Grazas por visitar Nature.com.Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez.Use os botóns Anterior e Seguinte para moverse por tres diapositivas á vez, ou use os botóns deslizantes ao final para moverse por tres diapositivas á vez.
A barreira hematoencefálica e a barreira hematoencefálica impiden que os axentes bioterapéuticos cheguen aos seus obxectivos no sistema nervioso central, dificultando así o tratamento eficaz das enfermidades neurolóxicas.Para descubrir novos transportadores cerebrais in vivo, introducimos unha biblioteca de péptidos do fago T7 e recollemos sangue e líquido cefalorraquídeo (LCR) en serie usando un modelo de piscina grande consciente canulado de ratas.Os clons de fagos específicos foron moi enriquecidos en LCR despois de catro roldas de selección.As probas de péptidos candidatos individuais revelaron un enriquecemento de máis de 1000 veces no LCR.A bioactividade da entrega ao cerebro mediada por péptidos foi confirmada por unha redución do 40% no nivel de amiloide-β no líquido cefalorraquídeo mediante un inhibidor peptídico BACE1 ligado ao novo péptido de tránsito identificado.Estes resultados suxiren que os péptidos identificados mediante métodos de selección de fagos in vivo poden ser vehículos útiles para a entrega sistémica de macromoléculas ao cerebro cun efecto terapéutico.
A investigación terapéutica dirixida ao sistema nervioso central (SNC) centrouse en gran medida na identificación de fármacos e axentes optimizados que presentan propiedades de orientación ao SNC, con menos esforzo para descubrir os mecanismos que impulsan a entrega activa de fármacos ao cerebro.Isto está empezando a cambiar agora xa que a entrega de fármacos, especialmente as moléculas grandes, é unha parte integral do desenvolvemento de fármacos da neurociencia moderna.O ambiente do sistema nervioso central está ben protexido polo sistema de barreira cerebrovascular, composto pola barreira hematoencefálica (BBB) ​​e a barreira hematoencefálica (BCBB)1, polo que é difícil entregar medicamentos ao cerebro1,2.Estímase que case todos os fármacos de moléculas grandes e máis do 98% dos fármacos de moléculas pequenas son eliminados do cerebro3.Por iso é moi importante identificar novos sistemas de transporte cerebral que proporcionen unha entrega eficiente e específica de fármacos terapéuticos ao SNC 4,5.Non obstante, o BBB e o BCSFB tamén presentan unha excelente oportunidade para a administración de fármacos xa que penetran e entran en todas as estruturas do cerebro a través da súa extensa vasculatura.Así, os esforzos actuais para utilizar métodos non invasivos de entrega ao cerebro baséanse en gran medida no mecanismo de transporte mediado por receptores (PMT) que utiliza o receptor BBB6 endóxeno.A pesar dos avances clave recentes que empregan a vía do receptor da transferrina7,8, é necesario desenvolver novos sistemas de entrega con propiedades melloradas.Para iso, o noso obxectivo era identificar péptidos capaces de mediar o transporte do LCR, xa que en principio poderían utilizarse para entregar macromoléculas ao SNC ou para abrir novas vías de receptores.En particular, receptores e transportadores específicos do sistema cerebrovascular (BBB e BSCFB) poden servir como dianas potenciais para a entrega activa e específica de fármacos bioterapéuticos.O líquido cefalorraquídeo (LCR) é un produto secretor do plexo coroide (CS) e está en contacto directo co líquido intersticial do cerebro a través do espazo subaracnoideo e do espazo ventricular4.Recentemente demostrouse que o líquido cefalorraquídeo subaracnoideo difunde excesivamente no intersticio do cerebro9.Esperamos acceder ao espazo parénquimatoso mediante este tracto de entrada subaracnoidea ou directamente a través do BBB.Para logralo, implementamos unha estratexia sólida de selección de fagos in vivo que identifica idealmente os péptidos transportados por calquera destas dúas vías distintas.
Agora describimos un método de cribado secuencial de visualización de fagos in vivo con mostraxe de LCR xunto cunha secuenciación de alto rendemento (HTS) para controlar as roldas de selección iniciais coa maior diversidade de bibliotecas.Realizouse o cribado en ratas conscientes cunha cánula de cisterna grande (CM) implantada de forma permanente para evitar a contaminación do sangue.É importante destacar que este enfoque selecciona tanto a orientación cerebral como os péptidos con actividade de transporte a través da barreira cerebrovascular.Usamos fagos T7 debido ao seu pequeno tamaño (~60 nm)10 e suxerimos que son axeitados para o transporte de vesículas que permiten o cruzamento transcelular da barreira endotelial e/ou epitelial-medular.Despois de catro quendas de panorámicas, as poboacións de fagos foron illadas mostrando un forte enriquecemento in vivo de LCR e asociación de microvasos cerebrais.É importante destacar que puidemos confirmar os nosos descubrimentos demostrando que os péptidos candidatos preferidos e sintetizados químicamente son capaces de transportar carga de proteínas ao líquido cefalorraquídeo.En primeiro lugar, os efectos farmacodinámicos do SNC establecéronse combinando un péptido de tránsito líder cun inhibidor do péptido BACE1.Ademais de demostrar que as estratexias de cribado funcional in vivo poden identificar novos péptidos de transporte cerebral como transportadores de carga de proteínas eficaces, esperamos que enfoques similares de selección funcional tamén sexan importantes para identificar novas vías de transporte cerebral.
A partir das unidades formadoras de placas (PFU), despois da etapa de empaquetado do fago, deseñouse e creouse unha biblioteca de péptidos de fagos T7 lineais aleatorios de 12 meros cunha diversidade de aproximadamente 109 (ver Materiais e métodos).É importante ter en conta que analizamos coidadosamente esta biblioteca antes da panorámica in vivo.A amplificación por PCR de mostras da biblioteca de fagos mediante cebadores modificados xerou amplicóns que eran directamente aplicables a HTS (figura complementaria 1a).Debido a a) erros de secuenciación de HTS11, b) impacto na calidade dos cebadores (NNK) 1-12 e c) á presenza de fagos de tipo salvaxe (wt) (insercións de esqueleto) na biblioteca en espera, implementouse un procedemento de filtrado de secuencias para extraer só información de secuencias verificadas (figura complementaria 1b).Estes pasos de filtro aplícanse a todas as bibliotecas de secuenciación HTS.Para a biblioteca estándar, obtivéronse un total de 233.868 lecturas, das cales o 39% superou os criterios de filtro e utilizáronse para a análise e selección da biblioteca para as roldas posteriores (Figura complementaria 1c-e).As lecturas foron predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de lonxitude cun pico en 36 nucleótidos (figura complementaria 1c), confirmando o deseño da biblioteca (NNK) 1-12.Notablemente, aproximadamente o 11% dos membros da biblioteca contiñan un inserto PAGISRELVDKL de tipo salvaxe (wt) de 12 dimensións, e case a metade das secuencias (49%) contiñan insercións ou eliminacións.O HTS da biblioteca da biblioteca confirmou a alta diversidade de péptidos na biblioteca: máis do 81% das secuencias peptídicas atopáronse só unha vez e só o 1,5% ocorreu en ≥4 copias (figura complementaria 2a).As frecuencias de aminoácidos (aa) en todas as 12 posicións do repertorio correlacionáronse ben coas frecuencias esperadas para o número de codóns xerados polo repertorio NKK dexenerado (figura complementaria 2b).A frecuencia observada dos residuos aa codificados por estas insercións correlacionouse ben coa frecuencia calculada (r = 0,893) (figura complementaria 2c).A preparación de bibliotecas de fagos para a inxección inclúe os pasos de amplificación e eliminación de endotoxinas.Anteriormente demostrouse que isto reduce potencialmente a diversidade de bibliotecas de fagos12,13.Polo tanto, secuenciamos unha biblioteca de fagos amplificada por placas que sufrira a eliminación de endotoxinas e comparámola coa biblioteca orixinal para estimar a frecuencia de AA.Observouse unha forte correlación (r = 0,995) entre a piscina orixinal e a piscina amplificada e purificada (figura complementaria 2d), o que indica que a competencia entre clons amplificados en placas usando o fago T7 non causou un sesgo importante.Esta comparación baséase na frecuencia dos motivos tripéptidos en cada biblioteca, xa que a diversidade de bibliotecas (~109) non se pode capturar completamente nin sequera con HTS.A análise de frecuencia de aa en cada posición revelou un pequeno sesgo dependente da posición nas tres últimas posicións do repertorio introducido (figura complementaria 2e).En conclusión, concluímos que a calidade e diversidade da biblioteca eran aceptables e que só se observaron pequenos cambios na diversidade debido á amplificación e preparación de bibliotecas de fagos entre varias roldas de selección.
A mostraxe de líquido cefalorraquídeo en serie pódese realizar implantando cirurxicamente unha cánula no CM de ratas conscientes para facilitar a identificación do fago T7 inxectado por vía intravenosa (iv) a través do BBB e/ou BCSFB (Fig. 1a-b).Usamos dous brazos de selección independentes (brazos A e B) nas tres primeiras roldas de selección in vivo (Fig. 1c).Aumentamos gradualmente a rigorosidade da selección diminuíndo a cantidade total de fagos introducidos nas tres primeiras roldas de selección.Para a cuarta quenda de panoramización, combinamos mostras das ramas A e B e realizamos tres seleccións independentes adicionais.Para estudar as propiedades in vivo das partículas do fago T7 neste modelo, inxectouse un fago de tipo salvaxe (inserto mestre PAGISRELVDKL) en ratas a través da vea da cola.A recuperación dos fagos do líquido cefalorraquídeo e do sangue en diferentes momentos mostrou que os fagos icosaédricos T7 relativamente pequenos tiñan unha rápida fase de eliminación inicial do compartimento sanguíneo (figura complementaria 3).En función dos títulos administrados e do volume sanguíneo das ratas, calculamos que só aproximadamente o 1% en peso.O fago da dose administrada detectouse no sangue 10 minutos despois da inxección intravenosa.Despois deste rápido descenso inicial, mediuse un aclaramento primario máis lento cunha vida media de 27,7 minutos.É importante destacar que só se recuperaron moi poucos fagos do compartimento de LCR, o que indica un fondo baixo para a migración de fagos de tipo salvaxe cara ao compartimento de LCR (figura complementaria 3).De media, só se detectaron 1 x 10-3% dos títulos de fago T7 no sangue e 4 x 10-8% dos fagos infundidos inicialmente no líquido cefalorraquídeo durante todo o período de mostraxe (0-250 min).Notablemente, a vida media (25,7 min) do fago de tipo salvaxe no líquido cefalorraquídeo foi similar á observada no sangue.Estes datos demostran que a barreira que separa o compartimento do LCR do sangue está intacta en ratas canuladas con CM, o que permite a selección in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clons que son facilmente transportados do sangue ao compartimento do LCR.
(a) Configurar un método para volver a tomar mostras de líquido cefalorraquídeo (LCR) dunha piscina grande.(b) Diagrama que mostra a localización celular da barreira do sistema nervioso central (SNC) e a estratexia de selección utilizada para identificar os péptidos que atravesan a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira hematoencefálica.(c) Diagrama de fluxo de visualización de fagos in vivo.En cada rolda de selección, inxectáronse por vía intravenosa os fagos (identificadores de animais dentro das frechas).Dúas ramas alternativas independentes (A, B) mantéñense por separado ata a 4a rolda de selección.Para as roldas de selección 3 e 4, cada clon de fago extraído do LCR foi secuenciado manualmente.( d ) Cinética do fago illado do sangue (círculos vermellos) e líquido cefalorraquídeo (triángulos verdes) durante a primeira rolda de selección en dúas ratas canuladas despois da inxección intravenosa da biblioteca de péptidos T7 (2 x 1012 fagos/animal).Os cadrados azuis indican a concentración inicial media de fago no sangue, calculada a partir da cantidade de fago inxectado, tendo en conta o volume total de sangue.Os cadrados negros indican o punto de intersección da liña y extrapolada a partir das concentracións de fagos no sangue.(e,f) Presente a frecuencia relativa e a distribución de todos os posibles motivos tripéptidos superpostos atopados no péptido.Móstrase o número de motivos atopados en 1000 lecturas.Os motivos enriquecidos significativamente (p < 0,001) están marcados con puntos vermellos.(e) Gráfico de dispersión de correlación que compara a frecuencia relativa do motivo tripéptido da biblioteca inxectada co fago derivado do sangue dos animais #1.1 e #1.2.(f) Gráfico de dispersión de correlación que compara as frecuencias relativas dos motivos do tripéptido dos fagos animais #1.1 e #1.2 illados en sangue e líquido cefalorraquídeo.(g, h) Representación de ID de secuencia de fagos enriquecidos en sangue (g) fronte a bibliotecas inxectadas e fagos enriquecidos en LCR (h) fronte a sangue despois dunha rolda de selección in vivo en ambos animais.O tamaño do código dunha letra indica a frecuencia con que se produce ese aminoácido nesa posición.Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, vermello = ácido e negro = aminoácidos hidrófobos.A figura 1a, b foi deseñada e producida por Eduard Urich.
Inxectamos unha biblioteca de péptidos de fagos en dúas ratas de instrumentos CM (clados A e B) e illamos o fago do líquido cefalorraquídeo e do sangue (figura 1d).A eliminación rápida inicial da biblioteca foi menos pronunciada en comparación co fago de tipo salvaxe.A vida media media da biblioteca inxectada en ambos animais foi de 24,8 minutos en sangue, similar ao fago de tipo salvaxe, e de 38,5 minutos no LCR.As mostras de fagos de sangue e líquido cefalorraquídeo de cada animal foron sometidas a HTS e todos os péptidos identificados foron analizados para detectar a presenza dun motivo tripéptido curto.Os motivos tripéptidos escolléronse porque proporcionan unha base mínima para a formación de estruturas e as interaccións péptido-proteína14,15.Atopamos unha boa correlación na distribución de motivos entre a biblioteca de fagos inxectados e os clons extraídos do sangue de ambos animais (Fig. 1e).Os datos indican que a composición da biblioteca só se enriquece marxinalmente no compartimento sanguíneo.As frecuencias de aminoácidos e as secuencias consenso analizáronse máis en cada posición mediante unha adaptación do software Weblogo16.Curiosamente, atopamos un forte enriquecemento nos residuos de glicina no sangue (Fig. 1g).Cando se comparou o sangue con clons seleccionados de LCR, observouse unha forte selección e algunha deseleccion de motivos (Fig. 1f), e certos aminoácidos estaban presentes preferentemente en posicións predeterminadas nos 12 membros (Fig. 1h).Notablemente, os animais individuais diferían significativamente no líquido cefalorraquídeo, mentres que se observou o enriquecemento de glicina no sangue en ambos os animais (figuras complementarias 4a-j).Despois dun filtrado rigoroso dos datos de secuencias no líquido cefalorraquídeo dos animais #1.1 e #1.2, obtivéronse un total de 964 e 420 péptidos únicos de 12-mer (figura complementaria 1d-e).Os clons de fagos illados foron amplificados e sometidos a unha segunda rolda de selección in vivo.Os fagos extraídos da segunda quenda de selección foron sometidos a HTS en cada animal e todos os péptidos identificados foron utilizados como entrada para un programa de recoñecemento de motivos para analizar a aparición de motivos tripéptidos (Fig. 2a, b, ef).En comparación co primeiro ciclo do fago recuperado do LCR, observamos unha maior selección e deseleccion de moitos motivos no LCR nas ramas A e B (Fig. 2).Aplicouse un algoritmo de identificación de rede para determinar se representaban diferentes patróns de secuencia consistente.Observouse unha clara semellanza entre as secuencias de 12 dimensións recuperadas polo LCR no clado alternativo A (Fig. 2c, d) e no clado B (Fig. 2g, h).A análise agrupada en cada rama revelou diferentes perfís de selección para os péptidos 12-mer (Figura complementaria 5c, d) e un aumento da relación de títulos de LCR/sangue ao longo do tempo para os clons agrupados despois da segunda rolda de selección en comparación coa primeira rolda de selección (Figura complementaria 5e).).
Enriquecemento de motivos e péptidos no líquido cefalorraquídeo mediante dúas roldas sucesivas de selección de exhibición de fagos funcionais in vivo.
Todos os fagos do líquido cefalorraquídeo recuperados da primeira rolda de cada animal (animais #1.1 e #1.2) foron agrupados, amplificados, secuenciados con HT e reinxectados xuntos (2 x 1010 fagos/animal) 2 ratas canuladas SM (#1.1 → #).2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4).(a,b,e,f) Gráficos de dispersión de correlación que comparan a frecuencia relativa dos motivos tripéptidos de todos os fagos derivados do LCR na primeira e segunda roldas de selección.Frecuencia relativa e distribución de motivos que representan todos os posibles tripéptidos superpostos atopados en péptidos en ambas as orientacións.Móstrase o número de motivos atopados en 1000 lecturas.Os motivos que foron seleccionados ou excluídos significativamente (p < 0,001) nunha das bibliotecas comparadas resáltanse con puntos vermellos.(c, d, g, h) Representación do logotipo da secuencia de todas as secuencias longas de 12 aminoácidos ricas en LCR baseada nas roldas 2 e 1 de selección in vivo.O tamaño do código dunha letra indica a frecuencia con que se produce ese aminoácido nesa posición.Para representar o logotipo, compárase a frecuencia das secuencias de LCR extraídas de animais individuais entre dúas roldas de selección e móstranse as secuencias enriquecidas na segunda rolda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4.Os aminoácidos máis enriquecidos nunha posición determinada en (c, d) animais non.2.1 e non.2.2 ou (g, h) nos animais núm.2.3 e non.2.4 móstranse en cor.Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, vermello = ácido e negro = aminoácidos hidrófobos.
Despois da terceira rolda de selección, identificamos 124 secuencias peptídicas únicas (n.º 3.1 e n.º 3.2) de 332 clons de fagos reconstituídos con CSF illados de dous animais (figura complementaria 6a).A secuencia LGSVS (18,7%) tivo a maior proporción relativa, seguida das insercións de tipo salvaxe PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%).Na cuarta rolda final, agrupamos dúas ramas seleccionadas de forma independente de tres animais separados (Fig. 1c).Dos 925 clons de fagos secuenciados recuperados do LCR, na cuarta rolda atopamos 64 secuencias peptídicas únicas (figura complementaria 6b), entre as que a proporción relativa de fagos de tipo salvaxe baixou ata o 0,8%.Os clons de LCR máis comúns na cuarta rolda foron LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).O intervalo de lonxitude dos péptidos seleccionados débese a insercións/delecións de nucleótidos ou codóns de parada prematuros nos cebadores da biblioteca cando se usan codóns dexenerados para o deseño da biblioteca NNK.Os codóns de parada prematuros xeran péptidos máis curtos e son seleccionados porque conteñen o motivo favorable aa.Os péptidos máis longos poden resultar de insercións/delecións nos cebadores das bibliotecas sintéticas.Isto sitúa o codón de parada deseñado fóra do cadro e leo ata que aparece un novo codón de parada augas abaixo.En xeral, calculamos os factores de enriquecemento para as catro roldas de selección comparando os datos de entrada cos datos de saída da mostra.Para a primeira quenda de selección, usamos títulos de fagos de tipo salvaxe como referencia de fondo non específica.Curiosamente, a selección de fagos negativos foi moi forte no primeiro ciclo do LCR, pero non no sangue (Fig. 3a), o que pode deberse á baixa probabilidade de difusión pasiva da maioría dos membros da biblioteca peptídica no compartimento do LCR ou os fagos relativos tenden a ser retidos ou eliminados máis eficientemente do torrente sanguíneo que os bacteriófagos.Non obstante, na segunda rolda de panoramización, observouse unha forte selección de fagos no LCR en ambos os clados, o que suxire que a quenda anterior estaba enriquecida en fagos que mostraban péptidos que promoven a captación de LCR (Fig. 3a).De novo, sen un enriquecemento significativo de sangue.Tamén na terceira e cuarta roldas, os clons de fagos enriquecéronse significativamente en LCR.Comparando a frecuencia relativa de cada secuencia peptídica única entre as dúas últimas roldas de selección, descubrimos que as secuencias estaban aínda máis enriquecidas na cuarta rolda de selección (Fig. 3b).Un total de 931 motivos tripeptídicos foron extraídos das 64 secuencias peptídicas únicas utilizando ambas as orientacións peptídicas.Os motivos máis enriquecidos na cuarta rolda examináronse máis detidamente polos seus perfís de enriquecemento en todas as quendas en comparación coa biblioteca inxectada (corte: 10% de enriquecemento) (Figura complementaria 6c).Os patróns xerais de selección mostraron que a maioría dos motivos estudados foron enriquecidos en todas as roldas anteriores de ambas ramas de selección.Non obstante, algúns motivos (por exemplo, SGL, VSG, LGS GSV) eran predominantemente do clado alternativo A, mentres que outros (por exemplo, FGW, RTN, WGF, NTR) estaban enriquecidos no clado alternativo B.
Validación do transporte de LCR de péptidos mostrados en fagos enriquecidos en LCR e péptidos líderes biotinilados conxugados a cargas útiles de estreptavidina.
(a) Relacións de enriquecemento calculadas nas catro roldas (R1-R4) en función dos títulos de fagos (PFU) inxectados (entrada = I) e dos títulos de fagos determinados do LCR (saída = O).Os factores de enriquecemento das tres últimas quendas (R2-R4) calculáronse mediante a comparación coa rolda anterior e a primeira rolda (R1) con datos de peso.As barras abertas son líquido cefalorraquídeo, as barras sombreadas son plasma.(***p<0,001, baseado na proba t de Student).(b) Lista dos péptidos de fagos máis abundantes, clasificados segundo a súa proporción relativa con todos os fagos recollidos no LCR despois da cuarta rolda de selección.Os seis clons de fagos máis comúns están destacados en cor, numerados e os seus factores de enriquecemento entre as roldas 3 e 4 de selección (insertos).( c, d ) Os seis clons de fagos máis enriquecidos, as bibliotecas de fagos baleiros e de péptidos de fagos parentais da rolda 4 analizáronse individualmente nun modelo de mostraxe de CSF.Recolléronse mostras de LCR e sangue nos puntos de tempo indicados.(c) Cantidades iguais de 6 clons de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animais), fagos baleiros (#1779) (2 x 1010 fagos/animais) e bibliotecas de péptidos de fagos (2 x 1012 fagos/animais).Móstrase a farmacocinética de LCR de cada clon de fago inxectado e biblioteca de péptidos de fago ao longo do tempo.(d) mostra a relación media de LCR/sangue para todos os fagos recuperados/ml durante o tempo de mostraxe.(e) Catro péptidos líderes sintéticos e un control revolto foron ligados con biotina a estreptavidina a través do seu extremo N (exhibición de tetrámero) seguido dunha inxección (vea da cola iv, 10 mg de estreptavidina/kg).Polo menos tres ratas intubadas (N = 3).).As mostras de LCR recolléronse nos puntos de tempo indicados e as concentracións de estreptavidina midéronse mediante ELISA anti-estreptavidina de LCR (nd = non detectado).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baseado na proba ANOVA).(f) Comparación da secuencia de aminoácidos do clon #2002 do fago máis enriquecido (púrpura) con outros clons de péptidos do fago seleccionados da 4a rolda de selección.Os fragmentos de aminoácidos idénticos e similares están codificados por cores.
De todos os fagos enriquecidos na cuarta rolda (Fig. 3b), seleccionáronse seis clons candidatos para unha posterior análise individual no modelo de mostraxe de LCR.Inxectáronse cantidades iguais de seis bibliotecas de fagos candidatos, fagos baleiros (sen inserción) e péptidos profagos en tres animais CM canulados e determinouse a farmacocinética en ensaios de LCR (Fig. 3c) e sangue (Figura complementaria 7).Todos os clons de fagos probados dirixíronse ao compartimento do LCR a un nivel 10-1000 veces superior ao do fago control baleiro (#1779).Por exemplo, os clons #2020 e #2077 tiñan unhas 1000 veces máis títulos de LCR que o fago control.O perfil farmacocinético de cada péptido seleccionado é diferente, pero todos teñen unha alta capacidade de localización do LCR.Observamos unha diminución constante ao longo do tempo para os clons #1903 e #2011, mentres que para os clons #2077, #2002 e #2009 un aumento durante os primeiros 10 minutos pode indicar un transporte activo pero é necesario verificalo.Os clons #2020, #2002 e #2077 estabilizáronse en niveis altos, mentres que a concentración de LCR do clon #2009 diminuíu lentamente despois do aumento inicial.A continuación, comparamos a frecuencia relativa de cada candidato a LCR coa súa concentración sanguínea (Fig. 3d).A correlación do título medio de cada candidato a LCR co seu título de sangue en todos os momentos de mostraxe mostrou que tres dos seis candidatos estaban significativamente enriquecidos en LCR de sangue.Curiosamente, o clon #2077 mostrou unha maior estabilidade no sangue (Figura complementaria 7).Para confirmar que os propios péptidos son capaces de transportar activamente cargas distintas das partículas do fago ao compartimento do LCR, sintetizamos catro péptidos líderes derivados con biotina no extremo N-terminal onde os péptidos se unen á partícula do fago.Os péptidos biotinilados (nos. 2002, 2009, 2020 e 2077) conxugáronse con estreptavidina (SA) para obter formas multiméricas que imitaban algo a xeometría do fago.Este formato tamén nos permitiu medir a exposición a SA no sangue e no líquido cefalorraquídeo como péptidos proteicos que transportan carga.É importante destacar que os datos dos fagos poderían reproducirse a miúdo cando se administraron péptidos sintéticos neste formato conxugado con SA (Fig. 3e).Os péptidos revoltos tiveron menos exposición inicial e unha eliminación máis rápida do LCR con niveis indetectables en 48 horas.Para coñecer as vías de entrega destes clons de fagos peptídicos no espazo do LCR, analizamos a localización de golpes de péptidos de fagos individuais mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar directamente partículas de fagos 1 hora despois da inxección intravenosa in vivo.En particular, os clons #2002, #2077 e #2009 puideron detectarse mediante unha forte tinción nos capilares cerebrais, mentres que o fago de control (#1779) e o clon #2020 non se detectaron (Figura 8 complementaria).Isto suxire que estes péptidos contribúen ao efecto sobre o cerebro precisamente atravesando o BBB.Requírese unha análise máis detallada para probar esta hipótese, xa que a ruta BSCFB tamén pode estar implicada.Ao comparar a secuencia de aminoácidos do clon máis enriquecido (#2002) con outros péptidos seleccionados, observouse que algúns deles teñen extensións de aminoácidos similares, o que pode indicar un mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Debido ao seu perfil de plasma único e ao aumento significativo do LCR ao longo do tempo, o clon de exhibición de fagos #2077 foi explorado máis durante un período máis longo de 48 horas e foi capaz de reproducir o rápido aumento do LCR observado en asociación con niveis sostidos de SA (Fig. 4a).Respecto doutros clons de fagos identificados, o # 2077 tinguiuse fortemente para os capilares cerebrais e mostrou unha colocalización significativa coa lectina marcadora capilar cando se viu a maior resolución e posiblemente algunha tinción no espazo parenquimático (figura 4b).Para investigar se se podían obter efectos farmacolóxicos mediados por péptidos no SNC, realizamos un experimento no que se mesturaron versións biotiniladas de i) o péptido de tránsito #2077 e ii) o péptido inhibidor de BACE1 con SA en dúas proporcións diferentes.Para unha combinación usamos só o inhibidor do péptido BACE1 e para a outra usamos unha proporción de 1:3 do inhibidor do péptido BACE1 ao péptido #2077.As dúas mostras administráronse por vía intravenosa e os niveis de sangue e líquido cefalorraquídeo do péptido beta-amiloide 40 (Abeta40) foron medidos ao longo do tempo.Abeta40 mediuse no LCR xa que reflicte a inhibición de BACE1 no parénquima cerebral.Como era de esperar, ambos complexos reduciron significativamente os niveis sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d).Non obstante, só as mostras que conteñan unha mestura de péptido núm.2077 e un inhibidor do péptido BACE1 conxugado a SA provocou unha diminución significativa de Abeta40 no líquido cefalorraquídeo (Fig. 4c).Os datos mostran que o péptido núm.2077 é capaz de transportar a proteína SA de 60 kDa ao SNC e tamén induce efectos farmacolóxicos con inhibidores do péptido BACE1 conxugados a SA.
(a) Inxección clonal (2 × 10 fagos/animal) do fago T7 que mostra perfís farmacocinéticos a longo prazo do péptido CSF ​​#2077 (RLSSVDSDLSGC) e do fago control non inxectado (#1779) en polo menos tres ratas intubadas con CM.(b) Imaxe microscópica confocal de microvasos corticais representativos en ratas inxectadas con fagos (2 × 10 10 fagos/animal) que mostra a contratinción do péptido #2077 e dos vasos (lectina).Estes clons de fagos administráronse a 3 ratas e deixáronse circular durante 1 hora antes da perfusión.Seccionáronse os cerebros e tinguironse con anticorpos policlonais marcados con FITC contra a cápside do fago T7.Dez minutos antes da perfusión e da fixación posterior, administrouse por vía intravenosa lectina marcada con DyLight594.Imaxes fluorescentes que mostran tinción de lectina (vermello) do lado luminal dos microvasos e fagos (verde) no lume dos capilares e do tecido cerebral perivascular.A barra de escala corresponde a 10 µm.(c, d) O péptido inhibidor de BACE1 biotinilado só ou en combinación co péptido de tránsito biotinilado #2077 acoplóuse a estreptavidina seguida dunha inxección intravenosa de polo menos tres ratas CM canuladas (10 mg de estreptavidina/kg).A redución de Aβ40 mediada polo inhibidor do péptido BACE1 foi medida mediante ELISA Aβ1-40 en sangue (vermello) e líquido cefalorraquídeo (laranxa) nos puntos de tempo indicados.Para unha mellor claridade, debúxase unha liña de puntos no gráfico a unha escala do 100%.(c) Redución porcentual de Aβ40 no sangue (triángulos vermellos) e líquido cefalorraquídeo (triángulos laranxas) en ratas tratadas con estreptavidina conxugada co péptido de tránsito #2077 e o péptido inhibidor de BACE1 nunha proporción de 3:1.(d) Redución porcentual no sangue Aβ40 (círculos vermellos) e líquido cefalorraquídeo (círculos laranxas) de ratas tratadas con estreptavidina acoplada só a un péptido inhibidor de BACE1.A concentración de Aβ no control foi de 420 pg/ml (desviación estándar = 101 pg/ml).
A exhibición de fagos aplicouse con éxito en varias áreas da investigación biomédica17.Este método utilizouse para estudos de diversidade vascular in vivo18,19, así como para estudos dirixidos a vasos cerebrais20,21,22,23,24,25,26.Neste estudo, estendemos a aplicación deste método de selección non só á identificación directa de péptidos dirixidos aos vasos cerebrais, senón tamén ao descubrimento de candidatos con propiedades de transporte activas para cruzar a barreira hematoencefálica.Agora describimos o desenvolvemento dun procedemento de selección in vivo en ratas intubadas con CM e demostramos o seu potencial para identificar péptidos con propiedades de localización do LCR.Usando o fago T7 que mostra unha biblioteca de péptidos aleatorios de 12 meros, puidemos demostrar que o fago T7 é o suficientemente pequeno (uns 60 nm de diámetro)10 para adaptarse á barreira hematoencefálica, atravesando así directamente a barreira hematoencefálica ou o plexo coroide.Observamos que a recollida de LCR de ratas CM canuladas era un método de cribado funcional in vivo ben controlado e que o fago extraído non só se unía á vasculatura senón que tamén funcionaba como transportador a través da barreira hematoencefálica.Ademais, ao recoller sangue e aplicar simultáneamente HTS ao LCR e aos fagos derivados do sangue, confirmamos que a nosa elección do LCR non estivo influenciada polo enriquecemento do sangue ou a aptitude para a expansión entre as roldas de selección.Non obstante, o compartimento sanguíneo forma parte do procedemento de selección, xa que os fagos capaces de chegar ao compartimento do LCR deben sobrevivir e circular polo torrente sanguíneo o tempo suficiente para enriquecerse no cerebro.Co fin de extraer información de secuencia fiable dos datos HTS en bruto, implementamos filtros adaptados aos erros de secuenciación específicos da plataforma no fluxo de traballo de análise.Ao incorporar parámetros cinéticos ao método de cribado, confirmamos a rápida farmacocinética dos fagos T7 de tipo salvaxe (t½ ~ 28 min) en sangue24, 27, 28 e tamén determinamos a súa vida media no líquido cefalorraquídeo (t½ ~ 26 min) por minuto).A pesar de perfís farmacocinéticos similares no sangue e no LCR, só se puido detectar o 0,001% da concentración sanguínea do fago no LCR, o que indica unha baixa mobilidade de fondo do fago T7 de tipo salvaxe a través da barreira hematoencefálica.Este traballo destaca a importancia da primeira rolda de selección cando se usan estratexias de panoramización in vivo, especialmente para os sistemas de fagos que se eliminan rapidamente da circulación, xa que poucos clons son capaces de chegar ao compartimento do SNC.Así, na primeira quenda, a redución da diversidade bibliotecaria foi moi grande, xa que só se recolleron un número limitado de clons neste modelo CSF ​​tan estricto.Esta estratexia de panorámica in vivo incluíu varios pasos de selección, como a acumulación activa no compartimento do LCR, a supervivencia do clon no compartimento sanguíneo e a rápida eliminación dos clons do fago T7 do sangue nos primeiros 10 minutos (figura 1d e figura complementaria 4M).).Así, despois da primeira rolda, identificáronse diferentes clons de fagos no LCR, aínda que se utilizou o mesmo conxunto inicial para animais individuais.Isto suxire que varios pasos de selección estritas para bibliotecas fonte con gran número de membros da biblioteca dan lugar a unha redución significativa da diversidade.Polo tanto, os eventos aleatorios converteranse nunha parte integrante do proceso de selección inicial, influíndo moito no resultado.É probable que moitos dos clons da biblioteca orixinal tivesen unha propensión ao enriquecemento do LCR moi similar.Non obstante, mesmo nas mesmas condicións experimentais, os resultados da selección poden diferir debido ao pequeno número de cada clon particular no grupo inicial.
Os motivos enriquecidos en LCR difiren dos do sangue.Curiosamente, observamos o primeiro cambio cara a péptidos ricos en glicina no sangue de animais individuais.(Fig. 1g, Figuras complementarias 4e, 4f).Os fagos que conteñen péptidos de glicina poden ser máis estables e ter menos probabilidades de ser retirados da circulación.Non obstante, estes péptidos ricos en glicina non se detectaron nas mostras de líquido cefalorraquídeo, o que suxire que as bibliotecas curadas pasaron por dous pasos de selección diferentes: un no sangue e outro permitido acumularse no líquido cefalorraquídeo.Os clons enriquecidos con LCR resultantes da cuarta rolda de selección foron probados amplamente.Confirmouse que case todos os clons probados individualmente estaban enriquecidos en LCR en comparación co fago control en branco.Examinouse con máis detalle un acerto peptídico (#2077).Mostrou unha vida media plasmática máis longa en comparación con outros éxitos (Figura 3d e Figura 7 complementaria) e, curiosamente, este péptido contiña un residuo de cisteína no extremo C-terminal.Recentemente demostrouse que a adición de cisteína aos péptidos pode mellorar as súas propiedades farmacocinéticas uníndose á albúmina 29 .Isto é actualmente descoñecido para o péptido #2077 e require máis estudos.Algúns péptidos mostraron unha dependencia da valencia no enriquecemento do LCR (datos non mostrados), que pode estar relacionado coa xeometría da superficie mostrada da cápside T7.O sistema T7 que utilizamos mostrou 5-15 copias de cada péptido por partícula de fago.O IHC realizouse en clons de fagos de chumbo candidatos inxectados por vía intravenosa no córtex cerebral das ratas (figura complementaria 8).Os datos mostraron que polo menos tres clons (no 2002, no 2009 e no 2077) interactuaron co BBB.Queda por determinar se esta interacción BBB produce a acumulación de LCR ou o movemento destes clons directamente ao BCSFB.Importante, mostramos que os péptidos seleccionados manteñen a súa capacidade de transporte de LCR cando se sintetizan e se unen á carga de proteínas.A unión dos péptidos biotinilados N-terminais a SA repite esencialmente os resultados obtidos cos seus respectivos clons de fagos en sangue e líquido cefalorraquídeo (Fig. 3e).Finalmente, amosamos que o péptido de chumbo #2077 é capaz de promover a acción cerebral dun inhibidor peptídico biotinilado de BACE1 conxugado a SA, causando efectos farmacodinámicos pronunciados no SNC ao reducir significativamente os niveis de Abeta40 no LCR (Fig. 4).Non puidemos identificar ningún homólogo na base de datos realizando unha busca de homoloxía de secuencias peptídicas de todos os resultados.É importante ter en conta que o tamaño da biblioteca T7 é de aproximadamente 109, mentres que o tamaño da biblioteca teórico para 12-mers é de 4 x 1015. Polo tanto, só seleccionamos unha pequena fracción do espazo de diversidade da biblioteca de péptidos de 12-mer, o que pode significar que se poden identificar péptidos máis optimizados avaliando o espazo de secuencias de hits adxacentes destes identificados.Hipoteticamente, unha das razóns polas que non atopamos ningún homólogo natural destes péptidos pode ser a deseleccion durante a evolución para evitar a entrada incontrolada de certos motivos peptídicos no cerebro.
En conxunto, os nosos resultados proporcionan unha base para futuros traballos para identificar e caracterizar os sistemas de transporte da barreira cerebrovascular in vivo con máis detalle.A configuración básica deste método baséase nunha estratexia de selección funcional que non só identifica clons con propiedades de unión vascular cerebral, senón que tamén inclúe un paso crítico no que os clons exitosos teñen actividade intrínseca para atravesar barreiras biolóxicas in vivo no compartimento do SNC.consiste en dilucidar o mecanismo de transporte destes péptidos e a súa preferencia pola unión á microvasculatura específica da rexión cerebral.Isto pode levar ao descubrimento de novas vías para o transporte do BBB e dos receptores.Esperamos que os péptidos identificados poidan unirse directamente a receptores cerebrovasculares ou a ligandos circulantes transportados a través do BBB ou BCSFB.Os vectores peptídicos con actividade de transporte de LCR descubertos neste traballo investigaranse máis a fondo.Actualmente estamos investigando a especificidade cerebral destes péptidos pola súa capacidade de cruzar o BBB e/ou BCSFB.Estes novos péptidos serán ferramentas extremadamente valiosas para o descubrimento potencial de novos receptores ou vías e para o desenvolvemento de novas plataformas altamente eficientes para a entrega de macromoléculas, como biolóxicas, ao cerebro.
Canular a cisterna grande (CM) utilizando unha modificación do método descrito anteriormente.Montáronse ratas Wistar anestesiadas (200-350 g) nun aparello estereotáxico e fíxose unha incisión media sobre o coiro cabeludo rapado e preparado asépticamente para expor o cranio.Perforar dous buratos na zona da faixa superior e fixar os parafusos de fixación nos orificios.Perforouse un burato adicional na crista occipital lateral para guiar estereotácticamente unha cánula de aceiro inoxidable no CM.Aplique cemento dental arredor da cánula e asegúrela con parafusos.Despois do fotocurado e do endurecemento do cemento, a ferida da pel pechouse cunha sutura supramedia 4/0.A colocación correcta da cánula confírmase pola fuga espontánea de líquido cefalorraquídeo (LCR).Retire a rata do aparello estereotáxico, reciba os coidados postoperatorios adecuados e o manexo da dor e permita que se recupere durante polo menos unha semana ata que se observen signos de sangue no líquido cefalorraquídeo.As ratas Wistar (Crl:WI/Han) obtivéronse de Charles River (Francia).Todas as ratas mantivéronse en condicións específicas libres de patóxenos.Todos os experimentos con animais foron aprobados pola Oficina Veterinaria da cidade de Basilea, Suíza, e realizáronse de acordo co número de licenza animal 2474 (Avaliación do transporte activo do cerebro mediante a medición dos niveis de candidatos terapéuticos no líquido cefalorraquídeo e no cerebro da rata).
Manteña suavemente a rata consciente coa cánula CM na man.Retire Datura da cánula e recolle 10 µl de líquido cefalorraquídeo que flúe espontáneamente.Dado que a permeabilidade da cánula foi finalmente comprometida, neste estudo só se incluíron mostras claras de líquido cefalorraquídeo sen evidencia de contaminación ou decoloración do sangue.Paralelamente, tomáronse aproximadamente 10-20 μl de sangue dunha pequena incisión na punta da cola en tubos con heparina (Sigma-Aldrich).O LCR e o sangue foron recollidos en varios momentos despois da inxección intravenosa do fago T7.Antes de recoller cada mostra de LCR, descartáronse aproximadamente 5-10 μl de fluído, o que corresponde ao volume morto do catéter.
As bibliotecas foron xeradas usando o vector T7Select 10-3b como se describe no manual do sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Brevemente, sintetizouse un inserto de ADN aleatorio de 12 meros no seguinte formato:
Utilizouse o codón NNK para evitar codóns de parada dobre e a sobreexpresión de aminoácidos no inserto.N é unha relación equimolar mesturada manualmente de cada nucleótido, e K é unha proporción equimolar mesturada manualmente de nucleótidos de adenina e citosina.As rexións monocatenarias convertéronse en ADN de dobre cadea mediante unha incubación posterior con dNTP (Novagen) e encima Klenow (New England Biolabs) en tampón Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37 °C.Despois da reacción, recuperouse o ADN de dobre cadea mediante precipitación con EtOH.O ADN resultante foi dixerido con encimas de restrición EcoRI e HindIII (ambos de Roche).A inserción escindida e purificada (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) foi entón ligada no cadro nun vector T7 preclivado despois do aminoácido 348 do xene da cápside 10B.As reaccións de ligadura incubáronse a 16 °C durante 18 horas antes do envasado in vitro.O empaquetado de fagos in vitro realizouse segundo as instrucións subministradas co kit de clonación T7Select 10-3b (Novagen) e a solución de envasado amplificouse unha vez ata a lise usando Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Os lisados ​​foron centrifugados, valorados e conxelados a -80°C como solución stock de glicerol.
Amplificación directa por PCR de rexións variables de fagos amplificadas en caldo ou placa utilizando cebadores de fusión patentados 454/Roche-amplicón.O cebador de fusión directa contén secuencias que flanquean a rexión variable (NNK) 12 (específica do modelo), o adaptador A de titanio GS FLX e unha secuencia de claves de biblioteca de catro bases (TCAG) (Figura complementaria 1a):
O cebador de fusión inversa tamén contén biotina unida ás perlas de captura e o adaptador B de titanio GS FLX necesario para a amplificación clonal durante a PCR en emulsión:
Os amplicóns foron sometidos a pirosecuenciación 454/Roche segundo o protocolo 454 GS-FLX Titanium.Para a secuenciación manual de Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), o ADN do fago T7 foi amplificado por PCR e secuenciado cos seguintes pares de cebadores:
Os insertos de placas individuais foron sometidos a amplificación por PCR mediante o kit de ADN polimerase de inicio rápido de Roche (segundo as instrucións do fabricante).Realice un arranque en quente (10 min a 95 °C) e 35 ciclos de aumento (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
Fagos de bibliotecas, fagos salvaxes, fagos rescatados de LCR e sangue ou clons individuais foron amplificados en Escherichia coli BL5615 en caldo TB (Sigma Aldrich) ou en pratos de 500 cm2 (Thermo Scientific) durante 4 h a 37 °C.Os fagos foron extraídos das placas lavando as placas con tampón Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou recollendo as placas con puntas de pipeta estériles.Os fagos foron illados do sobrenadante de cultivo ou do tampón de extracción cunha rolda de precipitación de polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) e resuspendidos en tampón Tris-EDTA.
O fago amplificado foi sometido a 2-3 roldas de eliminación de endotoxinas usando perlas de eliminación de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes da inxección intravenosa (IV) (500 μl/animal).Na primeira rolda, introducíronse 2×1012 fagos;no segundo, 2×1010 fagos;na terceira e cuarta quendas de selección, 2×109 fagos por animal.O contido de fagos en LCR e mostras de sangue recollidas nos puntos de tempo indicados determinouse mediante o reconto de placas segundo as instrucións do fabricante (manual do sistema T7Select).A selección de fagos realizouse mediante a inxección intravenosa de bibliotecas purificadas na vea da cola ou mediante a reinxección de fagos extraídos do LCR da quenda de selección anterior, e as colleitas posteriores realizáronse a 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min CSF e mostras de sangue respectivamente.Realizáronse un total de catro roldas de panorámica in vivo nas que as dúas ramas seleccionadas foron almacenadas e analizadas por separado durante as tres primeiras quendas de selección.Todos os insertos de fagos extraídos do LCR das dúas primeiras roldas de selección foron sometidos á pirosecuenciación 454/Roche, mentres que todos os clons extraídos do LCR das dúas últimas quendas de selección foron secuenciados manualmente.Todos os fagos sanguíneos da primeira rolda de selección tamén foron sometidos á pirosecuenciación 454/Roche.Para a inxección de clons de fagos, os fagos seleccionados foron amplificados en E. coli (BL5615) en placas de 500 cm2 a 37 °C durante 4 horas.Os clons seleccionados individualmente e secuenciados manualmente propagáronse en medio TB.Despois da extracción do fago, purificación e eliminación da endotoxina (como se describe anteriormente), inxectáronse por vía intravenosa 2 × 1010 fagos/animal en 300 μl nunha vea da cola.
Preprocesamento e filtrado cualitativo de datos de secuencia.Os datos brutos 454/Roche convertéronse dun formato de mapa de fluxo estándar binario (sff) a un formato lexible por humanos (fasta) de Pearson mediante o software do provedor.O procesamento posterior da secuencia de nucleótidos realizouse mediante programas e scripts propietarios C (paquete de software inédito) como se describe a continuación.A análise dos datos primarios inclúe procedementos estritos de filtrado en varias etapas.Para filtrar as lecturas que non contiñan unha secuencia de ADN de inserción de 12mer válida, as lecturas aliñáronse secuencialmente coa etiqueta de inicio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), a etiqueta de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e a inserción de fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mediante o test global de Needleman-Wunsch.aliñación que permite ata 2 inconsistencias por aliñación31.Polo tanto, elimináronse da biblioteca as lecturas sen etiquetas de inicio e parada e as lecturas que conteñan insercións de fondo, é dicir, aliñacións que excedan o número permitido de coincidencias.En canto ás lecturas restantes, a secuencia de ADN N-mer que se estende desde a marca de inicio e remata antes da marca de parada foi eliminada da secuencia de lectura orixinal e procesouse máis adiante (en diante denominada "inserción").Despois da tradución do inserto, a parte posterior ao primeiro codón de parada no extremo 5′ do cebador elimínase do inserto.Ademais, tamén se eliminaron os nucleótidos que conducen a codóns incompletos no extremo 3′ do cebador.Para excluír as insercións que conteñen só secuencias de fondo, tamén se eliminaron as insercións traducidas que comezan co patrón de aminoácidos "PAG".Os péptidos cunha lonxitude posterior á tradución de menos de 3 aminoácidos foron eliminados da biblioteca.Finalmente, elimine a redundancia no grupo de insercións e determine a frecuencia de cada inserción única.Os resultados desta análise incluíron unha lista de secuencias de nucleótidos (insercións) e as súas frecuencias (lecturas) (figuras complementarias 1c e 2).
Agrupar insercións de ADN de N-mer por semellanza de secuencia: para eliminar os erros de secuenciación específicos de 454/Roche (como problemas coa secuenciación de extensións de homopolímeros) e eliminar as redundancias menos importantes, os insertos de secuencias de ADN de N-mer previamente filtrados (insertos) ordénanse por semellanza.insercións (permítense ata 2 bases non coincidentes) mediante un algoritmo iterativo definido do seguinte xeito: as insercións ordénanse primeiro pola súa frecuencia (de maior a menor), e se son iguais, pola súa ordenación secundaria por lonxitude (de maior a menor) ).Así, as insercións máis frecuentes e longas definen o primeiro “grupo”.A frecuencia do grupo establécese na frecuencia clave.Despois, intentouse engadir ao grupo cada inserción que quedaba na lista ordenada mediante o aliñamento Needleman-Wunsch por parellas.Se o número de non coincidencias, insercións ou eliminacións nun aliñamento non supera o limiar de 2, engádese unha inserción ao grupo e a frecuencia global do grupo increméntase coa frecuencia coa que se engadiu a inserción.As insercións engadidas a un grupo márcanse como usadas e exclúense do procesamento posterior.Se a secuencia de inserción non se pode engadir a un grupo xa existente, a secuencia de inserción utilízase para crear un novo grupo coa frecuencia de inserción adecuada e márcase como usado.A iteración remata cando cada secuencia de inserción se utilizou para formar un novo grupo ou se pode incluír nun grupo xa existente.Despois de todo, as insercións agrupadas que consisten en nucleótidos finalmente tradúcense en secuencias peptídicas (bibliotecas peptídicas).O resultado desta análise é un conxunto de insercións e as súas correspondentes frecuencias que constitúen o número de lecturas consecutivas (figura complementaria 2).
Xeración de motivos: baseándose nunha lista de péptidos únicos, creouse unha biblioteca que contén todos os patróns de aminoácidos posibles (aa) como se mostra a continuación.Cada posible patrón de lonxitude 3 foi extraído do péptido e o seu patrón inverso engadiuse xunto cunha biblioteca de motivos común que contén todos os patróns (tripéptidos).Secuencáronse bibliotecas de motivos moi repetitivos e elimináronse a redundancia.Despois, para cada tripéptido da biblioteca de motivos, comprobamos a súa presenza na biblioteca mediante ferramentas computacionais.Neste caso, a frecuencia do péptido que contén o tripéptido do motivo atopado engádese e asígnase ao motivo na biblioteca de motivos ("número de motivos").O resultado da xeración de motivos é unha matriz bidimensional que contén todas as aparicións de tripéptidos (motivos) e os seus respectivos valores, que son o número de lecturas de secuenciación que dan como resultado o motivo correspondente cando as lecturas se filtran, agrupan e traducen.Métricas descritas anteriormente en detalle.
Normalización do número de motivos e diagramas de dispersión correspondentes: o número de motivos para cada mostra normalizouse mediante
onde ni é o número de lecturas que conteñen o tema i.Así, vi representa a frecuencia porcentual de lecturas (ou péptidos) que conteñen o motivo i na mostra.Os valores P para o número non normalizado de motivos calculáronse mediante a proba exacta de Fisher.En canto aos correlogramas do número de motivos, as correlacións de Spearman calculáronse utilizando o número normalizado de motivos con R.
Para visualizar o contido de aminoácidos en cada posición da biblioteca de péptidos, creáronse os logogramas web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).En primeiro lugar, o contido de aminoácidos en cada posición do péptido 12-mer almacénase nunha matriz de 20×12.A continuación, xérase un conxunto de 1000 péptidos que conteñen o mesmo contido relativo de aminoácidos en cada posición en formato de secuencia fasta e ofrécese como entrada ao web-logo 3, que xera unha representación gráfica do contido relativo de aminoácidos en cada posición.para unha determinada biblioteca de péptidos.Para visualizar conxuntos de datos multidimensionais, creáronse mapas térmicos utilizando unha ferramenta desenvolvida internamente en R (biosHeatmap, un paquete R aínda por lanzar).Os dendrogramas presentados nos mapas térmicos calculáronse mediante o método de agrupación xerárquica de Ward coa métrica de distancia euclidiana.Para a análise estatística dos datos de puntuación do motivo, calculáronse os valores de P para a puntuación non normalizada mediante a proba exacta de Fisher.Os valores P para outros conxuntos de datos calculáronse en R mediante a proba t de Student ou ANOVA.
Os clons de fagos seleccionados e os fagos sen insercións inxectáronse por vía intravenosa a través da vea da cola (2 × 1010 fagos/animal en 300 μl de PBS).Dez minutos antes da perfusión e posterior fixación, os mesmos animais foron inxectados por vía intravenosa con 100 μl de lectina marcada con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutos despois da inxección do fago, as ratas foron perfundidas polo corazón con 50 ml de PBS seguidos de 50 ml de PFA/PBS ao 4%.As mostras cerebrais fixéronse ademais durante a noite nun 4% de PFA/PBS e mergulláronse nun 30% de sacarosa durante a noite a 4 °C.As mostras conxélanse instantáneamente na mestura OCT.A análise inmunohistoquímica de mostras conxeladas realizouse a temperatura ambiente en crioseccións de 30 µm bloqueadas con BSA ao 1% e incubadas con anticorpos policlonais marcados con FITC contra o fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C.Incubar durante a noite.Finalmente, as seccións foron lavadas 3 veces con PBS e examinadas cun microscopio láser confocal (Leica TCS SP5).
Todos os péptidos cunha pureza mínima do 98% foron sintetizados por GenScript USA, biotinilados e liofilizados.A biotina únese a través dun espazo adicional de triple glicina no extremo N-terminal.Comprobe todos os péptidos mediante espectrometría de masas.
Mesturouse a estreptavidina (Sigma S0677) cun exceso equimolar de 5 veces de péptido biotinilado, péptido inhibidor de BACE1 biotinilado ou unha combinación (proporción 3:1) de péptido inhibidor de BACE1 biotinilado e péptido inhibidor de BACE1 nun 5-10% de DMSO/incubado en PBS.1 hora a temperatura ambiente antes da inxección.Os péptidos conxugados con estreptavidina foron inxectados por vía intravenosa a unha dose de 10 mg/kg nunha das veas da cola de ratas cunha cavidade cerebral.
A concentración de complexos estreptavidina-péptido avaliouse mediante ELISA.As placas de microtitulación Nunc Maxisorp (Sigma) foron recubertas durante a noite a 4 °C con 1,5 μg/ml de anticorpo anti-estreptavidina de rato (Thermo, MA1-20011).Despois do bloqueo (tampón de bloqueo: 140 nM de NaCL, 5 mM de EDTA, 0,05% de NP40, 0,25% de xelatina, 1% de BSA) a temperatura ambiente durante 2 horas, lave a placa con 0,05% de Tween-20/PBS (tampón de lavado) durante 3 segundos, engadíronse a CSF e as mostras de plasma de bloqueo:10. CSF 1:115).Despois incubouse a placa durante a noite a 4 °C con anticorpo de detección (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239).Despois de tres pasos de lavado, detectouse estreptavidina por incubación en solución de substrato de TMB (Roche) durante ata 20 min.Despois de deter o desenvolvemento da cor con H2SO4 1M, mida a absorbancia a 450 nm.
A función do complexo inhibidor de estreptavidina-péptido-BACE1 avaliouse mediante ELISA Aβ(1-40) segundo o protocolo do fabricante (Wako, 294-64701).Brevemente, as mostras de LCR foron diluídas nun diluyente estándar (1:23) e incubáronse durante a noite a 4 °C en placas de 96 pocillos recubertas con anticorpo de captura BNT77.Despois de cinco etapas de lavado, engadiuse anticorpo BA27 conxugado con HRP e incubábase durante 2 horas a 4 °C, seguido de cinco etapas de lavado.Aβ(1-40) detectouse por incubación en solución de TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente.Despois de deter o desenvolvemento da cor coa solución de parada, mida a absorbancia a 450 nm.As mostras de plasma foron sometidas a extracción en fase sólida antes do ELISA Aβ(1-40).Engadiuse plasma ao 0,2% de DEA (Sigma) en placas de 96 pocillos e incubouse a temperatura ambiente durante 30 minutos.Despois de lavar sucesivamente as placas SPE (Oasis, 186000679) con auga e metanol ao 100%, engadíronse mostras de plasma ás placas SPE e eliminouse todo o líquido.As mostras laváronse (primeiro con metanol ao 5% e despois metanol ao 30%) e eluíronse con NH4OH ao 2%/metanol ao 90%.Despois de secar o eluido a 55 °C durante 99 min a corrente de N2 constante, as mostras reducíronse en diluentes estándar e mediuse Aβ(1-40) como se describe anteriormente.
Como citar este artigo: Urich, E. et al.Entrega de carga ao cerebro mediante péptidos de tránsito identificados in vivo.a ciencia.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB e Moos T. Entrega de fármacos macromoleculares ao cerebro mediante terapia dirixida.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. e Martinez-Martinez, P. Entrega de fármacos peptídicos e proteicos a través da barreira hematoencefálica.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM A barreira hematoencefálica: un pescozo de botella no desenvolvemento de fármacos cerebrais.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG e Byrd, A. Perspectivas de mellora da entrega de fármacos e da orientación ao cerebro a través da vía do plexo coroideo-CSF.Investigación farmacéutica 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernización de produtos biofarmacéuticos con cabalos de Troia moleculares para a entrega do cerebro.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transporte peptídico mediado polo receptor WM a través da barreira hematoencefálica.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Aumentar a penetración cerebral e a eficacia dos anticorpos terapéuticos mediante lanzadeiras moleculares monovalentes.Neurona 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.O transporte do receptor da transferrina (TfR) determina a captación cerebral de variantes de afinidade dos anticorpos TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).