Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Sıvı biyopsi (LB), biyomedikal alanda hızla popülerlik kazanan bir kavramdır. Bu kavram, esas olarak çeşitli dokularda hücre ölümünden sonra küçük parçalar halinde salınan dolaşımdaki hücre dışı DNA (ccfDNA) parçalarının saptanmasına dayanmaktadır. Bu parçaların küçük bir kısmı yabancı dokulardan veya organizmalardan kaynaklanmaktadır. Mevcut çalışmada, bu kavramı, yüksek deniz suyu filtrasyon kapasitesiyle bilinen bir gösterge türü olan midyelere uyguladık. Midyelerin doğal filtre görevi görme yeteneğini kullanarak, çeşitli kaynaklardan gelen çevresel DNA parçalarını yakalayıp deniz kıyı ekosistemlerinin biyoçeşitliliği hakkında bilgi sağlamayı amaçladık. Sonuçlarımız, midye hemolenfinin 1 ila 5 kb arasında değişen boyutlarda DNA parçaları içerdiğini göstermektedir. Shotgun sekanslama, çok sayıda DNA parçasının yabancı mikrobiyal kökenli olduğunu göstermiştir. Bunlar arasında, kıyı deniz ekosistemlerinde yaygın olarak bulunan çeşitli konakçıları enfekte ettiği bilinen virüsler de dahil olmak üzere bakteri, arkea ve virüslerden DNA parçaları bulduk. Sonuç olarak, çalışmamız, midyelere uygulanan LB kavramının, deniz kıyı ekosistemlerindeki mikrobiyal çeşitlilik hakkında zengin ancak henüz keşfedilmemiş bir bilgi kaynağı olduğunu göstermektedir.
İklim değişikliğinin (İİ) deniz ekosistemlerinin biyoçeşitliliği üzerindeki etkisi, hızla büyüyen bir araştırma alanıdır. Küresel ısınma sadece önemli fizyolojik streslere neden olmakla kalmaz, aynı zamanda deniz organizmalarının termal stabilitesinin evrimsel sınırlarını da zorlar ve bir dizi türün yaşam alanını etkileyerek onları daha elverişli koşullar aramaya yönlendirir [1, 2]. İİ, metazoanların biyoçeşitliliğini etkilemenin yanı sıra, konak-mikrobiyal etkileşimlerin hassas dengesini de bozar. Bu mikrobiyal disbakteriyoz, deniz organizmalarını bulaşıcı patojenlere karşı daha duyarlı hale getirdiği için deniz ekosistemleri için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır [3, 4]. SS'nin, küresel deniz ekosistemlerinin yönetimi için ciddi bir sorun olan kitlesel ölümlerde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır [5, 6]. Bu, birçok deniz türünün ekonomik, ekolojik ve beslenme açısından etkileri göz önüne alındığında önemli bir konudur. Bu, özellikle İİ'nin etkilerinin daha ani ve şiddetli olduğu kutup bölgelerinde yaşayan çift kabuklular için geçerlidir [6, 7]. Aslında, Mytilus spp. gibi çift kabuklular... CC'nin deniz ekosistemleri üzerindeki etkilerini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, sağlıklarını izlemek için nispeten çok sayıda biyobelirteç geliştirilmiştir; bunlar genellikle enzimatik aktiviteye veya hücre canlılığı ve fagositoz aktivitesi gibi hücresel fonksiyonlara dayalı fonksiyonel biyobelirteçleri içeren iki kademeli bir yaklaşım kullanmaktadır [8]. Bu yöntemler ayrıca, büyük miktarda deniz suyu emiliminden sonra yumuşak dokularda biriken spesifik basınç göstergelerinin konsantrasyonunun ölçümünü de içermektedir. Bununla birlikte, çift kabukluların yüksek filtrasyon kapasitesi ve yarı açık dolaşım sistemi, hasta yönetimi için basit ve minimal invaziv bir yaklaşım olan sıvı biyopsi (LB) kavramını kullanarak yeni hemolenf biyobelirteçleri geliştirme fırsatı sunmaktadır. kan örnekleri [9, 10]. İnsan LB'sinde çeşitli dolaşım molekülleri bulunabilse de, bu kavram öncelikle plazmadaki dolaşımdaki hücre dışı DNA (ccfDNA) parçalarının DNA dizileme analizine dayanmaktadır. Aslında, insan plazmasında dolaşan DNA'nın varlığı 20. yüzyılın ortalarından beri bilinmektedir [11], ancak yüksek verimli sekanslama yöntemlerinin ortaya çıkması, ccfDNA'ya dayalı klinik tanıya ancak son yıllarda yol açmıştır. Bu dolaşan DNA parçalarının varlığı kısmen, hücre ölümünden sonra genomik DNA'nın (nükleer ve mitokondriyal) pasif salınımından kaynaklanmaktadır. Sağlıklı bireylerde serbest dolaşan DNA (ccfDNA) konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojilerden muzdarip veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artabilir ve bu da doku hasarına yol açabilir. Sağlıklı bireylerde serbest dolaşan DNA (ccfDNA) konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojilerden muzdarip veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artabilir ve bu da doku hasarına yol açabilir. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией veya подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sağlıklı kişilerde cccDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojileri olan veya doku hasarına yol açan stres altında olan hastalarda 5-10 kat artabilir.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL)在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者5-10 gün önce , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями veya стрессом, что приводит к повреждению тканей. Sağlıklı bireylerde serbest dolaşan DNA (ccfDNA) konsantrasyonları genellikle düşüktür (<10 ng/ml), ancak çeşitli patolojileri veya stresi olan hastalarda 5-10 kat artabilir ve doku hasarına yol açabilir.ccfDNA parçalarının boyutu oldukça değişkendir, ancak genellikle 150 ila 200 bp arasındadır [12]. Kendi kendine türetilen ccfDNA'nın, yani normal veya transforme olmuş konakçı hücrelerden elde edilen ccfDNA'nın analizi, nükleer ve/veya mitokondriyal genomda mevcut genetik ve epigenetik değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir ve böylece klinisyenlerin spesifik moleküler hedefli tedavileri seçmelerine yardımcı olur [13]. Bununla birlikte, ccfDNA, gebelik sırasında fetal hücrelerden veya nakledilen organlardan elde edilen ccfDNA gibi yabancı kaynaklardan da elde edilebilir [14,15,16,17]. ccfDNA ayrıca, enfeksiyon etkeninin (yabancı) nükleik asitlerinin varlığını tespit etmek için önemli bir bilgi kaynağıdır; bu da kan kültürleriyle tespit edilemeyen yaygın enfeksiyonların invaziv olmayan bir şekilde tespit edilmesini sağlar ve enfekte dokunun invaziv biyopsisine gerek kalmaz [18]. Son çalışmalar, insan kanının viral ve bakteriyel patojenleri tanımlamak için kullanılabilecek zengin bir bilgi kaynağı içerdiğini ve insan plazmasında bulunan ccfDNA'nın yaklaşık %1'inin yabancı kökenli olduğunu göstermiştir [19]. Bu çalışmalar, bir organizmanın dolaşımdaki mikrobiyomunun biyoçeşitliliğinin ccfDNA analizi kullanılarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar bu kavram yalnızca insanlarda ve daha az ölçüde diğer omurgalılarda kullanılıyordu [20, 21].
Bu çalışmada, LB potansiyelini kullanarak, 35 milyon yıl önce volkanik bir patlama sonucu oluşan büyük bir plato üzerinde yer alan bir ada grubu olan subantarktika Kerguelen Adaları'nda yaygın olarak bulunan güney türü Aulacomya atra'nın ccfDNA'sını analiz ettik. İn vitro deneysel bir sistem kullanarak, deniz suyundaki DNA parçalarının midyeler tarafından hızla alındığını ve hemolenf bölmesine girdiğini bulduk. Shotgun sekanslama, midye hemolenf ccfDNA'sının kendi ve yabancı kökenli DNA parçaları içerdiğini, bunlar arasında simbiyotik bakteriler ve soğuk volkanik deniz kıyı ekosistemlerine özgü biyomlardan DNA parçaları bulunduğunu göstermiştir. Hemolenf ccfDNA ayrıca farklı konakçı aralıklarına sahip virüslerden türetilen viral sekanslar da içermektedir. Ayrıca kemikli balıklar, deniz anemonları, algler ve böcekler gibi çok hücreli hayvanlardan DNA parçaları da bulduk. Sonuç olarak, çalışmamız LB konseptinin deniz ekosistemlerinde zengin bir genomik repertuar oluşturmak için deniz omurgasızlarına başarıyla uygulanabileceğini göstermektedir.
Yetişkin (55-70 mm uzunluğunda) Mytilus platensis (M. platensis) ve Aulacomya atra (A. atra) bireyleri, Aralık 2018'de Port-au-France'ın (049°21.235 G, 070°13.490 D) Kerguelen Adaları'ndaki gelgitli kayalık kıyılarından toplandı. Diğer yetişkin mavi midyeler (Mytilus spp.) ticari bir tedarikçiden (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) temin edildi ve 10-20 L %32'lik yapay tuzlu su (yapay deniz tuzu Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, ABD) içeren, sıcaklık kontrollü (4°C) havalandırılmış bir tanka yerleştirildi. Her deney için, tek tek kabukların uzunluğu ve ağırlığı ölçüldü.
Bu program için ücretsiz açık erişim protokolü çevrimiçi olarak mevcuttur (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kısaca, LB hemolenfi, [22]'de açıklandığı gibi abduktör kaslarından toplandı. Hemolenf, 3 dakika boyunca 1200×g'de santrifüj edilerek berraklaştırıldı, süpernatant kullanıma kadar donduruldu (-20°C). cfDNA'nın izolasyonu ve saflaştırılması için, örnekler (1,5-2,0 ml) çözüldü ve üreticinin talimatlarına göre NucleoSnap cfDNA kiti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) kullanılarak işlendi. ccfDNA, daha sonraki analizlere kadar -80°C'de saklandı. Bazı deneylerde, ccfDNA, QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) kullanılarak izole edildi ve saflaştırıldı. Saflaştırılmış DNA, standart bir PicoGreen testi kullanılarak ölçüldü. İzole edilen ccfDNA'nın fragment dağılımı, Agilent 2100 bioanaliz cihazı (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) kullanılarak ve Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti ile kapiler elektroforez yöntemiyle analiz edildi. Analiz, üreticinin talimatlarına göre 1 µl ccfDNA örneği kullanılarak gerçekleştirildi.
Hemolenf ccfDNA parçalarının dizilenmesi için, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada), Illumina MiSeq PE75 kitinin Illumina DNA Mix kitini kullanarak shotgun kütüphaneleri hazırladı. Standart bir adaptör (BioO) kullanıldı. Ham veri dosyaları NCBI Sequence Read Archive'dan (SRR8924808 ve SRR8924809) edinilebilir. Temel okuma kalitesi FastQC [23] kullanılarak değerlendirildi. Adaptörlerin ve düşük kaliteli okumaların kırpılması için Trimmomatic [24] kullanıldı. Eşleştirilmiş uçlara sahip shotgun okumaları, uyumsuzlukları önlemek için minimum 20 bp'lik bir örtüşme ile daha uzun tek okumalara FLASH ile birleştirildi [25]. Birleştirilmiş okumalar, bir çift kabuklu NCBI Taksonomi veritabanı kullanılarak BLASTN ile açıklamalandırıldı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) ve düşük karmaşıklıkta dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi. Birleştirilmiş okumalar, bir çift kabuklu NCBI Taksonomi veritabanı kullanılarak BLASTN ile açıklamalandırıldı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) ve düşük karmaşıklıkta dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 ve 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности Bu, DUST'ın bir parçasıydı [26]. Havuzlanmış okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomi veritabanı kullanılarak BLASTN ile açıklamalandı (e değeri < 1e-3 ve %90 homoloji) ve DUST [26] kullanılarak düşük karmaşıklıkta dizi maskelemesi gerçekleştirildi.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] Bir başka deyişle, iyi bir şey değil.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 toz [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ve 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности Bu, DUST'ın bir parçasıydı [26]. Havuzlanmış okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomik veritabanı (e değeri <1e-3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklanmış ve DUST [26] kullanılarak düşük karmaşıklıkta dizi maskelemesi gerçekleştirilmiştir.Okumalar iki gruba ayrıldı: çift kabuklu dizileriyle ilgili olanlar (burada kendi kendine okumalar olarak adlandırılır) ve ilgisiz olanlar (kendi kendine olmayan okumalar). İki grup, kontigler oluşturmak için MEGAHIT kullanılarak ayrı ayrı birleştirildi [27]. Bu arada, yabancı mikrobiyom okumalarının taksonomik dağılımı Kraken2 [28] kullanılarak sınıflandırıldı ve Galaxy'de [29, 30] Krona pasta grafiği ile grafiksel olarak temsil edildi. Ön deneylerimizden en uygun kmer sayısının kmers-59 olduğu belirlendi. Daha sonra, son bir açıklama için BLASTN (çift kabuklu NCBI veritabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalama yapılarak kendi kendine oluşan kontigler belirlendi. Daha sonra, son bir açıklama için BLASTN (çift kabuklu NCBI veritabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalama yapılarak kendi kendine oluşan kontigler belirlendi. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых) NCBI'nin моллюсков, значение e <1e-10 ve гомология 60%) окончательной аннотации. Daha sonra, son açıklama için BLASTN'ye (NCBI çift kabuklu veritabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) karşı eşleştirme yapılarak kendi kendine oluşan kontigler belirlendi.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (NCBI'nin для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ve гомология 60%'e kadar). Daha sonra, BLASTN (NCBI çift kabuklu veritabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile eşleştirilerek son açıklama için kendi kendine oluşan kontigler belirlendi. Buna paralel olarak, kendiyle eşleşmeyen grup kontigleri BLASTN ile etiketlendi (nt NCBI veritabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji). Buna paralel olarak, kendiyle eşleşmeyen grup kontigleri BLASTN ile etiketlendi (nt NCBI veritabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e) <1e-10 ve гомология 60%). Buna paralel olarak, yabancı grup kontigleri BLASTN (NT NCBI veritabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile açıklamalandırıldı.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно kontiги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt) NCBI, значение e <1e-10 ve гомология 60%). Buna paralel olarak, kendi grubuna ait olmayan kontigler BLASTN ile açıklamalandırıldı (nt NCBI veritabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji). Ayrıca, nr ve RefSeq protein NCBI veritabanları kullanılarak (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kendi kendine olmayan kontigler üzerinde BLASTX analizi yapıldı. Ayrıca, nr ve RefSeq protein NCBI veritabanları kullanılarak (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kendi kendine olmayan kontigler üzerinde BLASTX analizi yapıldı. BLASTX, nr ve RefSeq NCBI'ye bağlı olarak yeni bir müşteri bağlantısına sahiptir. (значение e <1e-10 ve гомология 60%). Ayrıca, nr ve RefSeq NCBI protein veritabanları kullanılarak (e değeri < 1e-10 ve %60 homoloji) kendi kendine olmayan kontigler üzerinde BLASTX analizi yapıldı.还使用nr ve RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr ve RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX, nr ve RefSeq NCBI'de (e-posta yoluyla) yeni bir müşteri bağlantısına sahiptir. <1e-10 ve гомология 60%). Ayrıca, nr ve RefSeq NCBI protein veritabanları kullanılarak (e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) kendi kendine olmayan kontigler üzerinde BLASTX analizi yapıldı.Kendi kendine eşleşmeyen kontiglerin BLASTN ve BLASTX havuzları, nihai kontigleri temsil etmektedir (Ek dosyaya bakınız).
PCR için kullanılan primerler Tablo S1'de listelenmiştir. ccfDNA hedef genlerini çoğaltmak için Taq DNA polimeraz (Bio Basic Canada, Markham, ON) kullanılmıştır. Aşağıdaki reaksiyon koşulları kullanılmıştır: 95°C'de 3 dakika denatürasyon, 95°C'de 1 dakika, 1 dakika boyunca ayarlanmış tavlama sıcaklığı, 72°C'de 1 dakika uzama, 35 döngü ve son olarak 10 dakika içinde 72°C. PCR ürünleri, 95 V'de SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) içeren agaroz jellerde (%1,5) elektroforez ile ayrılmıştır.
Midyeler (Mytilus spp.), 4°C'de 24 saat boyunca 500 ml oksijenli deniz suyunda (32 PSU) aklimatize edildi. İnsan galektin-7 cDNA sekansını (NCBI erişim numarası L07769) kodlayan bir ek içeren plazmid DNA, şişeye son konsantrasyonu 190 μg/μl olacak şekilde eklendi. Aynı koşullar altında DNA eklenmeden inkübe edilen midyeler kontrol grubu olarak kullanıldı. Üçüncü kontrol tankında ise midyeler olmadan DNA bulunuyordu. Deniz suyundaki DNA kalitesini izlemek için, belirtilen zamanlarda her tanktan deniz suyu örnekleri (20 μl; üç tekrar) alındı. Plazmid DNA izlenebilirliği için, LB midyeleri belirtilen zamanlarda hasat edildi ve qPCR ve ddPCR ile analiz edildi. Deniz suyunun yüksek tuz içeriği nedeniyle, tüm PCR analizlerinden önce örnekler PCR kalitesinde suda (1:10) seyreltildi.
Dijital damlacık PCR (ddPCR), BioRad QX200 protokolü (Mississauga, Ontario, Kanada) kullanılarak gerçekleştirildi. Optimum sıcaklığı belirlemek için sıcaklık profili kullanıldı (Tablo S1). Damlacıklar, bir QX200 damlacık jeneratörü (BioRad) kullanılarak oluşturuldu. ddPCR şu şekilde gerçekleştirildi: 95°C'de 5 dakika, 95°C'de 30 saniye ve belirli bir tavlama sıcaklığında 1 dakika ve 72°C'de 30 saniye, 4°C'de 5 dakika ve 90°C'de 5 dakika içinde 50 döngü. Damlacık sayısı ve pozitif reaksiyon sayısı (kopya sayısı/µl), bir QX200 damlacık okuyucu (BioRad) kullanılarak ölçüldü. 10.000'den az damlacık içeren örnekler reddedildi. Her ddPCR çalıştırıldığında desen kontrolü yapılmadı.
qPCR, Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Avustralya) ve LGALS7'ye özgü primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm kantitatif PCR'lar, QuantiFast SYBR Green PCR Kiti (QIAGEN) kullanılarak 20 µl'de yapıldı. qPCR, 95°C'de 15 dakika inkübasyonla başlatıldı, ardından 95°C'de 10 saniye ve 60°C'de 60 saniye olmak üzere 40 döngü ve bir veri toplama işlemi gerçekleştirildi. Erime eğrileri, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de 60 saniye ve qPCR'ın sonunda 97°C'de ardışık ölçümler kullanılarak oluşturuldu. Kontrol örnekleri hariç, her qPCR üçer kopya halinde gerçekleştirildi.
Midyelerin yüksek filtrasyon hızıyla bilindiği göz önüne alındığında, öncelikle deniz suyunda bulunan DNA parçalarını filtreleyip tutabileceklerini araştırdık. Ayrıca bu parçaların yarı açık lenfatik sistemlerinde birikip birikmediğiyle de ilgilendik. Bu sorunu, mavi midye tanklarına eklenen çözünür DNA parçalarının akıbetini izleyerek deneysel olarak çözdük. DNA parçalarının izlenmesini kolaylaştırmak için, insan galektin-7 genini içeren yabancı (kendimize ait olmayan) plazmid DNA kullandık. ddPCR, deniz suyunda ve midyelerde plazmid DNA parçalarını izler. Sonuçlarımız, midyelerin yokluğunda deniz suyundaki DNA parçalarının miktarı zaman içinde (7 güne kadar) nispeten sabit kalırken, midyelerin varlığında bu seviyenin 8 saat içinde neredeyse tamamen ortadan kalktığını göstermektedir (Şekil 1a,b). Eksojen DNA parçaları, kapak içi sıvıda ve hemolenfte 15 dakika içinde kolayca tespit edildi (Şekil 1c). Bu parçalar, maruz kalmadan 4 saat sonrasına kadar hala tespit edilebiliyordu. DNA parçalarına ilişkin bu filtreleme aktivitesi, bakteri ve alglerin filtreleme aktivitesiyle karşılaştırılabilir [31]. Bu sonuçlar, midyelerin sıvı bölmelerinde yabancı DNA'yı filtreleyebildiğini ve biriktirebildiğini göstermektedir.
Midye varlığında (A) veya yokluğunda (B) deniz suyundaki plazmid DNA'nın nispi konsantrasyonları, ddPCR ile ölçülmüştür. A'da sonuçlar yüzde olarak ifade edilmiştir ve kutuların sınırları 75. ve 25. yüzdelikleri temsil etmektedir. Uyarlanmış logaritmik eğri kırmızı renkte gösterilmiştir ve gri ile gölgelenmiş alan %95 güven aralığını temsil etmektedir. B'de kırmızı çizgi ortalamayı, mavi çizgi ise konsantrasyon için %95 güven aralığını temsil etmektedir. C Plazmid DNA'nın eklenmesinden sonra farklı zamanlarda midyelerin hemolenf ve kapak sıvısında birikimi. Sonuçlar tespit edilen mutlak kopya sayısı/mL (±SE) olarak sunulmuştur.
Daha sonra, sınırlı insan etkisine sahip uzak bir ada grubu olan Kerguelen Adaları'ndaki midye yataklarından toplanan midyelerdeki ccfDNA'nın kökenini araştırdık. Bu amaçla, midye hemolenflerinden cccDNA, insan cccDNA'sını saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerle izole edildi ve saflaştırıldı [32, 33]. Midyelerdeki ortalama hemolenf ccfDNA konsantrasyonlarının düşük mikrogram/ml hemolenf aralığında olduğunu bulduk (bkz. Ek Bilgilerdeki Tablo S2). Bu konsantrasyon aralığı, sağlıklı insanlardakinden (düşük nanogram/mililitre) çok daha geniştir, ancak nadir durumlarda, kanser hastalarında, ccfDNA seviyesi birkaç mikrogram/mililitreye ulaşabilir [34, 35]. Hemolenf ccfDNA'sının boyut dağılımının analizi, bu parçaların 1000 bp'den 1000 bp'ye ve 5000 bp'ye kadar değişen boyutlarda büyük ölçüde farklılık gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 2). Benzer sonuçlar, adli bilimlerde yaygın olarak kullanılan ve ccfDNA dahil düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden genomik DNA'yı hızla izole edip saflaştırmak için kullanılan silika bazlı QIAamp Araştırmacı Kiti kullanılarak elde edildi [36].
Midye hemolenfinin temsili ccfDNA elektroforegramı. NucleoSnap Plazma Kiti (üstte) ve QIAamp DNA Araştırma Kiti ile ekstrakte edilmiştir. B Midyelerdeki hemolenf ccfDNA konsantrasyonlarının (±SE) dağılımını gösteren keman grafiği. Siyah ve kırmızı çizgiler sırasıyla medyanı ve birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil etmektedir.
İnsanlarda ve primatlarda ccfDNA'nın yaklaşık %1'inin yabancı bir kaynağı vardır [21, 37]. İki kabuklu deniz canlılarının yarı açık dolaşım sistemi, mikrobiyal açıdan zengin deniz suyu ve midye ccfDNA'sının boyut dağılımı göz önüne alındığında, midye hemolenf ccfDNA'sının zengin ve çeşitli bir mikrobiyal DNA havuzu içerebileceğini varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, Kerguelen Adaları'ndan toplanan Aulacomya atra örneklerinden hemolenf ccfDNA'sını diziledik ve 10 milyondan fazla okuma elde ettik; bunların %97,6'sı kalite kontrolünden geçti. Okumalar daha sonra BLASTN ve NCBI iki kabuklu deniz canlısı veritabanları kullanılarak kendi ve yabancı kaynaklara göre sınıflandırıldı (Şekil S1, Ek Bilgiler).
İnsanlarda hem nükleer hem de mitokondriyal DNA kan dolaşımına salınabilir [38]. Bununla birlikte, mevcut çalışmada, A. atra genomu dizilenmediği veya tanımlanmadığı için midyelerin nükleer genomik DNA'sını ayrıntılı olarak tanımlamak mümkün olmamıştır. Ancak, çift kabuklu kütüphanesini kullanarak kendi kökenimizden bir dizi ccfDNA parçası tanımlayabildik (Şekil S2, Ek Bilgiler). Ayrıca, dizilenen A. atra genlerinin yönlendirilmiş PCR amplifikasyonu ile kendi kökenimizden DNA parçalarının varlığını doğruladık (Şekil 3). Benzer şekilde, A. atra'nın mitokondriyal genomu kamuya açık veritabanlarında mevcut olduğundan, A. atra'nın hemolenfinde mitokondriyal ccfDNA parçalarının varlığına dair kanıt bulunabilir. Mitokondriyal DNA parçalarının varlığı PCR amplifikasyonu ile doğrulandı (Şekil 3).
PCR ile çoğaltılan A. atra (kırmızı noktalar – stok numarası: SRX5705969) ve M. platensis'in (mavi noktalar – stok numarası: SRX5705968) hemolenfinde çeşitli mitokondriyal genler mevcuttu. Şekil, Breton vd., 2011'den uyarlanmıştır. B A. atra'dan elde edilen hemolenf süpernatantının çoğaltılması FTA kağıdında saklandı. PCR karışımını içeren PCR tüpüne doğrudan eklemek için 3 mm'lik bir zımba kullanın.
Deniz suyundaki bol miktardaki mikrobiyal içerik göz önüne alındığında, başlangıçta hemolenfteki mikrobiyal DNA dizilerinin karakterizasyonuna odaklandık. Bunu yapmak için iki farklı strateji kullandık. İlk strateji, BLAST ve diğer araçlarla karşılaştırılabilir bir doğrulukla mikrobiyal dizileri tanımlayabilen algoritma tabanlı bir dizi sınıflandırma programı olan Kraken2'yi kullandı [28]. 6719'dan fazla okumanın bakteriyel kökenli olduğu belirlenirken, 124'ü arkea ve 64'ü virüslerden kaynaklanıyordu (Şekil 4). En bol bulunan bakteriyel DNA parçaları Firmicutes (%46), Proteobacteria (%27) ve Bacteroidetes (%17) idi (Şekil 4a). Bu dağılım, deniz mavi midyesi mikrobiyomuna ilişkin önceki çalışmalarla tutarlıdır [39, 40]. Gammaproteobacteria, birçok Vibrionales'i de içeren Proteobacteria'nın ana sınıfıydı (%44) (Şekil 4b). ddPCR yöntemi, A. atra hemolenfinin ccfDNA'sında Vibrio DNA parçalarının varlığını doğruladı (Şekil 4c) [41]. ccfDNA'nın bakteriyel kökeni hakkında daha fazla bilgi edinmek için ek bir yaklaşım benimsendi (Şekil S2, Ek Bilgiler). Bu durumda, örtüşen okumalar çift uçlu okumalar olarak bir araya getirildi ve BLASTN kullanılarak, 1e−3'lük bir e değeri ve %90'dan fazla homoloji eşiği ile kendi (çift kabuklu) veya yabancı kökenli olarak sınıflandırıldı. Bu durumda, örtüşen okumalar çift uçlu okumalar olarak bir araya getirildi ve BLASTN kullanılarak, 1e−3'lük bir e değeri ve %90'dan fazla homoloji eşiği ile kendi (çift kabuklu) veya yabancı kökenli olarak sınıflandırıldı. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с концами ve были классифицированы как собственные (двустворчатые молюски) veya чужие по происхождению с использованием BLASTN ve значения e 1e-3 ve отсечения с гомологией> 90%. Bu durumda, örtüşen okumalar çift uçlu okumalar olarak toplandı ve BLASTN ve 1e-3 e değeri kullanılarak ve %90'dan fazla homoloji eşiği ile yerli (çift kabuklu) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN ve 1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ve классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) veya несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ve 1e-3 ve sonraki oyunlar>% 90. Bu durumda, örtüşen okumalar çift uçlu okumalar olarak toplandı ve e BLASTN ve 1e-3 değerleri kullanılarak ve %90'ın üzerinde bir homoloji eşiği ile kendi (çift kabuklu) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.A. atra genomu henüz dizilenmediğinden, MEGAHIT Yeni Nesil Dizileme (NGS) derleyicisinin de novo derleme stratejisini kullandık. Toplam 147.188 kontig, bağımlı (çift kabuklu) kökenli olarak tanımlandı. Bu kontigler daha sonra BLASTN ve BLASTX kullanılarak 1e-10 e-değerleriyle patlatıldı. Bu strateji, A. atra ccfDNA'sında bulunan 482 çift kabuklu olmayan parçayı tanımlamamızı sağladı. Bu DNA parçalarının yarısından fazlası (%57), esas olarak solungaç simbiyontlarından, sülfotrofik simbiyontlar da dahil olmak üzere, ve solungaç simbiyontları Solemya velum'dan elde edildi (Şekil 5).
Tip düzeyinde göreceli bolluk. B İki ana filumun (Firmicutes ve Proteobacteria) mikrobiyal çeşitliliği. ddPCR'nin temsili amplifikasyonu C Vibrio spp. A. Üç atra hemolenfinde 16S rRNA geninin parçaları (mavi).
Toplam 482 toplanan kontig analiz edildi. Metagenomik kontig açıklamalarının taksonomik dağılımının genel profili (prokaryotlar ve ökaryotlar). B BLASTN ve BLASTX ile tanımlanan bakteri DNA parçalarının ayrıntılı dağılımı.
Kraken2 analizi ayrıca midye ccfDNA'sının, Euryarchaeota (%65), Crenarchaeota (%24) ve Thaurmarcheota (%11) DNA parçaları da dahil olmak üzere arkeal DNA parçaları içerdiğini gösterdi (Şekil 6a). Daha önce Kaliforniya midyelerinin mikrobiyal topluluğunda bulunan Euryarchaeota ve Crenarchaeota'dan türetilen DNA parçalarının varlığı şaşırtıcı olmamalıdır [42]. Euryarchaeota genellikle aşırı koşullarla ilişkilendirilse de, artık hem Euryarchaeota hem de Crenarcheota'nın deniz kriyojenik ortamındaki en yaygın prokaryotlar arasında olduğu kabul edilmektedir [43, 44]. Kerguelen Platosu'ndaki dip sızıntılarından kaynaklanan yaygın metan sızıntılarına ilişkin son raporlar [45] ve Kerguelen Adaları kıyılarında gözlemlenen olası mikrobiyal metan üretimi [46] göz önüne alındığında, midyelerde metanojenik mikroorganizmaların varlığı şaşırtıcı değildir.
Daha sonra dikkatimiz DNA virüslerinden elde edilen okumalara yöneldi. Bildiğimiz kadarıyla, bu, midyelerin virüs içeriğine ilişkin ilk hedef dışı çalışmadır. Beklendiği gibi, bakteriyofajların (Caudovirales) DNA parçalarını bulduk (Şekil 6b). Bununla birlikte, en yaygın viral DNA, nükleer sitoplazmik büyük DNA virüsü (NCLDV) olarak da bilinen ve herhangi bir virüsün en büyük genomuna sahip olan nükleositovirüsler filumundan gelmektedir. Bu filum içinde, DNA dizilerinin çoğu, doğal konakçıları omurgalılar ve eklembacaklılar olan Mimimidoviridae (%58) ve Poxviridae (%21) ailelerine aittir, bu DNA dizilerinin küçük bir kısmı ise bilinen virolojik alglerden gelmektedir. Deniz ökaryotik alglerini enfekte eder. Diziler ayrıca, bilinen herhangi bir viral cinsin en büyük genom boyutuna sahip dev virüsü olan Pandora virüsünden de elde edilmiştir. İlginç bir şekilde, hemolenf ccfDNA dizilemesiyle belirlendiği üzere, virüsle enfekte olduğu bilinen konakçı yelpazesi nispeten genişti (Şekil S3, Ek Bilgiler). Bu yelpaze, Baculoviridae ve Iridoviridae gibi böcekleri enfekte eden virüslerin yanı sıra amip, alg ve omurgalıları enfekte eden virüsleri de içerir. Ayrıca Pithovirus sibericum genomuna uyan diziler de bulduk. Pitovirüsler (aynı zamanda "zombi virüsleri" olarak da bilinir) ilk olarak Sibirya'daki 30.000 yıllık donmuş topraktan izole edilmiştir [47]. Bu nedenle, sonuçlarımız, bu virüslerin tüm modern türlerinin yok olmadığını [48] ve bu virüslerin uzak subarktik deniz ekosistemlerinde mevcut olabileceğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır.
Son olarak, diğer çok hücreli hayvanlardan DNA parçaları bulup bulamayacağımızı test ettik. nt, nr ve RefSeq kütüphaneleri (genomik ve protein) ile BLASTN ve BLASTX kullanılarak toplam 482 yabancı kontig tanımlandı. Sonuçlarımız, çok hücreli hayvanların ccfDNA'sının yabancı parçaları arasında kemik DNA'sının baskın olduğunu göstermektedir (Şekil 5). Böceklerden ve diğer türlerden DNA parçaları da bulunmuştur. DNA parçalarının nispeten büyük bir kısmı tanımlanamamıştır, muhtemelen karasal türlere kıyasla genomik veritabanlarında çok sayıda deniz türünün az temsil edilmesinden kaynaklanmaktadır [49].
Bu çalışmada, LB kavramını midyelere uygulayarak, hemolenf ccfDNA dizilemesinin deniz kıyı ekosistemlerinin bileşimine dair bilgi sağlayabileceğini savunuyoruz. Özellikle, 1) midye hemolenfinin nispeten yüksek konsantrasyonlarda (mikrogram düzeyinde) nispeten büyük (~1-5 kb) dolaşan DNA parçaları içerdiğini; 2) bu DNA parçalarının hem bağımsız hem de bağımsız olmayan türler olduğunu; 3) bu DNA parçalarının yabancı kaynakları arasında bakteri, arke ve virüs DNA'sının yanı sıra diğer çok hücreli hayvanların DNA'sını da bulduk; 4) bu yabancı ccfDNA parçalarının hemolenfte birikiminin hızla gerçekleştiğini ve midyelerin iç filtreleme aktivitesine katkıda bulunduğunu tespit ettik. Sonuç olarak, çalışmamız, bugüne kadar ağırlıklı olarak biyotıp alanında uygulanan LB kavramının, öncü türler ile çevreleri arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kullanılabilecek zengin ancak keşfedilmemiş bir bilgi kaynağı içerdiğini göstermektedir.
Primatlara ek olarak, ccfDNA izolasyonu fareler, köpekler, kediler ve atlar dahil olmak üzere memelilerde de rapor edilmiştir [50, 51, 52]. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, çalışmamız açık dolaşım sistemine sahip deniz türlerinde ccfDNA'nın saptanması ve dizilenmesini bildiren ilk çalışmadır. Midyelerin bu anatomik özelliği ve filtreleme yeteneği, dolaşımdaki DNA parçalarının diğer türlere kıyasla farklı boyut özelliklerini en azından kısmen açıklayabilir. İnsanlarda, kanda dolaşan DNA parçalarının çoğu, 150 ila 200 bp arasında değişen boyutlarda küçük parçalardır ve maksimum tepe noktası 167 bp'dir [34, 53]. DNA parçalarının küçük ama önemli bir kısmı 300 ila 500 bp arasındadır ve yaklaşık %5'i 900 bp'den daha uzundur [54]. Bu boyut dağılımının nedeni, plazmadaki ccfDNA'nın ana kaynağının, sağlıklı bireylerde dolaşımdaki hematopoetik hücrelerin nekrozu veya kanser hastalarında tümör hücrelerinin apoptozu (dolaşımdaki tümör DNA'sı, ctDNA olarak bilinir) nedeniyle oluşan hücre ölümü sonucu ortaya çıkmasıdır. Midyelerde bulduğumuz hemolenf ccfDNA'nın boyut dağılımı 1000 ila 5000 bp arasında değişmekte olup, midye ccfDNA'sının farklı bir kökene sahip olduğunu düşündürmektedir. Bu mantıklı bir hipotezdir, çünkü midyeler yarı açık bir vasküler sisteme sahiptir ve yüksek konsantrasyonlarda mikrobiyal genomik DNA içeren deniz ortamlarında yaşarlar. Aslında, eksojen DNA kullanarak yaptığımız laboratuvar deneyleri, midyelerin deniz suyunda DNA parçalarını biriktirdiğini, en azından birkaç saat sonra hücresel alımdan sonra parçalandığını ve/veya salındığını ve/veya çeşitli organizasyonlarda depolandığını göstermiştir. Hücrelerin (hem prokaryotik hem de ökaryotik) nadirliği göz önüne alındığında, kapak içi bölmelerin kullanımı, hem kendi kaynaklarından hem de yabancı kaynaklardan gelen ccfDNA miktarını azaltacaktır. İki kabuklu deniz canlılarının doğuştan gelen bağışıklığının önemi ve dolaşımdaki çok sayıda fagositer hücre göz önüne alındığında, yabancı ccfDNA'nın bile mikroorganizmaların ve/veya hücresel kalıntıların yutulması üzerine yabancı DNA biriktiren dolaşımdaki fagositer hücrelerde zenginleştiğini varsaydık. Sonuç olarak, bulgularımız iki kabuklu deniz canlılarının hemolenf ccfDNA'sının benzersiz bir moleküler bilgi deposu olduğunu ve onların bir bekçi türü olarak statüsünü güçlendirdiğini göstermektedir.
Verilerimiz, bakteriyel kaynaklı hemolenf ccfDNA parçalarının dizilenmesi ve analizinin, konak bakteri florası ve çevredeki deniz ekosisteminde bulunan bakteriler hakkında önemli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Shot dizileme teknikleri, kısmen referans kütüphanesi yanlılığı nedeniyle geleneksel 16S rRNA tanımlama yöntemleri kullanılmış olsaydı gözden kaçacak olan A. atra solungaç kommensal bakterilerinin dizilerini ortaya çıkarmıştır. Aslında, Kerguelen'deki aynı midye tabakasında M. platensis'ten toplanan LB verilerinin kullanımı, solungaçla ilişkili bakteriyel simbiyontların bileşiminin her iki midye türü için de aynı olduğunu göstermiştir (Şekil S4, Ek Bilgiler). Genetik olarak farklı iki midyenin bu benzerliği, Kerguelen'in soğuk, kükürtlü ve volkanik tortularındaki bakteri topluluklarının bileşimini yansıtabilir [55, 56, 57, 58]. Port-au-France kıyıları gibi biyoturbasyonlu kıyı bölgelerinden midye hasadı yapıldığında kükürt indirgeyici mikroorganizmaların daha yüksek seviyeleri iyi bir şekilde tanımlanmıştır [59]. Başka bir olasılık da, midyelerdeki ortak yaşam florasının yatay bulaşmadan etkilenebileceğidir [60, 61]. Deniz ortamı, deniz tabanı yüzeyi ve midyelerdeki simbiyotik bakterilerin bileşimi arasındaki korelasyonu belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu çalışmalar şu anda devam etmektedir.
Midye ccfDNA'sının deniz kıyı ekosistemlerindeki biyoçeşitliliği değerlendirmek için kullanılmasının birçok avantajı arasında, hemolenf ccfDNA'sının uzunluğu ve konsantrasyonu, saflaştırılmasının kolaylığı ve hızlı shotgun dizilemesine olanak tanıyan yüksek kalitesi yer almaktadır. Bu yaklaşım, belirli bir ekosistemdeki viral toplulukları (viromları) karakterize etmek için özellikle etkilidir [62, 63]. Bakteriler, arkeler ve ökaryotların aksine, viral genomlar 16S dizileri gibi filogenetik olarak korunmuş genler içermez. Sonuçlarımız, midyeler gibi gösterge türlerinden alınan sıvı biyopsilerinin, tipik olarak kıyı deniz ekosistemlerinde yaşayan konakçıları enfekte ettiği bilinen nispeten büyük sayıda ccfDNA virüs parçasını tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, protozoaları, eklembacaklıları, böcekleri, bitkileri ve bakteriyel virüsleri (örneğin, bakteriyofajlar) enfekte ettiği bilinen virüsleri içerir. Kerguelen'deki aynı midye tabakasından toplanan mavi midyelerin (M. platensis) hemolenf ccfDNA viromunu incelediğimizde de benzer bir dağılım bulundu (Tablo S2, Ek Bilgiler). ccfDNA'nın shotgun dizilemesi, insan veya diğer türlerin viromunun incelenmesinde ivme kazanan yeni bir yaklaşımdır [21, 37, 64]. Bu yaklaşım, özellikle çift sarmallı DNA virüslerini incelemek için kullanışlıdır, çünkü Baltimore'daki en çeşitli ve geniş virüs sınıfını temsil eden tüm çift sarmallı DNA virüsleri arasında tek bir gen korunmamıştır [65]. Bu virüslerin çoğu sınıflandırılmamış olsa ve virüs dünyasının tamamen bilinmeyen bir bölümünden virüsleri içerebilse de [66], A. atra ve M. platensis midyelerinin viromlarının ve konakçı aralıklarının iki tür arasında benzer şekilde yer aldığını bulduk (şekil S3'e bakınız, ek bilgiler). Bu benzerlik şaşırtıcı değil, çünkü çevrede bulunan DNA'nın alımında seçicilik eksikliğini yansıtıyor olabilir. RNA viromunu karakterize etmek için saflaştırılmış RNA kullanan gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Çalışmamızda, yerel ccfDNA'nın montajından önce ve sonra havuzlanmış okumaların ve kontiglerin iki aşamalı silinmesini kullanan Kowarski ve meslektaşlarının [37] çalışmasından uyarlanmış çok titiz bir işlem hattı kullandık ve bu da yüksek oranda eşleştirilmemiş okuma ile sonuçlandı. Bu nedenle, bu eşleştirilmemiş okumaların bazılarının hala kendi kökenlerine sahip olabileceğini göz ardı edemeyiz, çünkü öncelikle bu midye türü için bir referans genomumuz yok. Ayrıca, kendi kendine ve kendi kendine olmayan okumalar arasındaki kimeralar ve Illumina MiSeq PE75 tarafından üretilen okuma uzunlukları konusunda endişeli olduğumuz için bu işlem hattını kullandık. Haritalandırılmamış okumaların çoğunluğunun bir diğer nedeni de, özellikle Kerguelen gibi uzak bölgelerdeki deniz mikroplarının çoğunun henüz açıklanmamış olmasıdır. İnsan ccfDNA'sına benzer ccfDNA parça uzunluklarını varsayarak Illumina MiSeq PE75 kullandık. Gelecekteki çalışmalar için, hemolenf ccfDNA'sının insan ve/veya memelilerden daha uzun okumalara sahip olduğunu gösteren sonuçlarımız göz önüne alındığında, daha uzun ccfDNA parçaları için daha uygun bir sekanslama platformu kullanılmasını öneriyoruz. Bu uygulama, daha derin analiz için daha fazla gösterge belirlemeyi çok daha kolaylaştıracaktır. Şu anda mevcut olmayan tam A. atra nükleer genom sekansının elde edilmesi de, ccfDNA'nın kendi ve yabancı kaynaklardan ayırt edilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır. Araştırmamızın sıvı biyopsi kavramının midyelere uygulanma olasılığına odaklandığı göz önüne alındığında, bu kavram gelecekteki araştırmalarda kullanıldıkça, midyelerin mikrobiyal çeşitliliğini incelemek için bu yöntemin potansiyelini artıracak yeni araçlar ve süreçler geliştirileceğini umuyoruz.
Non-invaziv bir klinik biyobelirteç olarak, insan plazmasındaki yüksek ccfDNA seviyeleri çeşitli hastalıklar, doku hasarı ve stres koşullarıyla ilişkilidir [67,68,69]. Bu artış, doku hasarından sonra kendi kökenli DNA parçalarının salınımıyla ilişkilidir. Bu konuyu, midyelerin kısa süreliğine 30 °C sıcaklığa maruz bırakıldığı akut ısı stresi kullanarak ele aldık. Bu analizi üç farklı midye türü üzerinde üç bağımsız deneyde gerçekleştirdik. Bununla birlikte, akut ısı stresinden sonra ccfDNA seviyelerinde herhangi bir değişiklik bulamadık (bkz. Şekil S5, ek bilgiler). Bu bulgu, en azından kısmen, midyelerin yarı açık bir dolaşım sistemine sahip olmaları ve yüksek filtreleme aktiviteleri nedeniyle büyük miktarda yabancı DNA biriktirmeleri gerçeğini açıklayabilir. Öte yandan, midyeler, birçok omurgasız gibi, stres kaynaklı doku hasarına karşı daha dirençli olabilir ve böylece hemolenflerinde ccfDNA salınımını sınırlayabilir [70, 71].
Bugüne kadar, su ekosistemlerindeki biyoçeşitliliğin DNA analizi esas olarak çevresel DNA (eDNA) metabarkodlamaya odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem genellikle primerler kullanıldığında biyoçeşitlilik analizinde sınırlıdır. Shotgun sekanslama kullanımı, PCR'ın sınırlamalarını ve primer setlerinin yanlı seçimini ortadan kaldırır. Bu nedenle, bir anlamda, yöntemimiz, parçalanmış DNA'yı doğrudan sekanslayabilen ve neredeyse tüm organizmaları analiz edebilen yakın zamanda kullanılan yüksek verimli eDNA Shotgun sekanslama yöntemine daha yakındır [72, 73]. Bununla birlikte, LB'yi standart eDNA yöntemlerinden ayıran bir dizi temel sorun vardır. Elbette, eDNA ve LB arasındaki temel fark, doğal filtre konaklarının kullanılmasıdır. Süngerler ve çift kabuklular (Dresseina spp.) gibi deniz türlerinin eDNA'yı incelemek için doğal filtre olarak kullanılması rapor edilmiştir [74, 75]. Bununla birlikte, Dreissena'nın çalışmasında DNA'nın çıkarıldığı doku biyopsileri kullanılmıştır. LB'den ccfDNA analizi, eDNA veya doku biyopsisiyle ilişkili doku biyopsisi, özel ve bazen pahalı ekipman ve lojistik gerektirmez. Aslında, yakın zamanda LB'den ccfDNA'nın soğuk zincir tutmadan FTA desteğiyle saklanabileceğini ve analiz edilebileceğini bildirdik; bu, uzak bölgelerdeki araştırmalar için büyük bir zorluktur [76]. Sıvı biyopsilerden ccfDNA ekstraksiyonu da basittir ve shotgun sekanslama ve PCR analizi için yüksek kaliteli DNA sağlar. Bu, eDNA analiziyle ilişkili bazı teknik sınırlamalar göz önüne alındığında büyük bir avantajdır [77]. Örnekleme yönteminin basitliği ve düşük maliyeti, özellikle uzun vadeli izleme programları için de uygundur. Yüksek filtreleme yeteneklerine ek olarak, çift kabukluların bilinen bir diğer özelliği de mukuslarının kimyasal mukopolisakkarit bileşimidir; bu da virüslerin emilimini teşvik eder [78, 79]. Bu, çift kabukluları, belirli bir su ekosisteminde biyoçeşitliliği ve iklim değişikliğinin etkisini karakterize etmek için ideal bir doğal filtre haline getirir. Konakçıdan türetilen DNA parçalarının varlığı, eDNA'ya kıyasla yöntemin bir sınırlaması olarak görülebilse de, eDNA'ya kıyasla bu tür yerel ccfDNA'ya sahip olmanın maliyeti, sağlık çalışmaları için mevcut olan geniş bilgi miktarı göz önüne alındığında aynı zamanda anlaşılabilir. Bu, konakçının genomuna entegre edilmiş viral dizilerin varlığını içerir. Bu, özellikle midyeler için önemlidir, çünkü çift kabuklularda yatay olarak bulaşan lösemik retrovirüslerin varlığı söz konusudur [80, 81]. LB'nin eDNA'ya göre bir diğer avantajı, hemolenfte dolaşan kan hücrelerinin fagositoz aktivitesinden yararlanmasıdır; bu da mikroorganizmaları (ve genomlarını) yutar. Fagositoz, çift kabuklularda kan hücrelerinin ana işlevidir [82]. Son olarak, yöntem, midyelerin yüksek filtreleme kapasitesinden (ortalama 1,5 l/saat deniz suyu) ve iki günlük dolaşımdan yararlanır; bu da deniz suyunun farklı katmanlarının karışımını artırarak heterolog eDNA'nın yakalanmasına olanak tanır. [83, 84]. Bu nedenle, midyelerin beslenme, ekonomik ve çevresel etkileri göz önüne alındığında, midye ccfDNA analizi ilginç bir alan oluşturmaktadır. İnsanlardan toplanan LB analizine benzer şekilde, bu yöntem de dışsal maddelere yanıt olarak konak DNA'sındaki genetik ve epigenetik değişiklikleri ölçme olasılığını açmaktadır. Örneğin, üçüncü nesil sekanslama teknolojileri, nanopore sekanslama kullanılarak doğal ccfDNA'da genom çapında metilasyon analizi yapmak için öngörülebilir. Bu süreç, midye ccfDNA parçalarının uzunluğunun, kimyasal dönüşümlere gerek kalmadan tek bir sekanslama çalışmasından genom çapında DNA metilasyon analizine izin veren uzun okuma sekanslama platformlarıyla ideal olarak uyumlu olması gerçeğiyle kolaylaştırılmalıdır.85,86] Bu ilginç bir olasılıktır, çünkü DNA metilasyon desenlerinin çevresel strese bir yanıtı yansıttığı ve birçok nesil boyunca devam ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, iklim değişikliğine veya kirleticilere maruz kaldıktan sonra tepkiyi yöneten temel mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir [87]. Bununla birlikte, LB kullanımının sınırlamaları da vardır. Söylemeye gerek yok, bu, ekosistemde gösterge türlerinin varlığını gerektirir. Yukarıda belirtildiği gibi, belirli bir ekosistemin biyoçeşitliliğini değerlendirmek için LB kullanmak, kaynaktan gelen DNA parçalarının varlığını dikkate alan titiz bir biyoinformatik işlem hattını da gerektirir. Bir diğer önemli sorun, deniz türleri için referans genomlarının bulunabilirliğidir. Deniz Memelileri Genom Projesi ve yakın zamanda kurulan Fish10k projesi [88] gibi girişimlerin gelecekte bu tür analizleri kolaylaştıracağı umulmaktadır. LB kavramının deniz filtre besleyici organizmalara uygulanması, sıralama teknolojisindeki en son gelişmelerle de uyumludur ve bu da onu, çevresel strese yanıt olarak deniz habitatlarının sağlığı hakkında önemli bilgiler sağlamak için çoklu ohm biyobelirteçlerinin geliştirilmesi için uygun hale getirir.
Genom dizileme verileri, NCBI Dizi Okuma Arşivi'ne (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) SRR8924808 numaralı Biyoproje altında yüklenmiştir.
Brierley AS, Kingsford MJ İklim değişikliğinin deniz yaşamı ve ekosistemleri üzerindeki etkisi. Cole Biyoloji. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, vd. İklim değişikliğinin ve diğer yerel stres faktörlerinin deniz ortamı üzerindeki birleşik etkilerini göz önünde bulundurun. Genel bilimsel çevre. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, ve diğerleri. ). Mart ayının ilk bilimi. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tekrarlayan ısı stresi koşulları altında azalan ısı toleransı, mavi midyelerin yüksek yaz ölüm oranını açıklamaktadır. Bilimsel rapor 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER ve diğerleri. Hayvan ölümlerinin sıklığı, nedenleri ve kapsamındaki son değişiklikler. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, ve diğerleri. Türe özgü olmayan çok sayıda patojen, Pinna nobilis'in kitlesel ölümüne neden olmuş olabilir. Hayat. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. İklim değişikliğinin Arktik zoonotik hastalıklar üzerindeki potansiyel etkisi. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ve diğerleri. Kıyı kirliliği izlemesinde sinyal organizmaları olarak mavi midyeler (Mytilus edulis spp.): bir inceleme. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Kanser tedavisinde sıvı biyopsinin entegrasyonu. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C ve diğerleri. Sıvı biyopsi olgunlaşması: Tümör DNA'sının dolaşmasına izin verir. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. İnsan plazmasındaki nükleik asitler. Biyolojik Toplum alt kuruluşlarının toplantı tutanakları. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Kanser tedavisinde moleküler belirteç olarak hücre dışı DNA'nın yeni bir rolü. Biyomolar analizin nicelleştirilmesi. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Sıvı biyopsi klinik uygulamaya giriyor – uygulama sorunları ve gelecekteki zorluklar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ve diğerleri. Fetal DNA, anne plazmasında ve serumunda mevcuttur. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Gebelik sırasında kadınların kanındaki dolaşan hücre dışı RNA'yı kullanarak gebeliğin seyrini ve komplikasyonlarını inceleme çalışması. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J ve diğerleri. Sıvı biyopsi: donör hücre içermeyen DNA, böbrek naklinde allojenik lezyonları tespit etmek için kullanılır. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM. Doğum öncesi tanılamada yenilikler: anne plazması genom dizilemesi. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D ve diğerleri. Enfekte vücut sıvılarının yeni nesil metagenomik sekanslamasıyla hızlı patojen tespiti. Nat Medicine. 2021;27:115-24.