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La barrera hematoencefálica impide que los agentes bioterapéuticos alcancen sus objetivos en el sistema nervioso central, dificultando así el tratamiento eficaz de las enfermedades neurológicas. Para descubrir nuevos transportadores cerebrales in vivo, introdujimos una biblioteca de péptidos del fago T7 y recolectamos muestras seriadas de sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) utilizando un modelo de ratas conscientes con cánulas. Se observó un alto enriquecimiento de clones de fagos específicos en el LCR tras cuatro rondas de selección. Las pruebas de péptidos candidatos individuales revelaron un enriquecimiento de más de 1000 veces en el LCR. La bioactividad de la administración mediada por péptidos al cerebro se confirmó mediante una reducción del 40 % en el nivel de amiloide-β en el líquido cefalorraquídeo utilizando un inhibidor peptídico de BACE1 unido al nuevo péptido de tránsito identificado. Estos resultados sugieren que los péptidos identificados mediante métodos de selección de fagos in vivo podrían ser vehículos útiles para la administración sistémica de macromoléculas al cerebro con efecto terapéutico.
La investigación sobre terapias dirigidas al sistema nervioso central (SNC) se ha centrado principalmente en identificar fármacos y agentes optimizados con propiedades de acción en el SNC, prestando menos atención al descubrimiento de los mecanismos que impulsan la administración activa de fármacos al cerebro. Esta situación está empezando a cambiar, ya que la administración de fármacos, especialmente de macromoléculas, es una parte integral del desarrollo de fármacos en neurociencia moderna. El entorno del sistema nervioso central está bien protegido por el sistema de barreras cerebrovasculares, compuesto por la barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica cerebral (BHEC)¹, lo que dificulta la administración de fármacos al cerebro¹,². Se estima que casi todos los fármacos de macromoléculas y más del 98 % de los de micromoléculas se eliminan del cerebro³. Por ello, es fundamental identificar nuevos sistemas de transporte cerebral que permitan la administración eficiente y específica de fármacos terapéuticos al SNC⁴,⁵. Sin embargo, la BHE y la BHEC también ofrecen una excelente oportunidad para la administración de fármacos, ya que penetran y acceden a todas las estructuras del cerebro a través de su extensa vascularización. Por lo tanto, los esfuerzos actuales para utilizar métodos no invasivos de administración al cerebro se basan en gran medida en el mecanismo de transporte mediado por receptores (PMT) utilizando el receptor endógeno BBB6. A pesar de los recientes avances clave utilizando la vía del receptor de transferrina7,8, se requiere un mayor desarrollo de nuevos sistemas de administración con propiedades mejoradas. Con este fin, nuestro objetivo fue identificar péptidos capaces de mediar el transporte de LCR, ya que en principio podrían utilizarse para administrar macromoléculas al SNC o para abrir nuevas vías de receptores. En particular, receptores y transportadores específicos del sistema cerebrovascular (BBB y BSCFB) pueden servir como objetivos potenciales para la administración activa y específica de fármacos bioterapéuticos. El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un producto de secreción del plexo coroideo (SC) y está en contacto directo con el líquido intersticial del cerebro a través del espacio subaracnoideo y el espacio ventricular4. Recientemente se ha demostrado que el líquido cefalorraquídeo subaracnoideo se difunde excesivamente en el intersticio del cerebro9. Esperamos acceder al espacio parenquimatoso mediante este tracto de entrada subaracnoideo o directamente a través de la barrera hematoencefálica. Para lograrlo, implementamos una estrategia robusta de selección de fagos in vivo que, idealmente, identifica péptidos transportados por cualquiera de estas dos vías distintas.
Describimos un método secuencial de cribado de fagos in vivo con muestreo de LCR acoplado a secuenciación de alto rendimiento (HTS) para monitorizar las rondas de selección iniciales con la mayor diversidad de biblioteca. El cribado se realizó en ratas conscientes con una cánula de cisterna grande (CM) implantada permanentemente para evitar la contaminación sanguínea. Es importante destacar que este enfoque selecciona tanto péptidos dirigidos al cerebro como péptidos con actividad de transporte a través de la barrera cerebrovascular. Utilizamos fagos T7 debido a su pequeño tamaño (~60 nm)10 y sugerimos que son adecuados para el transporte de vesículas que permiten el cruce transcelular de la barrera endotelial y/o epitelio-medular. Tras cuatro rondas de selección, se aislaron poblaciones de fagos que mostraron un fuerte enriquecimiento in vivo en LCR y asociación con microvasos cerebrales. Es importante señalar que pudimos confirmar nuestros hallazgos demostrando que los péptidos candidatos preferidos y sintetizados químicamente son capaces de transportar carga proteica al líquido cefalorraquídeo. En primer lugar, se establecieron los efectos farmacodinámicos en el SNC mediante la combinación de un péptido de tránsito principal con un inhibidor del péptido BACE1. Además de demostrar que las estrategias de cribado funcional in vivo pueden identificar nuevos péptidos de transporte cerebral como transportadores eficaces de proteínas, prevemos que enfoques de selección funcional similares también adquirirán importancia para identificar nuevas vías de transporte cerebral.
Basándonos en unidades formadoras de placa (UFP), tras el paso de empaquetamiento de fagos, se diseñó y creó una biblioteca de péptidos lineales aleatorios de fago T7 de 12 nucleótidos con una diversidad aproximada de 10⁹ (véase Materiales y Métodos). Es importante destacar que analizamos cuidadosamente esta biblioteca antes del análisis in vivo. La amplificación por PCR de muestras de la biblioteca de fagos utilizando cebadores modificados generó amplicones directamente aplicables a HTS (Figura suplementaria 1a). Debido a a) errores de secuenciación de HTS11, b) impacto en la calidad de los cebadores (NNK)1-12 y c) la presencia de fagos de tipo salvaje (wt) (insertos de esqueleto) en la biblioteca de reserva, se implementó un procedimiento de filtrado de secuencias para extraer únicamente información de secuencia verificada (Figura suplementaria 1b). Estos pasos de filtrado se aplican a todas las bibliotecas de secuenciación HTS. Para la biblioteca estándar, se obtuvieron un total de 233.868 lecturas, de las cuales el 39% cumplió con los criterios de filtrado y se utilizó para el análisis y la selección de la biblioteca para las rondas posteriores (Figura suplementaria 1c-e). Las lecturas fueron predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de longitud con un pico en 36 nucleótidos (Figura suplementaria 1c), lo que confirma el diseño de la biblioteca (NNK) 1-12. Cabe destacar que aproximadamente el 11% de los miembros de la biblioteca contenían un inserto PAGISRELVDKL de tipo salvaje (wt) de 12 dimensiones, y casi la mitad de las secuencias (49%) contenían inserciones o deleciones. El HTS de la biblioteca confirmó la alta diversidad de péptidos en la biblioteca: más del 81% de las secuencias de péptidos se encontraron solo una vez y solo el 1,5% apareció en ≥4 copias (Figura suplementaria 2a). Las frecuencias de aminoácidos (aa) en las 12 posiciones del repertorio se correlacionaron bien con las frecuencias esperadas para el número de codones generados por el repertorio NKK degenerado (Fig. suplementaria 2b). La frecuencia observada de residuos de aa codificados por estos insertos se correlacionó bien con la frecuencia calculada (r = 0,893) (Fig. suplementaria 2c). La preparación de bibliotecas de fagos para inyección incluye los pasos de amplificación y eliminación de endotoxina. Se ha demostrado previamente que esto puede reducir la diversidad de las bibliotecas de fagos12,13. Por lo tanto, secuenciamos una biblioteca de fagos amplificada en placa que había sido sometida a la eliminación de endotoxina y la comparamos con la biblioteca original para estimar la frecuencia de AA. Se observó una fuerte correlación (r = 0,995) entre el pool original y el pool amplificado y purificado (Fig. suplementaria 2d), lo que indica que la competencia entre clones amplificados en placas usando fago T7 no causó un sesgo importante. Esta comparación se basa en la frecuencia de motivos de tripéptidos en cada biblioteca, ya que la diversidad de las bibliotecas (~10⁹) no se puede capturar completamente ni siquiera con HTS. El análisis de frecuencia de aa en cada posición reveló un pequeño sesgo dependiente de la posición en las últimas tres posiciones del repertorio introducido (Figura suplementaria 2e). En conclusión, determinamos que la calidad y la diversidad de la biblioteca eran aceptables y que solo se observaron cambios menores en la diversidad debido a la amplificación y preparación de las bibliotecas de fagos entre varias rondas de selección.
Se puede realizar un muestreo seriado de líquido cefalorraquídeo implantando quirúrgicamente una cánula en el CM de ratas conscientes para facilitar la identificación del fago T7 inyectado por vía intravenosa (iv) a través de la BBB y/o la BCSFB (Fig. 1a-b). Utilizamos dos brazos de selección independientes (brazos A y B) en las tres primeras rondas de selección in vivo (Fig. 1c). Aumentamos gradualmente la rigurosidad de la selección disminuyendo la cantidad total de fago introducido en las tres primeras rondas de selección. Para la cuarta ronda de selección, combinamos muestras de las ramas A y B y realizamos tres selecciones independientes adicionales. Para estudiar las propiedades in vivo de las partículas del fago T7 en este modelo, se inyectó fago de tipo salvaje (inserto maestro PAGISRELVDKL) en ratas a través de la vena de la cola. La recuperación de fagos del líquido cefalorraquídeo y la sangre en diferentes momentos mostró que los fagos icosaédricos T7 relativamente pequeños tenían una fase de eliminación inicial rápida del compartimento sanguíneo (Fig. suplementaria 3). Basándonos en los títulos administrados y el volumen sanguíneo de las ratas, calculamos que solo aproximadamente el 1% del peso corporal del fago de la dosis administrada se detectó en la sangre 10 minutos después de la inyección intravenosa. Tras este rápido descenso inicial, se midió una eliminación primaria más lenta con una vida media de 27,7 minutos. Es importante destacar que solo se recuperaron muy pocos fagos del compartimento del LCR, lo que indica un bajo nivel basal de migración del fago de tipo salvaje al compartimento del LCR (Figura suplementaria 3). En promedio, solo se detectaron alrededor de 1 x 10⁻³% de títulos de fago T7 en la sangre y 4 x 10⁻⁸% de los fagos infundidos inicialmente en el líquido cefalorraquídeo durante todo el período de muestreo (0-250 min). Cabe destacar que la vida media (25,7 min) del fago de tipo salvaje en el líquido cefalorraquídeo fue similar a la observada en la sangre. Estos datos demuestran que la barrera que separa el compartimento del líquido cefalorraquídeo (LCR) de la sangre permanece intacta en ratas con cánulas en el medio condicionado, lo que permite la selección in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que se transportan fácilmente desde la sangre al compartimento del LCR.
(a) Establecimiento de un método para remuestrear líquido cefalorraquídeo (LCR) de un gran pool. (b) Diagrama que muestra la ubicación celular de la barrera del sistema nervioso central (SNC) y la estrategia de selección utilizada para identificar péptidos que cruzan la barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica. (c) Diagrama de flujo de cribado de visualización de fagos in vivo. En cada ronda de selección, los fagos (identificadores de animales dentro de las flechas) se inyectaron por vía intravenosa. Dos ramas alternativas independientes (A, B) se mantienen separadas hasta la 4.ª ronda de selección. Para las rondas de selección 3 y 4, cada clon de fago extraído del LCR se secuenció manualmente. (d) Cinética de fagos aislados de sangre (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos verdes) durante la primera ronda de selección en dos ratas canuladas después de la inyección intravenosa de la biblioteca de péptidos T7 (2 x 10¹² fagos/animal). Los cuadrados azules indican la concentración inicial promedio de fago en la sangre, calculada a partir de la cantidad de fago inyectado, teniendo en cuenta el volumen total de sangre. Los cuadrados negros indican el punto de intersección de la línea y extrapolada a partir de las concentraciones de fago en sangre. (e,f) Presentan la frecuencia relativa y la distribución de todos los posibles motivos de tripéptido superpuestos encontrados en el péptido. Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas. Los motivos significativamente enriquecidos (p < 0,001) están marcados con puntos rojos. (e) Diagrama de dispersión de correlación que compara la frecuencia relativa del motivo de tripéptido de la biblioteca inyectada con fago derivado de sangre de los animales #1.1 y #1.2. (f) Diagrama de dispersión de correlación que compara las frecuencias relativas de los motivos de tripéptido de fago animal #1.1 y #1.2 aislados en sangre y líquido cefalorraquídeo. (g, h) Representación de la secuencia de identificación de fagos enriquecidos en sangre (g) frente a bibliotecas inyectadas y fagos enriquecidos en LCR (h) frente a sangre tras una ronda de selección in vivo en ambos animales. El tamaño del código de una letra indica la frecuencia con la que aparece ese aminoácido en esa posición. Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrofóbicos. La figura 1a, b fue diseñada y producida por Eduard Urich.
Inyectamos una biblioteca de péptidos de fagos en dos ratas CM instrumentadas (clados A y B) y aislamos fagos del líquido cefalorraquídeo y la sangre (Figura 1d). La eliminación inicial rápida de la biblioteca fue menos pronunciada en comparación con el fago de tipo silvestre. La vida media media de la biblioteca inyectada en ambos animales fue de 24,8 minutos en sangre, similar al fago de tipo silvestre, y de 38,5 minutos en LCR. Las muestras de fagos de sangre y líquido cefalorraquídeo de cada animal se sometieron a HTS y todos los péptidos identificados se analizaron para detectar la presencia de un motivo de tripéptido corto. Los motivos de tripéptidos se eligieron porque proporcionan una base mínima para la formación de la estructura y las interacciones péptido-proteína14,15. Encontramos una buena correlación en la distribución de motivos entre la biblioteca de fagos inyectada y los clones extraídos de la sangre de ambos animales (Fig. 1e). Los datos indican que la composición de la biblioteca está solo marginalmente enriquecida en el compartimento sanguíneo. Las frecuencias de aminoácidos y las secuencias consenso se analizaron en cada posición utilizando una adaptación del software Weblogo16. Curiosamente, encontramos un fuerte enriquecimiento en residuos de glicina en sangre (Fig. 1g). Al comparar la sangre con clones seleccionados del LCR, se observó una fuerte selección y cierta deselección de motivos (Fig. 1f), y ciertos aminoácidos estaban presentes preferentemente en posiciones predeterminadas en el péptido de 12 miembros (Fig. 1h). Cabe destacar que los animales individuales diferían significativamente en el líquido cefalorraquídeo, mientras que el enriquecimiento de glicina en sangre se observó en ambos animales (Fig. suplementaria 4a-j). Después de un filtrado riguroso de los datos de secuencia en el líquido cefalorraquídeo de los animales #1.1 y #1.2, se obtuvieron un total de 964 y 420 péptidos únicos de 12 mer (Fig. suplementaria 1d-e). Los clones de fagos aislados se amplificaron y se sometieron a una segunda ronda de selección in vivo. Los fagos extraídos de la segunda ronda de selección se sometieron a HTS en cada animal y todos los péptidos identificados se utilizaron como entrada para un programa de reconocimiento de motivos para analizar la aparición de motivos de tripéptidos (Fig. 2a, b, ef). En comparación con el primer ciclo de los fagos recuperados del LCR, observamos una mayor selección y deselección de muchos motivos en el LCR en las ramas A y B (Fig. 2). Se aplicó un algoritmo de identificación de redes para determinar si representaban diferentes patrones de secuencia consistente. Se observó una clara similitud entre las secuencias de 12 dimensiones recuperadas por el LCR en el clado alternativo A (Fig. 2c, d) y el clado B (Fig. 2g, h). El análisis combinado en cada rama reveló diferentes perfiles de selección para péptidos de 12 mer (Fig. suplementaria 5c,d) y un aumento en la relación de título LCR/sangre a lo largo del tiempo para los clones combinados después de la segunda ronda de selección en comparación con la primera ronda de selección (Fig. suplementaria 5e).
Enriquecimiento de motivos y péptidos en el líquido cefalorraquídeo mediante dos rondas sucesivas de selección funcional in vivo mediante la técnica de visualización de fagos.
Todos los fagos del líquido cefalorraquídeo recuperados de la primera ronda de cada animal (animales n.° 1.1 y n.° 1.2) se agruparon, amplificaron, secuenciaron mediante HT y se reinyectaron juntos (2 x 1010 fagos/animal) 2 ratas canuladas SM (n.° 1.1 → n.° 2.1 y 2.2, 1.2 → 2.3 y 2.4). (a,b,e,f) Diagramas de dispersión de correlación que comparan la frecuencia relativa de los motivos de tripéptidos de todos los fagos derivados del LCR en la primera y segunda ronda de selección. Frecuencia relativa y distribución de motivos que representan todos los posibles tripéptidos superpuestos encontrados en péptidos en ambas orientaciones. Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas. Los motivos que fueron significativamente (p < 0,001) seleccionados o excluidos en una de las bibliotecas comparadas se resaltan con puntos rojos. (c, d, g, h) Representación del logotipo de secuencia de todas las secuencias de 12 aminoácidos ricas en LCR basadas en las rondas 2 y 1 de selección in vivo. El tamaño del código de una letra indica con qué frecuencia aparece ese aminoácido en esa posición. Para representar el logotipo, se compara la frecuencia de las secuencias de LCR extraídas de animales individuales entre dos rondas de selección y se muestran las secuencias enriquecidas en la segunda ronda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 y (h) #1.2–#2.4. Los aminoácidos más enriquecidos en una posición dada en (c, d) animales n.° 2.1 y n.° 2.2 o (g, h) en animales n.° 2.3 y n.° 2.4 se muestran en color. Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrofóbicos.
Después de la tercera ronda de selección, identificamos 124 secuencias de péptidos únicas (#3.1 y #3.2) de 332 clones de fagos reconstituidos en LCR aislados de dos animales (Figura suplementaria 6a). La secuencia LGSVS (18,7%) tuvo la mayor proporción relativa, seguida de los insertos de tipo silvestre PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) y SARGSWREIVSLS (2,2%). En la cuarta y última ronda, agrupamos dos ramas seleccionadas independientemente de tres animales diferentes (Figura 1c). De los 925 clones de fagos secuenciados recuperados del LCR, en la cuarta ronda encontramos 64 secuencias de péptidos únicas (Figura suplementaria 6b), entre las cuales la proporción relativa de fagos de tipo silvestre se redujo al 0,8%. Los clones de LCR más comunes en la cuarta ronda fueron LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) y RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). El rango de longitud de los péptidos seleccionados se debe a inserciones/deleciones de nucleótidos o codones de parada prematuros en los cebadores de la biblioteca cuando se utilizan codones degenerados para el diseño de la biblioteca NNK. Los codones de parada prematuros generan péptidos más cortos y se seleccionan porque contienen el motivo de aa favorable. Los péptidos más largos pueden resultar de inserciones/deleciones en los cebadores de las bibliotecas sintéticas. Esto coloca el codón de parada diseñado fuera del marco y lo lee hasta que aparece un nuevo codón de parada corriente abajo. En general, calculamos los factores de enriquecimiento para las cuatro rondas de selección comparando los datos de entrada con los datos de salida de la muestra. Para la primera ronda de cribado, utilizamos títulos de fagos de tipo salvaje como referencia de fondo no específica. Curiosamente, la selección negativa de fagos fue muy fuerte en el primer ciclo de LCR, pero no en sangre (Fig. 3a), lo que puede deberse a la baja probabilidad de difusión pasiva de la mayoría de los miembros de la biblioteca de péptidos en el compartimento del LCR o a que los fagos relativos tienden a retenerse o eliminarse del torrente sanguíneo de manera más eficiente que los bacteriófagos. Sin embargo, en la segunda ronda de selección, se observó una fuerte selección de fagos en el LCR en ambos clados, lo que sugiere que la ronda anterior estuvo enriquecida en fagos que muestran péptidos que promueven la captación de LCR (Fig. 3a). Nuevamente, sin un enriquecimiento significativo en sangre. También en la tercera y cuarta rondas, los clones de fagos se enriquecieron significativamente en LCR. Comparando la frecuencia relativa de cada secuencia de péptido única entre las dos últimas rondas de selección, encontramos que las secuencias estaban aún más enriquecidas en la cuarta ronda de selección (Fig. 3b). Se extrajeron un total de 931 motivos de tripéptidos de las 64 secuencias peptídicas únicas utilizando ambas orientaciones de péptidos. Los motivos más enriquecidos en la cuarta ronda se examinaron con mayor detalle para determinar sus perfiles de enriquecimiento en todas las rondas en comparación con la biblioteca inyectada (umbral: 10 % de enriquecimiento) (Figura suplementaria 6c). Los patrones generales de selección mostraron que la mayoría de los motivos estudiados se enriquecieron en todas las rondas anteriores de ambas ramas de selección. Sin embargo, algunos motivos (p. ej., SGL, VSG, LGS, GSV) provenían predominantemente del clado alternativo A, mientras que otros (p. ej., FGW, RTN, WGF, NTR) se enriquecieron en el clado alternativo B.
Validación del transporte en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de péptidos presentados en fagos enriquecidos en LCR y péptidos líderes biotinilados conjugados a cargas útiles de estreptavidina.
(a) Índices de enriquecimiento calculados en las cuatro rondas (R1-R4) basados ​​en los títulos de fagos inyectados (entrada = I) (UFP) y los títulos de fagos determinados en LCR (salida = O). Los factores de enriquecimiento para las últimas tres rondas (R2-R4) se calcularon por comparación con la ronda anterior y la primera ronda (R1) con datos de peso. Las barras abiertas son líquido cefalorraquídeo, las barras sombreadas son plasma. (***p<0,001, basado en la prueba t de Student). (b) Lista de los péptidos de fagos más abundantes, clasificados según su proporción relativa a todos los fagos recolectados en LCR después de la ronda 4 de selección. Los seis clones de fagos más comunes están resaltados en color, numerados y sus factores de enriquecimiento entre las rondas 3 y 4 de selección (recuadros). (c,d) Los seis clones de fagos más enriquecidos, las bibliotecas de péptidos de fagos vacíos y parentales de la ronda 4 se analizaron individualmente en un modelo de muestreo de LCR. Se recolectaron muestras de LCR y sangre en los puntos de tiempo indicados. (c) Cantidades iguales de 6 clones de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animales), fagos vacíos (#1779) (2 x 1010 fagos/animales) y bibliotecas de péptidos de fagos de reserva (2 x 1012 fagos/animales). Se inyectó al menos 3 CM al animal canulado por separado a través de la vena de la cola. Se muestra la farmacocinética del LCR de cada clon de fago inyectado y biblioteca de péptidos de fagos a lo largo del tiempo. (d) muestra la relación promedio LCR/sangre para todos los fagos/mL recuperados durante el tiempo de muestreo. (e) Cuatro péptidos líderes sintéticos y un control aleatorio se unieron con biotina a estreptavidina a través de su extremo N (presentación de tetrámeros) seguido de inyección (vena de la cola iv, 10 mg de estreptavidina/kg). Al menos tres ratas intubadas (N = 3). Se recolectaron muestras de LCR en los puntos de tiempo indicados y se midieron las concentraciones de estreptavidina mediante ELISA anti-estreptavidina en LCR (nd = no detectado). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, según la prueba ANOVA). (f) Comparación de la secuencia de aminoácidos del clon de péptido de fago más enriquecido n.° 2002 (púrpura) con otros clones de péptido de fago seleccionados de la cuarta ronda de selección. Los fragmentos de aminoácidos idénticos y similares están codificados por colores.
De todos los fagos enriquecidos en la cuarta ronda (Fig. 3b), se seleccionaron seis clones candidatos para un análisis individual posterior en el modelo de muestreo de LCR. Se inyectaron cantidades iguales de seis fagos candidatos, fagos vacíos (sin inserto) y bibliotecas de péptidos de profagos en tres animales CM canulados, y se determinó la farmacocinética en ensayos de LCR (Fig. 3c) y sangre (Fig. suplementaria 7). Todos los clones de fagos probados se dirigieron al compartimento del LCR a un nivel 10-1000 veces mayor que el del fago de control vacío (#1779). Por ejemplo, los clones #2020 y #2077 tuvieron títulos de LCR aproximadamente 1000 veces mayores que el fago de control. El perfil farmacocinético de cada péptido seleccionado es diferente, pero todos ellos tienen una alta capacidad de localización en el LCR. Observamos una disminución constante a lo largo del tiempo para los clones #1903 y #2011, mientras que para los clones #2077, #2002 y #2009 un aumento durante los primeros 10 minutos podría indicar transporte activo, pero necesita ser verificado. Los clones #2020, #2002 y #2077 se estabilizaron en niveles altos, mientras que la concentración de LCR del clon #2009 disminuyó lentamente después del aumento inicial. Luego comparamos la frecuencia relativa de cada candidato de LCR con su concentración en sangre (Fig. 3d). La correlación del título medio de cada candidato de LCR con su título en sangre en todos los tiempos de muestreo mostró que tres de los seis candidatos estaban significativamente enriquecidos en LCR sanguíneo. Curiosamente, el clon #2077 mostró mayor estabilidad en sangre (Figura suplementaria 7). Para confirmar que los péptidos son capaces de transportar activamente carga distinta a partículas de fago al compartimento del LCR, sintetizamos cuatro péptidos líderes derivados con biotina en el extremo N-terminal, donde los péptidos se unen a la partícula de fago. Los péptidos biotinilados (n.º 2002, 2009, 2020 y 2077) se conjugaron con estreptavidina (SA) para obtener formas multiméricas que imitan la geometría del fago. Este formato también nos permitió medir la exposición a SA en sangre y líquido cefalorraquídeo como péptidos proteicos transportadores de carga. Es importante destacar que los datos del fago a menudo se pudieron reproducir cuando se administraron péptidos sintéticos en este formato conjugado con SA (Fig. 3e). Los péptidos aleatorios tuvieron una menor exposición inicial y una eliminación más rápida del LCR, con niveles indetectables en 48 horas. Para comprender mejor las vías de administración de estos clones de fagos peptídicos en el espacio del LCR, analizamos la localización de péptidos de fagos individuales mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar directamente partículas de fagos 1 hora después de la inyección intravenosa in vivo. Cabe destacar que los clones #2002, #2077 y #2009 pudieron detectarse mediante una tinción intensa en los capilares cerebrales, mientras que el fago de control (#1779) y el clon #2020 no se detectaron (Figura suplementaria 8). Esto sugiere que estos péptidos contribuyen al efecto en el cerebro precisamente al atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). Se requiere un análisis más detallado para comprobar esta hipótesis, ya que la ruta de la barrera hematoencefálica también podría estar implicada. Al comparar la secuencia de aminoácidos del clon más enriquecido (#2002) con otros péptidos seleccionados, se observó que algunos de ellos tienen extensiones de aminoácidos similares, lo que podría indicar un mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Debido a su perfil plasmático único y al aumento significativo en LCR con el tiempo, el clon de fagos #2077 se exploró más a fondo durante un período más largo de 48 horas y pudo reproducir el rápido aumento en LCR observado en asociación con niveles sostenidos de SA (Fig. 4a). Con respecto a otros clones de fagos identificados, el #2077 se tiñó fuertemente para capilares cerebrales y mostró una colocalización significativa con la lectina marcadora capilar cuando se observó a mayor resolución y posiblemente cierta tinción en el espacio parenquimatoso (Figura 4b). Para investigar si se podrían obtener efectos farmacológicos mediados por péptidos en el SNC, realizamos un experimento en el que versiones biotiniladas de i) el péptido de tránsito #2077 y ii) el péptido inhibidor de BACE1 se mezclaron con SA en dos proporciones diferentes. Para una combinación usamos solo el péptido inhibidor de BACE1 y para la otra usamos una proporción 1:3 de péptido inhibidor de BACE1 a péptido #2077. Ambas muestras se administraron por vía intravenosa y se midieron los niveles de péptido beta-amiloide 40 (Abeta40) en sangre y líquido cefalorraquídeo a lo largo del tiempo. El Abeta40 se midió en el LCR, ya que refleja la inhibición de BACE1 en el parénquima cerebral. Como era de esperar, ambos complejos redujeron significativamente los niveles sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d). Sin embargo, solo las muestras que contenían una mezcla del péptido n.° 2077 y un inhibidor del péptido BACE1 conjugado con SA provocaron una disminución significativa de Abeta40 en el líquido cefalorraquídeo (Fig. 4c). Los datos muestran que el péptido n.° 2077 es capaz de transportar la proteína SA de 60 kDa al SNC y también induce efectos farmacológicos con inhibidores del péptido BACE1 conjugados con SA.
(a) Inyección clonal (2 × 10 fagos/animal) del fago T7 que muestra perfiles farmacocinéticos a largo plazo del péptido LCR n.° 2077 (RLSSVDSDLSGC) y fago de control no inyectado (n.° 1779) en al menos tres ratas intubadas con CM. (b) Imagen de microscopía confocal de microvasos corticales representativos en ratas inyectadas con fagos (2 × 10 10 fagos/animal) que muestra la contratinción del péptido n.° 2077 y vasos (lectina). Estos clones de fagos se administraron a 3 ratas y se dejaron circular durante 1 hora antes de la perfusión. Los cerebros se seccionaron y tiñeron con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra la cápside del fago T7. Diez minutos antes de la perfusión y la fijación posterior, se administró lectina marcada con DyLight594 por vía intravenosa. Imágenes fluorescentes que muestran tinción de lectina (rojo) del lado luminal de los microvasos y fagos (verde) en el lumen de los capilares y el tejido cerebral perivascular. La barra de escala corresponde a 10 µm. (c, d) El péptido inhibidor de BACE1 biotinilado solo o en combinación con el péptido de tránsito biotinilado n.° 2077 se acopló a estreptavidina seguido de inyección intravenosa en al menos tres ratas CM canuladas (10 mg de estreptavidina/kg). La reducción de Aβ40 mediada por el inhibidor peptídico de BACE1 se midió mediante ELISA de Aβ1-40 en sangre (rojo) y líquido cefalorraquídeo (naranja) en los puntos de tiempo indicados. Para mayor claridad, se ha dibujado una línea punteada en el gráfico a una escala del 100 %. c) Porcentaje de reducción de Aβ40 en sangre (triángulos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos naranjas) en ratas tratadas con estreptavidina conjugada al péptido de tránsito n.° 2077 y un péptido inhibidor de BACE1 en una proporción de 3:1. d) Porcentaje de reducción de Aβ40 en sangre (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (círculos naranjas) en ratas tratadas únicamente con estreptavidina acoplada a un péptido inhibidor de BACE1. La concentración de Aβ en el grupo control fue de 420 pg/ml (desviación estándar = 101 pg/ml).
La presentación de fagos se ha aplicado con éxito en varias áreas de la investigación biomédica17. Este método se ha utilizado para estudios de diversidad vascular in vivo18,19 así como para estudios dirigidos a vasos cerebrales20,21,22,23,24,25,26. En este estudio, extendimos la aplicación de este método de selección no solo a la identificación directa de péptidos dirigidos a vasos cerebrales, sino también al descubrimiento de candidatos con propiedades de transporte activo para cruzar la barrera hematoencefálica. Ahora describimos el desarrollo de un procedimiento de selección in vivo en ratas intubadas con CM y demostramos su potencial para identificar péptidos con propiedades de localización en el LCR. Utilizando el fago T7 que presenta una biblioteca de péptidos aleatorios de 12-mer, pudimos demostrar que el fago T7 es lo suficientemente pequeño (aproximadamente 60 nm de diámetro)10 como para adaptarse a la barrera hematoencefálica, cruzándola directamente o al plexo coroideo. Observamos que la extracción de LCR de ratas CM canuladas fue un método de cribado funcional in vivo bien controlado, y que el fago extraído no solo se unió a la vasculatura, sino que también funcionó como transportador a través de la barrera hematoencefálica. Además, al recolectar sangre simultáneamente y aplicar HTS a los fagos derivados del LCR y la sangre, confirmamos que nuestra elección de LCR no se vio influenciada por el enriquecimiento sanguíneo ni por la aptitud para la expansión entre rondas de selección. Sin embargo, el compartimento sanguíneo forma parte del procedimiento de selección, ya que los fagos capaces de alcanzar el compartimento del LCR deben sobrevivir y circular en el torrente sanguíneo el tiempo suficiente para enriquecerse en el cerebro. Para extraer información de secuencia fiable de los datos HTS brutos, implementamos filtros adaptados a los errores de secuenciación específicos de la plataforma en el flujo de trabajo de análisis. Al incorporar parámetros cinéticos en el método de cribado, confirmamos la farmacocinética rápida de los fagos T7 de tipo salvaje (t½ ~ 28 min) en sangre24, 27, 28 y también determinamos su vida media en el líquido cefalorraquídeo (t½ ~ 26 min) por minuto). A pesar de los perfiles farmacocinéticos similares en sangre y LCR, solo se pudo detectar el 0,001% de la concentración sanguínea del fago en el LCR, lo que indica una baja movilidad basal del fago T7 de tipo salvaje a través de la barrera hematoencefálica. Este trabajo destaca la importancia de la primera ronda de selección cuando se utilizan estrategias de selección in vivo, especialmente para sistemas de fagos que se eliminan rápidamente de la circulación, ya que pocos clones pueden llegar al compartimento del SNC. Por lo tanto, en la primera ronda, la reducción en la diversidad de la biblioteca fue muy grande, ya que solo se recolectó un número limitado de clones en este modelo de LCR tan estricto. Esta estrategia de selección in vivo incluyó varios pasos de selección, como la acumulación activa en el compartimento del LCR, la supervivencia de los clones en el compartimento sanguíneo y la eliminación rápida de los clones del fago T7 de la sangre en los primeros 10 minutos (Fig. 1d y Fig. suplementaria 4M). Por lo tanto, después de la primera ronda, se identificaron diferentes clones de fagos en el LCR, aunque se utilizó el mismo pool inicial para cada animal. Esto sugiere que múltiples pasos de selección estrictos para bibliotecas de origen con un gran número de miembros de la biblioteca dan como resultado una reducción significativa de la diversidad. Por lo tanto, los eventos aleatorios se convertirán en una parte integral del proceso de selección inicial, influyendo en gran medida en el resultado. Es probable que muchos de los clones en la biblioteca original tuvieran una propensión de enriquecimiento en el LCR muy similar. Sin embargo, incluso bajo las mismas condiciones experimentales, los resultados de la selección pueden diferir debido al pequeño número de cada clon en particular en el pool inicial.
Los motivos enriquecidos en LCR difieren de los de la sangre. Curiosamente, observamos el primer cambio hacia péptidos ricos en glicina en la sangre de animales individuales. (Fig. 1g, Figs. suplementarias 4e, 4f). Los fagos que contienen péptidos de glicina pueden ser más estables y menos propensos a ser eliminados de la circulación. Sin embargo, estos péptidos ricos en glicina no se detectaron en las muestras de líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que las bibliotecas curadas pasaron por dos pasos de selección diferentes: uno en la sangre y otro que se permitió acumularse en el líquido cefalorraquídeo. Los clones enriquecidos en LCR resultantes de la cuarta ronda de selección se han probado exhaustivamente. Casi todos los clones probados individualmente se confirmaron como enriquecidos en LCR en comparación con el fago de control en blanco. Un péptido identificado (#2077) se examinó con más detalle. Mostró una vida media plasmática más larga en comparación con otros resultados (Figura 3d y Figura suplementaria 7), e interesantemente, este péptido contenía un residuo de cisteína en el extremo C. Recientemente se ha demostrado que la adición de cisteína a los péptidos puede mejorar sus propiedades farmacocinéticas al unirse a la albúmina 29. Esto es actualmente desconocido para el péptido #2077 y requiere más estudio. Algunos péptidos mostraron una dependencia de valencia en el enriquecimiento de LCR (datos no mostrados), lo que puede estar relacionado con la geometría de superficie mostrada de la cápside T7. El sistema T7 que utilizamos mostró de 5 a 15 copias de cada péptido por partícula de fago. Se realizó IHC en clones de fagos candidatos principales inyectados por vía intravenosa en la corteza cerebral de ratas (Figura suplementaria 8). Los datos mostraron que al menos tres clones (n.° 2002, n.° 2009 y n.° 2077) interactuaron con la BBB. Queda por determinar si esta interacción con la BBB resulta en la acumulación de LCR o en el movimiento de estos clones directamente a la BCSFB. Es importante destacar que mostramos que los péptidos seleccionados conservan su capacidad de transporte de LCR cuando se sintetizan y se unen a la carga proteica. La unión de péptidos biotinilados N-terminales a SA reproduce esencialmente los resultados obtenidos con sus respectivos clones de fagos en sangre y líquido cefalorraquídeo (Fig. 3e). Finalmente, mostramos que el péptido principal #2077 es capaz de promover la acción cerebral de un inhibidor peptídico biotinilado de BACE1 conjugado a SA, causando efectos farmacodinámicos pronunciados en el SNC al reducir significativamente los niveles de Abeta40 en el LCR (Fig. 4). No pudimos identificar ningún homólogo en la base de datos al realizar una búsqueda de homología de secuencia peptídica de todos los resultados. Es importante destacar que el tamaño de la biblioteca T7 es de aproximadamente 10⁹, mientras que el tamaño teórico de la biblioteca para péptidos de 12 aminoácidos es de 4 x 10¹⁵. Por lo tanto, solo seleccionamos una pequeña fracción del espacio de diversidad de la biblioteca de péptidos de 12 aminoácidos, lo que podría significar que se pueden identificar péptidos más optimizados evaluando el espacio de secuencias adyacentes de estos resultados. Hipotéticamente, una de las razones por las que no hemos encontrado homólogos naturales de estos péptidos podría ser la deselección durante la evolución para evitar la entrada incontrolada de ciertos motivos peptídicos en el cerebro.
En conjunto, nuestros resultados proporcionan una base para futuros trabajos que permitan identificar y caracterizar con mayor detalle los sistemas de transporte de la barrera cerebrovascular in vivo. La configuración básica de este método se basa en una estrategia de selección funcional que no solo identifica clones con propiedades de unión vascular cerebral, sino que también incluye un paso crítico en el que los clones exitosos poseen actividad intrínseca para atravesar barreras biológicas in vivo hacia el compartimento del SNC. El objetivo es dilucidar el mecanismo de transporte de estos péptidos y su preferencia por la unión a la microvasculatura específica de la región cerebral. Esto podría conducir al descubrimiento de nuevas vías para el transporte a través de la BHE y los receptores. Esperamos que los péptidos identificados puedan unirse directamente a receptores cerebrovasculares o a ligandos circulantes transportados a través de la BHE o la BCSFB. Los vectores peptídicos con actividad de transporte de LCR descubiertos en este trabajo serán objeto de una investigación más profunda. Actualmente estamos investigando la especificidad cerebral de estos péptidos para su capacidad de atravesar la BHE y/o la BCSFB. Estos nuevos péptidos serán herramientas de gran valor para el posible descubrimiento de nuevos receptores o vías de señalización, así como para el desarrollo de nuevas plataformas altamente eficientes para la administración de macromoléculas, como productos biológicos, al cerebro.
Canular la cisterna mayor (CM) mediante una modificación del método descrito previamente. Ratas Wistar anestesiadas (200-350 g) fueron montadas en un aparato estereotáxico y se realizó una incisión mediana sobre el cuero cabelludo afeitado y preparado asépticamente para exponer el cráneo. Perforar dos orificios en el área de la faja superior y fijar los tornillos de fijación en los orificios. Se perforó un orificio adicional en la cresta occipital lateral para la guía estereotáctica de una cánula de acero inoxidable hacia la CM. Aplicar cemento dental alrededor de la cánula y asegurar con tornillos. Después del fotopolimerizado y el endurecimiento del cemento, la herida de la piel se cerró con sutura supramid 4/0. La correcta colocación de la cánula se confirma por la fuga espontánea de líquido cefalorraquídeo (LCR). Retirar la rata del aparato estereotáxico, proporcionar los cuidados postoperatorios y el control del dolor adecuados, y permitirle recuperarse durante al menos una semana hasta que se observen signos de sangre en el líquido cefalorraquídeo. Se obtuvieron ratas Wistar (Crl:WI/Han) de Charles River (Francia). Todas las ratas se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria de la Ciudad de Basilea, Suiza, y se realizaron de acuerdo con la Licencia Animal n.° 2474 (Evaluación del transporte cerebral activo mediante la medición de los niveles de candidatos terapéuticos en el líquido cefalorraquídeo y el cerebro de la rata).
Mantenga a la rata consciente con cuidado, sosteniendo la cánula CM. Retire Datura de la cánula y recoja 10 µl de líquido cefalorraquídeo que fluya espontáneamente. Dado que la permeabilidad de la cánula se vio comprometida, solo se incluyeron en este estudio muestras de líquido cefalorraquídeo transparentes, sin evidencia de contaminación sanguínea ni decoloración. Paralelamente, se extrajeron aproximadamente 10–20 µl de sangre mediante una pequeña incisión en la punta de la cola, en tubos con heparina (Sigma-Aldrich). Se recolectaron LCR y sangre en diferentes momentos después de la inyección intravenosa del fago T7. Se desecharon aproximadamente 5–10 µl de líquido antes de cada muestra de LCR, lo que corresponde al volumen muerto del catéter.
Las bibliotecas se generaron utilizando el vector T7Select 10-3b, tal como se describe en el manual del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). En resumen, se sintetizó un inserto de ADN aleatorio de 12 nucleótidos en el siguiente formato:
El codón NNK se utilizó para evitar codones de parada dobles y sobreexpresión de aminoácidos en el inserto. N es una proporción equimolar mezclada manualmente de cada nucleótido, y K es una proporción equimolar mezclada manualmente de nucleótidos de adenina y citosina. Las regiones monocatenarias se convirtieron en ADN bicatenario mediante una incubación adicional con dNTP (Novagen) y enzima Klenow (New England Biolabs) en tampón Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37 °C. Después de la reacción, el ADN bicatenario se recuperó por precipitación con EtOH. El ADN resultante se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII (ambas de Roche). El inserto escindido y purificado (QIAquick, Qiagen) (ligasa T4, New England Biolabs) se ligó en fase en un vector T7 preescindido después del aminoácido 348 del gen de la cápside 10B. Las reacciones de ligación se incubaron a 16 °C durante 18 horas antes del empaquetamiento in vitro. El empaquetamiento de fagos in vitro se realizó según las instrucciones del kit de clonación T7Select 10-3b (Novagen) y la solución de empaquetamiento se amplificó una vez hasta la lisis con Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Los lisados ​​se centrifugaron, se titularon y se congelaron a -80 °C como solución madre de glicerol.
Amplificación directa por PCR de regiones variables de fagos amplificadas en caldo o placa utilizando cebadores de fusión 454/Roche-amplicón patentados. El cebador de fusión directo contiene secuencias que flanquean la región variable (NNK) 12 (específicas de la plantilla), el adaptador GS FLX Titanium A y una secuencia clave de biblioteca de cuatro bases (TCAG) (Figura suplementaria 1a):
El cebador de fusión inversa también contiene biotina unida a microesferas de captura y el adaptador GS FLX Titanium B necesario para la amplificación clonal durante la PCR en emulsión:
Los amplicones se sometieron posteriormente a pirosecuenciación 454/Roche según el protocolo 454 GS-FLX Titanium. Para la secuenciación Sanger manual (analizador de ADN Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), el ADN del fago T7 se amplificó mediante PCR y se secuenció con los siguientes pares de cebadores:
Los fragmentos extraídos de cada placa se sometieron a amplificación por PCR utilizando el kit Roche Fast Start DNA Polymerase (siguiendo las instrucciones del fabricante). Realice un ciclo de precalentamiento (10 min a 95 °C) y 35 ciclos de refuerzo (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C).
Los fagos de bibliotecas, los fagos de tipo salvaje, los fagos rescatados del LCR y la sangre, o los clones individuales se amplificaron en Escherichia coli BL5615 en caldo TB (Sigma Aldrich) o en placas de 500 cm² (Thermo Scientific) durante 4 h a 37 °C. Los fagos se extrajeron de las placas lavándolas con tampón Tris-EDTA (Fluka Analytical) o recogiendo las placas con puntas de pipeta estériles. Los fagos se aislaron del sobrenadante del cultivo o del tampón de extracción con una ronda de precipitación con polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) y se resuspendieron en tampón Tris-EDTA.
El fago amplificado se sometió a 2-3 rondas de eliminación de endotoxinas utilizando perlas de eliminación de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes de la inyección intravenosa (IV) (500 μl/animal). En la primera ronda, se introdujeron 2×10¹² fagos; en la segunda, 2×10¹⁰ fagos; en la tercera y cuarta rondas de selección, 2×10⁹ fagos por animal. El contenido de fagos en muestras de LCR y sangre recolectadas en los puntos de tiempo indicados se determinó mediante recuento de placas según las instrucciones del fabricante (manual del sistema T7Select). La selección de fagos se realizó mediante inyección intravenosa de bibliotecas purificadas en la vena de la cola o mediante reinyección de fagos extraídos del LCR de la ronda de selección anterior, y las cosechas posteriores se realizaron a los 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min y 240 min respectivamente de muestras de LCR y sangre. Se realizaron un total de cuatro rondas de selección in vivo en las que las dos ramas seleccionadas se almacenaron y analizaron por separado durante las tres primeras rondas de selección. Todos los insertos de fagos extraídos del LCR de las dos primeras rondas de selección se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche, mientras que todos los clones extraídos del LCR de las dos últimas rondas de selección se secuenciaron manualmente. Todos los fagos sanguíneos de la primera ronda de selección también se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche. Para la inyección de clones de fagos, los fagos seleccionados se amplificaron en E. coli (BL5615) en placas de 500 cm2 a 37 °C durante 4 horas. Los clones seleccionados individualmente y secuenciados manualmente se propagaron en medio TB. Después de la extracción, purificación y eliminación de endotoxinas de los fagos (como se describió anteriormente), se inyectaron 2 × 10¹⁰ fagos/animal en 300 μl por vía intravenosa en una vena de la cola.
Preprocesamiento y filtrado cualitativo de datos de secuencia. Los datos brutos de 454/Roche se convirtieron de un formato binario estándar de mapa de flujo (sff) a un formato legible por humanos de Pearson (fasta) utilizando software del proveedor. El procesamiento adicional de la secuencia de nucleótidos se realizó utilizando programas y scripts C propietarios (paquete de software no publicado) como se describe a continuación. El análisis de datos primarios incluye procedimientos estrictos de filtrado de múltiples etapas. Para filtrar las lecturas que no contenían una secuencia de ADN insertada válida de 12 mer, las lecturas se alinearon secuencialmente a la etiqueta de inicio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), la etiqueta de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) y el inserto de fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizando la prueba global de Needleman-Wunsch. alineación que permite hasta 2 inconsistencias por alineación31. Por lo tanto, las lecturas sin etiquetas de inicio y parada y las lecturas que contienen insertos de fondo, es decir, las alineaciones que exceden el número permitido de desajustes, se eliminaron de la biblioteca. En cuanto a las lecturas restantes, la secuencia de ADN N-mer que se extiende desde la marca de inicio hasta antes de la marca de parada se extrajo de la secuencia de lectura original y se procesó posteriormente (en adelante, "inserto"). Tras la traducción del inserto, se eliminó la porción posterior al primer codón de parada en el extremo 5' del cebador. Además, también se eliminaron los nucleótidos que daban lugar a codones incompletos en el extremo 3' del cebador. Para excluir los insertos que contenían únicamente secuencias de fondo, también se eliminaron los insertos traducidos que comenzaban con el patrón de aminoácidos "PAG". Se eliminaron de la biblioteca los péptidos con una longitud postraduccional inferior a 3 aminoácidos. Finalmente, se eliminó la redundancia en el conjunto de insertos y se determinó la frecuencia de cada inserto único. Los resultados de este análisis incluyeron una lista de secuencias de nucleótidos (insertos) y sus frecuencias (de lectura) (Figuras suplementarias 1c y 2).
Agrupar inserciones de ADN N-mer por similitud de secuencia: Para eliminar errores de secuenciación específicos de 454/Roche (como problemas con la secuenciación de extensiones de homopolímeros) y eliminar redundancias menos importantes, las inserciones de secuencias de ADN N-mer previamente filtradas (inserciones) se ordenan por similitud. inserciones (hasta 2 bases no coincidentes permitidas) usando un algoritmo iterativo definido de la siguiente manera: las inserciones se ordenan primero por su frecuencia (de mayor a menor) y, si son iguales, por su ordenación secundaria por longitud (de mayor a menor). Así, las inserciones más frecuentes y más largas definen el primer "grupo". La frecuencia del grupo se establece en la frecuencia clave. Luego, cada inserción restante en la lista ordenada se intentó agregar al grupo mediante alineación por pares de Needleman-Wunsch. Si el número de desajustes, inserciones o deleciones en una alineación no supera un umbral de 2, una inserción se agrega al grupo y la frecuencia general del grupo aumenta según la frecuencia con la que se agregó la inserción. Las inserciones añadidas a un grupo se marcan como usadas y se excluyen del procesamiento posterior. Si la secuencia de inserción no puede añadirse a un grupo ya existente, se utiliza para crear un nuevo grupo con la frecuencia de inserción adecuada y se marca como usada. La iteración finaliza cuando cada secuencia de inserción se ha utilizado para formar un nuevo grupo o puede incluirse en uno ya existente. En definitiva, las inserciones agrupadas, compuestas por nucleótidos, se traducen finalmente en secuencias de péptidos (bibliotecas de péptidos). El resultado de este análisis es un conjunto de inserciones y sus frecuencias correspondientes que conforman el número de lecturas consecutivas (Figura suplementaria 2).
Generación de motivos: A partir de una lista de péptidos únicos, se creó una biblioteca que contenía todos los patrones de aminoácidos posibles (aa), como se muestra a continuación. Cada patrón posible de longitud 3 se extrajo del péptido y se añadió su patrón inverso junto con una biblioteca de motivos comunes que contenía todos los patrones (tripéptidos). Se secuenciaron bibliotecas de motivos altamente repetitivos y se eliminó la redundancia. Luego, para cada tripéptido en la biblioteca de motivos, se verificó su presencia en la biblioteca utilizando herramientas computacionales. En este caso, se añade la frecuencia del péptido que contiene el tripéptido del motivo encontrado y se asigna al motivo en la biblioteca de motivos ("número de motivos"). El resultado de la generación de motivos es una matriz bidimensional que contiene todas las ocurrencias de tripéptidos (motivos) y sus respectivos valores, que son el número de lecturas de secuenciación que dan como resultado el motivo correspondiente cuando las lecturas se filtran, agrupan y traducen. Métricas como se describe en detalle anteriormente.
Normalización del número de motivos y diagramas de dispersión correspondientes: El número de motivos para cada muestra se normalizó utilizando
donde ni es el número de lecturas que contienen el tema i. Por lo tanto, vi representa la frecuencia porcentual de lecturas (o péptidos) que contienen el motivo i en la muestra. Los valores p para el número de motivos no normalizado se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher. En cuanto a los correlogramas del número de motivos, se calcularon las correlaciones de Spearman utilizando el número de motivos normalizado con R.
Para visualizar el contenido de aminoácidos en cada posición de la biblioteca de péptidos, se crearon los logogramas web 32 y 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Primero, el contenido de aminoácidos en cada posición del péptido de 12 nucleótidos se almacena en una matriz de 20×12. Luego, se genera un conjunto de 1000 péptidos con el mismo contenido relativo de aminoácidos en cada posición en formato fasta-sequence y se proporciona como entrada al logograma web 3, que genera una representación gráfica del contenido relativo de aminoácidos en cada posición para una biblioteca de péptidos dada. Para visualizar conjuntos de datos multidimensionales, se crearon mapas de calor utilizando una herramienta desarrollada internamente en R (biosHeatmap, un paquete de R aún no publicado). Los dendrogramas presentados en los mapas de calor se calcularon utilizando el método de agrupamiento jerárquico de Ward con la métrica de distancia euclidiana. Para el análisis estadístico de los datos de puntuación de motivos, se calcularon los valores p para la puntuación no normalizada utilizando la prueba exacta de Fisher. Los valores p para otros conjuntos de datos se calcularon en R utilizando la prueba t de Student o ANOVA.
Se inyectaron por vía intravenosa clones de fagos seleccionados y fagos sin insertos a través de la vena de la cola (2 × 10¹⁰ fagos/animal en 300 μl de PBS). Diez minutos antes de la perfusión y la posterior fijación, a los mismos animales se les inyectaron por vía intravenosa 100 μl de lectina marcada con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Sesenta minutos después de la inyección de fagos, las ratas fueron perfundidas a través del corazón con 50 ml de PBS seguido de 50 ml de PFA/PBS al 4%. Las muestras de cerebro se fijaron adicionalmente durante la noche en PFA/PBS al 4% y se sumergieron en sacarosa al 30% durante la noche a 4 °C. Las muestras se congelaron rápidamente en la mezcla OCT. Se realizó un análisis inmunohistoquímico de muestras congeladas a temperatura ambiente en criosecciones de 30 µm bloqueadas con BSA al 1 % e incubadas con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra el fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. La incubación duró toda la noche. Finalmente, las secciones se lavaron tres veces con PBS y se examinaron con un microscopio láser confocal (Leica TCS SP5).
Todos los péptidos, con una pureza mínima del 98%, fueron sintetizados por GenScript USA, biotinilados y liofilizados. La biotina se une mediante un espaciador triple de glicina adicional en el extremo N-terminal. Se verificaron todos los péptidos mediante espectrometría de masas.
La estreptavidina (Sigma S0677) se mezcló con un exceso equimolar de 5 veces de péptido biotinilado, péptido inhibidor de BACE1 biotinilado o una combinación (proporción 3:1) de péptido inhibidor de BACE1 biotinilado y péptido inhibidor de BACE1 en DMSO al 5-10%/incubado en PBS. 1 hora a temperatura ambiente antes de la inyección. Los péptidos conjugados con estreptavidina se inyectaron por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg en una de las venas de la cola de ratas con cavidad cerebral.
La concentración de complejos estreptavidina-péptido se evaluó mediante ELISA. Las placas de microtitulación Nunc Maxisorp (Sigma) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 1,5 μg/ml de anticuerpo anti-estreptavidina de ratón (Thermo, MA1-20011). Después del bloqueo (tampón de bloqueo: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatina, 1 % BSA) a temperatura ambiente durante 2 horas, lave la placa con 0,05 % Tween-20/PBS (tampón de lavado) durante 3 segundos, se añadieron muestras de LCR y plasma a los pocillos diluidas con tampón de bloqueo (plasma 1:10.000, LCR 1:115). La placa se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo de detección (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Tras tres lavados, se detectó la estreptavidina mediante incubación en solución de sustrato TMB (Roche) durante un máximo de 20 minutos. Después de detener el desarrollo del color con H2SO4 1M, se midió la absorbancia a 450 nm.
La función del complejo inhibidor de estreptavidina-péptido-BACE1 se evaluó mediante ELISA de Aβ(1-40) según el protocolo del fabricante (Wako, 294-64701). Brevemente, las muestras de LCR se diluyeron en diluyente estándar (1:23) y se incubaron durante la noche a 4 °C en placas de 96 pocillos recubiertas con el anticuerpo de captura BNT77. Después de cinco pasos de lavado, se añadió el anticuerpo BA27 conjugado con HRP y se incubó durante 2 horas a 4 °C, seguido de cinco pasos de lavado. El Aβ(1–40) se detectó mediante incubación en solución de TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de detener el desarrollo del color con la solución de parada, se midió la absorbancia a 450 nm. Las muestras de plasma se sometieron a extracción en fase sólida antes del ELISA de Aβ(1–40). El plasma se añadió a DEA al 0,2 % (Sigma) en placas de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras lavar sucesivamente las placas SPE (Oasis, 186000679) con agua y metanol al 100%, se añadieron muestras de plasma a las placas y se eliminó todo el líquido. Las muestras se lavaron (primero con metanol al 5% y luego con metanol al 30%) y se eluyeron con NH4OH al 2%/metanol al 90%. Tras secar el eluato a 55 °C durante 99 minutos con una corriente constante de N2, las muestras se redujeron en diluyentes estándar y se midió Aβ(1–40) como se describió anteriormente.
Cómo citar este artículo: Urich, E. et al. Entrega de carga al cerebro mediante péptidos de tránsito identificados in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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