Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir „JavaScript“.
Rodo trijų skaidrių karuselę vienu metu. Naudokite mygtukus „Ankstesnis“ ir „Kitas“, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres, arba naudokite slankiklio mygtukus gale, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres.
Kraujo ir smegenų barjeras neleidžia bioterapiniams vaistams pasiekti savo taikinių centrinėje nervų sistemoje, todėl trukdo veiksmingai gydyti neurologines ligas. Siekdami atrasti naujus smegenų transporterius in vivo, įdiegėme T7 fagų peptidų biblioteką ir nuosekliai surinkome kraujo ir smegenų skysčio (CSF) mėginius, naudodami kaniliuotą sąmoningą didelį žiurkių baseino modelį. Po keturių atrankos etapų specifiniai fagų klonai buvo labai praturtinti CSF. Individualių kandidatų peptidų testavimas parodė daugiau nei 1000 kartų didesnį CSF praturtėjimą. Peptidų sukelto tiekimo į smegenis biologinį aktyvumą patvirtino 40 % amiloido-β kiekio sumažėjimas smegenų skystyje, naudojant BACE1 peptido inhibitorių, susietą su identifikuotu nauju tranzitiniu peptidu. Šie rezultatai rodo, kad peptidai, identifikuoti in vivo fagų atrankos metodais, gali būti naudingos terpės sisteminiam makromolekulių tiekimui į smegenis, turinčios terapinį poveikį.
Centrinės nervų sistemos (CNS) tikslinės terapijos tyrimai daugiausia buvo skirti optimizuotų vaistų ir agentų, pasižyminčių CNS veikiančiomis savybėmis, nustatymui, mažiau pastangų skiriant mechanizmų, skatinančių aktyvų vaistų tiekimą į smegenis, atradimui. Dabar tai pradeda keistis, nes vaistų, ypač didelių molekulių, tiekimas yra neatsiejama šiuolaikinių neurologijos vaistų kūrimo dalis. Centrinės nervų sistemos aplinką gerai apsaugo smegenų kraujagyslių barjerų sistema, kurią sudaro kraujo ir smegenų barjeras (KSB) ir kraujo ir smegenų barjeras (KBBB)1, todėl vaistus į smegenis pristatyti sunku1,2. Manoma, kad beveik visi didelių molekulių vaistai ir daugiau nei 98 % mažų molekulių vaistų yra pašalinami iš smegenų3. Štai kodėl labai svarbu nustatyti naujas smegenų transporto sistemas, kurios užtikrintų efektyvų ir specifinį gydomųjų vaistų tiekimą į CNS4,5. Tačiau KBBB ir KBSB taip pat suteikia puikią galimybę vaistams tiekti, nes jie prasiskverbia ir patenka į visas smegenų struktūras per plačią jų kraujagyslių sistemą. Taigi, dabartinės pastangos naudoti neinvazinius vaisto pateikimo į smegenis metodus daugiausia grindžiamos receptorių tarpininkaujamos pernašos (PMT) mechanizmu, naudojant endogeninį BBB6 receptorių. Nepaisant pastaruoju metu pasiektos svarbios pažangos naudojant transferino receptorių kelią7,8, reikia toliau kurti naujas pernašos sistemas su patobulintomis savybėmis. Šiuo tikslu mūsų tikslas buvo nustatyti peptidus, galinčius tarpininkauti smegenų skysčio pernašai, nes jie iš principo galėtų būti naudojami makromolekulėms pristatyti į CNS arba atverti naujus receptorių kelius. Visų pirma, specifiniai smegenų kraujagyslių sistemos receptoriai ir transporteriai (BBB ir BSCFB) gali būti potencialūs taikiniai aktyviam ir specifiniam bioterapinių vaistų tiekimui. Smegenų skystis (CSF) yra gyslainės rezginio (CS) sekrecinis produktas ir tiesiogiai liečiasi su smegenų intersticiniu skysčiu per subarachnoidinę erdvę ir skilvelių erdvę4. Neseniai buvo įrodyta, kad subarachnoidinis smegenų skystis pernelyg difunduoja į smegenų intersticį9. Tikimės pasiekti parenchiminę erdvę naudodami šį subarachnoidinį įtekėjimo taką arba tiesiai per smegenų barjerą. Tam įdiegėme patikimą in vivo fagų atrankos strategiją, kuri idealiai identifikuoja peptidus, transportuojamus bet kuriuo iš šių dviejų skirtingų kelių.
Dabar aprašome nuoseklų in vivo fagų demonstravimo atrankos metodą, kai smegenų skysčio mėginių ėmimas derinamas su didelio našumo sekvenavimu (HTS), siekiant stebėti pradinius atrankos etapus su didžiausia bibliotekos įvairove. Atranka buvo atlikta su sąmoningomis žiurkėmis, kurioms buvo nuolat implantuota didelė cisternos (CM) kaniulė, siekiant išvengti kraujo užteršimo. Svarbu tai, kad šis metodas atrenka tiek į smegenis nukreiptus peptidus, tiek peptidus, pasižyminčius transportavimo aktyvumu per smegenų kraujagyslių barjerą. Mes naudojome T7 fagus dėl jų mažo dydžio (~60 nm)10 ir teigėme, kad jie tinka pūslelių, kurios leidžia transląsteliniu būdu kirsti endotelio ir (arba) epitelio-medulos barjerą, transportavimui. Po keturių panningo etapų buvo išskirtos fagų populiacijos, pasižyminčios stipriu in vivo smegenų skysčio praturtinimu ir smegenų mikrokraujagyslių ryšiu. Svarbu tai, kad galėjome patvirtinti savo išvadas parodydami, kad pageidaujami ir chemiškai susintetinti geriausi kandidatų peptidai gali transportuoti baltymų krovinį į smegenų skystį. Pirma, farmakodinaminis poveikis CNS buvo nustatytas sujungiant pagrindinį tranzito peptidą su BACE1 peptido inhibitoriumi. Be to, kad parodome, jog in vivo funkcinės atrankos strategijos gali identifikuoti naujus smegenų pernašos peptidus kaip veiksmingus baltymų krovinių nešiotojus, tikimės, kad panašūs funkcinės atrankos metodai taip pat taps svarbūs nustatant naujus smegenų pernašos kelius.
Remiantis plokšteles formuojančiais vienetais (PFU), po fagų pakavimo etapo buvo suprojektuota ir sukurta atsitiktinių 12 merų linijinių T7 fagų peptidų biblioteka, kurios įvairovė yra maždaug 109 (žr. Medžiagos ir metodai). Svarbu pažymėti, kad prieš in vivo panning'ą kruopščiai išanalizavome šią biblioteką. Fagų bibliotekos mėginių PGR amplifikacija naudojant modifikuotus pradmenis generavo amplikonus, kurie buvo tiesiogiai taikomi HTS (papildomas 1a pav.). Dėl a) HTS11 sekoskaitos klaidų, b) poveikio pradmenų (NNK)1-12 kokybei ir c) laukinio tipo (wt) fago (skeleto įdėklų) buvimo atsarginėje bibliotekoje buvo įdiegta sekos filtravimo procedūra, skirta išgauti tik patikrintą sekos informaciją (papildomas 1b pav.). Šie filtravimo veiksmai taikomi visoms HTS sekoskaitos bibliotekoms. Standartinėje bibliotekoje iš viso buvo gauti 233 868 nuskaitymai, iš kurių 39 % atitiko filtro kriterijus ir buvo panaudoti bibliotekos analizei ir atrankai vėlesniems etapams (papildomas 1c–e pav.). Nuskaitymai daugiausia buvo 3 bazių porų ilgio kartotiniai, kurių pikas buvo ties 36 nukleotidais (papildomas 1c pav.), patvirtinantys bibliotekos dizainą (NNK) 1-12. Pažymėtina, kad maždaug 11 % bibliotekos narių turėjo 12 dimensijų laukinio tipo (wt) pagrindinį PAGISRELVDKL įterpimą, o beveik pusė sekų (49 %) turėjo įterpimų arba ištrynimų. Bibliotekos bibliotekos HTS patvirtino didelę peptidų įvairovę bibliotekoje: daugiau nei 81 % peptidų sekų buvo rastos tik vieną kartą ir tik 1,5 % pasireiškė ≥4 kopijomis (papildomas 2a pav.). Aminorūgščių (ar) dažniai visose 12 repertuaro pozicijų gerai koreliavo su dažniais, kurių tikimasi iš degeneravusio NKK repertuaro generuojamų kodonų skaičiaus (papildomas 2b pav.). Stebimas šių įterpimų užkoduotų ara liekanų dažnis gerai koreliavo su apskaičiuotu dažniu (r = 0,893) (papildomas 2c pav.). Fagų bibliotekų paruošimas injekcijai apima amplifikacijos ir endotoksino pašalinimo etapus. Anksčiau buvo įrodyta, kad tai gali sumažinti fagų bibliotekų įvairovę12,13. Todėl sekvenavome plokštelėje amplifikuotą fagų biblioteką, iš kurios buvo pašalintas endotoksinas, ir palyginome ją su pradine biblioteka, kad įvertintume AA dažnį. Pastebėta stipri koreliacija (r = 0,995) tarp pradinio telkinio ir amplifikuoto bei išgryninto telkinio (papildomas 2d pav.), rodanti, kad konkurencija tarp klonų, amplifikuotų plokštelėse naudojant T7 fagą, nesukėlė didelės paklaidos. Šis palyginimas pagrįstas tripeptidinių motyvų dažniu kiekvienoje bibliotekoje, nes bibliotekų įvairovės (~109) negalima visiškai užfiksuoti net naudojant HTS. Amino rūgščių dažnio analizė kiekvienoje pozicijoje atskleidė nedidelį nuo pozicijos priklausomą paklaidą paskutinėse trijose įvesto repertuaro pozicijose (papildomas 2e pav.). Apibendrinant, padarėme išvadą, kad bibliotekos kokybė ir įvairovė buvo priimtinos ir pastebėti tik nedideli įvairovės pokyčiai dėl amplifikacijos ir fagų bibliotekų paruošimo tarp kelių atrankos etapų.
Serijinis smegenų skysčio mėginių ėmimas gali būti atliekamas chirurginiu būdu implantuojant kaniulę į sąmoningų žiurkių smegenų skystį, kad būtų lengviau identifikuoti į veną (iv) per BBB ir (arba) BCSFB suleistą T7 fagą (1a–b pav.). Pirmuosiuose trijuose in vivo atrankos etapuose naudojome dvi nepriklausomas atrankos atšakas (A ir B atšakas) (1c pav.). Palaipsniui didinome atrankos griežtumą, mažindami bendrą fago kiekį, įvestą per pirmuosius tris atrankos etapus. Ketvirtajame paningo etape sujungėme mėginius iš A ir B atšakų ir atlikome tris papildomas nepriklausomas atrankas. Norėdami ištirti T7 fago dalelių savybes in vivo šiame modelyje, laukinio tipo fagas (PAGISRELVDKL pagrindinis įdėklas) buvo suleistas žiurkėms per uodegos veną. Fagų išskyrimas iš smegenų skysčio ir kraujo skirtingais laiko momentais parodė, kad santykinai maži T7 ikosaedriniai fagai pasižymėjo greita pradine klirenso faze iš kraujo skyriaus (papildomas 3 pav.). Remiantis suleistų titrų skaičiumi ir žiurkių kraujo tūriu, apskaičiavome, kad praėjus 10 minučių po intraveninės injekcijos kraujyje buvo aptikta tik maždaug 1 % suleistos dozės fago svorio. Po šio pradinio spartaus sumažėjimo buvo išmatuotas lėtesnis pirminis klirensas, kurio pusinės eliminacijos laikas buvo 27,7 minutės. Svarbu tai, kad iš smegenų skysčio skyriaus buvo aptikta tik labai nedaug fagų, o tai rodo žemą laukinio tipo fagų migracijos į smegenų skysčio skyrių foną (papildomas 3 pav.). Vidutiniškai per visą mėginių ėmimo laikotarpį (0–250 min.) kraujyje buvo aptikta tik apie 1 x 10⁻⁶ % T7 fago titrų, o smegenų skystyje – 4 x 10⁻⁶ % iš pradžių įšvirkštų fagų. Pažymėtina, kad laukinio tipo fago pusinės eliminacijos laikas (25,7 min.) smegenų skystyje buvo panašus į stebėtą kraujyje. Šie duomenys rodo, kad barjeras, skiriantis smegenų skysčio skyrių nuo kraujo, žiurkėms, kurioms buvo įdėtos CM kanuliacijos, yra nepažeistas, todėl in vivo galima atrinkti fagų bibliotekas, siekiant nustatyti klonus, kurie lengvai transportuojami iš kraujo į smegenų skysčio skyrių.
(a) Smegenų skysčio (CSF) pakartotinio mėginių ėmimo iš didelio telkinio metodo nustatymas. (b) Diagrama, rodanti centrinės nervų sistemos (CNS) barjero vietą ląstelėse ir atrankos strategiją, naudojamą peptidams, kurie kerta kraujo ir smegenų barjerą (BEB) ir kraujo ir smegenų barjerą, identifikuoti. (c) In vivo fagų demonstravimo atrankos schema. Kiekviename atrankos etape fagai (gyvūnų identifikatoriai rodyklių viduje) buvo suleidžiami į veną. Dvi nepriklausomos alternatyvios šakos (A, B) laikomos atskirai iki 4-ojo atrankos etapo. 3 ir 4 atrankos etapuose kiekvienas iš CSF išskirtas fago klonas buvo sekvenuojamas rankiniu būdu. (d) Fago, išskirto iš kraujo (raudoni apskritimai) ir smegenų skysčio (žali trikampiai), kinetika per pirmąjį atrankos etapą dviem kaniuliuotoms žiurkėms po T7 peptidų bibliotekos intraveninės injekcijos (2 x 1012 fagų/gyvūnui). Mėlyni kvadratai rodo vidutinę pradinę fago koncentraciją kraujyje, apskaičiuotą pagal suleisto fago kiekį, atsižvelgiant į bendrą kraujo tūrį. Juodi kvadratai žymi y linijos, ekstrapoliuotos iš kraujo fagų koncentracijų, susikirtimo tašką. (e, f) Pateikite visų galimų persidengiančių tripeptidinių motyvų, randamų peptide, santykinį dažnį ir pasiskirstymą. Parodytas motyvų skaičius, rastas per 1000 rodmenų. Reikšmingai (p < 0,001) praturtinti motyvai pažymėti raudonais taškais. (e) Koreliacijos sklaidos diagrama, lyginanti injekuotos bibliotekos tripeptidinio motyvo santykinį dažnį su iš kraujo gautu fagu iš gyvūnų #1.1 ir #1.2. (f) Koreliacijos sklaidos diagrama, lyginanti kraujyje ir smegenų skystyje išskirtų gyvūnų fagų tripeptidinių motyvų #1.1 ir #1.2 santykinius dažnius. (g, h) Kraujyje praturtinto fago (g) ir injekuotų bibliotekų bei smegenų skystyje praturtinto fago (h) ir kraujo sekos ID atvaizdavimas po in vivo atrankos etapo abiejuose gyvūnuose. Vienos raidės kodo dydis rodo, kaip dažnai ta aminorūgštis pasitaiko toje pozicijoje. Žalia = polinė, violetinė = neutrali, mėlyna = bazinė, raudona = rūgštinė ir juoda = hidrofobinės aminorūgštys. 1a, b paveikslus sukūrė ir pagamino Eduardas Urichas.
Į dvi CM instrumentines žiurkes (A ir B kladus) suleidome fagų peptidų biblioteką ir išskyrėme fagą iš smegenų skysčio ir kraujo (1d pav.). Pradinis greitas bibliotekos klirensas buvo mažiau ryškus, palyginti su laukinio tipo fagu. Vidutinis suleistos bibliotekos pusinės eliminacijos laikas abiejuose gyvūnuose buvo 24,8 minutės kraujyje, panašus į laukinio tipo fago, ir 38,5 minutės smegenų skystyje. Kiekvieno gyvūno kraujo ir smegenų skysčio fagų mėginiai buvo tiriami aukšto slėgio endotelio impulsų perdozavimo metodu (HTS), o visi identifikuoti peptidai buvo analizuojami dėl trumpo tripeptido motyvo buvimo. Tripeptido motyvai buvo pasirinkti todėl, kad jie suteikia minimalų pagrindą struktūros formavimuisi ir peptidų-baltymų sąveikai14,15. Nustatėme gerą motyvų pasiskirstymo koreliaciją tarp suleistos fagų bibliotekos ir iš abiejų gyvūnų kraujo išgautų klonų (1e pav.). Duomenys rodo, kad bibliotekos sudėtis kraujo skyriuje yra tik nežymiai praturtinta. Aminorūgščių dažniai ir konsensuso sekos buvo toliau analizuojamos kiekvienoje pozicijoje naudojant Weblogo16 programinės įrangos adaptaciją. Įdomu tai, kad kraujyje aptikome stiprų glicino likučių padidėjimą (1g pav.). Lyginant kraują su iš smegenų skysčio atrinktais klonais, pastebėta stipri motyvų atranka ir tam tikra jų deselekcija (1f pav.), o tam tikros aminorūgštys pirmenybę teikė iš anksto nustatytoms 12 narių struktūros pozicijoms (1h pav.). Pažymėtina, kad atskirų gyvūnų smegenų skystyje pastebėtas reikšmingas skirtumas, tuo tarpu abiejų gyvūnų kraujyje pastebėtas glicino praturtėjimas (papildomas 4a–j pav.). Atlikus griežtą sekos duomenų filtravimą gyvūnų Nr. 1.1 ir Nr. 1.2 smegenų skystyje, iš viso buvo gauti 964 ir 420 unikalių 12 merų peptidų (papildomas 1d–e pav.). Izoliuoti fagų klonai buvo amplifikuoti ir atlikti antrąjį in vivo atrankos etapą. Iš antrojo atrankos etapo išskirti fagai kiekviename gyvūne buvo atlikti HTS, o visi identifikuoti peptidai buvo panaudoti kaip įvestis į motyvų atpažinimo programą, skirtą tripeptidinių motyvų atsiradimui analizuoti (2a, b, ef pav.). Palyginti su pirmuoju iš smegenų skysčio (CSF) išskirto fago ciklu, A ir B šakose (2 pav.) stebėjome tolesnę daugelio motyvų atranką ir atrankos nutraukimą CSF. Buvo pritaikytas tinklo identifikavimo algoritmas, siekiant nustatyti, ar jie atspindi skirtingus nuoseklios sekos modelius. Pastebėtas aiškus panašumas tarp 12 dimensijų sekų, atkurtų CSF alternatyviame A klade (2c, d pav.) ir B klade (2g, h pav.). Apibendrinus kiekvienos šakos duomenis, paaiškėjo skirtingi 12 merų peptidų atrankos profiliai (papildomas 5c, d pav.) ir CSF/kraujo titro santykio padidėjimas laikui bėgant sujungtiems klonams po antrojo atrankos etapo, palyginti su pirmuoju atrankos etapu (papildomas 5e pav.).
Motyvų ir peptidų praturtinimas smegenų skystyje dviem iš eilės in vivo funkcinio fagų demonstravimo atrankos etapais.
Visi smegenų skysčio fagai, gauti iš kiekvieno gyvūno (gyvūnų Nr. 1.1 ir Nr. 1.2) pirmojo atrankos etapo, buvo sujungti, amplifikuoti, HT sekvenuoti ir kartu pakartotinai suleisti (2 x 1010 fagų/gyvūnui) 2 SM kanuliuotoms žiurkėms (Nr. 1.1 → Nr. 2.1 ir 2.2, 1.2 → 2.3 ir 2.4). (a, b, e, f) Koreliacijos sklaidos diagramos, kuriose lyginamas visų iš smegenų skysčio gautų fagų tripeptidinių motyvų santykinis dažnis pirmajame ir antrajame atrankos etapuose. Santykinis dažnis ir motyvų pasiskirstymas, atspindintis visus galimus persidengiančius tripeptidus, rastus peptiduose abiejose orientacijose. Rodomas motyvų, rastų per 1000 rodmenų, skaičius. Motyvai, kurie buvo reikšmingai (p < 0,001) atrinkti arba neįtraukti vienoje iš palygintų bibliotekų, pažymėti raudonais taškais. (c, d, g, h) Visų CSF turtingų 12 aminorūgščių ilgio sekų, pagrįstų 2 ir 1 in vivo atrankos etapais, sekos logotipo atvaizdavimas. Vienos raidės kodo dydis rodo, kaip dažnai ta aminorūgštis pasitaiko toje pozicijoje. Logotipui pavaizduoti lyginamas iš atskirų gyvūnų išskirtų CSF sekų dažnis tarp dviejų atrankos etapų ir parodytos praturtintos sekos antrajame etape: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ir (h) #1.2–#2.4. Labiausiai praturtintos aminorūgštys tam tikroje pozicijoje (c, d) gyvūnuose Nr. 2.1 ir Nr. 2.2 arba (g, h) gyvūnuose Nr. 2.3 ir Nr. 2.4 parodytos spalvotai. Žalia = polinė, violetinė = neutrali, mėlyna = bazinė, raudona = rūgštinė ir juoda = hidrofobinės aminorūgštys.
Po trečiojo atrankos etapo iš 332 CSF atkurtų fagų klonų, išskirtų iš dviejų gyvūnų (papildomas 6a pav.), identifikavome 124 unikalias peptidų sekas (#3.1 ir #3.2). Didžiausią santykinę dalį turėjo seka LGSVS (18,7 %), po jos sekė laukinio tipo įdėklai PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) ir SARGSWREIVSLS (2,2 %). Paskutiniame ketvirtajame etape sujungėme dvi nepriklausomai atrinktas šakas iš trijų atskirų gyvūnų (1c pav.). Iš 925 sekvenuotų fagų klonų, išskirtų iš CSF, ketvirtajame etape radome 64 unikalias peptidų sekas (papildomas 6b pav.), tarp kurių santykinė laukinio tipo fagų dalis sumažėjo iki 0,8 %. Dažniausi CSF klonai ketvirtajame etape buvo LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) ir RLSSVDSDLSGC (3, 2 %). Pasirinktų peptidų ilgio diapazonas atsiranda dėl nukleotidų įterpimų/ištrynimų arba priešlaikinių stop kodonų bibliotekos pradmenyse, kai NNK bibliotekos dizainui naudojami degeneravę kodonai. Priešlaikiniai stop kodonai generuoja trumpesnius peptidus ir yra atrenkami todėl, kad juose yra palankus aminorūgščių motyvas. Ilgesni peptidai gali atsirasti dėl įterpimų/ištrynimų sintetinių bibliotekų pradmenyse. Tai pozicionuoja suprojektuotą stop kodoną už rėmelio ribų ir jį skaito tol, kol atsiranda naujas stop kodonas pasroviui. Apskritai visų keturių atrankos etapų praturtinimo koeficientus apskaičiavome palygindami įvesties duomenis su mėginio išvesties duomenimis. Pirmajame atrankos etape kaip nespecifinį foninį etaloną naudojome laukinio tipo fagų titrus. Įdomu tai, kad neigiama fagų atranka buvo labai stipri pirmajame smegenų skysčio cikle, bet ne kraujyje (3a pav.), o tai gali būti dėl mažos daugumos peptidų bibliotekos narių pasyvios difuzijos į smegenų skysčio skyrių tikimybės arba dėl to, kad santykiniai fagai yra linkę efektyviau sulaikyti arba pašalinti iš kraujotakos nei bakteriofagai. Tačiau antrajame panning etape abiejuose kladuose buvo pastebėta stipri fagų atranka smegenų skystyje, o tai rodo, kad ankstesnis etapas buvo praturtintas fagais, turinčiais peptidus, skatinančius smegenų skysčio įsisavinimą (3a pav.). Vėlgi, be reikšmingo kraujo praturtėjimo. Taip pat trečiajame ir ketvirtajame etapuose fagų klonai buvo žymiai praturtinti smegenų skystyje. Palyginę kiekvienos unikalios peptidų sekos santykinį dažnį tarp paskutinių dviejų atrankos etapų, nustatėme, kad sekos buvo dar labiau praturtintos ketvirtajame atrankos etape (3b pav.). Iš visų 64 unikalių peptidų sekų, naudojant abi peptidų orientacijas, buvo išskirti iš viso 931 tripeptido motyvas. Labiausiai praturtinti motyvai ketvirtajame etape buvo atidžiau ištirti dėl jų praturtėjimo profilių visuose etapuose, palyginti su įšvirkšta biblioteka (ribinė vertė: 10 % praturtinimas) (papildomas 6c pav.). Bendri atrankos modeliai parodė, kad dauguma tirtų motyvų buvo praturtinti visuose ankstesniuose abiejų atrankos šakų etapuose. Tačiau kai kurie motyvai (pvz., SGL, VSG, LGS GSV) buvo daugiausia iš alternatyvaus A klado, o kiti (pvz., FGW, RTN, WGF, NTR) buvo praturtinti alternatyviame B klade.
CSF praturtintų fagu rodomų peptidų ir biotinilintų lyderių peptidų, konjuguotų su streptavidino naudingosiomis apkrovomis, CSF pernašos patvirtinimas.
(a) Praturtinimo santykiai, apskaičiuoti visuose keturiuose etapuose (R1–R4), remiantis suleistų (įvestis = I) fagų (PFU) titrais ir nustatytais smegenų skysčio fagų titrais (išvestis = 0). Paskutinių trijų etapų (R2–R4) praturtinimo koeficientai buvo apskaičiuoti palyginus su ankstesniu etapu ir pirmuoju etapu (R1) su svorio duomenimis. Atviri stulpeliai yra smegenų skystis, tamsesni stulpeliai – plazma. (***p < 0,001, remiantis Stjudento t testu). (b) Gausiausių fagų peptidų sąrašas, surūšiuotas pagal jų santykinę dalį, palyginti su visais fagais, surinktais smegenų skystyje po 4 atrankos etapo. Šeši dažniausiai pasitaikantys fagų klonai yra paryškinti spalva, sunumeruoti, o jų praturtinimo koeficientai tarp 3 ir 4 atrankos etapų (įdėklai). (c, d) Šeši labiausiai praturtinti fagų klonai, tuščių fagų ir tėvinių fagų peptidų bibliotekos iš 4 etapo buvo analizuojami atskirai smegenų skysčio mėginių ėmimo modelyje. Smegenų skysčio ir kraujo mėginiai buvo surinkti nurodytais laiko momentais. (c) Vienodi kiekiai 6 kandidatų fagų klonų (2 x 1010 fagų/gyvūnų), tuščių fagų (Nr. 1779) (2 x 1010 fagų/gyvūnų) ir standartinių fagų peptidų bibliotekų (2 x 1012 fagų/gyvūnų). Į kanuliuotą gyvūną atskirai į uodegos veną suleidžiama bent 3 CM. Parodyta kiekvieno suleisto fagų klono ir fagų peptidų bibliotekos smegenų skysčio farmakokinetika laikui bėgant. (d) parodytas vidutinis visų atgauto fago/ml smegenų skysčio/kraujo santykis per mėginių ėmimo laiką. (e) Keturi sintetiniai lyderio peptidai ir vienas sumaišytas kontrolinis preparatas buvo sujungti biotinu su streptavidinu per jų N galą (tetramerų demonstravimas), po to atlikta injekcija (uodegos venos iv, 10 mg streptavidino/kg). Bent trys intubuotos žiurkės (N = 3). CSF mėginiai buvo surinkti nurodytais laiko momentais, o streptavidino koncentracijos buvo matuojamos smegenų skysčio antistreptavidino ELISA metodu (nd = neaptikta). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, remiantis ANOVA testu). (f) Labiausiai praturtinto fago peptido klono Nr. 2002 (violetinė) aminorūgščių sekos palyginimas su kitais atrinktais fago peptidų klonais iš 4-ojo atrankos etapo. Identiški ir panašūs aminorūgščių fragmentai yra pažymėti spalvomis.
Iš visų praturtintų fagų ketvirtajame etape (3b pav.) šeši kandidatų klonai buvo atrinkti tolesnei individualiai analizei CSF mėginių ėmimo modelyje. Į tris kaniliuotus CM gyvūnus buvo sušvirkšti vienodi šešių kandidatų fagų, tuščių fagų (be įdėklo) ir profagų peptidų bibliotekų kiekiai, o farmakokinetika buvo nustatyta CSF (3c pav.) ir kraujo (papildomas 7 pav.) tyrimuose. Visi tirti fagų klonai nukreipė CSF skyrių 10–1000 kartų didesniu lygiu nei tuščio kontrolinio fago (#1779). Pavyzdžiui, klonų #2020 ir #2077 CSF titrai buvo apie 1000 kartų didesni nei kontrolinio fago. Kiekvieno pasirinkto peptido farmakokinetinis profilis yra skirtingas, tačiau visi jie pasižymi dideliu CSF nukreipimo į pradinį lygį gebėjimu. Klonams #1903 ir #2011 stebėjome nuolatinį mažėjimą laikui bėgant, o klonams #2077, #2002 ir #2009 padidėjimas per pirmąsias 10 minučių gali rodyti aktyvią pernašą, tačiau tai reikia patikrinti. Klonai Nr. 2020, Nr. 2002 ir Nr. 2077 stabilizavosi ties aukštu lygiu, o klono Nr. 2009 koncentracija smegenų skystyje po pradinio padidėjimo lėtai mažėjo. Tada palyginome kiekvieno smegenų skysčio kandidato santykinį dažnį su jo koncentracija kraujyje (3d pav.). Kiekvieno smegenų skysčio kandidato vidutinio titro koreliacija su jo kraujo titru visais mėginių ėmimo laikais parodė, kad trys iš šešių kandidatų buvo žymiai praturtinti kraujo smegenų skystyje. Įdomu tai, kad klonas Nr. 2077 parodė didesnį stabilumą kraujyje (papildomas 7 pav.). Norėdami patvirtinti, kad patys peptidai gali aktyviai pernešti ne tik fago daleles, bet ir kitus krovinius į smegenų skysčio skyrių, susintetinome keturis lyderio peptidus, derivatizuotus biotinu N gale, kur peptidai prisijungia prie fago dalelės. Biotinilinti peptidai (Nr. 2002, 2009, 2020 ir 2077) buvo konjuguoti su streptavidinu (SA), kad būtų gautos multimerinės formos, šiek tiek imituojančios fago geometriją. Šis formatas taip pat leido mums išmatuoti SA poveikį kraujyje ir smegenų skystyje kaip krovinius pernešančių baltymų peptidus. Svarbu tai, kad fagų duomenis dažnai buvo galima atkurti, kai sintetiniai peptidai buvo skiriami šiuo SA konjuguotu formatu (3e pav.). Sumaišyti peptidai turėjo mažesnę pradinę ekspoziciją ir greitesnį smegenų skysčio pašalinimą, o per 48 valandas jų kiekis tapo neaptinkamas. Norėdami suprasti šių peptidinių fagų klonų patekimo į smegenų skysčio erdvę kelius, analizavome atskirų fagų peptidų patekimo lokalizaciją naudodami imunohistochemiją (IHC), kad tiesiogiai aptiktume fagų daleles praėjus 1 valandai po intraveninės injekcijos in vivo. Pažymėtina, kad klonai Nr. 2002, Nr. 2077 ir Nr. 2009 galėjo būti aptikti stipriu dažymu smegenų kapiliaruose, o kontrolinis fagas (Nr. 1779) ir klonas Nr. 2020 nebuvo aptikti (papildomas 8 pav.). Tai rodo, kad šie peptidai prisideda prie poveikio smegenims būtent peržengdami smegenų barjerą. Norint patikrinti šią hipotezę, reikalinga tolesnė išsami analizė, nes gali būti įtrauktas ir BSCFB kelias. Lyginant labiausiai praturtinto klono (#2002) aminorūgščių seką su kitais atrinktais peptidais, pastebėta, kad kai kurie iš jų turi panašius aminorūgščių išplėtimus, kurie gali rodyti panašų transportavimo mechanizmą (3f pav.).
Dėl unikalaus plazmos profilio ir reikšmingo smegenų skysčio padidėjimo laikui bėgant, fagų demonstracinis klonas Nr. 2077 buvo toliau tiriamas ilgesnį 48 valandų laikotarpį ir sugebėjo atkurti spartų smegenų skysčio padidėjimą, pastebėtą kartu su ilgalaikiu SA lygiu (4a pav.). Kalbant apie kitus identifikuotus fagų klonus, Nr. 2077 stipriai nusidažė smegenų kapiliarus ir, žiūrint didesne skiriamąja geba, parodė reikšmingą kolokalizaciją su kapiliarų žymekliu lektinu ir galbūt tam tikrą dažymą parenchiminėje erdvėje (4b pav.). Norėdami ištirti, ar CNS galima pasiekti peptidų sukeltą farmakologinį poveikį, atlikome eksperimentą, kuriame biotinilintos i) tranzitinio peptido Nr. 2077 ir ii) BACE1 inhibitoriaus peptido versijos buvo sumaišytos su SA dviem skirtingais santykiais. Vienam deriniui naudojome tik BACE1 peptido inhibitorių, o kitam - 1:3 BACE1 peptido inhibitoriaus ir Nr. 2077 peptido santykį. Abu mėginiai buvo suleisti į veną, o beta-amiloido peptido 40 (Abeta40) kiekis kraujyje ir smegenų skystyje buvo matuojamas laikui bėgant. Abeta40 buvo matuojamas smegenų skystyje, nes jis atspindi BACE1 slopinimą smegenų parenchimoje. Kaip ir tikėtasi, abu kompleksai reikšmingai sumažino Abeta40 kiekį kraujyje (4c, d pav.). Tačiau tik mėginiai, kuriuose buvo peptido Nr. 2077 ir su SA konjuguoto BACE1 peptido inhibitoriaus mišinys, sukėlė reikšmingą Abeta40 sumažėjimą smegenų skystyje (4c pav.). Duomenys rodo, kad peptidas Nr. 2077 gali pernešti 60 kDa SA baltymą į CNS ir taip pat sukelia farmakologinį poveikį kartu su SA konjuguotais BACE1 peptido inhibitoriais.
(a) Kloninė T7 fago injekcija (2 × 10 fagų/gyvūnui), rodanti ilgalaikius CSF peptido Nr. 2077 (RLSSVDSDLSGC) ir neinjekuoto kontrolinio fago (Nr. 1779) farmakokinetikos profilius mažiausiai trims CM intubuotoms žiurkėms. (b) Konfokalinis mikroskopinis reprezentatyvių žievės mikrokraujagyslių vaizdas žiurkėms, kurioms buvo sušvirkšta fagais (2 × 1010 fagų/gyvūnui), rodantis peptido Nr. 2077 ir kraujagyslių (lektino) kontrastinį dažymą. Šie fagų klonai buvo suleisti 3 žiurkėms ir leista cirkuliuoti 1 valandą prieš perfuziją. Smegenys buvo perpjautos ir nudažytos polikloniniais FITC žymėtais antikūnais prieš T7 fago kapsidę. Dešimt minučių prieš perfuziją ir vėlesnę fiksaciją į veną buvo suleista DyLight594 žymėto lektino. Fluorescenciniai vaizdai, rodantys mikrokraujagyslių spindžio pusės lektino dažymą (raudona spalva) ir fagų (žalia spalva) dažymą kapiliarų spindyje ir perivaskuliniame smegenų audinyje. Mastelio juosta atitinka 10 µm. (c, d) Biotinilintas BACE1 slopinamasis peptidas, vienas arba kartu su biotinilintu tranzitiniu peptidu Nr. 2077, buvo sujungtas su streptavidinu, po to bent trims kanuliuotoms CM žiurkėms buvo suleista į veną (10 mg streptavidino/kg). BACE1 peptido inhibitoriaus sukeltas Aβ40 sumažėjimas buvo matuojamas Aβ1-40 ELISA metodu kraujyje (raudona spalva) ir smegenų skystyje (oranžinė spalva) nurodytais laiko momentais. Siekiant geresnio aiškumo, grafike brėžiama punktyrinė linija 100 % skalėje. (c) Procentinis Aβ40 sumažėjimas kraujyje (raudoni trikampiai) ir smegenų skystyje (oranžiniai trikampiai) žiurkėms, gydytoms streptavidinu, konjuguotu su tranzitiniu peptidu Nr. 2077, ir BACE1 slopinančiu peptidu santykiu 3:1. (d) Procentinis Aβ40 sumažėjimas kraujyje (raudoni apskritimai) ir smegenų skystyje (oranžiniai apskritimai) žiurkėms, gydytoms tik streptavidinu, sujungtu su BACE1 slopinančiu peptidu. Aβ koncentracija kontrolinėje grupėje buvo 420 pg/ml (standartinis nuokrypis = 101 pg/ml).
Fagų demonstravimas sėkmingai pritaikytas keliose biomedicininių tyrimų srityse17. Šis metodas buvo naudojamas in vivo kraujagyslių įvairovės tyrimams18,19, taip pat tyrimams, nukreiptiems į smegenų kraujagysles20,21,22,23,24,25,26. Šiame tyrime išplėtėme šio atrankos metodo taikymą ne tik tiesioginiam peptidų, nukreiptų į smegenų kraujagysles, identifikavimui, bet ir kandidatų, turinčių aktyvių pernašos savybių, galinčių įveikti hematoencefalinį barjerą, atradimui. Dabar aprašome in vivo atrankos procedūros, atliktos su CM intubuotomis žiurkėmis, kūrimą ir parodome jos potencialą identifikuoti peptidus, turinčius smegenų skysčio nukreipimo savybių. Naudodami T7 fagą, demonstruojantį 12 merų atsitiktinių peptidų biblioteką, galėjome parodyti, kad T7 fagas yra pakankamai mažas (maždaug 60 nm skersmens)10, kad prisitaikytų prie hematoencefalinio barjero ir tiesiogiai kirstų hematoencefalinį barjerą arba gyslainės rezginį. Pastebėjome, kad smegenų skysčio (CSF) surinkimas iš kanuliuotų CM žiurkių buvo gerai kontroliuojamas in vivo funkcinės atrankos metodas ir kad išgautas fagas ne tik prisijungė prie kraujagyslių, bet ir veikė kaip transporteris per hematoencefalinį barjerą. Be to, vienu metu rinkdami kraują ir taikydami HTS CSF ir iš kraujo gautiems fagams, patvirtinome, kad mūsų CSF pasirinkimui įtakos neturėjo kraujo praturtėjimas ar tinkamumas plėstis tarp atrankos etapų. Tačiau kraujo skyrius yra atrankos procedūros dalis, nes fagai, galintys pasiekti CSF skyrių, turi išgyventi ir cirkuliuoti kraujyje pakankamai ilgai, kad praturtėtų smegenyse. Siekdami išgauti patikimą sekos informaciją iš neapdorotų HTS duomenų, analizės darbo eigoje įdiegėme filtrus, pritaikytus prie platformos specifinių sekos nustatymo klaidų. Įtraukdami kinetinius parametrus į atrankos metodą, patvirtinome greitą laukinio tipo T7 fagų farmakokinetiką (t½ ~ 28 min.) kraujyje [24, 27, 28], taip pat nustatėme jų pusinės eliminacijos laiką smegenų skystyje (t½ ~ 26 min.) per minutę [24, 27, 28]. Nepaisant panašių farmakokinetinių profilių kraujyje ir smegenų skystyje, smegenų skystyje buvo galima aptikti tik 0,001 % fago koncentracijos kraujyje, o tai rodo mažą laukinio tipo T7 fago foninį judrumą per hematoencefalinį barjerą. Šis darbas pabrėžia pirmojo atrankos etapo svarbą naudojant in vivo panning strategijas, ypač fagų sistemoms, kurios greitai pašalinamos iš kraujotakos, nes nedaug klonų gali pasiekti CNS skyrių. Taigi, pirmajame etape bibliotekos įvairovės sumažėjimas buvo labai didelis, nes šiame labai griežtame CSF modelyje galiausiai buvo surinktas tik ribotas skaičius klonų. Ši in vivo panning strategija apėmė kelis atrankos etapus, tokius kaip aktyvus kaupimas CSF skyriuje, klono išgyvenimas kraujo skyriuje ir greitas T7 fago klonų pašalinimas iš kraujo per pirmąsias 10 minučių (1d pav. ir papildomas 4M pav.). Taigi, po pirmojo etapo CSF ​​buvo identifikuoti skirtingi fagų klonai, nors atskiriems gyvūnams buvo naudojamas tas pats pradinis fondas. Tai rodo, kad keli griežti atrankos etapai šaltinių bibliotekoms, turinčioms daug bibliotekos narių, žymiai sumažina įvairovę. Todėl atsitiktiniai įvykiai taps neatsiejama pradinio atrankos proceso dalimi, darysiančia didelę įtaką rezultatui. Tikėtina, kad daugelis pradinės bibliotekos klonų turėjo labai panašų smegenų skysčio sodrinimo polinkį. Tačiau net ir tomis pačiomis eksperimentinėmis sąlygomis atrankos rezultatai gali skirtis dėl mažo kiekvieno konkretaus klono skaičiaus pradiniame telkinyje.
CSF praturtinti motyvai skiriasi nuo esančių kraujyje. Įdomu tai, kad pirmą kartą pastebėjome poslinkį link glicino turtingų peptidų atskirų gyvūnų kraujyje. (1g pav., papildomi 4e, 4f pav.). Fagai, kuriuose yra glicino peptidų, gali būti stabilesni ir rečiau pašalinami iš kraujotakos. Tačiau šių glicino turtingų peptidų smegenų skysčio mėginiuose aptikta nebuvo, o tai rodo, kad atrinktos bibliotekos praėjo du skirtingus atrankos etapus: vieną kraujyje, o kitą – smegenų skystyje. Ketvirtojo atrankos etapo metu gauti CSF praturtinti klonai buvo nuodugniai ištirti. Patvirtinta, kad beveik visi individualiai ištirti klonai buvo praturtinti CSF, palyginti su tuščiu kontroliniu fagu. Vienas peptidas (Nr. 2077) buvo ištirtas išsamiau. Jis parodė ilgesnį pusinės eliminacijos laiką plazmoje, palyginti su kitais fagais (3d pav. ir papildomas 7 pav.), ir, kas įdomu, šio peptido C gale buvo cisteino liekana. Neseniai buvo įrodyta, kad cisteino pridėjimas prie peptidų gali pagerinti jų farmakokinetines savybes, prisijungiant prie albumino 29. Šiuo metu tai nežinoma peptidui Nr. 2077 ir reikalauja tolesnių tyrimų. Kai kurie peptidai parodė priklausomybę nuo valentingumo smegenų skysčio sodrinime (duomenys nepateikti), o tai gali būti susiję su rodoma T7 kapsidės paviršiaus geometrija. Mūsų naudota T7 sistema parodė 5–15 kiekvieno peptido kopijų vienoje fago dalelėje. IHC buvo atliktas su kandidatais į pagrindinius fago klonus, suleistais į veną žiurkių smegenų žievę (papildomas 8 pav.). Duomenys parodė, kad mažiausiai trys klonai (Nr. 2002, Nr. 2009 ir Nr. 2077) sąveikavo su smegenų barjeru (BBB). Dar reikia išsiaiškinti, ar ši BBB sąveika lemia CSF kaupimąsi, ar šių klonų tiesioginį judėjimą į BCSB. Svarbu tai, kad parodome, jog atrinkti peptidai išlaiko savo CSF ​​transportavimo pajėgumą, kai yra susintetinami ir prisijungia prie baltymų krovinio. N-galo biotinilintų peptidų prisijungimas prie SA iš esmės pakartoja rezultatus, gautus su atitinkamais jų fagų klonais kraujyje ir smegenų skystyje (3e pav.). Galiausiai parodome, kad pagrindinis peptidas #2077 gali skatinti biotinilinto peptido inhibitoriaus BACE1, konjuguoto su SA, smegenų veikimą, sukeldamas ryškų farmakodinaminį poveikį CNS, žymiai sumažindamas Abeta40 kiekį smegenų skystyje (4 pav.). Atlikdami visų atitikmenų peptidų sekos homologijos paiešką, duomenų bazėje neradome jokių homologų. Svarbu pažymėti, kad T7 bibliotekos dydis yra maždaug 109, o teorinis 12 merų bibliotekos dydis yra 4 x 1015. Todėl pasirinkome tik nedidelę 12 merų peptidų bibliotekos įvairovės erdvės dalį, o tai gali reikšti, kad įvertinus gretimą šių identifikuotų atitikmenų sekų erdvę, galima identifikuoti labiau optimizuotus peptidus. Hipotetiškai viena iš priežasčių, kodėl neradome jokių natūralių šių peptidų homologų, gali būti deselekcija evoliucijos metu, siekiant užkirsti kelią nekontroliuojamam tam tikrų peptidų motyvų patekimui į smegenis.
Apibendrinus, mūsų rezultatai suteikia pagrindą būsimiems darbams, siekiant išsamiau identifikuoti ir apibūdinti smegenų kraujagyslių barjero pernašos sistemas in vivo. Pagrindinis šio metodo pagrindas yra funkcinės atrankos strategija, kuri ne tik identifikuoja klonus, turinčius smegenų kraujagyslių jungimosi savybių, bet ir apima svarbų žingsnį, kuriame sėkmingi klonai pasižymi vidiniu aktyvumu in vivo kirsti biologinius barjerus ir patekti į CNS skyrių. Tikslas yra išsiaiškinti šių peptidų pernašos mechanizmą ir jų pirmenybę jungtis prie smegenų sričiai būdingų mikrokraujagyslių. Tai gali padėti atrasti naujus BBB ir receptorių pernašos kelius. Tikimės, kad identifikuoti peptidai gali tiesiogiai jungtis prie smegenų kraujagyslių receptorių arba prie cirkuliuojančių ligandų, pernešamų per BBB arba BCSFB. Šiame darbe atrasti peptidų vektoriai, turintys CSF pernašos aktyvumą, bus toliau tiriami. Šiuo metu tiriame šių peptidų smegenų specifiškumą, atsižvelgiant į jų gebėjimą kirsti BBB ir (arba) BCSFB. Šie nauji peptidai bus itin vertingi įrankiai potencialiam naujų receptorių ar kelių atradimui ir naujų labai efektyvių platformų, skirtų makromolekulių, tokių kaip biologiniai preparatai, tiekimui į smegenis, kūrimui.
Didelė cisterna (DS) kanuliuota naudojant anksčiau aprašyto metodo modifikaciją. Anestezuotos Wistar žiurkės (200–350 g) buvo uždėtos ant stereotaksinio aparato ir virš nuskustos ir aseptiškai paruoštos galvos odos padarytas vidurinis pjūvis, kad būtų atidengta kaukolė. Viršutinės juostos srityje išgręžtos dvi skylės ir į jas įsukti tvirtinimo varžtai. Papildoma skylė išgręžta šoninėje pakaušio keteroje, kad būtų galima stereotaksiškai nukreipti nerūdijančio plieno kaniulę į DS. Aplink kaniulę užtepti dantų cemento ir pritvirtinti varžtais. Po fotokonditacijos ir cemento sukietėjimo odos žaizda uždaryta 4/0 supramidiniu siūlu. Tinkamą kaniulės padėtį patvirtina savaiminis smegenų skysčio (CSF) nutekėjimas. Išimkite žiurkę iš stereotaksinio aparato, suteikite tinkamą pooperacinę priežiūrą ir skausmo malšinimą, leiskite jai atsigauti bent vieną savaitę, kol smegenų skystyje bus pastebėta kraujo požymių. Wistar žiurkės (Crl:WI/Han) buvo gautos iš Charles River (Prancūzija). Visos žiurkės buvo laikomos specifinėmis patogenų neturinčiomis sąlygomis. Visus eksperimentus su gyvūnais patvirtino Bazelio miesto (Šveicarija) veterinarijos tarnyba ir jie buvo atlikti pagal Gyvūno licencijos Nr. 2474 (Aktyvios smegenų pernašos įvertinimas matuojant terapinių kandidatų lygius žiurkės smegenų skystyje ir smegenyse) reikalavimus.
Švelniai laikykite žiurkę sąmoningą, laikydami rankoje CM kaniulę. Išimkite Datura iš kaniulės ir surinkite 10 µl savaime tekančio smegenų skysčio. Kadangi kaniulės praeinamumas galiausiai buvo pažeistas, į šį tyrimą buvo įtraukti tik skaidrūs smegenų skysčio mėginiai be kraujo užteršimo ar spalvos pakitimo požymių. Tuo pačiu metu iš mažo pjūvio uodegos galiuje buvo paimta maždaug 10–20 μl kraujo į mėgintuvėlius su heparinu („Sigma-Aldrich“). CSF ir kraujas buvo surinkti įvairiais laiko momentais po T7 fago injekcijos į veną. Prieš surenkant kiekvieną CSF mėginį, buvo išpilta maždaug 5–10 μl skysčio, tai atitinka kateterio negyvąjį tūrį.
Bibliotekos buvo sugeneruotos naudojant T7Select 10-3b vektorių, kaip aprašyta T7Select sistemos vadove (Novagen, Rosenberg ir kt., InNovations 6, 1-6, 1996). Trumpai tariant, atsitiktinis 12 merų DNR įterpimas buvo susintetintas tokiu formatu:
NNK kodonas buvo naudojamas siekiant išvengti dvigubų stop kodonų ir aminorūgščių perteklinės raiškos įterpime. N yra rankiniu būdu sumaišytas kiekvieno nukleotido ekvimolinis santykis, o K yra rankiniu būdu sumaišytas adenino ir citozino nukleotidų ekvimolinis santykis. Viengrandžiai regionai buvo paversti dvigrandine DNR toliau inkubuojant su dNTP (Novagen) ir Klenow fermentu (New England Biolabs) Klenow buferyje (New England Biolabs) 3 valandas 37 °C temperatūroje. Po reakcijos dvigrandė DNR buvo išskirta EtOH nusodinimu. Gauta DNR buvo suskaidyta restrikcijos fermentais EcoRI ir HindIII (abu iš Roche). Suskaldytas ir išgrynintas (QIAquick, Qiagen) įterpinys (T4 ligazė, New England Biolabs) buvo liguotas rėmelyje į iš anksto suskaldytą T7 vektorių po 348 aminorūgšties 10B kapsidės gene. Ligacijos reakcijos buvo inkubuojamos 16 °C temperatūroje 18 valandų prieš pakavimą in vitro. Fagų pakavimas in vitro buvo atliktas pagal instrukcijas, pateiktas kartu su T7Select 10-3b klonavimo rinkiniu („Novagen“), o pakavimo tirpalas buvo vieną kartą amplifikuotas iki lizės naudojant Escherichia coli (BLT5615, „Novagen“). Lizatai buvo centrifuguoti, titruoti ir užšaldyti -80 °C temperatūroje kaip glicerolio tirpalas.
Tiesioginė PGR amplifikacija fago kintamųjų sričių, amplifikuotų sultinyje arba lėkštelėje, naudojant patentuotus 454/Roche-amplikono susiliejimo pradmenis. Tiesioginio susiliejimo pradmenyje yra sekos, besiribojančios su kintamuoju regionu (NNK) 12 (specifinis šablonui), GS FLX titano adapteriu A ir keturių bazių bibliotekos rakto seka (TCAG) (papildomas 1a paveikslas):
Atvirkštinės sintezės pradmenyje taip pat yra prie fiksavimo granulių pritvirtinto biotino ir GS FLX titano adapterio B, reikalingo klonų amplifikacijai emulsijos PGR metu:
Amplikonai buvo pirosekvenuoti naudojant 454/Roche pagal 454 GS-FLX Titanium protokolą. Rankiniam Sanger sekvenavimui („Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer“) T7 fago DNR buvo amplifikuota PGR metodu ir sekvenuota naudojant šias pradmenų poras:
Įterpiniai fragmentai iš atskirų plokštelių buvo amplifikuoti PGR metodu naudojant „Roche Fast Start“ DNR polimerazės rinkinį (pagal gamintojo instrukcijas). Atlikite karštąjį paleidimą (10 min. 95 °C temperatūroje) ir 35 sustiprinimo ciklus (50 s 95 °C temperatūroje, 1 min. 50 °C temperatūroje ir 1 min. 72 °C temperatūroje).
Fagai iš bibliotekų, laukinio tipo fagai, iš smegenų skysčio ir kraujo išskirti fagai arba individualūs klonai buvo amplifikuoti Escherichia coli BL5615 bakterijoje TB sultinyje („Sigma Aldrich“) arba 500 cm2 lėkštelėse („Thermo Scientific“) 4 valandas 37 °C temperatūroje. Fagai iš plokštelių buvo išskirti jas praplaunant Tris-EDTA buferiu („Fluka Analytical“) arba surenkant plokšteles steriliais pipetės antgaliais. Fagai buvo išskirti iš kultūros supernatanto arba ekstrakcijos buferio vienu polietilenglikolio (PEG 8000) nusodinimo etapu („Promega“) ir resuspenduoti Tris-EDTA buferyje.
Prieš intraveninę (IV) injekciją (500 μl/gyvūnui) amplifikuotas fagas buvo 2–3 kartus pašalintas endotoksinais, naudojant endotoksinų šalinimo granules („Miltenyi Biotec“). Pirmajame etape buvo įterpta 2 × 1012 fagų; antrajame – 2 × 1010 fagų; trečiajame ir ketvirtajame atrankos etapuose – 2 × 109 fagų vienam gyvūnui. Fagų kiekis smegenų skystyje ir kraujo mėginiuose, surinktuose nurodytais laiko momentais, buvo nustatytas skaičiuojant plokšteles pagal gamintojo instrukcijas („T7Select“ sistemos vadovas). Fagų atranka buvo atliekama į veną suleidžiant išgrynintas bibliotekas į uodegos veną arba pakartotinai suleidžiant iš smegenų skysčio iš ankstesnio atrankos etapo išskirtą fagą, o vėlesni surinkimai buvo atliekami atitinkamai po 10 min., 30 min., 60 min., 90 min., 120 min., 180 min. ir 240 min. smegenų skysčio ir kraujo mėginiuose. Iš viso buvo atlikti keturi in vivo panning etapai, kurių metu dvi atrinktos šakos buvo atskirai saugomos ir analizuojamos per pirmuosius tris atrankos etapus. Visiems fagų įdėklams, išskirtiems iš smegenų skysčio (CSF) per pirmuosius du atrankos etapus, buvo atlikta 454/Roche pirosekvencija, o visiems klonams, išskirtiems iš CSF per paskutinius du atrankos etapus, buvo atlikta rankiniu būdu sekvencija. Visiems kraujo fagams iš pirmojo atrankos etapo taip pat buvo atlikta 454/Roche pirosekvencija. Fagų klonų injekcijai atrinkti fagai buvo amplifikuoti E. coli (BL5615) bakterijose 500 cm2 ploto plokštelėse 37 °C temperatūroje 4 valandas. Individualiai atrinkti ir rankiniu būdu sekvenuoti klonai buvo dauginami TB terpėje. Po fagų ekstrakcijos, išgryninimo ir endotoksino pašalinimo (kaip aprašyta aukščiau), į vieną uodegos veną buvo sušvirkšta 2 × 1010 fagų/gyvūnui 300 μl tirpale.
Sekos duomenų išankstinis apdorojimas ir kokybinis filtravimas. Neapdoroti 454/Roche duomenys buvo konvertuoti iš dvejetainio standartinio srauto žemėlapio formato (sff) į Pearson žmogaus skaitomą formatą (fasta) naudojant tiekėjo programinę įrangą. Tolesnis nukleotidų sekos apdorojimas buvo atliktas naudojant patentuotas C programas ir scenarijus (neišleistas programinės įrangos paketas), kaip aprašyta toliau. Pirminių duomenų analizė apima griežtas daugiapakopes filtravimo procedūras. Siekiant išfiltruoti nuskaitymus, kuriuose nebuvo galiojančios 12-mer įterptos DNR sekos, nuskaitymai buvo nuosekliai sulygiuoti su pradžios žyme (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), pabaigos žyme (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ir fono įterpimu (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC), naudojant visuotinį Needleman-Wunsch testą. Lygiavimas, leidžiantis iki 2 neatitikimų vienam lygiavimui31. Todėl nuskaitymai be pradžios ir pabaigos žymų bei nuskaitymai su fono įterpiniais, t. y. lygiavimai, viršijantys leistiną neatitikimų skaičių, buvo pašalinti iš bibliotekos. Kalbant apie likusius nuskaitymus, N-mer DNR seka, besitęsianti nuo pradžios žymės ir pasibaigianti prieš pabaigos žymę, buvo iškirpta iš pradinės nuskaitytos sekos ir toliau apdorota (toliau vadinama „įterpiniu“). Po įterpinio transliacijos iš įterpinio pašalinama dalis po pirmojo pabaigos kodono pradmens 5′ gale. Be to, taip pat buvo pašalinti nukleotidai, vedantys į nepilnus kodonus pradmens 3′ gale. Siekiant neįtraukti įterpinių, kuriuose yra tik foninės sekos, taip pat buvo pašalinti transliuoti įterpiniai, prasidedantys aminorūgščių modeliu „PAG“. Peptidai, kurių postransliacinis ilgis yra mažesnis nei 3 aminorūgštys, buvo pašalinti iš bibliotekos. Galiausiai, įterptinių elementų telkinyje buvo pašalintas perteklius ir nustatytas kiekvieno unikalaus įterptinio elemento dažnis. Šios analizės rezultatai apėmė nukleotidų sekų (įterpinių) sąrašą ir jų (skaitymo) dažnius (papildomi 1c ir 2 paveikslai).
Grupuoti N-mer DNR įterpinius pagal sekos panašumą: Siekiant pašalinti 454/Roche specifines sekos nustatymo klaidas (pvz., problemas su sekos nustatymo homopolimerų plėtiniais) ir pašalinti mažiau svarbius perteklius, anksčiau filtruoti N-mer DNR sekos įterpiniai (įterpiniai) rūšiuojami pagal panašumą. Įterpimai (leidžiama iki 2 nesutampančių bazių) naudojant iteracinį algoritmą, apibrėžtą taip: įterpiniai pirmiausia rūšiuojami pagal jų dažnį (nuo didžiausio iki mažiausio), o jei jie yra vienodi, pagal jų antrinį rūšiavimą pagal ilgį (nuo ilgiausio iki trumpiausio) ). Taigi, dažniausi ir ilgiausi įterpiniai apibrėžia pirmąją „grupę“. Grupės dažnis nustatomas pagal pagrindinį dažnį. Tada kiekvienas likęs įterpimas rūšiuotame sąraše buvo bandomas pridėti prie grupės poriniu Needleman-Wunsch lygiavimu. Jei neatitikimų, įterpimų ar ištrynimų skaičius lygiavime neviršija 2 ribos, įterpimas pridedamas prie grupės, o bendras grupės dažnis padidinamas tiek, kiek dažnai įterpimas buvo pridėtas. Į grupę pridėti įterpiniai pažymimi kaip panaudoti ir neįtraukiami į tolesnį apdorojimą. Jei įterpimo sekos negalima pridėti prie jau esamos grupės, įterpimo seka naudojama naujai grupei su atitinkamu įterpimo dažniu sukurti ir pažymima kaip panaudota. Iteracija baigiasi, kai kiekviena įterpimo seka yra panaudota naujai grupei sudaryti arba gali būti įtraukta į jau esamą grupę. Juk sugrupuoti įterpimai, sudaryti iš nukleotidų, galiausiai yra transliuojami į peptidų sekas (peptidų bibliotekas). Šios analizės rezultatas yra įterpimų rinkinys ir jų atitinkami dažniai, sudarantys iš eilės einančių skaitymų skaičių (papildomas 2 pav.).
Motyvų generavimas: Remiantis unikalių peptidų sąrašu, buvo sukurta biblioteka, kurioje yra visi galimi aminorūgščių modeliai (aa), kaip parodyta žemiau. Kiekvienas galimas 3 ilgio modelis buvo išskirtas iš peptido, o jo atvirkštinis modelis buvo pridėtas kartu su bendra motyvų biblioteka, kurioje yra visi modeliai (tripeptidai). Labai pasikartojančių motyvų bibliotekos buvo sekvenuotos ir pašalintas perteklius. Tada kiekvienam tripeptidui motyvų bibliotekoje, naudodami skaičiavimo įrankius, patikrinome, ar jis yra bibliotekoje. Šiuo atveju pridedamas peptido, kuriame yra rastas motyvo tripeptidas, dažnis ir priskiriamas motyvui motyvų bibliotekoje („motyvų skaičius“). Motyvų generavimo rezultatas yra dvimatis masyvas, kuriame yra visi tripeptidų (motyvų) atsiradimai ir jų atitinkamos vertės, kurios yra sekvenavimo nuskaitymų, kurie lemia atitinkamą motyvą, kai nuskaitymai yra filtruojami, grupuojami ir transliuojami, skaičius. Metrika, kaip išsamiai aprašyta aukščiau.
Motyvų skaičiaus ir atitinkamų sklaidos diagramų normalizavimas: kiekvieno mėginio motyvų skaičius buvo normalizuotas naudojant
kur ni yra skaitymų, kuriuose yra i-oji tema, skaičius. Taigi, vi reiškia skaitymų (arba peptidų), kuriuose yra i-asis motyvas, procentinį dažnį imtyje. Nenormalizuoto motyvų skaičiaus P reikšmės buvo apskaičiuotos naudojant Fišerio tikslųjį testą. Motyvų skaičiaus koreliogramoms Spearmano koreliacijos buvo apskaičiuotos naudojant normalizuotą motyvų skaičių su R.
Norint vizualizuoti aminorūgščių kiekį kiekvienoje peptidų bibliotekos pozicijoje, buvo sukurtos internetinės logogramos 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Pirmiausia, aminorūgščių kiekis kiekvienoje 12-mer peptido pozicijoje saugomas 20×12 matricoje. Tada 1000 peptidų, turinčių tą patį santykinį aminorūgščių kiekį kiekvienoje pozicijoje, rinkinys sugeneruojamas fasta-sekos formatu ir pateikiamas kaip įvestis į web-logo 3, kuris sugeneruoja grafinį santykinio aminorūgščių kiekio kiekvienoje pozicijoje vaizdą tam tikroje peptidų bibliotekoje. Norint vizualizuoti daugiamačius duomenų rinkinius, buvo sukurti šilumos žemėlapiai naudojant viduje sukurtą R įrankį („biosHeatmap“, dar neišleistas R paketas). Šilumos žemėlapiuose pateiktos dendrogramos buvo apskaičiuotos naudojant Wardo hierarchinį klasterizavimo metodą su Euklido atstumo metrika. Motyvų vertinimo duomenų statistinei analizei P vertės nenormalizuotam vertinimui buvo apskaičiuotos naudojant Fišerio tikslųjį testą. Kitų duomenų rinkinių P reikšmės buvo apskaičiuotos R programoje naudojant Student'o t testą arba ANOVA.
Atrinkti fagų klonai ir fagai be įdėklų buvo suleisti į veną per uodegos veną (2 × 1010 fagų/gyvūnui 300 μl PBS). Dešimt minučių prieš perfuziją ir vėlesnę fiksaciją tiems patiems gyvūnams buvo į veną suleista 100 μl DyLight594 žymėto lektino (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Praėjus 60 minučių po fagų injekcijos, žiurkėms per širdį buvo perfuzuota 50 ml PBS, o po to 50 ml 4 % PFA/PBS. Smegenų mėginiai papildomai buvo fiksuoti per naktį 4 % PFA/PBS ir mirkyti 30 % sacharozėje per naktį 4 °C temperatūroje. Mėginiai greitai užšaldomi OCT mišinyje. Užšaldytų mėginių imunohistocheminė analizė atlikta kambario temperatūroje su 30 µm kriosekcijos, blokuotomis 1 % BSA ir inkubuotomis su polikloniniais FITC žymėtais antikūnais prieš T7 fagą (Novus NB 600-376A) 4 °C temperatūroje. Inkubuojama per naktį. Galiausiai, pjūviai buvo 3 kartus plaunami PBS ir tiriami konfokaliniu lazeriniu mikroskopu (Leica TCS SP5).
Visi peptidai, kurių grynumas ne mažesnis kaip 98 %, buvo susintetinti „GenScript USA“, biotinilinti ir liofilizuoti. Biotinas prisijungia per papildomą trigubą glicino tarpiklį N gale. Visus peptidus patikrinkite masių spektrometrija.
Streptavidinas (Sigma S0677) buvo sumaišytas su 5 kartus ekvimoliniu biotinilinto peptido, biotinilinto BACE1 slopinamojo peptido arba biotinilinto BACE1 slopinamojo peptido ir BACE1 slopinamojo peptido derinio (santykiu 3:1) pertekliumi 5–10 % DMSO tirpale / inkubuojamas PBS tirpale. 1 valandą kambario temperatūroje prieš injekciją. Streptavidinu konjuguoti peptidai buvo suleidžiami į veną 10 mg/kg doze žiurkėms, turinčioms smegenų ertmę, į vieną iš uodegos venų.
Streptavidino-peptido kompleksų koncentracija buvo įvertinta ELISA metodu. „Nunc Maxisorp“ mikrotitravimo plokštelės („Sigma“) per naktį 4 °C temperatūroje buvo padengtos 1,5 μg/ml pelės anti-streptavidino antikūnu („Thermo“, MA1-20011). Po blokavimo (blokavimo buferis: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatinos, 1 % BSA) kambario temperatūroje 2 valandas, plokštelė 3 sekundes buvo plaunama 0,05 % Tween-20/PBS (plovimo buferiu). CSF ir plazmos mėginiai buvo įpilami į šulinėlius, praskiestus blokuojančiu buferiu (plazma 1:10 000, CSF 1:115). Tada plokštelė buvo inkubuojama per naktį 4 °C temperatūroje su aptikimo antikūnu (1 μg/ml, anti-streptavidinas-HRP, „Novus NB120-7239“). Po trijų plovimo etapų streptavidinas buvo aptiktas inkubuojant TMB substrato tirpale („Roche“) iki 20 min. Sustabdžius spalvos vystymąsi 1M H2SO4, išmatuokite absorbciją esant 450 nm bangos ilgiui.
Streptavidino-peptido-BACE1 inhibitoriaus komplekso funkcija buvo įvertinta Aβ(1-40) ELISA metodu pagal gamintojo protokolą (Wako, 294-64701). Trumpai tariant, CSF mėginiai buvo praskiesti standartiniu skiedikliu (1:23) ir inkubuoti per naktį 4 °C temperatūroje 96 šulinėlių plokštelėse, padengtose BNT77 antikūnu. Po penkių plovimo etapų buvo pridėtas HRP konjuguotas BA27 antikūnas ir inkubuotas 2 valandas 4 °C temperatūroje, po to atliktas penkių plovimo etapų. Aβ(1–40) buvo aptiktas inkubuojant TMB tirpale 30 minučių kambario temperatūroje. Sustabdžius spalvos vystymąsi stabdymo tirpalu, matuojamas absorbcija esant 450 nm bangos ilgiui. Prieš Aβ(1–40) ELISA plazmos mėginiams buvo atlikta kietosios fazės ekstrakcija. Plazma buvo įpilta į 0,2 % DEA (Sigma) 96 šulinėlių plokštelėse ir inkubuota kambario temperatūroje 30 minučių. Po to, kai SPE plokštelės (Oasis, 186000679) buvo išplautos vandeniu ir 100 % metanoliu, į jas buvo įlašinta plazmos mėginių ir pašalintas visas skystis. Mėginiai buvo plaunami (pirmiausia 5 % metanoliu, po to 30 % metanoliu) ir eliuuojami 2 % NH4OH / 90 % metanolio tirpalu. Eliuatui 99 minutes išdžiovinus 55 °C temperatūroje esant pastoviai N2 srovei, mėginiai buvo redukuoti standartiniuose skiedikliais ir Aβ(1–40) buvo išmatuotas, kaip aprašyta aukščiau.
Kaip cituoti šį straipsnį: Urich, E. ir kt. Krovinių pristatymas į smegenis naudojant in vivo identifikuotus tranzitinius peptidus. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ir Moos T. Makromolekulinių vaistų tiekimas į smegenis taikant taikinių terapiją. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ir Martinez-Martinez, P. Peptidinių ir baltymų vaistų perdavimas per hematoencefalinį barjerą. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneumobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Kraujo ir smegenų barjeras: kliūtis kuriant vaistus smegenims. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ir Byrd, A. Geresnio vaistų tiekimo ir nukreipimo į smegenis per gyslainės rezginio-CSF kelią perspektyvos. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM. Biofarmacijos modernizavimas naudojant molekulinius Trojos arklius perdavimui į smegenis. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorių sukelta peptidų pernaša per hematoencefalinį barjerą. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ir kt. Padidinkite terapinių antikūnų įsiskverbimą į smegenis ir veiksmingumą naudodami monovalentus molekulinius pervežimo mechanizmus. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ir kt. Transferino receptorių (TfR) pernaša lemia TfR antikūnų afininių variantų patekimą į smegenis. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).