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La barrera hematoencefálica impide que los agentes bioterapéuticos alcancen sus dianas en el sistema nervioso central, lo que dificulta el tratamiento eficaz de las enfermedades neurológicas. Para descubrir nuevos transportadores cerebrales in vivo, introdujimos una biblioteca de péptidos del fago T7 y recolectamos sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) en serie utilizando un modelo de rata canulada de gran tamaño y consciente. Los clones de fagos específicos mostraron un alto enriquecimiento en LCR tras cuatro rondas de selección. Las pruebas de péptidos candidatos individuales revelaron un enriquecimiento de más de 1000 veces en LCR. La bioactividad de la administración mediada por péptidos al cerebro se confirmó mediante una reducción del 40 % en el nivel de amiloide-β en el líquido cefalorraquídeo utilizando un inhibidor peptídico de BACE1 vinculado al nuevo péptido de tránsito identificado. Estos resultados sugieren que los péptidos identificados mediante métodos de selección de fagos in vivo podrían ser vehículos útiles para la administración sistémica de macromoléculas al cerebro con un efecto terapéutico.
La investigación en terapias dirigidas al sistema nervioso central (SNC) se ha centrado principalmente en la identificación de fármacos y agentes optimizados que presenten propiedades dirigidas al SNC, con menor esfuerzo en el descubrimiento de los mecanismos que impulsan la administración activa de fármacos al cerebro. Esto está empezando a cambiar, ya que la administración de fármacos, especialmente de moléculas grandes, es parte integral del desarrollo de fármacos en la neurociencia moderna. El entorno del sistema nervioso central está bien protegido por el sistema de barrera cerebrovascular, compuesto por la barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica (BCBB)1, lo que dificulta la administración de fármacos al cerebro1,2. Se estima que casi todos los fármacos de moléculas grandes y más del 98% de los fármacos de moléculas pequeñas se eliminan del cerebro3. Por ello, es fundamental identificar nuevos sistemas de transporte cerebral que proporcionen una administración eficiente y específica de fármacos terapéuticos al SNC4,5. Sin embargo, la BHE y la BCBB también representan una excelente oportunidad para la administración de fármacos, ya que estos penetran y entran en todas las estructuras del cerebro a través de su extensa vasculatura. Por lo tanto, los esfuerzos actuales para utilizar métodos no invasivos de administración al cerebro se basan principalmente en el mecanismo de transporte mediado por receptores (PMT) utilizando el receptor endógeno BBB6. A pesar de los recientes avances clave en el uso de la vía del receptor de transferrina7,8, se requiere un mayor desarrollo de nuevos sistemas de administración con propiedades mejoradas. Con este fin, nuestro objetivo fue identificar péptidos capaces de mediar el transporte del LCR, ya que en principio podrían usarse para administrar macromoléculas al SNC o para abrir nuevas vías receptoras. En particular, los receptores y transportadores específicos del sistema cerebrovascular (BHE y BSCFB) pueden servir como dianas potenciales para la administración activa y específica de fármacos bioterapéuticos. El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un producto de secreción del plexo coroideo (SC) y está en contacto directo con el líquido intersticial del cerebro a través del espacio subaracnoideo y el espacio ventricular4. Recientemente se ha demostrado que el líquido cefalorraquídeo subaracnoideo se difunde excesivamente en el intersticio del cerebro9. Esperamos acceder al espacio parenquimatoso mediante este tracto de entrada subaracnoideo o directamente a través de la BHE. Para lograrlo, implementamos una robusta estrategia de selección de fagos in vivo que identifica de forma ideal los péptidos transportados por cualquiera de estas dos vías distintas.
Ahora describimos un método de cribado secuencial de presentación de fagos in vivo con muestreo de LCR acoplado con secuenciación de alto rendimiento (HTS) para monitorear las rondas de selección iniciales con la mayor diversidad de biblioteca. El cribado se realizó en ratas conscientes con una cánula de cisterna grande (CM) implantada permanentemente para evitar la contaminación de la sangre. Es importante destacar que este enfoque selecciona tanto péptidos dirigidos al cerebro como péptidos con actividad de transporte a través de la barrera cerebrovascular. Usamos fagos T7 debido a su pequeño tamaño (~60 nm)10 y sugerimos que son adecuados para el transporte de vesículas que permiten el cruce transcelular de la barrera endotelial y/o epitelio-medular. Después de cuatro rondas de cribado, se aislaron poblaciones de fagos que mostraron un fuerte enriquecimiento de LCR in vivo y asociación de microvasos cerebrales. Es importante destacar que pudimos confirmar nuestros hallazgos al demostrar que los mejores péptidos candidatos preferidos y sintetizados químicamente son capaces de transportar carga proteica al líquido cefalorraquídeo. En primer lugar, se establecieron los efectos farmacodinámicos del SNC mediante la combinación de un péptido de tránsito líder con un inhibidor del péptido BACE1. Además de demostrar que las estrategias de cribado funcional in vivo pueden identificar nuevos péptidos de transporte cerebral como transportadores de carga proteica eficaces, esperamos que enfoques de selección funcional similares también adquieran importancia para identificar nuevas vías de transporte cerebral.
Basándonos en las unidades formadoras de placa (UFP), tras el empaquetamiento del fago, se diseñó y creó una biblioteca de péptidos lineales aleatorios de fagos T7 de 12 meros con una diversidad aproximada de 109 (véase Materiales y métodos). Cabe destacar que analizamos cuidadosamente esta biblioteca antes del cribado in vivo. La amplificación por PCR de muestras de la biblioteca de fagos utilizando cebadores modificados generó amplicones directamente aplicables a HTS (Fig. 1a del Suplemento). Debido a: a) errores de secuenciación de HTS11, b) el impacto en la calidad de los cebadores (NNK)1-12, y c) la presencia de fagos silvestres (insertos de esqueleto) en la biblioteca de reserva, se implementó un procedimiento de filtrado de secuencias para extraer únicamente la información de secuencia verificada (Fig. 1b del Suplemento). Estos pasos de filtrado se aplican a todas las bibliotecas de secuenciación de HTS. Para la biblioteca estándar, se obtuvo un total de 233.868 lecturas, de las cuales el 39% pasó los criterios de filtro y se utilizaron para el análisis de la biblioteca y la selección para rondas posteriores (Figura Suplementaria 1c–e). Las lecturas fueron predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de longitud con un pico a 36 nucleótidos (Fig. Suplementaria 1c), lo que confirma el diseño de la biblioteca (NNK) 1-12. Cabe destacar que aproximadamente el 11% de los miembros de la biblioteca contenían un inserto PAGISRELVDKL de tipo silvestre (wt) de 12 dimensiones, y casi la mitad de las secuencias (49%) contenían inserciones o deleciones. El HTS de la biblioteca confirmó la alta diversidad de péptidos en la biblioteca: más del 81% de las secuencias de péptidos se encontraron solo una vez y solo el 1,5% se presentó en ≥4 copias (Fig. Suplementaria 2a). Las frecuencias de aminoácidos (aa) en las 12 posiciones del repertorio se correlacionaron bien con las frecuencias esperadas para el número de codones generados por el repertorio NKK degenerado (Fig. 2b suplementaria). La frecuencia observada de residuos aa codificados por estos insertos se correlacionó bien con la frecuencia calculada (r = 0,893) (Fig. 2c suplementaria). La preparación de bibliotecas de fagos para inyección incluye los pasos de amplificación y eliminación de endotoxina. Se ha demostrado previamente que esto reduce potencialmente la diversidad de las bibliotecas de fagos12,13. Por lo tanto, secuenciamos una biblioteca de fagos amplificada en placa que se había sometido a la eliminación de endotoxina y la comparamos con la biblioteca original para estimar la frecuencia de AA. Se observó una fuerte correlación (r = 0,995) entre el grupo original y el grupo amplificado y purificado (Fig. 2d suplementaria), lo que indica que la competencia entre clones amplificados en placas utilizando fagos T7 no causó un sesgo importante. Esta comparación se basa en la frecuencia de los motivos tripéptidos en cada biblioteca, ya que la diversidad de las bibliotecas (~109) no puede capturarse completamente ni siquiera con HTS. El análisis de frecuencia de aa en cada posición reveló un pequeño sesgo dependiente de la posición en las tres últimas posiciones del repertorio introducido (Fig. 2e del Suplemento). En conclusión, concluimos que la calidad y la diversidad de la biblioteca eran aceptables y que solo se observaron cambios menores en la diversidad debido a la amplificación y preparación de las bibliotecas de fagos entre varias rondas de selección.
El muestreo seriado de líquido cefalorraquídeo puede realizarse mediante la implantación quirúrgica de una cánula en el CM de ratas conscientes para facilitar la identificación del fago T7 inyectado por vía intravenosa (iv) a través de la BHE y/o la BCSFB (Fig. 1a-b). Se utilizaron dos brazos de selección independientes (brazos A y B) en las tres primeras rondas de selección in vivo (Fig. 1c). Se incrementó gradualmente la rigurosidad de la selección disminuyendo la cantidad total de fago introducido en las tres primeras rondas de selección. Para la cuarta ronda de cribado, se combinaron muestras de las ramas A y B y se realizaron tres selecciones independientes adicionales. Para estudiar las propiedades in vivo de las partículas de fago T7 en este modelo, se inyectó el fago silvestre (inserto maestro PAGISRELVDKL) en ratas a través de la vena de la cola. La recuperación de fagos del líquido cefalorraquídeo y la sangre en diferentes puntos temporales mostró que los fagos icosaédricos T7 relativamente pequeños tuvieron una fase inicial de depuración rápida del compartimento sanguíneo (Fig. 3 suplementaria). Con base en los títulos administrados y el volumen sanguíneo de las ratas, calculamos que solo se detectó aproximadamente el 1% en peso del fago de la dosis administrada en la sangre 10 minutos después de la inyección intravenosa. Después de esta rápida disminución inicial, se midió un aclaramiento primario más lento con una vida media de 27,7 minutos. Es importante destacar que solo se recuperaron muy pocos fagos del compartimento del LCR, lo que indica un fondo bajo para la migración del fago de tipo silvestre al compartimento del LCR (Fig. 3 suplementaria). En promedio, solo se detectaron alrededor de 1 x 10-3% de títulos de fago T7 en la sangre y 4 x 10-8% de los fagos infundidos inicialmente en el líquido cefalorraquídeo durante todo el período de muestreo (0-250 min). En particular, la vida media (25,7 min) del fago de tipo silvestre en el líquido cefalorraquídeo fue similar a la observada en la sangre. Estos datos demuestran que la barrera que separa el compartimento del LCR de la sangre está intacta en ratas canuladas con CM, lo que permite la selección in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que se transportan fácilmente desde la sangre al compartimento del LCR.
(a) Configuración de un método para volver a muestrear líquido cefalorraquídeo (LCR) de un pool grande. (b) Diagrama que muestra la localización celular de la barrera del sistema nervioso central (SNC) y la estrategia de selección utilizada para identificar péptidos que cruzan la barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica. (c) Diagrama de flujo de cribado por visualización de fagos in vivo. En cada ronda de selección, se inyectaron fagos (identificadores de animales dentro de las flechas) por vía intravenosa. Dos ramas alternativas independientes (A, B) se mantienen por separado hasta la cuarta ronda de selección. Para las rondas de selección 3 y 4, cada clon de fago extraído del LCR se secuenció manualmente. (d) Cinética del fago aislado de sangre (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos verdes) durante la primera ronda de selección en dos ratas canuladas tras la inyección intravenosa de la biblioteca de péptidos T7 (2 x 1012 fagos/animal). Los cuadrados azules indican la concentración inicial promedio de fago en la sangre, calculada a partir de la cantidad de fago inyectado, teniendo en cuenta el volumen sanguíneo total. Los cuadrados negros indican el punto de intersección de la línea y extrapolada a partir de las concentraciones de fago en sangre. (e,f) Presente la frecuencia relativa y la distribución de todos los posibles motivos tripéptidos superpuestos encontrados en el péptido. Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas. Los motivos significativamente enriquecidos (p < 0,001) están marcados con puntos rojos. (e) Diagrama de dispersión de correlación que compara la frecuencia relativa del motivo tripéptido de la biblioteca inyectada con el fago derivado de sangre de los animales n.º 1.1 y n.º 1.2. (f) Diagrama de dispersión de correlación que compara las frecuencias relativas de los motivos tripéptidos del fago animal n.º 1.1 y n.º 1.2 aislados en sangre y líquido cefalorraquídeo. (g, h) Representación del ID de secuencia del fago enriquecido en sangre (g) frente a las bibliotecas inyectadas, y del fago enriquecido en LCR (h) frente a la sangre, tras una ronda de selección in vivo en ambos animales. El tamaño del código de una letra indica la frecuencia con la que aparece ese aminoácido en esa posición. Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrofóbicos. Las figuras 1a y 1b fueron diseñadas y producidas por Eduard Urich.
Inyectamos una biblioteca de péptidos de fagos en dos ratas de instrumento CM (clados A y B) y aislamos el fago del líquido cefalorraquídeo y la sangre (Figura 1d). La rápida depuración inicial de la biblioteca fue menos pronunciada en comparación con el fago de tipo silvestre. La vida media media de la biblioteca inyectada en ambos animales fue de 24,8 minutos en sangre, similar al fago de tipo silvestre, y de 38,5 minutos en LCR. Las muestras de fagos de sangre y líquido cefalorraquídeo de cada animal se sometieron a HTS y todos los péptidos identificados se analizaron para la presencia de un motivo tripéptido corto. Los motivos tripéptidos se eligieron porque proporcionan una base mínima para la formación de la estructura y las interacciones péptido-proteína14,15. Encontramos una buena correlación en la distribución de motivos entre la biblioteca de fagos inyectada y los clones extraídos de la sangre de ambos animales (Fig. 1e). Los datos indican que la composición de la biblioteca solo está marginalmente enriquecida en el compartimento sanguíneo. Las frecuencias de aminoácidos y las secuencias consenso se analizaron con más detalle en cada posición mediante una adaptación del software Weblogo16. Curiosamente, se observó un fuerte enriquecimiento de residuos de glicina en sangre (Fig. 1g). Al comparar la sangre con clones seleccionados del LCR, se observó una fuerte selección y cierta deselección de motivos (Fig. 1f), y ciertos aminoácidos se presentaron preferentemente en posiciones predeterminadas en el fragmento de 12 miembros (Fig. 1h). Cabe destacar que los animales individuales presentaron diferencias significativas en el líquido cefalorraquídeo, mientras que se observó un enriquecimiento de glicina en sangre en ambos animales (Fig. 4a-j del Suplemento). Tras un filtrado riguroso de los datos de secuencia en el líquido cefalorraquídeo de los animales n.° 1.1 y n.° 1.2, se obtuvieron un total de 964 y 420 péptidos únicos de 12 meros (Fig. 1d-e del Suplemento). Los clones de fago aislados se amplificaron y se sometieron a una segunda ronda de selección in vivo. Los fagos extraídos de la segunda ronda de selección se sometieron a HTS en cada animal, y todos los péptidos identificados se utilizaron como entrada para un programa de reconocimiento de motivos para analizar la presencia de motivos tripéptidos (Fig. 2a, b, ef). En comparación con el primer ciclo del fago recuperado del LCR, se observó una mayor selección y deselección de muchos motivos en el LCR en las ramas A y B (Fig. 2). Se aplicó un algoritmo de identificación de redes para determinar si representaban diferentes patrones de secuencia consistente. Se observó una clara similitud entre las secuencias de 12 dimensiones recuperadas por el LCR en el clado alternativo A (Fig. 2c, d) y el clado B (Fig. 2g, h). El análisis agrupado en cada rama reveló diferentes perfiles de selección para los péptidos de 12 meros (Fig. 5c, d suplementaria) y un aumento en la relación del título de LCR/sangre a lo largo del tiempo para los clones agrupados después de la segunda ronda de selección, en comparación con la primera ronda de selección (Fig. 5e suplementaria).
Enriquecimiento de motivos y péptidos en el líquido cefalorraquídeo mediante dos rondas sucesivas de selección mediante visualización de fagos funcionales in vivo.
Todos los fagos del líquido cefalorraquídeo recuperados de la primera ronda de cada animal (animales n.º 1.1 y n.º 1.2) se agruparon, amplificaron, secuenciaron por HT y se reinyectaron juntos (2 x 1010 fagos/animal) 2 ratas canuladas SM (n.º 1.1 → n.º 2.1 y 2.2, 1.2 → 2.3 y 2.4). (a, b, e, f) Diagramas de dispersión de correlación que comparan la frecuencia relativa de los motivos tripéptidos de todos los fagos derivados del LCR en la primera y la segunda rondas de selección. Frecuencia relativa y distribución de los motivos que representan todos los posibles tripéptidos superpuestos encontrados en péptidos en ambas orientaciones. Se muestra el número de motivos encontrados en 1000 lecturas. Los motivos que se seleccionaron o excluyeron significativamente (p < 0,001) en una de las bibliotecas comparadas se resaltan con puntos rojos. (c, d, g, h) Representación del logotipo de la secuencia de todas las secuencias de 12 aminoácidos de longitud ricas en LCR basadas en las rondas 2 y 1 de selección in vivo. El tamaño del código de una letra indica la frecuencia con la que aparece ese aminoácido en esa posición. Para representar el logotipo, se compara la frecuencia de las secuencias de LCR extraídas de animales individuales entre dos rondas de selección y se muestran las secuencias enriquecidas en la segunda ronda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 y (h) #1.2–#2.4. Los aminoácidos más enriquecidos en una posición dada en (c, d) los animales n.º 2.1 y n.º 2.2 o (g, h) en los animales n.º 2.3 y n.º 2.4 se muestran en color. Verde = polar, morado = neutro, azul = básico, rojo = ácido y negro = aminoácidos hidrófobos.
Después de la tercera ronda de selección, identificamos 124 secuencias peptídicas únicas (#3.1 y #3.2) de 332 clones de fagos reconstituidos en LCR aislados de dos animales (Fig. 6a suplementaria). La secuencia LGSVS (18,7%) tuvo la proporción relativa más alta, seguida de los insertos de tipo salvaje PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) y SARGSWREIVSLS (2,2%). En la cuarta ronda final, agrupamos dos ramas seleccionadas independientemente de tres animales separados (Fig. 1c). De los 925 clones de fagos secuenciados recuperados del LCR, en la cuarta ronda encontramos 64 secuencias peptídicas únicas (Fig. 6b suplementaria), entre las cuales la proporción relativa de fagos de tipo salvaje disminuyó al 0,8%. Los clones de LCR más comunes en la cuarta ronda fueron LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) y RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). El rango de longitud de los péptidos seleccionados se debe a inserciones/deleciones de nucleótidos o codones de parada prematuros en los cebadores de la biblioteca cuando se utilizan codones degenerados para el diseño de la biblioteca NNK. Los codones de parada prematuros generan péptidos más cortos y se seleccionan porque contienen el motivo aa favorable. Los péptidos más largos pueden resultar de inserciones/deleciones en los cebadores de las bibliotecas sintéticas. Esto posiciona el codón de parada diseñado fuera del marco y lo lee hasta que aparece un nuevo codón de parada aguas abajo. En general, calculamos los factores de enriquecimiento para las cuatro rondas de selección comparando los datos de entrada con los datos de salida de la muestra. Para la primera ronda de cribado, utilizamos títulos de fagos silvestres como referencia de fondo no específica. Curiosamente, la selección negativa de fagos fue muy fuerte en el primer ciclo de LCR, pero no en sangre (Fig. 3a), lo que podría deberse a la baja probabilidad de difusión pasiva de la mayoría de los miembros de la biblioteca de péptidos en el compartimento del LCR, o a que los fagos relacionados tienden a ser retenidos o eliminados del torrente sanguíneo con mayor eficiencia que los bacteriófagos. Sin embargo, en la segunda ronda de cribado, se observó una fuerte selección de fagos en LCR en ambos clados, lo que sugiere que la ronda anterior se enriqueció en fagos que presentan péptidos que promueven la captación en LCR (Fig. 3a). Nuevamente, sin un enriquecimiento significativo en sangre. Asimismo, en la tercera y cuarta rondas, los clones de fagos se enriquecieron significativamente en LCR. Al comparar la frecuencia relativa de cada secuencia peptídica única entre las dos últimas rondas de selección, observamos que las secuencias se enriquecieron aún más en la cuarta ronda de selección (Fig. 3b). Se extrajeron un total de 931 motivos tripeptídicos de las 64 secuencias peptídicas únicas utilizando ambas orientaciones peptídicas. Los motivos más enriquecidos en la cuarta ronda se examinaron con mayor detalle para determinar sus perfiles de enriquecimiento en todas las rondas, en comparación con la biblioteca inyectada (punto de corte: 10% de enriquecimiento) (Fig. Suplementaria 6c). Los patrones generales de selección mostraron que la mayoría de los motivos estudiados se enriquecieron en todas las rondas previas de ambas ramas de selección. Sin embargo, algunos motivos (p. ej., SGL, VSG, LGS, GSV) provenían predominantemente del clado alternativo A, mientras que otros (p. ej., FGW, RTN, WGF, NTR) se enriquecieron en el clado alternativo B.
Validación del transporte en LCR de péptidos expuestos en fagos enriquecidos en LCR y péptidos líderes biotinilados conjugados con cargas útiles de estreptavidina.
(a) Razones de enriquecimiento calculadas en las cuatro rondas (R1-R4) basadas en los títulos de fagos (UFP) inyectados (entrada = 1) y los títulos de fagos determinados en LCR (salida = 0). Los factores de enriquecimiento para las últimas tres rondas (R2-R4) se calcularon por comparación con la ronda anterior y la primera ronda (R1) con datos de peso. Las barras abiertas son líquido cefalorraquídeo, las barras sombreadas son plasma. (***p < 0,001, basado en la prueba t de Student). (b) Lista de los péptidos de fagos más abundantes, clasificados según su proporción relativa a todos los fagos recolectados en LCR después de la ronda 4 de selección. Los seis clones de fagos más comunes están resaltados en color, numerados y sus factores de enriquecimiento entre las rondas 3 y 4 de selección (recuadros). (c,d) Los seis clones de fagos más enriquecidos, fagos vacíos y bibliotecas de péptidos de fagos parentales de la ronda 4 se analizaron individualmente en un modelo de muestreo de LCR. Se recogieron muestras de LCR y sangre en los puntos de tiempo indicados. (c) Cantidades iguales de 6 clones de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animales), fagos vacíos (#1779) (2 x 1010 fagos/animales) y bibliotecas de péptidos de fagos de reserva (2 x 1012 fagos/animales). Inyectar al menos 3 CM se administra al animal canulado por separado a través de la vena de la cola. Se muestra la farmacocinética en LCR de cada clon de fago inyectado y biblioteca de péptidos de fagos a lo largo del tiempo. (d) muestra la relación media de LCR/sangre para todos los fagos recuperados/mL durante el tiempo de muestreo. (e) Cuatro péptidos líderes sintéticos y un control aleatorio se unieron con biotina a estreptavidina a través de su extremo N (exhibición de tetrámero) seguido de inyección (vena de la cola iv, 10 mg de estreptavidina/kg). Al menos tres ratas intubadas (N = 3). ). Se recogieron muestras de LCR en los puntos temporales indicados y se midieron las concentraciones de estreptavidina mediante ELISA anti-estreptavidina en LCR (nd = no detectado). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, basado en la prueba ANOVA). (f) Comparación de la secuencia de aminoácidos del clon péptido de fago más enriquecido n.º 2002 (morado) con otros clones de péptidos de fago seleccionados de la cuarta ronda de selección. Los fragmentos de aminoácidos idénticos y similares están codificados por color.
De todos los fagos enriquecidos en la cuarta ronda (Fig. 3b), se seleccionaron seis clones candidatos para su posterior análisis individual en el modelo de muestreo de LCR. Se inyectaron cantidades iguales de seis bibliotecas de fagos candidatos, fagos vacíos (sin inserto) y péptidos de profagos en tres animales con CM canulados, y se determinó la farmacocinética en ensayos de LCR (Fig. 3c) y sangre (Fig. 7 suplementaria). Todos los clones de fagos analizados dirigieron el compartimento del LCR a un nivel de 10 a 1000 veces superior al del fago de control vacío (#1779). Por ejemplo, los clones #2020 y #2077 presentaron títulos en LCR aproximadamente 1000 veces superiores a los del fago de control. El perfil farmacocinético de cada péptido seleccionado es diferente, pero todos presentan una alta capacidad de anidamiento en el LCR. Observamos una disminución constante a lo largo del tiempo para los clones #1903 y #2011, mientras que para los clones #2077, #2002 y #2009 un aumento durante los primeros 10 minutos podría indicar transporte activo, pero necesita ser verificado. Los clones #2020, #2002 y #2077 se estabilizaron en niveles altos, mientras que la concentración en LCR del clon #2009 disminuyó lentamente después del aumento inicial. Luego comparamos la frecuencia relativa de cada candidato en LCR con su concentración en sangre (Fig. 3d). La correlación del título medio de cada candidato en LCR con su título en sangre en todos los tiempos de muestreo mostró que tres de los seis candidatos estaban significativamente enriquecidos en LCR en sangre. Curiosamente, el clon #2077 mostró una mayor estabilidad en sangre (Figura Suplementaria 7). Para confirmar que los péptidos son capaces de transportar activamente carga distinta a las partículas fágicas al compartimento del LCR, sintetizamos cuatro péptidos líderes derivatizados con biotina en el extremo N-terminal, donde se unen a la partícula fágica. Los péptidos biotinilados (n.º 2002, 2009, 2020 y 2077) se conjugaron con estreptavidina (SA) para obtener formas multiméricas que imitan en cierta medida la geometría del fago. Este formato también nos permitió medir la exposición a SA en sangre y líquido cefalorraquídeo como péptidos proteicos transportadores de carga. Cabe destacar que los datos de fagos a menudo se pudieron reproducir cuando se administraron péptidos sintéticos en este formato conjugado con SA (Fig. 3e). Los péptidos codificados presentaron una menor exposición inicial y una depuración del LCR más rápida, con niveles indetectables en 48 horas. Para comprender mejor las vías de administración de estos clones de fagos peptídicos en el espacio del LCR, analizamos la localización de los hits peptídicos individuales del fago mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar directamente partículas de fago 1 hora después de la inyección intravenosa in vivo. Cabe destacar que los clones #2002, #2077 y #2009 pudieron detectarse mediante una fuerte tinción en capilares cerebrales, mientras que el fago de control (#1779) y el clon #2020 no se detectaron (Figura Suplementaria 8). Esto sugiere que estos péptidos contribuyen al efecto en el cerebro precisamente al cruzar la BHE. Se requiere un análisis más detallado para probar esta hipótesis, ya que la ruta BSCFB también podría estar involucrada. Al comparar la secuencia de aminoácidos del clon más enriquecido (#2002) con otros péptidos seleccionados, se observó que algunos de ellos tienen extensiones de aminoácidos similares, lo que puede indicar un mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Debido a su perfil plasmático único y al aumento significativo en el LCR con el tiempo, el clon de visualización de fagos #2077 se exploró más a fondo durante un período más largo de 48 horas y fue capaz de reproducir el rápido aumento en el LCR observado en asociación con niveles sostenidos de SA (Fig. 4a). Con respecto a otros clones de fagos identificados, #2077 se tiñó fuertemente para los capilares cerebrales y mostró una colocalización significativa con la lectina marcadora capilar cuando se observó a mayor resolución y posiblemente algo de tinción en el espacio parenquimatoso (Figura 4b). Para investigar si se podían obtener efectos farmacológicos mediados por péptidos en el SNC, realizamos un experimento en el que versiones biotiniladas de i) el péptido de tránsito #2077 y ii) el péptido inhibidor de BACE1 se mezclaron con SA en dos proporciones diferentes. Para una combinación, usamos solo el inhibidor del péptido BACE1 y para la otra, usamos una proporción 1:3 de inhibidor del péptido BACE1 a péptido #2077. Ambas muestras se administraron por vía intravenosa y se midieron a lo largo del tiempo los niveles de péptido beta-amiloide 40 (Abeta40) en sangre y líquido cefalorraquídeo. El Abeta40 se midió en el LCR, ya que refleja la inhibición de BACE1 en el parénquima cerebral. Como era de esperar, ambos complejos redujeron significativamente los niveles sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d). Sin embargo, solo las muestras que contenían una mezcla del péptido n.° 2077 y un inhibidor del péptido BACE1 conjugado con SA causaron una disminución significativa de Abeta40 en el líquido cefalorraquídeo (Fig. 4c). Los datos muestran que el péptido n.° 2077 es capaz de transportar la proteína SA de 60 kDa al SNC y también induce efectos farmacológicos con inhibidores del péptido BACE1 conjugados con SA.
(a) Inyección clonal (2 × 10 fagos/animal) del fago T7 que muestra los perfiles farmacocinéticos a largo plazo del péptido n.º 2077 en LCR (RLSSVDSDLSGC) y del fago control no inyectado (n.º 1779) en al menos tres ratas intubadas con CM. (b) Imagen de microscopía confocal de microvasos corticales representativos en ratas inyectadas con fagos (2 × 10 10 fagos/animal) que muestra la contratinción del péptido n.º 2077 y los vasos (lectina). Estos clones de fagos se administraron a tres ratas y se dejaron circular durante una hora antes de la perfusión. Los cerebros se seccionaron y se tiñeron con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra la cápside del fago T7. Diez minutos antes de la perfusión y la posterior fijación, se administró lectina marcada con DyLight594 por vía intravenosa. Imágenes fluorescentes que muestran la tinción de lectina (rojo) en la cara luminal de microvasos y fagos (verde) en el lumen de capilares y tejido cerebral perivascular. La barra de escala corresponde a 10 µm. (c, d) El péptido inhibidor de BACE1 biotinilado, solo o en combinación con el péptido de tránsito biotinilado n.º 2077, se acopló a estreptavidina, seguido de una inyección intravenosa de al menos tres ratas CM canuladas (10 mg de estreptavidina/kg). La reducción de Aβ40 mediada por el inhibidor del péptido BACE1 se midió mediante ELISA Aβ1-40 en sangre (rojo) y líquido cefalorraquídeo (naranja) en los puntos temporales indicados. Para mayor claridad, se dibuja una línea de puntos en el gráfico a una escala del 100 %. (c) Reducción porcentual de Aβ40 en sangre (triángulos rojos) y líquido cefalorraquídeo (triángulos naranjas) en ratas tratadas con estreptavidina conjugada con el péptido de tránsito n.º 2077 y el péptido inhibidor de BACE1 en una proporción de 3:1. (d) Reducción porcentual de Aβ40 en sangre (círculos rojos) y líquido cefalorraquídeo (círculos naranjas) en ratas tratadas con estreptavidina acoplada únicamente a un péptido inhibidor de BACE1. La concentración de Aβ en el grupo control fue de 420 pg/ml (desviación estándar = 101 pg/ml).
La visualización de fagos se ha aplicado con éxito en diversas áreas de la investigación biomédica17. Este método se ha empleado en estudios in vivo de diversidad vascular18,19, así como en estudios dirigidos a vasos cerebrales20,21,22,23,24,25,26. En este estudio, ampliamos la aplicación de este método de selección no solo a la identificación directa de péptidos dirigidos a vasos cerebrales, sino también al descubrimiento de candidatos con propiedades de transporte activo para cruzar la barrera hematoencefálica. Ahora describimos el desarrollo de un procedimiento de selección in vivo en ratas intubadas con CM y demostramos su potencial para identificar péptidos con propiedades de localización en el LCR. Utilizando el fago T7 que muestra una biblioteca de péptidos aleatorios de 12 meros, pudimos demostrar que el fago T7 es lo suficientemente pequeño (aproximadamente 60 nm de diámetro)10 como para adaptarse a la barrera hematoencefálica, cruzando así directamente la barrera hematoencefálica o el plexo coroideo. Observamos que la recolección de LCR de ratas CM canuladas fue un método de cribado funcional in vivo bien controlado, y que el fago extraído no solo se unió a la vasculatura, sino que también funcionó como transportador a través de la barrera hematoencefálica. Además, al recolectar sangre y aplicar simultáneamente HTS al LCR y a los fagos derivados de la sangre, confirmamos que nuestra elección del LCR no se vio influenciada por el enriquecimiento de la sangre ni por su aptitud para la expansión entre rondas de selección. Sin embargo, el compartimento sanguíneo forma parte del procedimiento de selección, ya que los fagos capaces de alcanzar el compartimento del LCR deben sobrevivir y circular en el torrente sanguíneo el tiempo suficiente para enriquecerse en el cerebro. Para extraer información secuencial fiable de los datos HTS sin procesar, implementamos filtros adaptados a errores de secuenciación específicos de la plataforma en el flujo de trabajo de análisis. Al incorporar parámetros cinéticos en el método de cribado, confirmamos la rápida farmacocinética de los fagos T7 de tipo salvaje (t½ ~ 28 min) en sangre24, 27, 28 y también determinamos su vida media en el líquido cefalorraquídeo (t½ ~ 26 min) por minuto). A pesar de los perfiles farmacocinéticos similares en sangre y LCR, solo el 0,001% de la concentración sanguínea del fago se pudo detectar en el LCR, lo que indica una baja movilidad de fondo del fago T7 de tipo salvaje a través de la barrera hematoencefálica. Este trabajo destaca la importancia de la primera ronda de selección cuando se utilizan estrategias de cribado in vivo, especialmente para sistemas de fagos que se eliminan rápidamente de la circulación, ya que pocos clones pueden alcanzar el compartimento del SNC. Por lo tanto, en la primera ronda, la reducción de la diversidad de la biblioteca fue muy grande, ya que finalmente solo se recolectó un número limitado de clones en este modelo de LCR muy estricto. Esta estrategia de selección in vivo incluyó varios pasos de selección, como la acumulación activa en el compartimento del LCR, la supervivencia de los clones en el compartimento de la sangre y la eliminación rápida de los clones del fago T7 de la sangre en los primeros 10 minutos (Fig. 1d y Fig. 4M suplementaria). ). Por lo tanto, después de la primera ronda, se identificaron diferentes clones de fagos en el LCR, aunque se utilizó el mismo grupo inicial para animales individuales. Esto sugiere que múltiples pasos de selección estricta para bibliotecas de origen con un gran número de miembros de la biblioteca dan como resultado una reducción significativa de la diversidad. Por lo tanto, los eventos aleatorios se convertirán en una parte integral del proceso de selección inicial, lo que influirá en gran medida en el resultado. Es probable que muchos de los clones en la biblioteca original tuvieran una propensión de enriquecimiento en LCR muy similar. Sin embargo, incluso en las mismas condiciones experimentales, los resultados de la selección pueden diferir debido al pequeño número de cada clon en particular en el grupo inicial.
Los motivos enriquecidos en LCR difieren de los de la sangre. Curiosamente, observamos el primer cambio hacia péptidos ricos en glicina en la sangre de animales individuales (Fig. 1g, Figs. suplementarias 4e y 4f). Los fagos que contienen péptidos de glicina pueden ser más estables y menos propensos a ser retirados de la circulación. Sin embargo, estos péptidos ricos en glicina no se detectaron en las muestras de líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que las bibliotecas seleccionadas pasaron por dos etapas de selección diferentes: una en la sangre y otra que se dejó acumular en el líquido cefalorraquídeo. Los clones enriquecidos en LCR resultantes de la cuarta ronda de selección se analizaron exhaustivamente. Se confirmó que casi todos los clones analizados individualmente estaban enriquecidos en LCR en comparación con el fago de control blanco. Un péptido coincidente (#2077) se examinó con más detalle. Mostró una vida media plasmática más larga en comparación con otros hits (Figura 3d y Figura suplementaria 7), y curiosamente, este péptido contenía un residuo de cisteína en el C-terminal. Recientemente se ha demostrado que la adición de cisteína a los péptidos puede mejorar sus propiedades farmacocinéticas al unirse a la albúmina 29. Esto es actualmente desconocido para el péptido #2077 y requiere más estudios. Algunos péptidos mostraron una dependencia de la valencia en el enriquecimiento del LCR (datos no mostrados), que puede estar relacionada con la geometría de superficie mostrada de la cápside T7. El sistema T7 que usamos mostró 5-15 copias de cada péptido por partícula de fago. Se realizó IHC en clones de fagos líderes candidatos inyectados por vía intravenosa en la corteza cerebral de ratas (Fig. suplementaria 8). Los datos mostraron que al menos tres clones (No. 2002, No. 2009 y No. 2077) interactuaron con la BHE. Queda por determinar si esta interacción con la barrera hematoencefálica (BHE) provoca la acumulación de LCR o el desplazamiento de estos clones directamente a la BCSFB. Cabe destacar que demostramos que los péptidos seleccionados conservan su capacidad de transporte en LCR tras su síntesis y unión a la carga proteica. La unión de los péptidos biotinilados N-terminales al SA repite esencialmente los resultados obtenidos con sus respectivos clones fágicos en sangre y líquido cefalorraquídeo (Fig. 3e). Finalmente, demostramos que el péptido líder n.º 2077 puede promover la acción cerebral de un inhibidor peptídico biotinilado de BACE1 conjugado con SA, lo que provoca efectos farmacodinámicos pronunciados en el SNC al reducir significativamente los niveles de Abeta40 en LCR (Fig. 4). No se identificaron homólogos en la base de datos tras realizar una búsqueda de homología de secuencias peptídicas de todos los resultados. Es importante destacar que el tamaño de la biblioteca T7 es de aproximadamente 10⁻¹, mientras que el tamaño teórico de la biblioteca para 12-meros es de 4 x 10⁻¹. Por lo tanto, solo seleccionamos una pequeña fracción del espacio de diversidad de la biblioteca de péptidos de 12-meros, lo que podría significar que se pueden identificar péptidos más optimizados mediante la evaluación del espacio de secuencias adyacentes de estos resultados identificados. Hipotéticamente, una de las razones por las que no hemos encontrado homólogos naturales de estos péptidos podría ser la deselección durante la evolución para evitar la entrada incontrolada de ciertos motivos peptídicos en el cerebro.
En conjunto, nuestros resultados sientan las bases para trabajos futuros destinados a identificar y caracterizar con mayor detalle los sistemas de transporte de la barrera cerebrovascular in vivo. La configuración básica de este método se basa en una estrategia de selección funcional que no solo identifica clones con propiedades de unión vascular cerebral, sino que también incluye un paso crítico en el que los clones exitosos poseen actividad intrínseca para atravesar barreras biológicas in vivo hacia el compartimento del SNC. Nuestro objetivo es dilucidar el mecanismo de transporte de estos péptidos y su preferencia por unirse a la microvasculatura específica de la región cerebral. Esto podría conducir al descubrimiento de nuevas vías de transporte de la BHE y sus receptores. Esperamos que los péptidos identificados puedan unirse directamente a receptores cerebrovasculares o a ligandos circulantes transportados a través de la BHE o la BCSFB. Los vectores peptídicos con actividad de transporte en LCR descubiertos en este trabajo se investigarán con mayor profundidad. Actualmente, estamos investigando la especificidad cerebral de estos péptidos por su capacidad para cruzar la BHE y/o la BCSFB. Estos nuevos péptidos serán herramientas extremadamente valiosas para el posible descubrimiento de nuevos receptores o vías y para el desarrollo de nuevas plataformas altamente eficientes para la entrega de macromoléculas, como productos biológicos, al cerebro.
Se canuló la cisterna mayor (CM) utilizando una modificación del método descrito previamente. Se montaron ratas Wistar anestesiadas (200-350 g) en un aparato estereotáxico y se realizó una incisión mediana sobre el cuero cabelludo afeitado y preparado asépticamente para exponer el cráneo. Se perforaron dos orificios en la zona de la banda superior y se fijaron los tornillos de fijación en los orificios. Se perforó un orificio adicional en la cresta occipital lateral para guiar estereotácticamente una cánula de acero inoxidable en la CM. Se aplicó cemento dental alrededor de la cánula y se fijó con tornillos. Tras el fotocurado y el endurecimiento del cemento, se cerró la herida cutánea con sutura de supramida 4/0. La correcta colocación de la cánula se confirmó mediante la fuga espontánea de líquido cefalorraquídeo (LCR). Se retiró a la rata del aparato estereotáxico, se le administraron los cuidados postoperatorios y el manejo del dolor adecuados, y se dejó recuperar durante al menos una semana hasta que se observaran signos de sangre en el líquido cefalorraquídeo. Se obtuvieron ratas Wistar (Crl:WI/Han) de Charles River (Francia). Todas las ratas se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria de la Ciudad de Basilea (Suiza) y se realizaron de acuerdo con la Licencia Animal n.° 2474 (Evaluación del Transporte Cerebral Activo mediante la Medición de los Niveles de Candidatos Terapéuticos en el Líquido Cefalorraquídeo y el Encéfalo de Ratas).
Mantenga a la rata consciente con cuidado, manteniendo la cánula de CM en la mano. Retire la datura de la cánula y recolecte 10 µl de líquido cefalorraquídeo que fluya espontáneamente. Dado que la permeabilidad de la cánula se vio comprometida, en este estudio solo se incluyeron muestras de líquido cefalorraquídeo transparente sin evidencia de contaminación sanguínea ni decoloración. Paralelamente, se extrajeron aproximadamente de 10 a 20 µl de sangre de una pequeña incisión en la punta de la cola y se introdujeron en tubos con heparina (Sigma-Aldrich). Se recolectaron LCR y sangre en varios momentos tras la inyección intravenosa del fago T7. Se desecharon aproximadamente de 5 a 10 µl de líquido antes de recolectar cada muestra de LCR, lo que corresponde al volumen muerto del catéter.
Las bibliotecas se generaron utilizando el vector T7Select 10-3b, como se describe en el manual del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). En resumen, se sintetizó un inserto aleatorio de ADN de 12 meros con el siguiente formato:
El codón NNK se utilizó para evitar codones de terminación dobles y la sobreexpresión de aminoácidos en el inserto. N es una proporción equimolar mezclada manualmente de cada nucleótido, y K es una proporción equimolar mezclada manualmente de nucleótidos de adenina y citosina. Las regiones monocatenarias se convirtieron a ADN bicatenario mediante incubación adicional con dNTP (Novagen) y enzima Klenow (New England Biolabs) en tampón Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37 °C. Después de la reacción, se recuperó el ADN bicatenario por precipitación con EtOH. El ADN resultante se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII (ambas de Roche). El inserto escindido y purificado (QIAquick, Qiagen) (ligasa T4, New England Biolabs) se ligó entonces en marco en un vector T7 preescindido después del aminoácido 348 del gen de la cápside 10B. Las reacciones de ligación se incubaron a 16 °C durante 18 horas antes del envasado in vitro. El envasado in vitro de fagos se realizó según las instrucciones del kit de clonación T7Select 10-3b (Novagen) y la solución de envasado se amplificó una vez para su lisis con Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Los lisados ​​se centrifugaron, titularon y congelaron a -80 °C como solución madre de glicerol.
Amplificación directa por PCR de regiones variables de fagos amplificadas en caldo o placa utilizando cebadores de fusión patentados 454/Roche-amplicón. El cebador de fusión directo contiene secuencias que flanquean la región variable (NNK) 12 (específica del molde), el adaptador de titanio GS FLX A y una secuencia clave de biblioteca de cuatro bases (TCAG) (Figura 1a suplementaria).
El cebador de fusión inversa también contiene biotina unida a perlas de captura y el adaptador de titanio GS FLX B necesario para la amplificación clonal durante la PCR en emulsión:
Los amplicones se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche según el protocolo 454 GS-FLX Titanium. Para la secuenciación manual por Sanger (analizador de ADN Hitachi 3730 xl de Applied Biosystems), el ADN del fago T7 se amplificó mediante PCR y se secuenció con los siguientes pares de cebadores:
Los insertos de placas individuales se sometieron a amplificación por PCR con el kit Roche Fast Start DNA Polymerase (según las instrucciones del fabricante). Se realizó un inicio en caliente (10 min a 95 °C) y 35 ciclos de refuerzo (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C).
Se amplificaron fagos de bibliotecas, fagos silvestres, fagos rescatados de LCR y sangre, o clones individuales, en Escherichia coli BL5615 en caldo TB (Sigma Aldrich) o en placas de 500 cm² (Thermo Scientific) durante 4 h a 37 °C. Los fagos se extrajeron de las placas lavándolas con tampón Tris-EDTA (Fluka Analytical) o recogiendo las placas con puntas de pipeta estériles. Los fagos se aislaron del sobrenadante de cultivo o del tampón de extracción con una ronda de precipitación con polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) y se resuspendieron en tampón Tris-EDTA.
El fago amplificado se sometió a 2-3 rondas de eliminación de endotoxinas utilizando microesferas de eliminación de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes de la inyección intravenosa (IV) (500 μl/animal). En la primera ronda, se introdujeron 2×1012 fagos; en la segunda, 2×1010 fagos; en la tercera y cuarta rondas de selección, 2×109 fagos por animal. El contenido de fagos en las muestras de LCR y sangre recolectadas en los puntos de tiempo indicados se determinó mediante recuento de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (manual del sistema T7Select). La selección de fagos se realizó mediante inyección intravenosa de bibliotecas purificadas en la vena de la cola o mediante reinyección de fagos extraídos del LCR de la ronda de selección anterior, y las cosechas posteriores se realizaron a los 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min y 240 min respectivamente de las muestras de LCR y sangre. Se realizaron un total de cuatro rondas de selección in vivo, en las que las dos ramas seleccionadas se almacenaron y analizaron por separado durante las tres primeras rondas. Todos los insertos de fagos extraídos del LCR de las dos primeras rondas se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche, mientras que todos los clones extraídos del LCR de las dos últimas rondas se secuenciaron manualmente. Todos los fagos sanguíneos de la primera ronda también se sometieron a pirosecuenciación 454/Roche. Para la inyección de clones de fagos, los fagos seleccionados se amplificaron en E. coli (BL5615) en placas de 500 cm2 a 37 °C durante 4 horas. Los clones seleccionados individualmente y secuenciados manualmente se propagaron en medio TB. Después de la extracción, purificación y eliminación de endotoxinas de los fagos (como se describió anteriormente), se inyectaron por vía intravenosa en una vena de la cola 2×1010 fagos/animal en 300 μl.
Preprocesamiento y filtrado cualitativo de datos de secuencia. Los datos sin procesar de 454/Roche se convirtieron de un formato binario de mapa de flujo estándar (sff) a un formato legible por humanos de Pearson (fasta) mediante software del proveedor. El procesamiento posterior de la secuencia de nucleótidos se realizó mediante programas y scripts propietarios en C (paquete de software no publicado), como se describe a continuación. El análisis de los datos primarios incluye estrictos procedimientos de filtrado multietapa. Para filtrar las lecturas que no contenían una secuencia de ADN de inserción de 12 mer válida, las lecturas se alinearon secuencialmente con la etiqueta de inicio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), la etiqueta de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) y la inserción de fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mediante la prueba global de Needleman-Wunsch. Alineamiento que permite hasta 2 inconsistencias por alineación31. Por lo tanto, las lecturas sin etiquetas de inicio y parada y las lecturas que contienen inserciones de fondo, es decir, alineaciones que exceden el número permitido de desajustes, se eliminaron de la biblioteca. En cuanto a las lecturas restantes, la secuencia de ADN N-mer que se extiende desde la marca de inicio y termina antes de la marca de parada se escindió de la secuencia de lectura original y se procesó adicionalmente (en adelante, "inserto"). Después de la traducción del inserto, la porción después del primer codón de parada en el extremo 5' del cebador se elimina del inserto. Además, también se eliminaron los nucleótidos que conducen a codones incompletos en el extremo 3' del cebador. Para excluir insertos que contienen solo secuencias de fondo, también se eliminaron insertos traducidos que comienzan con el patrón de aminoácidos "PAG". Los péptidos con una longitud postraduccional de menos de 3 aminoácidos se eliminaron de la biblioteca. Finalmente, elimine la redundancia en el grupo de insertos y determine la frecuencia de cada inserto único. Los resultados de este análisis incluyeron una lista de secuencias de nucleótidos (insertos) y sus frecuencias (de lectura) (Figuras suplementarias 1c y 2).
Agrupar insertos de ADN N-mer por similitud de secuencia: Para eliminar errores de secuenciación específicos de 454/Roche (como problemas con la secuenciación de extensiones de homopolímeros) y eliminar redundancias menos importantes, los insertos de secuencia de ADN N-mer previamente filtrados (inserciones) se ordenan por similitud. inserciones (hasta 2 bases no coincidentes permitidas) utilizando un algoritmo iterativo definido de la siguiente manera: las inserciones se ordenan primero por su frecuencia (de mayor a menor), y si son iguales, por su ordenación secundaria por longitud (de mayor a menor) ). Por lo tanto, las inserciones más frecuentes y más largas definen el primer "grupo". La frecuencia del grupo se establece en la frecuencia clave. Luego, cada inserción restante en la lista ordenada se intentó agregar al grupo mediante una alineación Needleman-Wunsch por pares. Si el número de desajustes, inserciones o deleciones en una alineación no excede un umbral de 2, se agrega una inserción al grupo y la frecuencia general del grupo se incrementa con la frecuencia con la que se agregó la inserción. Las inserciones añadidas a un grupo se marcan como usadas y se excluyen del procesamiento posterior. Si la secuencia de inserción no puede añadirse a un grupo ya existente, se utiliza para crear un nuevo grupo con la frecuencia de inserción adecuada y se marca como usada. La iteración finaliza cuando cada secuencia de inserción se ha utilizado para formar un nuevo grupo o puede incluirse en un grupo ya existente. Después de todo, las inserciones agrupadas, compuestas por nucleótidos, se traducen finalmente en secuencias peptídicas (bibliotecas de péptidos). El resultado de este análisis es un conjunto de inserciones y sus frecuencias correspondientes, que conforman el número de lecturas consecutivas (Fig. 2 suplementaria).
Generación de motivos: A partir de una lista de péptidos únicos, se creó una biblioteca con todos los posibles patrones de aminoácidos (aa), como se muestra a continuación. Cada posible patrón de longitud 3 se extrajo del péptido y se añadió su patrón inverso, junto con una biblioteca de motivos común que contiene todos los patrones (tripéptidos). Se secuenciaron las bibliotecas de motivos altamente repetitivos y se eliminó la redundancia. A continuación, para cada tripéptido de la biblioteca de motivos, se verificó su presencia en la biblioteca mediante herramientas computacionales. En este caso, se añade la frecuencia del péptido que contiene el tripéptido del motivo encontrado y se asigna al motivo en la biblioteca de motivos ("número de motivos"). El resultado de la generación de motivos es una matriz bidimensional que contiene todas las ocurrencias de tripéptidos (motivos) y sus respectivos valores, que son el número de lecturas de secuenciación que dan como resultado el motivo correspondiente cuando las lecturas se filtran, agrupan y traducen. Las métricas se detallan anteriormente.
Normalización del número de motivos y diagramas de dispersión correspondientes: El número de motivos para cada muestra se normalizó utilizando
Donde ni es el número de lecturas que contienen el tema i. Por lo tanto, vi representa la frecuencia porcentual de lecturas (o péptidos) que contienen el motivo i en la muestra. Los valores p para el número de motivos no normalizado se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher. Respecto a los correlogramas del número de motivos, las correlaciones de Spearman se calcularon utilizando el número de motivos normalizado con R.
Para visualizar el contenido de aminoácidos en cada posición de la biblioteca de péptidos, se crearon los weblogogramas 32 y 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Primero, se almacena el contenido de aminoácidos en cada posición del péptido de 12 mer en una matriz de 20×12. Luego, se genera un conjunto de 1000 péptidos con el mismo contenido relativo de aminoácidos en cada posición en formato fasta-sequence y se proporciona como entrada a web-logo 3, que genera una representación gráfica del contenido relativo de aminoácidos en cada posición para una biblioteca de péptidos dada. Para visualizar conjuntos de datos multidimensionales, se crearon mapas de calor utilizando una herramienta desarrollada internamente en R (biosHeatmap, un paquete de R aún por publicar). Los dendrogramas presentados en los mapas de calor se calcularon utilizando el método de agrupamiento jerárquico de Ward con la métrica de distancia euclidiana. Para el análisis estadístico de los datos de puntuación de motivos, se calcularon los valores P para la puntuación no normalizada utilizando la prueba exacta de Fisher. Los valores P para otros conjuntos de datos se calcularon en R utilizando la prueba t de Student o ANOVA.
Se inyectaron por vía intravenosa clones de fagos seleccionados y fagos sin insertos en la vena de la cola (2 × 10¹¹ fagos/animal en 300 μl de PBS). Diez minutos antes de la perfusión y posterior fijación, se inyectó por vía intravenosa a los mismos animales 100 μl de lectina marcada con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Sesenta minutos después de la inyección de fagos, se perfundió a las ratas a través del corazón con 50 ml de PBS, seguidos de 50 ml de PFA/PBS al 4%. Las muestras de cerebro se fijaron adicionalmente durante la noche en PFA/PBS al 4% y se sumergieron en sacarosa al 30% a 4 °C. Las muestras se congelaron instantáneamente en la mezcla de OCT. El análisis inmunohistoquímico de las muestras congeladas se realizó a temperatura ambiente en criosecciones de 30 µm bloqueadas con BSA al 1 % e incubadas con anticuerpos policlonales marcados con FITC contra el fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Se incubó durante la noche. Finalmente, las secciones se lavaron tres veces con PBS y se examinaron con un microscopio láser confocal (Leica TCS SP5).
Todos los péptidos con una pureza mínima del 98 % fueron sintetizados por GenScript USA, biotinilados y liofilizados. La biotina se une mediante un triple espaciador de glicina en el extremo aminoterminal. Analice todos los péptidos mediante espectrometría de masas.
Se mezcló estreptavidina (Sigma S0677) con un exceso equimolar de 5 veces de péptido biotinilado, péptido inhibidor de BACE1 biotinilado o una combinación (proporción 3:1) de péptidos inhibidores de BACE1 biotinilados y péptidos inhibidores de BACE1 en DMSO al 5-10 % e incubó en PBS. Se incubó en PBS durante una hora a temperatura ambiente antes de la inyección. Los péptidos conjugados con estreptavidina se inyectaron por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg en una vena de la cola de ratas con cavidad cerebral.
La concentración de complejos de estreptavidina-péptido se evaluó mediante ELISA. Placas de microtitulación Nunc Maxisorp (Sigma) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 1,5 μg/ml de anticuerpo anti-estreptavidina de ratón (Thermo, MA1-20011). Tras el bloqueo (tampón de bloqueo: NaCl 140 nM, EDTA 5 mM, NP40 al 0,05 %, gelatina al 0,25 %, BSA al 1 %) a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavó la placa con Tween-20/PBS al 0,05 % (tampón de lavado) durante 3 segundos. Se añadieron muestras de LCR y plasma a pocillos diluidos con tampón de bloqueo (plasma 1:10 000, LCR 1:115). La placa se incubó durante la noche a 4 °C con anticuerpo de detección (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Tras tres lavados, se detectó estreptavidina mediante incubación en solución de sustrato TMB (Roche) durante un máximo de 20 minutos. Tras detener el desarrollo de color con H₂SO₄ 1 M, se midió la absorbancia a 450 nm.
La función del complejo inhibidor de estreptavidina-péptido-BACE1 se evaluó mediante ELISA Aβ(1-40) según el protocolo del fabricante (Wako, 294-64701). Brevemente, las muestras de LCR se diluyeron en diluyente estándar (1:23) y se incubaron durante la noche a 4 °C en placas de 96 pocillos recubiertas con el anticuerpo de captura BNT77. Después de cinco lavados, se añadió el anticuerpo BA27 conjugado con HRP y se incubó durante 2 horas a 4 °C, seguido de cinco lavados. El Aβ(1-40) se detectó mediante incubación en solución TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez detenido el desarrollo de color con la solución de parada, se midió la absorbancia a 450 nm. Las muestras de plasma se sometieron a extracción en fase sólida antes del ELISA Aβ(1-40). Se añadió plasma a DEA al 0,2 % (Sigma) en placas de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras lavar sucesivamente las placas de SPE (Oasis, 186000679) con agua y metanol al 100 %, se añadieron muestras de plasma a las placas de SPE y se eliminó todo el líquido. Las muestras se lavaron (primero con metanol al 5 % y luego con metanol al 30 %) y se eluyeron con NH₄OH al 2 %/metanol al 90 %. Tras secar el eluido a 55 °C durante 99 min con corriente constante de N₂, las muestras se redujeron en diluyentes estándar y se midió la Aβ(1–40) como se describió anteriormente.
Cómo citar este artículo: Urich, E. et al. Entrega de carga al cerebro mediante péptidos de tránsito identificados in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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