < 0.001) selektearre of útsletten waarden yn ien fan 'e fergelike bibleteken binne markearre mei reade stippen. (c, d, g, h) Sekwinsjelogo-werjefte fan alle CSF-rike 12-aminosoer lange sekwinsjes basearre op rûndes 2 en 1 fan in vivo seleksje. De grutte fan 'e ien-letterkoade jout oan hoe faak dat aminosoer op dy posysje foarkomt. Om it logo te fertsjintwurdigjen, wurdt de frekwinsje fan CSF-sekwinsjes dy't út yndividuele bisten helle binne tusken twa seleksjerûndes fergelike en wurde de ferrike sekwinsjes yn 'e twadde rûnde werjûn: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4. De meast ferrike aminosoeren op in bepaalde posysje yn (c, d) bisten nr. 2.1 en nr. 2.2 of (g, h) yn bisten nr. 2.3 en nr. 2.4 wurde yn kleur werjûn. Grien = poal, pears = neutraal, blau = basisch, read = soer en swart = hydrofobe aminosoeren.
Nei de tredde seleksjeronde identifisearren wy 124 unike peptidesekwinsjes (#3.1 en #3.2) fan 332 CSF-rekonstituearre faagklonen isolearre fan twa bisten (Oanfoljende Fig. 6a). De sekwinsje LGSVS (18,7%) hie it heechste relative oanpart, folge troch de wildtype-ynfoegsels PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), en SARGSWREIVSLS (2,2%). Yn 'e lêste fjirde ronde hawwe wy twa ûnôfhinklik selektearre tûken fan trije aparte bisten gearfoege (Fig. 1c). Fan 'e 925 sekwinsjearre faagklonen dy't weromfûn binne út CSF, fûnen wy yn 'e fjirde ronde 64 unike peptidesekwinsjes (Oanfoljende Fig. 6b), wêrfan it relative oanpart fan wildtype-faag sakke nei 0,8%. De meast foarkommende CSF-klonen yn 'e fjirde ronde wiene LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) en RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). It lingteberik fan 'e selektearre peptiden is te tankjen oan nukleotiden-ynfoegings/deleasjes of te betiid stopkodons yn 'e bibleteekprimers by it brûken fan degenerearre kodons foar NNK-bibleteekûntwerp. Te betiid stopkodons generearje koartere peptiden en wurde selektearre om't se it geunstige aa-motyf befetsje. Langere peptiden kinne it gefolch wêze fan ynfoegings/deleasjes yn 'e primers fan 'e synthetyske bibleteken. Dit posysjonearret it ûntworpen stopkodon bûten it frame en lêst it oant in nij stopkodon streamôfwerts ferskynt. Yn 't algemien hawwe wy ferrikingsfaktoaren berekkene foar alle fjouwer seleksjerûndes troch de ynfiergegevens te fergelykjen mei de stekproefútfiergegevens. Foar de earste screeningsronde hawwe wy wildtype faagtiters brûkt as in net-spesifike eftergrûnreferinsje. Nijsgjirrich is dat negative faagseleksje tige sterk wie yn 'e earste CSF-syklus, mar net yn it bloed (Fig. 3a), wat mooglik te tankjen is oan 'e lege kâns op passive diffúzje fan 'e measte leden fan 'e peptidebibleteek yn it CSF-kompartimint, of relative fagen wurde effisjinter bewarre of fuorthelle út 'e bloedstream as bakteriofagen. Yn 'e twadde ronde fan panning waard lykwols in sterke seleksje fan fagen yn CSF waarnommen yn beide klades, wat suggerearret dat de foarige ronde ferrike wie mei fagen dy't peptiden werjaan dy't CSF-opname befoarderje (Fig. 3a). Wer sûnder wichtige bloedferriking. Ek yn 'e tredde en fjirde ronde wiene de faagklonen signifikant ferrike mei CSF. By it fergelykjen fan 'e relative frekwinsje fan elke unike peptidesekwinsje tusken de lêste twa rondes fan seleksje, fûnen wy dat de sekwinsjes noch mear ferrike wiene yn 'e fjirde ronde fan seleksje (Fig. 3b). In totaal fan 931 tripeptidemotiven waarden ekstrahearre út alle 64 unike peptidesekwinsjes mei beide peptidoriïntaasjes. De meast ferrike motiven yn 'e fjirde ronde waarden nauwer ûndersocht op har ferrikingsprofilen oer alle rondes yn ferliking mei de ynjeksjeare bibleteek (ôfsnijpunt: 10% ferriking) (Oanfoljende Fig. 6c). Algemiene seleksjepatroanen lieten sjen dat de measte fan 'e bestudearre motiven ferrike wiene yn alle foargeande rondes fan beide seleksjetakken. Guon motiven (bygelyks SGL, VSG, LGS GSV) wiene lykwols foaral fan alternative klade A, wylst oaren (bygelyks FGW, RTN, WGF, NTR) ferrike wiene yn alternative klade B.
Falidaasje fan CSF-transport fan CSF-ferrike faag-werjûne peptiden en biotinylearre liederpeptiden konjugearre oan streptavidine-payloads.
(a) Ferrikingsferhâldingen berekkene yn alle fjouwer rûndes (R1-R4) basearre op ynjeksjeare (ynfier = I) faag (PFU) titers en bepaalde CSF faag titers (útfier = O). Ferrikingsfaktoaren foar de lêste trije rûndes (R2-R4) waarden berekkene troch fergeliking mei de foarige rûnde en de earste rûnde (R1) mei gewichtsgegevens. Iepen balken binne harsenfloeistof, skaad balken binne plasma. (***p<0.001, basearre op Student's t-test). (b) List fan 'e meast foarkommende faagpeptiden, rangearre neffens har relative ferhâlding ta alle fagen dy't sammele binne yn CSF nei rûnde 4 fan seleksje. De seis meast foarkommende faagklonen binne markearre yn kleur, nûmere en har ferrikingsfaktoaren tusken rûndes 3 en 4 fan seleksje (ynfoegsels). (c,d) De seis meast ferrike faagklonen, lege faag- en âlderlike faagpeptidebibleteken fan rûnde 4 waarden yndividueel analysearre yn in CSF-samplingmodel. CSF- en bloedmonsters waarden sammele op 'e oanjûne tiidpunten. (c) Gelike hoemannichten fan 6 kandidaat-faagklonen (2 x 1010 fagen/dieren), lege fagen (#1779) (2 x 1010 fagen/dieren) en stockfaagpeptidebibleteken (2 x 1012 fagen/dieren). Ynjeksje fan teminsten 3 CM wurdt apart fia de sturtader oan it kanulearre bist tadien. De CSF-farmakokinetika fan elke ynjeksjeare faagkloon en faagpeptidebibleteek oer tiid wurdt werjûn. (d) lit de gemiddelde CSF/bloedferhâlding sjen foar alle weromwûne fagen/mL oer de samplingtiid. (e) Fjouwer syntetyske liederpeptiden en ien scrambled kontrôle waarden mei biotine keppele oan streptavidine fia har N-terminus (tetrameerdisplay) folge troch ynjeksje (sturtader iv, 10 mg streptavidine/kg). Teminsten trije yntubearre rotten (N = 3). CSF-samples waarden sammele op 'e oanjûne tiidpunten en streptavidine-konsintraasjes waarden metten troch CSF-anti-streptavidine ELISA (nd = net detektearre). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, basearre op ANOVA-test). (f) Ferliking fan 'e aminosoersekwinsje fan 'e meast ferrike faagpeptidekloon #2002 (pears) mei oare selektearre faagpeptidekloonen út 'e 4e seleksjeronde. Identike en ferlykbere aminosoerfragminen binne kleurkodearre.
Fan alle ferrike fagen yn 'e fjirde ronde (Fig. 3b) waarden seis kandidaat-klonen selektearre foar fierdere yndividuele analyze yn it CSF-samplingmodel. Gelike hoemannichten fan seis kandidaat-faag-, lege faag- (gjin ynfoegsel) en profaag-peptidebibleteken waarden ynjektearre yn trije kannulearre CM-bisten, en de farmakokinetika waarden bepaald yn CSF- (Fig. 3c) en bloed- (Oanfoljende Fig. 7) assays. Alle testen faagklonen rjochten har op it CSF-kompartimint op in nivo dat 10-1000 kear heger wie as dat fan 'e lege kontrôlefaag (#1779). Bygelyks, klonen #2020 en #2077 hienen sawat 1000 kear hegere CSF-titers as kontrôlefaag. It farmakokinetyske profyl fan elk selektearre peptide is oars, mar se hawwe allegear in hege CSF-homing-fermogen. Wy seagen in konstante ôfname oer tiid foar klonen #1903 en #2011, wylst foar klonen #2077, #2002 en #2009 in tanimming yn 'e earste 10 minuten aktyf transport oanjaan kin, mar moat ferifiearre wurde. Klonen #2020, #2002 en #2077 stabilisearren har op hege nivo's, wylst de CSF-konsintraasje fan kloon #2009 stadich ôfnaam nei de earste tanimming. Wy fergelike doe de relative frekwinsje fan elke CSF-kandidaat mei syn bloedkonsintraasje (Fig. 3d). De korrelaasje fan 'e gemiddelde titer fan elke CSF-kandidaat mei syn bloedtiter op alle samplingtiden liet sjen dat trije fan 'e seis kandidaten signifikant ferrike wiene yn bloed-CSF. Nijsgjirrich is dat kloon #2077 in hegere bloedstabiliteit liet sjen (Oanfoljende figuer 7). Om te befêstigjen dat de peptiden sels by steat binne om oare lading as faagdieltsjes aktyf te ferfieren yn it CSF-kompartimint, hawwe wy fjouwer liederpeptiden synthetisearre dy't derivatisearre binne mei biotine oan 'e N-terminus dêr't de peptiden oan it faagdieltsje hechtsje. Biotinylearre peptiden (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) waarden konjugearre mei streptavidine (SA) om multimere foarmen te krijen dy't de faaggeometry wat neimakken. Dit formaat liet ús ek ta om SA-eksposysje yn bloed en harsensfloeistof te mjitten as frachttransportearjende proteïnepeptiden. Wichtich is dat faaggegevens faak reprodusearre wurde koene doe't syntetyske peptiden waarden administreare yn dit SA-konjugearre formaat (Fig. 3e). De mingde peptiden hienen minder earste eksposysje en rapper CSF-klaring mei net-detektearbere nivo's binnen 48 oeren. Om ynsjoch te krijen yn 'e leveringspaden fan dizze peptidefaagklonen yn' e CSF-romte, hawwe wy de lokalisaasje fan yndividuele faagpeptidetreffers analysearre mei immunohistochemy (IHC) om faagdieltsjes 1 oere nei intraveneuze ynjeksje yn vivo direkt te detektearjen. It is opmerklik dat klonen #2002, #2077, en #2009 ûntdutsen wurde koene troch sterke kleuring yn harsenskapillaren, wylst kontrôlefaag (#1779) en kloon #2020 net ûntdutsen waarden (Oanfoljende figuer 8). Dit suggerearret dat dizze peptiden bydrage oan it effekt op 'e harsens krekt troch de BBB te oerstekken. Fierdere detaillearre analyze is nedich om dizze hypoteze te testen, om't de BSCFB-rûte ek belutsen wêze kin. By it fergelykjen fan 'e aminosoersekwinsje fan' e meast ferrike kloon (#2002) mei oare selektearre peptiden, waard opmurken dat guon fan harren ferlykbere aminosoerútwreidings hawwe, wat in ferlykber transportmeganisme kin oanjaan (Fig. 3f).
Fanwegen syn unike plasmaprofyl en wichtige tanimming fan CSF oer tiid, waard faagdisplaykloon #2077 fierder ûndersocht oer in langere perioade fan 48 oeren en koe de rappe tanimming fan CSF reprodusearje dy't waarnommen waard yn ferbân mei oanhâldende SA-nivo's (Fig. 4a). Oangeande oare identifisearre faagklonen kleurde #2077 sterk foar harsenskapillaren en liet wichtige kolokalisaasje sjen mei kapillêr markerlektine by hegere resolúsje en mooglik wat kleuring yn 'e parenchymale romte (Figuer 4b). Om te ûndersykjen oft peptide-bemiddelde farmakologyske effekten koene wurde krigen yn it CNS, hawwe wy in eksperimint útfierd wêryn biotinylearre ferzjes fan i) it #2077 transitpeptide en ii) it BACE1-remmerpeptide waarden mingd mei SA yn twa ferskillende ferhâldingen. Foar ien kombinaasje brûkten wy allinich de BACE1-peptideremmer en foar de oare brûkten wy in 1:3 ferhâlding fan BACE1-peptideremmer ta #2077-peptide. Beide samples waarden intraveneus administrearre en bloed- en harsenfloeistofnivo's fan beta-amyloïde peptide 40 (Abeta40) waarden oer tiid metten. Abeta40 waard metten yn CSF, om't it BACE1-ynhibysje yn it harsenparenchym reflektearret. Lykas ferwachte, fermindere beide kompleksen de bloednivo's fan Abeta40 signifikant (Fig. 4c, d). Allinich samples mei in mingsel fan peptide nr. 2077 en in ynhibitor fan it BACE1-peptide konjugearre oan SA feroarsaken lykwols in signifikante ôfname fan Abeta40 yn 'e harsenfloeistof (Fig. 4c). De gegevens litte sjen dat peptide nr. 2077 yn steat is om it 60 kDa SA-proteïne yn it sintrale senuwstelsel te transportearjen en ek farmakologyske effekten ynducearret mei SA-konjugearre ynhibitoren fan it BACE1-peptide.
(a) Klonale ynjeksje (2 × 10 fagen/dier) fan T7-faag dy't lange-termyn farmakokinetyske profilen fan CSF-peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) en net-ynjeksjeare kontrôlefaag (#1779) sjen lit yn teminsten trije CM-yntubearre rotten. (b) Konfokale mikroskopyske ôfbylding fan represintative kortikale mikrofetten yn faag-ynjeksjeare rotten (2 × 10 10 fagen/dier) dy't tsjinkleuring fan peptide #2077 en fetten (lektine) sjen lit. Dizze faagklonen waarden oan 3 rotten administrearre en 1 oere foar perfúzje litten sirkulearje. Harsens waarden yn seksjes snien en kleurd mei polyklonale FITC-labelde antistoffen tsjin de T7-faagkapside. Tsien minuten foar perfúzje en folgjende fiksaasje waard DyLight594-labelde lektine intraveneus administrearre. Fluoreszinte ôfbyldings dy't lektinekleuring (read) fan 'e luminale kant fan mikrofetten en fagen (grien) yn it lumen fan kapillaren en perivaskulêr harsensweefsel sjen litte. De skaalbalke komt oerien mei 10 µm. (c, d) Biotinylearre BACE1-remmende peptide allinnich of yn kombinaasje mei biotinylearre transitpeptide #2077 waard keppele oan streptavidine, folge troch intraveneuze ynjeksje fan teminsten trije kanulearre CM-rotten (10 mg streptavidine/kg). BACE1-peptideremmer-mediearre reduksje yn Aβ40 waard metten troch Aβ1-40 ELISA yn bloed (read) en harsenfloeistof (oranje) op 'e oanjûne tiidpunten. Foar bettere dúdlikens is in stippele line tekene op 'e grafyk op in skaal fan 100%. (c) Persintaazje reduksje yn Aβ40 yn bloed (reade trijehoeken) en harsenfloeistof (oranje trijehoeken) yn rotten behannele mei streptavidine konjugearre oan transitpeptide #2077 en BACE1-remmende peptide yn in 3:1 ferhâlding. (d) Persintaazje reduksje yn bloed Aβ40 (reade sirkels) en harsenfloeistof (oranje sirkels) fan rotten behannele mei streptavidine keppele oan allinich in BACE1-remmende peptide. De Aβ-konsintraasje yn 'e kontrôle wie 420 pg/ml (standertôfwiking = 101 pg/ml).
Faagdisplay is mei súkses tapast yn ferskate gebieten fan biomedysk ûndersyk17. Dizze metoade is brûkt foar in vivo ûndersiken nei fasskulêre ferskaat18,19, lykas ek ûndersiken rjochte op harsensfetten20,21,22,23,24,25,26. Yn dizze stúdzje hawwe wy de tapassing fan dizze seleksjemetoade útwreide, net allinich nei de direkte identifikaasje fan peptiden dy't rjochte binne op harsensfetten, mar ek nei de ûntdekking fan kandidaten mei aktive transporteigenskippen om de bloed-harsensbarrière te oerstekken. Wy beskriuwe no de ûntwikkeling fan in in vivo seleksjeproseduere yn CM-yntubearre rotten en demonstrearje it potensjeel om peptiden mei CSF-homing-eigenskippen te identifisearjen. Mei help fan 'e T7-faag dy't in bibleteek fan 12-mer willekeurige peptiden toant, koene wy ​​oantoane dat de T7-faag lyts genôch is (sawat 60 nm yn diameter)10 om oanpast te wurden oan 'e bloed-harsensbarrière, wêrtroch't de bloed-harsensbarrière of choroïde plexus direkt oerstekke wurdt. Wy hawwe observearre dat it rispjen fan CSF fan kanulearre CM-rotten in goed kontroleare yn vivo funksjonele screeningmetoade wie, en dat de ekstrahearre faag net allinich oan 'e vaskulatuer bûn, mar ek funksjonearre as in transporter oer de bloed-harsensbarrière. Fierder, troch tagelyk bloed te sammeljen en HTS ta te passen op CSF en bloed-ôflaatte fagen, hawwe wy befêstige dat ús kar foar CSF net beynfloede waard troch bloedferriking of geskiktheid foar útwreiding tusken seleksjerûndes. It bloedkompartimint is lykwols ûnderdiel fan 'e seleksjeproseduere, om't fagen dy't it CSF-kompartimint kinne berikke, lang genôch yn 'e bloedstream moatte oerlibje en sirkulearje om harsels yn 'e harsens te ferriken. Om betroubere sekwinsje-ynformaasje út rau HTS-gegevens te heljen, hawwe wy filters ymplementearre dy't oanpast binne oan platfoarmspesifike sekwinsjefouten yn 'e analyseworkflow. Troch kinetische parameters yn 'e screeningmetoade op te nimmen, hawwe wy de rappe farmakokinetika fan wildtype T7-fagen (t½ ~ 28 min) yn bloed befêstige24, 27, 28 en ek har healweardetiid yn serebrospinale floeistof (t½ ~ 26 min) per minuut bepaald. Nettsjinsteande ferlykbere farmakokinetyske profilen yn bloed en CSF, koe mar 0,001% fan 'e bloedkonsintraasje fan faag yn CSF wurde detektearre, wat in lege eftergrûnmobiliteit fan wildtype T7-faag oer de bloed-harsensbarrière oanjout. Dit wurk beklammet it belang fan 'e earste seleksjeronde by it brûken fan in vivo panningstrategyen, foaral foar faagsystemen dy't rap út 'e sirkulaasje wurde helle, om't mar in pear klonen it CNS-kompartimint berikke kinne. Sa wie de reduksje yn bibleteekferskaat yn 'e earste ronde tige grut, om't úteinlik mar in beheind oantal klonen waarden sammele yn dit tige strange CSF-model. Dizze in vivo panningstrategy omfette ferskate seleksjestappen lykas aktive opgarjen yn it CSF-kompartimint, kloonoerlibjen yn it bloedkompartimint, en rappe ferwidering fan T7-faagklonen út it bloed binnen de earste 10 minuten (Fig. 1d en Oanfoljende Fig. 4M). Sa waarden nei de earste ronde ferskillende faagklonen identifisearre yn CSF, hoewol deselde earste pool waard brûkt foar yndividuele bisten. Dit suggerearret dat meardere strange seleksjestappen foar boarnebibleteken mei in grut oantal bibleteekleden resultearje yn in wichtige fermindering fan ferskaat. Dêrom sille willekeurige barrens in yntegraal ûnderdiel wurde fan it earste seleksjeproses, wat it resultaat sterk beynfloedet. It is wierskynlik dat in protte fan 'e klonen yn' e orizjinele bibleteek in tige ferlykbere CSF-ferrikingsneiging hienen. Sels ûnder deselde eksperimintele omstannichheden kinne seleksjeresultaten lykwols ferskille fanwegen it lytse oantal fan elke bepaalde kloon yn 'e earste pool.
De motiven dy't ferrike binne yn CSF ferskille fan dy yn it bloed. Nijsgjirrich is dat wy de earste ferskowing nei glycine-rike peptiden yn it bloed fan yndividuele bisten opmurken hawwe. (Fig. 1g, Oanfoljende Figs. 4e, 4f). Faag mei glycine-peptiden kin stabiler wêze en minder kâns hawwe om út 'e sirkulaasje helle te wurden. Dizze glycine-rike peptiden waarden lykwols net ûntdutsen yn 'e harsensfloeistofmonsters, wat suggerearret dat de gearstalde bibleteken twa ferskillende seleksjestappen trochgien binne: ien yn it bloed en in oare dy't tastien waard om op te heapje yn 'e harsensfloeistof. CSF-ferrike klonen dy't resultearren út 'e fjirde seleksjeronde binne útwreide testen. Hast alle yndividueel testen klonen waarden befêstige ferrike te wêzen yn CSF yn ferliking mei lege kontrôlefaag. Ien peptidetreffer (#2077) waard yn mear detail ûndersocht. It liet in langere plasmahealweartiid sjen yn ferliking mei oare treffers (Ofbylding 3d en Oanfoljende Ofbylding 7), en nijsgjirrich is dat dit peptide in cysteineresidu befette oan 'e C-terminus. Koartlyn is oantoand dat de tafoeging fan cysteine ​​oan peptiden har farmakokinetyske eigenskippen kin ferbetterje troch te binen oan albumine 29. Dit is op it stuit ûnbekend foar peptide #2077 en fereasket fierder ûndersyk. Guon peptiden lieten in valinsje-ôfhinklikens sjen yn CSF-ferriking (gegevens net werjûn), dy't mooglik relatearre is oan de werjûne oerflakgeometry fan 'e T7-kapside. It T7-systeem dat wy brûkten liet 5-15 kopyen fan elk peptide per faagdieltsje sjen. IHC waard útfierd op kandidaat-leadfaagklonen dy't intraveneus ynjektearre waarden yn 'e harsenskorteks fan rotten (Oanfoljende Fig. 8). De gegevens lieten sjen dat teminsten trije klonen (nr. 2002, nr. 2009 en nr. 2077) ynteraksje hienen mei de BBB. It moat noch bepaald wurde oft dizze BBB-ynteraksje resulteart yn 'e opgarjen fan CSF of de beweging fan dizze klonen direkt nei de BCSFB. Wichtich is dat wy sjen litte dat de selektearre peptiden har CSF-transportkapasiteit behâlde as se synthetisearre en bûn wurde oan 'e proteïnelading. Bining fan N-terminale biotinylearre peptiden oan SA werhellet yn essinsje de resultaten dy't krigen binne mei har respektive faagklonen yn bloed en harsenfloeistof (Fig. 3e). Uteinlik litte wy sjen dat leadpeptide #2077 yn steat is om de harsensaksje fan in biotinylearre peptideremmer fan BACE1 konjugearre oan SA te befoarderjen, wêrtroch útsprutsen farmakodynamyske effekten yn it CNS ûntsteane troch Abeta40-nivo's yn CSF signifikant te ferminderjen (Fig. 4). Wy koene gjin homologen yn 'e database identifisearje troch in peptidesekwinsjehomologysykjen út te fieren fan alle treffers. It is wichtich om te notearjen dat de grutte fan 'e T7-bibleteek sawat 109 is, wylst de teoretyske bibleteekgrutte foar 12-meren 4 x 1015 is. Dêrom hawwe wy mar in lytse fraksje fan 'e ferskaatromte fan' e 12-mer peptidebibleteek selektearre, wat betsjutte kin dat mear optimalisearre peptiden identifisearre wurde kinne troch de oanbuorjende sekwinsjeromte fan dizze identifisearre treffers te evaluearjen. Hypotetysk kin ien fan 'e redenen wêrom't wy gjin natuerlike homologen fan dizze peptiden fûn hawwe, deseleksje tidens evolúsje wêze om de ûnkontrolearre yngong fan bepaalde peptidemotiven yn 'e harsens te foarkommen.
Mei-inoar jouwe ús resultaten in basis foar takomstich wurk om de transportsystemen fan 'e serebrovaskulêre barriêre yn vivo yn mear detail te identifisearjen en te karakterisearjen. De basisopset fan dizze metoade is basearre op in funksjonele seleksjestrategy dy't net allinich klonen identifisearret mei serebrale vaskulêre biningseigenskippen, mar ek in krityske stap omfettet wêryn suksesfolle klonen yntrinsyke aktiviteit hawwe om biologyske barriêres yn vivo oer te stekken yn it CNS-kompartimint. is om it meganisme fan transport fan dizze peptiden en har foarkar foar binding oan 'e mikrovaskulatuer spesifyk foar de harsensregio te ferdúdlikjen. Dit kin liede ta de ûntdekking fan nije paden foar it transport fan 'e BBB en reseptors. Wy ferwachtsje dat de identifisearre peptiden direkt kinne bine oan serebrovaskulêre reseptors of oan sirkulearjende liganden dy't troch de BBB of BCSFB ferfierd wurde. De peptidefektoren mei CSF-transportaktiviteit dy't yn dit wurk ûntdutsen binne, sille fierder ûndersocht wurde. Wy ûndersykje op it stuit de harsenspesifisiteit fan dizze peptiden foar har fermogen om de BBB en/of BCSFB oer te stekken. Dizze nije peptiden sille ekstreem weardefolle ark wêze foar de potinsjele ûntdekking fan nije reseptors of paden en foar de ûntwikkeling fan nije tige effisjinte platfoarms foar de levering fan makromolekulen, lykas biologyske medisinen, oan 'e harsens.
Kanulearje de grutte cisterna (CM) mei in modifikaasje fan 'e earder beskreaune metoade. Ferdoofde Wistar-rotten (200-350 g) waarden op in stereotaksysk apparaat monteard en in mediane ynsnijing waard makke oer de skeare en aseptysk taret skalp om de skedel bleat te lizzen. Boarje twa gatten yn it gebiet fan 'e boppeste sjerp en befestigje de befestigingsskroeven yn 'e gatten. In ekstra gat waard boarre yn 'e laterale occipitale kam foar stereotaktyske begelieding fan in roestfrij stielen kanule yn 'e CM. Bring dentale semint oan om 'e kanule en befeiligje mei skroeven. Nei foto-útharding en semintferhurding waard de hûdwûne sluten mei 4/0 supramide-hechting. De juste pleatsing fan 'e kanule wurdt befêstige troch spontane lekkage fan serebrospinale floeistof (CSF). Ferwiderje de rat út it stereotaksyske apparaat, krije passende postoperative soarch en pinebehanneling, en lit it teminsten ien wike herstelle oant tekens fan bloed wurde waarnommen yn 'e serebrospinale floeistof. Wistar-rotten (Crl:WI/Han) waarden krigen fan Charles River (Frankryk). Alle rotten waarden ûnder spesifike patogeenfrije omstannichheden hâlden. Alle bisteproeven waarden goedkard troch it Feterinêr Kantoar fan 'e stêd Basel, Switserlân, en waarden útfierd yn oerienstimming mei Dierlisinsje nr. 2474 (Beoardieling fan Aktyf Harsenstransport troch it Mjitten fan Niveaus fan Therapeutyske Kandidaten yn 'e Cerebrospinale Floeistof en Harsens fan Rat).
Hâld de rat foarsichtich by bewustwêzen mei de CM-kanule yn 'e hân. Ferwiderje Datura út 'e kanule en sammelje 10 µl spontaan streamende harsensfloeistof. Om't de trochgongsfermogen fan 'e kanule úteinlik kompromittearre wie, waarden allinich dúdlike harsensfloeistofmonsters sûnder bewiis fan bloedfersmoarging of ferkleuring opnommen yn dizze stúdzje. Parallel waard sawat 10-20 μl bloed nommen út in lytse ynsnijing oan 'e punt fan' e sturt yn buizen mei heparine (Sigma-Aldrich). CSF en bloed waarden op ferskate tiidpunten sammele nei intraveneuze ynjeksje fan T7-faag. Sawat 5-10 μl floeistof waard fuortsmiten foardat elk CSF-monster waard sammele, wat oerienkomt mei it deade folume fan 'e katheter.
Biblioteken waarden generearre mei de T7Select 10-3b-fektor lykas beskreaun yn 'e T7Select-systeemhânlieding (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Koartsein, in willekeurige 12-mer DNA-ynfoegsel waard synthetisearre yn it folgjende formaat:
It NNK-kodon waard brûkt om dûbele stopkodons en aminosoer-oerekspresje yn 'e ynfoegsel te foarkommen. N is in mei de hân mingde ekwimolêre ferhâlding fan elke nukleotide, en K is in mei de hân mingde ekwimolêre ferhâlding fan adenine- en cytosinenukleotiden. Ienstringige regio's waarden omset yn dûbelstringich DNA troch fierdere ynkubaasje mei dNTP (Novagen) en Klenow-enzym (New England Biolabs) yn Klenow-buffer (New England Biolabs) foar 3 oeren by 37 °C. Nei de reaksje waard dûbelstringich DNA weromwûn troch EtOH-presiпитаasje. It resultearjende DNA waard fertarre mei restriksje-enzymen EcoRI en HindIII (beide fan Roche). De spjalte en suvere (QIAquick, Qiagen) ynfoegsel (T4-ligase, New England Biolabs) waard doe yn-frame ligearre yn in foarôf spjalte T7-fektor nei aminosoer 348 fan it 10B-kapsidegen. Ligaasjereaksjes waarden 18 oeren by 16 °C ynkubearre foar yn vitro-ynpakking. Faagferpakking yn vitro waard útfierd neffens de ynstruksjes dy't by de T7Select 10-3b kloningskit (Novagen) hearden en de ferpakkingsoplossing waard ien kear amplifisearre ta lysis mei Escherichia coli (BLT5615, Novagen). De lysaten waarden sintrifugearre, titrearre en beferzen by -80°C as in stockoplossing fan glycerol.
Direkte PCR-amplifikaasje fan faagfariabele regio's amplifisearre yn bouillon of plaat mei gebrûk fan proprietêre 454/Roche-amplikon-fúzjeprimers. De foarútfúzjeprimer befettet sekwinsjes dy't de fariabele regio (NNK) 12 (sjabloanspesifyk), GS FLX Titanium Adapter A, en in fjouwer-base bibleteekkaaisekwinsje (TCAG) flankearje (Oanfoljende figuer 1a):
De reverse fusion-primer befettet ek biotine dy't oan fangkralen is befestige en de GS FLX Titanium Adapter B dy't nedich is foar klonale amplifikaasje tidens emulsie-PCR:
De amplikons waarden doe ûnderwurpen oan 454/Roche pyrosekwinsje neffens it 454 GS-FLX Titanium-protokol. Foar manuele Sanger-sekwinsje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) waard T7-faag-DNA amplifisearre troch PCR en sekwinsjeare mei de folgjende primerpearen:
Inserts fan yndividuele plakjes waarden ûnderwurpen oan PCR-amplifikaasje mei de Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (neffens de ynstruksjes fan de fabrikant). Fier in hjitte start út (10 min by 95 °C) en 35 boost-syklusen (50 s by 95 °C, 1 min by 50 °C, en 1 min by 72 °C).
Faag út bibleteken, wildtype faag, faag rêden út CSF en bloed, of yndividuele klonen waarden amplifisearre yn Escherichia coli BL5615 yn TB-bouillon (Sigma Aldrich) of yn skûtels fan 500 cm2 (Thermo Scientific) foar 4 oeren by 37 °C. Faag waarden út 'e platen ekstrahearre troch de platen te spieljen mei Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) of troch de plakken te sammeljen mei sterile pipettepunten. Faag waarden isolearre út kultuersupernatant of ekstraksjebuffer mei ien ronde polyethyleenglycol (PEG 8000) delslach (Promega) en opnij suspendearre yn Tris-EDTA-buffer.
De fersterke faag waard ûnderwurpen oan 2-3 rûndes fan endotoxineferwidering mei endotoxineferwideringskralen (Miltenyi Biotec) foarôfgeand oan intraveneuze (IV) ynjeksje (500 μl/dier). Yn 'e earste rûnde waarden 2×1012 fagen ynfierd; yn 'e twadde 2×1010 fagen; yn 'e tredde en fjirde seleksjerûnde 2×109 fagen per dier. Faaginhâld yn CSF- en bloedmonsters sammele op 'e oanjûne tiidpunten waard bepaald troch plaquetelling neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant (T7Select-systeemhânlieding). Faagseleksje waard útfierd troch intraveneuze ynjeksje fan suvere bibleteken yn 'e sturtader of troch opnij ynjeksje fan faag ekstrahearre út CSF fan 'e foarige seleksjerûnde, en folgjende rispingen waarden útfierd nei respektivelik 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, en 240 min CSF- en bloedmonsters. Yn totaal waarden fjouwer rûndes fan in vivo panning útfierd, wêrby't de twa selektearre tûken apart opslein en analysearre waarden tidens de earste trije rûndes fan seleksje. Alle faaginserts dy't út CSF ekstrahearre waarden út 'e earste twa rûndes fan seleksje waarden ûnderwurpen oan 454/Roche-pyrosequencing, wylst alle klonen dy't út CSF ekstrahearre waarden út 'e lêste twa rûndes fan seleksje mei de hân sekwinsjearre waarden. Alle bloedfaagen út 'e earste rûnde fan seleksje waarden ek ûnderwurpen oan 454/Roche-pyrosequencing. Foar ynjeksje fan faakklonen waarden selektearre fagen amplifisearre yn E. coli (BL5615) op platen fan 500 cm2 by 37°C foar 4 oeren. Yndividueel selektearre en mei de hân sekwinsjearre klonen waarden propagearre yn TB-medium. Nei faagrekstraksje, suvering en ferwidering fan endotoxine (lykas hjirboppe beskreaun), waarden 2 × 1010 fagen/dier yn 300 μl intraveneus ynjektearre yn ien sturtader.
Foarferwurking en kwalitative filterjen fan sekwinsjegegevens. Rauwe 454/Roche-gegevens waarden konvertearre fan in binêr standert streamkaartformaat (sff) nei in Pearson minsklik lêsber formaat (fasta) mei help fan leveransiersoftware. Fierdere ferwurking fan 'e nukleotidensekwinsje waard útfierd mei help fan proprietêre C-programma's en skripts (net útbrocht softwarepakket) lykas hjirûnder beskreaun. De analyze fan primêre gegevens omfettet strange filterprosedueres yn meardere stadia. Om lêzingen te filterjen dy't gjin jildige 12mer-ynfoegsel-DNA-sekwinsje befette, waarden de lêzingen sekwinsjeel ôfstimd op startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoplabel (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) en eftergrûnynfoegsel (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mei help fan 'e wrâldwide Needleman-Wunsch-test. Ofstimming dy't maksimaal 2 ynkonsistinsjes per ôfstimming mooglik makket31. Dêrom waarden lêzingen sûnder start- en stoptags en lêzingen mei eftergrûnynfoegsels, d.w.s. ôfstimmingen dy't it tastiene oantal mismatches oerskriuwe, út 'e bibleteek fuorthelle. Wat de oerbleaune lêzingen oanbelanget, waard de N-mer DNA-sekwinsje dy't útwreidet fan 'e startmark en einiget foar de stopmark út 'e orizjinele lêzingsekwinsje helle en fierder ferwurke (hjirnei oantsjutten as "ynfoegsel"). Nei oersetting fan 'e ynfoegsel wurdt it diel nei it earste stopkodon oan 'e 5'-ein fan 'e primer út 'e ynfoegsel helle. Derneist waarden ek nukleotiden dy't liede ta ûnfolsleine kodons oan 'e 3'-ein fan 'e primer helle. Om ynfoegsels dy't allinich eftergrûnsekwinsjes befetsje út te sluten, waarden ek oersette ynfoegsels dy't begjinne mei it aminosoerpatroan "PAG" helle. Peptiden mei in post-translasjonele lingte fan minder as 3 aminosoeren waarden út 'e bibleteek helle. Uteinlik, ferwiderje redundânsje yn 'e ynfoegselpool en bepaal de frekwinsje fan elke unike ynfoegsel. De resultaten fan dizze analyze omfette in list mei nukleotidensekwinsjes (ynfoegsels) en har (lêzings)frekwinsjes (Oanfoljende figueren 1c en 2).
Groep N-mer DNA-ynfoegings op sekwinsje-oerienkomst: Om 454/Roche-spesifike sekwinsjefouten (lykas problemen mei sekwinsjearjende homopolymeer-útwreidings) te eliminearjen en minder wichtige redundânsjes te ferwiderjen, wurde earder filtere N-mer DNA-sekwinsje-ynfoegings (ynfoegings) sortearre op oerienkomst. Ynfoegings (oant 2 net-oerienkommende basen tastien) mei in iteratyf algoritme definieare as folget: ynfoegings wurde earst sortearre op har frekwinsje (heechst nei leechst), en as se itselde binne, op har sekundêre sortearring op lingte (langst nei koartst). Sa definiearje de meast foarkommende en langste ynfoegings de earste "groep". De groepsfrekwinsje wurdt ynsteld op de kaaifrekwinsje. Dêrnei waard besocht elke ynfoeging dy't oerbleau yn 'e sortearre list ta te foegjen oan 'e groep troch pearsgewijze Needleman-Wunsch-ôfstimming. As it oantal mismatches, ynfoegings of wiskingen yn in ôfstimming net mear as in drompel fan 2 is, wurdt in ynfoeging tafoege oan 'e groep, en wurdt de totale groepsfrekwinsje ferhege mei hoe faak de ynfoeging tafoege is. Ynfoegings tafoege oan in groep wurde markearre as brûkt en útsletten fan fierdere ferwurking. As de ynfoegsekwinsje net tafoege wurde kin oan in besteande groep, wurdt de ynfoegsekwinsje brûkt om in nije groep te meitsjen mei de passende ynfoegfrekwinsje en markearre as brûkt. De iteraasje einiget as elke ynfoegsekwinsje of brûkt is om in nije groep te foarmjen of opnommen wurde kin yn in besteande groep. Groepearre ynfoegings besteande út nukleotiden wurde úteinlik oerset yn peptidesekwinsjes (peptidebibleteken). It resultaat fan dizze analyze is in set ynfoegings en harren oerienkommende frekwinsjes dy't it oantal opienfolgjende lêzingen foarmje (Oanfoljende Fig. 2).
Motyfgeneraasje: Op basis fan in list mei unike peptiden waard in bibleteek makke mei alle mooglike aminosoerpatroanen (aa) lykas hjirûnder werjûn. Elk mooglik patroan fan lingte 3 waard út it peptide helle en it omkearde patroan waard tafoege tegearre mei in mienskiplike motyfbibleteek mei alle patroanen (tripeptiden). Bibleteken fan tige repetitive motiven waarden sekwinsjeare en redundânsje waard fuorthelle. Dêrnei hawwe wy foar elk tripeptide yn 'e motyfbibleteek kontrolearre op syn oanwêzigens yn 'e bibleteek mei help fan berekkeningsark. Yn dit gefal wurdt de frekwinsje fan it peptide mei it fûne motyftripeptide tafoege en tawiisd oan it motyf yn 'e motyfbibleteek ("oantal motiven"). It resultaat fan motyfgeneraasje is in twadiminsjonale array mei alle foarkommen fan tripeptiden (motiven) en har respektive wearden, dat binne it oantal sekwinsjelêzingen dy't resultearje yn it oerienkommende motyf as de lêzingen filtere, groepearre en oerset wurde. Metriken lykas hjirboppe yn detail beskreaun.
Normalisaasje fan it oantal motiven en oerienkommende ferspriedingsdiagrammen: It oantal motiven foar elke stekproef waard normalisearre mei
wêrby't ni it oantal lêzingen is dy't ûnderwerp i befetsje. Sa fertsjintwurdiget vi it ​​persintaazjefrekwinsje fan lêzingen (of peptiden) dy't motyf i befetsje yn 'e stekproef. P-wearden foar it net-normalisearre oantal motiven waarden berekkene mei de krekte test fan Fisher. Oangeande korrelogrammen fan it oantal motiven waarden de korrelaasjes fan Spearman berekkene mei it normalisearre oantal motiven mei R.
Om de ynhâld fan aminosoeren op elke posysje yn 'e peptidebibleteek te visualisearjen, waarden weblogogrammen 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) makke. Earst wurdt de ynhâld fan aminosoeren op elke posysje fan it 12-mer peptide opslein yn in 20 × 12 matrix. Dêrnei wurdt in set fan 1000 peptiden mei deselde relative aminosoerynhâld op elke posysje generearre yn fasta-sekwinsjeformaat en levere as ynfier foar weblogo 3, dat in grafyske werjefte genereart fan 'e relative aminosoerynhâld op elke posysje foar in bepaalde peptidebibleteek. Om multidimensionale datasets te visualisearjen, waarden waarmtekaarten makke mei in yntern ûntwikkele ark yn R (biosHeatmap, in noch te frijjaan R-pakket). De dendrogrammen presintearre yn 'e waarmtekaarten waarden berekkene mei de hiërargyske klustermetoade fan Ward mei de Euklidyske ôfstânmetriek. Foar statistyske analyze fan motiefskoargegevens waarden P-wearden foar net-normalisearre skoaren berekkene mei de krekte test fan Fisher. P-wearden foar oare datasets waarden berekkene yn R mei help fan de Student's t-test of ANOVA.
Selektearre faagklonen en fagen sûnder ynfoegsels waarden intraveneus ynjektearre fia de sturtvene (2 × 1010 fagen/dier yn 300 μl PBS). Tsien minuten foar perfúzje en dêrnei fiksaasje waarden deselde bisten intraveneus ynjektearre mei 100 μl DyLight594-labelde lektine (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuten nei faaginjeksje waarden rotten troch it hert perfusearre mei 50 ml PBS folge troch 50 ml 4% PFA/PBS. Harsensmonsters waarden ek oernachts fêstmakke yn 4% PFA/PBS en oernachts wekt yn 30% sukrose by 4 °C. Monsters wurde fluch beferzen yn it OCT-mingsel. Immunohistochemyske analyze fan beferzen monsters waard útfierd by keamertemperatuer op 30 µm kryoseksjes blokkearre mei 1% BSA en ynkubearre mei polyklonale FITC-labelde antistoffen tsjin T7-faag (Novus NB 600-376A) by 4 °C. Ynkubearje oernachts. Uteinlik waarden de seksjes 3 kear wosken mei PBS en ûndersocht mei in konfokale lasermikroskoop (Leica TCS SP5).
Alle peptiden mei in minimale suverens fan 98% waarden synthetisearre troch GenScript USA, biotinylearre en lyofilisearre. Biotine wurdt bûn fia in ekstra triple glycine spacer oan 'e N-terminus. Kontrolearje alle peptiden mei massaspektrometry.
Streptavidine (Sigma S0677) waard mingd mei in 5-fâld ekwimolêre oerskot fan biotinylearre peptide, biotinylearre BACE1-remmende peptide, of in kombinaasje (3:1 ferhâlding) fan biotinylearre BACE1-remmende peptide en BACE1-remmende peptide yn 5-10% DMSO/ynkubearre yn PBS. 1 oere by keamertemperatuer foar ynjeksje. Streptavidine-konjugearre peptiden waarden intraveneus ynjektearre mei in doasis fan 10 mg/kg yn ien fan 'e sturtvenen fan rotten mei in harsensholte.
De konsintraasje fan streptavidine-peptidekompleksen waard beoardiele troch ELISA. Nunc Maxisorp mikrotiterplaten (Sigma) waarden oernachtich by 4 °C bedekt mei 1,5 μg/ml mûs anti-streptavidine antistof (Thermo, MA1-20011). Nei it blokkearjen (blokkearjende buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) by keamertemperatuer foar 2 oeren, de plaat waskje mei 0,05% Tween-20/PBS (waskbuffer) foar 3 sekonden, waarden CSF- en plasmamonsters tafoege oan putten ferdund mei blokkearjende buffer (plasma 1:10.000, CSF 1:115). De plaat waard doe oernachtich by 4 °C ynkubearre mei deteksje-antistof (1 μg/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239). Nei trije waskstappen waard streptavidine ûntdutsen troch ynkubaasje yn TMB-substraatoplossing (Roche) foar maksimaal 20 minuten. Nei it stopjen fan kleurûntwikkeling mei 1M H2SO4, mjitte de absorbânsje by 450 nm.
De funksje fan it streptavidine-peptide-BACE1-remmerkompleks waard beoardiele troch Aβ(1-40) ELISA neffens it protokol fan 'e fabrikant (Wako, 294-64701). Koartsein, CSF-monsters waarden ferdund yn standert verdunner (1:23) en oernachtich ynkubearre by 4 °C yn 96-wellsplaten bedekt mei BNT77-fangst-antistof. Nei fiif waskstappen waard HRP-konjugearre BA27-antistof tafoege en 2 oeren ynkubearre by 4 °C, folge troch fiif waskstappen. Aβ(1–40) waard detektearre troch ynkubaasje yn TMB-oplossing foar 30 minuten by keamertemperatuer. Nei't de kleurûntwikkeling stoppe is mei stopoplossing, mjitte de absorbânsje by 450 nm. Plasmamonsters waarden ûnderwurpen oan fêste-faze-ekstraksje foarôfgeand oan Aβ(1–40) ELISA. Plasma waard tafoege oan 0,2% DEA (Sigma) yn 96-wellsplaten en 30 minuten by keamertemperatuer ynkubearre. Nei it opienfolgjend waskjen fan 'e SPE-platen (Oasis, 186000679) mei wetter en 100% metanol, waarden plasmamonsters tafoege oan 'e SPE-platen en alle floeistof waard fuorthelle. De monsters waarden wosken (earst mei 5% metanol en dan mei 30% metanol) en eluearre mei 2% NH4OH/90% metanol. Nei it droegjen fan it eluaat by 55 °C foar 99 minuten mei in konstante N2-stroom, waarden de monsters redusearre yn standert verdunners en waard Aβ(1–40) metten lykas hjirboppe beskreaun.
Hoe dit artikel te sitearjen: Urich, E. et al. Frachtlevering oan it brein mei help fan transitpeptiden identifisearre yn vivo. de wittenskip. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Levering fan makromolekulêre medisinen oan it brein mei help fan rjochte terapy. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Levering fan peptide- en proteïne-medisinen oer de bloed-harsensbarrière. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM De bloed-harsensbarrière: in knelpunt yn 'e ûntwikkeling fan harsensmedisinen. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Perspektiven foar ferbettere medisynlevering en targeting nei de harsens fia de choroid plexus-CSF-paad. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisaasje fan biofarmaseutika mei molekulêre Trojaanske hynders foar harsenslevering. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-reseptor-mediearre peptidetransport oer de bloed-harsensbarrière. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Fergrutsje harsenspenetraasje en effektiviteit fan terapeutyske antistoffen mei monovalente molekulêre shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrinereseptor (TfR)-transport bepaalt de opname fan affiniteitsfarianten fan TfR-antistoffen yn 'e harsens. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).