Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Vökvasýnataka (e. liquid biopsy (LB)) er hugtak sem er ört að verða vinsælla í lífeðlisfræði. Hugtakið byggist aðallega á því að greina brot af utanfrumu DNA í blóðrás (ccfDNA), sem losna aðallega sem smáir brot eftir frumudauða í ýmsum vefjum. Lítill hluti þessara brota á uppruna sinn í erlendum vefjum eða lífverum. Í núverandi vinnu höfum við beitt þessu hugtaki á krækling, varðtegund sem er þekkt fyrir mikla síunargetu sjávar. Við notum hæfileika kræklinga til að virka sem náttúruleg síur til að fanga umhverfis-DNA brot úr ýmsum áttum til að veita upplýsingar um líffræðilegan fjölbreytileika vistkerfa við ströndina. Niðurstöður okkar sýna að blóðvökvi kræklinga inniheldur DNA brot sem eru mjög mismunandi að stærð, frá 1 til 5 kb. Röðun með haglabyssu sýndi að fjöldi DNA brota eru af erlendum örverufræðilegum uppruna. Meðal þeirra fundum við DNA brot úr bakteríum, fornbakteríum og veirum, þar á meðal veirum sem vitað er að sýkja ýmsa hýsla sem almennt finnast í vistkerfum við ströndina. Að lokum sýnir rannsókn okkar fram á að hugtakið LB, notað um krækling, er rík en enn ókönnuð þekkingarbrunnur um örverufjölbreytni í vistkerfum sjávar við ströndir.
Áhrif loftslagsbreytinga á líffræðilegan fjölbreytileika vistkerfa sjávar eru ört vaxandi rannsóknarsvið. Hnattræn hlýnun veldur ekki aðeins mikilvægu lífeðlisfræðilegu álagi heldur ýtir einnig á þróunarmörk hitastöðugleika sjávarlífvera, sem hefur áhrif á búsvæði fjölda tegunda og hvetur þær til að leita að hagstæðari skilyrðum [1, 2]. Auk þess að hafa áhrif á líffræðilegan fjölbreytileika frumdýra raskar loftslagsbreytingar viðkvæmu jafnvægi milli hýsils og örvera. Þessi örverufræðilega sjúkdómsvaldandi bakteríusýking er alvarleg ógn við vistkerfi sjávar þar sem hún gerir sjávarlífverur viðkvæmari fyrir smitandi sjúkdómsvöldum [3, 4]. Talið er að SS gegni mikilvægu hlutverki í fjöldadauða, sem er alvarlegt vandamál fyrir stjórnun alþjóðlegra vistkerfa sjávar [5, 6]. Þetta er mikilvægt mál miðað við efnahagsleg, vistfræðileg og næringarfræðileg áhrif margra sjávartegunda. Þetta á sérstaklega við um skeljur sem lifa á pólsvæðunum, þar sem áhrif loftslagsbreytinga eru tafarlausari og alvarlegri [6, 7]. Reyndar eru skeljur eins og Mytilus spp. mikið notaðar til að fylgjast með áhrifum loftslagsbreytinga á vistkerfi sjávar. Ekki kemur á óvart að tiltölulega fjöldi lífmerkja hefur verið þróaður til að fylgjast með heilsu þeirra, oft með tvíþættri aðferð sem felur í sér virkni lífmerkja sem byggja á ensímvirkni eða frumustarfsemi eins og frumulífvænleika og átfrumuvirkni [8]. Þessar aðferðir fela einnig í sér mælingu á styrk sértækra þrýstingsvísa sem safnast fyrir í mjúkvefjum eftir frásog mikils magns af sjó. Hins vegar býður mikil síunargeta og hálfopið blóðrásarkerfi skelfiska upp á tækifæri til að þróa nýja blóðeitrunarlífmerki með því að nota hugmyndina um vökvasýni (LB), einfalda og lágmarksífarandi aðferð við meðhöndlun sjúklinga í blóðsýnum [9, 10]. Þó að nokkrar gerðir af blóðrásarsameindum finnist í blóðsýnum manna, byggist þetta hugtak fyrst og fremst á DNA-raðgreiningu á utanfrumu DNA (ccfDNA) brotum í plasma. Reyndar hefur verið vitað um tilvist DNA í plasma manna frá miðri 20. öld [11], en það er ekki fyrr en á undanförnum árum að tilkoma háafköstar raðgreiningaraðferða hefur leitt til klínískrar greiningar byggðrar á ccfDNA. Tilvist þessara DNA-brota í blóðrásinni er að hluta til vegna óvirkrar losunar erfðaefnis (kjarna- og hvatbera-DNA) eftir frumudauða. Hjá heilbrigðum einstaklingum er styrkur ccfDNA venjulega lágur (<10 ng/ml) en getur aukist 5–10 sinnum hjá sjúklingum sem þjást af ýmsum sjúkdómum eða verða fyrir streitu, sem leiðir til vefjaskemmda. Hjá heilbrigðum einstaklingum er styrkur ccfDNA venjulega lágur (<10 ng/ml) en getur aukist 5–10 sinnum hjá sjúklingum sem þjást af ýmsum sjúkdómum eða verða fyrir streitu, sem leiðir til vefjaskemmda. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 сразуся патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hjá heilbrigðu fólki er styrkur cccDNA venjulega lágur (<10 ng/ml), en hann getur aukist 5–10 sinnum hjá sjúklingum með ýmsa sjúkdóma eða undir álagi sem leiðir til vefjaskemmda.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 旅理 刏 扊理 刖 扊中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 мл. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Styrkur ccfDNA er venjulega lágur (<10 ng/ml) hjá heilbrigðum einstaklingum en getur aukist 5-10 falt hjá sjúklingum með ýmsa sjúkdóma eða streitu, sem leiðir til vefjaskemmda.Stærð ccfDNA-brota er mjög breytileg en er yfirleitt á bilinu 150 til 200 bp. [12]. Greining á sjálffengnu ccfDNA, þ.e. ccfDNA úr eðlilegum eða umbreyttum hýsilfrumum, getur verið notuð til að greina erfðafræðilegar og erfðafræðilegar breytingar í kjarna- og/eða hvatberaerfðamengi, og þannig hjálpað læknum að velja sértækar sameindamiðaðar meðferðir [13]. Hins vegar er hægt að fá ccfDNA úr erlendum uppruna eins og ccfDNA úr fósturfrumum á meðgöngu eða úr ígræddum líffærum [14,15,16,17]. ccfDNA er einnig mikilvæg upplýsingagjafi til að greina kjarnsýrur sýkla (erlendis), sem gerir kleift að greina útbreiddar sýkingar sem ekki eru greindar með blóðræktun án ífarandi aðferða, og forðast ífarandi vefjasýni úr sýktum vef [18]. Nýlegar rannsóknir hafa reyndar sýnt að mannsblóð inniheldur ríka upplýsingagjafa sem hægt er að nota til að greina veiru- og bakteríusýkingar, og að um 1% af ccfDNA sem finnst í plasma manna er af erlendum uppruna [19]. Þessar rannsóknir sýna fram á að hægt er að meta líffræðilegan fjölbreytileika örveruflóru lífveru með ccfDNA greiningu. Hins vegar var þetta hugtak, þar til nýlega, eingöngu notað hjá mönnum og í minna mæli hjá öðrum hryggdýrum [20, 21].
Í þessari grein notum við LB möguleika til að greina ccfDNA Aulacomya atra, suðlægrar tegundar sem finnst almennt á Kerguelen-eyjum undir Suðurskautslandinu, eyjahópi efst á stóru hásléttu sem myndaðist fyrir 35 milljónum ára. Með því að nota in vitro tilraunakerfi komumst við að því að kræklingur tekur fljótt upp DNA-brot í sjó og fer inn í blóðvökvahólfið. Röðun með haglabyssu hefur sýnt að ccfDNA kræklinga í blóðvökva inniheldur DNA-brot af eigin og öðrum uppruna, þar á meðal samlífisbakteríur og DNA-brot úr vistkerfum sem eru dæmigerð fyrir köld eldvirk vistkerfi við ströndina. CcfDNA blóðvökva inniheldur einnig veiruraðir sem eru fengnar úr veirum með mismunandi hýsilssvið. Við fundum einnig DNA-brot úr fjölfrumudýrum eins og beinfiskum, sjóanemónum, þörungum og skordýrum. Að lokum sýnir rannsókn okkar að LB hugtakið er hægt að beita með góðum árangri á hryggleysingja í sjó til að búa til ríkt erfðaefni í vistkerfum sjávar.
Fullorðnar kræklingar (55-70 mm langar) af gerðinni Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) voru safnað á grýttum ströndum Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 A.) á Kerguelen-eyjum í desember 2018. Aðrar fullorðnar blákræklingar (Mytilus spp.) voru fengnar frá birgja (PEI Mussel King Inc., Prince Edward-eyju, Kanada) og settar í hitastýrðan (4°C) loftræstan tank sem innihélt 10–20 lítra af 32‰ tilbúnum pækli (tilbúnu sjávarsalti Reef Crystal, Instant Ocean, Virginíu, Bandaríkjunum). Fyrir hverja tilraun var lengd og þyngd einstakra skelja mæld.
Ókeypis aðgangsleiðbeiningar fyrir þetta forrit eru aðgengilegar á netinu (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Í stuttu máli var LB blóðvöðva safnað úr fráfærsluvöðvum eins og lýst er [22]. Blóðvöðvinn var hreinsaður með skilvindu við 1200×g í 3 mínútur, ofanfljótandi vökvinn var frystur (-20°C) þar til hann var notaður. Til einangrunar og hreinsunar á cfDNA voru sýni (1,5-2,0 ml) þiðin og unnin með NucleoSnap cfDNA búnaðinum (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. ccfDNA var geymt við -80°C þar til frekari greining fór fram. Í sumum tilraunum var ccfDNA einangrað og hreinsað með QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Hreinsað DNA var magngreint með stöðluðu PicoGreen prófi. Dreifing brota á einangruðu ccfDNA var greind með háræðarafdrætti með Agilent 2100 lífgreiningartæki (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kaliforníu) sem notaði High Sensitivity DNA Kit. Prófunin var framkvæmd með 1 µl af ccfDNA sýninu samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Til að raðgreina ccfDNA-brot úr blóðeitrum útbjó Genome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) haglabyssusöfn með því að nota Illumina DNA Mix búnaðinn úr Illumina MiSeq PE75 búnaðinum. Staðlað millistykki (BioO) var notað. Óunnar gagnaskrár eru fáanlegar í NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809). Grunngæði lestrar voru metin með FastQC [23]. Trimmomatic [24] hefur verið notað fyrir klippingarmillistykki og lestrar af lélegum gæðum. Haglabyssulest með pöruðum endum voru FLASH-sameinuð í lengri stakar lestrar með lágmarks 20 bp skörun til að forðast ósamræmi [25]. Sameinuðum lestrum var merkt með BLASTN með því að nota NCBI flokkunargagnagrunn fyrir tvílokur (e gildi < 1e−3 og 90% samsvörun) og gríma lágflækjustigaröðir voru framkvæmdar með DUST [26]. Sameinuðum lestrum var merkt með BLASTN með því að nota NCBI flokkunargagnagrunn fyrir tvílokur (e gildi < 1e−3 og 90% samsvörun) og gríma lágflækjustigaröðir voru framkvæmdar með DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорча (síða e < 1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельогии á [26полнель с ис. Sameinuðum lestrum var lýst með BLASTN með því að nota NCBI samlokuflokkunargagnagrunninn (e gildi < 1e-3 og 90% samsvörun) og lágflækjustigsröðgrímun var framkvæmd með DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿繕，2]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 6￨st 2.进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двункор (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельогии á [26] с. Sameinuðum lestrum var lýst með BLASTN með því að nota flokkunargagnagrunn NCBI fyrir tvílokur (e gildi <1e-3 og 90% samsvörun) og lágflækjustigsröðunargrímun var framkvæmd með DUST [26].Lestrin voru skipt í tvo hópa: tengda tvílokuröðum (hér kallaðar sjálfslestrar) og ótengda (ekki sjálfslestrar). Tveir hópar voru settir saman sérstaklega með MEGAHIT til að búa til samfelldar gerðir [27]. Á sama tíma var flokkunarfræðileg dreifing lestrar framandi örveruflóru flokkuð með Kraken2 [28] og grafískt táknuð með Krona skífuriti á Galaxy [29, 30]. Besti kmerinn var ákvarðaður sem kmer-59 út frá fortilraunum okkar. Sjálfstengdar frumur voru síðan greindar með samstillingu við BLASTN (tvískelja NCBI gagnagrunnur, e gildi < 1e−10 og 60% einsleitni) fyrir lokaúttekt. Sjálfstengdar frumur voru síðan greindar með samstillingu við BLASTN (tvískelja NCBI gagnagrunnur, e gildi < 1e−10 og 60% einsleitni) fyrir lokaúttekt. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлых, скечен мент <1e-10 и гомология 60%) fyrir окончательной аннотации. Sjálfstengdar frumur voru síðan greindar með pörun við BLASTN (NCBI samlokugagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% einsleitni) fyrir lokaúttekt.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (fyrir BINC) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Sjálfstengdir einingar voru síðan greindir til lokaútskýringar með pörun við BLASTN (NCBI samlokugagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% einsleitni). Samhliða voru samliggjandi hópar sem ekki eru sjálfir merktir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi < 1e−10 og 60% samsvörun). Samhliða voru samliggjandi hópar sem ekki eru sjálfir merktir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi < 1e−10 og 60% samsvörun). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (á dögum NCBI, 1. september 10. september 60%). Samhliða voru erlendir hópsamfellingar merktar með BLASTN (NT NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% samsvörun).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныNC) <1e-10 и гомология 60%). Samhliða voru samliggjandi hópar sem ekki voru sjálfir merktir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% samsvörun). BLASTX var einnig framkvæmt á sjálfstæðum samliggjandi próteinum með því að nota nr og RefSeq prótein NCBI gagnagrunnana (e gildi < 1e−10 og 60% samsvörun). BLASTX var einnig framkvæmt á sjálfstæðum samliggjandi próteinum með því að nota nr og RefSeq prótein NCBI gagnagrunnana (e gildi < 1e−10 og 60% samsvörun). BLASTX hefur ekki aðgang að neyðartilvikum ásamt því að nota neyðarnúmer og RefSeq NCBI (f.d. 1.-0. гомология 60%). BLASTX var einnig framkvæmt á ekki-sjálfstæðum samfelldum próteinum með því að nota nr og RefSeq NCBI próteingagnagrunnana (e gildi < 1e-10 og 60% einsleitni).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 怉 吺 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 怉 吺 吺 吺 BLASTX hjálpar til við neyðarviðskipti ásamt því að nota neyðarnúmer og RefSeq NCBI (fánar <1e-1) гомология 60%). BLASTX var einnig framkvæmt á ekki-sjálfstæðum samfelldum próteinum með því að nota nr og RefSeq NCBI próteingagnagrunnana (e gildi <1e-10 og 60% einsleitni).BLASTN og BLASTX hóparnir af ósjálfstæðum samfelldum einingar tákna lokasamfellurnar (sjá viðbótarskrá).
Þeir praimerar sem notaðir voru fyrir PCR eru taldir upp í töflu S1. Taq DNA pólýmerasi (Bio Basic Canada, Markham, Ontario) var notaður til að magna ccfDNA markgenin. Eftirfarandi hvarfskilyrði voru notuð: denaturering við 95°C í 3 mínútur, 95°C í 1 mínútu, stillt glæðingarhitastig í 1 mínútu, lenging við 72°C í 1 mínútu, 35 lotur og að lokum 72°C innan 10 mínútna. PCR afurðirnar voru aðskildar með rafdrætti í agarósa gelum (1,5%) sem innihéldu SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, Ontario, Kanada) við 95 V.
Kræklingar (Mytilus spp.) voru aðlagaðir í 500 ml af súrefnisríku sjó (32 PSU) í 24 klukkustundir við 4°C. Plasmíð-DNA sem innihélt innskot sem kóðar fyrir galectin-7 cDNA röð manna (NCBI aðgangsnúmer L07769) var bætt í flöskuna í lokaþéttni 190 μg/μl. Kræklingar sem voru ræktaðir við sömu aðstæður án DNA-viðbótar voru samanburðartankurinn. Þriðji samanburðartankurinn innihélt DNA án kræklinga. Til að fylgjast með gæðum DNA í sjó voru sjósýni (20 μl; þrjár endurtekningar) tekin úr hverjum tanki á tilgreindum tíma. Til að rekja plasmíð-DNA voru LB-kræklingar tíndir á tilgreindum tímum og greindir með qPCR og ddPCR. Vegna mikils saltinnihalds sjávar voru skammtar þynntir í vatni af PCR-gæðum (1:10) fyrir allar PCR prófanir.
Stafræn dropa-PCR (ddPCR) var framkvæmd með BioRad QX200 samskiptareglunni (Mississauga, Ontario, Kanada). Notið hitastigsferilinn til að ákvarða kjörhitastig (Tafla S1). Dropar voru búnir til með QX200 dropagjafa (BioRad). ddPCR var framkvæmd á eftirfarandi hátt: 95°C í 5 mínútur, 50 lotur af 95°C í 30 sekúndur og gefið glæðingarhitastig í 1 mínútu og 72°C í 30 sekúndur, 4°C í 5 mínútur og 90°C innan 5 mínútna. Fjöldi dropa og jákvæð viðbrögð (fjöldi afrita/µl) voru mæld með QX200 dropalesara (BioRad). Sýni með færri en 10.000 dropum voru hafnað. Mynsturstýring var ekki framkvæmd í hvert skipti sem ddPCR var keyrt.
QPCR var framkvæmd með Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ástralíu) og LGALS7 sértækum praimerum. Allar megindlegar PCR prófanir voru framkvæmdar í 20 µl með QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). QPCR hófst með 15 mínútna ræktun við 95°C og síðan 40 lotum við 95°C í 10 sekúndur og við 60°C í 60 sekúndur með einni gagnasöfnun. Bræðslukúrfur voru búnar til með því að nota endurteknar mælingar við 95°C í 5 sekúndur, 65°C í 60 sekúndur og 97°C í lok qPCR. Hver qPCR var framkvæmd í þríriti, nema fyrir samanburðarsýni.
Þar sem kræklingur er þekktur fyrir mikinn síunarhraða, könnuðum við fyrst hvort hann gæti síað og haldið í DNA-brotum sem eru til staðar í sjó. Við höfðum einnig áhuga á því hvort þessir brot safnast fyrir í hálfopnu eitlakerfi þeirra. Við leystum þetta vandamál tilraunakennt með því að rekja örlög leysanlegra DNA-brota sem sett voru í blákræklingatanka. Til að auðvelda rakningu DNA-brota notuðum við framandi (ekki sjálfs-) plasmíð DNA sem innihélt galectin-7 genið úr mönnum. ddPCR rekur plasmíð DNA-brot í sjó og kræklingi. Niðurstöður okkar sýna að ef magn DNA-brota í sjó hélst tiltölulega stöðugt með tímanum (allt að 7 daga) í fjarveru kræklinga, þá hvarf þetta magn næstum alveg innan 8 klukkustunda í návist kræklinga (Mynd 1a, b). Brot af utanaðkomandi DNA greindust auðveldlega innan 15 mínútna í lokuvökva og blóðeitla (Mynd 1c). Þessi brot var samt hægt að greina allt að 4 klukkustundum eftir útsetningu. Þessi síunarvirkni gagnvart DNA-brotum er sambærileg við síunarvirkni baktería og þörunga [31]. Þessar niðurstöður benda til þess að kræklingur geti síað og safnað framandi DNA í vökvahólfum sínum.
Hlutfallslegur styrkur plasmíð DNA í sjó í návist (A) eða fjarveru (B) kræklinga, mælt með ddPCR. Í A eru niðurstöðurnar gefnar upp sem prósentur, þar sem jaðar kassanna tákna 75. og 25. hundraðshlutann. Aðlagaða lógaritmíska ferillinn er sýndur með rauðu og svæðið skyggt með gráu táknar 95% öryggisbil. Í B táknar rauða línan meðaltalið og bláa línan táknar 95% öryggisbil fyrir styrkinn. C Uppsöfnun plasmíð DNA í blóðvökva og lokuvökva kræklinga á mismunandi tímum eftir að plasmíð DNA var bætt við. Niðurstöður eru kynntar sem algild eintök greind/ml (±SE).
Næst rannsökuðum við uppruna ccfDNA í kræklingi sem safnað var úr kræklingabeðum á Kerguelen-eyjum, afskekktum eyjahópi með takmörkuð áhrif af mannavöldum. Í þessu skyni var cccDNA úr blóðvökvum kræklinga einangrað og hreinsað með aðferðum sem almennt eru notaðar til að hreinsa cccDNA manna [32, 33]. Við komumst að því að meðalþéttni ccfDNA í blóðvökva í kræklingi er á bilinu lágt míkrógrömm á ml af blóðvökva (sjá töflu S2, viðbótarupplýsingar). Þetta styrkbil er mun stærra en hjá heilbrigðu fólki (lágt magn nanógrömm á millilítra), en í sjaldgæfum tilfellum, hjá krabbameinssjúklingum, getur magn ccfDNA náð nokkrum míkrógrömm á millilítra [34, 35]. Greining á stærðardreifingu ccfDNA úr blóðvökva sýndi að þessir brot eru mjög mismunandi að stærð, allt frá 1000 bp til 1000 bp og allt upp í 5000 bp (Mynd 2). Svipaðar niðurstöður fengust með því að nota kísil-byggða QIAamp Investigator Kit, aðferð sem er algeng í réttarlæknisfræði til að einangra og hreinsa erfðaefni hratt úr lágþéttni DNA-sýnum, þar á meðal ccfDNA [36].
Dæmigert ccfDNA rafgreiningarmynd af blóðvökva kræklinga. Útdráttur gerður með NucleoSnap Plasma Kit (efst) og QIAamp DNA Investigator Kit. B Fiðlumynd sem sýnir dreifingu styrks ccfDNA í blóðvökva (±SE) í kræklingi. Svörtu og rauðu línurnar tákna miðgildi og fyrsta og þriðja fjórðung, talið í sömu röð.
Um það bil 1% af ccfDNA í mönnum og prímötum á sér erlendan uppruna [21, 37]. Miðað við hálfopið blóðrásarkerfi skelfiska, örveruríkt sjávarvatn og stærðardreifingu ccfDNA kræklinga, settum við fram þá tilgátu að ccfDNA úr kræklingahemólymphu gæti innihaldið ríkan og fjölbreyttan safn af örveru DNA. Til að prófa þessa tilgátu raðgreindum við ccfDNA úr hemólymphu úr sýnum úr Aulacomya atra sem safnað var frá Kerguelen-eyjum, sem gaf yfir 10 milljón mælingar, þar af stóðust 97,6% gæðaeftirlit. Mælingarnar voru síðan flokkaðar eftir eigin og ekki-sjálfsuppsprettum með því að nota BLASTN og NCBI gagnagrunna skelfiska (Mynd S1, Viðbótarupplýsingar).
Í mönnum geta bæði kjarna- og hvatbera-DNA losnað út í blóðrásina [38]. Í þessari rannsókn var þó ekki hægt að lýsa kjarnaerfðaefni kræklinga í smáatriðum, þar sem erfðamengi A. atra hefur ekki verið raðgreint eða lýst. Hins vegar gátum við borið kennsl á fjölda ccfDNA-brota af okkar eigin uppruna með því að nota samlokubókasafnið (Mynd S2, Viðbótarupplýsingar). Við staðfestum einnig tilvist DNA-brota af okkar eigin uppruna með beinni PCR-magnun á þeim A. atra-genum sem voru raðgreind (Mynd 3). Á sama hátt, þar sem hvatbera-erfðamengi A. atra er aðgengilegt í opinberum gagnagrunnum, er hægt að finna vísbendingar um tilvist hvatbera-ccfDNA-brota í blóðvökva A. atra. Tilvist hvatbera-DNA-brota var staðfest með PCR-magnun (Mynd 3).
Ýmis hvatberagen voru til staðar í blóðvökva A. atra (rauðir punktar – birgðanúmer: SRX5705969) og M. platensis (bláir punktar – birgðanúmer: SRX5705968) magnað með PCR. Mynd aðlöguð frá Breton o.fl., 2011 B Mögun á blóðvökvayfirborði úr A. atra. Geymt á FTA pappír. Notið 3 mm gat til að bæta beint í PCR rörið sem inniheldur PCR blönduna.
Í ljósi mikils örveruinnihalds í sjó einbeittum við okkur upphaflega að greiningu á örveruröðum DNA í blóðvökva. Til að gera þetta notum við tvær mismunandi aðferðir. Fyrsta aðferðin notaði Kraken2, reiknirit-byggða raðflokkunarforrit sem getur greint örveruröð með nákvæmni sem er sambærileg við BLAST og önnur verkfæri [28]. Meira en 6719 lestur reyndist vera af bakteríuuppruna, en 124 og 64 voru frá fornbakteríum og vírusum, talið í sömu röð (Mynd 4). Algengustu DNA-brotin úr bakteríum voru Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) og Bacteroidetes (17%) (Mynd 4a). Þessi dreifing er í samræmi við fyrri rannsóknir á örveruflóru sjávarblákræklinga [39, 40]. Gammaproteobacteria voru aðalflokkur Proteobacteria (44%), þar á meðal margir Vibrionales (Mynd 4b). ddPCR aðferðin staðfesti tilvist Vibrio DNA-brota í ccfDNA úr A. atra blóðeitrinu (Mynd 4c) [41]. Til að fá frekari upplýsingar um bakteríuuppruna ccfDNA var notuð önnur aðferð (Mynd S2, Viðbótarupplýsingar). Í þessu tilviki voru lestur sem skarast settur saman sem pöruð endalestur og flokkaður sem sjálfsuppruni (tvískeljur) eða ekki-sjálfsuppruna með því að nota BLASTN og e gildi 1e⁻⁶ og viðmiðunarmörk með >90% samsvörun. Í þessu tilviki voru lestur sem skarast settur saman sem pöruð endalestur og flokkaður sem sjálfsuppruni (tvískeljur) eða ekki-sjálfsuppruna með því að nota BLASTN og e gildi 1e⁻⁶ og viðmiðunarmörk með >90% samsvörun. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были класиксиов (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения> 0%. Í þessu tilviki voru skörunarmælingar safnaðar sem pöruð-endaðar mælingar og flokkaðar sem innfæddar (tvískelja) eða ekki-upprunalegar með því að nota BLASTN og e gildi 1e-3 og viðmiðunarmörk með >90% samsvörun.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和叠3 皒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使焨 使焚 的 的 的 的 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 eða 9%. Í þessu tilviki voru skörunarmælingar safnaðar sem pöruð-endaðar mælingar og flokkaðar sem eigin (tvískeljur) eða ekki-upprunalegar með því að nota e BLASTN og 1e-3 gildi og samsvörunarþröskuld >90%.Þar sem erfðamengi A. atra hefur ekki enn verið raðgreint, notuðum við de novo samsetningaraðferð MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) samsetningarforritsins. Alls hafa 147.188 samliggjandi frumur verið greindar sem háðar (tvískeljur) uppruna. Þessar samliggjandi frumur voru síðan sundurliðaðar með e-gildum 1e-10 með því að nota BLASTN og BLASTX. Þessi aðferð gerði okkur kleift að bera kennsl á 482 brot sem ekki eru tvíkeljur og eru til staðar í ccfDNA A. atra. Meira en helmingur (57%) þessara DNA-brota voru fengnir úr bakteríum, aðallega frá tálknasamherjum, þar á meðal súlfótrófum samhjálpardýrum, og frá tálknasamherjunum Solemya velum (Mynd 5).
Hlutfallsleg gnægð á gerðarstigi. B Örverufjölbreytni tveggja meginþyrpinga (Firmicutes og Proteobacteria). Dæmigert mögnun á ddPCR C Vibrio spp. A. Brot af 16S rRNA geninu (blátt) í þremur gáttatréhemólímfum.
Alls voru 482 safnaðar samfelldar einingar greindar. Almennt yfirlit yfir flokkunarfræðilega dreifingu erfðamengisgreininga (dreifkjörnungar og heilkjörnungar). B Ítarleg dreifing DNA-brota frá bakteríum sem greind voru með BLASTN og BLASTX.
Kraken2 greining sýndi einnig að ccfDNA kræklinga innihélt fornleifa DNA brot, þar á meðal DNA brot úr Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) og Thaurmarcheota (11%) (Mynd 6a). Tilvist DNA brotna sem eru unnin úr Euryarchaeota og Crenarchaeota, sem áður fundust í örverusamfélagi kalifornískra kræklinga, ætti ekki að koma á óvart [42]. Þótt Euryarchaeota sé oft tengd við öfgakenndar aðstæður er nú viðurkennt að bæði Euryarchaeota og Crenarcheota eru meðal algengustu dreifkjörnunga í sjávarfrystingu [43, 44]. Tilvist metanmyndandi örvera í kræklingi kemur ekki á óvart, miðað við nýlegar skýrslur um umfangsmikla metanleka frá botnlekum á Kerguelen hásléttunni [45] og mögulega örveruframleiðslu metan sem sést hefur undan ströndum Kerguelen-eyja [46].
Athygli okkar færðist þá að mælingum úr DNA-veirum. Að því er við best vitum er þetta fyrsta rannsóknin á veiruinnihaldi kræklinga utan markhóps. Eins og búist var við fundum við DNA-brot úr bakteríufögum (Caudovirales) (Mynd 6b). Hins vegar kemur algengasta veiru-DNA úr fylkingu kjarnafrumuveira, einnig þekkt sem kjarnafrumuveira stóra DNA-veiran (NCLDV), sem hefur stærsta erfðamengi allra veira. Innan þessarar fylkingar tilheyra flestar DNA-raðir ættirnar Mimimidoviridae (58%) og Poxviridae (21%), þar sem náttúrulegir hýslar eru hryggdýr og liðdýr, en lítill hluti þessara DNA-raða tilheyrir þekktum veirufræðilegum þörungum. Sýkir sjávarheilkjörnunga. Raðirnar voru einnig fengnar úr Pandora-veirunni, risavaxna veirunni með stærsta erfðamengisstærð allra þekktra veiruættkvísla. Athyglisvert er að fjöldi hýsla sem vitað er að eru smitaðir af veirunni, eins og ákvarðað var með ccfDNA raðgreiningu á hemolymph, var tiltölulega stór (Mynd S3, Viðbótarupplýsingar). Það felur í sér veirur sem sýkja skordýr eins og Baculoviridae og Iridoviridae, sem og veirur sem sýkja amöbu, þörunga og hryggdýr. Við fundum einnig raðir sem passa við erfðamengi Pithovirus sibericum. Pitovirusar (einnig þekktar sem „uppvakningaveirur“) voru fyrst einangraðar úr 30.000 ára gömlum sífrera í Síberíu [47]. Þannig eru niðurstöður okkar í samræmi við fyrri skýrslur sem sýna að ekki eru allar nútímategundir þessara veira útdauðar [48] og að þessar veirur gætu verið til staðar í afskekktum sjávarvistkerfum sunnan við norðurslóðir.
Að lokum prófuðum við hvort við gætum fundið DNA-brot úr öðrum fjölfrumudýrum. Alls voru 482 framandi samliggjandi erfðaefni greind með BLASTN og BLASTX með nt, nr og RefSeq bókasöfnum (erfðamengis- og próteinbókasöfnum). Niðurstöður okkar sýna að meðal framandi brota af ccfDNA fjölfrumudýra er DNA úr beinum ríkjandi (Mynd 5). DNA-brot úr skordýrum og öðrum tegundum hafa einnig fundist. Tiltölulega stór hluti DNA-brotanna hefur ekki fundist, hugsanlega vegna vanframsetningar fjölda sjávartegunda í erfðamengisgagnagrunnum samanborið við landtegundir [49].
Í þessari grein beiti við LB hugtakinu á krækling og rökstyðjum að ccfDNA raðgreining á blóðeitrum geti veitt innsýn í samsetningu vistkerfa sjávarstranda. Einkum komumst við að því að 1) blóðeitrið í kræklingi inniheldur tiltölulega mikið magn (míkrógrömm) af tiltölulega stórum (~1-5 kb) DNA brotum í blóðrás; 2) þessi DNA brot eru bæði óháð og óháð. 3) Meðal erlendra uppspretta þessara DNA brota fundum við bakteríu-, fornleifa- og veiru-DNA, sem og DNA annarra fjölfrumudýra; 4) Uppsöfnun þessara erlendu ccfDNA brota í blóðeitrinu á sér stað hratt og stuðlar að innri síunarvirkni kræklinga. Að lokum sýnir rannsókn okkar að hugtakið LB, sem hingað til hefur aðallega verið notað á sviði líftækni, felur í sér ríka en ókannaða þekkingarbrunn sem hægt er að nota til að skilja betur samspil varðtegunda og umhverfis þeirra.
Auk prímata hefur verið greint frá einangrun ccfDNA í spendýrum, þar á meðal músum, hundum, köttum og hestum [50, 51, 52]. Hins vegar, að því er okkur kunnugt, er rannsókn okkar sú fyrsta sem greinir frá greiningu og raðgreiningu ccfDNA í sjávardýrum með opið blóðrásarkerfi. Þessi líffærafræðilegi eiginleiki og síunarhæfni kræklinga gæti, að minnsta kosti að hluta til, skýrt mismunandi stærðareiginleika DNA-brota í blóðrás samanborið við aðrar tegundir. Í mönnum eru flestir DNA-brot sem eru í blóðrás litlir brot, á bilinu 150 til 200 bp að stærð, með hámarkstopp upp á 167 bp [34, 53]. Lítill en marktækur hluti DNA-brotanna er á bilinu 300 til 500 bp að stærð og um 5% eru lengri en 900 bp. [54]. Ástæðan fyrir þessari stærðardreifingu er sú að aðal uppspretta ccfDNA í plasma er vegna frumudauða, annað hvort vegna frumudauða eða vegna dreps í blóðmyndandi frumum í heilbrigðum einstaklingum eða vegna frumudauða í æxlisfrumum í krabbameinssjúklingum (þekkt sem blóðrásaræxlis-DNA, ctDNA). Stærðardreifing ccfDNA úr blóðeitrum sem við fundum í kræklingi var á bilinu 1000 til 5000 bp, sem bendir til þess að ccfDNA kræklinga eigi sér annan uppruna. Þetta er rökrétt tilgáta, þar sem kræklingur hefur hálfopið æðakerfi og lifir í sjávarvatnsumhverfi sem inniheldur mikið magn af örveruerfðaefni. Reyndar hafa rannsóknarstofutilraunir okkar með utanaðkomandi DNA sýnt að kræklingur safnar DNA-brotum í sjó, að minnsta kosti eftir nokkrar klukkustundir brotna þau niður eftir upptöku frumna og/eða losna og/eða geymd í ýmsum stofnunum. Miðað við sjaldgæfar frumur (bæði dreifkjörnunga og heilkjörnunga), mun notkun innanlokuhólfa draga úr magni ccfDNA úr eigin uppruna sem og frá erlendum uppruna. Í ljósi mikilvægis meðfædds ónæmiskerfis samlokna og mikils fjölda átfrumna í blóðrás, settum við fram þá tilgátu að jafnvel framandi ccfDNA sé auðgað af blóðrásarátfrumnum sem safna framandi DNA við inntöku örvera og/eða frumuleifa. Samanlagt sýna niðurstöður okkar að ccfDNA úr blóðeitrum samlokna samlokna er einstakt safn sameindaupplýsinga og styrkir stöðu þeirra sem varðtegundir.
Gögn okkar benda til þess að raðgreining og greining á ccfDNA brotum úr hemólymphu sem eru unnin úr bakteríum geti veitt lykilupplýsingar um flóru hýsilbakteríunnar og bakteríurnar sem eru til staðar í vistkerfi sjávar í kring. Skotraðgreiningaraðferðir hafa leitt í ljós raðir af gillibakteríunni A. atra sem hefði verið gleymt ef hefðbundnar 16S rRNA auðkenningaraðferðir hefðu verið notaðar, að hluta til vegna skekkju í tilvísunarbókasafni. Reyndar sýndi notkun okkar á LB gögnum sem söfnuð voru úr M. platensis í sama kræklingalaginu við Kerguelen að samsetning samlífisbaktería sem tengjast tálknum var sú sama fyrir báðar kræklingategundir (Mynd S4, viðbótarupplýsingar). Þessi líkindi tveggja erfðafræðilega ólíkra kræklinga gætu endurspeglað samsetningu bakteríusamfélaga í köldum, brennisteinsríkum og eldvirkum setlögum í Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Hærra magn brennisteinsafoxandi örvera hefur verið vel lýst við kræklingavínsveiflur frá lífrænum strandsvæðum [59], svo sem strönd Port-au-France. Annar möguleiki er að lárétt smit geti haft áhrif á flóru kræklinga [60, 61]. Frekari rannsókna er þörf til að ákvarða fylgni milli sjávarumhverfisins, yfirborðs sjávarbotnsins og samsetningar samlífisbaktería í kræklingi. Þessar rannsóknir eru enn í gangi.
Lengd og styrkur hemólymph ccfDNA, auðveld hreinsun þess og mikil gæði sem leyfa hraða raðgreiningu eru nokkrir af mörgum kostum þess að nota ccfDNA kræklinga til að meta líffræðilegan fjölbreytileika í vistkerfum við ströndina. Þessi aðferð er sérstaklega áhrifarík til að greina veirusamfélög (víróm) í tilteknu vistkerfi [62, 63]. Ólíkt bakteríum, fornbakteríum og heilkjörnungum innihalda veiruerfðamengi ekki erfðafræðilega varðveitt gen eins og 16S raðir. Niðurstöður okkar benda til þess að hægt sé að nota vökvasýni úr vísitegundum eins og kræklingi til að bera kennsl á tiltölulega mikið magn af ccfDNA veirubrotum sem vitað er að sýkja hýsla sem venjulega búa í vistkerfum við ströndina. Þetta felur í sér veirur sem vitað er að sýkja frumdýr, liðdýr, skordýr, plöntur og bakteríuveirur (td bakteríufaga). Svipuð dreifing fannst þegar við skoðuðum víróm hemólymph ccfDNA blákræklinga (M. platensis) sem safnað var í sama kræklingalaginu við Kerguelen (Tafla S2, Viðbótarupplýsingar). Röðun ccfDNA með haglabyssu er sannarlega ný aðferð sem er að ryðja sér til rúms í rannsóknum á veirufrumum manna eða annarra tegunda [21, 37, 64]. Þessi aðferð er sérstaklega gagnleg til að rannsaka tvíþátta DNA veirur, þar sem ekkert eitt gen er varðveitt meðal allra tvíþátta DNA veira, sem er fjölbreyttasti og breiðasti flokkur veira í Baltimore [65]. Þó að flestar þessar veirur séu enn óflokkaðar og geti innihaldið veirur frá algjörlega óþekktum hluta veiruheimsins [66], komumst við að því að veirufrumur og hýsilsvið kræklinganna A. atra og M. platensis falla á milli tegundanna tveggja á svipaðan hátt (sjá mynd S3, frekari upplýsingar). Þessi líkindi koma ekki á óvart, þar sem þau gætu endurspeglað skort á sértækni í upptöku DNA sem er til staðar í umhverfinu. Framtíðarrannsóknir með hreinsuðu RNA eru nú nauðsynlegar til að einkenna RNA veirufrumuna.
Í rannsókn okkar notuðum við mjög nákvæma leiðslu sem var aðlöguð frá verkum Kowarski og samstarfsmanna [37], sem notuðu tveggja þrepa eyðingu á sameinuðum lestum og samfelldum einingum fyrir og eftir samsetningu upprunalegs ccfDNA, sem leiddi til mikils hlutfalls ókortlagðra lestra. Þess vegna getum við ekki útilokað að sum þessara ókortlagðu lestra geti enn átt sér stað, fyrst og fremst vegna þess að við höfum ekki viðmiðunarerfðamengi fyrir þessa kræklingategund. Við notuðum einnig þessa leiðslu vegna þess að við höfðum áhyggjur af kímörum milli sjálfslestra og ekki-sjálfslestra og leslengdum sem Illumina MiSeq PE75 myndar. Önnur ástæða fyrir meirihluta ókortlagðra lestra er sú að margar sjávarörverur, sérstaklega á afskekktum svæðum eins og Kerguelen, hafa ekki verið merktar. Við notuðum Illumina MiSeq PE75, að því gefnu að ccfDNA brotlengdir séu svipaðar og ccfDNA manna. Fyrir framtíðarrannsóknir, miðað við niðurstöður okkar sem sýna að hemólymph ccfDNA hefur lengri lestur en manna og/eða spendýra, mælum við með að nota raðgreiningarpall sem hentar betur fyrir lengri ccfDNA brot. Þessi aðferð mun gera það mun auðveldara að bera kennsl á fleiri vísbendingar um ítarlegri greiningu. Að fá heildar kjarnaerfðamengisröð A. atra, sem nú er ekki tiltæk, myndi einnig auðvelda verulega aðgreiningu á ccfDNA frá sjálfs- og ekki-sjálfsuppsprettum. Þar sem rannsóknir okkar hafa einbeitt sér að möguleikanum á að beita hugmyndinni um fljótandi vefjasýni á krækling, vonumst við til að þegar þetta hugtak verður notað í framtíðarrannsóknum verði þróuð ný verkfæri og leiðslur til að auka möguleika þessarar aðferðar til að rannsaka örverufjölbreytni kræklinga og vistkerfis sjávar.
Sem óinngripandi klínískur lífmerki eru hækkaðar ccfDNA-gildi í plasma manna tengd ýmsum sjúkdómum, vefjaskemmdum og streituástandi [67,68,69]. Þessi aukning tengist losun DNA-brota af eigin uppruna eftir vefjaskemmdir. Við fjallaðum um þetta mál með því að nota bráða hitastreitu, þar sem kræklingur var stuttlega útsettur fyrir 30°C hitastigi. Við framkvæmdum þessa greiningu á þremur mismunandi tegundum kræklinga í þremur óháðum tilraunum. Hins vegar fundum við enga breytingu á ccfDNA-gildum eftir bráða hitastreitu (sjá mynd S5, frekari upplýsingar). Þessi uppgötvun gæti að minnsta kosti að hluta til skýrt þá staðreynd að kræklingur hefur hálfopið blóðrásarkerfi og safnar miklu magni af framandi DNA vegna mikillar síunarvirkni sinnar. Á hinn bóginn geta kræklingar, eins og margir hryggleysingjar, verið ónæmari fyrir streituvöldum vefjaskemmdum og þar með takmarkað losun ccfDNA í blóðvökva þeirra [70, 71].
Hingað til hefur DNA-greining á líffræðilegum fjölbreytileika í vatnavistkerfum aðallega einbeitt sér að umritunarstrikamerkjum á umhverfis-DNA (eDNA). Þessi aðferð er þó yfirleitt takmörkuð í greiningu á líffræðilegum fjölbreytileika þegar notaðir eru praimerar. Notkun haglabyssuröðunar (shotgun raðgreining) sniðgengur takmarkanir PCR og skekkt val á praimerasettum. Þannig er aðferð okkar, á vissan hátt, nær nýlega notuðu háafköstum eDNA Shotgun raðgreiningaraðferðinni, sem getur raðgreint sundurskorið DNA beint og greint nánast allar lífverur [72, 73]. Hins vegar eru nokkur grundvallaratriði sem aðgreina LB frá hefðbundnum eDNA aðferðum. Að sjálfsögðu er helsti munurinn á eDNA og LB notkun náttúrulegra síuhýsla. Greint hefur verið frá notkun sjávartegunda eins og svampa og skelfiska (Dresseina spp.) sem náttúrulegs síu til að rannsaka eDNA [74, 75]. Hins vegar notaði rannsókn Dreissena vefjasýni sem DNA var dregið úr. Greining á ccfDNA úr LB krefst ekki vefjasýnatöku, sérhæfðs og stundum dýrs búnaðar og flutninga sem tengjast eDNA eða vefjasýnatöku. Reyndar greindum við nýlega frá því að hægt sé að geyma og greina ccfDNA úr LB með FTA stuðningi án þess að viðhalda kælikeðju, sem er mikil áskorun fyrir rannsóknir á afskekktum svæðum [76]. Útdráttur ccfDNA úr vökvasýnum er einnig einfaldur og veitir hágæða DNA fyrir raðgreiningu með haglabyssu og PCR greiningu. Þetta er mikill kostur miðað við sumar tæknilegar takmarkanir sem tengjast eDNA greiningu [77]. Einfaldleiki og lágur kostnaður sýnatökuaðferðarinnar er einnig sérstaklega hentugur fyrir langtíma eftirlitsáætlanir. Auk mikillar síunargetu þeirra er annar vel þekktur eiginleiki skelfiska efnafræðileg slímfjölsykrusamsetning slímsins, sem stuðlar að frásogi veira [78, 79]. Þetta gerir skelfiska að kjörnum náttúrulegum síum til að greina líffræðilegan fjölbreytileika og áhrif loftslagsbreytinga á tilteknu vatnsvistkerfi. Þó að tilvist DNA-brota sem eru unnin úr hýsil megi líta á sem takmörkun á aðferðinni samanborið við eDNA, er kostnaðurinn sem fylgir því að hafa slíkt innfædd ccfDNA samanborið við eDNA jafnframt skiljanlegur miðað við það mikla magn upplýsinga sem eru tiltækar fyrir heilsufarsrannsóknir á móti hýsil. Þetta felur í sér tilvist veiruraða sem eru samþættar erfðamengi hýsilsins. Þetta er sérstaklega mikilvægt fyrir kræklinga, miðað við tilvist lárétt smitaðra hvítblæðis-retroveira í skeljum [80, 81]. Annar kostur við LB umfram eDNA er að það nýtir sér átfrumuvirkni blóðrásarblóðfrumna í blóðrásinni, sem gleypir örverur (og erfðamengi þeirra). Átfrumun er aðalhlutverk blóðfrumna í skeljum [82]. Að lokum nýtir aðferðin sér mikla síunargetu kræklinga (að meðaltali 1,5 l/klst af sjó) og tveggja daga blóðrás, sem eykur blöndun mismunandi laga af sjó, sem gerir kleift að fanga ósamhverft eDNA. [83, 84]. Þannig er ccfDNA greining á kræklingum áhugaverð leið miðað við næringarfræðileg, efnahagsleg og umhverfisleg áhrif kræklinga. Líkt og greining á LB sem safnað er frá mönnum, opnar þessi aðferð einnig möguleikann á að mæla erfðafræðilegar og erfðafræðilegar breytingar í DNA hýsilsins sem svar við utanaðkomandi efnum. Til dæmis má ímynda sér þriðju kynslóðar raðgreiningartækni til að framkvæma erfðamengisvíðar metýleringargreiningar í upprunalegu ccfDNA með því að nota nanóporaröðun. Þetta ferli ætti að vera auðveldað af þeirri staðreynd að lengd ccfDNA-brotanna úr kræklingi er fullkomlega samhæfð við langtíma raðgreiningarpalla sem leyfa erfðamengisvíðar DNA metýleringargreiningar úr einni raðgreiningarkeyrslu án þess að þörf sé á efnafræðilegum umbreytingum.85,86] Þetta er áhugaverður möguleiki, þar sem sýnt hefur verið fram á að DNA metýleringarmynstur endurspegla viðbrögð við umhverfisálagi og vara í margar kynslóðir. Þess vegna getur það veitt verðmæta innsýn í undirliggjandi ferla sem stjórna viðbrögðum eftir útsetningu fyrir loftslagsbreytingum eða mengunarefnum [87]. Hins vegar er notkun LB ekki án takmarkana. Óþarfi að taka fram að þetta krefst tilvistar vísitegunda í vistkerfinu. Eins og áður hefur komið fram krefst notkun LB til að meta líffræðilegan fjölbreytileika tiltekins vistkerfis einnig strangrar lífupplýsingafræði sem tekur tillit til tilvistar DNA-brota frá upptökum. Annað stórt vandamál er framboð á viðmiðunarerfðamengjum fyrir sjávartegundir. Vonast er til að verkefni eins og erfðamengisverkefnið um sjávarspendýr og nýstofnaða Fish10k verkefnið [88] muni auðvelda slíka greiningu í framtíðinni. Notkun LB-hugmyndarinnar á sjávarlífverur sem nærast á síum er einnig samhæfð nýjustu framförum í raðgreiningartækni, sem gerir það vel til þess fallið að þróa fjölóma lífmerki til að veita mikilvægar upplýsingar um heilsufar sjávarbúsvæða sem viðbrögð við umhverfisálagi.
Gögn um erfðamengisraðgreiningu hafa verið geymd í NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 undir Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Áhrif loftslagsbreytinga á lífríki sjávar og vistkerfi. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, o.fl. Íhugið samanlögð áhrif loftslagsbreytinga og annarra staðbundinna streituvalda á umhverfi hafsins. almennt vísindalegt umhverfi. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Vísindi fyrsta mars. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Minnkuð hitaþol við endurteknar hitastreituaðstæður skýrir háan sumardauða blákræklinga. Vísindaskýrsla 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, o.fl. Nýlegar breytingar á tíðni, orsökum og umfangi dýradauða. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, o.fl. Margir ótegunda-sértækir sýklar gætu hafa valdið fjöldadauða Pinna nobilis. Lífið. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Hugsanleg áhrif loftslagsbreytinga á dýrasjúkdóma sem berast á norðurslóðum. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. o.fl. Blákræklingur (Mytilus edulis spp.) sem merkjalífverur í mengunareftirliti við strendur: yfirlit. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Samþætting vökvasýnatöku í krabbameinsmeðferð. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, o.fl. Þroski vökvasýnatöku: Leyfir æxlis DNA að dreifast. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Kjarnsýrur í plasma manna. Fundargerðir dótturfélaga Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nýtt hlutverk frumulauss DNA sem sameindamerki fyrir krabbameinsmeðferð. Magnbundin greining á lífmólum. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vökvasýnataka kemur inn á klínísku rannsóknina – framkvæmdamál og framtíðaráskoranir. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW og fleiri. DNA úr fóstri er til staðar í plasma og sermi móður. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Rannsókn á gangi meðgöngu og fylgikvillum hennar með því að nota utanfrumu-RNA í blóði kvenna á meðgöngu. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, o.fl. Vökvasýnataka: frumulaust DNA úr gjafa er notað til að greina ósamgena meinsemdir í nýrnaígræðslu. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nýjungar í fósturgreiningu: erfðamengisraðgreining í plasma móður. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, o.fl. Hraðgreining sýkla með næstu kynslóð erfðamengisraðgreiningar á sýktum líkamsvökvum. Nat Medicine. 2021;27:115-24.