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रक्त-मस्तिष्क अवरोध (ब्लड-ब्रेन बैरियर) और इसके कारण जैविक उपचारात्मक एजेंट केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अपने लक्ष्य तक नहीं पहुंच पाते, जिससे तंत्रिका संबंधी रोगों का प्रभावी उपचार बाधित होता है। जीवित मस्तिष्क में नए ट्रांसपोर्टरों की खोज के लिए, हमने T7 फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी का प्रयोग किया और चूहों के एक कैनुलेटेड सचेत बड़े पूल मॉडल का उपयोग करके क्रमिक रूप से रक्त और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (CSF) एकत्र किया। चार चरणों के चयन के बाद विशिष्ट फेज क्लोन CSF में अत्यधिक समृद्ध पाए गए। व्यक्तिगत उम्मीदवार पेप्टाइड के परीक्षण से CSF में 1000 गुना से अधिक संवर्धन का पता चला। मस्तिष्क में पेप्टाइड-मध्यस्थता से होने वाली डिलीवरी की जैव सक्रियता की पुष्टि सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में एमिलॉयड-β के स्तर में 40% की कमी से हुई, जिसके लिए पहचाने गए नए ट्रांजिट पेप्टाइड से जुड़े BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग किया गया। ये परिणाम बताते हैं कि जीवित फेज चयन विधियों द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड चिकित्सीय प्रभाव के साथ मस्तिष्क में वृहदिका अणुओं की प्रणालीगत डिलीवरी के लिए उपयोगी वाहक हो सकते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लक्षित चिकित्सा अनुसंधान मुख्य रूप से सीएनएस-लक्ष्यीकरण गुण प्रदर्शित करने वाली अनुकूलित दवाओं और एजेंटों की पहचान पर केंद्रित रहा है, जबकि मस्तिष्क तक सक्रिय दवा वितरण को संचालित करने वाले तंत्रों की खोज पर कम ध्यान दिया गया है। अब यह स्थिति बदलने लगी है क्योंकि दवा वितरण, विशेष रूप से बड़े अणुओं का, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान दवा विकास का एक अभिन्न अंग है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का वातावरण मस्तिष्क वाहिका अवरोध प्रणाली द्वारा अच्छी तरह से संरक्षित है, जिसमें रक्त-मस्तिष्क अवरोध (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्क अवरोध (बीसीबीबी)1 शामिल हैं, जिससे मस्तिष्क तक दवाओं का वितरण चुनौतीपूर्ण हो जाता है1,2। यह अनुमान लगाया गया है कि लगभग सभी बड़े अणु वाली दवाएं और 98% से अधिक छोटे अणु वाली दवाएं मस्तिष्क से बाहर निकल जाती हैं3। यही कारण है कि सीएनएस में चिकित्सीय दवाओं के कुशल और विशिष्ट वितरण को प्रदान करने वाली नई मस्तिष्क परिवहन प्रणालियों की पहचान करना बहुत महत्वपूर्ण है4,5। हालांकि, बीबीबी और बीसीएसएफबी दवा वितरण के लिए एक उत्कृष्ट अवसर भी प्रदान करते हैं क्योंकि वे अपनी व्यापक वाहिका प्रणाली के माध्यम से मस्तिष्क की सभी संरचनाओं में प्रवेश करते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क तक दवा पहुंचाने के लिए गैर-आक्रामक विधियों का उपयोग करने के वर्तमान प्रयास मुख्य रूप से अंतर्जात BBB6 रिसेप्टर का उपयोग करके रिसेप्टर-मध्यस्थ परिवहन (PMT) की क्रियाविधि पर आधारित हैं। ट्रांसफ़रिन रिसेप्टर मार्ग7,8 का उपयोग करके हाल ही में हुई महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, बेहतर गुणों वाले नए वितरण तंत्रों के और विकास की आवश्यकता है। इस उद्देश्य से, हमारा लक्ष्य CSF परिवहन में मध्यस्थता करने में सक्षम पेप्टाइड्स की पहचान करना था, क्योंकि सिद्धांत रूप में इनका उपयोग मैक्रोमोलेक्यूल्स को CNS तक पहुंचाने या नए रिसेप्टर मार्गों को खोलने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, सेरेब्रोवास्कुलर प्रणाली (BBB और BSCFB) के विशिष्ट रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टर जैवचिकित्सीय दवाओं के सक्रिय और विशिष्ट वितरण के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में कार्य कर सकते हैं। सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (CSF) कोरॉइड प्लेक्सस (CS) का एक स्रावी उत्पाद है और सबराचनोइड स्पेस और वेंट्रिकुलर स्पेस4 के माध्यम से मस्तिष्क के अंतरालीय द्रव के साथ सीधे संपर्क में होता है। हाल ही में यह दिखाया गया है कि सबराचनोइड सेरेब्रोस्पाइनल द्रव मस्तिष्क के अंतरास्थि क्षेत्र में अत्यधिक मात्रा में फैलता है9। हम इस सबराचनोइड प्रवाह मार्ग का उपयोग करके या सीधे रक्त-रक्त वाहिनी (बीबीबी) के माध्यम से पैरेन्काइमल स्पेस तक पहुँचने की उम्मीद करते हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, हमने एक मजबूत इन विवो फेज चयन रणनीति लागू की है जो आदर्श रूप से इन दो अलग-अलग मार्गों में से किसी एक द्वारा परिवहन किए गए पेप्टाइड की पहचान करती है।
अब हम सीएसएफ नमूने के साथ उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (एचटीएस) का उपयोग करते हुए अनुक्रमिक इन विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग उच्चतम लाइब्रेरी विविधता वाले प्रारंभिक चयन दौरों की निगरानी के लिए किया जाता है। रक्त संदूषण से बचने के लिए स्थायी रूप से प्रत्यारोपित बड़े सिस्टर्ना (सीएम) कैनुला वाले सचेत चूहों पर स्क्रीनिंग की गई। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दृष्टिकोण मस्तिष्क-लक्ष्यीकरण करने वाले और सेरेब्रोवास्कुलर अवरोध के पार परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड्स दोनों का चयन करता है। हमने टी7 फेज का उपयोग उनके छोटे आकार (~60 एनएम)10 के कारण किया और सुझाव दिया कि वे वेसिकल्स के परिवहन के लिए उपयुक्त हैं जो एंडोथेलियल और/या एपिथेलियल-मेडुला अवरोध के ट्रांससेलुलर क्रॉसिंग की अनुमति देते हैं। पैनिंग के चार दौरों के बाद, फेज आबादी को अलग किया गया जो मजबूत इन विवो सीएसएफ संवर्धन और सेरेब्रल माइक्रोवेसल एसोसिएशन को दर्शाती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि हम यह प्रदर्शित करके अपने निष्कर्षों की पुष्टि करने में सक्षम थे कि पसंदीदा और रासायनिक रूप से संश्लेषित सर्वोत्तम उम्मीदवार पेप्टाइड्स प्रोटीन कार्गो को सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में परिवहन करने में सक्षम हैं। सर्वप्रथम, एक प्रमुख पारगमन पेप्टाइड को BACE1 पेप्टाइड के अवरोधक के साथ मिलाकर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) के औषधीय प्रभावों को स्थापित किया गया। यह प्रदर्शित करने के अलावा कि इन विवो कार्यात्मक स्क्रीनिंग रणनीतियाँ प्रभावी प्रोटीन कार्गो वाहक के रूप में नए मस्तिष्क परिवहन पेप्टाइड की पहचान कर सकती हैं, हम उम्मीद करते हैं कि इसी प्रकार के कार्यात्मक चयन दृष्टिकोण नए मस्तिष्क परिवहन मार्गों की पहचान करने में भी महत्वपूर्ण हो जाएँगे।
प्लाक-फॉर्मिंग यूनिट्स (पीएफयू) के आधार पर, फ़ेज पैकेजिंग चरण के बाद, लगभग 109 की विविधता वाले यादृच्छिक 12-मर लीनियर टी7 फ़ेज पेप्टाइड्स की एक लाइब्रेरी डिज़ाइन और निर्मित की गई (सामग्री और विधियाँ देखें)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने इन विवो पैनिंग से पहले इस लाइब्रेरी का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया। संशोधित प्राइमर का उपयोग करके फ़ेज लाइब्रेरी नमूनों के पीसीआर प्रवर्धन से ऐसे एम्प्लिकॉन उत्पन्न हुए जो सीधे एचटीएस के लिए लागू थे (पूरक चित्र 1ए)। (क) एचटीएस11 अनुक्रमण त्रुटियों, (ख) प्राइमर (एनएनके) 1-12 की गुणवत्ता पर प्रभाव, और (ग) स्टैंडबाय लाइब्रेरी में वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) फ़ेज (कंकाल इंसर्ट) की उपस्थिति के कारण, केवल सत्यापित अनुक्रम जानकारी निकालने के लिए एक अनुक्रम फ़िल्टरिंग प्रक्रिया लागू की गई (पूरक चित्र 1बी)। ये फ़िल्टर चरण सभी एचटीएस अनुक्रमण पुस्तकालयों पर लागू होते हैं। मानक लाइब्रेरी के लिए, कुल 233,868 रीड्स प्राप्त हुए, जिनमें से 39% फ़िल्टर मानदंडों पर खरे उतरे और लाइब्रेरी विश्लेषण और बाद के दौरों के लिए चयन हेतु उपयोग किए गए (पूरक चित्र 1c–e)। रीड्स मुख्य रूप से 3 बेस पेयर की लंबाई के गुणक थे, जिनमें 36 न्यूक्लियोटाइड पर एक शिखर था (पूरक चित्र 1c), जो लाइब्रेरी डिज़ाइन (NNK) 1-12 की पुष्टि करता है। विशेष रूप से, लाइब्रेरी के लगभग 11% सदस्यों में 12-आयामी वाइल्ड-टाइप (wt) बैकबोन PAGISRELVDKL इंसर्ट था, और लगभग आधे अनुक्रमों (49%) में इंसर्शन या डिलीशन थे। लाइब्रेरी के HTS ने लाइब्रेरी में पेप्टाइड्स की उच्च विविधता की पुष्टि की: 81% से अधिक पेप्टाइड अनुक्रम केवल एक बार पाए गए और केवल 1.5% ≥4 प्रतियों में पाए गए (पूरक चित्र 2a)। रिपर्टोयर में सभी 12 स्थितियों पर अमीनो एसिड (aa) की आवृत्तियाँ, डिजेनरेट NKK रिपर्टोयर द्वारा उत्पन्न कोडोन की संख्या के लिए अपेक्षित आवृत्तियों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित थीं (पूरक चित्र 2b)। इन इंसर्ट्स द्वारा एन्कोड किए गए aa अवशेषों की प्रेक्षित आवृत्ति, परिकलित आवृत्ति (r = 0.893) के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित थी (पूरक चित्र 2c)। इंजेक्शन के लिए फ़ेज लाइब्रेरी तैयार करने में प्रवर्धन और एंडोटॉक्सिन को हटाने के चरण शामिल हैं। पहले यह दिखाया गया है कि इससे फ़ेज लाइब्रेरी की विविधता कम हो सकती है12,13। इसलिए, हमने एंडोटॉक्सिन को हटाकर प्लेट-प्रवर्धित फ़ेज लाइब्रेरी का अनुक्रमण किया और AA की आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए इसकी तुलना मूल लाइब्रेरी से की। मूल पूल और प्रवर्धित एवं शुद्ध पूल के बीच एक मजबूत सहसंबंध (r = 0.995) देखा गया (पूरक चित्र 2d), जो दर्शाता है कि T7 फ़ेज का उपयोग करके प्लेटों पर प्रवर्धित क्लोनों के बीच प्रतिस्पर्धा से कोई बड़ा पूर्वाग्रह उत्पन्न नहीं हुआ। यह तुलना प्रत्येक लाइब्रेरी में ट्राइपेप्टाइड मोटिफ की आवृत्ति पर आधारित है, क्योंकि लाइब्रेरी की विविधता (~109) को एचटीएस से भी पूरी तरह से नहीं समझा जा सकता है। प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड के आवृत्ति विश्लेषण से दर्ज किए गए रिपर्टरी की अंतिम तीन स्थितियों में एक छोटा स्थिति-निर्भर पूर्वाग्रह सामने आया (पूरक चित्र 2e)। निष्कर्षतः, हमने पाया कि लाइब्रेरी की गुणवत्ता और विविधता स्वीकार्य थी और चयन के कई दौरों के बीच फाज लाइब्रेरी के प्रवर्धन और तैयारी के कारण विविधता में केवल मामूली परिवर्तन देखे गए।
सचेत चूहों के मस्तिष्क की रीढ़ की हड्डी (सीएम) में शल्य चिकित्सा द्वारा कैनुला प्रत्यारोपित करके क्रमिक मस्तिष्क की रीढ़ की हड्डी के द्रव के नमूने लिए जा सकते हैं, जिससे रक्त-ऊष्मायन (बीबीबी) और/या बीसीएसएफबी (चित्र 1ए-बी) के माध्यम से अंतःशिरा (iv) द्वारा इंजेक्ट किए गए टी7 फेज की पहचान में आसानी होती है। हमने इन विवो चयन के पहले तीन चरणों में दो स्वतंत्र चयन शाखाओं (आर्म ए और बी) का उपयोग किया (चित्र 1सी)। हमने चयन के पहले तीन चरणों में डाले गए फेज की कुल मात्रा को कम करके चयन की कठोरता को धीरे-धीरे बढ़ाया। पैनिंग के चौथे चरण के लिए, हमने शाखा ए और बी से नमूनों को मिलाकर तीन अतिरिक्त स्वतंत्र चयन किए। इस मॉडल में टी7 फेज कणों के इन विवो गुणों का अध्ययन करने के लिए, जंगली प्रकार के फेज (पीएजीआईएसआरईएलवीडीकेएल मास्टर इंसर्ट) को चूहों में पूंछ की नस के माध्यम से इंजेक्ट किया गया। विभिन्न समय बिंदुओं पर मस्तिष्क की रीढ़ की हड्डी के द्रव और रक्त से फेज की पुनर्प्राप्ति से पता चला कि अपेक्षाकृत छोटे टी7 आइकोसाहेड्रल फेज में रक्त डिब्बे से तेजी से प्रारंभिक निकासी चरण होता है (पूरक चित्र 3)। प्रशासित टाइटर्स और चूहों के रक्त की मात्रा के आधार पर, हमने गणना की कि अंतःशिरा इंजेक्शन के 10 मिनट बाद रक्त में प्रशासित खुराक का लगभग 1% भार फ़ेज ही पाया गया। इस प्रारंभिक तीव्र गिरावट के बाद, 27.7 मिनट के अर्ध-जीवन के साथ एक धीमी प्राथमिक निकासी मापी गई। महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएसएफ कम्पार्टमेंट से बहुत कम फ़ेज प्राप्त हुए, जो सीएसएफ कम्पार्टमेंट में वाइल्ड-टाइप फ़ेज माइग्रेशन के लिए कम पृष्ठभूमि का संकेत देता है (पूरक चित्र 3)। औसतन, संपूर्ण नमूना अवधि (0-250 मिनट) के दौरान रक्त में T7 फ़ेज के लगभग 1 x 10⁻³% टाइटर्स और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में प्रारंभ में डाले गए फ़ेज के 4 x 10⁻⁸% ही पाए गए। उल्लेखनीय रूप से, मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में वाइल्ड-टाइप फ़ेज का अर्ध-जीवन (25.7 मिनट) रक्त में देखे गए अर्ध-जीवन के समान था। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि सीएम-कैनुलेटेड चूहों में रक्त से सीएसएफ कम्पार्टमेंट को अलग करने वाली बाधा बरकरार रहती है, जिससे रक्त से सीएसएफ कम्पार्टमेंट में आसानी से स्थानांतरित होने वाले क्लोन की पहचान करने के लिए फाज लाइब्रेरी का इन विवो चयन संभव हो पाता है।
(a) एक बड़े पूल से सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (CSF) के पुनः नमूने लेने की विधि स्थापित करना। (b) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) अवरोध की कोशिकीय स्थिति और रक्त-मस्तिष्क अवरोध (BBB) ​​को पार करने वाले पेप्टाइड की पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली चयन रणनीति को दर्शाने वाला आरेख। (c) इन विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ्लोचार्ट। चयन के प्रत्येक दौर में, फेज (तीरों के भीतर पशु पहचानकर्ता) को अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया। चयन के चौथे दौर तक दो स्वतंत्र वैकल्पिक शाखाओं (A, B) को अलग-अलग रखा गया। चयन के तीसरे और चौथे दौर के लिए, CSF से निकाले गए प्रत्येक फेज क्लोन का मैन्युअल रूप से अनुक्रमण किया गया। (d) T7 पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 10¹² फेज/पशु) के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद दो कैनुलेटेड चूहों में चयन के पहले दौर के दौरान रक्त (लाल वृत्त) और सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (हरे त्रिकोण) से पृथक किए गए फेज की गतिकी। नीले वर्ग रक्त में फेज की औसत प्रारंभिक सांद्रता को दर्शाते हैं, जिसकी गणना इंजेक्ट किए गए फेज की मात्रा से, कुल रक्त की मात्रा को ध्यान में रखते हुए की गई है। काले वर्ग रक्त फेज सांद्रता से एक्सट्रपलेटेड y रेखा के प्रतिच्छेदन बिंदु को दर्शाते हैं। (e,f) पेप्टाइड में पाए जाने वाले सभी संभावित ओवरलैपिंग ट्राइपेप्टाइड मोटिफ की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण को दर्शाते हैं। 1000 रीडिंग में पाए गए मोटिफ की संख्या दिखाई गई है। महत्वपूर्ण रूप से (p < 0.001) समृद्ध मोटिफ को लाल बिंदुओं से चिह्नित किया गया है। (e) इंजेक्ट की गई लाइब्रेरी के ट्राइपेप्टाइड मोटिफ की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना पशु #1.1 और #1.2 से प्राप्त रक्त-व्युत्पन्न फेज से करने वाला सहसंबंध स्कैटरप्लॉट। (f) रक्त और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में पृथक किए गए पशु फेज ट्राइपेप्टाइड मोटिफ #1.1 और #1.2 की सापेक्ष आवृत्तियों की तुलना करने वाला सहसंबंध स्कैटरप्लॉट। (g, h) रक्त में समृद्ध फ़ेज (g) बनाम इंजेक्टेड लाइब्रेरी और सीएसएफ (h) में समृद्ध फ़ेज बनाम रक्त का अनुक्रम आईडी निरूपण, दोनों जानवरों में इन विवो चयन के एक दौर के बाद। एक-अक्षर कोड का आकार दर्शाता है कि उस स्थिति में वह अमीनो अम्ल कितनी बार आता है। हरा = ध्रुवीय, बैंगनी = उदासीन, नीला = क्षारीय, लाल = अम्लीय और काला = जल-विरोधी अमीनो अम्ल। चित्र 1a, b को एडुआर्ड यूरिच द्वारा डिज़ाइन और निर्मित किया गया था।
हमने दो सीएम इंस्ट्रूमेंट चूहों (क्लैड ए और बी) में एक फ़ेज पेप्टाइड लाइब्रेरी इंजेक्ट की और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव और रक्त से फ़ेज को अलग किया (चित्र 1डी)। वाइल्ड-टाइप फ़ेज की तुलना में लाइब्रेरी का प्रारंभिक तीव्र क्लीयरेंस कम स्पष्ट था। दोनों जानवरों में इंजेक्ट की गई लाइब्रेरी का औसत अर्ध-जीवन रक्त में 24.8 मिनट था, जो वाइल्ड-टाइप फ़ेज के समान था, और सीएसएफ में 38.5 मिनट था। प्रत्येक जानवर से रक्त और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव फ़ेज के नमूनों को एचटीएस के अधीन किया गया और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स का विश्लेषण एक छोटे ट्राइपेप्टाइड मोटिफ की उपस्थिति के लिए किया गया। ट्राइपेप्टाइड मोटिफ को इसलिए चुना गया क्योंकि वे संरचना निर्माण और पेप्टाइड-प्रोटीन अंतःक्रियाओं के लिए एक न्यूनतम आधार प्रदान करते हैं14,15। हमने इंजेक्ट की गई फ़ेज लाइब्रेरी और दोनों जानवरों के रक्त से निकाले गए क्लोनों के बीच मोटिफ के वितरण में एक अच्छा सहसंबंध पाया (चित्र 1ई)। डेटा इंगित करता है कि लाइब्रेरी की संरचना रक्त डिब्बे में केवल मामूली रूप से समृद्ध है। वेबलोगो16 सॉफ़्टवेयर के एक अनुकूलित संस्करण का उपयोग करके प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड आवृत्तियों और सर्वसम्मति अनुक्रमों का आगे विश्लेषण किया गया। दिलचस्प बात यह है कि हमने रक्त ग्लाइसिन अवशेषों में एक मजबूत संवर्धन पाया (चित्र 1g)। जब रक्त की तुलना सीएसएफ से चयनित क्लोनों से की गई, तो रूपांकनों का मजबूत चयन और कुछ अचयन देखा गया (चित्र 1f), और कुछ अमीनो एसिड 12-सदस्यीय संरचना में पूर्वनिर्धारित स्थितियों पर अधिमानतः मौजूद थे (चित्र 1h)। विशेष रूप से, अलग-अलग जानवरों के मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में काफी अंतर था, जबकि दोनों जानवरों में रक्त ग्लाइसिन संवर्धन देखा गया (पूरक चित्र 4a-j)। जानवर #1.1 और #1.2 के मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में अनुक्रम डेटा के कठोर फ़िल्टरिंग के बाद, कुल 964 और 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइड प्राप्त हुए (पूरक चित्र 1d-e)। पृथक किए गए फ़ेज क्लोनों को प्रवर्धित किया गया और इन विवो चयन के दूसरे दौर के अधीन किया गया। दूसरे दौर के चयन से निकाले गए फ़ेज को प्रत्येक जानवर में एचटीएस के अधीन किया गया और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स का उपयोग ट्राइपेप्टाइड मोटिफ्स की उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक मोटिफ पहचान प्रोग्राम में इनपुट के रूप में किया गया (चित्र 2a, b, ef)। सीएसएफ से प्राप्त फ़ेज के पहले चक्र की तुलना में, हमने शाखा A और B में सीएसएफ में कई मोटिफ्स के आगे चयन और अचयन को देखा (चित्र 2)। यह निर्धारित करने के लिए एक नेटवर्क पहचान एल्गोरिदम लागू किया गया कि क्या वे सुसंगत अनुक्रम के विभिन्न पैटर्न का प्रतिनिधित्व करते हैं। वैकल्पिक क्लेड A (चित्र 2c, d) और क्लेड B (चित्र 2g, h) में सीएसएफ द्वारा प्राप्त 12-आयामी अनुक्रमों के बीच स्पष्ट समानता देखी गई। प्रत्येक शाखा में पूल्ड विश्लेषण ने 12-मेर पेप्टाइड्स के लिए अलग-अलग चयन प्रोफाइल (पूरक चित्र 5c,d) और चयन के पहले दौर की तुलना में चयन के दूसरे दौर के बाद पूल्ड क्लोन के लिए समय के साथ सीएसएफ/रक्त टाइटर अनुपात में वृद्धि का खुलासा किया (पूरक चित्र 5e)।
दो क्रमिक इन विवो कार्यात्मक फाज डिस्प्ले चयन के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में रूपांकनों और पेप्टाइडों का संवर्धन।
प्रत्येक जानवर (जानवर #1.1 और #1.2) के पहले दौर से प्राप्त सभी सेरेब्रोस्पाइनल द्रव फ़ेजों को एकत्रित किया गया, प्रवर्धित किया गया, एचटी-अनुक्रमित किया गया और 2 एसएम कैनुलेटेड चूहों (#1.1 → #2.1 और 2.2, 1.2 → 2.3 और 2.4) में एक साथ पुनः इंजेक्ट किया गया (2 x 10¹⁰ फ़ेज/जानवर)। (a,b,e,f) पहले और दूसरे चयन दौर में सभी सीएसएफ-व्युत्पन्न फ़ेजों के ट्राइपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने वाले सहसंबंध प्रकीर्णक प्लॉट। दोनों अभिविन्यासों में पेप्टाइड में पाए जाने वाले सभी संभावित अतिव्यापी ट्राइपेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करने वाले रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण। 1000 रीडिंग में पाए गए रूपांकनों की संख्या दर्शाई गई है। तुलना की गई पुस्तकालयों में से किसी एक में महत्वपूर्ण रूप से (p < 0.001) चयनित या बहिष्कृत किए गए रूपांकनों को लाल बिंदुओं से हाइलाइट किया गया है। (c, d, g, h) इन विवो चयन के दूसरे और पहले चरण के आधार पर सभी सीएसएफ-समृद्ध 12 अमीनो एसिड लंबे अनुक्रमों का अनुक्रम लोगो निरूपण। एक-अक्षर कोड का आकार दर्शाता है कि उस स्थिति में वह अमीनो एसिड कितनी बार पाया जाता है। लोगो को दर्शाने के लिए, दो चयन चरणों के बीच अलग-अलग जानवरों से निकाले गए सीएसएफ अनुक्रमों की आवृत्ति की तुलना की जाती है और दूसरे चरण में समृद्ध अनुक्रमों को दर्शाया जाता है: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 और (h) #1.2–#2.4। (c, d) जानवरों संख्या 2.1 और 2.2 या (g, h) जानवरों संख्या 2.3 और 2.4 में किसी दी गई स्थिति में सबसे समृद्ध अमीनो एसिड को रंग में दर्शाया गया है। हरा = ध्रुवीय, बैंगनी = उदासीन, नीला = क्षारीय, लाल = अम्लीय और काला = जल-विरोधी अमीनो एसिड।
चयन के तीसरे दौर के बाद, हमने दो जानवरों से पृथक किए गए 332 सीएसएफ-पुनर्गठित फ़ेज क्लोनों में से 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (#3.1 और #3.2) की पहचान की (पूरक चित्र 6a)। अनुक्रम LGSVS (18.7%) का सापेक्षिक अनुपात सबसे अधिक था, इसके बाद वाइल्ड-टाइप इंसर्ट PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), और SARGSWREIVSLS (2.2%) थे। अंतिम चौथे दौर में, हमने तीन अलग-अलग जानवरों से स्वतंत्र रूप से चयनित दो शाखाओं को एक साथ मिलाया (चित्र 1c)। सीएसएफ से प्राप्त 925 अनुक्रमित फ़ेज क्लोनों में से, चौथे दौर में हमें 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम मिले (पूरक चित्र 6b), जिनमें वाइल्ड-टाइप फ़ेज का सापेक्षिक अनुपात घटकर 0.8% हो गया। चौथे दौर में सबसे आम CSF क्लोन LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) और RLSSVDSDLSGC (3.2%) थे। चयनित पेप्टाइडों की लंबाई में अंतर NNK लाइब्रेरी डिज़ाइन के लिए डिजेनरेट कोडन का उपयोग करते समय लाइब्रेरी प्राइमर में न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन/विलोपन या अपरिपक्व स्टॉप कोडन के कारण होता है। अपरिपक्व स्टॉप कोडन छोटे पेप्टाइड उत्पन्न करते हैं और इन्हें इसलिए चुना जाता है क्योंकि इनमें अनुकूल अमीनो एसिड मोटिफ होता है। लंबे पेप्टाइड सिंथेटिक लाइब्रेरी के प्राइमर में सम्मिलन/विलोपन के कारण हो सकते हैं। यह डिज़ाइन किए गए स्टॉप कोडन को फ्रेम के बाहर रखता है और तब तक पढ़ता है जब तक कि नीचे की ओर एक नया स्टॉप कोडन दिखाई नहीं देता। सामान्य तौर पर, हमने इनपुट डेटा की तुलना नमूना आउटपुट डेटा से करके सभी चार चयन दौरों के लिए संवर्धन कारकों की गणना की। स्क्रीनिंग के पहले दौर के लिए, हमने गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संदर्भ के रूप में वाइल्ड-टाइप फ़ेज टाइटर्स का उपयोग किया। दिलचस्प बात यह है कि पहले सीएसएफ चक्र में नकारात्मक फ़ेज चयन बहुत मजबूत था, लेकिन रक्त में नहीं (चित्र 3a), जिसका कारण पेप्टाइड लाइब्रेरी के अधिकांश सदस्यों के सीएसएफ कम्पार्टमेंट में निष्क्रिय प्रसार की कम संभावना या बैक्टीरियोफ़ेज की तुलना में सापेक्ष फ़ेजों का रक्तप्रवाह से अधिक कुशलता से बनाए रखा जाना या हटाया जाना हो सकता है। हालांकि, पैनिंग के दूसरे दौर में, दोनों क्लेड्स में सीएसएफ में फ़ेजों का मजबूत चयन देखा गया, जिससे पता चलता है कि पिछला दौर उन फ़ेजों से समृद्ध था जो सीएसएफ अवशोषण को बढ़ावा देने वाले पेप्टाइड प्रदर्शित करते हैं (चित्र 3a)। फिर से, रक्त में कोई महत्वपूर्ण संवर्धन नहीं हुआ। तीसरे और चौथे दौर में भी, फ़ेज क्लोन सीएसएफ में काफी समृद्ध थे। चयन के अंतिम दो दौरों के बीच प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने पर, हमने पाया कि चयन के चौथे दौर में अनुक्रम और भी अधिक समृद्ध थे (चित्र 3b)। दोनों पेप्टाइड अभिविन्यासों का उपयोग करके सभी 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमों से कुल 931 ट्राइपेप्टाइड रूपांकन निकाले गए। चौथे दौर में सबसे समृद्ध रूपांकनों की सभी दौरों में संवर्धन प्रोफाइल की तुलना इंजेक्टेड लाइब्रेरी (कट-ऑफ: 10% संवर्धन) से अधिक बारीकी से की गई (पूरक चित्र 6c)। चयन के सामान्य पैटर्न से पता चला कि अध्ययन किए गए अधिकांश रूपांकन दोनों चयन शाखाओं के सभी पिछले दौरों में समृद्ध थे। हालांकि, कुछ रूपांकन (जैसे SGL, VSG, LGS GSV) मुख्य रूप से वैकल्पिक क्लेड A से थे, जबकि अन्य (जैसे FGW, RTN, WGF, NTR) वैकल्पिक क्लेड B में समृद्ध थे।
सीएसएफ-समृद्ध फाज-प्रदर्शित पेप्टाइड और स्ट्रेप्टाविडिन पेलोड से जुड़े बायोटिनिलेटेड लीडर पेप्टाइड के सीएसएफ परिवहन का सत्यापन।
(a) सभी चार चरणों (R1-R4) में इंजेक्ट किए गए (इनपुट = I) फ़ेज (PFU) टाइटर्स और निर्धारित CSF फ़ेज टाइटर्स (आउटपुट = O) के आधार पर संवर्धन अनुपात की गणना की गई। अंतिम तीन चरणों (R2-R4) के लिए संवर्धन कारकों की गणना पिछले चरण और पहले चरण (R1) के भार डेटा से तुलना करके की गई। खुले बार सेरेब्रोस्पाइनल द्रव को दर्शाते हैं, छायांकित बार प्लाज्मा को। (***p<0.001, स्टूडेंट के t-परीक्षण पर आधारित)। (b) चयन के चौथे चरण के बाद CSF में एकत्रित सभी फ़ेजों के सापेक्ष अनुपात के अनुसार क्रमबद्ध, सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले फ़ेज पेप्टाइड्स की सूची। छह सबसे सामान्य फ़ेज क्लोन को रंग में हाइलाइट किया गया है, क्रमांकित किया गया है और चयन के तीसरे और चौथे चरण के बीच उनके संवर्धन कारक (इनसेट) दर्शाए गए हैं। (c,d) चौथे चरण से छह सबसे समृद्ध फ़ेज क्लोन, खाली फ़ेज और पैतृक फ़ेज पेप्टाइड पुस्तकालयों का CSF नमूनाकरण मॉडल में व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया। निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर सीएसएफ और रक्त के नमूने एकत्र किए गए। (c) 6 संभावित फ़ेज क्लोन (2 x 10¹⁰ फ़ेज/पशु), खाली फ़ेज (#1779) (2 x 10¹⁰ फ़ेज/पशु) और स्टॉक फ़ेज पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 10¹² फ़ेज/पशु) की समान मात्रा को कम से कम 3 सीएम की मात्रा में कैनुलेटेड पशु को पूंछ की नस के माध्यम से अलग-अलग इंजेक्ट किया गया। समय के साथ प्रत्येक इंजेक्ट किए गए फ़ेज क्लोन और फ़ेज पेप्टाइड लाइब्रेरी के सीएसएफ फार्माकोकाइनेटिक्स को दर्शाया गया है। (d) नमूना लेने के समय के दौरान सभी प्राप्त फ़ेज/एमएल के लिए औसत सीएसएफ/रक्त अनुपात दर्शाता है। (e) चार सिंथेटिक लीडर पेप्टाइड और एक स्क्रैम्बल्ड कंट्रोल को उनके एन-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) के माध्यम से बायोटिन द्वारा स्ट्रेप्टाविडिन से जोड़ा गया, जिसके बाद इंजेक्शन (पूंछ की नस में iv, 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन/किग्रा) दिया गया। कम से कम तीन इंट्यूबेटेड चूहों (N = 3) का उपयोग किया गया। निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर सीएसएफ के नमूने एकत्र किए गए और सीएसएफ एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एलिसा द्वारा स्ट्रेप्टाविडिन सांद्रता को मापा गया (एनडी = पता नहीं चला)। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, एनोवा परीक्षण पर आधारित)। (f) चयन के चौथे दौर से चयनित अन्य फेज पेप्टाइड क्लोनों के साथ सबसे समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (बैंगनी) के अमीनो एसिड अनुक्रम की तुलना। समान और समरूप अमीनो एसिड खंडों को रंग-कोडित किया गया है।
चौथे दौर में संवर्धित सभी फ़ेजों में से (चित्र 3b), सीएसएफ नमूनाकरण मॉडल में आगे के व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए छह संभावित क्लोनों का चयन किया गया। छह संभावित फ़ेज, खाली फ़ेज (बिना इंसर्ट के) और प्रोफ़ेज पेप्टाइड लाइब्रेरी की समान मात्रा को तीन कैनुलेटेड सीएम जानवरों में इंजेक्ट किया गया, और सीएसएफ (चित्र 3c) और रक्त (पूरक चित्र 7) परीक्षणों में फार्माकोकाइनेटिक्स का निर्धारण किया गया। परीक्षण किए गए सभी फ़ेज क्लोनों ने खाली नियंत्रण फ़ेज (#1779) की तुलना में 10-1000 गुना अधिक स्तर पर सीएसएफ कम्पार्टमेंट को लक्षित किया। उदाहरण के लिए, क्लोन #2020 और #2077 में नियंत्रण फ़ेज की तुलना में लगभग 1000 गुना अधिक सीएसएफ टाइटर थे। प्रत्येक चयनित पेप्टाइड का फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल अलग-अलग है, लेकिन उन सभी में उच्च सीएसएफ होमिंग क्षमता है। क्लोन #1903 और #2011 में समय के साथ लगातार कमी देखी गई, जबकि क्लोन #2077, #2002 और #2009 में पहले 10 मिनट के दौरान वृद्धि सक्रिय परिवहन का संकेत दे सकती है, लेकिन इसकी पुष्टि की जानी आवश्यक है। क्लोन #2020, #2002 और #2077 उच्च स्तर पर स्थिर हो गए, जबकि क्लोन #2009 की सीएसएफ सांद्रता प्रारंभिक वृद्धि के बाद धीरे-धीरे कम हो गई। इसके बाद हमने प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना उसकी रक्त सांद्रता से की (चित्र 3डी)। सभी नमूना लेने के समय पर प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार के औसत टाइटर और उसके रक्त टाइटर के सहसंबंध से पता चला कि छह उम्मीदवारों में से तीन रक्त सीएसएफ में काफी समृद्ध थे। दिलचस्प बात यह है कि क्लोन #2077 ने उच्च रक्त स्थिरता दिखाई (पूरक चित्र 7)। यह पुष्टि करने के लिए कि पेप्टाइड स्वयं फेज कणों के अलावा अन्य कार्गो को सीएसएफ डिब्बे में सक्रिय रूप से परिवहन करने में सक्षम हैं, हमने चार लीडर पेप्टाइड संश्लेषित किए, जिन्हें एन-टर्मिनस पर बायोटिन के साथ व्युत्पन्न किया गया था, जहां पेप्टाइड फेज कण से जुड़ते हैं। बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्स (संख्या 2002, 2009, 2020 और 2077) को स्ट्रेप्टाविडिन (SA) के साथ संयुग्मित करके बहुमरिक रूप प्राप्त किए गए जो कुछ हद तक फेज ज्यामिति की नकल करते हैं। इस प्रारूप ने हमें रक्त और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में कार्गो-परिवहन प्रोटीन पेप्टाइड्स के रूप में SA के प्रभाव को मापने की अनुमति भी दी। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब सिंथेटिक पेप्टाइड्स को इस SA-संयुग्मित प्रारूप में प्रशासित किया गया तो फेज डेटा को अक्सर पुन: प्रस्तुत किया जा सकता था (चित्र 3e)। स्क्रैम्बल्ड पेप्टाइड्स का प्रारंभिक प्रभाव कम था और CSF से तेजी से निकासी हुई, जिसके परिणामस्वरूप 48 घंटों के भीतर उनका स्तर पता नहीं चल सका। इन पेप्टाइड फेज क्लोनों के CSF क्षेत्र में वितरण मार्गों की जानकारी प्राप्त करने के लिए, हमने अंतःशिरा इंजेक्शन के 1 घंटे बाद इन विवो में फेज कणों का सीधे पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) का उपयोग करके व्यक्तिगत फेज पेप्टाइड हिट्स के स्थानीयकरण का विश्लेषण किया। विशेष रूप से, क्लोन #2002, #2077 और #2009 को मस्तिष्क की केशिकाओं में तीव्र रंगाई द्वारा पहचाना जा सकता था, जबकि नियंत्रण फ़ेज (#1779) और क्लोन #2020 का पता नहीं चला (पूरक चित्र 8)। इससे पता चलता है कि ये पेप्टाइड रक्त वाहिनी (बीबीबी) को पार करके मस्तिष्क पर प्रभाव डालते हैं। इस परिकल्पना की पुष्टि के लिए आगे विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता है, क्योंकि इसमें बीएससीएफबी मार्ग भी शामिल हो सकता है। सबसे समृद्ध क्लोन (#2002) के अमीनो अम्ल अनुक्रम की तुलना अन्य चयनित पेप्टाइडों से करने पर, यह पाया गया कि उनमें से कुछ में समान अमीनो अम्ल विस्तार हैं, जो एक समान परिवहन तंत्र का संकेत दे सकते हैं (चित्र 3f)।
अपने अद्वितीय प्लाज्मा प्रोफाइल और समय के साथ सीएसएफ में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण, फ़ेज डिस्प्ले क्लोन #2077 का 48 घंटे की लंबी अवधि में आगे अध्ययन किया गया और यह निरंतर एसए स्तरों के साथ देखे गए सीएसएफ में तीव्र वृद्धि को पुन: उत्पन्न करने में सक्षम था (चित्र 4ए)। अन्य पहचाने गए फ़ेज क्लोनों के संबंध में, #2077 ने मस्तिष्क केशिकाओं के लिए मजबूत रंगाई दिखाई और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखने पर केशिका मार्कर लेक्टिन के साथ महत्वपूर्ण सह-स्थानीकरण दिखाया और संभवतः पैरेन्काइमल स्पेस में भी कुछ रंगाई दिखाई (चित्र 4बी)। यह जांचने के लिए कि क्या सीएनएस में पेप्टाइड-मध्यस्थता वाले औषधीय प्रभाव प्राप्त किए जा सकते हैं, हमने एक प्रयोग किया जिसमें i) #2077 ट्रांजिट पेप्टाइड और ii) BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के बायोटिनिलेटेड संस्करणों को दो अलग-अलग अनुपातों में एसए के साथ मिलाया गया। एक संयोजन के लिए हमने केवल BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग किया और दूसरे के लिए हमने BACE1 पेप्टाइड अवरोधक और #2077 पेप्टाइड का 1:3 अनुपात उपयोग किया। दोनों नमूनों को अंतःशिरा द्वारा दिया गया और समय के साथ बीटा-एमाइलॉइड पेप्टाइड 40 (एबीटा40) के रक्त और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव के स्तर को मापा गया। मस्तिष्क के पैरेन्काइमा में BACE1 अवरोध को दर्शाने के लिए सीएसएफ में एबीटा40 को मापा गया। उम्मीद के मुताबिक, दोनों कॉम्प्लेक्स ने एबीटा40 के रक्त स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 4सी, डी)। हालांकि, केवल पेप्टाइड संख्या 2077 और SA से जुड़े BACE1 पेप्टाइड के अवरोधक के मिश्रण वाले नमूनों ने मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में एबीटा40 में महत्वपूर्ण कमी की (चित्र 4सी)। डेटा से पता चलता है कि पेप्टाइड संख्या 2077 60 kDa SA प्रोटीन को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ले जाने में सक्षम है और BACE1 पेप्टाइड के SA-संयुग्मित अवरोधकों के साथ औषधीय प्रभाव भी उत्पन्न करता है।
(a) कम से कम तीन सीएम-इंट्यूबेटेड चूहों में सीएसएफ पेप्टाइड #2077 (RLSSVDSDLSGC) और अनइंजेक्टेड कंट्रोल फेज (#1779) के दीर्घकालिक फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल को दर्शाने वाले T7 फेज का क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेज/पशु)। (b) फेज-इंजेक्टेड चूहों (2 × 10 फेज/पशु) में प्रतिनिधि कॉर्टिकल माइक्रोवेसल्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवि, जो पेप्टाइड #2077 और वेसल्स (लेक्टिन) की काउंटरस्टेनिंग को दर्शाती है। इन फेज क्लोनों को 3 चूहों को दिया गया और परफ्यूजन से पहले 1 घंटे तक परिसंचरण के लिए छोड़ दिया गया। मस्तिष्क के सेक्शन लिए गए और T7 फेज कैप्सिड के विरुद्ध पॉलीक्लोनल FITC-लेबल वाले एंटीबॉडी से रंगे गए। परफ्यूजन और बाद में फिक्सेशन से 10 मिनट पहले, DyLight594-लेबल वाले लेक्टिन को अंतःशिरा द्वारा दिया गया। सूक्ष्म वाहिकाओं के भीतरी भाग में लेक्टिन स्टेनिंग (लाल) और केशिकाओं तथा परिधीय मस्तिष्क ऊतक के भीतरी भाग में फ़ेज (हरा) दर्शाने वाली फ्लोरोसेंट छवियां। स्केल बार 10 µm के बराबर है। (c, d) बायोटिनिलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड को अकेले या बायोटिनिलेटेड ट्रांजिट पेप्टाइड #2077 के साथ मिलाकर स्ट्रेप्टाविडिन से जोड़ा गया और फिर कम से कम तीन कैनुलेटेड CM चूहों को अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा 10 mg स्ट्रेप्टाविडिन/kg दिया गया। BACE1 पेप्टाइड अवरोधक द्वारा Aβ40 में कमी को निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर रक्त (लाल) और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव (नारंगी) में Aβ1-40 ELISA द्वारा मापा गया। बेहतर स्पष्टता के लिए, ग्राफ पर 100% के पैमाने पर एक बिंदीदार रेखा खींची गई है। (c) स्ट्रेप्टाविडिन को ट्रांजिट पेप्टाइड #2077 और BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के साथ 3:1 अनुपात में मिलाकर उपचारित चूहों के रक्त (लाल त्रिकोण) और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव (नारंगी त्रिकोण) में Aβ40 में प्रतिशत कमी। (d) केवल BACE1 अवरोधक पेप्टाइड से जुड़े स्ट्रेप्टाविडिन से उपचारित चूहों के रक्त Aβ40 (लाल वृत्त) और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव (नारंगी वृत्त) में प्रतिशत कमी। नियंत्रण समूह में Aβ की सांद्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) थी।
फ़ेज डिस्प्ले को जैवचिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है17। इस विधि का उपयोग इन विवो संवहनी विविधता अध्ययनों18,19 के साथ-साथ मस्तिष्क वाहिकाओं को लक्षित करने वाले अध्ययनों20,21,22,23,24,25,26 में भी किया गया है। इस अध्ययन में, हमने इस चयन विधि के अनुप्रयोग को न केवल मस्तिष्क वाहिकाओं को लक्षित करने वाले पेप्टाइड्स की प्रत्यक्ष पहचान तक विस्तारित किया, बल्कि रक्त-मस्तिष्क अवरोध को पार करने के लिए सक्रिय परिवहन गुणों वाले उम्मीदवारों की खोज तक भी विस्तारित किया। अब हम सीएम इंट्यूबेटेड चूहों में एक इन विवो चयन प्रक्रिया के विकास का वर्णन करते हैं और सीएसएफ होमिंग गुणों वाले पेप्टाइड्स की पहचान करने की इसकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। 12-मर यादृच्छिक पेप्टाइड्स की लाइब्रेरी प्रदर्शित करने वाले टी7 फ़ेज का उपयोग करते हुए, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि टी7 फ़ेज रक्त-मस्तिष्क अवरोध के अनुकूल होने के लिए पर्याप्त छोटा (लगभग 60 एनएम व्यास का)10 है, जिससे यह सीधे रक्त-मस्तिष्क अवरोध या कोरॉइड प्लेक्सस को पार कर सकता है। हमने पाया कि कैनुलेटेड सीएम चूहों से सीएसएफ निकालना एक सुव्यवस्थित इन विवो कार्यात्मक स्क्रीनिंग विधि थी, और निकाले गए फ़ेज न केवल रक्त वाहिकाओं से बंधते थे बल्कि रक्त-मस्तिष्क अवरोध के पार एक ट्रांसपोर्टर के रूप में भी कार्य करते थे। इसके अलावा, रक्त को एक साथ एकत्र करके और सीएसएफ तथा रक्त-व्युत्पन्न फ़ेजों पर एचटीएस लागू करके, हमने पुष्टि की कि सीएसएफ का हमारा चयन रक्त संवर्धन या चयन के दौरों के बीच विस्तार की क्षमता से प्रभावित नहीं था। हालांकि, रक्त कम्पार्टमेंट चयन प्रक्रिया का एक हिस्सा है, क्योंकि सीएसएफ कम्पार्टमेंट तक पहुंचने में सक्षम फ़ेजों को मस्तिष्क में खुद को समृद्ध करने के लिए रक्तप्रवाह में पर्याप्त समय तक जीवित रहना और परिसंचरण करना आवश्यक है। कच्चे एचटीएस डेटा से विश्वसनीय अनुक्रम जानकारी निकालने के लिए, हमने विश्लेषण कार्यप्रवाह में प्लेटफ़ॉर्म-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटियों के अनुकूल फ़िल्टर लागू किए। स्क्रीनिंग विधि में गतिज मापदंडों को शामिल करके, हमने रक्त में वाइल्ड-टाइप T7 फ़ेज (t½ ~ 28 मिनट) की तीव्र फार्माकोकाइनेटिक्स की पुष्टि की24, 27, 28 और मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव (CSF) में उनकी अर्ध-आयु (t½ ~ 26 मिनट प्रति मिनट) भी निर्धारित की। रक्त और CSF में समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल के बावजूद, फ़ेज की रक्त सांद्रता का केवल 0.001% ही CSF में पाया जा सका, जो रक्त-मस्तिष्क अवरोध के पार वाइल्ड-टाइप T7 फ़ेज की कम पृष्ठभूमि गतिशीलता को दर्शाता है। यह कार्य इन विवो पैनिंग रणनीतियों का उपयोग करते समय चयन के पहले दौर के महत्व को उजागर करता है, विशेष रूप से उन फ़ेज प्रणालियों के लिए जो परिसंचरण से तेजी से साफ हो जाती हैं, क्योंकि कुछ ही क्लोन CNS डिब्बे तक पहुँचने में सक्षम होते हैं। इस प्रकार, पहले दौर में, लाइब्रेरी विविधता में बहुत अधिक कमी आई, क्योंकि इस बहुत ही सख्त CSF मॉडल में अंततः केवल सीमित संख्या में क्लोन ही एकत्र किए गए। इस इन विवो पैनिंग रणनीति में कई चयन चरण शामिल थे, जैसे कि सीएसएफ कम्पार्टमेंट में सक्रिय संचय, रक्त कम्पार्टमेंट में क्लोन का जीवित रहना, और पहले 10 मिनट के भीतर रक्त से टी7 फेज क्लोन को तेजी से हटाना (चित्र 1डी और पूरक चित्र 4एम)। इस प्रकार, पहले दौर के बाद, सीएसएफ में विभिन्न फेज क्लोन की पहचान की गई, हालांकि प्रत्येक जानवर के लिए एक ही प्रारंभिक पूल का उपयोग किया गया था। इससे पता चलता है कि बड़ी संख्या में लाइब्रेरी सदस्यों वाली स्रोत लाइब्रेरी के लिए कई कठोर चयन चरणों के परिणामस्वरूप विविधता में काफी कमी आती है। इसलिए, यादृच्छिक घटनाएं प्रारंभिक चयन प्रक्रिया का एक अभिन्न अंग बन जाएंगी, जो परिणाम को बहुत प्रभावित करेंगी। यह संभव है कि मूल लाइब्रेरी में कई क्लोनों में सीएसएफ संवर्धन की प्रवृत्ति बहुत समान रही हो। हालांकि, समान प्रायोगिक परिस्थितियों में भी, प्रारंभिक पूल में प्रत्येक विशेष क्लोन की कम संख्या के कारण चयन परिणाम भिन्न हो सकते हैं।
सीएसएफ में पाए जाने वाले रूपांकन रक्त में पाए जाने वाले रूपांकनों से भिन्न होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हमने अलग-अलग जानवरों के रक्त में ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड की ओर पहला बदलाव देखा (चित्र 1जी, पूरक चित्र 4ई, 4एफ)। ग्लाइसिन पेप्टाइड युक्त फ़ेज अधिक स्थिर हो सकते हैं और उनके परिसंचरण से बाहर निकलने की संभावना कम होती है। हालांकि, ये ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव के नमूनों में नहीं पाए गए, जिससे पता चलता है कि क्यूरेटेड लाइब्रेरी दो अलग-अलग चयन चरणों से गुज़री: एक रक्त में और दूसरा मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी के द्रव में जमा होने दिया गया। चयन के चौथे दौर से प्राप्त सीएसएफ-समृद्ध क्लोनों का व्यापक परीक्षण किया गया है। व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किए गए लगभग सभी क्लोनों को खाली नियंत्रण फ़ेज की तुलना में सीएसएफ में समृद्ध पाया गया। एक पेप्टाइड हिट (#2077) की अधिक विस्तार से जांच की गई। अन्य हिट्स की तुलना में इसने लंबी प्लाज्मा अर्ध-आयु प्रदर्शित की (चित्र 3डी और पूरक चित्र 7), और रोचक तथ्य यह है कि इस पेप्टाइड में सी-टर्मिनस पर एक सिस्टीन अवशेष मौजूद था। हाल ही में यह दिखाया गया है कि पेप्टाइड्स में सिस्टीन जोड़ने से एल्ब्यूमिन 29 से जुड़कर उनके फार्माकोकाइनेटिक गुणों में सुधार हो सकता है। पेप्टाइड #2077 के लिए यह वर्तमान में अज्ञात है और इसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। कुछ पेप्टाइड्स ने सीएसएफ संवर्धन में वैलेंस-निर्भरता दिखाई (डेटा प्रदर्शित नहीं किया गया), जो टी7 कैप्सिड की प्रदर्शित सतह ज्यामिति से संबंधित हो सकती है। हमारे द्वारा उपयोग किए गए टी7 सिस्टम ने प्रत्येक फेज कण में प्रत्येक पेप्टाइड की 5-15 प्रतियां दिखाईं। चूहों के मस्तिष्क प्रांतस्था में अंतःशिरा द्वारा इंजेक्ट किए गए उम्मीदवार लीड फेज क्लोन पर आईएचसी किया गया (पूरक चित्र 8)। डेटा से पता चला कि कम से कम तीन क्लोन (नंबर 2002, नंबर 2009 और नंबर 2077) बीबीबी के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। यह निर्धारित करना बाकी है कि क्या यह BBB इंटरेक्शन CSF के संचय का कारण बनता है या इन क्लोनों का सीधे BCSFB में संचलन होता है। महत्वपूर्ण रूप से, हम दिखाते हैं कि चयनित पेप्टाइड संश्लेषित होने और प्रोटीन कार्गो से बंधने पर अपनी CSF परिवहन क्षमता बनाए रखते हैं। N-टर्मिनल बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड का SA से बंधन, रक्त और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में उनके संबंधित फेज क्लोनों के साथ प्राप्त परिणामों को अनिवार्य रूप से दोहराता है (चित्र 3e)। अंत में, हम दिखाते हैं कि लीड पेप्टाइड #2077, SA से संयुग्मित BACE1 के बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड अवरोधक की मस्तिष्क क्रिया को बढ़ावा देने में सक्षम है, जिससे CSF में Abeta40 के स्तर को काफी कम करके CNS में स्पष्ट औषधीय प्रभाव उत्पन्न होते हैं (चित्र 4)। सभी हिट्स की पेप्टाइड अनुक्रम समरूपता खोज करके हम डेटाबेस में किसी भी समरूप की पहचान करने में असमर्थ रहे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि T7 लाइब्रेरी का आकार लगभग 109 है, जबकि 12-mers के लिए सैद्धांतिक लाइब्रेरी का आकार 4 x 1015 है। इसलिए, हमने 12-mer पेप्टाइड लाइब्रेरी के विविधता क्षेत्र का केवल एक छोटा सा अंश ही चुना है, जिसका अर्थ यह हो सकता है कि इन पहचाने गए हिट्स के आसन्न अनुक्रम क्षेत्र का मूल्यांकन करके अधिक अनुकूलित पेप्टाइड की पहचान की जा सकती है। परिकल्पना के अनुसार, इन पेप्टाइड के किसी भी प्राकृतिक समरूप को न ढूंढ पाने का एक कारण विकास के दौरान मस्तिष्क में कुछ पेप्टाइड रूपांकनों के अनियंत्रित प्रवेश को रोकने के लिए चयन में कमी हो सकती है।
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम मस्तिष्क वाहिका अवरोध (सेरेब्रोवास्कुलर बैरियर) की परिवहन प्रणालियों की पहचान और विशेषता का अधिक विस्तार से अध्ययन करने के लिए भविष्य के कार्यों का आधार प्रदान करते हैं। इस पद्धति का मूल ढांचा एक कार्यात्मक चयन रणनीति पर आधारित है जो न केवल मस्तिष्क वाहिका बंधन गुणों वाले क्लोनों की पहचान करता है, बल्कि इसमें एक महत्वपूर्ण चरण भी शामिल है जिसमें सफल क्लोनों में मस्तिष्क तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में जैविक अवरोधों को पार करने की आंतरिक क्षमता होती है। इसका उद्देश्य इन पेप्टाइडों के परिवहन की क्रियाविधि और मस्तिष्क क्षेत्र के लिए विशिष्ट सूक्ष्म वाहिका तंत्र से जुड़ने की उनकी प्राथमिकता को स्पष्ट करना है। इससे रक्त वाहिका अवरोध (बीबीबी) और रिसेप्टर्स के परिवहन के लिए नए मार्गों की खोज हो सकती है। हमें उम्मीद है कि पहचाने गए पेप्टाइड सीधे मस्तिष्क वाहिका रिसेप्टर्स या बीबीबी या बीसीएसएफबी के माध्यम से परिवहन किए जाने वाले परिसंचारी लिगैंड्स से जुड़ सकते हैं। इस कार्य में खोजे गए सीएसएफ परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड वैक्टरों की आगे जांच की जाएगी। हम वर्तमान में बीबीबी और/या बीसीएसएफबी को पार करने की उनकी क्षमता के लिए इन पेप्टाइडों की मस्तिष्क विशिष्टता की जांच कर रहे हैं। ये नए पेप्टाइड नए रिसेप्टर्स या मार्गों की संभावित खोज और मस्तिष्क तक बायोलॉजिक्स जैसे मैक्रोमोलेक्यूल्स की डिलीवरी के लिए नए अत्यधिक कुशल प्लेटफॉर्म के विकास के लिए अत्यंत मूल्यवान उपकरण होंगे।
पहले वर्णित विधि में संशोधन करके बड़ी सिस्टर्ना (सीएम) में कैनुला डालें। बेहोश किए गए विस्टार चूहों (200-350 ग्राम) को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखा गया और खोपड़ी को उजागर करने के लिए मुंडे हुए और रोगाणु रहित रूप से तैयार किए गए सिर की त्वचा पर एक मध्य चीरा लगाया गया। ऊपरी सैश के क्षेत्र में दो छेद करें और उनमें फिक्सिंग स्क्रू कस दें। सीएम में स्टेनलेस स्टील कैनुला के स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के लिए पार्श्व पश्चकपाल शिखा में एक अतिरिक्त छेद किया गया। कैनुला के चारों ओर डेंटल सीमेंट लगाएं और स्क्रू से सुरक्षित करें। फोटो-क्योरिंग और सीमेंट के सख्त होने के बाद, त्वचा के घाव को 4/0 सुप्रामिड टांके से बंद कर दिया गया। सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (सीएसएफ) के स्वतः रिसाव से कैनुला के सही स्थान की पुष्टि होती है। चूहे को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से हटा दें, उचित ऑपरेशनोत्तर देखभाल और दर्द प्रबंधन प्रदान करें, और उसे कम से कम एक सप्ताह तक ठीक होने दें जब तक कि सेरेब्रोस्पाइनल द्रव में रक्त के लक्षण दिखाई न दें। विस्टार चूहे (Crl:WI/Han) चार्ल्स रिवर (फ्रांस) से प्राप्त किए गए थे। सभी चूहों को विशिष्ट रोगजनक-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। सभी पशु प्रयोगों को स्विट्जरलैंड के बेसल शहर के पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु लाइसेंस संख्या 2474 (चूहे के मस्तिष्क के द्रव और मस्तिष्क में चिकित्सीय उम्मीदवारों के स्तर को मापकर सक्रिय मस्तिष्क परिवहन का आकलन) के अनुसार किए गए थे।
सीएम कैनुला को हाथ में पकड़े हुए चूहे को धीरे से होश में रखें। कैनुला से धतूरा निकालें और स्वतः प्रवाहित होने वाले सेरेब्रोस्पाइनल द्रव का 10 µl एकत्र करें। चूंकि कैनुला की कार्यक्षमता अंततः प्रभावित हुई, इसलिए इस अध्ययन में केवल स्पष्ट सेरेब्रोस्पाइनल द्रव के नमूने शामिल किए गए जिनमें रक्त संदूषण या रंग परिवर्तन का कोई प्रमाण नहीं था। समानांतर रूप से, पूंछ के सिरे पर एक छोटे चीरे से लगभग 10-20 µl रक्त को हेपरिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) युक्त ट्यूबों में लिया गया। टी7 फेज के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर सीएसएफ और रक्त एकत्र किए गए। प्रत्येक सीएसएफ नमूना एकत्र करने से पहले लगभग 5-10 µl द्रव को त्याग दिया गया, जो कैथेटर के निष्क्रिय आयतन के बराबर है।
लाइब्रेरीज़ को T7Select 10-3b वेक्टर का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जैसा कि T7Select सिस्टम मैनुअल (नोवाजेन, रोसेनबर्ग एट अल., इनोवेशंस 6, 1-6, 1996) में वर्णित है। संक्षेप में, एक यादृच्छिक 12-मर डीएनए इंसर्ट को निम्नलिखित प्रारूप में संश्लेषित किया गया था:
इंसर्ट में डबल स्टॉप कोडॉन और अमीनो एसिड के अति-अभिव्यक्ति से बचने के लिए NNK कोडॉन का उपयोग किया गया था। N प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित सममोलर अनुपात है, और K एडेनिन और साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित सममोलर अनुपात है। एकल-स्ट्रैंडेड क्षेत्रों को 37°C पर 3 घंटे के लिए क्लेनो बफर (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) में dNTP (नोवाजेन) और क्लेनो एंजाइम (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के साथ आगे इनक्यूबेशन करके डबल-स्ट्रैंडेड DNA में परिवर्तित किया गया। प्रतिक्रिया के बाद, EtOH अवक्षेपण द्वारा डबल-स्ट्रैंडेड DNA प्राप्त किया गया। परिणामी DNA को प्रतिबंध एंजाइम EcoRI और HindIII (दोनों रोश से) के साथ पचाया गया। क्लीव्ड और शुद्ध (QIAquick, Qiagen) इंसर्ट (T4 लाइगेज, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) को फिर 10B कैप्सिड जीन के अमीनो एसिड 348 के बाद एक पूर्व-क्लीव्ड T7 वेक्टर में इन-फ्रेम लाइगेट किया गया। इन विट्रो पैकेजिंग से पहले, लिगेशन प्रतिक्रियाओं को 16°C पर 18 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। इन विट्रो में फेज पैकेजिंग T7Select 10-3b क्लोनिंग किट (नोवाजेन) के साथ दिए गए निर्देशों के अनुसार की गई और पैकेजिंग घोल को एस्चेरिचिया कोलाई (BLT5615, नोवाजेन) का उपयोग करके एक बार लाइसिस तक प्रवर्धित किया गया। लाइसैट को सेंट्रीफ्यूज किया गया, टाइट्रेट किया गया और -80°C पर ग्लिसरॉल के स्टॉक घोल के रूप में जमा दिया गया।
ब्रोथ या प्लेट में प्रवर्धित फ़ेज चर क्षेत्रों का प्रत्यक्ष पीसीआर प्रवर्धन, स्वामित्व वाले 454/रोश-एम्प्लिकॉन फ़्यूज़न प्राइमर का उपयोग करके किया जाता है। फ़ॉरवर्ड फ़्यूज़न प्राइमर में चर क्षेत्र (NNK) 12 (टेम्प्लेट-विशिष्ट), GS FLX टाइटेनियम एडेप्टर A, और एक चार-बेस लाइब्रेरी कुंजी अनुक्रम (TCAG) (पूरक चित्र 1a) के पार्श्व अनुक्रम होते हैं:
रिवर्स फ्यूजन प्राइमर में कैप्चर बीड्स से जुड़ा बायोटिन और इमल्शन पीसीआर के दौरान क्लोनल एम्प्लीफिकेशन के लिए आवश्यक जीएस एफएलएक्स टाइटेनियम एडाप्टर बी भी शामिल है:
इसके बाद एम्प्लिकॉन को 454 GS-FLX टाइटेनियम प्रोटोकॉल के अनुसार 454/रोश पायरोसीक्वेंसिंग के लिए भेजा गया। मैनुअल सैंगर सीक्वेंसिंग (एप्लाइड बायोसिस्टम्स हिताची 3730 एक्सएल डीएनए एनालाइजर) के लिए, टी7 फेज डीएनए को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया और निम्नलिखित प्राइमर युग्मों के साथ अनुक्रमित किया गया:
प्रत्येक प्लाक से लिए गए नमूनों को रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलीमरेज़ किट का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया गया (निर्माता के निर्देशों के अनुसार)। एक हॉट स्टार्ट (95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) और 35 बूस्ट चक्र (95 डिग्री सेल्सियस पर 50 सेकंड, 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) किए गए।
लाइब्रेरी से प्राप्त फ़ेज, वाइल्ड-टाइप फ़ेज, सीएसएफ और रक्त से प्राप्त फ़ेज, या व्यक्तिगत क्लोन को एस्चेरिचिया कोलाई बीएल5615 में टीबी ब्रोथ (सिग्मा एल्ड्रिच) या 500 सेमी² डिश (थर्मो साइंटिफिक) में 37°C पर 4 घंटे के लिए प्रवर्धित किया गया। फ़ेज को प्लेटों को ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लुका एनालिटिकल) से धोकर या बाँझ पिपेट युक्तियों से पट्टिकाओं को एकत्रित करके प्लेटों से निकाला गया। फ़ेज को पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (पीईजी 8000) अवक्षेपण (प्रोमेगा) के एक दौर के साथ कल्चर सुपरनेटेंट या निष्कर्षण बफर से पृथक किया गया और ट्रिस-ईडीटीए बफर में पुनः निलंबित किया गया।
प्रवर्धित फ़ेज को अंतःशिरा (IV) इंजेक्शन (500 μl/पशु) देने से पहले एंडोटॉक्सिन निष्कासन बीड्स (मिल्टेनी बायोटेक) का उपयोग करके 2-3 चरणों में एंडोटॉक्सिन निष्कासन से गुज़ारा गया। पहले चरण में 2×10¹² फ़ेज डाले गए; दूसरे में 2×10¹⁰ फ़ेज; तीसरे और चौथे चयन चरण में प्रति पशु 2×10⁹ फ़ेज डाले गए। निर्धारित समय बिंदुओं पर एकत्रित CSF और रक्त के नमूनों में फ़ेज की मात्रा निर्माता के निर्देशों (T7Select सिस्टम मैनुअल) के अनुसार प्लाक गणना द्वारा निर्धारित की गई। फ़ेज का चयन शुद्ध पुस्तकालयों को पूंछ की नस में अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा या पिछले चयन चरण से CSF से निकाले गए फ़ेज को पुनः इंजेक्ट करके किया गया, और बाद में 10 मिनट, 30 मिनट, 60 मिनट, 90 मिनट, 120 मिनट, 180 मिनट और 240 मिनट पर CSF और रक्त के नमूने एकत्र किए गए। कुल मिलाकर चार चरणों की इन विवो पैनिंग की गई, जिसमें चयनित दो शाखाओं को चयन के पहले तीन चरणों के दौरान अलग-अलग संग्रहित और विश्लेषित किया गया। चयन के पहले दो चरणों से सीएसएफ से निकाले गए सभी फ़ेज इंसर्ट्स का 454/रोश पायरोसीक्वेंसिंग किया गया, जबकि चयन के अंतिम दो चरणों से सीएसएफ से निकाले गए सभी क्लोनों का मैन्युअल रूप से अनुक्रमण किया गया। चयन के पहले चरण से प्राप्त सभी रक्त फ़ेजों का भी 454/रोश पायरोसीक्वेंसिंग किया गया। फ़ेज क्लोनों के इंजेक्शन के लिए, चयनित फ़ेजों को 500 cm² प्लेटों पर 37°C पर 4 घंटे के लिए ई. कोलाई (BL5615) में प्रवर्धित किया गया। व्यक्तिगत रूप से चयनित और मैन्युअल रूप से अनुक्रमित क्लोनों को टीबी माध्यम में विकसित किया गया। फ़ेज निष्कर्षण, शुद्धिकरण और एंडोटॉक्सिन को हटाने के बाद (जैसा कि ऊपर वर्णित है), 300 μl में 2×10¹⁰ फ़ेज/पशु को एक पूंछ की नस में अंतःशिरा द्वारा इंजेक्ट किया गया।
अनुक्रम डेटा का पूर्व-प्रसंस्करण और गुणात्मक फ़िल्टरिंग। कच्चे 454/रोश डेटा को विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बाइनरी मानक स्ट्रीम मैप प्रारूप (एसएफएफ) से पियर्सन मानव पठनीय प्रारूप (फास्टा) में परिवर्तित किया गया। न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का आगे का प्रसंस्करण मालिकाना सी प्रोग्राम और स्क्रिप्ट (अप्रकाशित सॉफ़्टवेयर पैकेज) का उपयोग करके नीचे वर्णित अनुसार किया गया। प्राथमिक डेटा के विश्लेषण में कठोर बहु-स्तरीय फ़िल्टरिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं। उन रीड्स को फ़िल्टर करने के लिए जिनमें वैध 12mer इंसर्ट डीएनए अनुक्रम नहीं था, रीड्स को स्टार्ट लेबल (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), स्टॉप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) और बैकग्राउंड इंसर्ट (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) के साथ वैश्विक नीडलमैन-वुन्श परीक्षण का उपयोग करके क्रमिक रूप से संरेखित किया गया। संरेखण में प्रति संरेखण अधिकतम 2 विसंगतियों की अनुमति थी। इसलिए, स्टार्ट और स्टॉप टैग के बिना रीड्स और बैकग्राउंड इंसर्ट वाले रीड्स, यानी, वे संरेखण जो बेमेल की अनुमत संख्या से अधिक थे, लाइब्रेरी से हटा दिए गए। शेष रीड्स के लिए, स्टार्ट मार्क से शुरू होकर स्टॉप मार्क से पहले समाप्त होने वाले N-mer DNA अनुक्रम को मूल रीड अनुक्रम से अलग कर लिया गया और आगे संसाधित किया गया (जिसे आगे "इंसर्ट" कहा गया है)। इंसर्ट के अनुवाद के बाद, प्राइमर के 5′ सिरे पर पहले स्टॉप कोडॉन के बाद के हिस्से को इंसर्ट से हटा दिया गया। इसके अतिरिक्त, प्राइमर के 3′ सिरे पर अपूर्ण कोडॉन की ओर ले जाने वाले न्यूक्लियोटाइड्स को भी हटा दिया गया। केवल बैकग्राउंड अनुक्रमों वाले इंसर्ट को बाहर करने के लिए, "PAG" अमीनो एसिड पैटर्न से शुरू होने वाले अनुवादित इंसर्ट को भी हटा दिया गया। 3 अमीनो एसिड से कम पोस्ट-ट्रांसलेशनल लंबाई वाले पेप्टाइड्स को लाइब्रेरी से हटा दिया गया। अंत में, इंसर्ट पूल में अतिरेक को हटा दिया गया और प्रत्येक अद्वितीय इंसर्ट की आवृत्ति निर्धारित की गई। इस विश्लेषण के परिणामों में न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों (इंसर्ट) और उनकी (रीड) आवृत्तियों की एक सूची शामिल थी (पूरक चित्र 1c और 2)।
अनुक्रम समानता के आधार पर एन-मेर डीएनए इंसर्ट्स का समूहीकरण: 454/रोश-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटियों (जैसे होमोपॉलिमर एक्सटेंशन के अनुक्रमण में समस्याएँ) को दूर करने और कम महत्वपूर्ण अतिरेकों को हटाने के लिए, पहले से फ़िल्टर किए गए एन-मेर डीएनए अनुक्रम इंसर्ट्स (इंसर्ट्स) को समानता के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है। इंसर्शन (अधिकतम 2 गैर-मिलान वाले बेस की अनुमति) को एक पुनरावृत्ति एल्गोरिदम का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाता है, जिसे इस प्रकार परिभाषित किया गया है: इंसर्शन को पहले उनकी आवृत्ति (उच्चतम से निम्नतम) के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है, और यदि वे समान हैं, तो उनकी लंबाई (सबसे लंबी से सबसे छोटी) के आधार पर द्वितीयक क्रम में क्रमबद्ध किया जाता है। इस प्रकार, सबसे अधिक बारंबार और सबसे लंबी इंसर्शन पहले "समूह" को परिभाषित करती हैं। समूह आवृत्ति को कुंजी आवृत्ति पर सेट किया जाता है। फिर, क्रमबद्ध सूची में शेष प्रत्येक इंसर्शन को पेयरवाइज नीडलमैन-वुन्श संरेखण द्वारा समूह में जोड़ने का प्रयास किया जाता है। यदि किसी संरेखण में बेमेल, इंसर्शन या विलोपन की संख्या 2 की सीमा से अधिक नहीं होती है, तो इंसर्शन को समूह में जोड़ दिया जाता है, और समग्र समूह आवृत्ति को इंसर्शन को जोड़े जाने की आवृत्ति से बढ़ा दिया जाता है। किसी समूह में जोड़े गए इंसर्ट अनुक्रमों को प्रयुक्त के रूप में चिह्नित किया जाता है और आगे की प्रक्रिया से बाहर रखा जाता है। यदि इंसर्ट अनुक्रम को पहले से मौजूद समूह में नहीं जोड़ा जा सकता है, तो इंसर्ट अनुक्रम का उपयोग उपयुक्त इंसर्ट आवृत्ति के साथ एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है और उसे प्रयुक्त के रूप में चिह्नित किया जाता है। यह प्रक्रिया तब समाप्त होती है जब प्रत्येक इंसर्शन अनुक्रम का उपयोग या तो एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है या उसे पहले से मौजूद समूह में शामिल किया जा सकता है। अंततः, न्यूक्लियोटाइड से बने समूहीकृत इंसर्ट को पेप्टाइड अनुक्रमों (पेप्टाइड लाइब्रेरी) में अनुवादित किया जाता है। इस विश्लेषण का परिणाम इंसर्शन और उनकी संबंधित आवृत्तियों का एक समूह होता है जो लगातार रीड की संख्या बनाता है (पूरक चित्र 2)।
मोटिफ निर्माण: अद्वितीय पेप्टाइडों की एक सूची के आधार पर, नीचे दिखाए गए अनुसार सभी संभावित अमीनो एसिड पैटर्न (aa) युक्त एक लाइब्रेरी बनाई गई। लंबाई 3 के प्रत्येक संभावित पैटर्न को पेप्टाइड से निकाला गया और इसके व्युत्क्रम पैटर्न को सभी पैटर्नों (ट्राइपेप्टाइड) वाली एक सामान्य मोटिफ लाइब्रेरी के साथ जोड़ा गया। अत्यधिक दोहराव वाले मोटिफ की लाइब्रेरी का अनुक्रमण किया गया और अनावश्यकता को हटाया गया। फिर, मोटिफ लाइब्रेरी में प्रत्येक ट्राइपेप्टाइड के लिए, हमने कम्प्यूटेशनल उपकरणों का उपयोग करके लाइब्रेरी में इसकी उपस्थिति की जाँच की। इस मामले में, पाए गए मोटिफ ट्राइपेप्टाइड वाले पेप्टाइड की आवृत्ति को जोड़ा जाता है और मोटिफ लाइब्रेरी में मोटिफ को सौंपा जाता है ("मोटिफ की संख्या")। मोटिफ निर्माण का परिणाम एक द्वि-आयामी सरणी है जिसमें ट्राइपेप्टाइड (मोटिफ) की सभी घटनाएँ और उनके संबंधित मान शामिल हैं, जो अनुक्रमण रीड की संख्या है जिसके परिणामस्वरूप रीड को फ़िल्टर, समूहीकृत और अनुवादित करने पर संबंधित मोटिफ प्राप्त होता है। मेट्रिक्स का विस्तृत विवरण ऊपर दिया गया है।
रूपांकनों की संख्या का सामान्यीकरण और संबंधित स्कैटरप्लॉट: प्रत्येक नमूने के लिए रूपांकनों की संख्या को निम्न विधि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था।
जहां ni, विषय i युक्त रीड्स की संख्या है। इस प्रकार, vi नमूने में मोटिफ i युक्त रीड्स (या पेप्टाइड्स) की प्रतिशत आवृत्ति को दर्शाता है। मोटिफ की गैर-सामान्यीकृत संख्या के लिए P-मान फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके गणना किए गए थे। मोटिफ की संख्या के सहसंबंध आरेखों के संबंध में, स्पीयरमैन सहसंबंधों की गणना सामान्यीकृत मोटिफ संख्या का उपयोग करके R के साथ की गई थी।
पेप्टाइड लाइब्रेरी में प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड की मात्रा को देखने के लिए, वेब लोगोग्राम 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) बनाए गए। सबसे पहले, 12-मर पेप्टाइड की प्रत्येक स्थिति पर अमीनो एसिड की मात्रा को 20×12 मैट्रिक्स में संग्रहित किया जाता है। फिर, प्रत्येक स्थिति पर समान सापेक्ष अमीनो एसिड मात्रा वाले 1000 पेप्टाइड का एक सेट फास्टा-सीक्वेंस प्रारूप में तैयार किया जाता है और इसे वेब-लोगो 3 में इनपुट के रूप में दिया जाता है, जो दी गई पेप्टाइड लाइब्रेरी के लिए प्रत्येक स्थिति पर सापेक्ष अमीनो एसिड मात्रा का ग्राफिकल निरूपण तैयार करता है। बहुआयामी डेटासेट को देखने के लिए, R में आंतरिक रूप से विकसित टूल (बायोसहीटमैप, एक अभी तक जारी नहीं किया गया R पैकेज) का उपयोग करके हीट मैप बनाए गए। हीट मैप में प्रस्तुत डेंड्रोग्राम की गणना यूक्लिडियन दूरी मीट्रिक के साथ वार्ड की पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विधि का उपयोग करके की गई थी। मोटिफ स्कोरिंग डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, अननॉर्मलाइज़्ड स्कोरिंग के लिए P मान फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके गणना किए गए थे। अन्य डेटासेट के लिए P मान R में स्टूडेंट के t-परीक्षण या ANOVA का उपयोग करके गणना किए गए थे।
चयनित फ़ेज क्लोन और बिना इंसर्ट वाले फ़ेज को पूंछ की नस के माध्यम से अंतःशिरा द्वारा इंजेक्ट किया गया (300 μl PBS में 2×10¹⁰ फ़ेज/पशु)। परफ्यूज़न और उसके बाद फिक्सेशन से दस मिनट पहले, उन्हीं पशुओं को 100 μl DyLight594-लेबल वाले लेक्टिन (वेक्टर लेबोरेटरीज इंक., DL-1177) का अंतःशिरा इंजेक्शन दिया गया। फ़ेज इंजेक्शन के 60 मिनट बाद, चूहों को हृदय के माध्यम से 50 ml PBS और फिर 50 ml 4% PFA/PBS से परफ्यूज़ किया गया। मस्तिष्क के नमूनों को अतिरिक्त रूप से रात भर 4% PFA/PBS में फिक्स किया गया और 4°C पर रात भर 30% सुक्रोज में भिगोया गया। नमूनों को OCT मिश्रण में फ़्लैश फ़्रीज़ किया गया। जमे हुए नमूनों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण कमरे के तापमान पर 30 µm क्रायोसेक्शन पर किया गया, जिन्हें 1% बीएसए से अवरुद्ध किया गया था और टी7 फेज (नोवस एनबी 600-376ए) के खिलाफ पॉलीक्लोनल एफआईटीसी-लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। इसे रात भर इनक्यूबेट किया गया। अंत में, सेक्शन को पीबीएस से 3 बार धोया गया और एक कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (लीका टीसीएस एसपी5) से जांचा गया।
सभी पेप्टाइड्स जिनकी न्यूनतम शुद्धता 98% है, GenScript USA द्वारा संश्लेषित किए गए, बायोटिनयुक्त किए गए और लाइयोफिलाइज्ड किए गए। बायोटिन एन-टर्मिनस पर एक अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसर के माध्यम से जुड़ा हुआ है। सभी पेप्टाइड्स की मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जांच करें।
स्ट्रेप्टाविडिन (सिग्मा S0677) को बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनिलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड, या बायोटिनिलेटेड BACE1 अवरोधक पेप्टाइड और BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के संयोजन (3:1 अनुपात) की 5 गुना सममोलर अधिकता के साथ 5–10% DMSO में मिलाया गया और PBS में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इंजेक्शन से पहले इनक्यूबेट किया गया। स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित पेप्टाइड को मस्तिष्क गुहा वाले चूहों की पूंछ की नसों में से एक में 10 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर अंतःशिरा द्वारा इंजेक्ट किया गया।
स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की सांद्रता का आकलन ELISA द्वारा किया गया। Nunc Maxisorp माइक्रोटिटर प्लेट्स (सिग्मा) को 4°C पर रात भर 1.5 μg/ml माउस एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी (थर्मो, MA1-20011) से लेपित किया गया। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ब्लॉकिंग (ब्लॉकिंग बफर: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% BSA) के बाद, प्लेट को 0.05% Tween-20/PBS (वॉश बफर) से 3 सेकंड के लिए धोया गया। इसके बाद, CSF और प्लाज्मा के नमूनों को ब्लॉकिंग बफर (प्लाज्मा 1:10,000, CSF 1:115) से पतला करके कुओं में डाला गया। इसके बाद प्लेट को 4°C पर रात भर डिटेक्शन एंटीबॉडी (1 μg/ml, एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन-HRP, नोवस NB120-7239) के साथ इनक्यूबेट किया गया। तीन बार धोने के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन का पता लगाने के लिए इसे TMB सबस्ट्रेट सॉल्यूशन (रोश) में 20 मिनट तक इनक्यूबेट किया गया। 1M H2SO4 से रंग विकास को रोकने के बाद, 450 nm पर अवशोषण को मापा गया।
स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड-BACE1 अवरोधक कॉम्प्लेक्स के कार्य का मूल्यांकन Aβ(1-40) ELISA द्वारा निर्माता के प्रोटोकॉल (वाको, 294-64701) के अनुसार किया गया। संक्षेप में, CSF नमूनों को मानक डाइल्यूएंट (1:23) में पतला किया गया और BNT77 कैप्चर एंटीबॉडी से लेपित 96-वेल प्लेटों में 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। पाँच बार धोने के बाद, HRP-संयुग्मित BA27 एंटीबॉडी को मिलाया गया और 4°C पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, जिसके बाद पाँच बार धोया गया। Aβ(1–40) का पता लगाने के लिए, TMB घोल में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। स्टॉप सॉल्यूशन से रंग विकास को रोकने के बाद, 450 nm पर अवशोषण को मापा गया। Aβ(1–40) ELISA से पहले प्लाज्मा नमूनों को सॉलिड फेज एक्सट्रैक्शन से गुजारा गया। प्लाज्मा को 96-वेल प्लेटों में 0.2% DEA (सिग्मा) में मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट किया गया। एसपीई प्लेटों (ओएसिस, 186000679) को पानी और 100% मेथनॉल से बारी-बारी से धोने के बाद, प्लाज्मा के नमूनों को एसपीई प्लेटों में डाला गया और सारा तरल पदार्थ हटा दिया गया। नमूनों को धोया गया (पहले 5% मेथनॉल से, फिर 30% मेथनॉल से) और 2% NH4OH/90% मेथनॉल से एल्यूट किया गया। एलुएट को 55°C पर 99 मिनट तक स्थिर N2 प्रवाह पर सुखाने के बाद, नमूनों को मानक डाइल्यूएंट्स में रिड्यूस किया गया और Aβ(1–40) का मापन ऊपर वर्णित विधि के अनुसार किया गया।
इस लेख को कैसे उद्धृत करें: यूरिच, ई. एट अल. इन विवो में पहचाने गए ट्रांजिट पेप्टाइड्स का उपयोग करके मस्तिष्क तक कार्गो डिलीवरी। विज्ञान। 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)।
लिखोटा जे., स्कोर्रिंज टी., थॉमसेन एलबी और मूस टी. लक्षित चिकित्सा का उपयोग करके मस्तिष्क में मैक्रोमोलेक्यूलर दवाओं की डिलीवरी। जर्नल ऑफ न्यूरोकेमिस्ट्री 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
ब्रास्नजेविक, आई., स्टाइनबुश, एच.डब्ल्यू., श्मिट्ज़, सी., और मार्टिनेज़-मार्टिनेज़, पी. रक्त-मस्तिष्क अवरोध के पार पेप्टाइड और प्रोटीन दवाओं का वितरण। प्रोग न्यूरोबायोल 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
पार्ड्रिज, डब्ल्यू.एम. रक्त-मस्तिष्क अवरोध: मस्तिष्क दवा विकास में एक बाधा। न्यूरोआरएक्स 2, 3–14, 10.1602/न्यूरोआरएक्स.2.1.3 (2005)।
जोहानसन, के.ई., डंकन, जे.ए., स्टॉपा, ई.जी., और बर्ड, ए. कोरॉइड प्लेक्सस-सीएसएफ मार्ग के माध्यम से मस्तिष्क में बेहतर दवा वितरण और लक्ष्यीकरण की संभावनाएं। फार्मास्युटिकल रिसर्च 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
पार्ड्रिज, डब्ल्यू.एम. मस्तिष्क वितरण के लिए आणविक ट्रोजन हॉर्स के साथ बायोफार्मास्यूटिकल्स का आधुनिकीकरण। बायोकॉन्जुग केम 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
पार्ड्रिज, डब्ल्यूएम रिसेप्टर-मध्यस्थता पेप्टाइड परिवहन रक्त-मस्तिष्क बाधा के पार। एंडोक्राइन रेव. 7, 314–330 (1986)।
नीवोहनेर, जे. एट अल. मोनोवैलेंट मॉलिक्यूलर शटल का उपयोग करके चिकित्सीय एंटीबॉडी की मस्तिष्क पैठ और प्रभावकारिता में वृद्धि। न्यूरॉन 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
बिएन-ली, एन. एट अल. ट्रांसफ़रिन रिसेप्टर (टीएफआर) परिवहन टीएफआर एंटीबॉडी के आत्मीयता वेरिएंट के मस्तिष्क अवशोषण को निर्धारित करता है। जे एक्सप मेड 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।