Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Usa os botóns Anterior e Seguinte para moverte por tres diapositivas á vez ou usa os botóns deslizantes ao final para moverte por tres diapositivas á vez.
A barreira hematoencefálica e a barreira hematoencefálica impiden que os axentes bioterapéuticos alcancen os seus obxectivos no sistema nervioso central, o que dificulta o tratamento eficaz das enfermidades neurolóxicas. Para descubrir novos transportadores cerebrais in vivo, introducimos unha biblioteca de péptidos do fago T7 e recollemos en serie sangue e líquido cefalorraquídeo (LCR) utilizando un modelo de ratas canulado de gran conxunto consciente. Os clons específicos do fago enriquecéronse moito en LCR despois de catro roldas de selección. As probas de péptidos candidatos individuais revelaron un enriquecemento de máis de 1000 veces no LCR. A bioactividade da administración mediada por péptidos ao cerebro confirmouse cunha redución do 40 % no nivel de β-amiloide no líquido cefalorraquídeo utilizando un inhibidor do péptido BACE1 ligado ao novo péptido de tránsito identificado. Estes resultados suxiren que os péptidos identificados mediante métodos de selección de fagos in vivo poden ser vehículos útiles para a administración sistémica de macromoléculas ao cerebro cun efecto terapéutico.
A investigación sobre terapias dirixidas ao sistema nervioso central (SNC) centrouse principalmente na identificación de fármacos e axentes optimizados que presenten propiedades dirixidas ao SNC, con menos esforzo en descubrir os mecanismos que impulsan a administración activa de fármacos ao cerebro. Isto está a comezar a cambiar agora, xa que a administración de fármacos, especialmente de moléculas grandes, é unha parte integral do desenvolvemento de fármacos en neurociencia moderna. O ambiente do sistema nervioso central está ben protexido polo sistema de barreira cerebrovascular, que consiste na barreira hematoencefálica (BHE) e na barreira hematoencefálica (BCBB)1, o que dificulta a administración de fármacos ao cerebro1,2. Estímase que case todos os fármacos de moléculas grandes e máis do 98 % dos fármacos de moléculas pequenas elimínanse do cerebro3. Por iso é moi importante identificar novos sistemas de transporte cerebral que proporcionen unha administración eficiente e específica de fármacos terapéuticos ao SNC4,5. Non obstante, a BHE e a BCSFB tamén presentan unha excelente oportunidade para a administración de fármacos, xa que penetran e entran en todas as estruturas do cerebro a través da súa extensa vasculatura. Polo tanto, os esforzos actuais para empregar métodos non invasivos de administración ao cerebro baséanse en gran medida no mecanismo de transporte mediado por receptores (PMT) mediante o receptor endóxeno BBB6. A pesar dos recentes avances clave no uso da vía do receptor da transferrina7,8, requírese un maior desenvolvemento de novos sistemas de administración con propiedades melloradas. Para este fin, o noso obxectivo foi identificar péptidos capaces de mediar o transporte do LCR, xa que en principio poderían usarse para administrar macromoléculas ao SNC ou para abrir novas vías receptoras. En particular, os receptores e transportadores específicos do sistema cerebrovascular (BBB e BSCFB) poden servir como obxectivos potenciais para a administración activa e específica de fármacos bioterapéuticos. O líquido cefalorraquídeo (LCR) é un produto secretorio do plexo coroideo (SC) e está en contacto directo co líquido intersticial do cerebro a través do espazo subaracnoideo e o espazo ventricular4. Recentemente demostrouse que o líquido cefalorraquídeo subaracnoide difunde excesivamente no intersticio do cerebro9. Esperamos acceder ao espazo parenquimatoso usando este tracto de entrada subaracnoideo ou directamente a través da BHE. Para conseguilo, implementamos unha robusta estratexia de selección de fagos in vivo que idealmente identifica os péptidos transportados por calquera destas dúas vías distintas.
Agora describimos un método de cribado secuencial in vivo de fagos con mostraxe de LCR xunto con secuenciación de alto rendemento (HTS) para monitorizar as roldas de selección iniciais coa maior diversidade de bibliotecas. A cribado realizouse en ratas conscientes cunha cánula de cisterna grande (CM) implantada permanentemente para evitar a contaminación do sangue. É importante destacar que esta abordaxe selecciona tanto péptidos dirixidos ao cerebro como péptidos con actividade de transporte a través da barreira cerebrovascular. Empregamos fagos T7 debido ao seu pequeno tamaño (~60 nm)10 e suxerimos que son axeitados para o transporte de vesículas que permiten o cruzamento transcelular da barreira endotelial e/ou epitelio-medular. Despois de catro roldas de selección, illáronse poboacións de fagos que mostran un forte enriquecemento in vivo de LCR e asociación de microvasos cerebrais. É importante destacar que puidemos confirmar os nosos achados demostrando que os péptidos candidatos preferidos e sintetizados quimicamente son capaces de transportar carga de proteínas ao líquido cefalorraquídeo. En primeiro lugar, os efectos farmacodinámicos do SNC establecéronse combinando un péptido de tránsito principal cun inhibidor do péptido BACE1. Ademais de demostrar que as estratexias de cribado funcional in vivo poden identificar novos péptidos de transporte cerebral como transportadores de carga de proteínas eficaces, agardamos que enfoques de selección funcional similares tamén adquiran importancia na identificación de novas vías de transporte cerebral.
Baseándose nas unidades formadoras de placas (PFU), despois do paso de empaquetamento do fago, deseñouse e creouse unha biblioteca de péptidos aleatorios de fagos T7 lineares de 12 meros cunha diversidade de aproximadamente 109 (ver Materiais e métodos). É importante ter en conta que analizamos coidadosamente esta biblioteca antes do panning in vivo. A amplificación por PCR de mostras da biblioteca de fagos utilizando cebadores modificados xerou amplicóns que eran directamente aplicables ao HTS (Figura suplementaria 1a). Debido a a) erros de secuenciación de HTS11, b) impacto na calidade dos cebadores (NNK)1-12 e c) presenza de fagos de tipo salvaxe (wt) (insercións de esqueleto) na biblioteca de reserva, implementouse un procedemento de filtrado de secuencias para extraer só información de secuencia verificada (Figura suplementaria 1b). Estes pasos de filtro aplícanse a todas as bibliotecas de secuenciación HTS. Para a biblioteca estándar, obtivéronse un total de 233.868 lecturas, das cales o 39 % superaron os criterios de filtro e utilizáronse para a análise e selección da biblioteca para roldas posteriores (Figura suplementaria 1c-e). As lecturas foron predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de lonxitude cun pico a 36 nucleótidos (Fig. suplementaria 1c), o que confirma o deseño da biblioteca (NNK) 1-12. Cabe destacar que aproximadamente o 11 % dos membros da biblioteca contiñan un inserto PAGISRELVDKL de tipo salvaxe (wt) de 12 dimensiones, e case a metade das secuencias (49 %) contiñan insercións ou delecións. O HTS da biblioteca confirmou a alta diversidade de péptidos na biblioteca: máis do 81 % das secuencias peptídicas atopáronse só unha vez e só o 1,5 % ocorreron en ≥4 copias (Fig. suplementaria 2a). As frecuencias dos aminoácidos (aa) nas 12 posicións do repertorio correlacionáronse ben coas frecuencias esperadas para o número de codóns xerados polo repertorio NKK dexenerado (Fig. suplementaria 2b). A frecuencia observada de residuos de aa codificados por estes insertos correlacionouse ben coa frecuencia calculada (r = 0,893) (Fig. suplementaria 2c). A preparación de bibliotecas de fagos para a inxección inclúe os pasos de amplificación e eliminación de endotoxinas. Anteriormente demostrouse que isto reduce potencialmente a diversidade das bibliotecas de fagos12,13. Polo tanto, secuenciamos unha biblioteca de fagos amplificada en placa que se sometera á eliminación de endotoxinas e comparámola coa biblioteca orixinal para estimar a frecuencia de AA. Observouse unha forte correlación (r = 0,995) entre o conxunto orixinal e o conxunto amplificado e purificado (Figura suplementaria 2d), o que indica que a competencia entre clons amplificados en placas usando o fago T7 non causou un sesgo importante. Esta comparación baséase na frecuencia dos motivos tripeptídicos en cada biblioteca, xa que a diversidade das bibliotecas (~109) non se pode capturar completamente mesmo con HTS. A análise de frecuencia de aa en cada posición revelou un pequeno sesgo dependente da posición nas tres últimas posicións do repertorio introducido (Figura suplementaria 2e). En conclusión, concluímos que a calidade e a diversidade da biblioteca eran aceptables e só se observaron cambios menores na diversidade debido á amplificación e preparación das bibliotecas de fagos entre varias roldas de selección.
A mostraxe seriada de líquido cefalorraquídeo pódese realizar implantando cirurxicamente unha cánula na membrana plasmática (MC) de ratas conscientes para facilitar a identificación do fago T7 inxectado por vía intravenosa (iv) a través da BHE e/ou do BCSFB (Fig. 1a-b). Empregamos dous brazos de selección independentes (brazos A e B) nas tres primeiras roldas de selección in vivo (Fig. 1c). Aumentamos gradualmente o rigor da selección diminuíndo a cantidade total de fago introducido nas tres primeiras roldas de selección. Para a cuarta rolda de selección, combinamos mostras das ramas A e B e realizamos tres seleccións independentes adicionais. Para estudar as propiedades in vivo das partículas do fago T7 neste modelo, inxectouse fago de tipo salvaxe (inserto mestre PAGISRELVDKL) en ratas a través da vea da cola. A recuperación de fagos do líquido cefalorraquídeo e do sangue en diferentes puntos de tempo mostrou que os fagos icosaédricos T7 relativamente pequenos tiñan unha fase de eliminación inicial rápida do compartimento sanguíneo (Fig. suplementaria 3). Baseándonos nos títulos administrados e no volume sanguíneo das ratas, calculamos que só se detectou aproximadamente o 1 % en peso do fago da dose administrada no sangue 10 minutos despois da inxección intravenosa. Tras este rápido descenso inicial, mediuse unha eliminación primaria máis lenta cunha semivida de 27,7 minutos. É importante destacar que só se recuperaron moi poucos fagos do compartimento do LCR, o que indica un baixo nivel de fondo para a migración de fagos de tipo salvaxe ao compartimento do LCR (Figura suplementaria 3). De media, só se detectaron aproximadamente 1 x 10-3 % de títulos de fago T7 no sangue e 4 x 10-8 % dos fagos infundidos inicialmente no líquido cefalorraquídeo durante todo o período de mostraxe (0-250 min). Cabe destacar que a semivida (25,7 min) do fago de tipo salvaxe no líquido cefalorraquídeo foi similar á observada no sangue. Estes datos demostran que a barreira que separa o compartimento do LCR do sangue está intacta en ratas canuladas con CM, o que permite a selección in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clons que se transportan facilmente do sangue ao compartimento do LCR.
(a) Configuración dun método para a remostraxe de líquido cefalorraquídeo (LCR) dunha gran cantidade. (b) Diagrama que mostra a localización celular da barreira do sistema nervioso central (SNC) e a estratexia de selección utilizada para identificar péptidos que cruzan a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira hematoencefálica. (c) Diagrama de fluxo de cribado de fagos in vivo. En cada rolda de selección, os fagos (identificadores de animais dentro das frechas) inxectáronse por vía intravenosa. Dúas ramas alternativas independentes (A, B) mantéñense por separado ata a 4ª rolda de selección. Para as roldas de selección 3 e 4, cada clon de fago extraído do LCR secuenciouse manualmente. (d) Cinética do fago illado do sangue (círculos vermellos) e do líquido cefalorraquídeo (triángulos verdes) durante a primeira rolda de selección en dúas ratas canuladas despois da inxección intravenosa da biblioteca de péptidos T7 (2 x 1012 fagos/animal). Os cadrados azuis indican a concentración inicial media de fago no sangue, calculada a partir da cantidade de fago inxectado, tendo en conta o volume total de sangue. Os cadrados negros indican o punto de intersección da liña y extrapolada a partir das concentracións de fago no sangue. (e, f) Preséntase a frecuencia e a distribución relativas de todos os posibles motivos tripeptídicos superpostos atopados no péptido. Móstrase o número de motivos atopados en 1000 lecturas. Os motivos enriquecidos significativamente (p < 0,001) están marcados con puntos vermellos. (e) Diagrama de dispersión de correlación que compara a frecuencia relativa do motivo tripeptídico da biblioteca inxectada co fago derivado do sangue dos animais #1.1 e #1.2. (f) Diagrama de dispersión de correlación que compara as frecuencias relativas dos motivos tripeptídicos de fagos animais #1.1 e #1.2 illados en sangue e líquido cefalorraquídeo. (g, h) Representación da identificación da secuencia de fago enriquecido en sangue (g) fronte a bibliotecas inxectadas e fago enriquecido en LCR (h) fronte a sangue despois dunha rolda de selección in vivo en ambos os animais. O tamaño do código dunha letra indica a frecuencia coa que se produce ese aminoácido nesa posición. Verde = polar, púrpura = neutro, azul = básico, vermello = ácido e negro = aminoácidos hidrófobos. As figuras 1a e b foron deseñadas e producidas por Eduard Urich.
Inxectamos unha biblioteca de péptidos de fagos en dúas ratas de instrumento CM (clados A e B) e illámolos do líquido cefalorraquídeo e do sangue (Figura 1d). A rápida eliminación inicial da biblioteca foi menos pronunciada en comparación co fago de tipo salvaxe. A semivida media da biblioteca inxectada en ambos os animais foi de 24,8 minutos no sangue, similar ao fago de tipo salvaxe, e de 38,5 minutos no LCR. As mostras de fagos de sangue e líquido cefalorraquídeo de cada animal foron sometidas a HTS e todos os péptidos identificados foron analizados para detectar a presenza dun motivo tripeptídico curto. Os motivos tripeptídicos foron escollidos porque proporcionan unha base mínima para a formación de estruturas e as interaccións péptido-proteína14,15. Atopamos unha boa correlación na distribución de motivos entre a biblioteca de fagos inxectada e os clons extraídos do sangue de ambos os animais (Fig. 1e). Os datos indican que a composición da biblioteca só está marxinalmente enriquecida no compartimento sanguíneo. As frecuencias de aminoácidos e as secuencias de consenso foron analizadas máis a fondo en cada posición usando unha adaptación do software Weblogo16. Curiosamente, atopamos un forte enriquecemento nos residuos de glicina no sangue (Fig. 1g). Cando se comparou o sangue con clons seleccionados do LCR, observouse unha forte selección e certa deseleccione de motivos (Fig. 1f), e certos aminoácidos estaban presentes preferentemente en posicións predeterminadas no grupo de 12 membros (Fig. 1h). En particular, os animais individuais difiren significativamente no líquido cefalorraquídeo, mentres que se observou enriquecemento de glicina no sangue en ambos os animais (Fig. suplementaria 4a-j). Tras un filtrado rigoroso dos datos de secuencia no líquido cefalorraquídeo dos animais #1.1 e #1.2, obtivéronse un total de 964 e 420 péptidos únicos de 12 meros (Fig. suplementaria 1d-e). Os clons de fagos illados amplificáronse e sometéronse a unha segunda rolda de selección in vivo. Os fagos extraídos da segunda rolda de selección sometéronse a HTS en cada animal e todos os péptidos identificados utilizáronse como entrada para un programa de recoñecemento de motivos para analizar a aparición de motivos tripeptídicos (Fig. 2a, b, ef). En comparación co primeiro ciclo do fago recuperado do LCR, observamos unha maior selección e desselección de moitos motivos no LCR nas ramas A e B (Fig. 2). Aplicouse un algoritmo de identificación de rede para determinar se representaban diferentes patróns de secuencia consistente. Observouse unha clara semellanza entre as secuencias de 12 dimensións recuperadas polo LCR no clado alternativo A (Fig. 2c, d) e no clado B (Fig. 2g, h). A análise agrupada en cada rama revelou diferentes perfís de selección para os péptidos de 12 meros (Fig. suplementaria 5c, d) e un aumento na proporción de títulos LCR/sangue ao longo do tempo para os clons agrupados despois da segunda rolda de selección en comparación coa primeira rolda de selección (Fig. suplementaria 5e).
Enriquecemento de motivos e péptidos no líquido cefalorraquídeo mediante dúas roldas sucesivas de selección por presentación de fagos funcionais in vivo.
Todos os fagos do líquido cefalorraquídeo recuperados da primeira rolda de cada animal (animais nº 1.1 e nº 1.2) foron agrupados, amplificados, secuenciados por HT e reinxectados xuntos (2 x 1010 fagos/animal) en 2 ratas canuladas SM (nº 1.1 → nº). 2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4). (a, b, e, f) Diagramas de dispersión de correlación que comparan a frecuencia relativa dos motivos tripeptídicos de todos os fagos derivados do LCR na primeira e segunda rolda de selección. Frecuencia relativa e distribución dos motivos que representan todos os posibles tripéptidos superpostos atopados nos péptidos en ambas as orientacións. Móstrase o número de motivos atopados en 1000 lecturas. Os motivos que foron seleccionados ou excluídos significativamente (p < 0,001) nunha das bibliotecas comparadas están destacados con puntos vermellos. (c, d, g, h) Representación do logotipo da secuencia de todas as secuencias longas de 12 aminoácidos ricas en CSF baseadas nas roldas 2 e 1 da selección in vivo. O tamaño do código dunha letra indica a frecuencia coa que se produce ese aminoácido nesa posición. Para representar o logotipo, compárase a frecuencia das secuencias de CSF extraídas de animais individuais entre dúas roldas de selección e móstranse as secuencias enriquecidas na segunda rolda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4. Os aminoácidos máis enriquecidos nunha posición determinada nos animais (c, d) n.º 2.1 e n.º 2.2 ou (g, h) nos animais n.º 2.3 e n.º 2.4 móstranse en cor. Verde = polar, púrpura = neutro, azul = básico, vermello = ácido e negro = aminoácidos hidrófobos.
Tras a terceira rolda de selección, identificamos 124 secuencias peptídicas únicas (n.º 3.1 e n.º 3.2) de 332 clons de fagos reconstituídos con LCR illados de dous animais (figura suplementaria 6a). A secuencia LGSVS (18,7 %) tivo a maior proporción relativa, seguida dos insertos de tipo salvaxe PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) e SARGSWREIVSLS (2,2 %). Na cuarta rolda final, agrupamos dúas ramas seleccionadas independentemente de tres animais separados (figura 1c). Dos 925 clons de fagos secuenciados recuperados do LCR, na cuarta rolda atopamos 64 secuencias peptídicas únicas (figura suplementaria 6b), entre as cales a proporción relativa de fagos de tipo salvaxe baixou ao 0,8 %. Os clons de CSF máis comúns na cuarta rolda foron LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) e RLSSVDSDLSGC (3, 2 %). O rango de lonxitude dos péptidos seleccionados débese a insercións/delecións de nucleótidos ou codóns de terminación prematuros nos cebadores da biblioteca cando se usan codóns dexenerados para o deseño da biblioteca NNK. Os codóns de terminación prematuros xeran péptidos máis curtos e son seleccionados porque conteñen o motivo aa favorable. Os péptidos máis longos poden resultar de insercións/delecións nos cebadores das bibliotecas sintéticas. Isto coloca o codón de terminación deseñado fóra do marco e léeo ata que aparece un novo codón de terminación augas abaixo. En xeral, calculamos os factores de enriquecemento para as catro roldas de selección comparando os datos de entrada cos datos de saída da mostra. Para a primeira rolda de cribado, empregamos títulos de fagos de tipo salvaxe como referencia de fondo non específica. Curiosamente, a selección negativa de fagos foi moi forte no primeiro ciclo do LCR, pero non no sangue (Fig. 3a), o que pode deberse á baixa probabilidade de difusión pasiva da maioría dos membros da biblioteca de péptidos no compartimento do LCR ou aos fagos relativos que tenden a ser retidos ou eliminados da corrente sanguínea de forma máis eficiente que os bacteriófagos. Non obstante, na segunda rolda de selección, observouse unha forte selección de fagos no LCR en ambos os clados, o que suxire que a rolda anterior se enriqueceu en fagos que mostran péptidos que promoven a absorción do LCR (Fig. 3a). De novo, sen un enriquecemento significativo no sangue. Tamén na terceira e cuarta roldas, os clons de fagos enriquecéronse significativamente no LCR. Comparando a frecuencia relativa de cada secuencia peptídica única entre as dúas últimas roldas de selección, atopamos que as secuencias estaban aínda máis enriquecidas na cuarta rolda de selección (Fig. 3b). Extraéronse un total de 931 motivos tripeptídicos de todas as 64 secuencias peptídicas únicas utilizando ambas as orientacións peptídicas. Os motivos máis enriquecidos na cuarta rolda examináronse máis detidamente para determinar os seus perfís de enriquecemento en todas as roldas en comparación coa biblioteca inxectada (límite: 10 % de enriquecemento) (figura suplementaria 6c). Os patróns xerais de selección mostraron que a maioría dos motivos estudados estaban enriquecidos en todas as roldas anteriores de ambas as ramas de selección. Non obstante, algúns motivos (por exemplo, SGL, VSG, LGS GSV) procedían predominantemente do clado A alternativo, mentres que outros (por exemplo, FGW, RTN, WGF, NTR) estaban enriquecidos no clado B alternativo.
Validación do transporte en LCR de péptidos presentados en fagos enriquecidos con LCR e péptidos líderes biotinilados conxugados con cargas útiles de estreptavidina.
(a) Razóns de enriquecemento calculadas nas catro roldas (R1-R4) baseadas nos títulos de fagos (PFU) inxectados (entrada = I) e nos títulos de fagos do LCR determinados (saída = O). Os factores de enriquecemento para as tres últimas roldas (R2-R4) calculáronse en comparación coa rolda anterior e a primeira rolda (R1) con datos de peso. As barras abertas son líquido cefalorraquídeo, as barras sombreadas son plasma. (***p<0,001, baseado na proba t de Student). (b) Lista dos péptidos de fagos máis abundantes, clasificados segundo a súa proporción relativa con respecto a todos os fagos recollidos no LCR despois da rolda 4 de selección. Os seis clons de fagos máis comúns están destacados en cor, numerados e os seus factores de enriquecemento entre as roldas 3 e 4 de selección (recadros). (c,d) Os seis clons de fagos máis enriquecidos, as bibliotecas de péptidos de fagos baleiros e parentais da rolda 4 analizáronse individualmente nun modelo de mostraxe de LCR. Recolléronse mostras de LCR e sangue nos puntos de tempo indicados. (c) Cantidades iguais de 6 clons de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animais), fagos baleiros (n.º 1779) (2 x 1010 fagos/animais) e bibliotecas de péptidos de fagos stock (2 x 1012 fagos/animais). Inxectar polo menos 3 CM e administrarse ao animal canulado por separado a través da vea da cola. Móstrase a farmacocinética do LCR de cada clon de fago e biblioteca de péptidos de fagos inxectados ao longo do tempo. (d) mostra a proporción media de LCR/sangue para todos os fagos/ml recuperados ao longo do tempo de mostraxe. (e) Catro péptidos líderes sintéticos e un control desordenado uníronse con biotina á estreptavidina a través do seu extremo N-terminal (exposición tetrámera) seguido de inxección (vea da cola iv, 10 mg de estreptavidina/kg). Polo menos tres ratas intubadas (N = 3). ). Recolléronse mostras de LCR nos puntos de tempo indicados e medíronse as concentracións de estreptavidina mediante ELISA anti-estreptavidina en LCR (nd = non detectado). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baseado na proba ANOVA). (f) Comparación da secuencia de aminoácidos do clon de péptidos fagos máis enriquecido nº 2002 (púrpura) con outros clons de péptidos fagos seleccionados da 4.ª rolda de selección. Os fragmentos de aminoácidos idénticos e similares están codificados por cores.
De todos os fagos enriquecidos na cuarta rolda (Fig. 3b), seleccionáronse seis clons candidatos para unha análise individual posterior no modelo de mostraxe de LCR. Inxectáronse cantidades iguais de seis bibliotecas de péptidos de fagos candidatos, fagos baleiros (sen inserto) e profagos en tres animais CM canulados, e a farmacocinética determinouse en ensaios de LCR (Fig. 3c) e sangue (Fig. suplementaria 7). Todos os clons de fagos probados dirixíronse ao compartimento do LCR a un nivel de 10 a 1000 veces superior ao do fago de control baleiro (n.º 1779). Por exemplo, os clons n.º 2020 e n.º 2077 tiñan títulos de LCR unhas 1000 veces maiores que os do fago de control. O perfil farmacocinético de cada péptido seleccionado é diferente, pero todos eles teñen unha alta capacidade de localización no LCR. Observamos unha diminución constante ao longo do tempo para os clons #1903 e #2011, mentres que para os clons #2077, #2002 e #2009 un aumento durante os primeiros 10 minutos podería indicar transporte activo, pero debe ser verificado. Os clons #2020, #2002 e #2077 estabilizáronse en niveis altos, mentres que a concentración de LCR do clon #2009 diminuíu lentamente despois do aumento inicial. Despois comparamos a frecuencia relativa de cada candidato a LCR coa súa concentración no sangue (Fig. 3d). A correlación do título medio de cada candidato a LCR co seu título no sangue en todos os momentos de mostraxe mostrou que tres dos seis candidatos estaban significativamente enriquecidos en LCR no sangue. Curiosamente, o clon #2077 mostrou unha maior estabilidade no sangue (Figura suplementaria 7). Para confirmar que os propios péptidos son capaces de transportar activamente carga distinta das partículas do fago ao compartimento do LCR, sintetizamos catro péptidos líderes derivatizados con biotina no extremo N-terminal onde os péptidos se unen á partícula do fago. Os péptidos biotinilados (n.º 2002, 2009, 2020 e 2077) conxugáronse con estreptavidina (SA) para obter formas multiméricas que imitaban dalgún xeito a xeometría do fago. Este formato tamén nos permitiu medir a exposición a SA no sangue e no líquido cefalorraquídeo como péptidos proteicos transportadores de carga. É importante destacar que os datos do fago a miúdo podíanse reproducir cando se administraban péptidos sintéticos neste formato conxugado con SA (Fig. 3e). Os péptidos mesturados tiveron unha menor exposición inicial e unha eliminación máis rápida do LCR con niveis indetectables en 48 horas. Para obter información sobre as vías de administración destes clons de fagos peptídicos no espazo do LCR, analizamos a localización de acertos individuais de péptidos de fagos mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar directamente partículas de fagos 1 hora despois da inxección intravenosa in vivo. Cabe destacar que os clons #2002, #2077 e #2009 puideron detectarse mediante unha forte tinción nos capilares cerebrais, mentres que o fago de control (#1779) e o clon #2020 non se detectaron (Figura suplementaria 8). Isto suxire que estes péptidos contribúen ao efecto no cerebro precisamente ao cruzar a BHE. É necesaria unha análise máis detallada para probar esta hipótese, xa que a ruta BSCFB tamén pode estar implicada. Ao comparar a secuencia de aminoácidos do clon máis enriquecido (#2002) con outros péptidos seleccionados, observouse que algúns deles teñen extensións de aminoácidos similares, o que pode indicar un mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Debido ao seu perfil plasmático único e ao aumento significativo do LCR ao longo do tempo, o clon de presentación en fagos n.º 2077 explorouse máis a fondo durante un período máis longo de 48 horas e foi capaz de reproducir o rápido aumento do LCR observado en asociación cos niveis sostidos de SA (Fig. 4a). En canto a outros clons de fagos identificados, o n.º 2077 tinguíuse fortemente para os capilares cerebrais e mostrou unha colocalización significativa coa lectina marcadora capilar cando se observou a maior resolución e posiblemente algunha tinción no espazo parenquimatoso (Figura 4b). Para investigar se se podían obter efectos farmacolóxicos mediados por péptidos no SNC, realizamos un experimento no que as versións biotiniladas de i) o péptido de tránsito n.º 2077 e ii) o péptido inhibidor de BACE1 se mesturaron con SA en dúas proporcións diferentes. Para unha combinación empregamos só o inhibidor do péptido BACE1 e para a outra empregamos unha proporción de 1:3 de inhibidor do péptido BACE1 a péptido n.º 2077. Ambas as mostras administráronse por vía intravenosa e medíronse os niveis de péptido beta-amiloide 40 (Abeta40) no sangue e no líquido cefalorraquídeo ao longo do tempo. O Abeta40 mediuse no LCR, xa que reflicte a inhibición de BACE1 no parénquima cerebral. Como se esperaba, ambos os complexos reduciron significativamente os niveis sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d). Non obstante, só as mostras que contiñan unha mestura do péptido n.º 2077 e un inhibidor do péptido BACE1 conxugado con SA causaron unha diminución significativa de Abeta40 no líquido cefalorraquídeo (Fig. 4c). Os datos mostran que o péptido n.º 2077 é capaz de transportar a proteína SA de 60 kDa ao SNC e tamén induce efectos farmacolóxicos con inhibidores do péptido BACE1 conxugados con SA.
(a) Inxección clonal (2 × 10 fagos/animal) do fago T7 que mostra os perfís farmacocinéticos a longo prazo do péptido CSF ​​n.º 2077 (RLSSVDSDLSGC) e do fago de control non inxectado (n.º 1779) en polo menos tres ratas intubadas con CM. (b) Imaxe microscópica confocal de microvasos corticais representativos en ratas inxectadas con fago (2 × 10 10 fagos/animal) que mostra a contratinción do péptido n.º 2077 e dos vasos (lectina). Estes clons de fago administráronse a 3 ratas e deixáronse circular durante 1 hora antes da perfusión. Os cerebros seccionáronse e tinguíronse con anticorpos policlonais marcados con FITC contra a cápside do fago T7. Dez minutos antes da perfusión e a posterior fixación, administrouse lectina marcada con DyLight594 por vía intravenosa. Imaxes fluorescentes que mostran a tinguidura con lectina (vermello) da parte luminal dos microvasos e fagos (verde) na luz dos capilares e no tecido cerebral perivascular. A barra de escala corresponde a 10 µm. (c, d) O péptido inhibidor de BACE1 biotinilado, só ou en combinación co péptido de tránsito biotinilado n.º 2077, acoplouse a estreptavidina e logo a inxección intravenosa en polo menos tres ratas CM canuladas (10 mg de estreptavidina/kg). A redución de Aβ40 mediada polo inhibidor do péptido BACE1 mediuse mediante ELISA de Aβ1-40 en sangue (vermello) e líquido cefalorraquídeo (laranxa) nos puntos de tempo indicados. Para unha mellor claridade, debuxouse unha liña punteada no gráfico a unha escala do 100 %. (c) Porcentaxe de redución do Aβ40 no sangue (triángulos vermellos) e no líquido cefalorraquídeo (triángulos laranxas) en ratas tratadas con estreptavidina conxugada co péptido de tránsito nº 2077 e o péptido inhibidor da BACE1 nunha proporción de 3:1. (d) Porcentaxe de redución do Aβ40 no sangue (círculos vermellos) e no líquido cefalorraquídeo (círculos laranxas) de ratas tratadas só con estreptavidina acoplada a un péptido inhibidor da BACE1. A concentración de Aβ no control foi de 420 pg/ml (desviación estándar = 101 pg/ml).
A presentación en fagos aplicouse con éxito en varias áreas da investigación biomédica17. Este método utilizouse para estudos de diversidade vascular in vivo18,19, así como para estudos dirixidos a vasos cerebrais20,21,22,23,24,25,26. Neste estudo, ampliamos a aplicación deste método de selección non só á identificación directa de péptidos dirixidos a vasos cerebrais, senón tamén ao descubrimento de candidatos con propiedades de transporte activo para cruzar a barreira hematoencefálica. Agora describimos o desenvolvemento dun procedemento de selección in vivo en ratas intubadas con CM e demostramos o seu potencial para identificar péptidos con propiedades de localización no LCR. Usando o fago T7 que mostra unha biblioteca de péptidos aleatorios de 12 meros, puidemos demostrar que o fago T7 é o suficientemente pequeno (aproximadamente 60 nm de diámetro)10 como para adaptarse á barreira hematoencefálica, cruzando así directamente a barreira hematoencefálica ou o plexo coroideo. Observamos que a recollida de LCR de ratas CM canuladas era un método de cribado funcional in vivo ben controlado, e que o fago extraído non só se unía á vasculatura, senón que tamén funcionaba como transportador a través da barreira hematoencefálica. Ademais, ao recoller sangue e aplicar simultaneamente HTS ao LCR e aos fagos derivados do sangue, confirmamos que a nosa elección de LCR non estaba influenciada polo enriquecemento de sangue ou a aptitude para a expansión entre roldas de selección. Non obstante, o compartimento sanguíneo forma parte do procedemento de selección, xa que os fagos capaces de alcanzar o compartimento do LCR deben sobrevivir e circular na corrente sanguínea o tempo suficiente para enriquecerse no cerebro. Para extraer información de secuencia fiable dos datos HTS brutos, implementamos filtros adaptados aos erros de secuenciación específicos da plataforma no fluxo de traballo de análise. Ao incorporar parámetros cinéticos no método de cribado, confirmamos a farmacocinética rápida dos fagos T7 de tipo salvaxe (t½ ~ 28 min) no sangue24, 27, 28 e tamén determinamos a súa semivida no líquido cefalorraquídeo (t½ ~ 26 min) por minuto. A pesar de perfís farmacocinéticos similares no sangue e no LCR, só se puido detectar o 0,001 % da concentración sanguínea do fago no LCR, o que indica unha baixa mobilidade de fondo do fago T7 de tipo salvaxe a través da barreira hematoencefálica. Este traballo destaca a importancia da primeira rolda de selección ao usar estratexias de selección in vivo, especialmente para sistemas de fagos que se eliminan rapidamente da circulación, xa que poucos clons son capaces de chegar ao compartimento do SNC. Así, na primeira rolda, a redución na diversidade da biblioteca foi moi grande, xa que só se recolleu finalmente un número limitado de clons neste modelo de LCR moi estrito. Esta estratexia de selección in vivo incluíu varios pasos de selección, como a acumulación activa no compartimento do LCR, a supervivencia dos clons no compartimento do sangue e a eliminación rápida dos clons do fago T7 do sangue nos primeiros 10 minutos (Fig. 1d e Fig. suplementaria 4M). Así, despois da primeira rolda, identificáronse diferentes clons de fagos no LCR, aínda que se usou o mesmo conxunto inicial para animais individuais. Isto suxire que varios pasos de selección estrita para bibliotecas de orixe con gran número de membros da biblioteca resultan nunha redución significativa da diversidade. Polo tanto, os eventos aleatorios converteranse nunha parte integral do proceso de selección inicial, influíndo en gran medida no resultado. É probable que moitos dos clons da biblioteca orixinal tivesen unha propensión ao enriquecemento de CSF moi similar. Non obstante, mesmo nas mesmas condicións experimentais, os resultados da selección poden diferir debido ao pequeno número de cada clon en particular no conxunto inicial.
Os motivos enriquecidos en LCR difiren dos do sangue. Curiosamente, observamos o primeiro cambio cara a péptidos ricos en glicina no sangue de animais individuais. (Fig. 1g, Figs. suplementarias 4e, 4f). Os fagos que conteñen péptidos de glicina poden ser máis estables e menos propensos a ser retirados da circulación. Non obstante, estes péptidos ricos en glicina non se detectaron nas mostras de líquido cefalorraquídeo, o que suxire que as bibliotecas seleccionadas pasaron por dous pasos de selección diferentes: un no sangue e outro permitido acumularse no líquido cefalorraquídeo. Os clons enriquecidos en LCR resultantes da cuarta rolda de selección foron amplamente probados. Confirmouse que case todos os clons probados individualmente estaban enriquecidos en LCR en comparación co fago de control en branco. Examinouse con máis detalle un péptido acertado (n.º 2077). Mostrou unha vida media plasmática máis longa en comparación con outros acertos (Figura 3d e Figura suplementaria 7) e, curiosamente, este péptido contiña un residuo de cisteína no extremo C-terminal. Recentemente demostrouse que a adición de cisteína aos péptidos pode mellorar as súas propiedades farmacocinéticas ao unirse á albumina 29. Isto descoñécese actualmente para o péptido nº 2077 e require máis estudos. Algúns péptidos mostraron unha dependencia da valencia no enriquecemento do LCR (datos non mostrados), que pode estar relacionada coa xeometría superficial mostrada da cápside T7. O sistema T7 que empregamos mostrou de 5 a 15 copias de cada péptido por partícula do fago. A IHC realizouse en clons candidatos de fagos líderes inxectados por vía intravenosa no córtex cerebral de ratas (Figura suplementaria 8). Os datos mostraron que polo menos tres clons (nº 2002, nº 2009 e nº 2077) interactuaron coa BHE. Queda por determinar se esta interacción da BHE resulta na acumulación de LCR ou no movemento destes clons directamente ao córtex cerebral de células escamosas (BCSFB). É importante destacar que demostramos que os péptidos seleccionados conservan a súa capacidade de transporte de LCR cando se sintetizan e se unen á carga proteica. A unión de péptidos biotinilados N-terminais a SA repite esencialmente os resultados obtidos cos seus respectivos clons de fagos no sangue e no líquido cefalorraquídeo (Fig. 3e). Finalmente, demostramos que o péptido principal #2077 é capaz de promover a acción cerebral dun inhibidor peptídico biotinilado de BACE1 conxugado con SA, causando efectos farmacodinámicos pronunciados no SNC ao reducir significativamente os niveis de Abeta40 no LCR (Fig. 4). Non puidemos identificar ningún homólogo na base de datos realizando unha busca de homoloxía de secuencia peptídica de todos os resultados. É importante ter en conta que o tamaño da biblioteca T7 é de aproximadamente 109, mentres que o tamaño teórico da biblioteca para 12-meros é de 4 x 1015. Polo tanto, só seleccionamos unha pequena fracción do espazo de diversidade da biblioteca de péptidos de 12-meros, o que pode significar que se poden identificar péptidos máis optimizados avaliando o espazo de secuencia adxacente destes resultados identificados. Hipoteticamente, unha das razóns polas que non atopamos ningún homólogo natural destes péptidos podería ser a deselección durante a evolución para evitar a entrada incontrolada de certos motivos peptídicos no cerebro.
En conxunto, os nosos resultados proporcionan unha base para traballos futuros para identificar e caracterizar os sistemas de transporte da barreira cerebrovascular in vivo con máis detalle. A configuración básica deste método baséase nunha estratexia de selección funcional que non só identifica clons con propiedades de unión vascular cerebral, senón que tamén inclúe un paso crítico no que os clons exitosos teñen actividade intrínseca para cruzar as barreiras biolóxicas in vivo cara ao compartimento do SNC. O obxectivo é dilucidar o mecanismo de transporte destes péptidos e a súa preferencia por unirse á microvasculatura específica da rexión cerebral. Isto pode levar ao descubrimento de novas vías para o transporte da BHE e os receptores. Agardamos que os péptidos identificados poidan unirse directamente aos receptores cerebrovasculares ou aos ligandos circulantes transportados a través da BHE ou do BCSFB. Os vectores peptídicos con actividade de transporte no LCR descubertos neste traballo serán investigados máis a fondo. Actualmente estamos a investigar a especificidade cerebral destes péptidos pola súa capacidade para cruzar a BHE e/ou o BCSFB. Estes novos péptidos serán ferramentas extremadamente valiosas para o posible descubrimento de novos receptores ou vías e para o desenvolvemento de novas plataformas altamente eficientes para a administración de macromoléculas, como os biolóxicos, ao cerebro.
Canular a cisterna grande (MC) usando unha modificación do método descrito previamente. As ratas Wistar anestesiadas (200-350 g) foron montadas nun aparello estereotáxico e realizouse unha incisión media sobre o coiro cabeludo rapado e preparado asépticamente para expoñer o cranio. Perforar dous orificios na zona da faixa superior e fixar os parafusos de fixación nos orificios. Perforouse un orificio adicional na crista occipital lateral para a guía estereotáxica dunha cánula de aceiro inoxidable na MC. Aplicar cemento dental arredor da cánula e asegurar con parafusos. Despois da fotocuraxe e o endurecemento do cemento, a ferida da pel pechouse cunha sutura supramida 4/0. A colocación correcta da cánula confírmase mediante a fuga espontánea de líquido cefalorraquídeo (LCR). Retirar a rata do aparello estereotáxico, recibir coidados posoperatorios e tratamento da dor axeitados e deixar que se recupere durante polo menos unha semana ata que se observen signos de sangue no líquido cefalorraquídeo. As ratas Wistar (Crl:WI/Han) obtivéronse de Charles River (Francia). Todas as ratas mantivéronse en condicións específicas libres de patóxenos. Todos os experimentos con animais foron aprobados pola Oficina Veterinaria da cidade de Basilea, Suíza, e realizáronse de acordo coa licenza animal nº 2474 (Avaliación do transporte cerebral activo mediante a medición dos niveis de candidatos terapéuticos no líquido cefalorraquídeo e no cerebro de ratas).
Manteña a rata consciente con coidado coa cánula CM na man. Retire a Datura da cánula e recolla 10 µl de líquido cefalorraquídeo que flúe espontaneamente. Dado que a permeabilidade da cánula acabou por verse comprometida, só se incluíron neste estudo mostras de líquido cefalorraquídeo transparentes sen evidencias de contaminación ou decoloración por sangue. En paralelo, tomáronse aproximadamente de 10 a 20 μl de sangue dunha pequena incisión na punta da cola en tubos con heparina (Sigma-Aldrich). Recolléronse LCR e sangue en varios momentos despois da inxección intravenosa do fago T7. Desbotáronse aproximadamente de 5 a 10 μl de líquido antes de recoller cada mostra de LCR, o que corresponde ao volume morto do catéter.
As bibliotecas xeráronse empregando o vector T7Select 10-3b tal e como se describe no manual do sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). En resumo, sintetizouse un inserto de ADN aleatorio de 12 meros no seguinte formato:
O codón NNK utilizouse para evitar codóns de terminación dobres e a sobreexpresión de aminoácidos no inserto. N é unha proporción equimolar mesturada manualmente de cada nucleótido e K é unha proporción equimolar mesturada manualmente de nucleótidos de adenina e citosina. As rexións monocatenarias convertéronse en ADN bicatenario mediante unha incubación adicional con dNTP (Novagen) e encima Klenow (New England Biolabs) en tampón Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37 °C. Despois da reacción, o ADN bicatenario recuperouse mediante precipitación con EtOH. O ADN resultante dixeriuse cos encimas de restrición EcoRI e HindIII (ambas de Roche). O inserto clivado e purificado (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) ligouse entón no marco de cultivo nun vector T7 preclivado despois do aminoácido 348 do xene da cápside 10B. As reaccións de ligación incubáronse a 16 °C durante 18 horas antes do empaquetamento in vitro. O empaquetamento de fagos in vitro realizouse segundo as instrucións subministradas co kit de clonación T7Select 10-3b (Novagen) e a solución de empaquetamento amplificouse unha vez ata a lise utilizando Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Os lisados ​​centrifugáronse, tituláronse e conxeláronse a -80 °C como unha solución madre de glicerol.
Amplificación por PCR directa de rexións variables de fagos amplificadas en caldo ou placa usando cebadores de fusión 454/Roche-amplicón propietarios. O cebador de fusión directa contén secuencias que flanquean a rexión variable (NNK) 12 (específica do molde), o adaptador A de titanio GS FLX e unha secuencia clave de biblioteca de catro bases (TCAG) (Figura suplementaria 1a):
O cebador de fusión inversa tamén contén biotina unida a esferas de captura e o adaptador B de titanio GS FLX necesario para a amplificación clonal durante a PCR en emulsión:
Os amplicóns foron sometidos a pirosecuenciación 454/Roche segundo o protocolo 454 GS-FLX Titanium. Para a secuenciación manual de Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), o ADN do fago T7 amplificouse mediante PCR e secuenciouse cos seguintes pares de cebadores:
Os insertos de placas individuais foron sometidos a amplificación por PCR usando o kit de ADN polimerase Roche Fast Start (segundo as instrucións do fabricante). Realizouse un arranque en quente (10 min a 95 °C) e 35 ciclos de refuerzo (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
Amplificáronse fagos de bibliotecas, fagos de tipo salvaxe, fagos rescatados do LCR e do sangue ou clons individuais en Escherichia coli BL5615 en caldo de tuberculose (Sigma Aldrich) ou en placas de 500 cm2 (Thermo Scientific) durante 4 h a 37 °C. Os fagos extraéronse das placas enxaugándoas con tampón Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou recollendo as placas con puntas de pipeta estériles. Os fagos illáronse do sobrenadante de cultivo ou do tampón de extracción cunha rolda de precipitación con polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) e resuspendiuse en tampón Tris-EDTA.
O fago amplificado foi sometido a 2-3 roldas de eliminación de endotoxinas usando esferas de eliminación de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes da inxección intravenosa (IV) (500 μl/animal). Na primeira rolda, introducíronse 2×1012 fagos; na segunda, 2×1010 fagos; nas terceira e cuarta roldas de selección, 2×109 fagos por animal. O contido de fagos nas mostras de LCR e sangue recollidas nos puntos de tempo indicados determinouse mediante contaxe de placas segundo as instrucións do fabricante (manual do sistema T7Select). A selección de fagos realizouse mediante inxección intravenosa de bibliotecas purificadas na vea da cola ou mediante reinxección de fagos extraídos do LCR da rolda de selección anterior, e as colleitas posteriores realizáronse aos 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min, respectivamente, de mostras de LCR e sangue. Realizáronse un total de catro roldas de selección in vivo nas que as dúas ramas seleccionadas se almacenaron e analizaron por separado durante as tres primeiras roldas de selección. Todos os insertos de fagos extraídos do LCR das dúas primeiras roldas de selección sometéronse a pirosecuenciación 454/Roche, mentres que todos os clons extraídos do LCR das dúas últimas roldas de selección secuenciáronse manualmente. Todos os fagos do sangue da primeira rolda de selección tamén se someteron a pirosecuenciación 454/Roche. Para a inxección de clons de fagos, os fagos seleccionados amplificáronse en E. coli (BL5615) en placas de 500 cm2 a 37 °C durante 4 horas. Os clons seleccionados individualmente e secuenciados manualmente propagáronse en medio TB. Despois da extracción dos fagos, a purificación e a eliminación da endotoxina (como se describiu anteriormente), inxectáronse por vía intravenosa 2 × 1010 fagos/animal en 300 μl nunha vea da cola.
Preprocesamento e filtrado cualitativo dos datos de secuencia. Os datos brutos de 454/Roche convertéronse dun formato de mapa de fluxo estándar binario (sff) a un formato lexible por humanos de Pearson (fasta) empregando software do provedor. O procesamento posterior da secuencia de nucleótidos realizouse empregando programas e scripts C propietarios (paquete de software non publicado) como se describe a continuación. A análise dos datos primarios inclúe procedementos estritos de filtrado en varias etapas. Para filtrar as lecturas que non contiñan unha secuencia de ADN de inserción de 12 meros válida, as lecturas aliñáronse secuencialmente coa etiqueta de inicio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), a etiqueta de finalización (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e a inserción de fondo (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) empregando a proba global de Needleman-Wunsch. O aliñamento permite ata 2 inconsistencias por aliñamento31. Polo tanto, elimináronse da biblioteca as lecturas sen etiquetas de inicio e finalización e as lecturas que conteñen insercións de fondo, é dicir, aliñamentos que superan o número permitido de desaxustes. En canto ás lecturas restantes, a secuencia de ADN N-mer que se estende desde a marca de inicio e remata antes da marca de parada foi excisada da secuencia de lectura orixinal e procesada posteriormente (en diante denominada "inserción"). Despois da tradución da inserción, a porción posterior ao primeiro codón de parada no extremo 5' do cebador elimínase da inserción. Ademais, tamén se eliminaron os nucleótidos que levan a codóns incompletos no extremo 3' do cebador. Para excluír as insercións que contiñan só secuencias de fondo, tamén se eliminaron as insercións traducidas que comezan co patrón de aminoácidos "PAG". Elimináronse da biblioteca os péptidos cunha lonxitude postraducional inferior a 3 aminoácidos. Finalmente, eliminouse a redundancia no conxunto de insercións e determinouse a frecuencia de cada inserción única. Os resultados desta análise incluíron unha lista de secuencias de nucleótidos (insercións) e as súas frecuencias (de lectura) (Figuras suplementarias 1c e 2).
Agrupar insercións de ADN N-mer por semellanza de secuencia: Para eliminar erros de secuenciación específicos de 454/Roche (como problemas coas extensións de homopolímeros de secuenciación) e eliminar redundancias menos importantes, as insercións (insercións) de secuencia de ADN N-mer filtradas previamente ordénanse por semellanza. insercións (permítense ata 2 bases non coincidentes) usando un algoritmo iterativo definido do seguinte xeito: as insercións ordénanse primeiro pola súa frecuencia (de maior a menor) e, se son iguais, pola súa clasificación secundaria por lonxitude (de maior a menor)). Así, as insercións máis frecuentes e longas definen o primeiro "grupo". A frecuencia do grupo establécese na frecuencia clave. Despois, intentouse engadir ao grupo cada inserción restante na lista ordenada mediante aliñamento de Needleman-Wunsch por pares. Se o número de discrepancias, insercións ou delecións nun aliñamento non supera un limiar de 2, engádese unha inserción ao grupo e a frecuencia xeral do grupo aumenta segundo a frecuencia coa que se engadiu a inserción. As insercións engadidas a un grupo márcanse como usadas e exclúense de procesamento posterior. Se a secuencia de inserción non se pode engadir a un grupo xa existente, esta úsase para crear un novo grupo coa frecuencia de inserción axeitada e marcado como usado. A iteración remata cando cada secuencia de inserción se usou para formar un novo grupo ou se pode incluír nun grupo xa existente. Despois de todo, as insercións agrupadas que constan de nucleótidos tradúcense finalmente en secuencias peptídicas (bibliotecas de péptidos). O resultado desta análise é un conxunto de insercións e as súas frecuencias correspondentes que conforman o número de lecturas consecutivas (Figura suplementaria 2).
Xeración de motivos: Baseándose nunha lista de péptidos únicos, creouse unha biblioteca que contén todos os patróns de aminoácidos (aa) posibles, como se mostra a continuación. Cada patrón posible de lonxitude 3 extraeuse do péptido e engadiuse o seu patrón inverso xunto cunha biblioteca de motivos comúns que contén todos os patróns (tripéptidos). Secuenciáronse bibliotecas de motivos altamente repetitivos e eliminouse a redundancia. Despois, para cada tripéptido da biblioteca de motivos, comprobamos a súa presenza na biblioteca mediante ferramentas computacionais. Neste caso, engádese a frecuencia do péptido que contén o tripéptido motivo atopado e asígnase ao motivo na biblioteca de motivos ("número de motivos"). O resultado da xeración de motivos é unha matriz bidimensional que contén todas as aparicións de tripéptidos (motivos) e os seus respectivos valores, que son o número de lecturas de secuenciación que dan como resultado o motivo correspondente cando as lecturas se filtran, agrupan e traducen. Métricas como se describe en detalle anteriormente.
Normalización do número de motivos e diagramas de dispersión correspondentes: o número de motivos para cada mostra normalizouse mediante
onde ni é o número de lecturas que conteñen o tema i. Polo tanto, vi representa a frecuencia porcentual de lecturas (ou péptidos) que conteñen o motivo i na mostra. Os valores P para o número non normalizado de motivos calculáronse mediante a proba exacta de Fisher. En canto aos correlogramas do número de motivos, as correlacións de Spearman calculáronse utilizando o número normalizado de motivos con R.
Para visualizar o contido de aminoácidos en cada posición da biblioteca de péptidos, creáronse os logogramas web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Primeiro, o contido de aminoácidos en cada posición do péptido de 12 meros almacénase nunha matriz de 20×12. Despois, xérase un conxunto de 1000 péptidos que conteñen o mesmo contido relativo de aminoácidos en cada posición en formato fasta-sequence e proporciónase como entrada a web-logo 3, que xera unha representación gráfica do contido relativo de aminoácidos en cada posición para unha biblioteca de péptidos determinada. Para visualizar conxuntos de datos multidimensionais, creáronse mapas de calor usando unha ferramenta desenvolvida internamente en R (biosHeatmap, un paquete R aínda por lanzar). Os dendrogramas presentados nos mapas de calor calculáronse usando o método de agrupamento xerárquico de Ward coa métrica de distancia euclidiana. Para a análise estatística dos datos de puntuación de motivos, calculáronse os valores P para a puntuación non normalizada usando a proba exacta de Fisher. Os valores P para outros conxuntos de datos calculáronse en R usando a proba t de Student ou ANOVA.
Inxectáronse por vía intravenosa clons de fagos seleccionados e fagos sen insertos a través da vea da cola (2×1010 fagos/animal en 300 μl de PBS). Dez minutos antes da perfusión e posterior fixación, inxectáronselles por vía intravenosa 100 μl de lectina marcada con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) aos mesmos animais. 60 minutos despois da inxección de fagos, perfundíronse as ratas a través do corazón con 50 ml de PBS seguido de 50 ml de PFA/PBS ao 4%. As mostras cerebrais fixáronse adicionalmente durante a noite en PFA/PBS ao 4% e mergulláronse en sacarosa ao 30% durante a noite a 4 °C. As mostras conxélanse rapidamente na mestura OCT. A análise inmunohistoquímica de mostras conxeladas realizouse a temperatura ambiente en crioseccións de 30 µm bloqueadas con BSA ao 1 % e incubadas con anticorpos policlonais marcados con FITC contra o fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Incubar durante a noite. Finalmente, as seccións laváronse 3 veces con PBS e examináronse cun microscopio láser confocal (Leica TCS SP5).
Todos os péptidos cunha pureza mínima do 98 % foron sintetizados por GenScript USA, biotinilados e liofilizados. A biotina únese a través dun espazador triplo de glicina adicional no extremo N-terminal. Comprobe todos os péptidos mediante espectrometría de masas.
A estreptavidina (Sigma S0677) mesturouse cun exceso equimolar de 5 veces de péptido biotinilado, péptido inhibidor de BACE1 biotinilado ou unha combinación (proporción 3:1) de péptido inhibidor de BACE1 biotinilado e péptido inhibidor de BACE1 en 5–10 % de DMSO/incubouse en PBS. 1 hora a temperatura ambiente antes da inxección. Os péptidos conxugados con estreptavidina inxectáronse por vía intravenosa a unha dose de 10 mg/kg nunha das veas da cola de ratas cunha cavidade cerebral.
A concentración de complexos estreptavidina-péptido avaliouse mediante ELISA. As placas de microtitulación Nunc Maxisorp (Sigma) revistironse durante a noite a 4 °C con 1,5 μg/ml de anticorpo anti-estreptavidina de rato (Thermo, MA1-20011). Despois do bloqueo (tampón de bloqueo: 140 nM de NaCL, 5 mM de EDTA, 0,05 % de NP40, 0,25 % de xelatina, 1 % de BSA) a temperatura ambiente durante 2 horas, lavouse a placa con 0,05 % de Tween-20/PBS (tampón de lavado) durante 3 segundos. Engadíronse mostras de LCR e plasma aos pozos diluídos con tampón de bloqueo (plasma 1:10.000, LCR 1:115). Despois, a placa incubouse durante a noite a 4 °C con anticorpo de detección (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Despois de tres pasos de lavado, detectouse a estreptavidina por incubación en solución de substrato TMB (Roche) durante un máximo de 20 minutos. Despois de deter o desenvolvemento da cor con H2SO4 1M, mide a absorbancia a 450 nm.
A función do complexo estreptavidina-péptido-inhibidor da BACE1 avaliouse mediante ELISA de Aβ(1-40) segundo o protocolo do fabricante (Wako, 294-64701). En resumo, as mostras de LCR diluíronse en diluínte estándar (1:23) e incubáronse durante a noite a 4 °C en placas de 96 pozos recubertas con anticorpo de captura BNT77. Despois de cinco pasos de lavado, engadiuse o anticorpo BA27 conxugado con HRP e incubouse durante 2 horas a 4 °C, seguido de cinco pasos de lavado. O Aβ(1–40) detectouse por incubación en solución TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despois de deter o desenvolvemento da cor coa solución de parada, mide a absorbancia a 450 nm. As mostras de plasma sometéronse a extracción en fase sólida antes do ELISA de Aβ(1–40). O plasma engadiuse a DEA ao 0,2 % (Sigma) en placas de 96 pozos e incubouse a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despois de lavar sucesivamente as placas SPE (Oasis, 186000679) con auga e metanol ao 100 %, engadíronse mostras de plasma ás placas SPE e retirouse todo o líquido. As mostras laváronse (primeiro con metanol ao 5 % e despois con metanol ao 30 %) e eluíronse con NH4OH ao 2 %/metanol ao 90 %. Despois de secar o eluato a 55 °C durante 99 minutos a corrente constante de N2, as mostras reducíronse en diluíntes estándar e mediuse o Aβ(1–40) como se describiu anteriormente.
Como citar este artigo: Urich, E. et al. Entrega de carga ao cerebro mediante péptidos de tránsito identificados in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB e Moos T. Administración de fármacos macromoleculares ao cerebro mediante terapia dirixida. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. e Martinez-Martinez, P. Administración de fármacos peptídicos e proteicos a través da barreira hematoencefálica. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM A barreira hematoencefálica: un obstáculo no desenvolvemento de fármacos para o cerebro. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG e Byrd, A. Perspectivas para mellorar a administración de fármacos e a súa dirección ao cerebro a través da vía plexo coroideo-LCR. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernización de biofármacos con cabalos de Troia moleculares para a administración no cerebro. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transporte de péptidos mediado por receptores WM a través da barreira hematoencefálica. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Aumentar a penetración cerebral e a eficacia dos anticorpos terapéuticos mediante lanzaderas moleculares monovalentes. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. O transporte do receptor da transferrina (TfR) determina a captación cerebral de variantes de afinidade dos anticorpos TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).