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रक्त-मस्तिष्क अवरोध और रक्त-मस्तिष्क अवरोध जैव-चिकित्सीय एजेंटों को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अपने लक्ष्य तक पहुँचने से रोकते हैं, जिससे तंत्रिका संबंधी रोगों के प्रभावी उपचार में बाधा उत्पन्न होती है। विवो में नए मस्तिष्क ट्रांसपोर्टरों की खोज करने के लिए, हमने चूहों के कैनुलेटेड चेतन बड़े पूल मॉडल का उपयोग करके एक T7 फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी और क्रमिक रूप से एकत्रित रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) पेश किया। चयन के चार दौर के बाद विशिष्ट फेज क्लोन CSF में अत्यधिक समृद्ध थे। व्यक्तिगत उम्मीदवार पेप्टाइड्स के परीक्षण से CSF में 1000 गुना से अधिक समृद्धि का पता चला। मस्तिष्क में पेप्टाइड-मध्यस्थ वितरण की जैव-सक्रियता की पुष्टि पहचाने गए नए पारगमन पेप्टाइड से जुड़े BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग करके मस्तिष्कमेरु द्रव में एमिलॉयड-β के स्तर में 40% की कमी से हुई। ये परिणाम बताते हैं कि विवो फेज चयन विधियों द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड्स चिकित्सीय प्रभाव के साथ मस्तिष्क में मैक्रोमोलेक्यूल्स की प्रणालीगत डिलीवरी के लिए उपयोगी वाहन हो सकते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लक्षित चिकित्सा अनुसंधान ने मुख्य रूप से उन अनुकूलित दवाओं और एजेंटों की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया है जो सीएनएस-लक्ष्यीकरण गुणों को प्रदर्शित करते हैं, मस्तिष्क में सक्रिय दवा वितरण को संचालित करने वाले तंत्रों की खोज करने पर कम प्रयास करते हैं। यह अब बदलना शुरू हो रहा है क्योंकि दवा वितरण, विशेष रूप से बड़े अणु, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान दवा विकास का एक अभिन्न अंग है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का वातावरण मस्तिष्कवाहिकीय अवरोध प्रणाली द्वारा अच्छी तरह से संरक्षित है, जिसमें रक्त-मस्तिष्क अवरोध (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्क अवरोध (बीसीबीबी) 1 शामिल हैं, जिससे मस्तिष्क में दवाओं को पहुंचाना चुनौतीपूर्ण हो जाता है1,2। यह अनुमान लगाया गया है कि लगभग सभी बड़े अणु दवाएं और 98% से अधिक छोटे अणु दवाएं मस्तिष्क से समाप्त हो जाती हैं3। इसलिए नए मस्तिष्क परिवहन प्रणालियों की पहचान करना बहुत महत्वपूर्ण है जो सीएनएस 4,5 को चिकित्सीय दवाओं की कुशल और विशिष्ट डिलीवरी प्रदान करते हैं। हालांकि, बीबीबी और बीसीएसएफबी दवा वितरण के लिए एक उत्कृष्ट अवसर भी प्रस्तुत करते हैं क्योंकि वे मस्तिष्क की सभी संरचनाओं में प्रवेश करते हैं और इसके व्यापक वास्कुलचर के माध्यम से प्रवेश करते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क तक डिलीवरी के गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करने के वर्तमान प्रयास काफी हद तक अंतर्जात BBB6 रिसेप्टर का उपयोग करके रिसेप्टर-मध्यस्थ परिवहन (PMT) के तंत्र पर आधारित हैं। ट्रांसफ़रिन रिसेप्टर मार्ग7,8 का उपयोग करके हाल ही में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, बेहतर गुणों के साथ नई डिलीवरी प्रणालियों के आगे विकास की आवश्यकता है। इस उद्देश्य के लिए, हमारा लक्ष्य CSF परिवहन की मध्यस्थता करने में सक्षम पेप्टाइड्स की पहचान करना था, क्योंकि सिद्धांत रूप में उनका उपयोग CNS में मैक्रोमोलेक्यूल्स को पहुंचाने या नए रिसेप्टर मार्ग खोलने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, सेरेब्रोवास्कुलर सिस्टम (BBB और BSCFB) के विशिष्ट रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टर बायोथेरेप्यूटिक दवाओं की सक्रिय और विशिष्ट डिलीवरी के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं। मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) कोरॉइड प्लेक्सस (CS) का एक स्रावी उत्पाद है और यह सबराचनोइड स्पेस और वेंट्रिकुलर स्पेस4 के माध्यम से मस्तिष्क के अंतरालीय द्रव के सीधे संपर्क में होता है। हाल ही में यह दिखाया गया है कि सबराच्नॉइड सेरेब्रोस्पाइनल द्रव मस्तिष्क के अंतरालीय भाग में अत्यधिक मात्रा में फैलता है9। हम इस सबराच्नॉइड इनफ्लो ट्रैक्ट का उपयोग करके या सीधे BBB के माध्यम से पैरेन्काइमल स्पेस तक पहुँचने की उम्मीद करते हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, हमने एक मजबूत इन विवो फेज चयन रणनीति को लागू किया जो आदर्श रूप से इन दो अलग-अलग मार्गों में से किसी एक द्वारा परिवहन किए गए पेप्टाइड्स की पहचान करता है।
अब हम उच्चतम लाइब्रेरी विविधता के साथ प्रारंभिक चयन दौर की निगरानी के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (HTS) के साथ युग्मित CSF नमूनाकरण के साथ एक अनुक्रमिक इन विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करते हैं। रक्त संदूषण से बचने के लिए स्थायी रूप से प्रत्यारोपित बड़े सिस्टर्न (CM) कैनुला के साथ सचेत चूहों पर स्क्रीनिंग की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, यह दृष्टिकोण मस्तिष्क-लक्ष्यीकरण और मस्तिष्कवाहिकीय बाधा के पार परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड्स दोनों का चयन करता है। हमने उनके छोटे आकार (~ 60 एनएम) 10 के कारण T7 फेज का उपयोग किया और सुझाव दिया कि वे पुटिकाओं के परिवहन के लिए उपयुक्त हैं जो एंडोथेलियल और/या उपकला-मेडुला बाधा के ट्रांससेलुलर क्रॉसिंग की अनुमति देते हैं। पैनिंग के चार दौर के बाद, इन विवो CSF संवर्धन और सेरेब्रल माइक्रोवेसल एसोसिएशन को मजबूत दिखाते हुए फेज आबादी को अलग किया गया। महत्वपूर्ण रूप से, हम यह प्रदर्शित करके अपने निष्कर्षों की पुष्टि करने में सक्षम थे कि पसंदीदा और रासायनिक रूप से संश्लेषित सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार पेप्टाइड्स प्रोटीन कार्गो को मस्तिष्कमेरु द्रव में ले जाने में सक्षम हैं। सबसे पहले, सीएनएस के फार्माकोडायनामिक प्रभावों को एक प्रमुख ट्रांजिट पेप्टाइड को BACE1 पेप्टाइड के अवरोधक के साथ मिलाकर स्थापित किया गया था। यह प्रदर्शित करने के अलावा कि इन विवो कार्यात्मक स्क्रीनिंग रणनीतियाँ प्रभावी प्रोटीन कार्गो वाहक के रूप में नए मस्तिष्क परिवहन पेप्टाइड्स की पहचान कर सकती हैं, हम उम्मीद करते हैं कि इसी तरह के कार्यात्मक चयन दृष्टिकोण भी नए मस्तिष्क परिवहन मार्गों की पहचान करने में महत्वपूर्ण बनेंगे।
प्लाक-फॉर्मिंग यूनिट्स (PFU) के आधार पर, फेज पैकेजिंग चरण के बाद, लगभग 109 की विविधता के साथ यादृच्छिक 12-मेर रैखिक T7 फेज पेप्टाइड्स की एक लाइब्रेरी डिज़ाइन और बनाई गई थी (सामग्री और विधियाँ देखें)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने इन विवो पैनिंग से पहले इस लाइब्रेरी का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया था। संशोधित प्राइमरों का उपयोग करके फेज लाइब्रेरी नमूनों के पीसीआर प्रवर्धन ने ऐसे एम्प्लीकॉन उत्पन्न किए जो सीधे HTS (पूरक चित्र 1a) पर लागू थे। a) HTS11 अनुक्रमण त्रुटियों, b) प्राइमरों (NNK)1-12 की गुणवत्ता पर प्रभाव, और c) स्टैंडबाय लाइब्रेरी में वाइल्ड-टाइप (wt) फेज (कंकाल प्रविष्टियों) की उपस्थिति के कारण, केवल सत्यापित अनुक्रम जानकारी निकालने के लिए एक अनुक्रम फ़िल्टरिंग प्रक्रिया लागू की गई थी (पूरक चित्र 1b)। ये फ़िल्टर चरण सभी HTS अनुक्रमण लाइब्रेरी पर लागू होते हैं। मानक लाइब्रेरी के लिए, कुल 233,868 रीड प्राप्त किए गए, जिनमें से 39% फ़िल्टर मानदंड से गुज़रे और बाद के दौरों के लिए लाइब्रेरी विश्लेषण और चयन के लिए उपयोग किए गए (पूरक चित्र 1c-e)। रीड मुख्य रूप से लंबाई में 3 बेस पेयर के गुणक थे, जिनकी चोटी 36 न्यूक्लियोटाइड्स पर थी (पूरक चित्र 1c), जो लाइब्रेरी डिज़ाइन (NNK) 1-12 की पुष्टि करता है। उल्लेखनीय रूप से, लाइब्रेरी के लगभग 11% सदस्यों में 12-आयामी वाइल्ड-टाइप (wt) बैकबोन PAGISRELVDKL इंसर्ट था, और लगभग आधे अनुक्रमों (49%) में इंसर्ट या डिलीशन थे। लाइब्रेरी लाइब्रेरी के HTS ने लाइब्रेरी में पेप्टाइड्स की उच्च विविधता की पुष्टि की: 81% से अधिक पेप्टाइड अनुक्रम केवल एक बार पाए गए और केवल 1.5% ≥4 प्रतियों में पाए गए (पूरक चित्र 2a)। रिपर्टरी में सभी 12 स्थानों पर अमीनो एसिड (एए) की आवृत्तियाँ पतित एनकेके रिपर्टरी (पूरक चित्र 2बी) द्वारा उत्पन्न कोडोन की संख्या के लिए अपेक्षित आवृत्तियों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित थीं। इन प्रविष्टियों द्वारा एनकोड किए गए एए अवशेषों की देखी गई आवृत्ति गणना की गई आवृत्ति (आर = 0.893) (पूरक चित्र 2सी) के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित थी। इंजेक्शन के लिए फेज लाइब्रेरी की तैयारी में एंडोटॉक्सिन के प्रवर्धन और निष्कासन के चरण शामिल हैं। यह पहले फेज लाइब्रेरी की विविधता को संभावित रूप से कम करने के लिए दिखाया गया है12,13। इसलिए, हमने एक प्लेट-प्रवर्धित फेज लाइब्रेरी को अनुक्रमित किया, जिसमें एंडोटॉक्सिन निष्कासन हुआ था और एए की आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए इसकी तुलना मूल लाइब्रेरी से की। मूल पूल और प्रवर्धित और शुद्ध पूल (पूरक चित्र 2डी) के बीच एक मजबूत सहसंबंध (आर = 0.995) देखा गया, जो दर्शाता है कि टी7 फेज का उपयोग करके प्लेटों पर प्रवर्धित क्लोनों के बीच प्रतिस्पर्धा ने प्रमुख पूर्वाग्रह का कारण नहीं बनाया। यह तुलना प्रत्येक लाइब्रेरी में ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की आवृत्ति पर आधारित है, क्योंकि लाइब्रेरी की विविधता (~109) को HTS के साथ भी पूरी तरह से कैप्चर नहीं किया जा सकता है। प्रत्येक स्थिति पर एए के आवृत्ति विश्लेषण ने दर्ज किए गए प्रदर्शनों की सूची के अंतिम तीन पदों में एक छोटे से स्थान-निर्भर पूर्वाग्रह का खुलासा किया (पूरक चित्र 2e)। निष्कर्ष में, हमने निष्कर्ष निकाला कि लाइब्रेरी की गुणवत्ता और विविधता स्वीकार्य थी और चयन के कई दौरों के बीच फेज लाइब्रेरी के प्रवर्धन और तैयारी के कारण विविधता में केवल मामूली बदलाव देखे गए।
चेतन चूहों के CM में शल्य चिकित्सा द्वारा एक कैनुला प्रत्यारोपित करके क्रमिक मस्तिष्कमेरु द्रव नमूनाकरण किया जा सकता है, ताकि BBB और/या BCSFB (चित्र 1a-b) के माध्यम से अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किए गए T7 फेज की पहचान को सुगम बनाया जा सके। हमने इन विवो चयन के पहले तीन राउंड में दो स्वतंत्र चयन भुजाओं (भुजाओं A और B) का उपयोग किया (चित्र 1c)। हमने चयन के पहले तीन राउंड में पेश किए गए फेज की कुल मात्रा को कम करके धीरे-धीरे चयन की कठोरता को बढ़ाया। पैनिंग के चौथे राउंड के लिए, हमने शाखाओं A और B से नमूने मिलाए और तीन अतिरिक्त स्वतंत्र चयन किए। इस मॉडल में T7 फेज कणों के इन विवो गुणों का अध्ययन करने के लिए, जंगली-प्रकार के फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इंसर्ट) को पूंछ की नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्ट किया गया था। विभिन्न समय बिंदुओं पर मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त से फेज की रिकवरी ने दिखाया कि अपेक्षाकृत छोटे T7 इकोसाहेड्रल फेज में रक्त डिब्बे से एक तेज़ प्रारंभिक निकासी चरण था (पूरक चित्र 3)। प्रशासित टिटर्स और चूहों के रक्त की मात्रा के आधार पर, हमने गणना की कि प्रशासित खुराक से केवल लगभग 1% wt. फेज का अंतःशिरा इंजेक्शन के 10 मिनट बाद रक्त में पता चला था। इस शुरुआती तीव्र गिरावट के बाद, 27.7 मिनट के आधे जीवन के साथ एक धीमी प्राथमिक निकासी को मापा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, सीएसएफ कम्पार्टमेंट से बहुत कम फेज प्राप्त किए गए थे, जो सीएसएफ कम्पार्टमेंट में वाइल्ड-टाइप फेज माइग्रेशन के लिए कम पृष्ठभूमि का संकेत देता है (पूरक चित्र 3)। औसतन, रक्त में टी7 फेज के केवल लगभग 1 x 10-3% टिटर्स और प्रारंभिक रूप से संक्रमित फेज के 4 x 10-8% पूरे नमूना अवधि (0-250 मिनट) में मस्तिष्कमेरु द्रव में पाए गए ये आंकड़े दर्शाते हैं कि सी.एम.-कैन्युलेटेड चूहों में सी.एस.एफ. कक्ष को रक्त से अलग करने वाला अवरोध बरकरार है, जिससे इन विवो फेज लाइब्रेरी का चयन संभव हो पाता है, ताकि उन क्लोनों की पहचान की जा सके, जिन्हें आसानी से रक्त से सी.एस.एफ. कक्ष में ले जाया जा सके।
(ए) एक बड़े पूल से मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) को फिर से नमूना करने के लिए एक विधि की स्थापना। (बी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बाधा के सेलुलर स्थान को दर्शाने वाला आरेख और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने वाले पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली चयन रणनीति। (सी) विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ्लोचार्ट में। चयन के प्रत्येक दौर में, फेज (तीर के अंदर पशु पहचानकर्ता) को अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया था। दो स्वतंत्र वैकल्पिक शाखाओं (ए, बी) को चयन के चौथे दौर तक अलग रखा जाता है। चयन राउंड 3 और 4 के लिए, सीएसएफ से निकाले गए प्रत्येक फेज क्लोन को मैन्युअल रूप से अनुक्रमित किया गया था। नीले वर्ग रक्त में फेज की औसत प्रारंभिक सांद्रता को दर्शाते हैं, जिसकी गणना कुल रक्त मात्रा को ध्यान में रखते हुए इंजेक्ट किए गए फेज की मात्रा से की जाती है। काले वर्ग रक्त फेज सांद्रता से निकाले गए y रेखा के प्रतिच्छेद बिंदु को दर्शाते हैं। (e,f) पेप्टाइड में पाए जाने वाले सभी संभावित ओवरलैपिंग ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण प्रस्तुत करें। 1000 रीडिंग में पाए गए रूपांकनों की संख्या दिखाई गई है। महत्वपूर्ण रूप से (p < 0.001) समृद्ध रूपांकनों को लाल बिंदुओं से चिह्नित किया गया है। (e) जानवरों #1.1 और #1.2 से रक्त-व्युत्पन्न फेज के साथ इंजेक्ट किए गए लाइब्रेरी के ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने वाला सहसंबंध स्कैटरप्लॉट। (जी, एच) दोनों जानवरों में इन विवो चयन के एक दौर के बाद रक्त में समृद्ध फेज (जी) बनाम इंजेक्टेड लाइब्रेरी और सीएसएफ (एच) में समृद्ध फेज बनाम रक्त का अनुक्रम आईडी प्रतिनिधित्व। एक-अक्षर कोड का आकार इंगित करता है कि उस स्थिति में वह एमिनो एसिड कितनी बार होता है। हरा = ध्रुवीय, बैंगनी = तटस्थ, नीला = मूल, लाल = अम्लीय और काला = हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड। चित्र 1 ए, बी को एडुआर्ड उरिच द्वारा डिजाइन और निर्मित किया गया था।
हमने दो CM उपकरण चूहों (क्लैड ए और बी) में एक फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी इंजेक्ट की और मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त से फेज को अलग किया (चित्र 1डी)। लाइब्रेरी की शुरुआती तेज़ निकासी जंगली-प्रकार के फेज की तुलना में कम स्पष्ट थी। दोनों जानवरों में इंजेक्ट की गई लाइब्रेरी का औसत आधा जीवन रक्त में 24.8 मिनट था, जो जंगली-प्रकार के फेज के समान था, और CSF में 38.5 मिनट था। प्रत्येक जानवर के रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव फेज के नमूनों को HTS के अधीन किया गया और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स का विश्लेषण एक छोटे ट्रिपेप्टाइड मोटिफ की उपस्थिति के लिए किया गया। ट्रिपेप्टाइड मोटिफ को इसलिए चुना गया क्योंकि वे संरचना निर्माण और पेप्टाइड-प्रोटीन इंटरैक्शन14,15 के लिए न्यूनतम आधार प्रदान करते हैं। हमने इंजेक्ट की गई फेज लाइब्रेरी और दोनों जानवरों के रक्त से निकाले गए क्लोन के बीच मोटिफ के वितरण में एक अच्छा सहसंबंध पाया (चित्र 1ई)। डेटा इंगित करता है कि लाइब्रेरी की संरचना रक्त कम्पार्टमेंट में केवल मामूली रूप से समृद्ध है। वेबलोगो 16 सॉफ्टवेयर के अनुकूलन का उपयोग करके प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड आवृत्तियों और सर्वसम्मति अनुक्रमों का आगे विश्लेषण किया गया। दिलचस्प बात यह है कि हमने रक्त ग्लाइसिन अवशेषों में एक मजबूत संवर्धन पाया (चित्र 1जी)। जब रक्त की तुलना सीएसएफ से चुने गए क्लोनों से की गई, तो मजबूत चयन और रूपांकनों का कुछ अचयन देखा गया (चित्र 1एफ), और कुछ अमीनो एसिड 12-सदस्यीय (चित्र 1एच) में पूर्व निर्धारित पदों पर अधिमानतः मौजूद थे। उल्लेखनीय रूप से, अलग-अलग जानवरों में मस्तिष्कमेरु द्रव में काफी भिन्नता थी, जबकि दोनों जानवरों में रक्त ग्लाइसिन संवर्धन देखा गया (पूरक चित्र 4ए-जे)। जानवरों #1.1 और #1.2 के मस्तिष्कमेरु द्रव में अनुक्रम डेटा की कठोर फ़िल्टरिंग के बाद, कुल 964 और 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइड्स प्राप्त किए गए (पूरक चित्र 1डी-ई)। पृथक फेज क्लोनों को प्रवर्धित किया गया और इन विवो चयन के दूसरे दौर के अधीन किया गया। चयन के दूसरे दौर से निकाले गए फेज को प्रत्येक पशु में एचटीएस के अधीन किया गया और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स को ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की घटना का विश्लेषण करने के लिए एक मोटिफ पहचान कार्यक्रम के इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया गया (चित्र 2ए, बी, ईएफ)। सीएसएफ से बरामद फेज के पहले चक्र की तुलना में, हमने शाखाओं ए और बी में सीएसएफ में कई रूपांकनों का आगे चयन और अचयन देखा (चित्र 2)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वे सुसंगत अनुक्रम के विभिन्न पैटर्न का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक नेटवर्क पहचान एल्गोरिदम लागू किया गया था। वैकल्पिक क्लैड ए (चित्र 2सी, डी) और क्लैड बी (चित्र 2जी, एच) में सीएसएफ द्वारा बरामद 12-आयामी अनुक्रमों के बीच एक स्पष्ट समानता देखी गई। प्रत्येक शाखा में एकत्रित विश्लेषण से 12-मेर पेप्टाइड्स के लिए अलग-अलग चयन प्रोफाइल
विवो कार्यात्मक फेज प्रदर्शन चयन के दो क्रमिक दौर द्वारा मस्तिष्कमेरु द्रव में रूपांकनों और पेप्टाइड्स का संवर्धन।
प्रत्येक पशु (पशु #1.1 और #1.2) के पहले दौर से प्राप्त सभी मस्तिष्कमेरु द्रव फेजों को एकत्रित किया गया, प्रवर्धित किया गया, एचटी-अनुक्रमित किया गया और एक साथ पुनः इंजेक्ट किया गया (2 x 1010 फेज/पशु) 2 एसएम कैनुलेटेड चूहे (#1.1 → #)। 2.1 और 2.2, 1.2 → 2.3 और 2.4)। (ए, बी, ई, एफ) पहले और दूसरे चयन दौर में सभी सीएसएफ-व्युत्पन्न फेजों के ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने वाले सहसंबंध स्कैटरप्लॉट। दोनों अभिविन्यासों में पेप्टाइड्स में पाए जाने वाले सभी संभावित ओवरलैपिंग ट्रिपेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करने वाले रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण। 1000 रीडिंग में पाए गए रूपांकनों की संख्या दिखाई गई है। (सी, डी, जी, एच) इन विवो चयन के राउंड 2 और 1 के आधार पर सभी सीएसएफ-समृद्ध 12 अमीनो एसिड लंबे अनुक्रमों का अनुक्रम लोगो प्रतिनिधित्व। एक-अक्षर के कोड का आकार इंगित करता है कि उस स्थिति में वह अमीनो एसिड कितनी बार होता है। लोगो का प्रतिनिधित्व करने के लिए, दो चयन राउंड के बीच व्यक्तिगत जानवरों से निकाले गए सीएसएफ अनुक्रमों की आवृत्ति की तुलना की गई है और दूसरे राउंड में समृद्ध अनुक्रम दिखाए गए हैं: (सी) #1.1–#2.1 (डी) #1.1–#2.2 (जी) #1.2–#2.3 और (एच) #1.2–#2.4। (सी, डी) जानवर क्रमांक 2.1 और क्रमांक 2.2 या (जी, एच) जानवर क्रमांक 2.3 और क्रमांक 2.4 में किसी दिए गए स्थान पर सबसे समृद्ध अमीनो एसिड रंग में दिखाए गए हैं
चयन के तीसरे दौर के बाद, हमने दो जानवरों से अलग किए गए 332 सीएसएफ-पुनर्गठित फेज क्लोनों से 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमों (#3.1 और #3.2) की पहचान की (पूरक चित्र 6ए)। अनुक्रम LGSVS (18.7%) में सबसे अधिक सापेक्ष अनुपात था, इसके बाद वाइल्ड-टाइप इंसर्ट PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), और SARGSWREIVSLS (2.2%) थे। अंतिम चौथे दौर में, हमने तीन अलग-अलग जानवरों से दो स्वतंत्र रूप से चयनित शाखाओं को एकत्र किया (चित्र 1सी)। सीएसएफ से प्राप्त 925 अनुक्रमित फेज क्लोनों में से, चौथे दौर में हमें 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम मिले (पूरक चित्र 6बी), जिनमें वाइल्ड-टाइप फेज का सापेक्ष अनुपात 0.8% तक गिर गया। चौथे दौर में सबसे आम सीएसएफ क्लोन LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) और RLSSVDSDLSGC (3, 2%) थे। चयनित पेप्टाइड्स की लंबाई सीमा NNK लाइब्रेरी डिजाइन के लिए पतित कोडन का उपयोग करते समय लाइब्रेरी प्राइमरों में न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन/विलोपन या समयपूर्व स्टॉप कोडन के कारण होती है। समयपूर्व स्टॉप कोडन छोटे पेप्टाइड्स उत्पन्न करते हैं और चुने जाते हैं क्योंकि उनमें अनुकूल एए मोटिफ होता है। लंबे पेप्टाइड्स सिंथेटिक लाइब्रेरी के प्राइमरों में सम्मिलन/विलोपन के परिणामस्वरूप हो सकते हैं स्क्रीनिंग के पहले दौर के लिए, हमने गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संदर्भ के रूप में जंगली-प्रकार के फेज टाइटर्स का उपयोग किया। दिलचस्प बात यह है कि पहले CSF चक्र में नकारात्मक फेज चयन बहुत मजबूत था, लेकिन रक्त में नहीं (चित्र 3a), जो कि CSF कम्पार्टमेंट में पेप्टाइड लाइब्रेरी के अधिकांश सदस्यों के निष्क्रिय प्रसार की कम संभावना के कारण हो सकता है या सापेक्ष फेज बैक्टीरियोफेज की तुलना में रक्तप्रवाह से अधिक कुशलता से बनाए रखा या निकाला जाता है। हालांकि, पैनिंग के दूसरे दौर में, दोनों क्लेड्स में CSF में फेज का मजबूत चयन देखा गया, जो यह दर्शाता है कि पिछला दौर CSF अपटेक को बढ़ावा देने वाले पेप्टाइड्स को प्रदर्शित करने वाले फेज में समृद्ध था (चित्र 3a)। फिर से, महत्वपूर्ण रक्त संवर्धन के बिना। तीसरे और चौथे दौर में भी, फेज क्लोन CSF में महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध थे। चयन के अंतिम दो दौरों के बीच प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करते हुए, हमने पाया कि चयन के चौथे दौर में अनुक्रम और भी अधिक समृद्ध थे (चित्र 3b)। दोनों पेप्टाइड अभिविन्यासों का उपयोग करके सभी 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमों से कुल 931 ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों को निकाला गया। चौथे दौर में सबसे समृद्ध रूपांकनों की सभी दौरों में उनके संवर्धन प्रोफाइल के लिए अधिक बारीकी से जांच की गई, जबकि इंजेक्टेड लाइब्रेरी (कट-ऑफ: 10% संवर्धन) (पूरक चित्र 6c) की तुलना में। चयन के सामान्य पैटर्न से पता चला कि अध्ययन किए गए अधिकांश उद्देश्य दोनों चयन शाखाओं के सभी पिछले दौरों में समृद्ध थे। हालाँकि, कुछ रूपांकन (जैसे SGL, VSG, LGS GSV) मुख्य रूप से वैकल्पिक क्लेड A से थे, जबकि अन्य (जैसे FGW, RTN, WGF, NTR) वैकल्पिक क्लेड B में समृद्ध थे।
सीएसएफ-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइड्स और स्ट्रेप्टाविडिन पेलोड से संयुग्मित बायोटिनलेटेड लीडर पेप्टाइड्स के सीएसएफ परिवहन का सत्यापन।
(ए) इंजेक्ट किए गए (इनपुट = I) फेज (पीएफयू) टिटर्स और निर्धारित सीएसएफ फेज टिटर्स (आउटपुट = ओ) के आधार पर सभी चार राउंड (आर 1-आर 4) में गणना की गई संवर्धन अनुपात। पिछले तीन राउंड (आर 2-आर 4) के लिए संवर्धन कारकों की गणना पिछले राउंड और पहले राउंड (आर 1) के साथ वजन डेटा के साथ तुलना करके की गई थी। खुली पट्टियाँ मस्तिष्कमेरु द्रव हैं, छायांकित पट्टियाँ प्लाज्मा हैं। (***p<0.001, स्टूडेंट के टी-टेस्ट के आधार पर)। (बी) सबसे प्रचुर मात्रा में फेज पेप्टाइड्स की सूची, चयन के राउंड 4 के बाद सीएसएफ में एकत्र सभी फेजों के सापेक्ष अनुपात के अनुसार क्रमबद्ध। छह सबसे आम फेज क्लोनों को रंग, क्रमांकित और चयन के राउंड 3 और 4 के बीच उनके संवर्धन कारकों (इनसेट) में हाइलाइट किया गया है। संकेतित समय बिंदुओं पर सीएसएफ और रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। (सी) 6 उम्मीदवार फेज क्लोन (2 x 1010 फेज/जानवर), खाली फेज (#1779) (2 x 1010 फेज/जानवर) और स्टॉक फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 1012 फेज/जानवर) की बराबर मात्रा में कम से कम 3 सीएम इंजेक्शन को पूंछ की नस के माध्यम से अलग से कैनुलेटेड जानवर को दिया जाता है। समय के साथ प्रत्येक इंजेक्ट किए गए फेज क्लोन और फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी के सीएसएफ फार्माकोकाइनेटिक्स को दिखाया गया है। (डी) नमूना समय के दौरान सभी ठीक हुए फेज/एमएल के लिए औसत सीएसएफ/रक्त अनुपात दिखाता है। (ई) )। सीएसएफ नमूने संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए और स्ट्रेप्टाविडिन सांद्रता को सीएसएफ एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एलिसा (एनडी = पता नहीं चला) द्वारा मापा गया। (*पी<0.05, **पी<0.01, ***पी<0.001, एनोवा परीक्षण के आधार पर)। (एफ) चयन के चौथे दौर से सबसे समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (बैंगनी) के एमिनो एसिड अनुक्रम की तुलना अन्य चयनित फेज पेप्टाइड क्लोन के साथ की गई। समान और समान एमिनो एसिड अंश रंग-कोडित हैं।
चौथे दौर (चित्र 3बी) में सभी समृद्ध फेजों में से, सीएसएफ नमूनाकरण मॉडल में आगे के व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए छह उम्मीदवार क्लोन चुने गए। छह उम्मीदवार फेज, खाली फेज (कोई इंसर्ट नहीं) और प्रोफेज पेप्टाइड लाइब्रेरी की समान मात्रा को तीन कैनुलेटेड सीएम जानवरों में इंजेक्ट किया गया, और सीएसएफ (चित्र 3सी) और रक्त (पूरक चित्र 7) परख में फार्माकोकाइनेटिक्स निर्धारित किए गए। परीक्षण किए गए सभी फेज क्लोनों ने खाली नियंत्रण फेज (#1779) की तुलना में 10-1000 गुना अधिक स्तर पर सीएसएफ कम्पार्टमेंट को लक्षित किया। उदाहरण के लिए, क्लोन #2020 और #2077 में नियंत्रण फेज की तुलना में लगभग 1000 गुना अधिक सीएसएफ टिटर थे। प्रत्येक चयनित पेप्टाइड की फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल अलग है, लेकिन उन सभी में उच्च सीएसएफ होमिंग क्षमता है। हमने क्लोन #1903 और #2011 के लिए समय के साथ निरंतर कमी देखी, जबकि क्लोन #2077, #2002 और #2009 के लिए पहले 10 मिनट के दौरान वृद्धि सक्रिय परिवहन का संकेत दे सकती है, लेकिन इसकी पुष्टि करने की आवश्यकता है। क्लोन #2020, #2002 और #2077 उच्च स्तर पर स्थिर हो गए, जबकि क्लोन #2009 की सीएसएफ सांद्रता प्रारंभिक वृद्धि के बाद धीरे-धीरे कम हो गई। फिर हमने प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना उसके रक्त सांद्रता (चित्र 3डी) से की। सभी सैंपलिंग समय पर प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार के औसत टिटर के साथ उसके रक्त टिटर के सहसंबंध ने दिखाया कि छह उम्मीदवारों में से तीन रक्त सीएसएफ में महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध थे। दिलचस्प बात यह है कि क्लोन #2077 ने उच्च रक्त स्थिरता दिखाई (पूरक चित्र 7)। यह पुष्टि करने के लिए कि पेप्टाइड्स स्वयं सीएसएफ डिब्बे में फेज कणों के अलावा अन्य कार्गो को सक्रिय रूप से परिवहन करने में सक्षम हैं, हमने एन-टर्मिनस पर बायोटिन के साथ व्युत्पन्न चार लीडर पेप्टाइड्स को संश्लेषित किया जहां पेप्टाइड्स फेज कण से जुड़ते हैं। बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड्स (सं. 2002, 2009, 2020 और 2077) को स्ट्रेप्टाविडिन (SA) के साथ संयुग्मित किया गया ताकि कुछ हद तक फेज ज्यामिति की नकल करने वाले मल्टीमेरिक फॉर्म प्राप्त किए जा सकें। इस प्रारूप ने हमें कार्गो-ट्रांसपोर्टिंग प्रोटीन पेप्टाइड्स के रूप में रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव में SA एक्सपोजर को मापने की भी अनुमति दी। महत्वपूर्ण रूप से, जब सिंथेटिक पेप्टाइड्स को इस SA-संयुग्मित प्रारूप (चित्र 3e) में प्रशासित किया जाता है, तो फेज डेटा को अक्सर पुन: प्रस्तुत किया जा सकता है। तले हुए पेप्टाइड्स में शुरुआती एक्सपोजर कम था और 48 घंटों के भीतर पता न चलने वाले स्तरों के साथ CSF क्लीयरेंस तेज था। CSF स्पेस में इन पेप्टाइड फेज क्लोनों के वितरण मार्गों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने इन विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन के 1 घंटे बाद फेज कणों का सीधे पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) का उपयोग करके व्यक्तिगत फेज पेप्टाइड हिट के स्थानीयकरण का विश्लेषण किया। उल्लेखनीय रूप से, क्लोन #2002, #2077, और #2009 को मस्तिष्क केशिकाओं में मजबूत धुंधलापन द्वारा पता लगाया जा सकता है, जबकि नियंत्रण फेज (#1779) और क्लोन #2020 का पता नहीं लगाया गया (पूरक चित्र 8)। इससे पता चलता है कि ये पेप्टाइड्स BBB को पार करके मस्तिष्क पर प्रभाव में योगदान करते हैं। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए आगे विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता है, क्योंकि BSCFB मार्ग भी शामिल हो सकता है। सबसे समृद्ध क्लोन (#2002) के एमिनो एसिड अनुक्रम की तुलना अन्य चयनित पेप्टाइड्स से करने पर, यह देखा गया कि उनमें से कुछ में समान एमिनो एसिड एक्सटेंशन हैं, जो एक समान परिवहन तंत्र (चित्र 3f) का संकेत दे सकते हैं।
अपने अनूठे प्लाज्मा प्रोफाइल और समय के साथ सीएसएफ में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 को 48 घंटे की लंबी अवधि में और अधिक खोजा गया और यह निरंतर एसए स्तरों (चित्र 4 ए) के साथ देखे गए सीएसएफ में तेजी से वृद्धि को पुन: पेश करने में सक्षम था। अन्य पहचाने गए फेज क्लोनों के संबंध में, #2077 ने मस्तिष्क केशिकाओं के लिए दृढ़ता से रंग दिया और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखने पर केशिका मार्कर लेक्टिन के साथ महत्वपूर्ण सह-स्थानिकीकरण दिखाया और संभवतः पैरेन्काइमल स्थान (चित्र 4 बी) में कुछ धुंधलापन दिखाया। यह जांचने के लिए कि क्या सीएनएस में पेप्टाइड-मध्यस्थ औषधीय प्रभाव प्राप्त किए जा सकते हैं, हमने एक प्रयोग किया जिसमें i) #2077 ट्रांजिट पेप्टाइड और ii) BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के बायोटिनाइलेटेड संस्करणों को दो अलग-अलग अनुपातों में SA के साथ मिलाया गया। एक संयोजन के लिए हमने केवल BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग किया और दूसरे के लिए हमने #2077 पेप्टाइड के लिए BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का 1:3 अनुपात का उपयोग किया। दोनों नमूनों को नसों के द्वारा प्रशासित किया गया था और समय के साथ बीटा-एमाइलॉयड पेप्टाइड 40 (एबेटा40) के रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव स्तर को मापा गया था। एबेटा40 को सीएसएफ में मापा गया क्योंकि यह मस्तिष्क के पैरेन्काइमा में बीएसीई1 अवरोध को दर्शाता है। जैसा कि अपेक्षित था, दोनों परिसरों ने एबेटा40 के रक्त स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 4सी, डी)। हालांकि, केवल पेप्टाइड नंबर 2077 और SA से संयुग्मित BACE1 पेप्टाइड के अवरोधक के मिश्रण वाले नमूनों ने मस्तिष्कमेरु द्रव में एबेटा40 में उल्लेखनीय कमी की (चित्र 4सी)। डेटा दिखाता है कि पेप्टाइड नंबर 2077 60 kDa SA प्रोटीन को CNS में ले जाने में सक्षम है और BACE1 पेप्टाइड के SA-संयुग्मित अवरोधकों के साथ औषधीय प्रभाव भी उत्पन्न करता है।
(ए) कम से कम तीन सीएम-इंटुबेटेड चूहों में सीएसएफ पेप्टाइड #2077 (आरएलएसएसवीडीएसडीएलएसजीसी) और बिना इंजेक्शन वाले कंट्रोल फेज (#1779) के दीर्घकालिक फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल को दिखाते हुए टी7 फेज का क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेज/पशु)। (बी) फेज-इंजेक्ट किए गए चूहों (2 × 10 10 फेज/पशु) में प्रतिनिधि कॉर्टिकल माइक्रोवेसल्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवि पेप्टाइड #2077 और वाहिकाओं (लेक्टिन) के काउंटरस्टेनिंग को दर्शाती है। इन फेज क्लोनों को 3 चूहों को दिया गया और छिड़काव से पहले 1 घंटे तक प्रसारित होने दिया गया। मस्तिष्क को टी7 फेज कैप्सिड के खिलाफ पॉलीक्लोनल एफआईटीसी-लेबल वाले एंटीबॉडी से विभाजित और दाग दिया गया। छिड़काव और उसके बाद के फिक्सेशन से दस मिनट पहले, डाइलाइट594-लेबल वाले लेक्टिन को अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया गया था। केशिकाओं और पेरिवास्कुलर मस्तिष्क ऊतक के लुमेन में माइक्रोवेसल्स और फेज (हरा) के ल्यूमिनल पक्ष के लेक्टिन धुंधलापन (लाल) को दिखाने वाली फ्लोरोसेंट छवियां। स्केल बार 10 µm के अनुरूप है। (सी, डी) बायोटिनाइलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड अकेले या बायोटिनाइलेटेड ट्रांजिट पेप्टाइड #2077 के साथ संयोजन में स्ट्रेप्टाविडिन के साथ युग्मित किया गया था, जिसके बाद कम से कम तीन कैनुलेटेड सीएम चूहों (10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन/किग्रा) के अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा किया गया था। Aβ40 में BACE1 पेप्टाइड अवरोधक-मध्यस्थता कमी को Aβ1-40 ELISA द्वारा रक्त (लाल) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी) में संकेतित समय बिंदुओं पर मापा गया था। बेहतर स्पष्टता के लिए, ग्राफ पर 100% के पैमाने पर एक बिंदीदार रेखा खींची गई है। (सी) 3:1 अनुपात में ट्रांज़िट पेप्टाइड #2077 और BACE1 अवरोधक पेप्टाइड से संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन के साथ इलाज किए गए चूहों में रक्त (लाल त्रिकोण) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी त्रिकोण) में Aβ40 में प्रतिशत कमी। (डी) केवल BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के साथ युग्मित स्ट्रेप्टाविडिन के साथ इलाज किए गए चूहों के रक्त Aβ40 (लाल घेरे) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी घेरे) में प्रतिशत कमी। नियंत्रण में Aβ सांद्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) थी।
फेज डिस्प्ले को बायोमेडिकल रिसर्च के कई क्षेत्रों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है17. इस विधि का उपयोग इन विवो वैस्कुलर विविधता अध्ययनों18,19 के साथ-साथ मस्तिष्क वाहिकाओं20,21,22,23,24,25,26 को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए किया गया है. इस अध्ययन में, हमने इस चयन विधि के अनुप्रयोग को न केवल मस्तिष्क वाहिकाओं को लक्षित करने वाले पेप्टाइड्स की प्रत्यक्ष पहचान तक बढ़ाया, बल्कि रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने के लिए सक्रिय परिवहन गुणों वाले उम्मीदवारों की खोज तक भी बढ़ाया. अब हम CM इंट्यूबेटेड चूहों में इन विवो चयन प्रक्रिया के विकास का वर्णन करते हैं और CSF होमिंग गुणों वाले पेप्टाइड्स की पहचान करने की इसकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं. 12-मेर यादृच्छिक पेप्टाइड्स की लाइब्रेरी प्रदर्शित करने वाले T7 फेज का उपयोग करके, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि T7 फेज रक्त-मस्तिष्क बाधा के अनुकूल होने के लिए पर्याप्त छोटा (लगभग 60 एनएम व्यास)10 है, जिससे यह सीधे रक्त-मस्तिष्क बाधा या कोरॉइड प्लेक्सस को पार कर जाता है. हमने देखा कि कैनुलेटेड सीएम चूहों से सीएसएफ हार्वेस्टिंग एक इन विवो फंक्शनल स्क्रीनिंग विधि अच्छी तरह से नियंत्रित थी, और यह कि निकाले गए फेज न केवल वास्कुलचर से बंधे थे, बल्कि रक्त-मस्तिष्क बाधा के पार एक ट्रांसपोर्टर के रूप में भी काम करते थे। इसके अलावा, एक साथ रक्त एकत्र करने और सीएसएफ और रक्त-व्युत्पन्न फेज पर एचटीएस लागू करने से, हमने पुष्टि की कि सीएसएफ की हमारी पसंद चयन के दौर के बीच रक्त संवर्धन या विस्तार के लिए फिटनेस से प्रभावित नहीं थी। हालांकि, रक्त कम्पार्टमेंट चयन प्रक्रिया का हिस्सा है, क्योंकि सीएसएफ कम्पार्टमेंट तक पहुंचने में सक्षम फेज को मस्तिष्क में खुद को समृद्ध करने के लिए रक्तप्रवाह में जीवित रहना और प्रसारित होना चाहिए। कच्चे एचटीएस डेटा से विश्वसनीय अनुक्रम जानकारी निकालने के लिए स्क्रीनिंग विधि में गतिज मापदंडों को शामिल करके, हमने रक्त में वाइल्ड-टाइप T7 फेज (t½ ~ 28 मिनट) के तीव्र फार्माकोकाइनेटिक्स की पुष्टि की24, 27, 28 और मस्तिष्कमेरु द्रव में उनका आधा जीवन भी निर्धारित किया (t½ ~ 26 मिनट) प्रति मिनट)। रक्त और सीएसएफ में समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल के बावजूद, सीएसएफ में फेज के रक्त सांद्रता का केवल 0.001% ही पता लगाया जा सका, जो रक्त-मस्तिष्क बाधा के पार वाइल्ड-टाइप T7 फेज की कम पृष्ठभूमि गतिशीलता का संकेत देता है। यह कार्य इन विवो पैनिंग रणनीतियों का उपयोग करते समय चयन के पहले दौर के महत्व को उजागर करता है, खासकर फेज प्रणालियों के लिए जो परिसंचरण से तेजी से साफ हो जाते हैं इस इन विवो पैनिंग रणनीति में कई चयन कदम शामिल थे जैसे सीएसएफ कम्पार्टमेंट में सक्रिय संचय, रक्त कम्पार्टमेंट में क्लोन का जीवित रहना, और पहले 10 मिनट के भीतर रक्त से टी7 फेज क्लोनों को तेजी से हटाना (चित्र 1डी और अनुपूरक चित्र 4एम)। )। इस प्रकार, पहले दौर के बाद, सीएसएफ में विभिन्न फेज क्लोनों की पहचान की गई, हालांकि एक ही प्रारंभिक पूल का उपयोग व्यक्तिगत जानवरों के लिए किया गया था। इससे पता चलता है कि बड़ी संख्या में लाइब्रेरी सदस्यों वाले स्रोत पुस्तकालयों के लिए कई सख्त चयन कदम विविधता में महत्वपूर्ण कमी का कारण बनते हैं। इसलिए, यादृच्छिक घटनाएं प्रारंभिक चयन प्रक्रिया का एक अभिन्न अंग बन जाएंगी, जो परिणाम को बहुत प्रभावित करेंगी। यह संभावना है कि मूल पुस्तकालय के कई क्लोनों में एक समान सीएसएफ संवर्धन प्रवृत्ति थी।
सीएसएफ में समृद्ध रूपांकन रक्त में मौजूद रूपांकनों से भिन्न होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हमने अलग-अलग जानवरों के रक्त में ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्स की ओर पहला बदलाव देखा। (चित्र 1जी, अनुपूरक चित्र 4ई, 4एफ)। ग्लाइसिन पेप्टाइड्स युक्त फेज अधिक स्थिर हो सकते हैं और उन्हें परिसंचरण से बाहर निकाले जाने की संभावना कम होती है। हालांकि, इन ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्स का मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूनों में पता नहीं चला, जिससे पता चलता है कि क्यूरेटेड लाइब्रेरी दो अलग-अलग चयन चरणों से गुज़री: एक रक्त में और दूसरा मस्तिष्कमेरु द्रव में जमा होने दिया गया। चयन के चौथे दौर से उत्पन्न सीएसएफ-समृद्ध क्लोनों का बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है। लगभग सभी व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किए गए क्लोनों को खाली नियंत्रण फेज की तुलना में सीएसएफ में समृद्ध होने की पुष्टि की गई थी। एक पेप्टाइड हिट (#2077) की अधिक विस्तार से जांच की गई। इसने अन्य हिट्स (चित्रा 3डी और पूरक चित्रा 7) की तुलना में लंबा प्लाज्मा अर्ध-जीवन दिखाया, और दिलचस्प बात यह है कि इस पेप्टाइड में सी-टर्मिनस पर सिस्टीन अवशेष था। हाल ही में यह दिखाया गया है कि पेप्टाइड्स में सिस्टीन को शामिल करने से एल्ब्यूमिन 29 से बंध कर उनके फार्माकोकाइनेटिक गुणों में सुधार हो सकता है। यह वर्तमान में पेप्टाइड #2077 के लिए अज्ञात है और इसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। कुछ पेप्टाइड्स ने सीएसएफ संवर्धन में एक वैलेंस-निर्भरता दिखाई (डेटा नहीं दिखाया गया), जो टी7 कैप्सिड की प्रदर्शित सतह ज्यामिति से संबंधित हो सकता है। हमने जिस टी7 प्रणाली का इस्तेमाल किया उसने प्रत्येक फेज कण में प्रत्येक पेप्टाइड की 5-15 प्रतियां दिखाईं। आईएचसी उम्मीदवार लीड फेज क्लोनों पर किया गया था यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि क्या यह BBB इंटरैक्शन CSF के संचय या इन क्लोनों के सीधे BCSFB में जाने का कारण बनता है। महत्वपूर्ण रूप से, हम दिखाते हैं कि चयनित पेप्टाइड्स संश्लेषित होने और प्रोटीन कार्गो से बंधे होने पर अपनी CSF परिवहन क्षमता बनाए रखते हैं। N-टर्मिनल बायोटिनलेटेड पेप्टाइड्स का SA से बंधन अनिवार्य रूप से रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव में उनके संबंधित फेज क्लोन के साथ प्राप्त परिणामों को दोहराता है (चित्र 3e)। अंत में, हम दिखाते हैं कि लीड पेप्टाइड #2077 SA से संयुग्मित BACE1 के बायोटिनलेटेड पेप्टाइड अवरोधक की मस्तिष्क क्रिया को बढ़ावा देने में सक्षम है, जिससे CSF में Abeta40 के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से कम करके CNS में स्पष्ट फार्माकोडायनामिक प्रभाव होता है (चित्र 4)। हम सभी हिट्स की पेप्टाइड अनुक्रम समरूपता खोज करके डेटाबेस में किसी भी समरूप की पहचान करने में असमर्थ थे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि T7 लाइब्रेरी का आकार लगभग 109 है, जबकि 12-mers के लिए सैद्धांतिक लाइब्रेरी का आकार 4 x 1015 है। इसलिए, हमने 12-mer पेप्टाइड लाइब्रेरी के विविधता स्थान का केवल एक छोटा सा हिस्सा चुना है, जिसका अर्थ यह हो सकता है कि इन पहचाने गए हिट के आसन्न अनुक्रम स्थान का मूल्यांकन करके अधिक अनुकूलित पेप्टाइड्स की पहचान की जा सकती है। काल्पनिक रूप से, इन पेप्टाइड्स के किसी भी प्राकृतिक समरूप को न पाने का एक कारण विकास के दौरान मस्तिष्क में कुछ पेप्टाइड रूपांकनों के अनियंत्रित प्रवेश को रोकने के लिए अचयन हो सकता है।
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम भविष्य के कार्य के लिए एक आधार प्रदान करते हैं, ताकि अधिक विस्तार से मस्तिष्कवाहिकीय अवरोध की परिवहन प्रणालियों की पहचान और विशेषता का पता लगाया जा सके। इस विधि की मूल स्थापना एक कार्यात्मक चयन रणनीति पर आधारित है, जो न केवल मस्तिष्कवाहिकीय बंधन गुणों वाले क्लोनों की पहचान करती है, बल्कि इसमें एक महत्वपूर्ण चरण भी शामिल है, जिसमें सफल क्लोनों में जैविक अवरोधों को पार करके सीएनएस कम्पार्टमेंट में जाने की आंतरिक गतिविधि होती है। इन पेप्टाइड्स के परिवहन के तंत्र और मस्तिष्क क्षेत्र के लिए विशिष्ट माइक्रोवैस्कुलचर से बंधने की उनकी प्राथमिकता को स्पष्ट करना है। इससे BBB और रिसेप्टर्स के परिवहन के लिए नए मार्गों की खोज हो सकती है। हम उम्मीद करते हैं कि पहचाने गए पेप्टाइड्स सीधे मस्तिष्कवाहिकीय रिसेप्टर्स या BBB या BCSFB के माध्यम से परिवहन किए जाने वाले परिसंचारी लिगैंड से जुड़ सकते हैं। इस कार्य में खोजे गए CSF परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड वेक्टर की आगे जांच की जाएगी। हम वर्तमान में BBB और/या BCSFB को पार करने की उनकी क्षमता के लिए इन पेप्टाइड्स की मस्तिष्क विशिष्टता की जांच कर रहे हैं। ये नए पेप्टाइड्स नए रिसेप्टर्स या मार्गों की संभावित खोज के लिए और मस्तिष्क तक जैविक पदार्थों जैसे वृहत् अणुओं को पहुंचाने के लिए नए अत्यधिक कुशल प्लेटफार्मों के विकास के लिए अत्यंत मूल्यवान उपकरण होंगे।
पहले वर्णित विधि के संशोधन का उपयोग करके बड़े सिस्टर्ना (CM) को कैनुलेट करें। एनेस्थेटाइज़्ड विस्टार चूहों (200-350 ग्राम) को एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखा गया था और खोपड़ी को उजागर करने के लिए मुंडा और एसेप्टिक रूप से तैयार खोपड़ी पर एक मध्य चीरा लगाया गया था। ऊपरी सैश के क्षेत्र में दो छेद ड्रिल करें और छेद में फिक्सिंग स्क्रू को जकड़ें। CM में स्टेनलेस स्टील कैनुला के स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के लिए पार्श्व ओसीसीपिटल शिखा में एक अतिरिक्त छेद ड्रिल किया गया था। कैनुला के चारों ओर डेंटल सीमेंट लगाएं और स्क्रू से सुरक्षित करें। फोटो-क्योरिंग और सीमेंट सख्त होने के बाद, त्वचा के घाव को 4/0 सुप्रामिड सिवनी से बंद कर दिया गया। कैनुला के उचित स्थान की पुष्टि मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) के स्वतःस्फूर्त रिसाव से होती है। चूहे को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से निकालें, उचित पोस्टऑपरेटिव देखभाल और दर्द प्रबंधन प्राप्त करें, और मस्तिष्कमेरु द्रव में रक्त के लक्षण दिखाई देने तक उसे कम से कम एक सप्ताह तक ठीक होने दें। विस्टार चूहे (Crl:WI/Han) चार्ल्स नदी (फ्रांस) से प्राप्त किए गए थे। सभी चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। सभी पशु प्रयोगों को बेसल, स्विटज़रलैंड के शहर के पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था, और पशु लाइसेंस संख्या 2474 (चूहे के मस्तिष्कमेरु द्रव और मस्तिष्क में चिकित्सीय उम्मीदवारों के स्तरों को मापकर सक्रिय मस्तिष्क परिवहन का आकलन) के अनुसार किया गया था।
चूहे को CM कैनुला हाथ में लेकर धीरे से होश में रखें। कैनुला से धतूरा निकालें और स्वतः बहने वाले मस्तिष्कमेरु द्रव के 10 µl को इकट्ठा करें। चूँकि कैनुला की पारगम्यता अंततः कमज़ोर हो गई थी, इसलिए इस अध्ययन में केवल स्पष्ट मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूने शामिल किए गए थे जिनमें रक्त संदूषण या मलिनकिरण का कोई सबूत नहीं था। समानांतर में, पूंछ की नोक पर एक छोटे से चीरे से लगभग 10-20 μl रक्त हेपरिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ ट्यूबों में लिया गया था। T7 फेज के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर CSF और रक्त एकत्र किया गया। प्रत्येक CSF नमूने को एकत्र करने से पहले लगभग 5-10 μl द्रव को त्याग दिया गया था, जो कैथेटर की मृत मात्रा से मेल खाता है।
T7Select 10-3b वेक्टर का उपयोग करके लाइब्रेरी तैयार की गई, जैसा कि T7Select सिस्टम मैनुअल (नोवागेन, रोसेनबर्ग एट अल., इनोवेशन्स 6, 1-6, 1996) में वर्णित है। संक्षेप में, एक यादृच्छिक 12-मेर डीएनए इंसर्ट को निम्नलिखित प्रारूप में संश्लेषित किया गया:
एनएनके कोडॉन का उपयोग इंसर्ट में डबल स्टॉप कोडॉन और एमिनो एसिड ओवरएक्सप्रेशन से बचने के लिए किया गया था। N प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित सममोलर अनुपात है, और K एडेनिन और साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित सममोलर अनुपात है। सिंगल स्ट्रैंडेड क्षेत्रों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए क्लेनो बफर (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) में डीएनटीपी (नोवाजेन) और क्लेनो एंजाइम (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के साथ आगे के ऊष्मायन द्वारा डबल स्ट्रैंडेड डीएनए में परिवर्तित किया गया था। प्रतिक्रिया के बाद, डबल स्ट्रैंडेड डीएनए को EtOH अवक्षेपण द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया। परिणामी डीएनए को प्रतिबंध एंजाइम EcoRI और HindIII (दोनों रोश से) के साथ पचाया गया था। क्लीव्ड और शुद्ध (QIAquick, Qiagen) इंसर्ट (T4 लाइगेज, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) को 10B कैप्सिड जीन के एमिनो एसिड 348 के बाद प्री-क्लीव्ड T7 वेक्टर में फ्रेम में लिगेट किया गया था। इन विट्रो पैकेजिंग से पहले लिगेशन अभिक्रियाओं को 16° C पर 18 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। इन विट्रो में फेज पैकेजिंग T7Select 10-3b क्लोनिंग किट (नोवाजेन) के साथ दिए गए निर्देशों के अनुसार की गई और पैकेजिंग घोल को एस्चेरिचिया कोली (BLT5615, नोवाजेन) का उपयोग करके एक बार बढ़ाया गया। लाइसेट्स को सेंट्रीफ्यूज किया गया, टाइट्रेट किया गया और ग्लिसरॉल के स्टॉक घोल के रूप में -80° C पर जमाया गया।
प्रोप्राइटरी 454/रोश-एम्प्लिकॉन फ्यूजन प्राइमर का उपयोग करके ब्रॉथ या प्लेट में प्रवर्धित फेज वैरिएबल क्षेत्रों का प्रत्यक्ष पीसीआर प्रवर्धन। फॉरवर्ड फ्यूजन प्राइमर में वैरिएबल क्षेत्र (एनएनके) 12 (टेम्पलेट-विशिष्ट), जीएस एफएलएक्स टाइटेनियम एडेप्टर ए, और एक चार-बेस लाइब्रेरी कुंजी अनुक्रम (टीसीएजी) (पूरक चित्र 1 ए) के साथ अनुक्रम शामिल हैं:
रिवर्स फ्यूजन प्राइमर में कैप्चर बीड्स से जुड़ा बायोटिन और इमल्शन पीसीआर के दौरान क्लोनल प्रवर्धन के लिए आवश्यक जीएस एफएलएक्स टाइटेनियम एडाप्टर बी भी शामिल है:
इसके बाद एम्प्लीकॉन्स को 454 GS-FLX टाइटेनियम प्रोटोकॉल के अनुसार 454/रोश पाइरोसीक्वेंसिंग के अधीन किया गया। मैनुअल सेंगर सीक्वेंसिंग (एप्लाइड बायोसिस्टम्स हिताची 3730 xl डीएनए एनालाइजर) के लिए, T7 फेज डीएनए को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया और निम्नलिखित प्राइमर जोड़ों के साथ अनुक्रमित किया गया:
अलग-अलग प्लाक से इंसर्ट को रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलीमरेज़ किट (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन के अधीन किया गया। एक हॉट स्टार्ट (95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) और 35 बूस्ट साइकिल (95 डिग्री सेल्सियस पर 50 सेकंड, 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) करें।
लाइब्रेरी से फेज, वाइल्ड-टाइप फेज, सीएसएफ और रक्त से बचाए गए फेज, या अलग-अलग क्लोन को एस्चेरिचिया कोली BL5615 में टीबी शोरबा (सिग्मा एल्ड्रिच) या 500 सेमी2 डिश (थर्मो साइंटिफिक) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्रवर्धित किया गया। प्लेटों को ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लुका एनालिटिकल) से धोकर या स्टेराइल पिपेट टिप्स के साथ पट्टिकाओं को इकट्ठा करके प्लेटों से फेज को निकाला गया। पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल (पीईजी 8000) अवक्षेपण (प्रोमेगा) के एक दौर के साथ फेज को कल्चर सुपरनैटेंट या निष्कर्षण बफर से अलग किया गया और ट्रिस-ईडीटीए बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया।
प्रवर्धित फेज को अंतःशिरा (IV) इंजेक्शन (500 μl/पशु) से पहले एंडोटॉक्सिन हटाने वाले मोतियों (मिल्टेनी बायोटेक) का उपयोग करके एंडोटॉक्सिन हटाने के 2-3 दौर से गुजरना पड़ा। पहले दौर में, 2×1012 फेज पेश किए गए; दूसरे में, 2×1010 फेज; तीसरे और चौथे चयन दौर में, प्रति पशु 2×109 फेज। निर्माता के निर्देशों (T7Select सिस्टम मैनुअल) के अनुसार संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए CSF और रक्त के नमूनों में फेज सामग्री को प्लाक काउंटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। फेज का चयन शुद्ध लाइब्रेरी को अंतःशिरा रूप से पूंछ की शिरा में इंजेक्ट करके या पिछले चयन दौर से सीएसएफ से निकाले गए फेज को फिर से इंजेक्ट करके किया गया था, और बाद की हार्वेस्ट क्रमशः 10 मिनट, 30 मिनट, 60 मिनट, 90 मिनट, 120 मिनट, 180 मिनट और 240 मिनट पर सीएसएफ और रक्त के नमूने लिए गए थे। इन विवो पैनिंग के कुल चार दौर आयोजित किए गए थे जिसमें दो चयनित शाखाओं को अलग-अलग संग्रहीत किया गया था और चयन के पहले तीन दौर के दौरान उनका विश्लेषण किया गया था। चयन के पहले दो दौर से सीएसएफ से निकाले गए सभी फेज इंसर्ट को 454/रोश पाइरोसीक्वेंसिंग के अधीन किया गया था, फेज क्लोन के इंजेक्शन के लिए, चयनित फेज को 500 सेमी2 प्लेटों पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए ई. कोली (BL5615) में प्रवर्धित किया गया। व्यक्तिगत रूप से चयनित और मैन्युअल रूप से अनुक्रमित क्लोन को टीबी माध्यम में प्रचारित किया गया। फेज निष्कर्षण, शुद्धिकरण और एंडोटॉक्सिन को हटाने के बाद (जैसा कि ऊपर वर्णित है), 300 μl में 2×1010 फेज/पशु को एक पूंछ नस में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया।
अनुक्रम डेटा की प्रीप्रोसेसिंग और गुणात्मक फ़िल्टरिंग। विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे 454/रोश डेटा को बाइनरी मानक स्ट्रीम मैप फ़ॉर्मेट (sff) से पियर्सन मानव पठनीय फ़ॉर्मेट (फ़ास्टा) में परिवर्तित किया गया था। न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का आगे का प्रसंस्करण मालिकाना C प्रोग्राम और स्क्रिप्ट (अप्रकाशित सॉफ़्टवेयर पैकेज) का उपयोग करके किया गया था जैसा कि नीचे वर्णित है। प्राथमिक डेटा के विश्लेषण में सख्त बहु-चरण फ़िल्टरिंग प्रक्रियाएँ शामिल हैं। उन रीड्स को फ़िल्टर करने के लिए जिनमें वैध 12mer इंसर्ट DNA अनुक्रम नहीं था, रीड्स को क्रमिक रूप से स्टार्ट लेबल (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), स्टॉप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) और बैकग्राउंड इंसर्ट (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) के साथ संरेखित किया गया था, जो प्रति संरेखण 2 असंगतियों की अनुमति देता है31। इसलिए, बिना स्टार्ट और स्टॉप टैग वाले रीड और बैकग्राउंड इंसर्ट वाले रीड, यानी, ऐसे अलाइनमेंट जो मिसमैच की अनुमत संख्या से अधिक हैं, लाइब्रेरी से हटा दिए गए थे। शेष रीड के लिए, स्टार्ट मार्क से विस्तारित और स्टॉप मार्क से पहले समाप्त होने वाले एन-मेर डीएनए अनुक्रम को मूल रीड अनुक्रम से निकाल दिया गया था और आगे संसाधित किया गया था (इसके बाद "इंसर्ट" के रूप में संदर्भित)। इंसर्ट के अनुवाद के बाद, प्राइमर के 5' छोर पर पहले स्टॉप कोडन के बाद का हिस्सा इंसर्ट से हटा दिया जाता है। इसके अलावा, प्राइमर के 3' छोर पर अधूरे कोडन की ओर ले जाने वाले न्यूक्लियोटाइड भी हटा दिए गए थे। केवल बैकग्राउंड अनुक्रम वाले इंसर्ट को बाहर करने के लिए, एमिनो एसिड पैटर्न "PAG" से शुरू होने वाले अनुवादित इंसर्ट को भी हटा दिया गया था। 3 एमिनो एसिड से कम की पोस्ट-ट्रांसलेशनल लंबाई वाले पेप्टाइड्स को लाइब्रेरी से हटा दिया गया था। अंत में, इंसर्ट पूल में अतिरेक को हटा दें और प्रत्येक अद्वितीय इंसर्ट की आवृत्ति निर्धारित करें। इस विश्लेषण के परिणामों में न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों (सम्मिलित) और उनकी (पठनीय) आवृत्तियों की एक सूची शामिल थी (पूरक चित्र 1सी और 2)।
अनुक्रम समानता के आधार पर एन-मेर डीएनए प्रविष्टियों को समूहीकृत करें: 454/रोशे-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटियों (जैसे अनुक्रमण होमोपॉलीमर एक्सटेंशन के साथ समस्याएँ) को दूर करने और कम महत्वपूर्ण अतिरेक को हटाने के लिए, पहले से फ़िल्टर किए गए एन-मेर डीएनए अनुक्रम प्रविष्टियों (प्रविष्टियों) को समानता के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है। प्रविष्टियाँ (2 गैर-मिलान वाले आधारों तक की अनुमति है) एक पुनरावृत्त एल्गोरिथ्म का उपयोग करते हुए इस प्रकार परिभाषित की गई हैं: प्रविष्टियों को पहले उनकी आवृत्ति (उच्चतम से निम्नतम) के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है, और यदि वे समान हैं, तो उनकी लंबाई के अनुसार द्वितीयक क्रमबद्धता (सबसे लंबी से सबसे छोटी) के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है। इस प्रकार, सबसे अधिक बार और सबसे लंबी प्रविष्टियाँ पहले "समूह" को परिभाषित करती हैं। समूह आवृत्ति को कुंजी आवृत्ति पर सेट किया गया है। फिर, क्रमबद्ध सूची में यदि संरेखण में बेमेल, प्रविष्टियों या विलोपनों की संख्या 2 की सीमा से अधिक नहीं है, तो समूह में एक प्रविष्टि जोड़ी जाती है, और समग्र समूह आवृत्ति इस आधार पर बढ़ जाती है कि प्रविष्टि कितनी बार जोड़ी गई थी। समूह में जोड़े गए प्रविष्टियों को उपयोग किए गए के रूप में चिह्नित किया जाता है और आगे की प्रक्रिया से बाहर रखा जाता है। यदि प्रविष्टि अनुक्रम को पहले से मौजूद समूह में नहीं जोड़ा जा सकता है, तो प्रविष्टि अनुक्रम का उपयोग उचित प्रविष्टि आवृत्ति के साथ एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है और उपयोग किए गए के रूप में चिह्नित किया जाता है। पुनरावृत्ति तब समाप्त होती है जब प्रत्येक प्रविष्टि अनुक्रम का उपयोग या तो एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है या पहले से मौजूद समूह में शामिल किया जा सकता है। आखिरकार, न्यूक्लियोटाइड से युक्त समूहीकृत प्रविष्टियों को अंततः पेप्टाइड अनुक्रमों (पेप्टाइड लाइब्रेरी) में अनुवादित किया जाता है। इस विश्लेषण का परिणाम प्रविष्टियों और उनकी संगत आवृत्तियों का एक सेट है जो लगातार रीड्स की संख्या बनाते हैं (पूरक चित्र 2)।
मोटिफ जनरेशन: अद्वितीय पेप्टाइड्स की सूची के आधार पर, एक लाइब्रेरी बनाई गई जिसमें सभी संभावित अमीनो एसिड पैटर्न (aa) शामिल थे जैसा कि नीचे दिखाया गया है। लंबाई 3 के प्रत्येक संभावित पैटर्न को पेप्टाइड से निकाला गया और इसके व्युत्क्रम पैटर्न को सभी पैटर्न (ट्रिपेप्टाइड्स) वाले एक सामान्य मोटिफ लाइब्रेरी के साथ जोड़ा गया। अत्यधिक दोहराव वाले मोटिफ की लाइब्रेरी को अनुक्रमित किया गया और अतिरेक को हटा दिया गया। फिर, मोटिफ लाइब्रेरी में प्रत्येक ट्रिपेप्टाइड के लिए, हमने कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करके लाइब्रेरी में इसकी उपस्थिति की जाँच की। इस मामले में, पाए गए मोटिफ ट्रिपेप्टाइड वाले पेप्टाइड की आवृत्ति को जोड़ा जाता है और मोटिफ लाइब्रेरी में मोटिफ को सौंपा जाता है ("मोटिफ की संख्या")। मोटिफ जनरेशन का परिणाम एक दो-आयामी सरणी है जिसमें ट्रिपेप्टाइड्स (मोटिफ) की सभी घटनाएँ और उनके संबंधित मान शामिल हैं, जो अनुक्रमण रीड्स की संख्या है जो रीड्स को फ़िल्टर, समूहीकृत और अनुवादित किए जाने पर संबंधित मोटिफ में परिणामित होते हैं। मेट्रिक्स जैसा कि ऊपर विस्तार से वर्णित है।
रूपांकनों की संख्या और संबंधित स्कैटरप्लॉट्स का सामान्यीकरण: प्रत्येक नमूने के लिए रूपांकनों की संख्या का उपयोग करके सामान्यीकरण किया गया था
जहाँ ni विषय i वाले रीड्स की संख्या है। इस प्रकार, vi नमूने में मोटिफ i वाले रीड्स (या पेप्टाइड्स) की प्रतिशत आवृत्ति को दर्शाता है। गैर-सामान्यीकृत मोटिफ्स की संख्या के लिए P-मानों की गणना फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। उद्देश्यों की संख्या के सहसंबंधों के संबंध में, स्पीयरमैन के सहसंबंधों की गणना R के साथ उद्देश्यों की सामान्यीकृत संख्या का उपयोग करके की गई थी।
पेप्टाइड लाइब्रेरी में प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड की सामग्री को देखने के लिए, वेब लॉगोग्राम 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) बनाए गए थे। सबसे पहले, 12-मेर पेप्टाइड की प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड की सामग्री को 20×12 मैट्रिक्स में संग्रहीत किया जाता है। फिर, प्रत्येक स्थिति पर समान सापेक्ष अमीनो एसिड सामग्री वाले 1000 पेप्टाइड्स का एक सेट फास्टा-सीक्वेंस प्रारूप में उत्पन्न होता है और वेब-लोगो 3 में इनपुट के रूप में प्रदान किया जाता है, जो प्रत्येक स्थिति पर सापेक्ष अमीनो एसिड सामग्री का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व उत्पन्न करता है। किसी दिए गए पेप्टाइड लाइब्रेरी के लिए। बहुआयामी डेटासेट को देखने के लिए, R में आंतरिक रूप से विकसित टूल (biosHeatmap, अभी तक जारी नहीं किया गया R पैकेज) का उपयोग करके हीट मैप बनाए गए थे। हीट मैप में प्रस्तुत डेंड्रोग्राम की गणना यूक्लिडियन दूरी मीट्रिक के साथ वार्ड की पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विधि का उपयोग करके की गई थी। मोटिफ स्कोरिंग डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके असामान्य स्कोरिंग के लिए P मान की गणना की गई। अन्य डेटासेट के लिए P-मान की गणना R में स्टूडेंट के t-टेस्ट या ANOVA का उपयोग करके की गई।
चयनित फेज क्लोन और बिना इंसर्ट वाले फेज को पूंछ की नस (300 μl PBS में 2×1010 फेज/पशु) के माध्यम से अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया। छिड़काव और उसके बाद के स्थिरीकरण से दस मिनट पहले, उन्हीं जानवरों को 100 μl DyLight594-लेबल लेक्टिन (वेक्टर लेबोरेटरीज इंक., DL-1177) के साथ अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया। फेज इंजेक्शन के 60 मिनट बाद, चूहों के दिल के माध्यम से 50 मिली PBS और उसके बाद 50 मिली 4% PFA/PBS का छिड़काव किया गया। मस्तिष्क के नमूनों को अतिरिक्त रूप से 4% PFA/PBS में रात भर स्थिर किया गया और 4°C पर रात भर 30% सुक्रोज में भिगोया गया। नमूनों को OCT मिश्रण में फ्लैश फ्रोजन किया जाता है। जमे हुए नमूनों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण कमरे के तापमान पर 30 µm क्रायोसेक्शन पर 1% BSA के साथ ब्लॉक किया गया और 4 °C पर T7 फेज (नोवस NB 600-376A) के खिलाफ पॉलीक्लोनल FITC-लेबल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। रात भर इनक्यूबेट करें। अंत में, अनुभागों को PBS से 3 बार धोया गया और एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) से जांच की गई।
98% की न्यूनतम शुद्धता वाले सभी पेप्टाइड्स को जेनस्क्रिप्ट यूएसए द्वारा संश्लेषित किया गया, बायोटिनिलेटेड और लाइओफिलाइज्ड किया गया। बायोटिन को एन-टर्मिनस पर एक अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसर के माध्यम से बांधा जाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके सभी पेप्टाइड्स की जाँच करें।
स्ट्रेप्टाविडिन (सिग्मा S0677) को बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनिलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड या बायोटिनिलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड और BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के संयोजन (3:1 अनुपात) के 5 गुना सममोलर अतिरिक्त के साथ 5-10% DMSO/PBS में इनक्यूबेट किया गया। इंजेक्शन से 1 घंटे पहले कमरे के तापमान पर। स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित पेप्टाइड्स को मस्तिष्क गुहा वाले चूहों की पूंछ की नसों में से एक में 10 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया।
स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की सांद्रता का मूल्यांकन एलिसा द्वारा किया गया। ननक मैक्सिसॉर्प माइक्रोटिटर प्लेट्स (सिग्मा) को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 μg/ml माउस एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी (थर्मो, MA1-20011) के साथ रात भर लेपित किया गया। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ब्लॉकिंग (ब्लॉकिंग बफर: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% BSA) के बाद, प्लेट को 0.05% ट्वीन-20/PBS (वॉश बफर) से 3 सेकंड के लिए धो लें, CSF और प्लाज्मा के नमूनों को ब्लॉकिंग बफर (प्लाज्मा 1:10,000, CSF 1:115) से पतला करके कुओं में डाला गया। फिर प्लेट को डिटेक्शन एंटीबॉडी (1 μg/ml, एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन-HRP, Novus NB120-7239) के साथ 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। तीन धुलाई चरणों के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन को 20 मिनट तक TMB सब्सट्रेट सॉल्यूशन (रोश) में इनक्यूबेशन द्वारा डिटेक्ट किया गया। 1M H2SO4 के साथ रंग विकास को रोकने के बाद, 450 nm पर अवशोषण को मापें।
निर्माता के प्रोटोकॉल (वाको, 294-64701) के अनुसार स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड-BACE1 अवरोधक परिसर के कार्य का मूल्यांकन Aβ(1-40) ELISA द्वारा किया गया। संक्षेप में, CSF नमूनों को मानक मंदक (1:23) में पतला किया गया और BNT77 कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित 96-वेल प्लेटों में 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। पाँच धुलाई चरणों के बाद, HRP-संयुग्मित BA27 एंटीबॉडी को जोड़ा गया और 4°C पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, उसके बाद पाँच धुलाई चरण किए गए। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए TMB घोल में इनक्यूबेशन द्वारा Aβ(1–40) का पता लगाया गया। स्टॉप सॉल्यूशन के साथ रंग विकास को रोकने के बाद, 450 एनएम पर अवशोषण को मापें। प्लाज्मा नमूनों को Aβ(1–40) ELISA से पहले ठोस चरण निष्कर्षण के अधीन किया गया था। प्लाज्मा को 96-वेल प्लेट में 0.2% DEA (सिग्मा) में मिलाया गया और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया। SPE प्लेट (ओएसिस, 186000679) को पानी और 100% मेथनॉल से लगातार धोने के बाद, प्लाज्मा के नमूनों को SPE प्लेट में डाला गया और सारा तरल निकाल दिया गया। नमूनों को धोया गया (पहले 5% मेथनॉल और फिर 30% मेथनॉल से) और 2% NH4OH/90% मेथनॉल से निक्षालित किया गया। 55°C पर 99 मिनट तक लगातार N2 करंट पर निक्षालित करने के बाद, नमूनों को मानक तनु में कम किया गया और Aβ(1–40) को ऊपर बताए अनुसार मापा गया।
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