សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើលគេហទំព័រ Nature.com។ អ្នកកំពុងប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ ដើម្បីទទួលបានបទពិសោធន៍ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព (ឬបិទរបៀបឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ លើសពីនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
បង្ហាញ​រង្វង់​នៃ​ស្លាយ​បី​ក្នុង​ពេល​តែ​មួយ។ ប្រើ​ប៊ូតុង​មុន និង​បន្ទាប់ ដើម្បី​ផ្លាស់ទី​តាម​រយៈ​ស្លាយ​បី​ក្នុង​ពេល​តែ​មួយ ឬ​ប្រើ​ប៊ូតុង​គ្រាប់​រំកិល​នៅ​ខាង​ចុង ដើម្បី​ផ្លាស់ទី​តាម​រយៈ​ស្លាយ​បី​ក្នុង​ពេល​តែ​មួយ។
របាំងឈាម-ខួរក្បាល និងរបាំងឈាម-ខួរក្បាលរារាំងភ្នាក់ងារជីវសាស្ត្រពីការឈានដល់គោលដៅរបស់ពួកគេនៅក្នុងប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល ដោយហេតុនេះរារាំងការព្យាបាលប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៃជំងឺសរសៃប្រសាទ។ ដើម្បីស្វែងរកឧបករណ៍ដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលថ្មីនៅក្នុងខ្លួន យើងបានណែនាំបណ្ណាល័យ peptide phage T7 និងប្រមូលឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (CSF) ជាបន្តបន្ទាប់ដោយប្រើគំរូអាងធំដែលមានស្មារតី cannulated ។ ក្លូន phage ជាក់លាក់ត្រូវបានបង្កើនយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង CSF បន្ទាប់ពីការជ្រើសរើសចំនួនបួនជុំ។ ការធ្វើតេស្ត peptide បេក្ខជននីមួយៗបានបង្ហាញពីការកើនឡើងជាង 1000 ដងនៅក្នុង CSF ។ សកម្មភាពជីវសាស្រ្តនៃការចែកចាយដែលសម្របសម្រួលដោយ peptide ទៅកាន់ខួរក្បាលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការថយចុះ 40% នៃកម្រិត amyloid-β នៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងដោយប្រើសារធាតុទប់ស្កាត់ peptide BACE1 ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង peptide ដឹកជញ្ជូនថ្មីដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា peptides ដែលត្រូវបានកំណត់ដោយវិធីសាស្រ្តជ្រើសរើស phage នៅក្នុងខ្លួនអាចជាយានជំនិះមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការចែកចាយជាប្រព័ន្ធនៃម៉ាក្រូម៉ូលេគុលទៅកាន់ខួរក្បាលជាមួយនឹងប្រសិទ្ធភាពព្យាបាល។
ការស្រាវជ្រាវព្យាបាលគោលដៅប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល (CNS) ភាគច្រើនផ្តោតសំខាន់លើការកំណត់អត្តសញ្ញាណថ្នាំ និងភ្នាក់ងារដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង ដែលបង្ហាញពីលក្ខណៈសម្បត្តិកំណត់គោលដៅ CNS ជាមួយនឹងការខិតខំប្រឹងប្រែងតិចជាងមុនលើការរកឃើញយន្តការដែលជំរុញការដឹកជញ្ជូនថ្នាំសកម្មទៅកាន់ខួរក្បាល។ ស្ថានភាពនេះកំពុងចាប់ផ្តើមផ្លាស់ប្តូរឥឡូវនេះ ដោយសារការដឹកជញ្ជូនថ្នាំ ជាពិសេសម៉ូលេគុលធំៗ គឺជាផ្នែកសំខាន់មួយនៃការអភិវឌ្ឍថ្នាំវិទ្យាសាស្ត្រសរសៃប្រសាទទំនើប។ បរិស្ថាននៃប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាលត្រូវបានការពារយ៉ាងល្អដោយប្រព័ន្ធរបាំងខួរក្បាល-សរសៃឈាម ដែលមានរបាំងឈាម-ខួរក្បាល (BBB) ​​និងរបាំងឈាម-ខួរក្បាល (BCBB)1 ដែលធ្វើឱ្យវាពិបាកក្នុងការដឹកជញ្ជូនថ្នាំទៅកាន់ខួរក្បាល1,2។ វាត្រូវបានប៉ាន់ប្រមាណថាថ្នាំម៉ូលេគុលធំស្ទើរតែទាំងអស់ និងថ្នាំម៉ូលេគុលតូចជាង 98% ត្រូវបានលុបចេញពីខួរក្បាល3។ នោះហើយជាមូលហេតុដែលវាមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់ក្នុងការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រព័ន្ធដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលថ្មី ដែលផ្តល់នូវការដឹកជញ្ជូនថ្នាំព្យាបាលប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព និងជាក់លាក់ទៅកាន់ CNS4,5។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ BBB និង BCSFB ក៏បង្ហាញពីឱកាសដ៏ល្អសម្រាប់ការចែកចាយថ្នាំផងដែរ នៅពេលដែលពួកវាជ្រាបចូល និងចូលទៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងអស់នៃខួរក្បាលតាមរយៈសរសៃឈាមដ៏ធំទូលាយរបស់វា។ ដូច្នេះ កិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងបច្ចុប្បន្នក្នុងការប្រើប្រាស់វិធីសាស្រ្តដឹកជញ្ជូនដែលមិនរាតត្បាតទៅកាន់ខួរក្បាលភាគច្រើនគឺផ្អែកលើយន្តការនៃការដឹកជញ្ជូនដែលសម្របសម្រួលដោយអ្នកទទួល (PMT) ដោយប្រើអ្នកទទួល BBB6 ខាងក្នុង។ បើទោះបីជាមានការរីកចម្រើនសំខាន់ៗថ្មីៗនេះដោយប្រើផ្លូវអ្នកទទួល transferrin7,8 ក៏ដោយ ការអភិវឌ្ឍបន្ថែមទៀតនៃប្រព័ន្ធដឹកជញ្ជូនថ្មីដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិប្រសើរឡើងគឺត្រូវបានទាមទារ។ ចំពោះគោលបំណងនេះ គោលដៅរបស់យើងគឺកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ដែលមានសមត្ថភាពសម្របសម្រួលការដឹកជញ្ជូន CSF ព្រោះវាជាគោលការណ៍ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីដឹកជញ្ជូនម៉ាក្រូម៉ូលេគុលទៅកាន់ CNS ឬដើម្បីបើកផ្លូវអ្នកទទួលថ្មី។ ជាពិសេស អ្នកទទួល និងអ្នកដឹកជញ្ជូនជាក់លាក់នៃប្រព័ន្ធខួរក្បាល (BBB និង BSCFB) អាចបម្រើជាគោលដៅសក្តានុពលសម្រាប់ការចែកចាយសកម្ម និងជាក់លាក់នៃថ្នាំជីវព្យាបាល។ សារធាតុរាវខួរក្បាល (CSF) គឺជាផលិតផលសំងាត់នៃ choroid plexus (CS) ហើយមានទំនាក់ទំនងដោយផ្ទាល់ជាមួយសារធាតុរាវ interstitial នៃខួរក្បាលតាមរយៈចន្លោះ subarachnoid និងចន្លោះ ventricular4។ ថ្មីៗនេះ វាត្រូវបានបង្ហាញថា សារធាតុរាវខួរក្បាល subarachnoid សាយភាយច្រើនពេកទៅក្នុង interstitium នៃខួរក្បាល9។ យើងសង្ឃឹមថានឹងចូលទៅក្នុងលំហសរសៃប្រសាទដោយប្រើផ្លូវចូល subarachnoid នេះ ឬដោយផ្ទាល់តាមរយៈ BBB។ ដើម្បីសម្រេចបាននូវគោលដៅនេះ យើងបានអនុវត្តយុទ្ធសាស្ត្រជ្រើសរើស phage ក្នុង vivo ដ៏រឹងមាំមួយ ដែលល្អបំផុតគឺកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptide ដែលដឹកជញ្ជូនដោយផ្លូវទាំងពីរនេះដាច់ដោយឡែកពីគ្នា។
ឥឡូវនេះ យើងពិពណ៌នាអំពីវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យការបង្ហាញ phage ក្នុង vivo ជាបន្តបន្ទាប់ ជាមួយនឹងការយកគំរូ CSF រួមផ្សំជាមួយនឹងលំដាប់ខ្ពស់នៃ throughput (HTS) ដើម្បីតាមដានជុំជ្រើសរើសដំបូងជាមួយនឹងភាពចម្រុះបណ្ណាល័យខ្ពស់បំផុត។ ការត្រួតពិនិត្យត្រូវបានអនុវត្តលើសត្វកណ្តុរដែលដឹងខ្លួនជាមួយនឹង cannula ធុងទឹកធំ (CM) ដែលបានផ្សាំជាអចិន្ត្រៃយ៍ ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងរោគឈាម។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ វិធីសាស្ត្រនេះជ្រើសរើសទាំងការកំណត់គោលដៅខួរក្បាល និង peptides ជាមួយនឹងសកម្មភាពដឹកជញ្ជូនឆ្លងកាត់របាំងខួរក្បាល។ យើងបានប្រើ phages T7 ដោយសារតែទំហំតូចរបស់វា (~60 nm)10 ហើយបានណែនាំថា ពួកវាសមស្របសម្រាប់ការដឹកជញ្ជូន vesicles ដែលអនុញ្ញាតឱ្យឆ្លងកាត់កោសិកានៃរបាំង endothelial និង/ឬ epithelial-medulla។ បន្ទាប់ពីការ panning បួនជុំ ចំនួនប្រជាជន phage ត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នា ដែលបង្ហាញពីការពង្រឹង CSF ក្នុង vivo និងការផ្សារភ្ជាប់នៃ microvessel ខួរក្បាល។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ យើងអាចបញ្ជាក់ពីការរកឃើញរបស់យើងដោយបង្ហាញថា peptides បេក្ខជនល្អបំផុតដែលពេញចិត្ត និងសំយោគដោយគីមី អាចដឹកជញ្ជូនទំនិញប្រូតេអ៊ីនចូលទៅក្នុងសារធាតុរាវ cerebrospinal។ ដំបូងឡើយ ឥទ្ធិពលឱសថសាស្ត្រនៃ CNS ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការរួមបញ្ចូលគ្នារវាង peptide ដឹកជញ្ជូនឈានមុខគេជាមួយនឹងសារធាតុទប់ស្កាត់នៃ peptide BACE1។ បន្ថែមពីលើការបង្ហាញថាយុទ្ធសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យមុខងារនៅក្នុង vivo អាចកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptide ដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលថ្មីជាឧបករណ៍ដឹកជញ្ជូនប្រូតេអ៊ីនដែលមានប្រសិទ្ធភាព យើងរំពឹងថាវិធីសាស្រ្តជ្រើសរើសមុខងារស្រដៀងគ្នានេះក៏នឹងមានសារៈសំខាន់ផងដែរក្នុងការកំណត់ផ្លូវដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលថ្មី។
ដោយផ្អែកលើឯកតាបង្កើតបន្ទះ (PFU) បន្ទាប់ពីជំហានវេចខ្ចប់ហ្វាច បណ្ណាល័យនៃប៉ិបទីតហ្វាច T7 លីនេអ៊ែរចៃដន្យ 12-mer ជាមួយនឹងភាពចម្រុះប្រហែល 109 ត្រូវបានរចនា និងបង្កើតឡើង (សូមមើលសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត)។ វាជារឿងសំខាន់ក្នុងការកត់សម្គាល់ថា យើងបានវិភាគបណ្ណាល័យនេះដោយប្រុងប្រយ័ត្នមុនពេលធ្វើ panning ក្នុង vivo។ ការពង្រីក PCR នៃគំរូបណ្ណាល័យហ្វាចដោយប្រើប្រាយម័រដែលបានកែប្រែបានបង្កើត amplicons ដែលអាចអនុវត្តបានដោយផ្ទាល់ចំពោះ HTS (រូបភាពបន្ថែម 1a)។ ដោយសារតែក) កំហុសក្នុងការធ្វើលំដាប់ HTS11 ខ) ផលប៉ះពាល់លើគុណភាពនៃប្រាយម័រ (NNK)1-12 និងគ) វត្តមាននៃផាចប្រភេទព្រៃ (wt) (ការបញ្ចូលគ្រោងឆ្អឹង) នៅក្នុងបណ្ណាល័យរង់ចាំ នីតិវិធីច្រោះលំដាប់ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីទាញយកតែព័ត៌មានលំដាប់ដែលបានផ្ទៀងផ្ទាត់ (រូបភាពបន្ថែម 1b)។ ជំហានច្រោះទាំងនេះអនុវត្តចំពោះបណ្ណាល័យលំដាប់ HTS ទាំងអស់។ សម្រាប់បណ្ណាល័យស្តង់ដារ ការអានសរុបចំនួន 233,868 ត្រូវបានទទួល ដែលក្នុងនោះ 39% បានឆ្លងកាត់លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យតម្រង ហើយត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគបណ្ណាល័យ និងការជ្រើសរើសសម្រាប់ជុំបន្តបន្ទាប់ (រូបភាពបន្ថែម 1c–e)។ ការអានភាគច្រើនជាពហុគុណនៃគូមូលដ្ឋានចំនួន 3 ដែលមានប្រវែងជាមួយនឹងកំពូលនៅ 36 នុយក្លេអូទីត (រូបភាពបន្ថែម 1c) ដែលបញ្ជាក់ពីការរចនាបណ្ណាល័យ (NNK) 1-12។ ជាពិសេស ប្រហែល 11% នៃសមាជិកបណ្ណាល័យមានការបញ្ចូល PAGISRELVDKL ឆ្អឹងខ្នងប្រភេទព្រៃ (wt) 12 វិមាត្រ ហើយស្ទើរតែពាក់កណ្តាលនៃលំដាប់ (49%) មានការបញ្ចូល ឬការលុប។ HTS នៃបណ្ណាល័យបណ្ណាល័យបានបញ្ជាក់ពីភាពចម្រុះខ្ពស់នៃ peptides នៅក្នុងបណ្ណាល័យ៖ លំដាប់ peptide ច្រើនជាង 81% ត្រូវបានរកឃើញតែម្តង ហើយមានតែ 1.5% ប៉ុណ្ណោះដែលកើតឡើងក្នុង ≥4 ច្បាប់ចម្លង (រូបភាពបន្ថែម 2a)។ ប្រេកង់នៃអាស៊ីតអាមីណូ (aa) នៅគ្រប់ទីតាំងទាំង 12 នៅក្នុងបញ្ជីមានទំនាក់ទំនងល្អជាមួយនឹងប្រេកង់ដែលរំពឹងទុកសម្រាប់ចំនួនកូដុងដែលបង្កើតឡើងដោយបញ្ជី NKK ដែលទ្រុឌទ្រោម (រូបភាពបន្ថែម 2b)។ ប្រេកង់ដែលសង្កេតឃើញនៃសំណល់ aa ដែលបានអ៊ិនកូដដោយការបញ្ចូលទាំងនេះមានទំនាក់ទំនងល្អជាមួយនឹងប្រេកង់ដែលបានគណនា (r = 0.893) (រូបភាពបន្ថែម 2c)។ ការរៀបចំបណ្ណាល័យហ្វាសសម្រាប់ចាក់រួមមានជំហាននៃការពង្រីក និងការដកយកអង់ដូតូស៊ីនចេញ។ នេះត្រូវបានបង្ហាញពីមុនថាអាចកាត់បន្ថយភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យហ្វាស12,13។ ដូច្នេះ យើងបានរៀបចំលំដាប់បណ្ណាល័យហ្វាសដែលបានពង្រីកបន្ទះដែលបានឆ្លងកាត់ការដកយកអង់ដូតូស៊ីនចេញ ហើយប្រៀបធៀបវាជាមួយបណ្ណាល័យដើមដើម្បីប៉ាន់ស្មានប្រេកង់នៃ AA។ ទំនាក់ទំនងខ្លាំង (r = 0.995) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញរវាងអាងដើម និងអាងដែលបានពង្រីក និងបន្សុទ្ធ (រូបភាពបន្ថែម 2d) ដែលបង្ហាញថាការប្រកួតប្រជែងរវាងក្លូនដែលបានពង្រីកនៅលើបន្ទះដោយប្រើហ្វាស T7 មិនបានបង្កឱ្យមានភាពលំអៀងធំដុំនោះទេ។ ការប្រៀបធៀបនេះគឺផ្អែកលើភាពញឹកញាប់នៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីតនៅក្នុងបណ្ណាល័យនីមួយៗ ដោយសារភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យ (~109) មិនអាចចាប់យកបានពេញលេញទេ សូម្បីតែជាមួយ HTS ក៏ដោយ។ ការវិភាគភាពញឹកញាប់នៃ aa នៅទីតាំងនីមួយៗបានបង្ហាញពីភាពលំអៀងអាស្រ័យលើទីតាំងតូចមួយនៅក្នុងទីតាំងបីចុងក្រោយនៃបញ្ជីដែលបានបញ្ចូល (រូបភាពបន្ថែម 2e)។ សរុបមក យើងបានសន្និដ្ឋានថា គុណភាព និងភាពចម្រុះនៃបណ្ណាល័យគឺអាចទទួលយកបាន ហើយមានតែការផ្លាស់ប្តូរតិចតួចប៉ុណ្ណោះនៃភាពចម្រុះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយសារតែការពង្រីក និងការរៀបចំបណ្ណាល័យផាចរវាងជុំជាច្រើននៃការជ្រើសរើស។
ការយកសំណាកសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងជាបន្តបន្ទាប់អាចត្រូវបានអនុវត្តដោយការវះកាត់ដាក់បំពង់ចូលទៅក្នុង CM នៃសត្វកណ្តុរដែលមានស្មារតី ដើម្បីសម្រួលដល់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណរបស់ផាច T7 ដែលត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែន (iv) តាមរយៈ BBB និង/ឬ BCSFB (រូបភាពទី 1a-b)។ យើងបានប្រើដៃជ្រើសរើសឯករាជ្យពីរ (ដៃ A និង B) នៅក្នុងជុំទីបីដំបូងនៃការជ្រើសរើសក្នុងខ្លួន (រូបភាពទី 1c)។ យើងបានបង្កើនភាពតឹងរ៉ឹងនៃការជ្រើសរើសបន្តិចម្តងៗ ដោយកាត់បន្ថយបរិមាណសរុបនៃផាចដែលបានណែនាំនៅក្នុងជុំទីបីដំបូងនៃការជ្រើសរើស។ សម្រាប់ជុំទីបួននៃការរែង យើងបានផ្សំសំណាកពីសាខា A និង B ហើយបានអនុវត្តការជ្រើសរើសឯករាជ្យចំនួនបីបន្ថែមទៀត។ ដើម្បីសិក្សាពីលក្ខណៈសម្បត្តិក្នុងខ្លួនរបស់ភាគល្អិតផាច T7 នៅក្នុងគំរូនេះ ផាចប្រភេទព្រៃ (PAGISRELVDKL master insert) ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងសត្វកណ្តុរតាមរយៈសរសៃកន្ទុយ។ ការស្តារផាចពីសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង និងឈាមនៅចំណុចពេលវេលាផ្សេងៗគ្នាបានបង្ហាញថា ផាច T7 icosahedral តូចៗដែលមានទំនាក់ទំនងគ្នាមានដំណាក់កាលបោសសំអាតដំបូងយ៉ាងឆាប់រហ័សពីបន្ទប់ឈាម (រូបភាពបន្ថែមទី 3)។ ដោយផ្អែកលើកម្រិតថ្នាំដែលត្រូវបានចាក់ និងបរិមាណឈាមរបស់សត្វកណ្តុរ យើងបានគណនាថា មានតែប្រហែល 1% wt. នៃហ្វាសពីកម្រិតថ្នាំដែលបានចាក់ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងឈាម 10 នាទីបន្ទាប់ពីការចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែន។ បន្ទាប់ពីការធ្លាក់ចុះយ៉ាងឆាប់រហ័សនេះ ការបោសសំអាតបឋមយឺតជាងត្រូវបានវាស់វែងជាមួយនឹងអាយុកាលពាក់កណ្តាល 27.7 នាទី។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ មានតែហ្វាសមួយចំនួនតូចប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានយកចេញពីបន្ទប់ CSF ដែលបង្ហាញពីផ្ទៃខាងក្រោយទាបសម្រាប់ការធ្វើចំណាកស្រុករបស់ហ្វាសប្រភេទព្រៃចូលទៅក្នុងបន្ទប់ CSF (រូបភាពបន្ថែមទី 3)។ ជាមធ្យម មានតែប្រហែល 1 x 10-3% នៃហ្វាស T7 នៅក្នុងឈាម និង 4 x 10-8% នៃហ្វាសដែលចាក់ដំបូងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងក្នុងរយៈពេលយកសំណាកទាំងមូល (0-250 នាទី)។ ជាពិសេស អាយុកាលពាក់កណ្តាល (25.7 នាទី) នៃហ្វាសប្រភេទព្រៃនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលសង្កេតឃើញនៅក្នុងឈាម។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា របាំងដែលបំបែកបន្ទប់ CSF ចេញពីឈាមគឺនៅដដែលនៅក្នុងសត្វកណ្តុរដែលមានបំពង់ CM ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការជ្រើសរើសបណ្ណាល័យហ្វាចនៅក្នុងខ្លួន ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណក្លូនដែលត្រូវបានដឹកជញ្ជូនយ៉ាងងាយស្រួលពីឈាមចូលទៅក្នុងបន្ទប់ CSF។
(ក) ការរៀបចំវិធីសាស្ត្រសម្រាប់ការយកសំណាកឡើងវិញនូវសារធាតុរាវខួរក្បាល (CSF) ពីអាងធំមួយ។ (ខ) ដ្យាក្រាមបង្ហាញទីតាំងកោសិកានៃរបាំងប្រព័ន្ធសរសៃប្រសាទកណ្តាល (CNS) និងយុទ្ធសាស្ត្រជ្រើសរើសដែលប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides ដែលឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល (BBB) ​​​​និងរបាំងឈាម-ខួរក្បាល។ (គ) ដ្យាក្រាមលំហូរការត្រួតពិនិត្យការបង្ហាញ phage ក្នុង vivo។ នៅក្នុងជុំនីមួយៗនៃការជ្រើសរើស phages (ឧបករណ៍កំណត់អត្តសញ្ញាណសត្វនៅខាងក្នុងព្រួញ) ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែន។ សាខាជំនួសឯករាជ្យពីរ (A, B) ត្រូវបានរក្សាទុកដោយឡែកពីគ្នារហូតដល់ជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។ សម្រាប់ជុំជ្រើសរើសទី 3 និងទី 4 ក្លូន phage នីមួយៗដែលស្រង់ចេញពី CSF ត្រូវបានរៀបចំលំដាប់ដោយដៃ។ (ឃ) ចលនវិទ្យានៃ phage ដែលញែកចេញពីឈាម (រង្វង់ពណ៌ក្រហម) និងសារធាតុរាវខួរក្បាល (ត្រីកោណពណ៌បៃតង) ក្នុងអំឡុងពេលជុំទីមួយនៃការជ្រើសរើសចំពោះសត្វកណ្តុរពីរក្បាលដែលចាក់តាមសរសៃឈាមបន្ទាប់ពីការចាក់តាមសរសៃឈាមនៃបណ្ណាល័យ peptide T7 (2 x 1012 phages/សត្វ)។ ការ៉េពណ៌ខៀវបង្ហាញពីកំហាប់ដំបូងនៃហ្វាសនៅក្នុងឈាម ដែលគណនាចេញពីបរិមាណហ្វាសដែលបានចាក់ ដោយគិតគូរពីបរិមាណឈាមសរុប។ ការ៉េពណ៌ខ្មៅបង្ហាញពីចំណុចប្រសព្វនៃខ្សែ y ដែលបានពង្រីកចេញពីកំហាប់ហ្វាសក្នុងឈាម។ (ង,ច) បង្ហាញប្រេកង់ទាក់ទង និងការចែកចាយនៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីតដែលត្រួតស៊ីគ្នាទាំងអស់ដែលមាននៅក្នុងប៉ិបទីត។ ចំនួនលំនាំដែលរកឃើញក្នុងការអានចំនួន 1000 ត្រូវបានបង្ហាញ។ លំនាំដែលសម្បូរទៅដោយ (p < 0.001) ត្រូវបានសម្គាល់ដោយចំណុចក្រហម។ (ង) គ្រោងការរាយប៉ាយទំនាក់ទំនងប្រៀបធៀបប្រេកង់ទាក់ទងនៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីតនៃបណ្ណាល័យដែលបានចាក់ជាមួយហ្វាសដែលទទួលបានឈាមពីសត្វ #1.1 និង #1.2។ (ច) គ្រោងការរាយប៉ាយទំនាក់ទំនងប្រៀបធៀបប្រេកង់ទាក់ទងនៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីតរបស់ហ្វាសសត្វ #1.1 និង #1.2 ដែលញែកដាច់ពីគ្នានៅក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង។ (ជ,ជ) ការតំណាងលេខសម្គាល់លំដាប់នៃហ្វាសដែលសម្បូរទៅដោយឈាម (ជ) ធៀបនឹងបណ្ណាល័យដែលបានចាក់ និងហ្វាសដែលសម្បូរទៅដោយ CSF (ជ) ធៀបនឹងឈាមបន្ទាប់ពីការជ្រើសរើសក្នុងខ្លួនមួយជុំនៅក្នុងសត្វទាំងពីរ។ ទំហំនៃលេខកូដអក្សរមួយបង្ហាញពីភាពញឹកញាប់នៃអាស៊ីតអាមីណូនោះកើតឡើងនៅទីតាំងនោះ។ ពណ៌បៃតង = ប៉ូលា ពណ៌ស្វាយ = អព្យាក្រឹត ពណ៌ខៀវ = បាស ពណ៌ក្រហម = អាស៊ីត និងពណ៌ខ្មៅ = អាស៊ីតអាមីណូដែលមិនរលាយក្នុងទឹក។ រូបភាពទី 1a, ខ ត្រូវបានរចនា និងផលិតដោយ Eduard Urich។
យើងបានចាក់បណ្ណាល័យ peptide phage ចូលទៅក្នុងកណ្តុរឧបករណ៍ CM ពីរក្បាល (ក្រុម A និង B) ហើយញែក phage ចេញពីសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង និងឈាម (រូបភាពទី 1d)។ ការសម្អាតបណ្ណាល័យយ៉ាងឆាប់រហ័សដំបូងគឺមិនសូវច្បាស់បើប្រៀបធៀបទៅនឹង phage ប្រភេទព្រៃ។ អាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃបណ្ណាល័យដែលត្រូវបានចាក់នៅក្នុងសត្វទាំងពីរគឺ 24.8 នាទីនៅក្នុងឈាម ស្រដៀងនឹង phage ប្រភេទព្រៃ និង 38.5 នាទីនៅក្នុង CSF។ គំរូ phage ឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងពីសត្វនីមួយៗត្រូវបានទទួលរងនូវ HTS ហើយ peptides ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទាំងអស់ត្រូវបានវិភាគសម្រាប់វត្តមាននៃ motif tripeptide ខ្លី។ motifs Tripeptide ត្រូវបានជ្រើសរើសព្រោះវាផ្តល់នូវមូលដ្ឋានអប្បបរមាសម្រាប់ការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ និងអន្តរកម្ម peptide-ប្រូតេអ៊ីន14,15។ យើងបានរកឃើញទំនាក់ទំនងល្អនៅក្នុងការចែកចាយ motifs រវាងបណ្ណាល័យ phage ដែលបានចាក់ និងក្លូនដែលស្រង់ចេញពីឈាមរបស់សត្វទាំងពីរ (រូបភាពទី 1e)។ ទិន្នន័យបង្ហាញថាសមាសធាតុនៃបណ្ណាល័យត្រូវបានបង្កើនតិចតួចប៉ុណ្ណោះនៅក្នុងផ្នែកឈាម។ ប្រេកង់អាស៊ីតអាមីណូ និងលំដាប់នៃការឯកភាពគ្នាត្រូវបានវិភាគបន្ថែមនៅទីតាំងនីមួយៗដោយប្រើការសម្របខ្លួននៃកម្មវិធី Weblogo16។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានរកឃើញការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៃសំណល់គ្លីស៊ីនក្នុងឈាម (រូបភាពទី 1g)។ នៅពេលដែលឈាមត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងក្លូនដែលបានជ្រើសរើសពី CSF ការជ្រើសរើសយ៉ាងខ្លាំង និងការមិនជ្រើសរើសលំនាំមួយចំនួនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាពទី 1f) ហើយអាស៊ីតអាមីណូមួយចំនួនមានវត្តមាននៅទីតាំងដែលបានកំណត់ទុកជាមុននៅក្នុងសមាជិក 12 (រូបភាពទី 1h)។ ជាពិសេស សត្វនីមួយៗមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង ខណៈពេលដែលការកើនឡើងនៃគ្លីស៊ីនក្នុងឈាមត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងសត្វទាំងពីរ (រូបភាពបន្ថែម 4a-j)។ បន្ទាប់ពីការច្រោះទិន្នន័យលំដាប់យ៉ាងតឹងរ៉ឹងនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងរបស់សត្វ #1.1 និង #1.2 សរុបចំនួន 964 និង 420 ប៉ិបទីត 12-mer តែមួយគត់ត្រូវបានទទួល (រូបភាពបន្ថែម 1d-e)។ ក្លូនហ្វាសដាច់ដោយឡែកត្រូវបានពង្រីក និងទទួលរងនូវការជ្រើសរើសជុំទីពីរនៅក្នុងខ្លួន។ ហ្វាសដែលស្រង់ចេញពីជុំទីពីរនៃការជ្រើសរើសត្រូវបានទទួលរងនូវ HTS នៅក្នុងសត្វនីមួយៗ ហើយប៉ិបទីតដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទាំងអស់ត្រូវបានប្រើជាការបញ្ចូលទៅក្នុងកម្មវិធីទទួលស្គាល់លំនាំដើម្បីវិភាគការកើតឡើងនៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីត (រូបភាពទី 2a, b, ef)។ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវដ្តដំបូងនៃហ្វាសដែលបានស្តារឡើងវិញពីទឹកខួរឆ្អឹងខ្នង យើងបានសង្កេតឃើញការជ្រើសរើស និងការមិនជ្រើសរើសបន្ថែមទៀតនៃលំនាំជាច្រើននៅក្នុងទឹកខួរឆ្អឹងខ្នងនៅក្នុងសាខា A និង B (រូបភាពទី 2)។ ក្បួនដោះស្រាយកំណត់អត្តសញ្ញាណបណ្តាញត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីកំណត់ថាតើពួកវាតំណាងឱ្យគំរូផ្សេងៗគ្នានៃលំដាប់ស្របគ្នាដែរឬទេ។ ភាពស្រដៀងគ្នាយ៉ាងច្បាស់មួយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញរវាងលំដាប់ 12 វិមាត្រដែលស្តារឡើងវិញដោយទឹកខួរឆ្អឹងខ្នងនៅក្នុងក្លាដេសជំនួស A (រូបភាពទី 2c, d) និងក្លាដេស B (រូបភាពទី 2g, h)។ ការវិភាគរួមបញ្ចូលគ្នានៅក្នុងសាខានីមួយៗបានបង្ហាញពីទម្រង់ជ្រើសរើសផ្សេងៗគ្នាសម្រាប់ប៉ិបទីត 12-mer (រូបភាពបន្ថែម 5c, d) និងការកើនឡើងនៃសមាមាត្រ CSF/ឈាមតាមពេលវេលាសម្រាប់ក្លូនដែលរួមបញ្ចូលគ្នាបន្ទាប់ពីជុំទីពីរនៃការជ្រើសរើសបើប្រៀបធៀបទៅនឹងជុំទីមួយនៃការជ្រើសរើស (រូបភាពបន្ថែម 5e)។
ការបង្កើនភាពសម្បូរបែបនៃលំនាំ និងប៉ិបទីតនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងដោយការជ្រើសរើសការបង្ហាញហ្វាសមុខងារក្នុងខ្លួនពីរជុំជាប់ៗគ្នា។
ហ្វាសសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងទាំងអស់ដែលបានស្តារឡើងវិញពីជុំទីមួយនៃសត្វនីមួយៗ (សត្វ #1.1 និង #1.2) ត្រូវបានបញ្ចូលគ្នា ពង្រីក រៀបលំដាប់ HT និងចាក់ឡើងវិញជាមួយគ្នា (ហ្វាស 2 x 1010/សត្វ) កណ្តុរ SM ចំនួន 2 ក្បាលដែលមានបំពង់ (#1.1 → #)។ 2.1 និង 2.2, 1.2 → 2.3 និង 2.4)។ (a,b,e,f) គ្រោងរាយប៉ាយទំនាក់ទំនងប្រៀបធៀបប្រេកង់ទាក់ទងនៃលំនាំទ្រីប៉ិបទីតនៃហ្វាសដែលទទួលបានពី CSF ទាំងអស់នៅក្នុងជុំជ្រើសរើសទីមួយ និងទីពីរ។ ប្រេកង់ទាក់ទង និងការចែកចាយលំនាំដែលតំណាងឱ្យទ្រីប៉ិបទីតដែលត្រួតស៊ីគ្នាទាំងអស់ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងប៉ិបទីតក្នុងទិសដៅទាំងពីរ។ ចំនួនលំនាំដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការអាន 1000 ត្រូវបានបង្ហាញ។ លំនាំដែលត្រូវបានជ្រើសរើស ឬដកចេញយ៉ាងច្រើន (p < 0.001) នៅក្នុងបណ្ណាល័យមួយក្នុងចំណោមបណ្ណាល័យដែលបានប្រៀបធៀបត្រូវបានបន្លិចដោយចំណុចក្រហម។ (គ, ឃ, ឆ, ជ) ការតំណាងឡូហ្គោលំដាប់នៃលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូ 12 ដែលសម្បូរទៅដោយ CSF ទាំងអស់ដោយផ្អែកលើជុំទី 2 និងទី 1 នៃការជ្រើសរើសក្នុងខ្លួន។ ទំហំនៃលេខកូដមួយអក្សរបង្ហាញពីភាពញឹកញាប់នៃអាស៊ីតអាមីណូនោះកើតឡើងនៅទីតាំងនោះ។ ដើម្បីតំណាងឱ្យឡូហ្គោ ភាពញឹកញាប់នៃលំដាប់ CSF ដែលស្រង់ចេញពីសត្វនីមួយៗរវាងជុំជ្រើសរើសពីរត្រូវបានប្រៀបធៀប ហើយលំដាប់ដែលសម្បូរបែបនៅក្នុងជុំទីពីរត្រូវបានបង្ហាញ៖ (គ) #1.1–#2.1 (ឃ) #1.1–#2.2 (ឆ) #1.2–#2.3 និង (ជ) #1.2–#2.4។ អាស៊ីតអាមីណូដែលសម្បូរបែបបំផុតនៅទីតាំងដែលបានផ្តល់ឱ្យនៅក្នុង (គ, ឃ) សត្វលេខ 2.1 និងលេខ 2.2 ឬ (ឆ, ជ) នៅក្នុងសត្វលេខ 2.3 និងលេខ 2.4 ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌។ ពណ៌បៃតង = ប៉ូល ពណ៌ស្វាយ = អព្យាក្រឹត ពណ៌ខៀវ = បាស ពណ៌ក្រហម = អាស៊ីត និងខ្មៅ = អាស៊ីតអាមីណូដែលមិនរលាយក្នុងទឹក។
បន្ទាប់ពីជុំទីបីនៃការជ្រើសរើស យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណលំដាប់ peptide តែមួយគត់ចំនួន 124 (#3.1 និង #3.2) ពីក្លូន phage ដែលបានបង្កើតឡើងឡើងវិញចំនួន 332 ដែលញែកចេញពីសត្វពីរ (រូបភាពបន្ថែម 6a)។ លំដាប់ LGSVS (18.7%) មានសមាមាត្រទាក់ទងខ្ពស់បំផុត បន្ទាប់មកគឺការបញ្ចូលប្រភេទព្រៃ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) និង SARGSWREIVSLS (2.2%)។ នៅក្នុងជុំទីបួនចុងក្រោយ យើងបានប្រមូលផ្តុំមែកពីរដែលបានជ្រើសរើសដោយឯករាជ្យពីសត្វបីដាច់ដោយឡែកពីគ្នា (រូបភាពទី 1c)។ ក្នុងចំណោមក្លូន phage ដែលមានលំដាប់ 925 ដែលបានរកឃើញពី CSF នៅក្នុងជុំទីបួន យើងបានរកឃើញលំដាប់ peptide តែមួយគត់ចំនួន 64 (រូបភាពបន្ថែម 6b) ដែលក្នុងនោះសមាមាត្រទាក់ទងនៃ phage ប្រភេទព្រៃបានធ្លាក់ចុះមកត្រឹម 0.8%។ ក្លូន CSF ទូទៅបំផុតនៅក្នុងជុំទីបួនគឺ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KWAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) និង RLSSVDSDLSGC (3, 2%)។ ជួរប្រវែងនៃ peptide ដែលបានជ្រើសរើសគឺដោយសារតែការបញ្ចូល/លុបនុយក្លេអូទីត ឬកូដុងឈប់មុនអាយុនៅក្នុង primers បណ្ណាល័យនៅពេលប្រើកូដុង degenerate សម្រាប់ការរចនាបណ្ណាល័យ NNK។ កូដុងឈប់មុនអាយុបង្កើត peptides ខ្លីជាង ហើយត្រូវបានជ្រើសរើសព្រោះវាមាន motif aa អំណោយផល។ peptides វែងជាងអាចបណ្តាលមកពីការបញ្ចូល/លុបនៅក្នុង primers នៃបណ្ណាល័យសំយោគ។ នេះដាក់កូដុងឈប់ដែលបានរចនានៅខាងក្រៅស៊ុម ហើយអានវារហូតដល់កូដុងឈប់ថ្មីលេចឡើងនៅខាងក្រោម។ ជាទូទៅ យើងបានគណនាកត្តាបង្កើនប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ជុំជ្រើសរើសទាំងបួនដោយប្រៀបធៀបទិន្នន័យបញ្ចូលជាមួយទិន្នន័យទិន្នផលគំរូ។ សម្រាប់ជុំទីមួយនៃការត្រួតពិនិត្យ យើងបានប្រើកម្រិត phage ប្រភេទព្រៃជាឯកសារយោងផ្ទៃខាងក្រោយមិនជាក់លាក់។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការជ្រើសរើស phage អវិជ្ជមានគឺខ្លាំងខ្លាំងណាស់នៅក្នុងវដ្ត CSF ដំបូង ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងឈាមទេ (រូបភាពទី 3a) ដែលអាចបណ្តាលមកពីប្រូបាប៊ីលីតេទាបនៃការសាយភាយអកម្មនៃសមាជិកភាគច្រើននៃបណ្ណាល័យ peptide ទៅក្នុងបន្ទប់ CSF ឬ phage ដែលទាក់ទងមានទំនោរត្រូវបានរក្សាទុក ឬយកចេញពីចរន្តឈាមប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពជាង bacteriophages។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុងជុំទីពីរនៃការ panning ការជ្រើសរើស phage យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង CSF ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង clades ទាំងពីរ ដែលបង្ហាញថាជុំមុនត្រូវបានបង្កើននៅក្នុង phages ដែលបង្ហាញ peptides ដែលជំរុញការស្រូបយក CSF (រូបភាពទី 3a)។ ជាថ្មីម្តងទៀត ដោយគ្មានការបង្កើនឈាមគួរឱ្យកត់សម្គាល់។ ដូចគ្នានេះផងដែរនៅក្នុងជុំទីបី និងទីបួន ក្លូន phage ត្រូវបានបង្កើនយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង CSF។ ការប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃលំដាប់ peptide តែមួយគត់នីមួយៗរវាងជុំពីរចុងក្រោយនៃការជ្រើសរើស យើងបានរកឃើញថាលំដាប់ត្រូវបានបង្កើនកាន់តែច្រើននៅក្នុងជុំទីបួននៃការជ្រើសរើស (រូបភាពទី 3b)។ លំនាំទ្រីប៉ិបទីតសរុបចំនួន 931 ត្រូវបានស្រង់ចេញពីលំដាប់ប៉ិបទីតតែមួយគត់ទាំង 64 ដោយប្រើទិសដៅប៉ិបទីតទាំងពីរ។ លំនាំដែលសម្បូរបែបបំផុតនៅក្នុងជុំទីបួនត្រូវបានពិនិត្យយ៉ាងដិតដល់សម្រាប់ទម្រង់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពរបស់វានៅទូទាំងជុំទាំងអស់បើប្រៀបធៀបទៅនឹងបណ្ណាល័យដែលបានចាក់ (កម្រិតកំណត់៖ ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាព 10%) (រូបភាពបន្ថែម 6c)។ គំរូទូទៅនៃការជ្រើសរើសបានបង្ហាញថា ការជំរុញដែលបានសិក្សាភាគច្រើនត្រូវបានបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៅក្នុងជុំមុនៗទាំងអស់នៃសាខាជ្រើសរើសទាំងពីរ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ លំនាំមួយចំនួន (ឧទាហរណ៍ SGL, VSG, LGS GSV) ភាគច្រើនមកពីក្រុមជំនួស A ខណៈពេលដែលផ្សេងទៀត (ឧទាហរណ៍ FGW, RTN, WGF, NTR) ត្រូវបានបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៅក្នុងក្រុមជំនួស B។
ការផ្ទៀងផ្ទាត់ការដឹកជញ្ជូន CSF នៃ peptides ដែលបង្ហាញដោយ phage ដែលសម្បូរទៅដោយ CSF និង peptides leader biotinylated ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង streptavidin payloads។
(ក) សមាមាត្របង្កើនប្រសិទ្ធភាពដែលបានគណនានៅក្នុងជុំទាំងបួន (R1-R4) ដោយផ្អែកលើកម្រិត phage (PFU) ដែលបានចាក់ (បញ្ចូល = I) និងកម្រិត phage CSF ដែលបានកំណត់ (ទិន្នផល = O)។ កត្តាបង្កើនប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ជុំទាំងបីចុងក្រោយ (R2-R4) ត្រូវបានគណនាដោយការប្រៀបធៀបជាមួយជុំមុន និងជុំទីមួយ (R1) ជាមួយនឹងទិន្នន័យទម្ងន់។ របារបើកចំហគឺជាសារធាតុរាវខួរក្បាល របារដែលមានស្រមោលគឺជាប្លាស្មា។ (***p<0.001 ផ្អែកលើការធ្វើតេស្ត t របស់សិស្ស)។ (ខ) បញ្ជីនៃ peptides phage ដែលមានច្រើនបំផុត ដែលត្រូវបានចាត់ថ្នាក់តាមសមាមាត្រដែលទាក់ទងទៅនឹង phages ទាំងអស់ដែលប្រមូលបាននៅក្នុង CSF បន្ទាប់ពីជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។ ក្លូន phage ចំនួនប្រាំមួយទូទៅបំផុតត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ មានលេខរៀង និងកត្តាបង្កើនប្រសិទ្ធភាពរបស់វារវាងជុំទី 3 និងទី 4 នៃការជ្រើសរើស (បញ្ចូល)។ (គ,ឃ) ក្លូន phage ចំនួនប្រាំមួយដែលបង្កើនប្រសិទ្ធភាពបំផុត បណ្ណាល័យ peptide phage ឪពុកម្តាយ និង peptide phage ដែលបង្កើនប្រសិទ្ធភាពបំផុតពីជុំទី 4 ត្រូវបានវិភាគជាលក្ខណៈបុគ្គលនៅក្នុងគំរូយកគំរូ CSF។ សំណាក CSF និងឈាមត្រូវបានប្រមូលនៅចំណុចពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ (គ) បរិមាណស្មើគ្នានៃក្លូនហ្វាសចំនួន 6 (2 x 1010 ហ្វាស/សត្វ) ហ្វាសទទេ (#1779) (2 x 1010 ហ្វាស/សត្វ) និងបណ្ណាល័យប៉ិបទីតហ្វាសស្តុក (2 x 1012 ហ្វាស/សត្វ)។ ការចាក់យ៉ាងហោចណាស់ 3 CM ត្រូវបានចាក់ទៅលើសត្វដែលត្រូវបានចាក់តាមបំពង់ដោយឡែកពីគ្នាតាមរយៈសរសៃកន្ទុយ។ ឱសថសាស្ត្រនៃសារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នង (CSF) នៃក្លូនហ្វាសនីមួយៗដែលបានចាក់ និងបណ្ណាល័យប៉ិបទីតហ្វាសតាមពេលវេលាត្រូវបានបង្ហាញ។ (ឃ) បង្ហាញពីសមាមាត្រ CSF/ឈាមជាមធ្យមសម្រាប់ហ្វាសដែលបានជាសះស្បើយទាំងអស់/មីលីលីត្រក្នុងរយៈពេលយកសំណាក។ (ង) ប៉ិបទីតនាំមុខសំយោគចំនួនបួន និងក្រុមត្រួតពិនិត្យដែលបានច្របល់មួយត្រូវបានភ្ជាប់ជាមួយប៊ីយ៉ូទីនទៅនឹងស្ទ្រីបតាវីឌីនតាមរយៈចុង N-terminus របស់វា (ការបង្ហាញតេត្រាមឺរ) បន្ទាប់មកដោយការចាក់ (សរសៃកន្ទុយ iv, ស្ទ្រីបតាវីឌីន 10 មីលីក្រាម/គីឡូក្រាម)។ យ៉ាងហោចណាស់កណ្តុរបីក្បាលដែលបានដាក់បំពង់ខ្យល់ (N = 3)។ សំណាក CSF ត្រូវបានប្រមូលនៅចំណុចពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ហើយកំហាប់ streptavidin ត្រូវបានវាស់ដោយ CSF anti-streptavidin ELISA (nd = មិនត្រូវបានរកឃើញ)។ (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ផ្អែកលើការធ្វើតេស្ត ANOVA)។ (f) ការប្រៀបធៀបលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូនៃក្លូន peptide phage ដែលសម្បូរបំផុត #2002 (ពណ៌ស្វាយ) ជាមួយនឹងក្លូន peptide phage ដែលបានជ្រើសរើសផ្សេងទៀតពីជុំទី 4 នៃការជ្រើសរើស។ បំណែកអាស៊ីតអាមីណូដូចគ្នា និងស្រដៀងគ្នាត្រូវបានសរសេរកូដពណ៌។
ក្នុងចំណោមហ្វាសដែលបានពង្រឹងទាំងអស់នៅក្នុងជុំទីបួន (រូបភាពទី 3b) ក្លូនបេក្ខជនចំនួនប្រាំមួយត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់ការវិភាគជាលក្ខណៈបុគ្គលបន្ថែមទៀតនៅក្នុងគំរូយកសំណាក CSF។ បរិមាណស្មើគ្នានៃហ្វាសបេក្ខជនចំនួនប្រាំមួយ ហ្វាសទទេ (គ្មានការបញ្ចូល) និងបណ្ណាល័យប៉ិបទីតប្រូហ្វាសត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងសត្វ CM ចំនួនបីដែលមានបំពង់ ហើយឱសថសាស្ត្រត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងការវិភាគ CSF (រូបភាពទី 3c) និងឈាម (រូបភាពបន្ថែមទី 7)។ ក្លូនហ្វាសទាំងអស់ដែលត្រូវបានសាកល្បងបានកំណត់គោលដៅផ្នែក CSF នៅកម្រិតខ្ពស់ជាង 10-1000 ដងជាងហ្វាសត្រួតពិនិត្យទទេ (#1779)។ ឧទាហរណ៍ ក្លូន #2020 និង #2077 មានកម្រិត CSF ខ្ពស់ជាងហ្វាសត្រួតពិនិត្យប្រហែល 1000 ដង។ ទម្រង់ឱសថសាស្ត្រនៃប៉ិបទីតដែលបានជ្រើសរើសនីមួយៗគឺខុសគ្នា ប៉ុន្តែពួកវាទាំងអស់មានសមត្ថភាព homing CSF ខ្ពស់។ យើងបានសង្កេតឃើញការថយចុះជាប់លាប់តាមពេលវេលាសម្រាប់ក្លូន #1903 និង #2011 ខណៈពេលដែលសម្រាប់ក្លូន #2077, #2002 និង #2009 ការកើនឡើងក្នុងអំឡុងពេល 10 នាទីដំបូងអាចបង្ហាញពីការដឹកជញ្ជូនសកម្ម ប៉ុន្តែត្រូវការផ្ទៀងផ្ទាត់។ ក្លូន #2020, #2002 និង #2077 មានស្ថេរភាពនៅកម្រិតខ្ពស់ ខណៈពេលដែលកំហាប់ CSF នៃក្លូន #2009 បានថយចុះយឺតៗបន្ទាប់ពីការកើនឡើងដំបូង។ បន្ទាប់មកយើងបានប្រៀបធៀបប្រេកង់ដែលទាក់ទងនៃបេក្ខជន CSF នីមួយៗជាមួយនឹងកំហាប់ឈាមរបស់វា (រូបភាពទី 3d)។ ទំនាក់ទំនងនៃកម្រិតមធ្យមនៃបេក្ខជន CSF នីមួយៗជាមួយនឹងកម្រិតឈាមរបស់វានៅពេលវេលាយកសំណាកទាំងអស់បានបង្ហាញថាបេក្ខជនបីនាក់ក្នុងចំណោមបេក្ខជនទាំងប្រាំមួយនាក់មានកម្រិត CSF ឈាមខ្ពស់។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ក្លូន #2077 បានបង្ហាញពីស្ថេរភាពឈាមខ្ពស់ជាង (រូបភាពបន្ថែមទី 7)។ ដើម្បីបញ្ជាក់ថា peptides ខ្លួនឯងមានសមត្ថភាពដឹកជញ្ជូនទំនិញយ៉ាងសកម្មក្រៅពីភាគល្អិត phage ចូលទៅក្នុងបន្ទប់ CSF យើងបានសំយោគ peptides នាំមុខចំនួនបួនដែលដេរីវេជាមួយ biotin នៅចុង N-terminus ជាកន្លែងដែល peptides ភ្ជាប់ទៅនឹងភាគល្អិត phage។ ប៉ិបទីតដែលមានជីវទីន (លេខ 2002, 2009, 2020 និង 2077) ត្រូវបានផ្សំជាមួយស្ទ្រីបតាវីឌីន (SA) ដើម្បីទទួលបានទម្រង់ពហុមេរិកដែលធ្វើត្រាប់តាមធរណីមាត្រហ្វាជ។ ទម្រង់នេះក៏អនុញ្ញាតឱ្យយើងវាស់ការប៉ះពាល់ SA នៅក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងជាប៉ិបទីតប្រូតេអ៊ីនដឹកជញ្ជូនទំនិញផងដែរ។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ ទិន្នន័យហ្វាជអាចត្រូវបានបង្កើតឡើងវិញជាញឹកញាប់នៅពេលដែលប៉ិបទីតសំយោគត្រូវបានគ្រប់គ្រងក្នុងទម្រង់ភ្ជាប់ SA នេះ (រូបភាពទី 3e)។ ប៉ិបទីតដែលបានច្របល់មានការប៉ះពាល់ដំបូងតិច និងការសម្អាត CSF លឿនជាងមុនជាមួយនឹងកម្រិតមិនអាចរកឃើញក្នុងរយៈពេល 48 ម៉ោង។ ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងអំពីផ្លូវចែកចាយនៃក្លូនហ្វាជ ប៉ិបទីតទាំងនេះទៅក្នុងលំហ CSF យើងបានវិភាគទីតាំងនៃការប៉ះទង្គិចប៉ិបទីតហ្វាជនីមួយៗដោយប្រើអ៊ីមមូណូហ៊ីស្តូគីមីវិទ្យា (IHC) ដើម្បីរកឃើញភាគល្អិតហ្វាជដោយផ្ទាល់ 1 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែននៅក្នុងខ្លួន។ ជាពិសេស ក្លូន #2002, #2077, និង #2009 អាចត្រូវបានរកឃើញដោយការជ្រលក់ពណ៌ខ្លាំងនៅក្នុងសរសៃឈាមតូចៗក្នុងខួរក្បាល ខណៈពេលដែលហ្វាចត្រួតពិនិត្យ (#1779) និងក្លូន #2020 មិនត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាពបន្ថែមទី 8)។ នេះបង្ហាញថា ប៉ិបទីតទាំងនេះរួមចំណែកដល់ឥទ្ធិពលលើខួរក្បាលយ៉ាងជាក់លាក់ដោយការឆ្លងកាត់ BBB។ ការវិភាគលម្អិតបន្ថែមទៀតគឺត្រូវបានទាមទារដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះ ព្រោះផ្លូវ BSCFB ក៏អាចពាក់ព័ន្ធផងដែរ។ នៅពេលប្រៀបធៀបលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូនៃក្លូនដែលសម្បូរបំផុត (#2002) ជាមួយប៉ិបទីតដែលបានជ្រើសរើសផ្សេងទៀត វាត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាពួកវាមួយចំនួនមានផ្នែកបន្ថែមអាស៊ីតអាមីណូស្រដៀងគ្នា ដែលអាចបង្ហាញពីយន្តការដឹកជញ្ជូនស្រដៀងគ្នា (រូបភាពទី 3f)។
ដោយសារតែទម្រង់ប្លាស្មាតែមួយគត់របស់វា និងការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃសារធាតុរាវខួរក្បាល (CSF) តាមពេលវេលា ក្លូនបង្ហាញហ្វាច #2077 ត្រូវបានរុករកបន្ថែមទៀតក្នុងរយៈពេល 48 ម៉ោងយូរជាងនេះ ហើយអាចបង្កើតឡើងវិញនូវការកើនឡើងយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃសារធាតុរាវខួរក្បាល (CSF) ដែលសង្កេតឃើញទាក់ទងនឹងកម្រិត SA ជាប់លាប់ (រូបភាពទី 4a)។ ទាក់ទងនឹងក្លូនហ្វាចផ្សេងទៀតដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ #2077 បានប្រឡាក់ពណ៌យ៉ាងខ្លាំងសម្រាប់សរសៃឈាមតូចៗក្នុងខួរក្បាល និងបានបង្ហាញពីការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងសារធាតុសម្គាល់សរសៃឈាមតូចៗ (lectin) នៅពេលមើលក្នុងគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ជាងនេះ និងអាចមានស្នាមប្រឡាក់ខ្លះនៅក្នុងលំហសរសៃប្រសាទ (រូបភាពទី 4b)។ ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើឥទ្ធិពលឱសថសាស្ត្រដែលសម្របសម្រួលដោយ peptide អាចទទួលបាននៅក្នុង CNS ដែរឬទេ យើងបានធ្វើពិសោធន៍មួយដែលកំណែ biotinylated នៃ i) peptide transit #2077 និង ii) peptide inhibitor BACE1 ត្រូវបានលាយជាមួយ SA ក្នុងសមាមាត្រពីរផ្សេងគ្នា។ សម្រាប់ការរួមបញ្ចូលគ្នាមួយ យើងបានប្រើតែ peptide inhibitor BACE1 ហើយសម្រាប់ការរួមបញ្ចូលគ្នាមួយទៀត យើងបានប្រើសមាមាត្រ 1:3 នៃ peptide inhibitor BACE1 ទៅនឹង peptide #2077។ គំរូទាំងពីរត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែន ហើយកម្រិតនៃបេតា-អាមីឡូអ៊ីដ ប៉ិបទីត 40 (Abeta40) ក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងត្រូវបានវាស់តាមពេលវេលា។ Abeta40 ត្រូវបានវាស់នៅក្នុង CSF ព្រោះវាឆ្លុះបញ្ចាំងពីការរារាំង BACE1 នៅក្នុងជាលិកាខួរក្បាល។ ដូចដែលរំពឹងទុក ស្មុគស្មាញទាំងពីរបានកាត់បន្ថយកម្រិតឈាមរបស់ Abeta40 យ៉ាងច្រើន (រូបភាពទី 4c, d)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មានតែគំរូដែលមានល្បាយនៃប៉ិបទីតលេខ 2077 និងសារធាតុទប់ស្កាត់ប៉ិបទីត BACE1 ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង SA ប៉ុណ្ណោះដែលបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃ Abeta40 នៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (រូបភាពទី 4c)។ ទិន្នន័យបង្ហាញថា ប៉ិបទីតលេខ 2077 អាចដឹកជញ្ជូនប្រូតេអ៊ីន SA 60 kDa ទៅក្នុង CNS ហើយក៏បង្កើតប្រសិទ្ធភាពឱសថសាស្ត្រជាមួយនឹងសារធាតុទប់ស្កាត់ SA ដែលភ្ជាប់ជាមួយប៉ិបទីត BACE1។
(ក) ការចាក់ក្លូន (2 × 10phages/សត្វ) នៃហ្វាស T7 ដែលបង្ហាញពីទម្រង់ឱសថសាស្ត្ររយៈពេលវែងនៃប៉ិបទីត CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) និងហ្វាសត្រួតពិនិត្យដែលមិនបានចាក់ (#1779) ចំពោះសត្វកណ្តុរយ៉ាងហោចណាស់បីក្បាលដែលបានដាក់បំពង់ខ្យល់ CM ។ (ខ) រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ Confocal នៃសរសៃឈាមតូចៗនៃស្រទាប់ខាងក្រៅតំណាងនៅក្នុងសត្វកណ្តុរដែលចាក់ដោយហ្វាស (2 × 10 10phages/សត្វ) ដែលបង្ហាញពីការប្រឆាំងការជ្រលក់ពណ៌នៃប៉ិបទីត #2077 និងសរសៃឈាម (ឡិចទីន)។ ក្លូនហ្វាសទាំងនេះត្រូវបានផ្តល់ឱ្យសត្វកណ្តុរចំនួន 3 ក្បាល ហើយអនុញ្ញាតឱ្យចរាចររយៈពេល 1 ម៉ោងមុនពេលបញ្ចូលឈាម។ ខួរក្បាលត្រូវបានកាត់ និងជ្រលក់ពណ៌ដោយអង្គបដិប្រាណដែលមានស្លាក FITC ពហុក្លូណាលប្រឆាំងនឹង capsid ហ្វាស T7 ។ ដប់នាទីមុនពេលបញ្ចូលឈាម និងការជួសជុលជាបន្តបន្ទាប់ ឡិចទីនដែលមានស្លាក DyLight594 ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែន។ រូបភាព​ហ្វ្លុយអូរ៉េសង់​បង្ហាញ​ពី​ការ​ជ្រលក់​ពណ៌​ឡិចទីន (ក្រហម) នៃ​ផ្នែក​ខាង​ក្នុង​នៃ​សរសៃឈាម​តូចៗ និង​ហ្វាស (បៃតង) នៅ​ក្នុង​ប្រហោង​នៃ​សរសៃឈាម​តូចៗ និង​ជាលិកា​ខួរក្បាល​ជុំវិញ​សរសៃឈាម។ របារ​មាត្រដ្ឋាន​ត្រូវ​នឹង 10 µm។ (គ, ឃ) ប៉ិបទីត​ទប់ស្កាត់ BACE1 ដែល​មាន​ជីវទីន​តែឯង ឬ​រួម​ជាមួយ​ប៉ិបទីត​ឆ្លងកាត់​ជីវទីន #2077 ត្រូវ​បាន​ភ្ជាប់​ជាមួយ​នឹង streptavidin បន្ទាប់​មក​ដោយ​ការ​ចាក់​តាម​សរសៃឈាម​កណ្តុរ CM ដែល​មាន​បំពង់​យ៉ាងហោចណាស់​បី​ក្បាល (streptavidin 10 mg/kg)។ ការ​ថយ​ចុះ​ដែល​សម្របសម្រួល​ដោយ​ប៉ិបទីត​ទប់ស្កាត់ BACE1 នៅ​ក្នុង Aβ40 ត្រូវ​បាន​វាស់​ដោយ Aβ1-40 ELISA នៅ​ក្នុង​ឈាម (ក្រហម) និង​សារធាតុរាវ​ខួរឆ្អឹងខ្នង (ទឹកក្រូច) នៅ​ចំណុច​ពេលវេលា​ដែល​បាន​បង្ហាញ។ ដើម្បី​ភាព​ច្បាស់លាស់​កាន់តែ​ប្រសើរ បន្ទាត់​ចំនុច​មួយ​ត្រូវ​បាន​គូរ​នៅ​លើ​ក្រាហ្វ​ក្នុង​មាត្រដ្ឋាន 100%។ (គ) ភាគរយនៃការថយចុះនៃ Aβ40 នៅក្នុងឈាម (ត្រីកោណពណ៌ក្រហម) និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (ត្រីកោណពណ៌ទឹកក្រូច) ចំពោះសត្វកណ្តុរដែលបានព្យាបាលដោយ streptavidin ភ្ជាប់ទៅនឹង transit peptide #2077 និង BACE1 inhibitory peptide ក្នុងសមាមាត្រ 3:1។ (ឃ) ភាគរយនៃការថយចុះនៃ Aβ40 ក្នុងឈាម (រង្វង់ពណ៌ក្រហម) និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (រង្វង់ពណ៌ទឹកក្រូច) នៃសត្វកណ្តុរដែលបានព្យាបាលដោយ streptavidin ភ្ជាប់ទៅនឹង BACE1 inhibitory peptide តែប៉ុណ្ណោះ។ កំហាប់ Aβ នៅក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យគឺ 420 pg/ml (គម្លាតស្តង់ដារ = 101 pg/ml)។
ការបង្ហាញហ្វាចត្រូវបានអនុវត្តដោយជោគជ័យនៅក្នុងវិស័យជាច្រើននៃការស្រាវជ្រាវជីវវេជ្ជសាស្ត្រ17។ វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការសិក្សាអំពីភាពចម្រុះសរសៃឈាមនៅក្នុងខ្លួន18,19 ក៏ដូចជាការសិក្សាដែលផ្តោតលើសរសៃឈាមខួរក្បាល20,21,22,23,24,25,26។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានពង្រីកការអនុវត្តវិធីសាស្រ្តជ្រើសរើសនេះមិនត្រឹមតែចំពោះការកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយផ្ទាល់នៃប៉ិបទីតដែលផ្តោតលើសរសៃឈាមខួរក្បាលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងការរកឃើញបេក្ខជនដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិដឹកជញ្ជូនសកម្មដើម្បីឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាលផងដែរ។ ឥឡូវនេះ យើងពិពណ៌នាអំពីការអភិវឌ្ឍនៃនីតិវិធីជ្រើសរើសនៅក្នុងខ្លួននៅក្នុងសត្វកណ្តុរដែលដាក់បំពង់ខ្យល់ CM និងបង្ហាញពីសក្តានុពលរបស់វាក្នុងការកំណត់អត្តសញ្ញាណប៉ិបទីតដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិ homing CSF។ ដោយប្រើហ្វាច T7 ដែលបង្ហាញបណ្ណាល័យនៃប៉ិបទីតចៃដន្យ 12-mer យើងអាចបង្ហាញថាហ្វាច T7 មានទំហំតូចគ្រប់គ្រាន់ (អង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 60 nm)10 ដែលអាចសម្របខ្លួនទៅនឹងរបាំងឈាម-ខួរក្បាល ដោយហេតុនេះឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល ឬ choroid plexus ដោយផ្ទាល់។ យើងបានសង្កេតឃើញថា ការប្រមូលផលសារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នង (CSF) ពីសត្វកណ្តុរ CM ដែលមានបំពង់គឺជាវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យមុខងារក្នុងខ្លួនដែលត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងល្អ ហើយថាហ្វាចដែលស្រង់ចេញមិនត្រឹមតែភ្ជាប់ទៅនឹងសរសៃឈាមប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាថែមទាំងដំណើរការជាឧបករណ៍ដឹកជញ្ជូនឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាលផងដែរ។ លើសពីនេះ ដោយការប្រមូលឈាម និងការអនុវត្ត HTS ទៅលើសារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នង និងហ្វាចដែលទទួលបានឈាមក្នុងពេលដំណាលគ្នា យើងបានបញ្ជាក់ថា ជម្រើសសារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នងរបស់យើងមិនត្រូវបានជះឥទ្ធិពលដោយការបង្កើនឈាម ឬភាពស័ក្តិសមសម្រាប់ការពង្រីករវាងជុំនៃការជ្រើសរើសនោះទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បន្ទប់ឈាមគឺជាផ្នែកមួយនៃនីតិវិធីជ្រើសរើស ដោយសារហ្វាចដែលមានសមត្ថភាពទៅដល់បន្ទប់សារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នងត្រូវតែរស់រានមានជីវិត និងចរាចរក្នុងចរន្តឈាមយូរគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបង្កើនខ្លួនវានៅក្នុងខួរក្បាល។ ដើម្បីទាញយកព័ត៌មានលំដាប់ដែលអាចទុកចិត្តបានពីទិន្នន័យ HTS ឆៅ យើងបានអនុវត្តតម្រងដែលសម្របទៅនឹងកំហុសក្នុងការធ្វើលំដាប់ជាក់លាក់នៃវេទិកានៅក្នុងលំហូរការងារវិភាគ។ ដោយការបញ្ចូលប៉ារ៉ាម៉ែត្រចលនវិទ្យាទៅក្នុងវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យ យើងបានបញ្ជាក់ពីឱសថសាស្ត្រចលនវិទ្យាយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃហ្វាច T7 ប្រភេទព្រៃ (t½ ~ 28 នាទី) ក្នុងឈាម 24, 27, 28 ហើយក៏កំណត់ពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់វានៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (t½ ~ 26 នាទី) ក្នុងមួយនាទី)។ ទោះបីជាមានទម្រង់ឱសថសាស្ត្រស្រដៀងគ្នានៅក្នុងឈាម និង CSF ក៏ដោយ មានតែ 0.001% នៃកំហាប់ឈាមរបស់ហ្វាសអាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង CSF ដែលបង្ហាញពីការចល័តផ្ទៃខាងក្រោយទាបនៃហ្វាស T7 ប្រភេទព្រៃឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល។ ការងារនេះគូសបញ្ជាក់ពីសារៈសំខាន់នៃជុំទីមួយនៃការជ្រើសរើសនៅពេលប្រើយុទ្ធសាស្ត្រ panning ក្នុង vivo ជាពិសេសសម្រាប់ប្រព័ន្ធហ្វាសដែលត្រូវបានសម្អាតយ៉ាងឆាប់រហ័សពីចរន្តឈាម ដោយសារក្លូនមួយចំនួនតូចអាចទៅដល់បន្ទប់ CNS ។ ដូច្នេះ នៅក្នុងជុំទីមួយ ការថយចុះនៃភាពចម្រុះបណ្ណាល័យគឺមានទំហំធំណាស់ ព្រោះមានតែក្លូនមួយចំនួនតូចប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រមូលនៅទីបំផុតនៅក្នុងគំរូ CSF ដ៏តឹងរ៉ឹងនេះ។ យុទ្ធសាស្ត្រ panning ក្នុង vivo នេះរួមមានជំហានជ្រើសរើសជាច្រើនដូចជាការប្រមូលផ្តុំសកម្មនៅក្នុងបន្ទប់ CSF ការរស់រានមានជីវិតរបស់ក្លូននៅក្នុងបន្ទប់ឈាម និងការដកយកក្លូនហ្វាស T7 ចេញពីឈាមក្នុងរយៈពេល 10 នាទីដំបូង (រូបភាពទី 1d និងរូបភាពបន្ថែម 4M)។ ដូច្នេះ បន្ទាប់ពីជុំទីមួយ ក្លូនហ្វាសផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុង CSF ទោះបីជាអាងដំបូងដូចគ្នាត្រូវបានប្រើសម្រាប់សត្វនីមួយៗក៏ដោយ។ នេះបង្ហាញថា ជំហានជ្រើសរើសយ៉ាងតឹងរ៉ឹងច្រើនសម្រាប់បណ្ណាល័យប្រភពដែលមានសមាជិកបណ្ណាល័យមួយចំនួនធំ បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃភាពចម្រុះ។ ដូច្នេះ ព្រឹត្តិការណ៍ចៃដន្យនឹងក្លាយជាផ្នែកសំខាន់មួយនៃដំណើរការជ្រើសរើសដំបូង ដែលជះឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងដល់លទ្ធផល។ វាទំនងជាថា ក្លូនជាច្រើននៅក្នុងបណ្ណាល័យដើមមានទំនោរបង្កើនសារធាតុរាវខួរក្បាលស្រដៀងគ្នាខ្លាំង។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សូម្បីតែស្ថិតនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ដូចគ្នាក៏ដោយ លទ្ធផលនៃការជ្រើសរើសអាចខុសគ្នាដោយសារតែចំនួនតិចតួចនៃក្លូនជាក់លាក់នីមួយៗនៅក្នុងអាងដំបូង។
លំនាំដែលសម្បូរទៅដោយសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងខុសពីលំនាំនៅក្នុងឈាម។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានកត់សម្គាល់ឃើញការផ្លាស់ប្តូរលើកដំបូងឆ្ពោះទៅរកប៉ិបទីតដែលសម្បូរទៅដោយគ្លីស៊ីននៅក្នុងឈាមរបស់សត្វនីមួយៗ។ (រូបភាពទី 1g, រូបភាពបន្ថែម 4e, 4f)។ ប៉ិបទីតដែលមានផ្ទុកគ្លីស៊ីនរបស់ហ្វាចអាចមានស្ថេរភាពជាង និងមិនសូវត្រូវបានយកចេញពីចរន្តឈាមទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ប៉ិបទីតដែលសម្បូរទៅដោយគ្លីស៊ីនទាំងនេះមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងគំរូសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងទេ ដែលបង្ហាញថាបណ្ណាល័យដែលបានរៀបចំបានឆ្លងកាត់ជំហានជ្រើសរើសពីរផ្សេងគ្នា៖ មួយនៅក្នុងឈាម និងមួយទៀតត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យកកកុញនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង។ ក្លូនដែលសម្បូរទៅដោយសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងដែលជាលទ្ធផលនៃជុំទីបួននៃការជ្រើសរើសត្រូវបានសាកល្បងយ៉ាងទូលំទូលាយ។ ស្ទើរតែទាំងអស់នៃក្លូនដែលបានសាកល្បងជាលក្ខណៈបុគ្គលត្រូវបានបញ្ជាក់ថាសម្បូរទៅដោយសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងហ្វាចត្រួតពិនិត្យទទេ។ ការប៉ះប៉ិបទីតមួយ (#2077) ត្រូវបានពិនិត្យលម្អិតបន្ថែមទៀត។ វាបានបង្ហាញពីអាយុកាលពាក់កណ្តាលប្លាស្មាយូរជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការប៉ះផ្សេងទៀត (រូបភាពទី 3d និងរូបភាពបន្ថែម 7) ហើយគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ប៉ិបទីតនេះមានផ្ទុកសំណល់ស៊ីស្តេអ៊ីននៅចុង C-terminus។ ថ្មីៗនេះ វាត្រូវបានបង្ហាញថា ការបន្ថែមស៊ីស្តេអ៊ីនទៅក្នុងប៉ិបទីតអាចធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវលក្ខណៈសម្បត្តិឱសថសាស្ត្ររបស់វាដោយការភ្ជាប់ទៅនឹងអាល់ប៊ុយមីន 29។ បច្ចុប្បន្ននេះមិនទាន់ដឹងអំពីប៉ិបទីត #2077 នៅឡើយទេ ហើយត្រូវការការសិក្សាបន្ថែមទៀត។ ប៉ិបទីតមួយចំនួនបានបង្ហាញពីភាពអាស្រ័យវ៉ាឡង់នៅក្នុងការបង្កើនសារធាតុរាវខួរក្បាល (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ដែលអាចទាក់ទងនឹងធរណីមាត្រផ្ទៃដែលបានបង្ហាញនៃកាបស៊ីដ T7។ ប្រព័ន្ធ T7 ដែលយើងបានប្រើបានបង្ហាញច្បាប់ចម្លងចំនួន 5-15 នៃប៉ិបទីតនីមួយៗក្នុងមួយភាគល្អិតហ្វាស។ IHC ត្រូវបានអនុវត្តលើក្លូនហ្វាសនាំមុខបេក្ខជនដែលត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែនចូលទៅក្នុងខួរក្បាលរបស់សត្វកណ្តុរ (រូបភាពបន្ថែមទី 8)។ ទិន្នន័យបានបង្ហាញថា យ៉ាងហោចណាស់ក្លូនបី (លេខ 2002 លេខ 2009 និងលេខ 2077) មានអន្តរកម្មជាមួយ BBB។ វានៅតែត្រូវកំណត់ថាតើអន្តរកម្ម BBB នេះបណ្តាលឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំនៃសារធាតុរាវខួរក្បាល ឬចលនារបស់ក្លូនទាំងនេះដោយផ្ទាល់ទៅ BCSFB។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ យើងបង្ហាញថា ប៉ិបទីតដែលបានជ្រើសរើសរក្សាសមត្ថភាពដឹកជញ្ជូនសារធាតុរាវខួរក្បាលរបស់ពួកគេនៅពេលដែលសំយោគ និងភ្ជាប់ទៅនឹងទំនិញប្រូតេអ៊ីន។ ការភ្ជាប់នៃប៉ិបទីតប៊ីយ៉ូទីណាល់ N-terminal ទៅនឹង SA ជាទូទៅធ្វើម្តងទៀតនូវលទ្ធផលដែលទទួលបានជាមួយនឹងក្លូនហ្វាសរៀងៗខ្លួននៅក្នុងឈាម និងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (រូបភាពទី 3e)។ ជាចុងក្រោយ យើងបង្ហាញថា ប៉ិបទីតនាំមុខ #2077 អាចជំរុញសកម្មភាពខួរក្បាលរបស់សារធាតុទប់ស្កាត់ប៉ិបទីតប៊ីយ៉ូទីណាល់ BACE1 ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង SA ដែលបណ្តាលឱ្យមានផលប៉ះពាល់ឱសថសាស្ត្រយ៉ាងច្បាស់នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រសាទកណ្តាល (CNS) ដោយកាត់បន្ថយកម្រិត Abeta40 យ៉ាងសំខាន់នៅក្នុង CSF (រូបភាពទី 4)។ យើងមិនអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណភាពដូចគ្នាណាមួយនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យដោយអនុវត្តការស្វែងរកភាពដូចគ្នានៃលំដាប់ប៉ិបទីតនៃការប៉ះទង្គិចទាំងអស់។ វាជារឿងសំខាន់ក្នុងការកត់សម្គាល់ថាទំហំនៃបណ្ណាល័យ T7 គឺប្រហែល 109 ខណៈពេលដែលទំហំបណ្ណាល័យទ្រឹស្តីសម្រាប់ 12-mers គឺ 4 x 1015។ ដូច្នេះ យើងបានជ្រើសរើសតែប្រភាគតូចមួយនៃលំហចម្រុះនៃបណ្ណាល័យប៉ិបទីត 12-mer ដែលអាចមានន័យថា ប៉ិបទីតដែលប្រសើរឡើងជាងនេះអាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការវាយតម្លៃលំហលំដាប់ដែលនៅជាប់គ្នានៃការប៉ះទង្គិចដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទាំងនេះ។ តាមសម្មតិកម្ម ហេតុផលមួយក្នុងចំណោមហេតុផលដែលយើងមិនបានរកឃើញភាពស្រដៀងគ្នាធម្មជាតិនៃ peptides ទាំងនេះអាចជាការមិនជ្រើសរើសក្នុងអំឡុងពេលវិវត្តន៍ដើម្បីការពារការចូលដែលមិនអាចគ្រប់គ្រងបាននៃលំនាំ peptide ជាក់លាក់ចូលទៅក្នុងខួរក្បាល។
ប្រសិនបើយើងពិចារណាលើលទ្ធផលទាំងនេះរួមគ្នា យើងអាចផ្តល់ជាមូលដ្ឋានសម្រាប់ការងារនាពេលអនាគត ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងកំណត់លក្ខណៈប្រព័ន្ធដឹកជញ្ជូននៃរបាំងខួរក្បាល និងសរសៃឈាមនៅក្នុងខ្លួនឲ្យបានលម្អិតបន្ថែមទៀត។ ការរៀបចំជាមូលដ្ឋាននៃវិធីសាស្ត្រនេះគឺផ្អែកលើយុទ្ធសាស្ត្រជ្រើសរើសមុខងារ ដែលមិនត្រឹមតែកំណត់អត្តសញ្ញាណក្លូនដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិចងសរសៃឈាមខួរក្បាលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងរួមបញ្ចូលជំហានដ៏សំខាន់មួយដែលក្លូនដែលទទួលបានជោគជ័យមានសកម្មភាពខាងក្នុង ដើម្បីឆ្លងកាត់របាំងជីវសាស្រ្តនៅក្នុងខ្លួន ចូលទៅក្នុងផ្នែក CNS។ គឺដើម្បីបញ្ជាក់ពីយន្តការនៃការដឹកជញ្ជូនប៉ិបទីតទាំងនេះ និងចំណង់ចំណូលចិត្តរបស់ពួកគេសម្រាប់ការភ្ជាប់ទៅនឹងមីក្រូសរសៃឈាមជាក់លាក់ចំពោះតំបន់ខួរក្បាល។ នេះអាចនាំឱ្យមានការរកឃើញផ្លូវថ្មីសម្រាប់ការដឹកជញ្ជូន BBB និងឧបករណ៍ទទួល។ យើងរំពឹងថាប៉ិបទីតដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណអាចភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹងឧបករណ៍ទទួលខួរក្បាល និងសរសៃចងដែលចរាចរតាមរយៈ BBB ឬ BCSFB។ វ៉ិចទ័រប៉ិបទីតដែលមានសកម្មភាពដឹកជញ្ជូន CSF ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការងារនេះនឹងត្រូវបានស៊ើបអង្កេតបន្ថែមទៀត។ យើងកំពុងស៊ើបអង្កេតភាពជាក់លាក់នៃខួរក្បាលរបស់ប៉ិបទីតទាំងនេះសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការឆ្លងកាត់ BBB និង/ឬ BCSFB។ ប៉ិបទីតថ្មីទាំងនេះនឹងក្លាយជាឧបករណ៍ដ៏មានតម្លៃបំផុតសម្រាប់ការរកឃើញសក្តានុពលនៃអ្នកទទួល ឬផ្លូវថ្មី និងសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍវេទិកាថ្មីដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់សម្រាប់ការចែកចាយម៉ាក្រូម៉ូលេគុល ដូចជាជីវសាស្ត្រ ទៅកាន់ខួរក្បាល។
បញ្ចូលបំពង់ទឹកចូលទៅក្នុងធុងទឹកធំ (CM) ដោយប្រើការកែប្រែវិធីសាស្ត្រដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ កណ្តុរ Wistar ដែលទទួលបានការប្រើថ្នាំសណ្តំ (200-350 ក្រាម) ត្រូវបានដាក់លើឧបករណ៍ស្តេរ៉េអូតាក់ស៊ី ហើយស្នាមវះកណ្តាលត្រូវបានធ្វើឡើងលើស្បែកក្បាលដែលកោររួច និងរៀបចំដោយមិនមានមេរោគ ដើម្បីបង្ហាញលលាដ៍ក្បាល។ ខួងរន្ធពីរនៅក្នុងតំបន់នៃខ្សែខាងលើ ហើយភ្ជាប់វីសជួសជុលនៅក្នុងរន្ធទាំងនោះ។ រន្ធបន្ថែមមួយត្រូវបានខួងនៅក្នុងផ្នត់ occipital ចំហៀងសម្រាប់ការណែនាំស្តេរ៉េអូតាក់ស៊ីនៃបំពង់ទឹកដែកអ៊ីណុកចូលទៅក្នុង CM។ លាបស៊ីម៉ង់ត៍ធ្មេញជុំវិញបំពង់ទឹក ហើយធានាដោយវីស។ បន្ទាប់ពីការស្ងួតដោយពន្លឺ និងការរឹងស៊ីម៉ង់ត៍ មុខរបួសស្បែកត្រូវបានបិទដោយថ្នេរ supramid 4/0។ ការដាក់បំពង់ទឹកឱ្យបានត្រឹមត្រូវត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការលេចធ្លាយដោយឯកឯងនៃសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង (CSF)។ យកកណ្តុរចេញពីឧបករណ៍ស្តេរ៉េអូតាក់ស៊ី ទទួលបានការថែទាំក្រោយការវះកាត់ និងការគ្រប់គ្រងការឈឺចាប់សមស្រប ហើយទុកឱ្យវាជាសះស្បើយយ៉ាងហោចណាស់មួយសប្តាហ៍រហូតដល់សញ្ញានៃឈាមត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង។ កណ្តុរ Wistar (Crl:WI/Han) ត្រូវបានទទួលពី Charles River (ប្រទេសបារាំង)។ សត្វកណ្តុរទាំងអស់ត្រូវបានរក្សាទុកក្រោមលក្ខខណ្ឌជាក់លាក់ដែលគ្មានភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ។ ការពិសោធន៍លើសត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុម័តដោយការិយាល័យពេទ្យសត្វនៃទីក្រុងបាសែល ប្រទេសស្វីស ហើយត្រូវបានអនុវត្តស្របតាមអាជ្ញាប័ណ្ណសត្វលេខ 2474 (ការវាយតម្លៃការដឹកជញ្ជូនខួរក្បាលសកម្មដោយការវាស់កម្រិតនៃបេក្ខជនព្យាបាលនៅក្នុងសារធាតុរាវខួរឆ្អឹងខ្នង និងខួរក្បាលរបស់សត្វកណ្តុរ)។
រក្សាកណ្តុរឱ្យដឹងខ្លួនដោយថ្នមៗ ដោយមានបំពង់ CM នៅក្នុងដៃ។ យក Datura ចេញពីបំពង់ ហើយប្រមូលសារធាតុរាវខួរក្បាលដែលហូរដោយឯកឯងចំនួន 10 µl។ ដោយសារតែភាពជ្រាបចូលនៃបំពង់ត្រូវបានប៉ះពាល់នៅទីបំផុត មានតែគំរូសារធាតុរាវខួរក្បាលដែលថ្លាដោយគ្មានភស្តុតាងនៃការចម្លងរោគឈាម ឬការប្រែពណ៌ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងការសិក្សានេះ។ ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ឈាមប្រហែល 10-20 µl ត្រូវបានយកចេញពីស្នាមវះតូចមួយនៅចុងកន្ទុយចូលទៅក្នុងបំពង់ដែលមានថ្នាំ heparin (Sigma-Aldrich)។ សារធាតុរាវខួរក្បាល និងឈាមត្រូវបានប្រមូលនៅចំណុចពេលវេលាផ្សេងៗគ្នា បន្ទាប់ពីការចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមនៃ phage T7។ សារធាតុរាវប្រហែល 5-10 µl ត្រូវបានបោះចោល មុនពេលគំរូសារធាតុរាវខួរក្បាលនីមួយៗត្រូវបានប្រមូល ដែលត្រូវនឹងបរិមាណដែលបានស្លាប់នៃបំពង់បូម។
បណ្ណាល័យត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើវ៉ិចទ័រ T7Select 10-3b ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសៀវភៅណែនាំប្រព័ន្ធ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)។ សរុបមក ការបញ្ចូល DNA ចៃដន្យ 12-mer ត្រូវបានសំយោគក្នុងទម្រង់ដូចខាងក្រោម៖
កូដុង NNK ត្រូវបានប្រើដើម្បីជៀសវាងកូដុងឈប់ពីរដង និងការបញ្ចេញអាស៊ីតអាមីណូច្រើនពេកនៅក្នុងការបញ្ចូល។ N គឺជាសមាមាត្រអេក្វាឌ័រម៉ូឡាដែលលាយដោយដៃនៃនុយក្លេអូទីតនីមួយៗ ហើយ K គឺជាសមាមាត្រអេក្វាឌ័រម៉ូឡាដែលលាយដោយដៃនៃនុយក្លេអូទីតអាដេនីន និងស៊ីតូស៊ីន។ តំបន់ខ្សែតែមួយត្រូវបានបំលែងទៅជា DNA ខ្សែពីរដោយការភ្ញាស់បន្ថែមជាមួយ dNTP (Novagen) និងអង់ស៊ីម Klenow (New England Biolabs) នៅក្នុងសារធាតុរាវ Klenow (New England Biolabs) រយៈពេល 3 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ បន្ទាប់ពីប្រតិកម្ម DNA ខ្សែពីរត្រូវបានទាញយកមកវិញដោយទឹកភ្លៀង EtOH។ DNA លទ្ធផលត្រូវបានរំលាយជាមួយអង់ស៊ីមកំណត់ EcoRI និង HindIII (ទាំងពីរមកពី Roche)។ ការបញ្ចូលដែលត្រូវបានកាត់ និងបន្សុទ្ធ (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) បន្ទាប់មកត្រូវបានចងនៅក្នុងស៊ុមទៅជាវ៉ិចទ័រ T7 ដែលបានកាត់ជាមុនបន្ទាប់ពីអាស៊ីតអាមីណូ 348 នៃហ្សែន capsid 10B។ ប្រតិកម្មភ្ជាប់ត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 16°C រយៈពេល 18 ម៉ោងមុនពេលវេចខ្ចប់ក្នុងវីត្រូ។ ការវេចខ្ចប់ហ្វាសនៅក្នុងវីត្រូត្រូវបានអនុវត្តតាមការណែនាំដែលភ្ជាប់មកជាមួយឧបករណ៍ក្លូន T7Select 10-3b (Novagen) ហើយដំណោះស្រាយវេចខ្ចប់ត្រូវបានពង្រីកម្តងដើម្បីបំបែកដោយប្រើ Escherichia coli (BLT5615, Novagen)។ លីសេតត្រូវបានបង្វិល ទីត្រាត និងកកនៅសីតុណ្ហភាព -80°C ជាដំណោះស្រាយស្តុកនៃគ្លីសេរ៉ុល។
ការពង្រីក PCR ដោយផ្ទាល់នៃតំបន់អថេរ phage ដែលបានពង្រីកនៅក្នុង broth ឬ plate ដោយប្រើ primers fusion 454/Roche-amplicon ដែលមានកម្មសិទ្ធិ។ primer fusion fusion ទៅមុខមាន sequences ដែលនៅជាប់នឹងតំបន់អថេរ (NNK) 12 (ជាក់លាក់លើគំរូ) GS FLX Titanium Adapter A និង sequence key library key ចំនួនបួន (TCAG) (រូបភាពបន្ថែម 1a)៖
ប្រាយមឺរ​សម្រាប់​លាយ​បញ្ច្រាស​ក៏​មាន​ផ្ទុក​ជីវទីន​ដែល​ភ្ជាប់​ទៅ​នឹង​អង្កាំ​ចាប់​យក និង​អាដាប់ទ័រ​ទីតាញ៉ូម GS FLX B ដែល​ត្រូវការ​សម្រាប់​ការ​ពង្រីក​ក្លូណាល​អំឡុង​ពេល​ប្រើ​សារធាតុ emulsion PCR៖
បន្ទាប់មក អំព្លីកុងត្រូវបានទទួលរងនូវការធ្វើលំដាប់ pyrosequencing 454/Roche ស្របតាមពិធីការ Titanium 454 GS-FLX។ សម្រាប់ការរៀបលំដាប់ Sanger ដោយដៃ (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) DNA phage T7 ត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR ហើយត្រូវបានរៀបលំដាប់ជាមួយគូ primer ដូចខាងក្រោម៖
ការបញ្ចូលពីបន្ទះនីមួយៗត្រូវបានទទួលរងនូវការពង្រីក PCR ដោយប្រើ Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត)។ អនុវត្តការចាប់ផ្តើមក្តៅ (10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 95 °C) និងវដ្តជំរុញចំនួន 35 (50 វិនាទីនៅសីតុណ្ហភាព 95 °C, 1 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 50 °C និង 1 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 72 °C)។
ហ្វាចពីបណ្ណាល័យ ហ្វាចប្រភេទព្រៃ ហ្វាចដែលត្រូវបានជួយសង្គ្រោះពីសារធាតុរាវក្នុងខួរឆ្អឹងខ្នង និងឈាម ឬក្លូននីមួយៗត្រូវបានពង្រីកនៅក្នុង Escherichia coli BL5615 ក្នុងទឹកស៊ុប TB (Sigma Aldrich) ឬក្នុងចាន 500 cm2 (Thermo Scientific) រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ ហ្វាចត្រូវបានស្រង់ចេញពីចានដោយលាងសម្អាតចានជាមួយនឹងសារធាតុរាវ Tris-EDTA (Fluka Analytical) ឬដោយការប្រមូលបន្ទះជាមួយនឹងចុងបំពង់បឺតមាប់មគ។ ហ្វាចត្រូវបានញែកចេញពីសារធាតុរាវខាងលើនៃវប្បធម៌ ឬសារធាតុរាវស្រង់ចេញជាមួយនឹងទឹកភ្លៀង polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) មួយជុំ ហើយត្រូវបានរំលាយឡើងវិញនៅក្នុងសារធាតុរាវ Tris-EDTA។
ហ្វាច​ដែល​បាន​ពង្រីក​ត្រូវ​បាន​យក​ចេញ​សារធាតុ endotoxin ចំនួន 2-3 ជុំ ដោយ​ប្រើ​អង្កាំ​យក​ចេញ​សារធាតុ endotoxin (Miltenyi Biotec) មុន​ពេល​ចាក់​តាម​សរសៃឈាម​វ៉ែន (IV) (500 μl/សត្វ)។ នៅ​ក្នុង​ជុំ​ទី​មួយ ហ្វាច​ចំនួន 2×1012 ត្រូវ​បាន​បញ្ចូល។ នៅ​ក្នុង​ជុំ​ទី​ពីរ ហ្វាច​ចំនួន 2×1010។ នៅ​ក្នុង​ជុំ​ជ្រើសរើស​លើក​ទី​បី និង​ទី​បួន ហ្វាច​ចំនួន 2×109 ក្នុង​មួយ​សត្វ។ មាតិកា​ហ្វាច​នៅ​ក្នុង​សារធាតុ CSF និង​សំណាក​ឈាម​ដែល​ប្រមូល​បាន​នៅ​ចំណុច​ពេលវេលា​ដែល​បាន​បង្ហាញ​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ដោយ​ការ​រាប់​បន្ទះ​យោង​តាម​ការ​ណែនាំ​របស់​អ្នក​ផលិត (សៀវភៅ​ណែនាំ​ប្រព័ន្ធ T7Select)។ ការ​ជ្រើសរើស​ហ្វាច​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​ដោយ​ការ​ចាក់​បញ្ចូល​បណ្ណាល័យ​ដែល​បាន​បន្សុទ្ធ​ចូល​ទៅ​ក្នុង​សរសៃឈាម​កន្ទុយ ឬ​ដោយ​ការ​ចាក់​ឡើងវិញ​នូវ​ហ្វាច​ដែល​ស្រង់​ចេញ​ពី​សារធាតុ CSF ពី​ជុំ​ជ្រើសរើស​លើក​មុន ហើយ​ការ​ប្រមូល​ផល​បន្ត​បន្ទាប់​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​នៅ​ពេល 10 នាទី 30 នាទី 60 នាទី 90 នាទី 120 នាទី 180 នាទី និង 240 នាទី​រៀងៗ​ខ្លួន​សម្រាប់​សំណាក CSF និង​ឈាម។ ការធ្វើ​ panning ក្នុង​ខ្លួន​សរុប​ចំនួន​បួន​ជុំ​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឡើង ដែល​សាខា​ពីរ​ដែល​បាន​ជ្រើសរើស​ត្រូវ​បាន​រក្សា​ទុក និង​វិភាគ​ដោយ​ឡែក​ពី​គ្នា​ក្នុង​អំឡុង​ពេល​ជ្រើសរើស​បី​ជុំ​ដំបូង។ សារធាតុ​បញ្ចូល​ហ្វាច​ទាំងអស់​ដែល​ស្រង់​ចេញ​ពី CSF ពី​ការ​ជ្រើសរើស​ពីរ​ជុំ​ដំបូង​ត្រូវ​បាន​ទទួលរង​នូវ​វិធីសាស្ត្រ 454/Roche pyrosequencing ខណៈ​ដែល​ក្លូន​ទាំងអស់​ដែល​ស្រង់​ចេញ​ពី CSF ពី​ការ​ជ្រើសរើស​ពីរ​ជុំ​ចុងក្រោយ​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​លំដាប់​ដោយ​ដៃ។ ហ្វាច​ឈាម​ទាំងអស់​ពី​ការ​ជ្រើសរើស​ជុំ​ដំបូង​ក៏​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​តេស្ត 454/Roche pyrosequencing ផងដែរ។ សម្រាប់​ការ​ចាក់​ក្លូន​ហ្វាច ហ្វាច​ដែល​បាន​ជ្រើសរើស​ត្រូវ​បាន​ពង្រីក​ក្នុង E. coli (BL5615) លើ​ចាន 500 cm2 នៅ 37°C រយៈពេល 4 ម៉ោង។ ក្លូន​ដែល​បាន​ជ្រើសរើស​ជា​លក្ខណៈ​បុគ្គល និង​លំដាប់​ដោយ​ដៃ​ត្រូវ​បាន​បន្តពូជ​ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្សព្វផ្សាយ TB។ បន្ទាប់​ពី​ការ​ស្រង់​ហ្វាច ការ​បន្សុទ្ធ និង​ការ​យក​ចេញ​នូវ​សារធាតុ endotoxin (ដូច​បាន​ពិពណ៌នា​ខាងលើ) ហ្វាច 2 × 1010/សត្វ​ក្នុង 300 μl ត្រូវ​បាន​ចាក់​តាម​សរសៃឈាម​វ៉ែន​កន្ទុយ​មួយ។
ការដំណើរការជាមុន និងការច្រោះទិន្នន័យលំដាប់គុណភាព។ ទិន្នន័យឆៅ 454/Roche ត្រូវបានបម្លែងពីទម្រង់ផែនទីស្ទ្រីមស្តង់ដារគោលពីរ (sff) ទៅជាទម្រង់ Pearson ដែលមនុស្សអាចអានបាន (fasta) ដោយប្រើកម្មវិធីអ្នកលក់។ ដំណើរការបន្ថែមនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីតត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី និងស្គ្រីប C ដែលមានកម្មសិទ្ធិ (កញ្ចប់កម្មវិធីដែលមិនទាន់ចេញផ្សាយ) ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងក្រោម។ ការវិភាគទិន្នន័យបឋមរួមមាននីតិវិធីច្រោះពហុដំណាក់កាលយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។ ដើម្បីច្រោះការអានដែលមិនមានលំដាប់ DNA បញ្ចូល 12mer ដែលមានសុពលភាព ការអានត្រូវបានតម្រឹមតាមលំដាប់ទៅស្លាកចាប់ផ្តើម (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) ស្លាកឈប់ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) និងការបញ្ចូលផ្ទៃខាងក្រោយ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) ដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Needleman-Wunsch សកល។ ការតម្រឹមអនុញ្ញាតឱ្យមានភាពមិនស៊ីសង្វាក់គ្នារហូតដល់ 2 ក្នុងមួយការតម្រឹម31។ ដូច្នេះ ការអានដោយគ្មានស្លាកចាប់ផ្តើម និងឈប់ និងការអានដែលមានការបញ្ចូលផ្ទៃខាងក្រោយ ពោលគឺការតម្រឹមដែលលើសពីចំនួនភាពមិនស៊ីសង្វាក់គ្នាដែលអនុញ្ញាត ត្រូវបានដកចេញពីបណ្ណាល័យ។ ចំពោះ​ការអាន​ដែលនៅសេសសល់ លំដាប់ DNA N-mer ដែលលាតសន្ធឹងពីចំណុចចាប់ផ្តើម និងបញ្ចប់មុនពេលចំណុចឈប់ ត្រូវបានកាត់ចេញពីលំដាប់អានដើម ហើយដំណើរការបន្ថែមទៀត (តទៅនេះហៅថា "ការបញ្ចូល")។ បន្ទាប់ពីការបកប្រែនៃការបញ្ចូល ផ្នែកបន្ទាប់ពីកូដុងឈប់ដំបូងនៅចុង 5′ នៃប្រាយម័រ ត្រូវបានយកចេញពីការបញ្ចូល។ លើសពីនេះ នុយក្លេអូទីតដែលនាំទៅដល់កូដុងមិនពេញលេញនៅចុង 3′ នៃប្រាយម័រ ក៏ត្រូវបានយកចេញផងដែរ។ ដើម្បីមិនរាប់បញ្ចូលការបញ្ចូលដែលមានតែលំដាប់ផ្ទៃខាងក្រោយ ការបញ្ចូលដែលបានបកប្រែដែលចាប់ផ្តើមដោយលំនាំអាស៊ីតអាមីណូ "PAG" ក៏ត្រូវបានយកចេញផងដែរ។ ប៉ិបទីតដែលមានប្រវែងក្រោយការបកប្រែតិចជាង 3 អាស៊ីតអាមីណូ ត្រូវបានយកចេញពីបណ្ណាល័យ។ ជាចុងក្រោយ យកភាពលើសនៅក្នុងអាងបញ្ចូល ហើយកំណត់ភាពញឹកញាប់នៃការបញ្ចូលតែមួយគត់នីមួយៗ។ លទ្ធផលនៃការវិភាគនេះរួមមានបញ្ជីនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីត (ការបញ្ចូល) និងប្រេកង់ (អាន) របស់វា (រូបភាពបន្ថែម 1c និង 2)។
ការបញ្ចូល DNA ក្រុម N-mer តាមភាពស្រដៀងគ្នានៃលំដាប់៖ ដើម្បីលុបបំបាត់កំហុសក្នុងការធ្វើលំដាប់ជាក់លាក់ 454/Roche (ដូចជាបញ្ហាជាមួយនឹងផ្នែកបន្ថែម homopolymer ក្នុងការធ្វើលំដាប់) និងដកចេញនូវភាពលែងត្រូវការដែលមិនសូវសំខាន់ ការបញ្ចូលលំដាប់ DNA N-mer ដែលបានត្រងពីមុន (ការបញ្ចូល) ត្រូវបានតម្រៀបតាមភាពស្រដៀងគ្នា។ ការបញ្ចូល (រហូតដល់ 2 មូលដ្ឋានមិនត្រូវគ្នាត្រូវបានអនុញ្ញាត) ដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយដដែលៗដែលបានកំណត់ដូចខាងក្រោម៖ ការបញ្ចូលត្រូវបានតម្រៀបជាមុនសិនតាមប្រេកង់របស់វា (ខ្ពស់បំផុតទៅទាបបំផុត) ហើយប្រសិនបើវាដូចគ្នា ដោយការតម្រៀបបន្ទាប់បន្សំរបស់វាតាមប្រវែង (វែងបំផុតទៅខ្លីបំផុត)។ ដូច្នេះ ការបញ្ចូលញឹកញាប់បំផុត និងវែងបំផុតកំណត់ "ក្រុម" ដំបូង។ ប្រេកង់ក្រុមត្រូវបានកំណត់ទៅប្រេកង់គន្លឹះ។ បន្ទាប់មក ការបញ្ចូលនីមួយៗដែលនៅសល់ក្នុងបញ្ជីដែលបានតម្រៀបត្រូវបានព្យាយាមបន្ថែមទៅក្នុងក្រុមដោយការតម្រៀប Needleman-Wunsch តាមគូ។ ប្រសិនបើចំនួននៃភាពមិនត្រូវគ្នា ការបញ្ចូល ឬការលុបនៅក្នុងការតម្រៀបមិនលើសពីកម្រិត 2 ការបញ្ចូលត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងក្រុម ហើយភាពញឹកញាប់នៃក្រុមទាំងមូលត្រូវបានបង្កើនដោយភាពញឹកញាប់នៃការបញ្ចូល។ ការបញ្ចូលដែលបានបន្ថែមទៅក្នុងក្រុមត្រូវបានសម្គាល់ថាបានប្រើ និងដកចេញពីដំណើរការបន្ថែម។ ប្រសិនបើលំដាប់បញ្ចូលមិនអាចបន្ថែមទៅក្នុងក្រុមដែលមានស្រាប់បានទេ លំដាប់បញ្ចូលត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតក្រុមថ្មីដែលមានប្រេកង់បញ្ចូលសមស្រប និងត្រូវបានសម្គាល់ថាបានប្រើ។ ការធ្វើម្តងទៀតបញ្ចប់នៅពេលដែលលំដាប់បញ្ចូលនីមួយៗត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតក្រុមថ្មី ឬអាចត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងក្រុមដែលមានស្រាប់។ យ៉ាងណាមិញ ការដាក់ជាក្រុមដែលមាននុយក្លេអូទីតត្រូវបានបកប្រែទៅជាលំដាប់ peptide (បណ្ណាល័យ peptide) នៅទីបំផុត។ លទ្ធផលនៃការវិភាគនេះគឺជាសំណុំនៃការបញ្ចូល និងប្រេកង់ដែលត្រូវគ្នារបស់វា ដែលបង្កើតបានជាចំនួននៃការអានជាប់ៗគ្នា (រូបភាពបន្ថែមទី 2)។
ការបង្កើតលំនាំ៖ ដោយផ្អែកលើបញ្ជីនៃ peptides តែមួយគត់ បណ្ណាល័យមួយត្រូវបានបង្កើតឡើងដែលមានលំនាំអាស៊ីតអាមីណូដែលអាចធ្វើទៅបានទាំងអស់ (aa) ដូចបង្ហាញខាងក្រោម។ លំនាំដែលអាចធ្វើទៅបាននីមួយៗដែលមានប្រវែង 3 ត្រូវបានស្រង់ចេញពី peptide ហើយលំនាំបញ្ច្រាសរបស់វាត្រូវបានបន្ថែមរួមជាមួយបណ្ណាល័យលំនាំទូទៅដែលមានលំនាំទាំងអស់ (tripeptides)។ បណ្ណាល័យនៃលំនាំដដែលៗខ្ពស់ត្រូវបានធ្វើលំដាប់ ហើយភាពលើសលប់ត្រូវបានដកចេញ។ បន្ទាប់មក សម្រាប់ tripeptide នីមួយៗនៅក្នុងបណ្ណាល័យលំនាំ យើងបានពិនិត្យមើលវត្តមានរបស់វានៅក្នុងបណ្ណាល័យដោយប្រើឧបករណ៍គណនា។ ក្នុងករណីនេះ ភាពញឹកញាប់នៃ peptide ដែលមាន motif tripeptide ដែលបានរកឃើញត្រូវបានបន្ថែម និងកំណត់ទៅ motif នៅក្នុងបណ្ណាល័យ motif ("ចំនួន motifs")។ លទ្ធផលនៃការបង្កើតលំនាំគឺជាអារេពីរវិមាត្រដែលមានការកើតឡើងទាំងអស់នៃ tripeptides (motifs) និងតម្លៃរៀងៗខ្លួនរបស់វា ដែលជាចំនួននៃការអានលំដាប់ដែលបណ្តាលឱ្យមាន motif ដែលត្រូវគ្នានៅពេលដែលការអានត្រូវបានត្រង ដាក់ជាក្រុម និងបកប្រែ។ រង្វាស់ដូចដែលបានពិពណ៌នាលម្អិតខាងលើ។
ការធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតានៃចំនួនលំនាំ និងគំនូសតាងរាយប៉ាយដែលត្រូវគ្នា៖ ចំនួនលំនាំសម្រាប់គំរូនីមួយៗត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយប្រើ
ដែល ni ជាចំនួននៃការអានដែលមានប្រធានបទ i។ ដូច្នេះ vi តំណាងឱ្យភាពញឹកញាប់ភាគរយនៃការអាន (ឬ peptides) ដែលមាន motif i នៅក្នុងគំរូ។ តម្លៃ P សម្រាប់ចំនួន motifs ដែលមិនបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាត្រូវបានគណនាដោយប្រើការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher។ ទាក់ទងនឹង correlograms នៃចំនួននៃការជំរុញ សហសម្ព័ន្ធរបស់ Spearman ត្រូវបានគណនាដោយប្រើចំនួននៃការជំរុញដែលបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាជាមួយ R។
ដើម្បីមើលឃើញមាតិកានៃអាស៊ីតអាមីណូនៅទីតាំងនីមួយៗនៅក្នុងបណ្ណាល័យ peptide គេហទំព័រ logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ត្រូវបានបង្កើតឡើង។ ដំបូង មាតិកានៃអាស៊ីតអាមីណូនៅទីតាំងនីមួយៗនៃ peptide 12-mer ត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងម៉ាទ្រីស 20 × 12។ បន្ទាប់មក សំណុំនៃ peptides ចំនួន 1000 ដែលមានមាតិកាអាស៊ីតអាមីណូដែលទាក់ទងគ្នានៅទីតាំងនីមួយៗត្រូវបានបង្កើតជាទម្រង់ fasta-sequence និងផ្តល់ជាការបញ្ចូលទៅ web-logo 3 ដែលបង្កើតការតំណាងក្រាហ្វិកនៃមាតិកាអាស៊ីតអាមីណូដែលទាក់ទងនៅទីតាំងនីមួយៗ។ សម្រាប់បណ្ណាល័យ peptide ដែលបានផ្តល់ឱ្យ។ ដើម្បីមើលឃើញសំណុំទិន្នន័យពហុវិមាត្រ ផែនទីកំដៅត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើឧបករណ៍ដែលបានបង្កើតឡើងផ្ទៃក្នុងនៅក្នុង R (biosHeatmap ដែលជាកញ្ចប់ R ដែលមិនទាន់ចេញផ្សាយ)។ dendrograms ដែលបង្ហាញនៅក្នុងផែនទីកំដៅត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រចង្កោមឋានានុក្រមរបស់ Ward ជាមួយនឹងម៉ែត្រចម្ងាយ Euclidean។ សម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិនៃទិន្នន័យពិន្ទុ motif តម្លៃ P សម្រាប់ការពិន្ទុមិនប្រក្រតីត្រូវបានគណនាដោយប្រើការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher។ តម្លៃ P សម្រាប់សំណុំទិន្នន័យផ្សេងទៀតត្រូវបានគណនាជា R ដោយប្រើតេស្ត t របស់សិស្ស ឬ ANOVA។
ក្លូនហ្វាច និងហ្វាចដែលបានជ្រើសរើសដោយគ្មានការបញ្ចូល ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែនកន្ទុយ (2×1010 ហ្វាច/សត្វ ក្នុង PBS 300 μl)។ ដប់នាទីមុនពេលចាក់បញ្ចូលឈាម និងការចាក់បញ្ចូលជាបន្តបន្ទាប់ សត្វដូចគ្នាត្រូវបានចាក់បញ្ចូលតាមសរសៃឈាមវ៉ែនជាមួយឡិចទីនដែលមានស្លាក DyLight594 ចំនួន 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177)។ 60 នាទីបន្ទាប់ពីការចាក់ហ្វាច កណ្តុរត្រូវបានចាក់បញ្ចូលតាមបេះដូងជាមួយ PBS ចំនួន 50 មីលីលីត្រ បន្ទាប់មកដោយ PFA/PBS 4% ចំនួន 50 មីលីលីត្រ។ គំរូខួរក្បាលត្រូវបានបន្ថែមពេញមួយយប់ក្នុង PFA/PBS 4% និងត្រាំក្នុងស្ករស 30% ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ គំរូត្រូវបានកកភ្លាមៗក្នុងល្បាយ OCT។ ការវិភាគ​ភាពស៊ាំ​ហ៊ីស្តូគីមី​នៃ​សំណាក​កក​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់​លើ​ការ​វះកាត់​ត្រជាក់ 30 µm ដែល​បាន​ទប់ស្កាត់​ដោយ 1% BSA ហើយ​ភ្ញាស់​ជាមួយ​អង្គបដិប្រាណ​ដែល​មាន​ស្លាក FITC ពហុក្លូណាល​ប្រឆាំង​នឹង​ហ្វាស T7 (Novus NB 600-376A) នៅ​សីតុណ្ហភាព 4°C។ ភ្ញាស់​ពេញ​មួយ​យប់។ ជាចុងក្រោយ ផ្នែក​ទាំងនោះ​ត្រូវ​បាន​លាង​សម្អាត 3 ដង​ជាមួយ PBS ហើយ​ពិនិត្យ​ដោយ​មីក្រូទស្សន៍​ឡាស៊ែរ​ខនហ្វូកាល់ (Leica TCS SP5)។
ប៉ិបទីតទាំងអស់ដែលមានភាពបរិសុទ្ធអប្បបរមា 98% ត្រូវបានសំយោគដោយ GenScript USA បានធ្វើជីវទីន និងធ្វើឱ្យស្ងួត។ ប៉ិបទីតត្រូវបានចងតាមរយៈឧបករណ៍បំបែកគ្លីស៊ីនបីជាន់បន្ថែមនៅចុង N-terminus។ ពិនិត្យមើលប៉ិបទីតទាំងអស់ដោយប្រើម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រី។
Streptavidin (Sigma S0677) ត្រូវបានលាយជាមួយ peptide biotinylated លើស equimolar 5 ដង peptide biotinylated inhibitory BACE1 ឬការរួមបញ្ចូលគ្នា (សមាមាត្រ 3:1) នៃ peptide biotinylated inhibitory BACE1 និង peptide inhibitory BACE1 ក្នុង DMSO 5–10%/incubated ក្នុង PBS។ 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់មុនពេលចាក់។ peptides ដែលភ្ជាប់ជាមួយ Streptavidin ត្រូវបានចាក់តាមសរសៃឈាមវ៉ែនក្នុងកម្រិត 10 mg/kg ចូលទៅក្នុងសរសៃវ៉ែនកន្ទុយមួយរបស់សត្វកណ្តុរដែលមានប្រហោងខួរក្បាល។
កំហាប់នៃស្មុគស្មាញ streptavidin-peptide ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយ ELISA។ បន្ទះមីក្រូទីទ័រ Nunc Maxisorp (Sigma) ត្រូវបានស្រោបពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំង streptavidin កណ្ដុរ 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011)។ បន្ទាប់ពីការទប់ស្កាត់ (សារធាតុរារាំង៖ 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 2 ម៉ោង សូមលាងសម្អាតបន្ទះជាមួយ 0.05% Tween-20/PBS (សារធាតុលាងសម្អាត) រយៈពេល 3 វិនាទី សំណាក CSF និងប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងអណ្តូងដែលពនលាយជាមួយសារធាតុរារាំង (ប្លាស្មា 1:10,000, CSF 1:115)។ បន្ទាប់មកបន្ទះត្រូវបានភ្ញាស់ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណរកឃើញ (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239)។ បន្ទាប់ពីជំហានលាងសម្អាតបីជំហាន ស្ទ្រីបតាវីឌីនត្រូវបានរកឃើញដោយការភ្ញាស់ក្នុងដំណោះស្រាយស្រទាប់ខាងក្រោម TMB (Roche) រយៈពេលរហូតដល់ 20 នាទី។ បន្ទាប់ពីបញ្ឈប់ការវិវត្តពណ៌ជាមួយ 1M H2SO4 សូមវាស់ការស្រូបយកនៅ 450 nm។
មុខងាររបស់ស្មុគស្មាញ streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយ Aβ(1-40) ELISA ស្របតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត (Wako, 294-64701)។ ជាសង្ខេប គំរូ CSF ត្រូវបានពនលាយក្នុងសារធាតុពនលាយស្តង់ដារ (1:23) ហើយភ្ញាស់ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ក្នុងចាន 96 រន្ធដែលស្រោបដោយអង្គបដិប្រាណចាប់យក BNT77។ បន្ទាប់ពីជំហានលាងសម្អាតចំនួនប្រាំ អង្គបដិប្រាណ BA27 ដែលភ្ជាប់ជាមួយ HRP ត្រូវបានបន្ថែម និងភ្ញាស់រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4°C បន្ទាប់មកដោយជំហានលាងសម្អាតចំនួនប្រាំ។ Aβ(1–40) ត្រូវបានរកឃើញដោយការភ្ញាស់ក្នុងដំណោះស្រាយ TMB រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ បន្ទាប់ពីការវិវត្តពណ៌ត្រូវបានបញ្ឈប់ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ សូមវាស់ការស្រូបយកនៅ 450 nm។ គំរូប្លាស្មាត្រូវបានទទួលរងនូវការស្រង់ចេញដំណាក់កាលរឹងមុនពេល Aβ(1–40) ELISA។ ប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុង 0.2% DEA (Sigma) ក្នុងចាន 96 រន្ធ ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទី។ បន្ទាប់ពីលាងសម្អាតបន្ទះ SPE (Oasis, 186000679) ជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយទឹក និងមេតាណុល 100% សំណាកប្លាស្មាត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងបន្ទះ SPE ហើយសារធាតុរាវទាំងអស់ត្រូវបានយកចេញ។ សំណាកត្រូវបានលាងសម្អាត (ដំបូងជាមួយមេតាណុល 5% បន្ទាប់មកមេតាណុល 30%) ហើយត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយ NH4OH 2%/មេតាណុល 90%។ បន្ទាប់ពីសម្ងួតសារធាតុរំលាយនៅសីតុណ្ហភាព 55°C រយៈពេល 99 នាទី នៅចរន្ត N2 ថេរ សំណាកត្រូវបានកាត់បន្ថយក្នុងសារធាតុរំលាយស្តង់ដារ ហើយ Aβ(1–40) ត្រូវបានវាស់ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។
របៀបដកស្រង់អត្ថបទនេះ៖ Urich, E. et al. ការដឹកជញ្ជូនទំនិញទៅកាន់ខួរក្បាលដោយប្រើ peptides ឆ្លងកាត់ដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង vivo ។ the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)។
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB និង Moos T. ការដឹកជញ្ជូនថ្នាំម៉ាក្រូម៉ូលេគុលទៅកាន់ខួរក្បាលដោយប្រើការព្យាបាលគោលដៅ។ ទិនានុប្បវត្តិ Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)។
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., និង Martinez-Martinez, P. ការដឹកជញ្ជូនថ្នាំ peptide និងប្រូតេអ៊ីនឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល។ Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)។
Pardridge, WM របាំងឈាម-ខួរក្បាល៖ ជាចំណុចកកស្ទះក្នុងការអភិវឌ្ឍថ្នាំខួរក្បាល។ NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)។
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, និង Byrd, A. ទស្សនវិស័យសម្រាប់ការចែកចាយថ្នាំ និងការកំណត់គោលដៅទៅកាន់ខួរក្បាលកាន់តែប្រសើរឡើងតាមរយៈផ្លូវ choroid plexus-CSF។ ការស្រាវជ្រាវឱសថ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)។
Pardridge, WM ការធ្វើទំនើបកម្មជីវឱសថជាមួយសេះ Trojan ម៉ូលេគុលសម្រាប់ការបញ្ជូនខួរក្បាល។ Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)។
Pardridge, ការដឹកជញ្ជូន peptide ដែលសម្របសម្រួលដោយ receptor WM ឆ្លងកាត់របាំងឈាម-ខួរក្បាល។ Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)។
Niewoehner, J. et al. បង្កើនការជ្រៀតចូលខួរក្បាល និងប្រសិទ្ធភាពនៃអង្គបដិប្រាណព្យាបាលដោយប្រើយានអវកាសម៉ូណូវ៉ាឡង់។ Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)។
Bien-Lee, N. et al. ការដឹកជញ្ជូន Transferrin receptor (TfR) កំណត់ការទទួលយកខួរក្បាលនៃវ៉ារ្យ៉ង់ស្និទ្ធស្នាលនៃអង្គបដិប្រាណ TfR។ J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)។