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Kev kuaj kua (LB) yog ib lub tswv yim uas tau nrov sai sai hauv kev kho mob biomedical. Lub tswv yim no feem ntau yog raws li kev tshawb pom cov khoom ntawm cov DNA sab nraud (ccfDNA), uas feem ntau raug tso tawm ua cov khoom me me tom qab lub cell tuag hauv ntau cov nqaij. Ib feem me me ntawm cov khoom no yog los ntawm cov nqaij txawv teb chaws (txawv teb chaws) lossis cov kab mob. Hauv kev ua haujlwm tam sim no, peb tau siv lub tswv yim no rau cov mussels, ib hom tsiaj sentinel uas paub txog lawv lub peev xwm lim dej hiav txwv siab. Peb siv lub peev xwm ntawm cov mussels los ua cov lim dej ntuj los ntes cov khoom DNA ib puag ncig los ntawm ntau qhov chaw los muab cov ntaub ntawv hais txog kev muaj ntau haiv neeg ntawm cov ecosystem ntug dej hiav txwv. Peb cov txiaj ntsig qhia tau tias mussel hemolymph muaj cov khoom DNA uas sib txawv ntau heev, txij li 1 txog 5 kb. Shotgun sequencing qhia tau hais tias ntau cov khoom DNA yog los ntawm cov kab mob txawv teb chaws. Ntawm lawv, peb pom cov khoom DNA los ntawm cov kab mob, archaea, thiab cov kab mob, suav nrog cov kab mob uas paub tias kis tau rau ntau tus tswv tsev feem ntau pom hauv cov ecosystem ntug dej hiav txwv. Xaus lus, peb txoj kev tshawb fawb qhia tau hais tias lub tswv yim ntawm LB siv rau cov mussels yog ib qho chaw nplua nuj tab sis tseem tsis tau tshawb nrhiav txog kev sib txawv ntawm cov kab mob hauv cov ecosystem ntug dej hiav txwv.
Qhov cuam tshuam ntawm kev hloov pauv huab cua (CC) rau ntawm kev muaj ntau haiv neeg ntawm cov ecosystem hauv dej hiav txwv yog ib qho chaw tshawb fawb uas loj hlob sai. Kev sov ntawm lub ntiaj teb tsis yog tsuas yog ua rau muaj kev ntxhov siab tseem ceeb xwb, tab sis kuj thawb cov kev txwv ntawm kev hloov pauv ntawm kev ruaj khov ntawm cov tsiaj txhu hauv dej hiav txwv, cuam tshuam rau qhov chaw nyob ntawm ntau hom tsiaj, ua rau lawv nrhiav cov xwm txheej zoo dua [1, 2]. Ntxiv nrog rau kev cuam tshuam rau kev muaj ntau haiv neeg ntawm metazoans, CC cuam tshuam qhov sib npaug ntawm kev sib cuam tshuam ntawm tus tswv tsev-microbial. Qhov microbial dysbacteriosis no ua rau muaj kev hem thawj loj rau cov ecosystem hauv dej hiav txwv vim nws ua rau cov tsiaj txhu hauv dej hiav txwv muaj kev phom sij rau cov kab mob sib kis [3, 4]. Nws ntseeg tias SS ua lub luag haujlwm tseem ceeb hauv kev tuag coob, uas yog teeb meem loj rau kev tswj hwm cov ecosystem hauv dej hiav txwv thoob ntiaj teb [5, 6]. Qhov no yog ib qho teeb meem tseem ceeb uas muab cov kev cuam tshuam kev lag luam, ecological thiab kev noj haus ntawm ntau hom tsiaj hauv dej hiav txwv. Qhov no yog qhov tseeb tshwj xeeb rau cov bivalves nyob hauv thaj chaw polar, qhov twg cov teebmeem ntawm CK yog tam sim ntawd thiab hnyav dua [6, 7]. Qhov tseeb, bivalves xws li Mytilus spp. tau siv dav los saib xyuas cov teebmeem ntawm CC rau cov ecosystem hauv dej hiav txwv. Tsis yog qhov xav tsis thoob, muaj ntau tus biomarkers tau tsim los saib xyuas lawv txoj kev noj qab haus huv, feem ntau siv ob txoj hauv kev uas muaj cov biomarkers ua haujlwm raws li kev ua haujlwm enzymatic lossis kev ua haujlwm ntawm tes xws li lub hlwb muaj sia nyob thiab phagocytic kev ua haujlwm [8]. Cov txheej txheem no kuj suav nrog kev ntsuas qhov concentration ntawm cov ntsuas siab tshwj xeeb uas sib sau ua ke hauv cov ntaub so ntswg mos tom qab nqus dej hiav txwv ntau. Txawm li cas los xij, lub peev xwm lim dej siab thiab semi-qhib circulatory system ntawm bivalves muab lub sijhawm los tsim cov hemolymph biomarkers tshiab siv lub tswv yim ntawm kua biopsy (LB), ib txoj hauv kev yooj yim thiab tsawg kawg nkaus rau kev tswj hwm tus neeg mob. cov qauv ntshav [9, 10]. Txawm hais tias ntau hom circulating molecules tuaj yeem pom hauv tib neeg LB, lub tswv yim no feem ntau yog raws li DNA sequencing kev tshuaj xyuas ntawm circulating extracellular DNA (ccfDNA) fragments hauv plasma. Qhov tseeb, qhov muaj DNA circulating hauv tib neeg plasma tau paub txij li nruab nrab-20th xyoo pua [11], tab sis nws tsuas yog nyob rau hauv xyoo tas los no uas qhov kev tshwm sim ntawm cov txheej txheem high-throughput sequencing tau ua rau kev kuaj mob raws li ccfDNA. Qhov muaj cov DNA fragments no yog vim muaj kev tso tawm ntawm genomic DNA (nuclear thiab mitochondrial) tom qab cell tuag. Hauv cov tib neeg noj qab nyob zoo, qhov concentration ntawm ccfDNA feem ntau yog qis (<10 ng/mL) tab sis tuaj yeem nce ntxiv 5–10 npaug rau cov neeg mob uas raug kev txom nyem los ntawm ntau yam kab mob lossis raug kev ntxhov siab, ua rau cov nqaij puas tsuaj. Hauv cov tib neeg noj qab nyob zoo, qhov concentration ntawm ccfDNA feem ntau yog qis (<10 ng/mL) tab sis tuaj yeem nce ntxiv 5–10 npaug rau cov neeg mob uas raug kev txom nyem los ntawm ntau yam kab mob lossis raug kev ntxhov siab, ua rau cov nqaij puas tsuaj. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 рсльре у завичет патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hauv cov neeg noj qab nyob zoo, qhov concentration ntawm cccDNA feem ntau yog qis (<10 ng/mL), tab sis nws tuaj yeem nce ntxiv 5–10 npaug rau cov neeg mob uas muaj ntau yam kab mob lossis muaj kev ntxhov siab uas ua rau cov nqaij puas tsuaj.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患倅5倍, 从而导致组织损伤.在健康 个体中 ， ccfdna 的 浓度较 低 （（<10 ng/ml） 但在各种 病理 或 承受 压力 患5-10 倍 ， 从而组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раиз у различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Feem ntau cov ccfDNA concentration qis (<10 ng/ml) rau cov tib neeg noj qab nyob zoo, tab sis tuaj yeem nce 5-10 npaug rau cov neeg mob uas muaj ntau yam kab mob lossis kev ntxhov siab, ua rau cov nqaij puas tsuaj.Qhov loj ntawm cov ccfDNA fragments sib txawv ntau, tab sis feem ntau yog txij li 150 txog 200 bp. [12]. Kev tshuaj xyuas ntawm ccfDNA uas tau los ntawm tus kheej, piv txwv li, ccfDNA los ntawm cov hlwb ib txwm lossis hloov pauv, tuaj yeem siv los ntes cov kev hloov pauv caj ces thiab epigenetic uas muaj nyob rau hauv lub nucleus thiab/lossis mitochondrial genome, yog li pab cov kws kho mob xaiv cov kev kho mob tshwj xeeb molecular-targeted [13]. Txawm li cas los xij, ccfDNA tuaj yeem tau txais los ntawm cov chaw txawv teb chaws xws li ccfDNA los ntawm cov hlwb fetal thaum cev xeeb tub lossis los ntawm cov noob hloov pauv [14,15,16,17]. ccfDNA kuj yog ib qho chaw tseem ceeb ntawm cov ntaub ntawv rau kev ntes qhov muaj cov nucleic acids ntawm tus kab mob sib kis (txawv teb chaws), uas tso cai rau kev ntes tsis muaj kev cuam tshuam ntawm cov kab mob dav dav uas tsis tau txheeb xyuas los ntawm cov kab mob ntshav, zam kev kuaj mob ntawm cov ntaub so ntswg kis kab mob [18]. Cov kev tshawb fawb tsis ntev los no tau qhia tias cov ntshav tib neeg muaj cov ntaub ntawv nplua nuj uas tuaj yeem siv los txheeb xyuas cov kab mob viral thiab bacterial, thiab tias kwv yees li 1% ntawm ccfDNA pom hauv cov ntshav tib neeg yog los ntawm txawv teb chaws [19]. Cov kev tshawb fawb no qhia tau hais tias qhov kev muaj ntau haiv neeg ntawm cov kab mob me me uas ncig mus los ntawm cov kab mob me me tuaj yeem soj ntsuam siv kev tshuaj xyuas ccfDNA. Txawm li cas los xij, txog thaum tsis ntev los no, lub tswv yim no tsuas yog siv rau tib neeg thiab, rau qhov tsawg dua, rau lwm cov tsiaj txhu [20, 21].
Hauv daim ntawv tam sim no, peb siv lub peev xwm LB los tshuaj xyuas ccfDNA ntawm Aulacomya atra, ib hom tsiaj nyob rau sab qab teb uas feem ntau pom nyob rau hauv subantarctic Kerguelen Islands, ib pawg ntawm cov kob nyob rau saum toj ntawm lub tiaj tiaj loj uas tsim 35 lab xyoo dhau los. volcanic eruption. Siv ib qho kev sim hauv vitro, peb pom tias cov DNA fragments hauv dej hiav txwv raug coj los ntawm cov mussels sai sai thiab nkag mus rau hauv hemolymph compartment. Shotgun sequencing tau qhia tias mussel hemolymph ccfDNA muaj cov DNA fragments ntawm nws tus kheej thiab tsis yog nws tus kheej keeb kwm, suav nrog cov kab mob symbiotic thiab cov DNA fragments los ntawm biomes feem ntau ntawm cov volcanic txias marine coastal ecosystems. Hemolymph ccfDNA kuj tseem muaj cov kab mob viral sequences los ntawm cov kab mob nrog ntau yam host ranges. Peb kuj pom cov DNA fragments los ntawm cov tsiaj multicellular xws li bony ntses, hiav txwv anemones, algae thiab kab. Hauv kev xaus, peb txoj kev tshawb fawb qhia tau hais tias lub tswv yim LB tuaj yeem siv tau zoo rau marine invertebrates los tsim kom muaj cov genomic repertoire nplua nuj hauv marine ecosystems.
Cov ntses loj (ntev 55-70 hli) Mytilus platensis (M. platensis) thiab Aulacomya atra (A. atra) tau sau los ntawm ntug dej hiav txwv intertidal ntawm Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.). Kerguelen Islands thaum Lub Kaum Ob Hlis 2018. Lwm cov ntses xiav loj (Mytilus spp.) tau txais los ntawm tus neeg muag khoom lag luam (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) thiab muab tso rau hauv lub tank tswj qhov kub thiab txias (4 ° C) uas muaj 10-20 L ntawm 32 ‰ brine dag. (ntsev hiav txwv dag Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Rau txhua qhov kev sim, qhov ntev thiab qhov hnyav ntawm cov plhaub ib leeg tau ntsuas.
Ib qho kev cai nkag mus qhib dawb rau qhov kev pab cuam no muaj nyob hauv online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Hauv luv luv, LB hemolymph tau sau los ntawm cov leeg nqaij abductor raws li tau piav qhia [22]. Lub hemolymph tau ua kom pom tseeb los ntawm centrifugation ntawm 1200 × g rau 3 feeb, lub supernatant tau khov (-20 ° C) kom txog thaum siv. Rau kev cais thiab kev ntxuav ntawm cfDNA, cov qauv (1.5-2.0 ml) tau yaj thiab ua tiav siv NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) raws li cov lus qhia ntawm cov chaw tsim khoom. ccfDNA tau khaws cia ntawm -80 ° C kom txog thaum tshuaj xyuas ntxiv. Hauv qee qhov kev sim, ccfDNA tau cais thiab ntxuav siv QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Cov DNA huv tau ntsuas siv tus qauv PicoGreen assay. Qhov kev faib tawm ntawm cov ccfDNA cais tawm tau raug tshuaj xyuas los ntawm capillary electrophoresis siv Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) siv High Sensitivity DNA Kit. Qhov kev ntsuam xyuas tau ua tiav siv 1 µl ntawm cov qauv ccfDNA raws li cov lus qhia ntawm cov chaw tsim khoom.
Rau kev txheeb xyuas cov hemolymph ccfDNA fragments, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) tau npaj cov tsev qiv ntawv shotgun siv Illumina DNA Mix kit ntawm Illumina MiSeq PE75 kit. Ib qho adapter txheem (BioO) tau siv. Cov ntaub ntawv raw muaj los ntawm NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 thiab SRR8924809). Kev nyeem ntawv yooj yim tau soj ntsuam siv FastQC [23]. Trimmomatic [24] tau siv rau kev txiav cov adapters thiab kev nyeem tsis zoo. Kev nyeem phom nrog cov khub kawg tau FLASH sib koom ua ke rau hauv kev nyeem ntev dua nrog qhov sib tshooj tsawg kawg ntawm 20 bp kom tsis txhob muaj qhov tsis sib xws [25]. Cov kev nyeem sib koom ua ke tau sau tseg nrog BLASTN siv lub hauv paus ntaub ntawv bivalve NCBI Taxonomy (e tus nqi <1e−3 thiab 90% homology), thiab kev npog cov kab ke tsis tshua muaj kev nyuaj tau ua tiav siv DUST [26]. Cov kev nyeem sib koom ua ke tau sau tseg nrog BLASTN siv lub hauv paus ntaub ntawv bivalve NCBI Taxonomy (e tus nqi <1e−3 thiab 90% homology), thiab kev npog cov kab ke tsis tshua muaj kev nyuaj tau ua tiav siv DUST [26]. Объединенные чтения были анннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуслтвор двуслтвор (значение e <1e-3 thiab 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпольнеспам [26]. Cov kev nyeem ua ke tau sau tseg nrog BLASTN siv lub NCBI bivalve taxonomy database (e value < 1e-3 thiab 90% homology), thiab kev ua kom tsis muaj teeb meem tsawg tau ua tiav siv DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库 (e 值< 1e-3 和90% 同源性) 用BLASTN 注释合并的读数，并使进行低复杂度序列的掩蔽.使用双 壳类 ncbi 分类（（<1e-3和 90%同源）用用用注释 合并读数，幨俽6用复杂度序列的。。。。掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были анннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннных всус NCBI (значение e <1e-3 thiab 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпосьностей низкой сложности было выпосьненне [26]. Cov kev nyeem ua ke tau sau tseg nrog BLASTN siv lub NCBI bivalve taxonomic database (e tus nqi <1e-3 thiab 90% homology), thiab kev ua kom tsis muaj teeb meem tsawg tau ua tiav siv DUST [26].Cov kev nyeem tau muab faib ua ob pawg: cuam tshuam nrog cov kab ke bivalve (ntawm no hu ua kev nyeem tus kheej) thiab tsis muaj feem cuam tshuam (tsis yog kev nyeem tus kheej). Ob pawg tau sib sau ua ke siv MEGAHIT los tsim cov contigs [27]. Lub caij no, kev faib tawm ntawm cov ntawv nyeem microbiome txawv teb chaws tau muab faib ua pawg siv Kraken2 [28] thiab sawv cev los ntawm daim duab kos duab Krona ntawm Galaxy [29, 30]. Cov kmers zoo tshaj plaws tau txiav txim siab tias yog kmers-59 los ntawm peb cov kev sim ua ntej. Cov kev sib txuas ntawm tus kheej tau raug txheeb xyuas los ntawm kev sib phim nrog BLASTN (bivalve NCBI database, e tus nqi <1e−10 thiab 60% homology) rau qhov kev piav qhia zaum kawg. Cov kev sib txuas ntawm tus kheej tau raug txheeb xyuas los ntawm kev sib phim nrog BLASTN (bivalve NCBI database, e tus nqi <1e−10 thiab 60% homology) rau qhov kev piav qhia zaum kawg. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двусытвосчата двусытворчата значение e <1e-10 thiab гомология 60%) для окончательной аннотации. Cov kev sib txuas ntawm tus kheej tau raug txheeb xyuas los ntawm kev sib phim nrog BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 thiab 60% homology) rau kev sau ntawv kawg.然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值 < 1e-10 和60%同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值 < 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной анннотации путем сопоста вления NBI с для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 thiab гомология 60%). Cov kev sib txuas ntawm tus kheej tau raug txheeb xyuas rau qhov kev piav qhia zaum kawg los ntawm kev sib phim nrog BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 thiab 60% homology). Nyob rau tib lub sijhawm, cov pab pawg tsis yog tus kheej tau sau tseg nrog BLASTN (nt NCBI database, e tus nqi <1e−10 thiab 60% homology). Nyob rau tib lub sijhawm, cov pab pawg tsis yog tus kheej tau sau tseg nrog BLASTN (nt NCBI database, e tus nqi <1e−10 thiab 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, зна <чиояни-1гом месяца назад) 60%). Nyob rau tib lub sijhawm, cov pab pawg txawv teb chaws tau sau tseg nrog BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 thiab 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (базачни ntазенны) <1e-10 thiab гомология 60%). Nyob rau tib lub sijhawm, cov pawg tsis yog tus kheej tau sau tseg nrog BLASTN (nt NCBI database, e tus nqi <1e-10 thiab 60% homology). BLASTX kuj tau ua rau ntawm cov nonself contigs siv cov nr thiab RefSeq protein NCBI databases (e tus nqi < 1e−10 thiab 60% homology). BLASTX kuj tau ua rau ntawm cov nonself contigs siv cov nr thiab RefSeq protein NCBI databases (e tus nqi < 1e−10 thiab 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значинием 1 60%). BLASTX kuj tau ua tiav rau ntawm cov contig uas tsis yog tus kheej siv cov ntaub ntawv nr thiab RefSeq NCBI protein (e tus nqi < 1e-10 thiab 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 倧源).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 倧源). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значиние-1 eмом 60%). BLASTX kuj tau ua tiav rau ntawm cov contig uas tsis yog tus kheej siv cov ntaub ntawv nr thiab RefSeq NCBI protein (e tus nqi <1e-10 thiab 60% homology).Cov pas dej BLASTN thiab BLASTX ntawm cov tsis sib txuas ua ke sawv cev rau cov sib txuas kawg (saib cov ntaub ntawv ntxiv).
Cov primers siv rau PCR tau teev nyob rau hauv Rooj S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) tau siv los ua kom cov noob ccfDNA loj dua. Cov xwm txheej hauv qab no tau siv: denaturation ntawm 95 ° C rau 3 feeb, 95 ° C rau 1 feeb, teeb tsa qhov kub thiab txias rau 1 feeb, elongation ntawm 72 ° C rau 1 feeb, 35 lub voj voog, thiab thaum kawg 72 ° C hauv 10 feeb. . Cov khoom PCR tau sib cais los ntawm electrophoresis hauv agarose gels (1.5%) uas muaj SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ntawm 95 V.
Cov ntses mussels (Mytilus spp.) tau raug hloov kho rau hauv 500 ml dej hiav txwv uas muaj oxygenated (32 PSU) rau 24 teev ntawm 4°C. Plasmid DNA uas muaj ib qho ntxig uas encoding tib neeg galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) tau ntxiv rau hauv lub vial ntawm qhov concentration kawg ntawm 190 μg/μl. Cov ntses mussels uas tau incubated nyob rau hauv tib qho xwm txheej yam tsis muaj DNA ntxiv yog cov tswj. Lub tank tswj thib peb muaj DNA tsis muaj ntses mussels. Txhawm rau saib xyuas qhov zoo ntawm DNA hauv dej hiav txwv, cov qauv dej hiav txwv (20 μl; peb rov ua dua) tau coj los ntawm txhua lub tank ntawm lub sijhawm qhia. Rau plasmid DNA traceability, LB mussels tau sau thaum lub sijhawm qhia thiab tshuaj xyuas los ntawm qPCR thiab ddPCR. Vim yog cov ntsev ntau ntawm dej hiav txwv, aliquots tau diluted hauv PCR dej zoo (1:10) ua ntej txhua qhov kev ntsuam xyuas PCR.
Kev ntsuas digital droplet PCR (ddPCR) tau ua tiav siv BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada). Siv qhov kub thiab txias los txiav txim siab qhov kub zoo tshaj plaws (Rooj S1). Cov tee dej tau tsim los ntawm kev siv lub tshuab tsim QX200 (BioRad). ddPCR tau ua raws li nram no: 95°C rau 5 feeb, 50 lub voj voog ntawm 95°C rau 30 vib nas this thiab qhov kub thiab txias annealing rau 1 feeb thiab 72°C rau 30 vib nas this, 4°C rau 5 feeb thiab 90°C hauv 5 feeb. Tus naj npawb ntawm cov tee dej thiab cov tshuaj tiv thaiv zoo (tus naj npawb ntawm cov ntawv theej/µl) tau ntsuas siv lub tshuab nyeem QX200 (BioRad). Cov qauv uas muaj tsawg dua 10,000 tee dej tau raug tsis lees txais. Kev tswj tus qauv tsis tau ua txhua zaus ddPCR tau khiav.
qPCR tau ua tiav siv Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) thiab LGALS7 cov primers tshwj xeeb. Tag nrho cov PCRs ntau tau ua tiav hauv 20 µl siv QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR tau pib nrog 15 feeb incubation ntawm 95°C ua raws li 40 lub voj voog ntawm 95°C rau 10 vib nas this thiab ntawm 60°C rau 60 vib nas this nrog ib qho kev sau cov ntaub ntawv. Cov kab melting tau tsim los ntawm kev siv kev ntsuas sib law liag ntawm 95°C rau 5 vib nas this, 65°C rau 60 vib nas this, thiab 97°C thaum kawg ntawm qPCR. Txhua qPCR tau ua tiav hauv triplicate, tshwj tsis yog cov qauv tswj.
Vim tias cov mussels paub txog lawv qhov kev lim dej siab, peb xub tshawb xyuas seb lawv puas tuaj yeem lim thiab khaws cov DNA fragments uas muaj nyob hauv dej hiav txwv. Peb kuj xav paub seb cov fragments no puas sib sau ua ke hauv lawv lub cev lymphatic semi-open. Peb tau daws qhov teeb meem no los ntawm kev sim los ntawm kev taug qab qhov hmoo ntawm cov DNA fragments soluble ntxiv rau cov thoob dej xiav mussel. Txhawm rau pab txhawb kev taug qab cov DNA fragments, peb tau siv cov neeg txawv teb chaws (tsis yog tus kheej) plasmid DNA uas muaj cov noob galectin-7 tib neeg. ddPCR taug qab cov plasmid DNA fragments hauv dej hiav txwv thiab mussels. Peb cov txiaj ntsig qhia tau tias yog tias qhov ntau ntawm cov DNA fragments hauv dej hiav txwv tseem nyob ruaj khov dhau sijhawm (txog li 7 hnub) thaum tsis muaj mussels, ces thaum muaj mussels qhov no yuav luag ploj mus tag hauv 8 teev (Daim duab 1a, b). Cov fragments ntawm exogenous DNA tau yooj yim pom hauv 15 feeb hauv cov kua dej intravalvular thiab hemolymph (Daim duab 1c). Cov fragments no tseem tuaj yeem pom txog li 4 teev tom qab raug. Qhov kev lim dej no nrog rau cov DNA fragments yog sib piv rau qhov kev lim dej ntawm cov kab mob thiab algae [31]. Cov txiaj ntsig no qhia tau tias cov mussels tuaj yeem lim thiab sau cov DNA txawv teb chaws hauv lawv cov kua dej.
Qhov sib piv ntawm cov plasmid DNA hauv dej hiav txwv thaum muaj (A) lossis tsis muaj (B) ntawm cov mussels, ntsuas los ntawm ddPCR. Hauv A, cov txiaj ntsig tau qhia ua feem pua, nrog rau cov ciam teb ntawm cov thawv sawv cev rau 75th thiab 25th feem pua. Cov kab logarithmic haum tau qhia ua xim liab, thiab thaj chaw ntxoov ntxoo hauv grey sawv cev rau 95% kev ntseeg siab. Hauv B, kab liab sawv cev rau qhov nruab nrab thiab kab xiav sawv cev rau 95% kev ntseeg siab rau qhov kev sib sau ua ke. C Kev sib sau ua ke ntawm plasmid DNA hauv cov ntshav hemolymph thiab cov kua dej ntawm cov mussels ntawm ntau lub sijhawm sib txawv tom qab ntxiv plasmid DNA. Cov txiaj ntsig tau nthuav tawm ua cov ntawv theej pom / mL (± SE).
Tom ntej no, peb tau tshawb nrhiav keeb kwm ntawm ccfDNA hauv cov ntses mussels uas tau sau los ntawm cov txaj ntses mussel ntawm Kerguelen Islands, ib pawg kob nyob deb uas muaj kev cuam tshuam tsawg ntawm tib neeg. Rau lub hom phiaj no, cccDNA los ntawm cov ntses mussel hemolymphs tau raug cais tawm thiab ntxuav los ntawm cov txheej txheem uas feem ntau siv los ntxuav tib neeg cccDNA [32, 33]. Peb pom tias qhov nruab nrab ntawm hemolymph ccfDNA concentration hauv cov ntses mussels yog nyob rau hauv qhov tsawg micrograms ib ml hemolymph ntau yam (saib Rooj S2, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Qhov ntau ntawm cov concentration no loj dua li cov neeg noj qab haus huv (qis nanograms ib milliliter), tab sis qee zaum, rau cov neeg mob qog noj ntshav, qib ntawm ccfDNA tuaj yeem ncav cuag ntau micrograms ib milliliter [34, 35]. Kev tshuaj xyuas ntawm qhov loj me ntawm hemolymph ccfDNA qhia tau hais tias cov khoom no sib txawv heev ntawm qhov loj me, xws li 1000 bp txog 1000 bp. txog li 5000 bp (Daim Duab 2). Cov txiaj ntsig zoo sib xws tau txais los ntawm kev siv cov khoom siv silica-based QIAamp Investigator Kit, ib txoj kev uas feem ntau siv hauv kev tshawb fawb txog kev ua txhaum cai kom sai thiab ntxuav cov DNA genomic los ntawm cov qauv DNA uas muaj cov concentration tsawg, suav nrog ccfDNA [36].
Tus sawv cev ccfDNA electrophoregram ntawm cov mussel hemolymph. Rho tawm nrog NucleoSnap Plasma Kit (sab saum toj) thiab QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin plot qhia txog kev faib tawm ntawm hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) hauv cov mussels. Cov kab dub thiab liab sawv cev rau median thiab thawj thiab thib peb quartiles, raws li.
Kwv yees li 1% ntawm ccfDNA hauv tib neeg thiab primates muaj qhov chaw txawv teb chaws [21, 37]. Muab lub cev semi-qhib circulatory ntawm bivalves, microbial-nplua nuj dej hiav txwv, thiab qhov loj me ntawm mussel ccfDNA, peb xav tias mussel hemolymph ccfDNA yuav muaj cov DNA microbial nplua nuj thiab ntau yam. Txhawm rau sim qhov kev xav no, peb tau ua cov kab ke hemolymph ccfDNA los ntawm Aulacomya atra cov qauv sau los ntawm Kerguelen Islands, ua rau muaj ntau dua 10 lab nyeem, 97.6% ntawm cov uas dhau qhov kev tswj hwm zoo. Cov kev nyeem ntawv tom qab ntawd tau muab faib ua pawg raws li tus kheej thiab tsis yog tus kheej siv cov ntaub ntawv BLASTN thiab NCBI bivalve (Daim duab S1, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv).
Hauv tib neeg, ob qho tib si nuclear thiab mitochondrial DNA tuaj yeem tso tawm rau hauv cov ntshav [38]. Txawm li cas los xij, hauv kev tshawb fawb tam sim no, nws tsis tuaj yeem piav qhia meej txog nuclear genomic DNA ntawm cov mussels, vim tias A. atra genome tsis tau raug txheeb xyuas lossis piav qhia. Txawm li cas los xij, peb tau txheeb xyuas ntau qhov ccfDNA fragments ntawm peb tus kheej keeb kwm siv lub tsev qiv ntawv bivalve (Daim Duab S2, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Peb kuj tau lees paub qhov muaj DNA fragments ntawm peb tus kheej keeb kwm los ntawm kev coj PCR amplification ntawm cov A. atra genes uas tau raug txheeb xyuas (Daim Duab 3). Ib yam li ntawd, vim tias mitochondrial genome ntawm A. atra muaj nyob rau hauv cov ntaub ntawv pej xeem, ib tus tuaj yeem nrhiav pov thawj rau qhov muaj mitochondrial ccfDNA fragments hauv hemolymph ntawm A. atra. Qhov muaj mitochondrial DNA fragments tau lees paub los ntawm PCR amplification (Daim Duab 3).
Muaj ntau hom noob caj noob ces mitochondrial nyob hauv cov hemolymph ntawm A. atra (cov dots liab - tus lej khoom: SRX5705969) thiab M. platensis (cov dots xiav - tus lej khoom: SRX5705968) uas tau nthuav dav los ntawm PCR. Daim duab hloov kho los ntawm Breton et al., 2011 B Kev nthuav dav ntawm cov hemolymph supernatant los ntawm A. atra Khaws cia rau ntawm daim ntawv FTA. Siv lub tshuab xuas 3 hli los ntxiv ncaj qha rau lub raj PCR uas muaj cov sib tov PCR.
Muab cov microbial ntau ntau hauv dej hiav txwv, peb thawj zaug tsom mus rau kev piav qhia txog cov kab mob DNA hauv hemolymph. Txhawm rau ua qhov no, peb siv ob txoj kev sib txawv. Txoj kev thawj zaug siv Kraken2, ib qho kev pab cuam algorithm-based sequence classification uas tuaj yeem txheeb xyuas cov kab mob microbial nrog qhov tseeb sib piv rau BLAST thiab lwm yam cuab yeej [28]. Ntau tshaj 6719 qhov kev nyeem tau txiav txim siab tias yog los ntawm cov kab mob, thaum 124 thiab 64 yog los ntawm archaea thiab cov kab mob, feem (Daim duab 4). Cov kab mob DNA feem ntau yog Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), thiab Bacteroidetes (17%) (Daim duab 4a). Qhov kev faib tawm no yog sib xws nrog cov kev tshawb fawb yav dhau los ntawm cov kab mob marine xiav mussel microbiome [39, 40]. Gammaproteobacteria yog cov chav kawm tseem ceeb ntawm Proteobacteria (44%), suav nrog ntau Vibrionales (Daim duab 4b). Txoj kev ddPCR tau lees paub qhov muaj cov khoom tawg ntawm Vibrio DNA hauv ccfDNA ntawm A. atra hemolymph (Daim duab 4c) [41]. Txhawm rau kom tau txais cov ntaub ntawv ntxiv txog keeb kwm ntawm cov kab mob ntawm ccfDNA, ib txoj hauv kev ntxiv tau raug coj mus (Daim duab S2, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Hauv qhov no, cov nyeem uas sib tshooj tau sib sau ua ke ua cov nyeem khub thiab tau muab faib ua tus kheej (bivalves) lossis tsis yog tus kheej keeb kwm siv BLASTN thiab tus nqi e ntawm 1e−3 thiab qhov txiav nrog >90% homology. Hauv qhov no, cov nyeem uas sib tshooj tau sib sau ua ke ua cov nyeem khub thiab tau muab faib ua tus kheej (bivalves) lossis tsis yog tus kheej keeb kwm siv BLASTN thiab tus nqi e ntawm 1e−3 thiab qhov txiav nrog >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифыцирова (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечиония %. Hauv qhov no, cov nyeem uas sib tshooj tau sau ua cov nyeem uas muaj khub thiab tau muab faib ua cov neeg ib txwm (bivalve) lossis tsis yog thawj siv BLASTN thiab e tus nqi ntawm 1e-3 thiab txiav nrog >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用的使用使用 blastn - 1e 和90% 同源性的分类 自身 (双壳类) 非 自身。 。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированты (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3га и прользованием значений e BLASTN и 1e-3га погроо Hauv qhov no, cov nyeem ntawv sib tshooj tau sau ua cov nyeem ntawv sib txuas thiab faib ua tus kheej (bivalves) lossis tsis yog thawj siv e BLASTN thiab 1e-3 tus nqi ​​thiab qhov sib xws ntawm qhov sib xws> 90%.Vim tias A. atra genome tseem tsis tau raug txheeb xyuas, peb tau siv txoj kev sib dhos de novo ntawm MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler. Tag nrho ntawm 147,188 contigs tau txheeb xyuas tias yog nyob ntawm (bivalves) ntawm keeb kwm. Cov contigs no tau tawg nrog e-tus nqi ntawm 1e-10 siv BLASTN thiab BLASTX. Txoj kev no tso cai rau peb txheeb xyuas 482 cov khoom tsis yog bivalve uas muaj nyob hauv A. atra ccfDNA. Ntau tshaj ib nrab (57%) ntawm cov khoom DNA no tau txais los ntawm cov kab mob, feem ntau yog los ntawm gill symbionts, suav nrog sulfotrophic symbionts, thiab los ntawm gill symbionts Solemya velum (Daim duab 5).
Qhov muaj ntau ntawm qib hom. B Kev sib txawv ntawm cov kab mob me me ntawm ob lub phyla tseem ceeb (Firmicutes thiab Proteobacteria). Kev nthuav dav ntawm ddPCR C Vibrio spp. A. Cov ntu ntawm 16S rRNA gene (xiav) hauv peb lub atra hemolymphs.
Tag nrho ntawm 482 cov contig uas tau sau los tau raug tshuaj xyuas. Cov ntaub ntawv dav dav ntawm kev faib tawm ntawm cov ntawv sau metagenomic contig (prokaryotes thiab eukaryotes). B Kev faib tawm kom ntxaws ntawm cov kab mob DNA fragments txheeb xyuas los ntawm BLASTN thiab BLASTX.
Kev tshuaj xyuas Kraken2 kuj qhia tau tias cov mussel ccfDNA muaj cov DNA archaeal fragments, suav nrog cov DNA fragments ntawm Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), thiab Thaurmarcheota (11%) (Daim duab 6a). Qhov muaj cov DNA fragments los ntawm Euryarchaeota thiab Crenarchaeota, uas yav dhau los pom hauv zej zog microbial ntawm Californian mussels, yuav tsum tsis txhob xav tsis thoob [42]. Txawm hais tias Euryarchaeota feem ntau cuam tshuam nrog cov xwm txheej hnyav, tam sim no nws tau lees paub tias ob qho tib si Euryarchaeota thiab Crenarcheota yog cov prokaryotes feem ntau hauv qhov chaw cryogenic marine [43, 44]. Qhov muaj cov kab mob methanogenic hauv cov mussels tsis yog qhov xav tsis thoob, muab cov ntawv ceeb toom tsis ntev los no ntawm kev xau methane ntau heev los ntawm kev xau hauv qab ntawm Kerguelen Plateau [45] thiab qhov ua tau microbial methane tsim tawm ntawm ntug dej hiav txwv ntawm Kerguelen Islands [46].
Tom qab ntawd peb tau hloov mus rau kev nyeem cov kab mob DNA. Raws li peb paub, qhov no yog thawj zaug kev tshawb fawb txog cov kab mob hauv cov mussels. Raws li xav tau, peb pom cov DNA fragments ntawm bacteriophages (Caudovirales) (Daim Duab 6b). Txawm li cas los xij, cov kab mob DNA feem ntau yog los ntawm ib hom kab mob ntawm nucleocytoviruses, tseem hu ua nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), uas muaj cov genome loj tshaj plaws ntawm txhua tus kab mob. Hauv hom kab mob no, feem ntau cov DNA sequences yog rau tsev neeg Mimimidoviridae (58%) thiab Poxviridae (21%), uas cov tsiaj txhu muaj xws li vertebrates thiab arthropods, thaum ib feem me me ntawm cov DNA sequences no yog rau cov virological algae paub. Kis rau cov algae eukaryotic marine. Cov sequences kuj tau txais los ntawm tus kab mob Pandora, tus kab mob loj heev nrog qhov loj tshaj plaws ntawm txhua hom kab mob paub. Qhov nthuav yog, qhov ntau ntawm cov tswv tsev uas paub tias muaj tus kab mob, raws li txiav txim siab los ntawm hemolymph ccfDNA sequencing, yog qhov loj heev (Daim Duab S3, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Nws suav nrog cov kab mob uas kis rau cov kab xws li Baculoviridae thiab Iridoviridae, nrog rau cov kab mob uas kis rau amoeba, algae thiab vertebrates. Peb kuj pom cov kab ke sib phim nrog Pithovirus sibericum genome. Pitoviruses (tseem hu ua "zombie viruses") tau raug rho tawm thawj zaug los ntawm 30,000 xyoo permafrost hauv Siberia [47]. Yog li, peb cov txiaj ntsig yog sib xws nrog cov ntawv ceeb toom yav dhau los qhia tias tsis yog txhua hom kab mob niaj hnub no ploj mus [48] thiab tias cov kab mob no yuav muaj nyob rau hauv cov ecosystems subarctic marine deb.
Thaum kawg, peb tau sim seb peb puas tuaj yeem nrhiav tau cov DNA fragments los ntawm lwm cov tsiaj multicellular. Tag nrho ntawm 482 qhov sib txawv teb chaws tau txheeb xyuas los ntawm BLASTN thiab BLASTX nrog nt, nr thiab RefSeq cov tsev qiv ntawv (genomic thiab protein). Peb cov txiaj ntsig qhia tau tias ntawm cov khoom txawv teb chaws ntawm ccfDNA ntawm cov tsiaj multicellular DNA ntawm cov pob txha bony predominates (Daim duab 5). Cov khoom DNA los ntawm kab thiab lwm hom tsiaj kuj tau pom. Ib feem loj ntawm cov khoom DNA tsis tau txheeb xyuas, tej zaum vim yog qhov tsis muaj ntau hom tsiaj hauv dej hauv cov ntaub ntawv genomic piv rau cov tsiaj hauv av [49].
Hauv tsab ntawv tam sim no, peb siv lub tswv yim LB rau cov mussels, sib cav tias hemolymph ccfDNA txhaj tshuaj sequencing tuaj yeem muab kev nkag siab rau hauv cov khoom sib xyaw ntawm cov ecosystem ntug dej hiav txwv. Tshwj xeeb, peb pom tias 1) mussel hemolymph muaj cov concentration siab (microgram theem) ntawm cov DNA fragments loj (~ 1-5 kb) circulating; 2) cov DNA fragments no yog ob qho tib si ywj pheej thiab tsis ywj pheej 3) Ntawm cov chaw txawv teb chaws ntawm cov DNA fragments no, peb pom cov kab mob bacterial, archaeal thiab viral DNA, nrog rau DNA ntawm lwm cov tsiaj multicellular; 4) Kev sib sau ua ke ntawm cov ccfDNA fragments txawv teb chaws no hauv hemolymph tshwm sim sai thiab pab txhawb rau kev lim dej sab hauv ntawm cov mussels. Xaus lus, peb txoj kev tshawb fawb qhia tau hais tias lub tswv yim ntawm LB, uas tau siv txog tam sim no feem ntau hauv thaj chaw ntawm biomedicine, encodes ib qho chaw nplua nuj tab sis tsis tau tshawb nrhiav ntawm kev paub uas tuaj yeem siv los nkag siab zoo dua txog kev sib cuam tshuam ntawm cov tsiaj sentinel thiab lawv ib puag ncig.
Ntxiv rau cov primates, ccfDNA kev rho tawm tau tshaj tawm hauv cov tsiaj txhu, suav nrog nas, dev, miv, thiab nees [50, 51, 52]. Txawm li cas los xij, raws li peb paub, peb txoj kev tshawb fawb yog thawj zaug tshaj tawm txog kev kuaj pom thiab kev txheeb xyuas ntawm ccfDNA hauv cov tsiaj hauv dej hiav txwv nrog lub kaw lus qhib. Qhov no anatomical feature thiab filtering peev xwm ntawm mussels tej zaum yuav, tsawg kawg yog ib feem, piav qhia txog qhov sib txawv ntawm cov DNA fragments circulating piv rau lwm hom. Hauv tib neeg, feem ntau DNA fragments circulating hauv cov ntshav yog me me fragments uas muaj qhov loj me ntawm 150 txog 200 bp. nrog lub ncov siab tshaj plaws ntawm 167 bp [34, 53]. Ib feem me me tab sis tseem ceeb ntawm DNA fragments yog ntawm 300 thiab 500 bp hauv qhov loj me, thiab txog 5% yog ntev dua 900 bp. [54]. Qhov laj thawj rau qhov kev faib tawm qhov loj me no yog tias qhov chaw tseem ceeb ntawm ccfDNA hauv plasma tshwm sim los ntawm kev tuag ntawm tes, vim yog kev tuag ntawm tes lossis vim necrosis ntawm cov hlwb hematopoietic hauv cov tib neeg noj qab haus huv lossis vim apoptosis ntawm cov hlwb qog hauv cov neeg mob qog noj ntshav (hu ua circulating tumor DNA). , ctDNA). Qhov kev faib tawm loj ntawm hemolymph ccfDNA uas peb pom hauv cov mussels yog txij li 1000 txog 5000 bp, qhia tias mussel ccfDNA muaj keeb kwm sib txawv. Qhov no yog ib qho kev xav, txij li thaum mussels muaj lub cev hlab ntsha semi-qhib thiab nyob hauv cov chaw nyob hauv dej hiav txwv uas muaj cov DNA genomic microbial ntau. Qhov tseeb, peb cov kev sim hauv chaw kuaj mob siv cov DNA sab nraud tau qhia tias cov mussels khaws cov DNA fragments hauv dej hiav txwv, tsawg kawg tom qab ob peb teev lawv raug rhuav tshem tom qab cellular uptake thiab / lossis tso tawm thiab / lossis khaws cia rau hauv ntau lub koom haum. Vim tias tsis tshua muaj cov cell (ob qho tib si prokaryotic thiab eukaryotic), kev siv cov compartments intravalvular yuav txo qhov ntau ntawm ccfDNA los ntawm cov chaw nws tus kheej thiab los ntawm cov chaw txawv teb chaws. Xav txog qhov tseem ceeb ntawm kev tiv thaiv kab mob bivalve thiab cov lej loj ntawm cov phagocytes uas ncig, peb ntxiv tias txawm tias cov ccfDNA txawv teb chaws muaj ntau ntxiv hauv cov phagocytes uas ncig uas sau cov DNA txawv teb chaws thaum noj cov kab mob me me thiab / lossis cov khib nyiab cellular. Thaum muab ua ke, peb cov txiaj ntsig qhia tau tias bivalve hemolymph ccfDNA yog lub chaw khaws cov ntaub ntawv molecular tshwj xeeb thiab txhawb nqa lawv txoj cai ua hom tsiaj sentinel.
Peb cov ntaub ntawv qhia tau hais tias kev txheeb xyuas thiab kev tshuaj xyuas cov kab mob hemolymph ccfDNA fragments tuaj yeem muab cov ntaub ntawv tseem ceeb txog cov kab mob bacterial flora thiab cov kab mob uas muaj nyob hauv cov ecosystem marine ib puag ncig. Cov txheej txheem txhaj tshuaj sequencing tau qhia txog cov kab mob commensal bacteria A. atra gill uas yuav tsis tau pom yog tias cov txheej txheem txheeb xyuas 16S rRNA ib txwm muaj tau siv, vim yog ib feem ntawm kev siv lub tsev qiv ntawv. Qhov tseeb, peb siv cov ntaub ntawv LB sau los ntawm M. platensis hauv tib txheej mussel ntawm Kerguelen qhia tau hais tias cov khoom sib xyaw ntawm cov kab mob gill-associated bacterial symbionts yog tib yam rau ob hom mussel (Daim duab S4, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Qhov zoo sib xws ntawm ob lub mussels sib txawv ntawm cov noob caj noob ces yuav cuam tshuam txog cov khoom sib xyaw ntawm cov zej zog bacterial hauv qhov txias, sulfurous, thiab volcanic deposits ntawm Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Cov kab mob sulfur-txo cov kab mob ntau dua tau piav qhia zoo thaum sau cov mussels los ntawm thaj chaw ntug dej hiav txwv bioturbated [59], xws li ntug dej hiav txwv ntawm Port-au-France. Lwm qhov ua tau yog tias cov kab mob mussel flora yuav raug cuam tshuam los ntawm kev sib kis kab rov tav [60, 61]. Xav tau kev tshawb fawb ntxiv los txiav txim siab qhov sib raug zoo ntawm ib puag ncig hauv dej hiav txwv, qhov chaw hauv qab dej hiav txwv, thiab cov kab mob symbiotic hauv cov mussels. Cov kev tshawb fawb no tam sim no tab tom ua.
Qhov ntev thiab qhov concentration ntawm hemolymph ccfDNA, nws yooj yim ntawm kev ntxuav, thiab zoo kom tso cai rau kev ua kom sai sai ntawm cov phom tua kab yog qee qhov zoo ntawm kev siv mussel ccfDNA los ntsuas qhov muaj ntau haiv neeg hauv cov ecosystem ntug dej hiav txwv. Txoj hauv kev no tshwj xeeb tshaj yog rau kev piav qhia txog cov zej zog viral (viromes) hauv ib qho ecosystem [62, 63]. Tsis zoo li cov kab mob, archaea, thiab eukaryotes, cov genomes viral tsis muaj cov noob phylogenetically conserved xws li 16S sequences. Peb cov txiaj ntsig qhia tau hais tias cov kua biopsies los ntawm cov cim qhia xws li mussels tuaj yeem siv los txheeb xyuas cov lej loj ntawm cov kab mob ccfDNA uas paub tias kis tus tswv tsev uas feem ntau nyob hauv cov ecosystem ntug dej hiav txwv. Qhov no suav nrog cov kab mob uas paub tias kis tus kab mob protozoa, arthropods, kab, nroj tsuag, thiab cov kab mob bacterial (piv txwv li, bacteriophages). Ib qho kev faib tawm zoo sib xws tau pom thaum peb tshuaj xyuas hemolymph ccfDNA virome ntawm cov mussels xiav (M. platensis) sau rau hauv tib txheej mussel ntawm Kerguelen (Rooj S2, Cov Ntaub Ntawv Ntxiv). Kev tshuaj xyuas cov kab mob ccfDNA yog ib txoj hauv kev tshiab uas tau txais kev txhawb nqa hauv kev kawm txog tus kab mob ntawm tib neeg lossis lwm hom tsiaj [21, 37, 64]. Txoj hauv kev no yog qhov tshwj xeeb tshaj yog rau kev kawm txog cov kab mob DNA ob txoj hlua, vim tias tsis muaj ib lub noob caj noob ces khaws cia ntawm txhua tus kab mob DNA ob txoj hlua, uas sawv cev rau ntau haiv neeg thiab dav tshaj plaws ntawm cov kab mob hauv Baltimore [65]. Txawm hais tias feem ntau ntawm cov kab mob no tseem tsis tau cais tawm thiab tej zaum yuav suav nrog cov kab mob los ntawm ib feem tsis paub ntawm lub ntiaj teb kab mob [66], peb pom tias cov viromes thiab cov tswv tsev ntawm cov mussels A. atra thiab M. platensis poob ntawm ob hom tsiaj. zoo sib xws (saib daim duab S3, cov ntaub ntawv ntxiv). Qhov kev zoo sib xws no tsis yog qhov xav tsis thoob, vim nws yuav qhia txog qhov tsis muaj kev xaiv hauv kev nqus DNA uas muaj nyob hauv ib puag ncig. Kev tshawb fawb yav tom ntej siv RNA ntshiab tam sim no xav tau los piav qhia txog RNA virome.
Hauv peb txoj kev tshawb fawb, peb tau siv cov kav dej uas nruj heev uas tau hloov kho los ntawm Kowarski thiab cov npoj yaig [37] txoj haujlwm, uas tau siv ob kauj ruam rho tawm ntawm cov ntawv nyeem ua ke thiab cov ntawv sib txuas ua ntej thiab tom qab sib sau ua ke ntawm ccfDNA hauv zos, ua rau muaj ntau cov ntawv nyeem tsis tau kos duab. Yog li ntawd, peb tsis tuaj yeem txiav txim siab tias qee qhov ntawm cov ntawv nyeem tsis tau kos duab no tseem yuav muaj lawv keeb kwm, feem ntau vim peb tsis muaj lub genome siv rau hom kab mob mussel no. Peb kuj tau siv cov kav dej no vim peb txhawj xeeb txog chimeras ntawm kev nyeem tus kheej thiab tsis yog tus kheej thiab qhov ntev nyeem uas tsim los ntawm Illumina MiSeq PE75. Lwm qhov laj thawj rau feem ntau ntawm kev nyeem tsis tau kos duab yog tias ntau ntawm cov kab mob hauv hiav txwv, tshwj xeeb tshaj yog nyob rau thaj chaw deb xws li Kerguelen, tsis tau muaj lus piav qhia. Peb tau siv Illumina MiSeq PE75, xav tias ccfDNA qhov ntev zoo ib yam li tib neeg ccfDNA. Rau kev tshawb fawb yav tom ntej, muab peb cov txiaj ntsig qhia tias hemolymph ccfDNA muaj cov nyeem ntev dua li tib neeg thiab / lossis tsiaj txhu, peb pom zoo kom siv lub platform sequencing uas tsim nyog dua rau cov ccfDNA fragments ntev dua. Kev xyaum no yuav ua rau nws yooj yim dua los txheeb xyuas ntau cov cim qhia rau kev tshuaj xyuas tob dua. Kev tau txais cov kab ke genome A. atra nuclear uas tsis muaj tam sim no kuj tseem yuav pab txhawb kev sib cais ntawm ccfDNA los ntawm tus kheej thiab tsis yog tus kheej. Muab hais tias peb txoj kev tshawb fawb tau tsom mus rau qhov ua tau ntawm kev siv lub tswv yim ntawm kev kuaj kua rau cov mussels, peb vam tias thaum lub tswv yim no siv rau hauv kev tshawb fawb yav tom ntej, cov cuab yeej tshiab thiab cov kav dej yuav raug tsim los ua kom muaj peev xwm ntawm txoj kev no los kawm txog ntau haiv neeg ntawm cov mussels.
Raws li ib qho biomarker kho mob uas tsis yog kev phais, cov neeg plasma theem siab ntawm ccfDNA yog txuam nrog ntau yam kab mob, kev puas tsuaj ntawm cov nqaij, thiab cov mob ntxhov siab [67,68,69]. Qhov kev nce no yog txuam nrog kev tso tawm ntawm cov DNA fragments ntawm nws tus kheej keeb kwm tom qab kev puas tsuaj ntawm cov nqaij. Peb tau daws qhov teeb meem no siv kev ntxhov siab kub heev, uas cov mussels tau raug rau qhov kub ntawm 30 ° C luv luv. Peb tau ua qhov kev tshuaj xyuas no ntawm peb hom mussels sib txawv hauv peb qhov kev sim ywj pheej. Txawm li cas los xij, peb tsis pom muaj kev hloov pauv hauv cov theem ccfDNA tom qab kev ntxhov siab kub heev (saib Daim Duab S5, cov ntaub ntawv ntxiv). Qhov kev tshawb pom no yuav piav qhia, tsawg kawg yog ib feem, qhov tseeb tias cov mussels muaj lub cev circulatory semi-open thiab sau ntau cov DNA txawv teb chaws vim lawv cov dej num lim dej siab. Ntawm qhov tod tes, cov mussels, zoo li ntau yam invertebrates, tej zaum yuav tiv taus kev ntxhov siab ua rau cov nqaij puas tsuaj, yog li txwv tsis pub tso tawm ntawm ccfDNA hauv lawv cov hemolymph [70, 71].
Txog niaj hnub no, kev tshuaj xyuas DNA ntawm ntau haiv neeg hauv cov ecosystems hauv dej tau tsom mus rau qhov kev tshuaj xyuas DNA ib puag ncig (eDNA) metabarcoding. Txawm li cas los xij, txoj kev no feem ntau raug txwv hauv kev tshuaj xyuas ntau haiv neeg thaum siv cov primers. Kev siv shotgun sequencing hla cov kev txwv ntawm PCR thiab kev xaiv tsis ncaj ncees ntawm cov primer teeb tsa. Yog li, hauv ib qho kev nkag siab, peb txoj kev yog ze rau txoj kev siv high-throughput eDNA Shotgun sequencing tshiab, uas muaj peev xwm ncaj qha sequencing fragmented DNA thiab tshuaj xyuas yuav luag txhua yam kab mob [72, 73]. Txawm li cas los xij, muaj ntau qhov teeb meem tseem ceeb uas sib txawv LB los ntawm cov txheej txheem eDNA txheem. Tau kawg, qhov sib txawv tseem ceeb ntawm eDNA thiab LB yog kev siv cov lim dej ntuj. Kev siv cov tsiaj hauv dej xws li sponges thiab bivalves (Dresseina spp.) ua lub lim dej ntuj rau kev kawm eDNA tau tshaj tawm [74, 75]. Txawm li cas los xij, Dreissena txoj kev tshawb fawb siv cov ntaub so ntswg biopsies uas DNA tau rho tawm. Kev tshuaj xyuas ccfDNA los ntawm LB tsis tas yuav tsum tau kuaj cov ntaub so ntswg, cov khoom siv tshwj xeeb thiab qee zaum kim thiab cov khoom siv logistics cuam tshuam nrog eDNA lossis cov ntaub so ntswg biopsy. Qhov tseeb, peb nyuam qhuav tshaj tawm tias ccfDNA los ntawm LB tuaj yeem khaws cia thiab tshuaj xyuas nrog FTA kev txhawb nqa yam tsis muaj kev tswj hwm cov saw hlau txias, uas yog qhov kev sib tw loj rau kev tshawb fawb hauv thaj chaw deb [76]. Kev rho tawm ntawm ccfDNA los ntawm cov kua biopsies kuj yooj yim thiab muab cov DNA zoo rau kev tshuaj xyuas shotgun sequencing thiab PCR kev tshuaj xyuas. Qhov no yog qhov zoo heev muab qee qhov kev txwv kev siv tshuab cuam tshuam nrog kev tshuaj xyuas eDNA [77]. Qhov yooj yim thiab tus nqi qis ntawm txoj kev kuaj kuj tseem tsim nyog rau cov kev pab cuam saib xyuas mus sij hawm ntev. Ntxiv nrog rau lawv lub peev xwm lim dej siab, lwm qhov paub zoo ntawm bivalves yog cov tshuaj mucopolysaccharide muaj pes tsawg leeg ntawm lawv cov hnoos qeev, uas txhawb nqa kev nqus ntawm cov kab mob [78, 79]. Qhov no ua rau bivalves yog lub lim dej zoo tagnrho rau kev piav qhia txog kev muaj ntau haiv neeg thiab kev cuam tshuam ntawm kev hloov pauv huab cua hauv ib qho ecosystem hauv dej. Txawm hais tias qhov muaj cov DNA fragments uas tau los ntawm tus tswv tsev tuaj yeem pom tias yog qhov txwv ntawm txoj kev piv rau eDNA, tus nqi cuam tshuam nrog kev muaj ccfDNA ib txwm muaj piv rau eDNA yog tib lub sijhawm nkag siab rau ntau cov ntaub ntawv muaj rau kev tshawb fawb txog kev noj qab haus huv. offset host. Qhov no suav nrog qhov muaj cov kab mob viral sib xyaw ua ke rau hauv genome ntawm tus tswv tsev. Qhov no tseem ceeb heev rau cov mussels, muab qhov muaj cov kab mob leukemic retroviruses kis tau kab rov tav hauv bivalves [80, 81]. Lwm qhov zoo ntawm LB dhau eDNA yog tias nws siv cov haujlwm phagocytic ntawm cov qe ntshav hauv cov hemolymph, uas engulfs microorganisms (thiab lawv cov genomes). Phagocytosis yog lub luag haujlwm tseem ceeb ntawm cov qe ntshav hauv bivalves [82]. Thaum kawg, txoj kev siv qhov zoo ntawm lub peev xwm lim dej siab ntawm cov mussels (qhov nruab nrab 1.5 l / h ntawm dej hiav txwv) thiab ob hnub ncig, uas ua rau muaj kev sib xyaw ntawm cov txheej sib txawv ntawm dej hiav txwv, tso cai rau kev ntes cov heterologous eDNA. [83, 84]. Yog li, kev tshuaj xyuas ccfDNA ntawm cov ntses mussel yog ib txoj hauv kev nthuav vim muaj kev cuam tshuam rau kev noj haus, kev lag luam, thiab ib puag ncig ntawm cov ntses mussels. Ib yam li kev tshuaj xyuas LB uas tau sau los ntawm tib neeg, txoj kev no kuj qhib qhov ua tau los ntsuas kev hloov pauv caj ces thiab epigenetic hauv tus tswv tsev DNA los teb rau cov tshuaj sab nraud. Piv txwv li, cov thev naus laus zis sequencing tiam thib peb tuaj yeem xav txog los ua qhov kev tshuaj xyuas methylation thoob plaws genome hauv ccfDNA haiv neeg siv nanopore sequencing. Cov txheej txheem no yuav tsum tau pab txhawb los ntawm qhov tseeb tias qhov ntev ntawm cov ntses mussel ccfDNA fragments yog qhov sib xws zoo tshaj plaws nrog cov platform sequencing ntev uas tso cai rau kev tshuaj xyuas DNA methylation thoob plaws genome los ntawm ib qho kev khiav sequencing yam tsis tas yuav hloov pauv tshuaj.85,86] Qhov no yog qhov ua tau nthuav, vim nws tau pom tias cov qauv DNA methylation qhia txog kev teb rau kev ntxhov siab ib puag ncig thiab nyob ntev dua ntau tiam neeg. Yog li ntawd, nws tuaj yeem muab kev nkag siab zoo rau hauv cov txheej txheem hauv qab tswj hwm kev teb tom qab raug kev hloov pauv huab cua lossis cov pa phem [87]. Txawm li cas los xij, kev siv LB tsis yog tsis muaj kev txwv. Tsis tas yuav hais, qhov no yuav tsum muaj cov hom tsiaj qhia nyob rau hauv lub ecosystem. Raws li tau hais los saum toj no, siv LB los ntsuas qhov muaj ntau haiv neeg ntawm ib lub ecosystem kuj xav tau ib txoj kab ke bioinformatics uas coj mus rau hauv tus account qhov muaj DNA fragments los ntawm qhov chaw. Lwm qhov teeb meem loj yog qhov muaj cov genomes siv rau cov tsiaj hauv dej hiav txwv. Nws tau cia siab tias cov kev pib xws li Marine Mammal Genomes Project thiab Fish10k project uas nyuam qhuav tsim [88] yuav pab txhawb kev tshuaj xyuas zoo li no yav tom ntej. Kev siv lub tswv yim LB rau cov tsiaj lim dej hauv dej hiav txwv kuj sib xws nrog cov kev nce qib tshiab hauv kev siv tshuab sequencing, ua rau nws zoo rau kev tsim cov cim biomarkers ntau-ohm los muab cov ntaub ntawv tseem ceeb txog kev noj qab haus huv ntawm cov chaw nyob hauv dej hiav txwv teb rau kev ntxhov siab ib puag ncig.
Cov ntaub ntawv genome sequencing tau muab tso rau hauv NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 hauv Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Kev cuam tshuam ntawm kev hloov pauv huab cua rau cov tsiaj txhu hauv dej hiav txwv thiab cov ecosystem. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, thiab lwm yam. Xav txog cov kev cuam tshuam ua ke ntawm kev hloov pauv huab cua thiab lwm yam kev ntxhov siab hauv zos rau ib puag ncig hauv dej hiav txwv. ib puag ncig kev tshawb fawb dav dav. 2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, thiab al. ). Science ntawm thawj lub Peb Hlis. Xyoo 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kev txo qis kev ua siab ntev thaum muaj cua sov ntau zaus piav qhia txog kev tuag ntau ntawm cov ntses xiav thaum lub caij ntuj sov. Daim ntawv tshaj tawm txog kev tshawb fawb xyoo 2019; 9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, thiab lwm tus. Cov kev hloov pauv tsis ntev los no hauv qhov zaus, ua rau thiab qhov dav ntawm kev tuag ntawm tsiaj. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Ntau yam tsis yog hom kab mob tshwj xeeb tej zaum yuav ua rau muaj neeg tuag coob ntawm Pinna nobilis. Lub neej. Xyoo 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Tej zaum yuav muaj kev cuam tshuam ntawm kev hloov pauv huab cua rau cov kab mob zoonotic Arctic. Int J Circumpolar kev noj qab haus huv. 2005; 64: 468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Cov ntses xiav (Mytilus edulis spp.) ua cov kab mob cim hauv kev saib xyuas kev ua qias tuaj ntawm ntug dej hiav txwv: kev tshuaj xyuas. Mar Environ Res 2017; 130: 338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Kev koom ua ke ntawm cov kua biopsy hauv kev kho mob qog noj ntshav. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Kev loj hlob ntawm cov kua biopsy: Tso cai rau cov DNA ntawm qog kom ncig tau. Nat Rev Cancer. 2017; 17: 223–38.
Mandel P., Metais P. Cov kua qaub nucleic hauv cov ntshav tib neeg. Cov ntaub ntawv sib tham ntawm Soc Biol cov tuam txhab me. 1948; 142: 241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Lub luag haujlwm tshiab rau DNA tsis muaj cell ua lub cim molecular rau kev kho mob qog noj ntshav. Kev ntsuas ntawm kev tshuaj xyuas biomolar. 2019; 17: 100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Kev kuaj ntshav kua nkag mus rau hauv tsev kho mob - cov teeb meem kev siv thiab cov teeb meem yav tom ntej. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18: 297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW thiab lwm tus. Cov DNA ntawm tus menyuam hauv plab muaj nyob rau hauv cov ntshav thiab cov ntshav ntawm niam. Lancet. 1997; 350: 485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Kev kawm txog kev xeeb tub thiab nws cov teeb meem siv cov RNA sab nraud hauv cov ntshav ntawm cov poj niam thaum cev xeeb tub. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, thiab lwm tus. Kev kuaj kua: DNA uas tsis muaj hlwb pub dawb yog siv los nrhiav cov qhov txhab allogeneic hauv kev cog raum. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Kev Tsim Kho Tshiab hauv kev kuaj mob ua ntej yug menyuam: kev txheeb xyuas cov noob caj noob ces ntawm niam. Anna MD. 2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, thiab lwm yam. Kev nrhiav pom kab mob sai nrog kev txheeb xyuas metagenomic tiam tom ntej ntawm cov kua dej hauv lub cev uas muaj kab mob. Nat Medicine. 2021; 27: 115-24.