Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn rendro'r wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae biopsi hylif (LB) yn gysyniad sy'n ennill poblogrwydd yn gyflym yn y maes biofeddygol. Mae'r cysyniad yn seiliedig yn bennaf ar ganfod darnau o DNA allgellog sy'n cylchredeg (ccfDNA), sy'n cael eu rhyddhau'n bennaf fel darnau bach ar ôl marwolaeth celloedd mewn amrywiol feinweoedd. Mae cyfran fach o'r darnau hyn yn tarddu o feinweoedd neu organebau tramor (estron). Yn y gwaith cyfredol, rydym wedi cymhwyso'r cysyniad hwn i gregyn gleision, rhywogaeth warchodol sy'n adnabyddus am eu gallu hidlo dŵr y môr uchel. Rydym yn defnyddio gallu cregyn gleision i weithredu fel hidlwyr naturiol i ddal darnau DNA amgylcheddol o amrywiaeth o ffynonellau i ddarparu gwybodaeth am fioamrywiaeth ecosystemau arfordirol morol. Mae ein canlyniadau'n dangos bod hemolymff cregyn gleision yn cynnwys darnau DNA sy'n amrywio'n fawr o ran maint, o 1 i 5 kb. Dangosodd dilyniannu gwn saethu fod nifer fawr o ddarnau DNA o darddiad microbaidd tramor. Yn eu plith, gwelsom ddarnau DNA o facteria, archaea, a firysau, gan gynnwys firysau y gwyddys eu bod yn heintio amrywiaeth o westeiwyr a geir yn gyffredin mewn ecosystemau morol arfordirol. I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod y cysyniad o LB a gymhwysir i gregyn gleision yn cynrychioli ffynhonnell wybodaeth gyfoethog ond heb ei harchwilio eto am amrywiaeth microbaidd mewn ecosystemau arfordirol morol.
Mae effaith newid hinsawdd (CC) ar fioamrywiaeth ecosystemau morol yn faes ymchwil sy'n tyfu'n gyflym. Nid yn unig y mae cynhesu byd-eang yn achosi straen ffisiolegol pwysig, ond mae hefyd yn gwthio terfynau esblygiadol sefydlogrwydd thermol organebau morol, gan effeithio ar gynefin nifer o rywogaethau, gan eu hannog i chwilio am amodau mwy ffafriol [1, 2]. Yn ogystal ag effeithio ar fioamrywiaeth metazoaid, mae CC yn tarfu ar y cydbwysedd bregus rhwng rhyngweithiadau gwesteiwr a microbiaid. Mae'r dysbacteriosis microbaidd hwn yn peri bygythiad difrifol i ecosystemau morol gan ei fod yn gwneud organebau morol yn fwy agored i bathogenau heintus [3, 4]. Credir bod SS yn chwarae rhan bwysig mewn marwolaethau torfol, sy'n broblem ddifrifol ar gyfer rheoli ecosystemau morol byd-eang [5, 6]. Mae hwn yn fater pwysig o ystyried effeithiau economaidd, ecolegol a maethol llawer o rywogaethau morol. Mae hyn yn arbennig o wir am gregyn bylchog sy'n byw yn y rhanbarthau pegynol, lle mae effeithiau CK yn fwy uniongyrchol a difrifol [6, 7]. Mewn gwirionedd, defnyddir cregyn bylchog fel Mytilus spp. yn helaeth i fonitro effeithiau CC ar ecosystemau morol. Nid yw'n syndod bod nifer gymharol fawr o fiomarcwyr wedi'u datblygu i fonitro eu hiechyd, yn aml gan ddefnyddio dull dwy haen sy'n cynnwys biomarcwyr swyddogaethol yn seiliedig ar weithgaredd ensymatig neu swyddogaethau cellog fel hyfywedd celloedd a gweithgaredd ffagosytig [8]. Mae'r dulliau hyn hefyd yn cynnwys mesur crynodiad dangosyddion pwysau penodol sy'n cronni mewn meinweoedd meddal ar ôl amsugno llawer iawn o ddŵr y môr. Fodd bynnag, mae'r gallu hidlo uchel a system gylchrediad gwaed lled-agored cregyn byfalf yn rhoi cyfle i ddatblygu biomarcwyr hemolymff newydd gan ddefnyddio'r cysyniad o fiopsi hylif (LB), dull syml a lleiaf ymledol o reoli samplau gwaed cleifion [9, 10]. Er y gellir dod o hyd i sawl math o foleciwlau sy'n cylchredeg mewn LB dynol, mae'r cysyniad hwn yn seiliedig yn bennaf ar ddadansoddiad dilyniannu DNA o ddarnau DNA allgellog (ccfDNA) sy'n cylchredeg mewn plasma. Mewn gwirionedd, mae presenoldeb DNA sy'n cylchredeg mewn plasma dynol wedi bod yn hysbys ers canol yr 20fed ganrif [11], ond dim ond yn ystod y blynyddoedd diwethaf y mae dyfodiad dulliau dilyniannu trwybwn uchel wedi arwain at ddiagnosis clinigol yn seiliedig ar ccfDNA. Mae presenoldeb y darnau DNA cylchredol hyn oherwydd rhyddhau goddefol DNA genomig (niwclear a mitocondriaidd) ar ôl marwolaeth celloedd. Mewn unigolion iach, mae crynodiad ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL) ond gall gael ei gynyddu 5–10 gwaith mewn cleifion sy'n dioddef o batholegau amrywiol neu sy'n destun straen, gan arwain at ddifrod i feinwe. Mewn unigolion iach, mae crynodiad ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL) ond gall gael ei gynyddu 5–10 gwaith mewn cleifion sy'n dioddef o batholegau amrywiol neu sy'n destun straen, gan arwain at ddifrod i feinwe. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьы бы различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Mewn pobl iach, mae crynodiad cccDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL), ond gall gynyddu 5–10 gwaith mewn cleifion â gwahanol batholegau neu dan straen sy'n arwain at ddifrod i feinwe.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL);在 健康个体中, ccfdna 的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承司可增加 5-10 倍，从而组织。。。损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5- ус и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и ц и целичение различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Mae crynodiadau ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/ml) mewn unigolion iach, ond gallant fod yn cynyddu 5-10 gwaith mewn cleifion â gwahanol batholegau neu straen, gan arwain at niwed i feinwe.Mae maint darnau ccfDNA yn amrywio'n fawr, ond fel arfer mae'n amrywio o 150 i 200 bp. [12]. Gellir defnyddio dadansoddiad o ccfDNA hunan-ddeilliedig, h.y., ccfDNA o gelloedd gwesteiwr normal neu wedi'u trawsnewid, i ganfod newidiadau genetig ac epigenetig sy'n bresennol yn y genom niwclear a/neu mitocondriaidd, a thrwy hynny helpu clinigwyr i ddewis therapïau penodol wedi'u targedu'n foleciwlaidd [13]. Fodd bynnag, gellir cael ccfDNA o ffynonellau tramor fel ccfDNA o gelloedd ffetws yn ystod beichiogrwydd neu o organau wedi'u trawsblannu [14,15,16,17]. Mae ccfDNA hefyd yn ffynhonnell bwysig o wybodaeth ar gyfer canfod presenoldeb asidau niwclëig asiant heintus (tramor), sy'n caniatáu canfod heintiau eang nad ydynt wedi'u nodi gan ddiwylliannau gwaed yn anfewnwthiol, gan osgoi biopsi ymledol o feinwe heintiedig [18]. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos yn wir bod gwaed dynol yn cynnwys ffynhonnell gyfoethog o wybodaeth y gellir ei defnyddio i nodi pathogenau firaol a bacteriol, a bod tua 1% o'r ccfDNA a geir mewn plasma dynol o darddiad tramor [19]. Mae'r astudiaethau hyn yn dangos y gellir asesu bioamrywiaeth microbiom cylchredol organeb gan ddefnyddio dadansoddiad ccfDNA. Fodd bynnag, tan yn ddiweddar, defnyddiwyd y cysyniad hwn yn unig mewn bodau dynol ac, i raddau llai, mewn fertebratau eraill [20, 21].
Yn y papur presennol, rydym yn defnyddio'r potensial LB i ddadansoddi ccfDNA Aulacomya atra, rhywogaeth ddeheuol a geir yn gyffredin yn Ynysoedd Kerguelen is-antarctig, grŵp o ynysoedd ar ben llwyfandir mawr a ffurfiodd 35 miliwn o flynyddoedd yn ôl. ffrwydrad folcanig. Gan ddefnyddio system arbrofol in vitro, gwelsom fod darnau DNA mewn dŵr y môr yn cael eu cymryd yn gyflym gan gregyn gleision ac yn mynd i mewn i'r adran hemolymff. Mae dilyniannu gwn saethu wedi dangos bod ccfDNA hemolymff cregyn gleision yn cynnwys darnau DNA o'i darddiad ei hun a darddiad nad yw'n hunan-gregyn, gan gynnwys bacteria symbiotig a darnau DNA o fiomau sy'n nodweddiadol o ecosystemau arfordirol morol folcanig oer. Mae ccfDNA hemolymff hefyd yn cynnwys dilyniannau firaol sy'n deillio o firysau â gwahanol ystodau gwesteiwr. Fe wnaethom hefyd ddod o hyd i ddarnau DNA o anifeiliaid amlgellog fel pysgod esgyrnog, anemonïau môr, algâu a phryfed. I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos y gellir cymhwyso'r cysyniad LB yn llwyddiannus i infertebratau morol i gynhyrchu repertoire genomig cyfoethog mewn ecosystemau morol.
Casglwyd oedolion (55-70 mm o hyd) Mytilus platensis (M. platensis) ac Aulacomya atra (A. atra) o lannau creigiog rhynglanwol Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Ynysoedd Kerguelen ym mis Rhagfyr 2018. Cafwyd cregyn gleision glas oedolion eraill (Mytilus spp.) gan gyflenwr masnachol (PEI Mussel King Inc., Ynys y Tywysog Edward, Canada) a'u rhoi mewn tanc awyredig â thymheredd rheoledig (4°C) yn cynnwys 10–20 L o heli artiffisial 32‰. (halen môr artiffisial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, UDA). Ar gyfer pob arbrawf, mesurwyd hyd a phwysau'r cregyn unigol.
Mae protocol mynediad agored am ddim ar gyfer y rhaglen hon ar gael ar-lein (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Yn gryno, casglwyd hemolymff LB o gyhyrau herwgipiwr fel y disgrifiwyd [22]. Eglurwyd yr hemolymff trwy allgyrchu ar 1200 × g am 3 munud, rhewyd yr uwchnofiant (-20 ° C) tan ei ddefnyddio. Ar gyfer ynysu a phuro cfDNA, dadmerwyd samplau (1.5-2.0 ml) a'u prosesu gan ddefnyddio'r pecyn cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Storiwyd ccfDNA ar -80 ° C tan ddadansoddiad pellach. Mewn rhai arbrofion, ynyswyd a phuro ccfDNA gan ddefnyddio'r Pecyn Ymchwilydd DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Mesurwyd DNA wedi'i buro gan ddefnyddio assay PicoGreen safonol. Dadansoddwyd dosbarthiad darnau'r ccfDNA ynysig drwy electrofforesis capilar gan ddefnyddio bio-ddadansoddwr Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gan ddefnyddio Pecyn DNA Sensitifrwydd Uchel. Perfformiwyd yr assay gan ddefnyddio 1 µl o'r sampl ccfDNA yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Ar gyfer dilyniannu darnau ccfDNA hemolymff, paratôdd Genome Québec (Montreal, Quebec, Canada) lyfrgelloedd gwn saethu gan ddefnyddio pecyn Cymysgedd DNA Illumina o becyn Illumina MiSeq PE75. Defnyddiwyd addasydd safonol (BioO). Mae ffeiliau data crai ar gael o Archif Darllen Dilyniant NCBI (SRR8924808 a SRR8924809). Aseswyd ansawdd darllen sylfaenol gan ddefnyddio FastQC [23]. Defnyddiwyd Trimmomatic [24] ar gyfer addaswyr clipio a darlleniadau o ansawdd gwael. Cafodd darlleniadau gwn saethu gyda phennau paru eu cyfuno â FLASH yn ddarlleniadau sengl hirach gyda gorgyffwrdd o leiaf 20 bp i osgoi anghydweddiadau [25]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodio â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata Tacsonomeg NCBI deufalf (gwerth e < 1e−3 a homologi 90%), a pherfformiwyd masgio dilyniannau cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodio â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata Tacsonomeg NCBI deufalf (gwerth e < 1e−3 a homologi 90%), a pherfformiwyd masgio dilyniannau cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономих таксономиь моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 a 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложност использованием LLWCH [26]. Cafodd darlleniadau cronedig eu hanodio â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata tacsonomeg cregyn deuglawr NCBI (gwerth e < 1e-3 a homologi 90%), a pherfformiwyd masgio dilyniant cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数 和 注释合并的读数，进行低复杂度序列的掩蔽。使用双壳类 ncbi 分类 (（（<1e-3和 90%同源）用用用注释合并读溕 llwch [2，2，进行复杂度序列的。。。。 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 蔽掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базны двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей жо ниложо ничелого по помологии выполнено с использованием LLWCH [26]. Cafodd darlleniadau cronedig eu hanodio â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata tacsonomeg cregyn deuglawr NCBI (gwerth e <1e-3 a homologi 90%), a pherfformiwyd masgio dilyniant cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26].Rhannwyd y darlleniadau yn ddau grŵp: rhai cysylltiedig â dilyniannau cregyn deuglawr (a elwir yma'n hunan-ddarlleniadau) a rhai anghysylltiedig (heb fod yn hunan-ddarlleniadau). Casglwyd dau grŵp at ei gilydd ar wahân gan ddefnyddio MEGAHIT i gynhyrchu contigs [27]. Yn y cyfamser, dosbarthwyd dosbarthiad tacsonomig darlleniadau microbiom estron gan ddefnyddio Kraken2 [28] a'i gynrychioli'n graffigol gan siart cylch Krona ar Galaxy [29, 30]. Penderfynwyd mai'r kmers gorau posibl oedd kmers-59 o'n harbrofion rhagarweiniol. Yna nodwyd hunan-gysylltiedig trwy alinio â BLASTN (cronfa ddata NCBI deuglawr, gwerth e < 1e−10 a homologi 60%) ar gyfer anodiad terfynol. Yna nodwyd hunan-gysylltiedig trwy alinio â BLASTN (cronfa ddata NCBI deuglawr, gwerth e < 1e−10 a homologi 60%) ar gyfer anodiad terfynol. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворлюкаты значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Yna nodwyd hunan-gysylltiedig trwy baru yn erbyn BLASTN (cronfa ddata cregyn deuglawr NCBI, gwerth e <1e-10 a homologi 60%) ar gyfer anodiad terfynol.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，a 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，a 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставлени NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Yna nodwyd hunan-gysylltiedig ar gyfer anodiad terfynol trwy baru yn erbyn BLASTN (cronfa ddata cregyn deuglawr NCBI, gwerth e <1e-10 a homologi 60%). Ochr yn ochr, anodiwyd contigs grŵp anhunanol gyda BLASTN (cronfa ddata nt NCBI, gwerth e < 1e−10 a homologi 60%). Ochr yn ochr, anodiwyd contigs grŵp anhunanol gyda BLASTN (cronfa ddata nt NCBI, gwerth e < 1e−10 a homologi 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI < гомология 60%). Ochr yn ochr, anodiwyd contigs grŵp tramor gyda BLASTN (cronfa ddata NT NCBI, gwerth e <1e-10 a homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (банЋ Поделитьной, были аннотированы с помощью BLASTN (банЋ NC) значение e <1e-10 и гомология 60%). Ochr yn ochr, anodiwyd contigs grŵp nad ydynt yn hunan-grŵp gyda BLASTN (cronfa ddata nt NCBI, gwerth e <1e-10 a homologi 60%). Cynhaliwyd BLASTX hefyd ar contigs nad ydynt yn hunan-contigs gan ddefnyddio'r cronfeydd data protein nr a RefSeq NCBI (gwerth e < 1e−10 a homologi 60%). Cynhaliwyd BLASTX hefyd ar contigs nad ydynt yn hunan-contigs gan ddefnyddio'r cronfeydd data protein nr a RefSeq NCBI (gwerth e < 1e−10 a homologi 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и Refзен <1e-10 и гомология 60%). Perfformiwyd BLASTX hefyd ar contigs nad ydynt yn hunan-contigs gan ddefnyddio'r cronfeydd data protein nr a RefSeq NCBI (gwerth e < 1e-10 a homologi 60%).还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼和 60 % 、还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼和 60 % 、 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr NCи- 1 RefSeq и гомология 60%). Perfformiwyd BLASTX hefyd ar gyd-gyfnerthiadau nad ydynt yn hunan-gyfnerthiadau gan ddefnyddio'r cronfeydd data protein nr a RefSeq NCBI (gwerth e <1e-10 a homologi 60%).Mae'r pyllau BLASTN a BLASTX o gyd-destunau nad ydynt yn hunan-gysylltiedig yn cynrychioli'r cyd-destunau terfynol (gweler y ffeil Atodol).
Rhestrir y primerau a ddefnyddiwyd ar gyfer PCR yn Nhabl S1. Defnyddiwyd polymerase DNA Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) i fwyhau'r genynnau targed ccfDNA. Defnyddiwyd yr amodau adwaith canlynol: dadnatureiddio ar 95°C am 3 munud, 95°C am 1 funud, tymheredd anelio gosod am 1 funud, ymestyn ar 72°C am 1 funud, 35 cylch, ac yn olaf 72°C o fewn 10 munud. Gwahanwyd cynhyrchion PCR trwy electrofforesis mewn geliau agaros (1.5%) yn cynnwys SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ar 95 V.
Cafodd cregyn gleision (Mytilus spp.) eu haddasu mewn 500 ml o ddŵr môr ocsigenedig (32 PSU) am 24 awr ar 4°C. Ychwanegwyd DNA plasmid yn cynnwys mewnosodiad yn amgodio dilyniant cDNA galectin-7 dynol (rhif mynediad NCBI L07769) at y ffiol ar grynodiad terfynol o 190 μg/μl. Cregyn gleision a gafodd eu deori o dan yr un amodau heb ychwanegu DNA oedd y rheolydd. Roedd y trydydd tanc rheoli yn cynnwys DNA heb gregyn gleision. Er mwyn monitro ansawdd y DNA mewn dŵr môr, cymerwyd samplau dŵr môr (20 μl; tair ailadrodd) o bob tanc ar yr amser a nodwyd. Er mwyn olrhain DNA plasmid, casglwyd cregyn gleision LB ar yr amseroedd a nodwyd a'u dadansoddi gan qPCR a ddPCR. Oherwydd cynnwys halen uchel dŵr y môr, cafodd aliquots eu gwanhau mewn dŵr o ansawdd PCR (1:10) cyn pob assay PCR.
Perfformiwyd PCR diferion digidol (ddPCR) gan ddefnyddio'r protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Defnyddiwch y proffil tymheredd i bennu'r tymheredd gorau posibl (Tabl S1). Cynhyrchwyd diferion gan ddefnyddio generadur diferion QX200 (BioRad). Cynhaliwyd ddPCR fel a ganlyn: 95°C am 5 munud, 50 cylch o 95°C am 30 eiliad a thymheredd anelio penodol am 1 munud a 72°C am 30 eiliad, 4°C am 5 munud a 90°C o fewn 5 munud. Mesurwyd nifer y diferion ac adweithiau positif (nifer y copïau/µl) gan ddefnyddio darllenydd diferion QX200 (BioRad). Gwrthodwyd samplau gyda llai na 10,000 o ddiferion. Ni pherfformiwyd rheolaeth patrwm bob tro y rhedwyd ddPCR.
Perfformiwyd qPCR gan ddefnyddio Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Awstralia) a phrimerau penodol i LGALS7. Perfformiwyd pob PCR meintiol mewn 20 µl gan ddefnyddio'r Pecyn PCR Gwyrdd QuantiFast SYBR (QIAGEN). Dechreuwyd qPCR gyda deori 15 munud ar 95°C ac yna 40 cylch ar 95°C am 10 eiliad ac ar 60°C am 60 eiliad gydag un casgliad data. Cynhyrchwyd cromliniau toddi gan ddefnyddio mesuriadau olynol ar 95°C am 5 eiliad, 65°C am 60 eiliad, a 97°C ar ddiwedd y qPCR. Perfformiwyd pob qPCR mewn tair copi, ac eithrio samplau rheoli.
Gan fod cregyn gleision yn adnabyddus am eu cyfradd hidlo uchel, fe wnaethom ymchwilio yn gyntaf a allent hidlo a chadw darnau DNA sy'n bresennol mewn dŵr y môr. Roeddem hefyd â diddordeb mewn a yw'r darnau hyn yn cronni yn eu system lymffatig lled-agored. Fe wnaethom ddatrys y mater hwn yn arbrofol trwy olrhain tynged darnau DNA hydawdd a ychwanegwyd at danciau cregyn gleision glas. Er mwyn hwyluso olrhain darnau DNA, fe wnaethom ddefnyddio DNA plasmid tramor (nid hunan) sy'n cynnwys y genyn galectin-7 dynol. Mae ddPCR yn olrhain darnau DNA plasmid mewn dŵr y môr a chregyn gleision. Mae ein canlyniadau'n dangos, os oedd faint o ddarnau DNA mewn dŵr y môr yn aros yn gymharol gyson dros amser (hyd at 7 diwrnod) yn absenoldeb cregyn gleision, yna ym mhresenoldeb cregyn gleision diflannodd y lefel hon bron yn llwyr o fewn 8 awr (Ffig. 1a,b). Canfuwyd darnau o DNA alldarddol yn hawdd o fewn 15 munud mewn hylif mewnfalfaidd a hemolymff (Ffig. 1c). Gellid dal i ganfod y darnau hyn hyd at 4 awr ar ôl dod i gysylltiad â nhw. Mae'r gweithgaredd hidlo hwn mewn perthynas â darnau DNA yn gymharol â gweithgaredd hidlo bacteria ac algâu [31]. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall cregyn gleision hidlo a chronni DNA tramor yn eu hadrannau hylif.
Crynodiadau cymharol DNA plasmid mewn dŵr y môr ym mhresenoldeb (A) neu absenoldeb (B) cregyn gleision, wedi'u mesur gan ddPCR. Yn A, mynegir y canlyniadau fel canrannau, gyda ffiniau'r blychau yn cynrychioli'r 75fed a'r 25ain ganradd. Dangosir y gromlin logarithmig wedi'i ffitio mewn coch, ac mae'r ardal wedi'i chysgodi mewn llwyd yn cynrychioli'r cyfwng hyder 95%. Yn B, mae'r llinell goch yn cynrychioli'r cymedr a'r llinell las yn cynrychioli'r cyfwng hyder 95% ar gyfer y crynodiad. C Cronni DNA plasmid yn hemolymff a hylif falf cregyn gleision ar wahanol adegau ar ôl ychwanegu DNA plasmid. Cyflwynir canlyniadau fel copïau absoliwt a ganfuwyd/mL (±SE).
Nesaf, fe wnaethom ymchwilio i darddiad ccfDNA mewn cregyn gleision a gasglwyd o welyau cregyn gleision ar Ynysoedd Kerguelen, grŵp anghysbell o ynysoedd â dylanwad anthropogenig cyfyngedig. At y diben hwn, ynyswyd a phuro cccDNA o hemolymffau cregyn gleision gan ddefnyddio dulliau a ddefnyddir yn gyffredin i buro cccDNA dynol [32, 33]. Gwelsom fod crynodiadau cyfartalog ccfDNA hemolymff mewn cregyn gleision yn yr ystod microgramau isel fesul ml o hemolymff (gweler Tabl S2, Gwybodaeth Atodol). Mae'r ystod hon o grynodiadau yn llawer mwy nag mewn pobl iach (nanogramau isel fesul mililitr), ond mewn achosion prin, mewn cleifion canser, gall lefel y ccfDNA gyrraedd sawl microgram fesul mililitr [34, 35]. Dangosodd dadansoddiad o ddosbarthiad maint ccfDNA hemolymff fod y darnau hyn yn amrywio'n fawr o ran maint, o 1000 bp i 1000 bp hyd at 5000 bp (Ffig. 2). Cafwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio'r Pecyn Ymchwilwyr QIAamp sy'n seiliedig ar silica, dull a ddefnyddir yn gyffredin mewn gwyddoniaeth fforensig i ynysu a phuro DNA genomig yn gyflym o samplau DNA crynodiad isel, gan gynnwys ccfDNA [36].
Electrofforegram ccfDNA cynrychioliadol o hemolymff cregyn gleision. Wedi'i echdynnu gyda Phecyn Plasma NucleoSnap (top) a Phecyn Ymchwilydd DNA QIAamp. Plot ffidil B yn dangos dosbarthiad crynodiadau ccfDNA hemolymff (±SE) mewn cregyn gleision. Mae'r llinellau du a choch yn cynrychioli'r canolrif a'r chwartel cyntaf a thrydydd, yn y drefn honno.
Mae tua 1% o ccfDNA mewn bodau dynol a phrimatiaid o ffynhonnell dramor [21, 37]. O ystyried system gylchrediad gwaed lled-agored cregyn bylfog, dŵr môr cyfoethog mewn microbau, a dosbarthiad maint ccfDNA cregyn bylfog, fe wnaethom ragdybio y gallai ccfDNA hemolymff cregyn bylfog gynnwys cronfa gyfoethog ac amrywiol o DNA microbaidd. I brofi'r rhagdybiaeth hon, fe wnaethom ddilyniannu ccfDNA hemolymff o samplau Aulacomya atra a gasglwyd o Ynysoedd Kerguelen, gan gynhyrchu dros 10 miliwn o ddarlleniadau, y pasiodd 97.6% ohonynt reolaeth ansawdd. Yna dosbarthwyd y darlleniadau yn ôl ffynonellau hunan a ffynonellau nad ydynt yn hunan gan ddefnyddio cronfeydd data cregyn bylfog BLASTN ac NCBI (Ffig. S1, Gwybodaeth Atodol).
Mewn bodau dynol, gellir rhyddhau DNA niwclear a mitocondriaidd i'r llif gwaed [38]. Fodd bynnag, yn yr astudiaeth bresennol, nid oedd yn bosibl disgrifio'n fanwl DNA genomig niwclear cregyn gleision, o ystyried nad yw genom A. atra wedi'i ddilyniannu na'i ddisgrifio. Fodd bynnag, roeddem yn gallu nodi nifer o ddarnau ccfDNA o'n tarddiad ein hunain gan ddefnyddio'r llyfrgell cregyn deuglawr (Ffig. S2, Gwybodaeth Atodol). Cadarnhawyd presenoldeb darnau DNA o'n tarddiad ein hunain hefyd trwy ymhelaethiad PCR cyfeiriedig o'r genynnau A. atra hynny a ddilyniannwyd (Ffig. 3). Yn yr un modd, o ystyried bod genom mitocondriaidd A. atra ar gael mewn cronfeydd data cyhoeddus, gellir dod o hyd i dystiolaeth o bresenoldeb darnau ccfDNA mitocondriaidd yn hemolymff A. atra. Cadarnhawyd presenoldeb darnau DNA mitocondriaidd trwy ymhelaethiad PCR (Ffig. 3).
Roedd amryw o enynnau mitocondriaidd yn bresennol yn hemolymff A. atra (dotiau coch – rhif stoc: SRX5705969) ac M. platensis (dotiau glas – rhif stoc: SRX5705968) wedi'u mwyhau gan PCR. Ffigur wedi'i addasu o Breton et al., 2011 B Mwyhadur uwchnofn hemolymff o A. atra Wedi'i storio ar bapur FTA. Defnyddiwch dyrnwr 3 mm i'w ychwanegu'n uniongyrchol at y tiwb PCR sy'n cynnwys y cymysgedd PCR.
O ystyried y cynnwys microbaidd toreithiog mewn dŵr y môr, fe wnaethom ganolbwyntio i ddechrau ar nodweddu dilyniannau DNA microbaidd mewn hemolymff. I wneud hyn, rydym yn defnyddio dau strategaeth wahanol. Defnyddiodd y strategaeth gyntaf Kraken2, rhaglen dosbarthu dilyniannau sy'n seiliedig ar algorithmau a all nodi dilyniannau microbaidd gyda chywirdeb cymharol â BLAST ac offer eraill [28]. Penderfynwyd bod mwy na 6719 o ddarlleniadau o darddiad bacteriol, tra bod 124 a 64 o archaea a firysau, yn y drefn honno (Ffig. 4). Y darnau DNA bacteriol mwyaf niferus oedd Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), a Bacteroidetes (17%) (Ffig. 4a). Mae'r dosbarthiad hwn yn gyson ag astudiaethau blaenorol o ficrobiom y cregyn gleision glas môr [39, 40]. Gammaproteobacteria oedd y prif ddosbarth o Proteobacteria (44%), gan gynnwys llawer o Vibrionales (Ffig. 4b). Cadarnhaodd y dull ddPCR bresenoldeb darnau DNA Vibrio yn ccfDNA hemolymph A. atra (Ffig. 4c) [41]. I gael rhagor o wybodaeth am darddiad bacteriol ccfDNA, cymerwyd dull ychwanegol (Ffig. S2, Gwybodaeth Atodol). Yn yr achos hwn, cafodd darlleniadau a oedd yn gorgyffwrdd eu casglu fel darlleniadau pen-pâr a'u dosbarthu fel rhai o darddiad hunan (cregennog deugragennog) neu an-hunan gan ddefnyddio BLASTN a gwerth e o 1e−3 a thorbwynt gyda homologi >90%. Yn yr achos hwn, cafodd darlleniadau a oedd yn gorgyffwrdd eu casglu fel darlleniadau pen-pâr a'u dosbarthu fel rhai o darddiad hunan (cregennog deugragennog) neu an-hunan gan ddefnyddio BLASTN a gwerth e o 1e−3 a thorbwynt gyda homologi >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения спарными концами и бысрифичи собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значение по происхождению с использованием BLASTN и значение и значение гомологией > 90%. Yn yr achos hwn, casglwyd darlleniadau sy'n gorgyffwrdd fel darlleniadau â phennau pâr a'u dosbarthu fel rhai brodorol (deuglawr) neu rai nad ydynt yn wreiddiol gan ddefnyddio BLASTN a gwerth e o 1e-3 a thorbwynt gyda homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN和1e-3的e值和>90%和>同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下, 重叠读数组装为配末端读数，使用使用使璔 blast 1 值 用 数 ​​用 璔 blast 1 倱和> 90% 同源性的分类自身 （双 壳类） 非自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классрифиц собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений по происхождению с использованием значений гомологии > 90%. Yn yr achos hwn, casglwyd darlleniadau sy'n gorgyffwrdd fel darlleniadau â phennau pâr a'u dosbarthu fel eu hunain (cregyn bylfog) neu nad ydynt yn wreiddiol gan ddefnyddio gwerthoedd e BLASTN ac 1e-3 a throthwy homologi >90%.Gan nad yw genom A. atra wedi'i ddilyniannu eto, fe wnaethom ddefnyddio strategaeth gydosod de novo cydosodwr MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Mae cyfanswm o 147,188 o gontigau wedi'u nodi fel rhai sy'n ddibynnol (deufalfiaid) ar darddiad. Yna cafodd y contigau hyn eu ffrwydro gyda gwerthoedd-e o 1e-10 gan ddefnyddio BLASTN a BLASTX. Caniataodd y strategaeth hon inni nodi 482 o ddarnau nad ydynt yn ddeufalfiaid sy'n bresennol yn ccfDNA A. atra. Cafwyd mwy na hanner (57%) o'r darnau DNA hyn o facteria, yn bennaf o symbiontiaid tagell, gan gynnwys symbiontiaid sylffotroffig, ac o symbiontiaid tagell Solemya velum (Ffig. 5).
Digonedd cymharol ar lefel y math. B Amrywiaeth microbaidd dau brif ffyla (Firmicutes a Proteobacteria). Mwyhadur cynrychioliadol o ddPCR C Vibrio spp. A. Darnau o'r genyn rRNA 16S (glas) mewn tri hemolymff atra.
Dadansoddwyd cyfanswm o 482 o contigau a gasglwyd. Proffil cyffredinol o ddosbarthiad tacsonomig anodiadau contig metagenomig (procaryotau ac ewcaryotau). B Dosbarthiad manwl o ddarnau DNA bacteriol a nodwyd gan BLASTN a BLASTX.
Dangosodd dadansoddiad Kraken2 hefyd fod ccfDNA cregyn gleision yn cynnwys darnau DNA archeol, gan gynnwys darnau DNA o Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), a Thaurmarcheota (11%) (Ffig. 6a). Ni ddylai presenoldeb darnau DNA sy'n deillio o Euryarchaeota a Crenarchaeota, a ddarganfuwyd yn flaenorol yng nghymuned microbaidd cregyn gleision Califfornia, fod yn syndod [42]. Er bod Euryarchaeota yn aml yn gysylltiedig ag amodau eithafol, cydnabyddir bellach fod Euryarchaeota a Crenarcheota ymhlith y procaryotau mwyaf cyffredin yn yr amgylchedd cryogenig morol [43, 44]. Nid yw presenoldeb micro-organebau methanogenig mewn cregyn gleision yn syndod, o ystyried adroddiadau diweddar am ollyngiadau methan helaeth o ollyngiadau gwaelod ar Lwyfandir Kerguelen [45] a chynhyrchu methan microbaidd posibl a welwyd oddi ar arfordir Ynysoedd Kerguelen [46].
Yna symudodd ein sylw at ddarlleniadau o firysau DNA. Hyd eithaf ein gwybodaeth, dyma'r astudiaeth gyntaf oddi ar y targed o gynnwys firws cregyn gleision. Fel y disgwyliwyd, daethom o hyd i ddarnau DNA o facterioffagau (Caudovirales) (Ffig. 6b). Fodd bynnag, mae'r DNA firaol mwyaf cyffredin yn dod o ffylwm o niwcleocytofirysau, a elwir hefyd yn firws DNA mawr cytoplasmig niwclear (NCLDV), sydd â'r genom mwyaf o unrhyw firws. O fewn y ffylwm hwn, mae'r rhan fwyaf o ddilyniannau DNA yn perthyn i'r teuluoedd Mimimidoviridae (58%) a Poxviridae (21%), y mae eu gwesteiwyr naturiol yn cynnwys fertebratau ac arthropodau, tra bod cyfran fach o'r dilyniannau DNA hyn yn perthyn i algâu firolegol hysbys. Yn heintio algâu ewcariotig morol. Cafwyd y dilyniannau hefyd o'r firws Pandora, y firws enfawr gyda'r maint genom mwyaf o unrhyw genera firaol hysbys. Yn ddiddorol, roedd yr ystod o westeiwyr y gwyddys eu bod wedi'u heintio â'r firws, fel y'i pennwyd gan ddilyniannu ccfDNA hemolymff, yn gymharol fawr (Ffigur S3, Gwybodaeth Atodol). Mae'n cynnwys firysau sy'n heintio pryfed fel Baculoviridae ac Iridoviridae, yn ogystal â firysau sy'n heintio amoeba, algâu ac fertebratau. Fe wnaethon ni hefyd ddod o hyd i ddilyniannau sy'n cyfateb i genom Pithovirus sibericum. Ynyswyd pitofirysau (a elwir hefyd yn "feirysau sombi") gyntaf o bermafrost 30,000 mlwydd oed yn Siberia [47]. Felly, mae ein canlyniadau'n gyson ag adroddiadau blaenorol sy'n dangos nad yw pob rhywogaeth fodern o'r firysau hyn wedi diflannu [48] a bod y firysau hyn o bosibl yn bresennol mewn ecosystemau morol isarctig anghysbell.
Yn olaf, fe wnaethon ni brofi i weld a allem ni ddod o hyd i ddarnau DNA o anifeiliaid amlgellog eraill. Nodwyd cyfanswm o 482 o gontigau tramor gan BLASTN a BLASTX gyda llyfrgelloedd nt, nr a RefSeq (genomig a phrotein). Mae ein canlyniadau'n dangos, ymhlith y darnau tramor o ccfDNA anifeiliaid amlgellog, fod DNA esgyrn esgyrn yn drech (Ffig. 5). Mae darnau DNA o bryfed a rhywogaethau eraill hefyd wedi'u canfod. Nid yw rhan gymharol fawr o'r darnau DNA wedi'u nodi, o bosibl oherwydd tangynrychiolaeth nifer fawr o rywogaethau morol mewn cronfeydd data genomig o'i gymharu â rhywogaethau daearol [49].
Yn y papur presennol, rydym yn cymhwyso'r cysyniad LB i gregyn gleision, gan ddadlau y gall dilyniannu ergydion ccfDNA hemolymff roi cipolwg ar gyfansoddiad ecosystemau arfordirol morol. Yn benodol, gwelsom fod 1) hemolymff cregyn gleision yn cynnwys crynodiadau cymharol uchel (lefelau microgram) o ddarnau DNA cylchredeg cymharol fawr (~1-5 kb); 2) mae'r darnau DNA hyn yn annibynnol ac yn an-annibynnol 3) Ymhlith ffynonellau tramor y darnau DNA hyn, gwelsom DNA bacteriol, archeol a firaol, yn ogystal â DNA anifeiliaid amlgellog eraill; 4) Mae cronni'r darnau ccfDNA tramor hyn yn yr hemolymff yn digwydd yn gyflym ac yn cyfrannu at weithgaredd hidlo mewnol cregyn gleision. I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod y cysyniad o LB, sydd hyd yn hyn wedi'i gymhwyso'n bennaf ym maes biofeddygaeth, yn amgodio ffynhonnell wybodaeth gyfoethog ond heb ei harchwilio y gellir ei defnyddio i ddeall yn well y rhyngweithio rhwng rhywogaethau sentinel a'u hamgylchedd.
Yn ogystal â phrimatiaid, mae ynysu ccfDNA wedi'i adrodd mewn mamaliaid, gan gynnwys llygod, cŵn, cathod a cheffylau [50, 51, 52]. Fodd bynnag, hyd y gwyddom ni, ein hastudiaeth ni yw'r gyntaf i adrodd ar ganfod a dilyniannu ccfDNA mewn rhywogaethau morol â system gylchrediad agored. Gall y nodwedd anatomegol hon a gallu hidlo cregyn gleision, o leiaf yn rhannol, esbonio'r gwahanol nodweddion maint o ddarnau DNA sy'n cylchredeg o'i gymharu â rhywogaethau eraill. Mewn bodau dynol, mae'r rhan fwyaf o ddarnau DNA sy'n cylchredeg yn y gwaed yn ddarnau bach sy'n amrywio o ran maint o 150 i 200 bp. gyda brig uchaf o 167 bp [34, 53]. Mae cyfran fach ond arwyddocaol o ddarnau DNA rhwng 300 a 500 bp o ran maint, ac mae tua 5% yn hirach na 900 bp. [54]. Y rheswm dros y dosbarthiad maint hwn yw bod prif ffynhonnell ccfDNA mewn plasma yn digwydd o ganlyniad i farwolaeth celloedd, naill ai oherwydd marwolaeth celloedd neu oherwydd necrosis celloedd hematopoietig sy'n cylchredeg mewn unigolion iach neu oherwydd apoptosis celloedd tiwmor mewn cleifion canser (a elwir yn DNA tiwmor sy'n cylchredeg). , ctDNA). Roedd dosbarthiad maint ccfDNA hemolymff a ganfuom mewn cregyn gleision yn amrywio o 1000 i 5000 bp, gan awgrymu bod gan ccfDNA cregyn gleision darddiad gwahanol. Mae hon yn ddamcaniaeth resymegol, gan fod gan gregyn gleision system fasgwlaidd lled-agored ac yn byw mewn amgylcheddau dyfrol morol sy'n cynnwys crynodiadau uchel o DNA genomig microbaidd. Mewn gwirionedd, mae ein harbrofion labordy gan ddefnyddio DNA alldarddol wedi dangos bod cregyn gleision yn cronni darnau DNA mewn dŵr y môr, o leiaf ar ôl ychydig oriau maent yn cael eu diraddio ar ôl eu derbyn yn y celloedd a/neu eu rhyddhau a/neu eu storio mewn amrywiol sefydliadau. O ystyried prinder celloedd (procariotig ac ewcariotig), bydd defnyddio adrannau mewnfalfaidd yn lleihau faint o ccfDNA o ffynonellau hunan-yn ogystal ag o ffynonellau tramor. O ystyried pwysigrwydd imiwnedd cynhenid ​​​​deufalf a'r nifer fawr o ffagocytau sy'n cylchredeg, fe wnaethom ragdybio ymhellach fod hyd yn oed ccfDNA tramor wedi'i gyfoethogi mewn ffagocytau sy'n cylchredeg sy'n cronni DNA tramor ar ôl llyncu micro-organebau a/neu falurion cellog. Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos bod ccfDNA hemolymff deufalf yn ystorfa unigryw o wybodaeth foleciwlaidd ac yn atgyfnerthu eu statws fel rhywogaeth sentinel.
Mae ein data yn dangos y gall dilyniannu a dadansoddi darnau ccfDNA hemolymff sy'n deillio o facteria ddarparu gwybodaeth allweddol am fflora bacteria'r gwesteiwr a'r bacteria sy'n bresennol yn yr ecosystem forol gyfagos. Mae technegau dilyniannu ergydion wedi datgelu dilyniannau o'r bacteria commensal A. atra tagell a fyddai wedi cael eu methu pe bai dulliau adnabod rRNA 16S confensiynol wedi'u defnyddio, yn rhannol oherwydd rhagfarn llyfrgell gyfeirio. Mewn gwirionedd, dangosodd ein defnydd o ddata LB a gasglwyd o M. platensis yn yr un haen cregyn gleision yn Kerguelen fod cyfansoddiad symbiontau bacteria sy'n gysylltiedig â thagellau yr un peth ar gyfer y ddwy rywogaeth o gregyn gleision (Ffig. S4, Gwybodaeth Atodol). Gall y tebygrwydd hwn o ddau gregyn gleision sy'n wahanol yn enetig adlewyrchu cyfansoddiad cymunedau bacteriol yng ngwaddodion oer, sylffwraidd a folcanig Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Mae lefelau uwch o ficro-organebau sy'n lleihau sylffwr wedi'u disgrifio'n dda wrth gynaeafu cregyn gleision o ardaloedd arfordirol bio-dyrredig [59], fel arfordir Port-au-France. Posibilrwydd arall yw y gallai trosglwyddiad llorweddol effeithio ar fflora cregyn gleision commensal [60, 61]. Mae angen mwy o ymchwil i bennu'r gydberthynas rhwng yr amgylchedd morol, wyneb llawr y môr, a chyfansoddiad bacteria symbiotig mewn cregyn gleision. Mae'r astudiaethau hyn yn mynd rhagddynt ar hyn o bryd.
Mae hyd a chrynodiad ccfDNA hemolymff, ei hwylustod puro, a'i ansawdd uchel i ganiatáu dilyniannu cyflym gyda saethu yn rhai o'r nifer o fanteision o ddefnyddio ccfDNA cregyn gleision i asesu bioamrywiaeth mewn ecosystemau arfordirol morol. Mae'r dull hwn yn arbennig o effeithiol ar gyfer nodweddu cymunedau firaol (firomau) mewn ecosystem benodol [62, 63]. Yn wahanol i facteria, archaea, ac ewcaryotau, nid yw genomau firaol yn cynnwys genynnau sydd wedi'u cadw'n ffylogenetig fel dilyniannau 16S. Mae ein canlyniadau'n dangos y gellir defnyddio biopsïau hylif o rywogaethau dangosol fel cregyn gleision i nodi niferoedd cymharol fawr o ddarnau firws ccfDNA y gwyddys eu bod yn heintio gwesteiwyr sydd fel arfer yn byw mewn ecosystemau morol arfordirol. Mae hyn yn cynnwys firysau y gwyddys eu bod yn heintio protosoa, arthropodau, pryfed, planhigion, a firysau bacteriol (e.e., bacterioffagau). Canfuwyd dosbarthiad tebyg pan wnaethom archwilio firom ccfDNA hemolymff cregyn gleision glas (M. platensis) a gasglwyd yn yr un haen cregyn gleision yn Kerguelen (Tabl S2, Gwybodaeth Atodol). Mae dilyniannu ccfDNA â gwn saethu yn wir yn ddull newydd sy'n ennill momentwm wrth astudio firom bodau dynol neu rywogaethau eraill [21, 37, 64]. Mae'r dull hwn yn arbennig o ddefnyddiol ar gyfer astudio firysau DNA llinyn dwbl, gan nad oes un genyn wedi'i gadw ymhlith yr holl firysau DNA llinyn dwbl, sy'n cynrychioli'r dosbarth mwyaf amrywiol ac eang o firysau yn Baltimore [65]. Er bod y rhan fwyaf o'r firysau hyn yn parhau i fod heb eu dosbarthu a gallant gynnwys firysau o ran gwbl anhysbys o'r byd firaol [66], gwelsom fod firomau ac ystodau gwesteiwr y cregyn gleision A. atra ac M. platensis yn disgyn rhwng y ddwy rywogaeth yn yr un modd (gweler ffigur S3, gwybodaeth ychwanegol). Nid yw'r tebygrwydd hwn yn syndod, gan y gallai adlewyrchu diffyg detholusrwydd wrth gymryd DNA sy'n bresennol yn yr amgylchedd. Mae angen astudiaethau yn y dyfodol gan ddefnyddio RNA wedi'i buro ar hyn o bryd i nodweddu'r firom RNA.
Yn ein hastudiaeth ni, fe wnaethon ni ddefnyddio piblinell drylwyr iawn wedi'i haddasu o waith Kowarski a'i gydweithwyr [37], a ddefnyddiodd ddileu darlleniadau cronedig a chontigau mewn dau gam cyn ac ar ôl cydosod ccfDNA brodorol, gan arwain at gyfran uchel o ddarlleniadau heb eu mapio. Felly, ni allwn ddiystyru y gallai rhai o'r darlleniadau heb eu mapio hyn fod â'u tarddiad eu hunain o hyd, yn bennaf oherwydd nad oes gennym genom cyfeirio ar gyfer y rhywogaeth hon o gregyn bylchog. Fe wnaethon ni hefyd ddefnyddio'r biblinell hon oherwydd ein bod ni'n pryderu am y chimeras rhwng darlleniadau hunanol a darlleniadau nad ydynt yn hunanol a'r hyd darlleniadau a gynhyrchir gan yr Illumina MiSeq PE75. Rheswm arall dros y rhan fwyaf o ddarlleniadau heb eu siartio yw nad yw llawer o'r microbau morol, yn enwedig mewn ardaloedd anghysbell fel Kerguelen, wedi'u hanodi. Fe wnaethon ni ddefnyddio Illumina MiSeq PE75, gan dybio hyd darnau ccfDNA tebyg i ccfDNA dynol. Ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol, o ystyried bod ein canlyniadau'n dangos bod gan ccfDNA hemolymff ddarlleniadau hirach na bodau dynol a/neu famaliaid, rydym yn argymell defnyddio platfform dilyniannu sy'n fwy addas ar gyfer darnau ccfDNA hirach. Bydd yr arfer hwn yn ei gwneud hi'n llawer haws nodi mwy o arwyddion ar gyfer dadansoddiad dyfnach. Byddai cael dilyniant genom niwclear cyflawn A. atra, nad yw ar gael ar hyn o bryd, hefyd yn hwyluso'r gwahaniaethu rhwng ccfDNA a ffynonellau hunan a ffynonellau nad ydynt yn hunan. O ystyried bod ein hymchwil wedi canolbwyntio ar y posibilrwydd o gymhwyso'r cysyniad o fiopsi hylif i gregyn gleision, rydym yn gobeithio, wrth i'r cysyniad hwn gael ei ddefnyddio mewn ymchwil yn y dyfodol, y bydd offer a phibellau newydd yn cael eu datblygu i gynyddu potensial y dull hwn i astudio amrywiaeth microbaidd cregyn gleision yn ecosystem forol.
Fel biomarciwr clinigol anfewnwthiol, mae lefelau uchel o ccfDNA mewn plasma dynol yn gysylltiedig ag amrywiol afiechydon, difrod i feinwe, ac amodau straen [67,68,69]. Mae'r cynnydd hwn yn gysylltiedig â rhyddhau darnau DNA o'i darddiad ei hun ar ôl difrod i feinwe. Aethom i'r afael â'r mater hwn gan ddefnyddio straen gwres acíwt, lle cafodd cregyn gleision eu hamlygu'n fyr i dymheredd o 30 °C. Gwnaethom y dadansoddiad hwn ar dri math gwahanol o gregyn gleision mewn tri arbrawf annibynnol. Fodd bynnag, ni chanfuom unrhyw newid yn lefelau ccfDNA ar ôl straen gwres acíwt (gweler Ffigur S5, gwybodaeth ychwanegol). Gall y darganfyddiad hwn egluro, o leiaf yn rhannol, y ffaith bod gan gregyn gleision system gylchrediad gwaed lled-agored ac maent yn cronni symiau mawr o DNA tramor oherwydd eu gweithgaredd hidlo uchel. Ar y llaw arall, gall cregyn gleision, fel llawer o infertebratau, fod yn fwy gwrthsefyll difrod i feinwe a achosir gan straen, a thrwy hynny gyfyngu ar ryddhau ccfDNA yn eu hemolymff [70, 71].
Hyd yn hyn, mae dadansoddiad DNA o fioamrywiaeth mewn ecosystemau dyfrol wedi canolbwyntio'n bennaf ar feta-fargodio DNA amgylcheddol (eDNA). Fodd bynnag, mae'r dull hwn fel arfer yn gyfyngedig mewn dadansoddiad bioamrywiaeth pan ddefnyddir primerau. Mae defnyddio dilyniannu dryll yn osgoi cyfyngiadau PCR a'r dewis rhagfarnllyd o setiau primerau. Felly, mewn ystyr, mae ein dull yn agosach at y dull dilyniannu dryll eDNA trwybwn uchel a ddefnyddiwyd yn ddiweddar, sy'n gallu dilyniannu DNA darniog yn uniongyrchol a dadansoddi bron pob organeb [72, 73]. Fodd bynnag, mae nifer o faterion sylfaenol sy'n gwahaniaethu LB oddi wrth ddulliau eDNA safonol. Wrth gwrs, y prif wahaniaeth rhwng eDNA ac LB yw'r defnydd o westeion hidlo naturiol. Adroddwyd ar y defnydd o rywogaethau morol fel sbyngau a chregyn bylchog (Dresseina spp.) fel hidlydd naturiol ar gyfer astudio eDNA [74, 75]. Fodd bynnag, defnyddiodd astudiaeth Dreissena fiopsïau meinwe y tynnwyd DNA ohonynt. Nid yw dadansoddi ccfDNA o LB yn gofyn am fiopsi meinwe, offer arbenigol ac weithiau drud a logisteg sy'n gysylltiedig ag eDNA neu fiopsi meinwe. Mewn gwirionedd, fe wnaethom adrodd yn ddiweddar y gellir storio a dadansoddi ccfDNA o LB gyda chefnogaeth FTA heb gynnal cadwyn oer, sy'n her fawr i ymchwil mewn ardaloedd anghysbell [76]. Mae echdynnu ccfDNA o fiopsïau hylif hefyd yn syml ac yn darparu DNA o ansawdd uchel ar gyfer dilyniannu saethu a dadansoddi PCR. Mae hyn yn fantais fawr o ystyried rhai o'r cyfyngiadau technegol sy'n gysylltiedig â dadansoddi eDNA [77]. Mae symlrwydd a chost isel y dull samplu hefyd yn arbennig o addas ar gyfer rhaglenni monitro hirdymor. Yn ogystal â'u gallu hidlo uchel, nodwedd adnabyddus arall o gregyn bylfog yw cyfansoddiad mwcopolysacarid cemegol eu mwcws, sy'n hyrwyddo amsugno firysau [78, 79]. Mae hyn yn gwneud cregyn bylfog yn hidlydd naturiol delfrydol ar gyfer nodweddu bioamrywiaeth ac effaith newid hinsawdd mewn ecosystem ddyfrol benodol. Er y gellir gweld presenoldeb darnau DNA sy'n deillio o'r gwesteiwr fel cyfyngiad ar y dull o'i gymharu ag eDNA, mae'r gost sy'n gysylltiedig â chael ccfDNA mor frodorol o'i gymharu ag eDNA ar yr un pryd yn ddealladwy am y swm enfawr o wybodaeth sydd ar gael ar gyfer astudiaethau iechyd gwesteiwr gwrthbwyso. Mae hyn yn cynnwys presenoldeb dilyniannau firaol wedi'u hintegreiddio i genom y gwesteiwr. Mae hyn yn arbennig o bwysig i gregyn bylchog, o ystyried presenoldeb retrofirysau lewcemig a drosglwyddir yn llorweddol mewn cregyn bylchog [80, 81]. Mantais arall o LB dros eDNA yw ei fod yn manteisio ar weithgaredd ffagosytig celloedd gwaed sy'n cylchredeg yn yr hemolymff, sy'n llyncu micro-organebau (a'u genom). Ffagosytosis yw prif swyddogaeth celloedd gwaed mewn cregyn bylchog [82]. Yn olaf, mae'r dull yn manteisio ar gapasiti hidlo uchel cregyn bylchog (cyfartaledd o 1.5 l/awr o ddŵr y môr) a chylchrediad deuddydd, sy'n cynyddu cymysgu gwahanol haenau o ddŵr y môr, gan ganiatáu dal eDNA heterologaidd. [83, 84]. Felly, mae dadansoddi ccfDNA cregyn bylchog yn llwybr diddorol o ystyried effeithiau maethol, economaidd ac amgylcheddol cregyn bylchog. Yn debyg i ddadansoddi LB a gesglir gan fodau dynol, mae'r dull hwn hefyd yn agor y posibilrwydd o fesur newidiadau genetig ac epigenetig yn DNA'r gwesteiwr mewn ymateb i sylweddau alldarddol. Er enghraifft, gellir rhagweld y bydd technolegau dilyniannu trydydd cenhedlaeth yn cynnal dadansoddiad methyliad genom-gyfan mewn ccfDNA brodorol gan ddefnyddio dilyniannu nanopandwll. Dylid hwyluso'r broses hon gan y ffaith bod hyd darnau ccfDNA'r cregyn gleision yn gydnaws yn ddelfrydol â llwyfannau dilyniannu darllen hir sy'n caniatáu dadansoddiad methyliad DNA genom-gyfan o un rhediad dilyniannu heb yr angen am drawsffurfiadau cemegol.85,86] Mae hwn yn bosibilrwydd diddorol, gan ei fod wedi'i ddangos bod patrymau methyliad DNA yn adlewyrchu ymateb i straen amgylcheddol ac yn parhau dros genedlaethau lawer. Felly, gall ddarparu cipolwg gwerthfawr ar y mecanweithiau sylfaenol sy'n llywodraethu ymateb ar ôl dod i gysylltiad â newid hinsawdd neu lygryddion [87]. Fodd bynnag, nid yw defnyddio LB heb gyfyngiadau. Yn ddiau, mae hyn yn gofyn am bresenoldeb rhywogaethau dangosol yn yr ecosystem. Fel y soniwyd uchod, mae defnyddio LB i asesu bioamrywiaeth ecosystem benodol hefyd yn gofyn am biblinell biowybodeg drylwyr sy'n ystyried presenoldeb darnau DNA o'r ffynhonnell. Problem fawr arall yw argaeledd genomau cyfeirio ar gyfer rhywogaethau morol. Gobeithir y bydd mentrau fel y Prosiect Genomau Mamaliaid Morol a'r prosiect Fish10k a sefydlwyd yn ddiweddar [88] yn hwyluso dadansoddiad o'r fath yn y dyfodol. Mae cymhwyso'r cysyniad LB i organebau morol sy'n bwydo ar hidlwyr hefyd yn gydnaws â'r datblygiadau diweddaraf mewn technoleg dilyniannu, gan ei wneud yn addas iawn ar gyfer datblygu biomarcwyr aml-ohm i ddarparu gwybodaeth bwysig am iechyd cynefinoedd morol mewn ymateb i straen amgylcheddol.
Mae data dilyniannu genom wedi'i adneuo yn Archif Darllen Dilyniannau NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 o dan Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Effaith newid hinsawdd ar fywyd morol ac ecosystemau. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ac eraill. Ystyriwch effeithiau cyfunol newid hinsawdd a ffactorau straen lleol eraill ar yr amgylchedd morol. amgylchedd gwyddonol cyffredinol. 2021;755:142564.
Mae Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Gwyddoniaeth y cyntaf o Fawrth. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Mae goddefgarwch gwres is o dan amodau straen gwres ailadroddus yn egluro marwolaethau uchel misglodion glas yn yr haf. Adroddiad gwyddonol 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ac eraill. Newidiadau diweddar yn amlder, achosion a graddfa marwolaethau anifeiliaid. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Mae'n bosibl bod pathogenau lluosog nad ydynt yn benodol i rywogaethau wedi achosi marwolaethau torfol Pinna nobilis. Bywyd. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Effaith bosibl newid hinsawdd ar glefydau sonotig yr Arctig. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ac eraill. Cregyn gleision glas (Mytilus edulis spp.) fel organebau signal wrth fonitro llygredd arfordirol: adolygiad. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integreiddio biopsi hylif mewn triniaeth canser. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, ac eraill. Aeddfedu biopsi hylif: Yn caniatáu i DNA tiwmor gylchredeg. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asidau niwcleig mewn plasma dynol. Cofnodion cyfarfodydd is-gwmnïau Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rôl newydd i DNA di-gelloedd fel marcwr moleciwlaidd ar gyfer triniaeth canser. Mesur dadansoddiad biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi hylif yn mynd i mewn i'r clinig – materion gweithredu a heriau yn y dyfodol. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ac eraill. Mae DNA ffetws yn bresennol mewn plasma a serwm mamol. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Astudiaeth o gwrs beichiogrwydd a'i gymhlethdodau gan ddefnyddio RNA allgellog sy'n cylchredeg yng ngwaed menywod yn ystod beichiogrwydd. Dopediatreg. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, ac eraill. Biopsi hylif: defnyddir DNA di-gelloedd rhoddwr i ganfod briwiau allogeneig mewn impiad aren. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Arloesiadau mewn diagnosteg cynenedigol: dilyniannu genom plasma mamol. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, ac eraill. Canfod pathogenau'n gyflym gyda dilyniannu metagenomig y genhedlaeth nesaf o hylifau corfforol heintiedig. Nat Medicine. 2021;27:115-24.