Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com. Nooca biraawsarka aad isticmaaleyso wuxuu leeyahay taageero CSS oo xaddidan. Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho biraawsar la cusbooneysiiyay (ama aad joojiso Habka La-qabsiga ee Internet Explorer). Dhanka kale, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan soo bandhigi doonnaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Biyo-qaadista dareeraha ah (LB) waa fikrad si dhakhso ah caan uga noqonaysa cilmiga bayoolajiga. Fikraddu waxay inta badan ku salaysan tahay ogaanshaha jajabyada DNA-da ka baxsan unugyada wareegaya (ccfDNA), kuwaas oo inta badan loo sii daayo jajabyo yaryar ka dib dhimashada unugyada ee unugyada kala duwan. Qayb yar oo ka mid ah jajabyadan waxay ka yimaadaan unugyo ama nooleyaal shisheeye (shisheeye). Shaqada hadda socota, waxaan fikraddan ku dabaqnay mussels, nooc sentinel ah oo loo yaqaan awooddooda sifeynta biyaha badda oo sareysa. Waxaan u adeegsannaa awoodda mussels-ka inay u dhaqmaan sidii shaandhooyin dabiici ah si ay u qabtaan jajabyada DNA-da deegaanka ee ilo kala duwan si ay u bixiyaan macluumaad ku saabsan kala duwanaanshaha noolaha ee nidaamyada deegaanka xeebaha badda. Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in mussel hemolymph uu ka kooban yahay jajabyo DNA ah oo aad u kala duwan cabbir ahaan, laga bilaabo 1 ilaa 5 kb. Taxanaha qoriga ayaa muujiyay in tiro badan oo jajabyo DNA ah ay ka yimaadeen asal ahaan microbial shisheeye. Kuwaas waxaa ka mid ah, waxaan ka helnay jajabyo DNA ah oo ka yimid bakteeriyada, archaea, iyo fayrasyada, oo ay ku jiraan fayrasyada loo yaqaan inay ku dhacaan noocyo kala duwan oo martigeliyayaal ah oo badanaa laga helo nidaamyada deegaanka badda ee xeebaha. Gunaanadkii, daraasaddeennu waxay muujinaysaa in fikradda LB ee loo adeegsado mussels ay ka dhigan tahay ilo aqoon oo hodan ah laakiin aan weli la sahamin oo ku saabsan kala duwanaanshaha microbial ee nidaamyada deegaanka xeebaha badda.
Saamaynta isbeddelka cimilada (CC) ee ku aaddan kala duwanaanshaha noolaha ee nidaamyada deegaanka badda waa goob cilmi baaris oo si xawli ah u koraysa. Kulaylka adduunku ma aha oo kaliya inuu keeno walaacyo muhiim ah oo ku saabsan jir ahaaneed, laakiin sidoo kale wuxuu riixaa xadka isbeddelka ee xasilloonida kulaylka ee noolaha badda, isagoo saameeya deegaanka noocyo badan, taasoo ku kallifaysa inay raadiyaan xaalado wanaagsan [1, 2]. Marka laga soo tago saameynta kala duwanaanshaha noolaha ee metazoans, CC waxay carqaladeysaa dheelitirka jilicsan ee isdhexgalka martida loo yahay iyo microbial. Dysbacteriosis-kan microbial wuxuu khatar weyn ku yahay nidaamyada deegaanka badda maadaama uu ka dhigayo noolaha badda kuwo u nugul cudurada faafa [3, 4]. Waxaa la rumeysan yahay in SS ay door muhiim ah ka ciyaarto dhimashada tirada badan, taas oo ah dhibaato halis ah oo ku wajahan maaraynta nidaamyada deegaanka badda adduunka [5, 6]. Tani waa arrin muhiim ah marka la eego saameynta dhaqaale, deegaanka iyo nafaqada ee noocyada badan ee badda. Tani waxay si gaar ah run ugu tahay bivalves-ka ku nool gobollada cidhifka, halkaas oo saameynta CK ay aad u degdeg badan tahay oo daran tahay [6, 7]. Xaqiiqdii, bivalves-ka sida Mytilus spp. ayaa si weyn loogu isticmaalaa in lagu kormeero saameynta CC ee nidaamyada deegaanka badda. Lama yaabin, tiro badan oo ah biomarkers ayaa la sameeyay si loola socdo caafimaadkooda, inta badan iyagoo adeegsanaya hab laba heer ah oo ku lug leh biomarkers shaqeynaya oo ku salaysan dhaqdhaqaaqa enzymatic ama hawlaha unugyada sida noolaanshaha unugyada iyo dhaqdhaqaaqa phagocytic [8]. Hababkani waxa kale oo ay ka mid yihiin cabbirka isku-darka tilmaamayaasha cadaadiska gaarka ah ee ku urura unugyada jilicsan ka dib nuugista xaddi badan oo biyo badda ah. Si kastaba ha ahaatee, awoodda shaandhaynta sare iyo nidaamka wareegga dhiigga ee nus-furan ee bivalves waxay bixiyaan fursad lagu horumariyo biomarkers cusub oo hemolymph ah iyadoo la adeegsanayo fikradda biopsy dareere ah (LB), oo ah hab fudud oo yar oo lagu maareeyo bukaanka. muunado dhiig [9, 10]. Inkasta oo noocyo badan oo molecules wareegaya laga heli karo LB-ga aadanaha, fikraddani waxay ugu horreyn ku salaysan tahay falanqaynta taxanaha DNA ee jajabyada DNA-da ee ku wareegaya xuubka ka baxsan (ccfDNA) ee plasma-ga. Xaqiiqdii, joogitaanka DNA-da wareegaysa ee plasma-ga aadanaha ayaa la ogaa tan iyo bartamihii qarnigii 20-aad [11], laakiin waa sannadihii ugu dambeeyay oo keliya in imaatinka hababka taxanaha sare ee wax soo saarka ay horseedday ogaanshaha caafimaad ee ku salaysan ccfDNA. Joogitaanka jajabyadan DNA-da ee wareegaya waxay qayb ahaan sabab u tahay sii deynta aan firfircoonayn ee DNA-da genomic (nukliyeerka iyo mitochondrial) ka dib dhimashada unugyada. Dadka caafimaadka qaba, heerka ccfDNA caadi ahaan waa hooseeyaa (<10 ng/mL) laakiin waxaa lagu kordhin karaa 5-10 jeer bukaanada qaba cuduro kala duwan ama la kulma walbahaar, taasoo keenta dhaawac unugyada ah. Dadka caafimaadka qaba, heerka ccfDNA caadi ahaan waa hooseeyaa (<10 ng/mL) laakiin waxaa lagu kordhin karaa 5-10 jeer bukaanada qaba cuduro kala duwan ama la kulma walbahaar, taasoo keenta dhaawac unugyada ah. У здоровых людей концентрастия различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Dadka caafimaadka qaba, heerka cccDNA caadi ahaan waa hooseeyaa (<10 ng/mL), laakiin wuxuu ku kordhi karaa 5-10 jeer bukaanada qaba cuduro kala duwan ama ku jira cadaadis taasoo keenta dhaawac unugyada ah.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）。倍，从而导致组织损伤。在 健康增加 5-10 倍 从而 组织。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Fiirsashada ccfDNA badanaa way hooseysaa (<10 ng/ml) dadka caafimaadka qaba, laakiin waxaa lagu kordhin karaa 5-10-laab bukaanada qaba cudurro kala duwan ama walbahaar, taasoo keenta dhaawac unugyada ah.Cabbirka jajabyada ccfDNA si weyn ayuu u kala duwan yahay, laakiin badanaa waxay u dhaxaysaa 150 ilaa 200 bp. [12]. Falanqaynta ccfDNA-ga iskiis u soo baxa, tusaale ahaan, ccfDNA laga helo unugyada martida loo yahay ee caadiga ah ama kuwa la beddelay, ayaa loo isticmaali karaa in lagu ogaado isbeddellada hidde-sidaha iyo epigenetic-ga ee ku jira hidde-sidaha nukliyeerka iyo/ama mitochondrial, taasoo ka caawinaysa dhakhaatiirta inay doortaan daaweyn gaar ah oo bartilmaameed u ah molecular-ka [13]. Si kastaba ha ahaatee, ccfDNA waxaa laga heli karaa ilo shisheeye sida ccfDNA unugyada uurjiifka inta lagu jiro uurka ama xubnaha la tallaalay [14,15,16,17]. ccfDNA sidoo kale waa ilo muhiim ah oo macluumaad ah si loo ogaado jiritaanka asiidhyada nucleic-ga ee wakiilka faafa (shisheeye), kaas oo u oggolaanaya ogaanshaha aan duullaanka ahayn ee caabuqyada baahsan ee aan lagu aqoonsan dhaqamada dhiigga, iyadoo laga fogaanayo biopsy-ga duullaanka ah ee unugyada cudurka qaba [18]. Daraasado dhowaan la sameeyay ayaa runtii muujiyay in dhiigga bini'aadamku uu ka kooban yahay ilo macluumaad oo qani ah oo loo isticmaali karo in lagu aqoonsado jeermiska fayraska iyo bakteeriyada, iyo in qiyaastii 1% ccfDNA laga helo plasma-ga aadanaha uu ka yimid asal shisheeye [19]. Daraasadahani waxay muujinayaan in kala duwanaanshaha noolaha ee microbiome-ka wareegaya ee noolaha lagu qiimeyn karo iyadoo la adeegsanayo falanqaynta ccfDNA. Si kastaba ha ahaatee, ilaa dhawaan, fikraddan waxaa si gaar ah loogu isticmaalay aadanaha iyo, ilaa xad yar, laf-dhabarta kale [20, 21].
Warqaddan hadda jirta, waxaan u adeegsaneynaa awoodda LB si aan u falanqeyno ccfDNA ee Aulacomya atra, nooc ka mid ah koonfurta oo si caadi ah looga helo Jasiiradaha Kerguelen ee ku yaal dhulka hoostiisa, oo ah koox jasiirado ah oo ku yaal meel bannaan oo weyn oo sameysmay 35 milyan oo sano ka hor. qarax foolkaane. Annagoo adeegsanayna nidaam tijaabo ah oo in vitro ah, waxaan ogaanay in jajabyada DNA-da ee biyaha badda si dhakhso ah ay u qaadaan mussels oo ay galaan qaybta hemolymph. Taxanaha qoriga ayaa muujiyay in mussel hemolymph ccfDNA ay ka kooban tahay jajabyo DNA ah oo asal ahaan u gaar ah iyo kuwa aan iskood u ahayn, oo ay ku jiraan bakteeriyada isku-dhafan iyo jajabyada DNA-da ee ka yimaada bayoolajiga caadiga ah ee nidaamyada deegaanka ee xeebaha foolkaane ee qabow. Hemolymph ccfDNA sidoo kale waxay ka kooban tahay taxane fayras ah oo ka soo jeeda fayrasyo ​​leh noocyo kala duwan oo martigeliya. Waxaan sidoo kale helnay jajabyo DNA ah oo ka yimid xayawaanka unugyada badan sida kalluunka lafaha leh, anemones-ka badda, algae iyo cayayaanka. Gunaanadkii, daraasaddeennu waxay muujineysaa in fikradda LB si guul leh loogu dabaqi karo laf-dhabarta badda si loo soo saaro hidde-side hodan ah oo ku jira nidaamyada deegaanka badda.
Dadka waaweyn (dhererka 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) iyo Aulacomya atra (A. atra) ayaa laga soo ururiyay xeebaha dhagaxa leh ee Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Jasiiradaha Kerguelen bishii Diseembar 2018. Mussels buluug ah oo kale oo waaweyn (Mytilus spp.) waxaa laga helay alaab-qeybiye ganacsi (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) waxaana la dhigay haan hawo leh oo heerkulkeedu la xakameeyey (4°C) oo ka kooban 10-20 L oo ah 32‰ milix macmal ah. (cusbo badda oo macmal ah Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Tijaabo kasta, dhererka iyo miisaanka qolofka shaqsiga ah ayaa la cabbiray.
Hab-maamuuska marin u helidda furan ee bilaashka ah ee barnaamijkan ayaa laga heli karaa khadka tooska ah (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Si kooban, LB hemolymph waxaa laga soo ururiyay muruqyada afduubka sida lagu sharraxay [22]. Hemolymph-ka waxaa lagu caddeeyay centrifugation 1200×g muddo 3 daqiiqo ah, dusha sare ee jirka ayaa la qaboojiyey (-20°C) ilaa la isticmaalo. Si loo go'doomiyo loona nadiifiyo cfDNA, muunado (1.5-2.0 ml) ayaa la dhalaaliyay oo la farsameeyay iyadoo la isticmaalayo qalabka NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sida ku cad tilmaamaha soo saaraha. ccfDNA waxaa lagu kaydiyay -80°C ilaa falanqayn dheeraad ah. Tijaabooyin qaar, ccfDNA waa la go'doomiyay oo la nadiifiyay iyadoo la isticmaalayo Qalabka Baarayaasha DNA-da ee QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). DNA-da la nadiifiyay waxaa lagu cabbiray iyadoo la isticmaalayo tijaabo caadi ah oo PicoGreen ah. Qaybinta jajabka ee ccfDNA-ga go'doonsan waxaa lagu falanqeeyay electrophoresis capillary electrophoresis iyadoo la adeegsanayo Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) iyadoo la adeegsanayo Qalabka DNA-da ee Dareenka Sare leh. Baaritaanka waxaa lagu sameeyay iyadoo la isticmaalayo 1 µl oo muunadda ccfDNA ah sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha.
Si loo sameeyo taxanaha jajabyada hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) waxay diyaarisay maktabadaha qoryaha darandooriga u dhaca iyagoo adeegsanaya qalabka isku darka ee Illumina DNA ee qalabka Illumina MiSeq PE75. Adapter caadi ah (BioO) ayaa la isticmaalay. Faylasha xogta cayriin waxaa laga heli karaa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 iyo SRR8924809). Tayada akhriska aasaasiga ah waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo FastQC [23]. Trimmomatic [24] waxaa loo isticmaalay jarista adapters-ka iyo akhrinta tayada liidata. Akhrinta qoryaha darandooriga u dhaca ee leh darafyo lammaane ah ayaa lagu daray akhrisyo hal-hal ah oo dheer oo leh ugu yaraan isku-darka 20 bp si looga fogaado isku-dhafnaan la'aan [25]. Akhriska la isku daray waxaa lagu sharraxay BLASTN iyadoo la adeegsanayo xog ururin NCBI Taxonomy ah oo laba-waji ah (qiimaha e < 1e−3 iyo 90% isku mid ah), waxaana lagu sameeyay qarinta taxanaha isku-dhafan ee dhibka yar iyadoo la adeegsanayo DUST [26]. Akhriska la isku daray waxaa lagu sharraxay BLASTN iyadoo la adeegsanayo xog ururin NCBI Taxonomy ah oo laba-waji ah (qiimaha e < 1e−3 iyo 90% isku mid ah), waxaana lagu sameeyay qarinta taxanaha isku-dhafan ee dhibka yar iyadoo la adeegsanayo DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы NCBI (значение e <1e-3 iyo 90% гомологии), а маскирование последовательностей [26] Akhriska la ururiyay waxaa lagu sharraxay BLASTN iyadoo la adeegsanayo xogta NCBI bivalve taxonomy (qiimaha e < 1e-3 iyo 90% isku mid ah), iyo qarinta taxanaha dhibka yar waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用进行复杂度 序列 的。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование использованием CASHIN [26]. Akhriska la ururiyay waxaa lagu sharraxay BLASTN iyadoo la adeegsanayo xogta NCBI bivalve taxonomic (qiimaha e <1e-3 iyo 90% isku mid ah), iyo qarinta taxanaha dhibka yar waxaa lagu sameeyay DUST [26].Akhrisyada waxaa loo qaybiyay laba kooxood: oo la xiriira taxanaha laba-wajiile (halkan waxaa loogu yeeraa is-akhris) iyo kuwa aan xiriir la lahayn (aan is-akhris ahayn). Laba kooxood ayaa si gaar ah loogu soo ururiyay iyadoo la adeegsanayo MEGAHIT si loo soo saaro contigs [27]. Dhanka kale, qaybinta taxonomic ee akhrinta microbiome-ka shisheeye waxaa lagu kala saaray iyadoo la adeegsanayo Kraken2 [28] waxaana si garaaf ahaan loogu matalay jaantuska pie Krona ee Galaxy [29, 30]. kmers-ka ugu fiican waxaa lagu go'aamiyay inay yihiin kmers-59 laga soo bilaabo tijaabooyinkayagii hore. Dabadeed waxaa lagu aqoonsaday is-qabadsiinta iyadoo la waafajinayo BLASTN (xogta xogta NCBI ee laba-geesoodka ah, qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah) si loo helo sharraxaad kama dambays ah. Dabadeed waxaa lagu aqoonsaday is-qabadsiinta iyadoo la waafajinayo BLASTN (xogta xogta NCBI ee laba-geesoodka ah, qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah) si loo helo sharraxaad kama dambays ah. Затем собственные значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Dabadeed waxaa lagu aqoonsaday is-qabadsiinta iyadoo la barbar dhigayo BLASTN (xogta xogta bivalve ee NCBI, qiimaha e <1e-10 iyo 60% isku mid ah) si loogu daro sharraxaadda kama dambaysta ah.然后通过与 BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与 BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы скачать видео - для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Dabadeed waxaa la aqoonsaday is-qabadsiinta si loogu daro sharraxaadda kama dambaysta ah iyadoo la barbar dhigayo BLASTN (xogta xogta bivalve ee NCBI, qiimaha e <1e-10 iyo 60% isku mid ah). Marka la barbar dhigo, kooxaha aan iskood isu ahayn waxaa lagu sharraxay BLASTN (xogta xogta NCBI, qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah). Marka la barbar dhigo, kooxaha aan iskood isu ahayn waxaa lagu sharraxay BLASTN (xogta xogta NCBI, qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN. гомология 60%). Marka la barbar dhigo, kooxaha ajnabiga ah ee la xiriira waxaa lagu sharraxay BLASTN (xogta NT NCBI, qiimaha e <1e-10 iyo 60% isku mid ah).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной <1e-10 iyo гомология 60%). Marka la barbar dhigo, kooxaha aan is-qabin waxaa lagu sharraxay BLASTN (xogta xogta nt NCBI, qiimaha e <1e-10 iyo 60% isku mid ah). BLASTX waxaa sidoo kale lagu sameeyay is-xakameyn aan iskeed ahayn iyadoo la adeegsanayo xogta borotiinka nr iyo RefSeq ee NCBI (qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah). BLASTX waxaa sidoo kale lagu sameeyay is-xakameyn aan iskeed ahayn iyadoo la adeegsanayo xogta borotiinka nr iyo RefSeq ee NCBI (qiimaha e < 1e−10 iyo 60% isku mid ah). BLASTX был проведен на несамостоятельных контигах с использованием гомология 60%). BLASTX waxaa sidoo kale lagu sameeyay baaritaanno aan iskood isu beddelin iyadoo la adeegsanayo xogta borotiinka nr iyo RefSeq NCBI (qiimaha e < 1e-10 iyo 60% isku mid ah).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧 BLASTX на просмотреть видео скачать видео - гомология 60%). BLASTX waxaa sidoo kale lagu sameeyay xaalado aan iskood isu beddelin iyadoo la adeegsanayo xogta borotiinka nr iyo RefSeq NCBI (qiimaha e <1e-10 iyo 60% isku mid ah).BALASTN iyo BLASTX barkadaha aan is-qabin waxay matalaan calaamadaha kama dambaysta ah (fiiri faylka dheeraadka ah).
Qalabka asaasiga ah ee loo isticmaalo PCR waxaa lagu taxay Shaxda S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ayaa loo isticmaalay in lagu xoojiyo hiddo-wadaha bartilmaameedka ccfDNA. Xaaladaha falcelinta soo socda ayaa la isticmaalay: denaturation 95°C muddo 3 daqiiqo ah, 95°C muddo 1 daqiiqo ah, heerkulka annealing 1 daqiiqo ah, dheereynta 72°C muddo 1 daqiiqo ah, 35 wareeg, iyo ugu dambeyntii 72°C muddo 10 daqiiqo ah gudahood. . Badeecadaha PCR waxaa lagu kala saaray electrophoresis jeelasha agarose (1.5%) oo ka kooban SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) oo ah 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) ayaa lagu dhex milmay 500 ml oo biyo badeed oksijiin leh (32 PSU) muddo 24 saacadood ah heerkul ah 4°C. DNA-da plasmid-ka oo ka kooban gelin ku lifaaqan taxanaha galectin-7 cDNA ee aadanaha (lambarka NCBI ee gelitaanka L07769) ayaa lagu daray dhalada iyadoo lagu daray fiirsasho kama dambays ah oo ah 190 μg/μl. Mussels-ka lagu dhex milmay xaalado isku mid ah iyada oo aan lagu darin DNA-da ayaa ahaa kantaroolka. Taangiga xakamaynta saddexaad wuxuu ka koobnaa DNA aan lahayn mussels. Si loola socdo tayada DNA-da biyaha badda, muunado biyaha badda ah (20 μl; saddex ku celcelin) ayaa laga soo qaaday taangi kasta waqtiga la tilmaamay. Raadinta DNA-da plasmid, mussels-ka LB waxaa la goostay waqtiyada la tilmaamay waxaana lagu falanqeeyay qPCR iyo ddPCR. Sababtoo ah milixda badan ee biyaha badda, aliquots-ka waxaa lagu qasi jiray biyaha tayada PCR (1:10) ka hor dhammaan baaritaannada PCR.
PCR-ka dhibicda dijitaalka ah (ddPCR) waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hab-raaca BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Adeegso qaabka heerkulka si aad u go'aamiso heerkulka ugu habboon (Jadwalka S1). Dhibcaha waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo matoorka dhibicda QX200 (BioRad). ddPCR waxaa loo sameeyay sidan soo socota: 95°C muddo 5 daqiiqo ah, 50 wareeg oo ah 95°C muddo 30 ilbiriqsi ah iyo heerkul la siiyay oo ah 1 daqiiqo iyo 72°C muddo 30 ilbiriqsi ah, 4°C muddo 5 daqiiqo ah iyo 90°C muddo 5 daqiiqo gudahood ah. Tirada dhibcaha iyo falcelinta togan (tirada nuqullada/µl) waxaa lagu cabbiray iyadoo la isticmaalayo akhristaha dhibicda QX200 (BioRad). Muunado leh wax ka yar 10,000 oo dhibcood ayaa la diiday. Xakamaynta qaabka lama sameyn mar kasta oo ddPCR la shaqeeyo.
qPCR waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) iyo hordhac gaar ah oo LGALS7 ah. Dhammaan PCR-yada tirada leh waxaa lagu sameeyay 20 µl iyadoo la adeegsanayo Qalabka PCR-ka ee QuantiFast SYBR Green (QIAGEN). qPCR waxaa lagu bilaabay ku-shubid 15 daqiiqo ah 95°C oo ay ku xigto 40 wareeg oo ah 95°C muddo 10 ilbiriqsi ah iyo 60°C muddo 60 ilbiriqsi ah iyadoo la adeegsanayo hal xog ururin. Qaloocyada dhalaalka waxaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo cabbirro isku xiga oo ah 95°C muddo 5 ilbiriqsi ah, 65°C muddo 60 ilbiriqsi ah, iyo 97°C dhammaadka qPCR. qPCR kasta waxaa lagu sameeyay saddex-jibbaar, marka laga reebo muunado xakameyn ah.
Maadaama mussels-ku loo yaqaan heerka sifeynta sare, waxaan marka hore baarnay inay shaandheyn karaan oo ay hayn karaan jajabyada DNA-da ee ku jira biyaha badda. Waxaan sidoo kale xiisaynaynay in jajabyadani ay ku ururaan nidaamkooda lymphatic-ka ee nus-furan. Waxaan si tijaabo ah u xallinay arrintaan annagoo raadinayna qaddarka jajabyada DNA-da ee milmi kara ee lagu daray haamaha mussel-ka buluugga ah. Si loo fududeeyo la socodka jajabyada DNA-da, waxaan isticmaalnay DNA-da plasmid ee shisheeye (aan iskeed ahayn) oo ka kooban hidda-wadaha galectin-7 ee aadanaha. ddPCR waxay raadraacdaa jajabyada DNA-da plasmid ee biyaha badda iyo mussels-ka. Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in haddii xaddiga jajabyada DNA-da ee biyaha badda ay sii ahaadaan kuwo joogto ah muddo ka dib (ilaa 7 maalmood) marka aysan jirin mussels-ka, markaa joogitaanka mussels-ka heerkani wuxuu ku dhawaad ​​​​gebi ahaanba baaba'ay 8 saacadood gudahood (Sawirka 1a, b). Jajabyada DNA-da dibadda ah si fudud ayaa loo ogaan karaa 15 daqiiqo gudahood dareeraha gudaha valvular iyo hemolymph (Sawirka 1c). Jajabyadan wali waa la ogaan karaa ilaa 4 saacadood ka dib soo-gaadhista. Hawlgalkan sifeynta marka loo eego jajabyada DNA-da wuxuu la mid yahay dhaqdhaqaaqa sifeynta bakteeriyada iyo algae [31]. Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in mussels-ku ay shaandhayn karaan oo ay ku ururin karaan DNA-da shisheeye ee ku jirta qaybaha dareeraha.
Fiirsashada qaraabada ah ee DNA-da plasmid-ka ee biyaha badda marka ay joogaan (A) ama maqnaanshaha (B) ee mussels, oo lagu cabbiro ddPCR. A, natiijooyinka waxaa lagu muujiyaa boqolley ahaan, iyadoo xuduudaha sanduuqyada ay matalayaan boqolleyda 75aad iyo 25aad. Qalooca logarithmic ee ku habboon waxaa lagu muujiyaa casaan, aagga hadhsan ee cawlan wuxuu matalaa muddada kalsoonida 95%. B, xariiqda cas waxay matashaa celceliska xariiqda buluuggana waxay matashaa muddada kalsoonida 95% ee fiirsashada. C Uruurinta DNA-da plasmid-ka ee hemolymph iyo dareeraha valvular ee mussels waqtiyo kala duwan ka dib marka lagu daro DNA-da plasmid-ka. Natiijooyinka waxaa loo soo bandhigayaa nuqullo dhammaystiran oo la ogaaday/mL (±SE).
Marka xigta, waxaan baarnay asalka ccfDNA ee mussels-ka laga soo ururiyey sariiraha mussel ee Jasiiradaha Kerguelen, oo ah koox fog oo jasiirado ah oo leh saameyn xaddidan oo ku saabsan aadanaha. Ujeeddadaas awgeed, cccDNA laga soo qaado mussel hemolymphs-ka waxaa lagu go'doomiyay oo lagu nadiifiyay habab caadi ahaan loo isticmaalo in lagu nadiifiyo cccDNA aadanaha [32, 33]. Waxaan ogaanay in celceliska fiirsashada ccfDNA ee hemolymph ee mussels-ka ay ku jiraan micrograms hooseeya halkii ml ee hemolymph (fiiri Jadwalka S2, Macluumaadka Dheeraadka ah). Kala duwanaanshaha fiirsashada ayaa aad uga weyn dadka caafimaadka qaba (nanograms hooseeya halkii millilitir), laakiin xaalado naadir ah, bukaanada kansarka, heerka ccfDNA wuxuu gaari karaa dhowr micrograms halkii millilitir [34, 35]. Falanqaynta qaybinta cabbirka ee hemolymph ccfDNA waxay muujisay in jajabyadani ay aad u kala duwan yihiin cabbirkooda, oo u dhexeeya 1000 bp ilaa 1000 bp. ilaa 5000 bp (Jaantuska 2). Natiijooyin la mid ah ayaa laga helay iyadoo la adeegsanayo Qalabka Baarayaasha QIAamp ee ku salaysan silica, oo ah hab caadi ahaan loo isticmaalo sayniska dambi baarista si si dhakhso ah loogu kala saaro loona nadiifiyo DNA-da genomic-ga laga soo qaado muunadaha DNA-da ee xoogga yar, oo ay ku jiraan ccfDNA [36].
Elektrophoregram-ka ccfDNA ee matalaya hemolymph-ka mussel. Waxaa laga soo saaray NucleoSnap Plasma Kit (kor) iyo Qalabka Baarayaasha DNA-da QIAamp. Sawirka B ee violin oo muujinaya qaybinta fiirsashada hemolymph ccfDNA (±SE) ee mussels-ka. Khadadka madow iyo casaanka waxay matalaan rubucyada dhexe iyo kuwa koowaad iyo saddexaad, siday u kala horreeyaan.
Qiyaastii 1% ccfDNA ee aadanaha iyo xayawaanku waxay leeyihiin ilo shisheeye [21, 37]. Marka la eego nidaamka wareegga dhiigga ee nus-furan ee bivalves, biyaha badda ee hodanka ku ah microbial, iyo qaybinta cabbirka mussel ccfDNA, waxaan qiyaasnay ​​in mussel hemolymph ccfDNA ay ku jiri karto barkad qani ah oo kala duwan oo DNA microbial ah. Si aan u tijaabino mala-awaalkan, waxaan isku xigxignay hemolymph ccfDNA laga soo qaaday muunado Aulacomya atra ah oo laga soo ururiyay Jasiiradaha Kerguelen, iyagoo soo saaray in ka badan 10 milyan oo akhris, 97.6% kuwaas oo ka gudbay xakamaynta tayada. Akhrinta waxaa markaa loo kala saaray iyadoo loo eegayo ilo iskood ah iyo kuwa aan iskood ahayn iyadoo la adeegsanayo xogta BLASTN iyo NCBI bivalve (Jaantuska S1, Macluumaadka Dheeraadka ah).
Aadanaha, DNA-da nukliyeerka iyo mitochondrial-ka labadaba waxaa lagu sii deyn karaa dhiigga [38]. Si kastaba ha ahaatee, daraasaddan hadda socota, ma suurtogal ahayn in si faahfaahsan loo sharaxo DNA-da hidde-sideyaasha nukliyeerka ee mussels, maadaama aan la isku xigxigin ama la sharaxin hidde-sideyaasha A. atra. Si kastaba ha ahaatee, waxaan awoodnay inaan aqoonsanno tiro jajabyo ccfDNA ah oo asalkeenna ah annagoo adeegsanayna maktabadda bivalve (Jaantuska S2, Macluumaadka Dheeraadka ah). Waxaan sidoo kale xaqiijinnay jiritaanka jajabyada DNA-da ee asalkeenna ah annagoo adeegsanayna kor u qaadista PCR ee hidde-sideyaasha A. atra ee isku xigxigay (Jaantuska 3). Sidoo kale, maadaama hidde-sideyaasha mitochondrial-ka ee A. atra laga heli karo xogta dadweynaha, qofku wuxuu heli karaa caddayn muujinaysa jiritaanka jajabyada ccfDNA ee mitochondrial-ka ee hemolymph-ka A. atra. Joogitaanka jajabyada DNA-da mitochondrial-ka waxaa xaqiijiyay kor u qaadista PCR (Jaantuska 3).
Hiddo-sidayaasha kala duwan ee mitochondrial-ka ayaa ku jiray hemolymph-ka A. atra (dhibco cas - lambarka kaydka: SRX5705969) iyo M. platensis (dhibco buluug ah - lambarka kaydka: SRX5705968) oo lagu xoojiyay PCR. Jaantuska laga soo qaatay Breton et al., 2011 B Kordhinta dheecaanka hemolymph ee ka yimid A. atra Lagu kaydiyay warqadda FTA. Isticmaal feer 3 mm ah si aad si toos ah ugu darto tuubada PCR ee ka kooban isku darka PCR.
Marka la eego tirada badan ee microbial-ka ee ku jirta biyaha badda, waxaan markii hore diiradda saarnay astaamaha taxanaha DNA-da microbial-ka ee hemolymph. Si tan loo sameeyo, waxaan isticmaalnaa laba xeeladood oo kala duwan. Istaraatiijiyadda koowaad waxay adeegsatay Kraken2, oo ah barnaamij kala-soocid taxane ah oo ku salaysan algorithm kaas oo aqoonsan kara taxanaha microbial-ka oo leh saxnaan la mid ah BLAST iyo qalab kale [28]. In ka badan 6719 akhrin ayaa la go'aamiyay inay asal ahaan ka soo jeedaan bakteeriyada, halka 124 iyo 64 ay ka yimaadeen archaea iyo fayrasyo, siday u kala horreeyaan (Jaantuska 4). Qaybaha DNA-da bakteeriyada ugu badan waxay ahaayeen Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), iyo Bacteroidetes (17%) (Jaantuska 4a). Qaybintani waxay la jaan qaadaysaa daraasadihii hore ee microbiome-ka buluugga ah ee badda [39, 40]. Gammaproteobacteria waxay ahaayeen nooca ugu weyn ee Proteobacteria (44%), oo ay ku jiraan Vibrionales badan (Jaantuska 4b). Habka ddPCR wuxuu xaqiijiyay jiritaanka jajabyada DNA-da Vibrio ee ccfDNA ee A. atra hemolymph (Sawirka 4c) [41]. Si loo helo macluumaad dheeraad ah oo ku saabsan asalka bakteeriyada ee ccfDNA, hab dheeraad ah ayaa la qaatay (Sawirka S2, Macluumaadka Dheeraadka ah). Xaaladdan, akhrinta is dulsaaran waxaa loo soo ururiyey akhrinta dhammaadka lammaane waxaana loo kala saaray inay yihiin is-afgarad (bivalves) ama asal aan is-afgarad ahayn iyadoo la adeegsanayo BLASTN iyo qiimaha e ee 1e−3 iyo goyn leh >90% isku mid ah. Xaaladdan, akhrinta is dulsaaran waxaa loo soo ururiyey akhrinta dhammaadka lammaane waxaana loo kala saaray inay yihiin is-afgarad (bivalves) ama asal aan is-afgarad ahayn iyadoo la adeegsanayo BLASTN iyo qiimaha e ee 1e−3 iyo goyn leh >90% isku mid ah. Комментарии к видео: (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению Xaaladdan, akhrinta is dulsaaran waxaa loo soo ururiyay akhrinno lammaane ah waxaana loo kala saaray inay yihiin kuwo asal ah (bivalve) ama aan asal ahayn iyadoo la adeegsanayo BLASTN iyo qiimaha e ee 1e-3 iyo goynta oo leh >90% isku mid ah.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在使况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配同源性 的 分类 自身（双 壳类） 非 自身。 Комментарии к видео: (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению Xaaladdan oo kale, akhrinta is dulsaaran waxaa loo soo ururiyay akhrinno lammaane ah waxaana loo kala saaray inay yihiin kuwo gaar ah (bivalves) ama aan asal ahayn iyadoo la adeegsanayo qiimaha e BLASTN iyo 1e-3 ​​iyo heerka isku midka ah oo ka badan 90%.Maadaama aan weli la isku xigxigin hiddo-wadaha A. atra, waxaan isticmaalnay istaraatiijiyadda isku-darka de novo ee isku-darka MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Wadarta 147,188 contigs ayaa loo aqoonsaday inay yihiin kuwo ku tiirsan (bivalves) oo asal ahaan ka soo jeeda. Contigs-yadan ayaa markaa lagu qarxiyay qiimayaal e-qiimo ah oo ah 1e-10 iyadoo la adeegsanayo BLASTN iyo BLASTX. Istaraatiijiyadani waxay noo ogolaatay inaan aqoonsanno 482 jajab oo aan laba-geesood ahayn oo ku jira A. atra ccfDNA. In ka badan kala bar (57%) jajabyadan DNA-da waxaa laga helay bakteeriyada, inta badan laga helay walxaha gill symbionts, oo ay ku jiraan walxaha sulfotrophic symbionts, iyo walxaha gill symbionts Solemya velum (Jaantuska 5).
Tirada qaraabada ah ee heerka nooca. B Kala duwanaanshaha microbial ee laba phyla oo waaweyn (Firmicutes iyo Proteobacteria). Kordhinta matalaadda ddPCR C Vibrio spp. A. Jajabyada hidda-wadaha 16S rRNA (buluug) ee saddex hemolymphs atra.
Wadarta guud ee 482 jeer oo la ururiyay ayaa la falanqeeyay. Astaanta guud ee qaybinta taxonomic ee qoraallada metagenomic contig (prokaryotes iyo eukaryotes). B Qaybinta faahfaahsan ee jajabyada DNA-da bakteeriyada ee lagu aqoonsaday BLASTN iyo BLASTX.
Falanqaynta Kraken2 waxay sidoo kale muujisay in mussel ccfDNA ay ku jirtay jajabyo DNA ah oo duug ah, oo ay ku jiraan jajabyo DNA ah oo Euryarchaeota ah (65%), Crenarchaeota (24%), iyo Thaurmarcheota (11%) (Jaantuska 6a). Joogitaanka jajabyada DNA-da ee laga soo qaatay Euryarchaeota iyo Crenarchaeota, oo hore looga helay bulshada microbial ee mussels-ka California, waa inaysan noqon wax lala yaabo [42]. Inkasta oo Euryarchaeota badanaa lala xiriiriyo xaalado ba'an, haddana waxaa la aqoonsan yahay in labada Euryarchaeota iyo Crenarcheota ay ka mid yihiin prokaryotes-ka ugu badan ee deegaanka cryogenic-ga badda [43, 44]. Joogitaanka noolaha methanogenic ee mussels-ka ma aha wax lala yaabo, marka la eego warbixinnada dhowaan la soo saaray ee daadashada methane ee ballaaran ee ka soo daadashada hoose ee dhulka Kerguelen [45] iyo wax soo saarka methane-ka microbial ee suurtagalka ah ee laga arkay xeebta Jasiiradaha Kerguelen [46].
Dabadeed fiiro gaar ah ayaan u yeelanay akhrinta fayrasyada DNA-da. Inta aan ognahay, kani waa daraasaddii ugu horreysay ee aan bartilmaameedka lahayn ee ku saabsan waxa ku jira fayraska mussels-ka. Sida la filayay, waxaan helnay jajabyo DNA ah oo bakteeriyada ah (Caudovirales) (Sawirka 6b). Si kastaba ha ahaatee, DNA-da fayraska ugu badan waxay ka timaaddaa phylum of nucleocytoviruses, oo sidoo kale loo yaqaan fayraska DNA-da weyn ee cytoplasmic (NCLDV), kaas oo leh genome-ka ugu weyn ee fayras kasta. Gudaha phylum-kan, inta badan taxanaha DNA-da waxay ka tirsan yihiin qoysaska Mimimidoviridae (58%) iyo Poxviridae (21%), oo martigeliyayaashooda dabiiciga ah ay ka mid yihiin laf-dhabarta iyo arthropods, halka qayb yar oo ka mid ah taxanaha DNA-da ay ka tirsan yihiin algae virological oo la yaqaan. Waxay saameysaa algae-ga badda eukaryotic. Taxanaha waxaa sidoo kale laga helay fayraska Pandora, fayraska weyn ee leh cabbirka genome-ka ugu weyn ee nooc kasta oo fayras ah oo la yaqaan. Waxaa xiiso leh, kala duwanaanshaha martida loo yaqaan inay qaadeen fayraska, sida lagu go'aamiyay taxanaha hemolymph ccfDNA, waxay ahayd mid aad u weyn (Jaantuska S3, Macluumaadka Dheeraadka ah). Waxaa ku jira fayrasyada ku dhaca cayayaanka sida Baculoviridae iyo Iridoviridae, iyo sidoo kale fayrasyada ku dhaca amoeba, algae iyo laf-dhabarta. Waxaan sidoo kale helnay taxane la mid ah genome-ka Pithovirus sibericum. Pitoviruses (oo sidoo kale loo yaqaan "fayrasyada zombie") waxaa markii ugu horreysay laga soocay permafrost 30,000 sano jir ah oo ku yaal Siberia [47]. Sidaa darteed, natiijooyinkayagu waxay la jaan qaadayaan warbixinnadii hore ee muujinaya in dhammaan noocyada casriga ah ee fayrasyadani aysan dabar go'in [48] iyo in fayrasyadani ay ku jiri karaan nidaamyada deegaanka badda ee fog ee subarctic.
Ugu dambeyntii, waxaan tijaabinay si aan u aragno inaan heli karno jajabyo DNA ah oo ka yimid xayawaanno kale oo unugyo badan leh. Wadarta guud ee 482 cudur oo shisheeye ah ayaa lagu aqoonsaday BLASTN iyo BLASTX oo leh maktabado nt, nr iyo RefSeq ah (genomic iyo protein). Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in qaybaha shisheeye ee ccfDNA ee xayawaanka unugyada badan leh DNA-da lafaha lafaha ayaa ku badan (Jaantuska 5). Qaybo DNA ah oo ka yimid cayayaanka iyo noocyada kale ayaa sidoo kale la helay. Qayb weyn oo ka mid ah jajabyada DNA-da lama aqoonsan, waxaa laga yaabaa inay ugu wacan tahay matalaad la'aanta tirada badan ee noocyada badda ee ku jira xogta hidde-sideyaasha marka loo eego noocyada dhulka [49].
Warqaddan hadda jirta, waxaan ku dabaqaynaa fikradda LB mussels, annagoo ku doodayna in taxanaha tallaalka hemolymph ccfDNA uu bixin karo aragti ku saabsan qaab-dhismeedka nidaamyada deegaanka xeebaha badda. Gaar ahaan, waxaan ogaanay in 1) mussel hemolymph uu ka kooban yahay xaddi badan (heerar microgram ah) oo ah jajabyo DNA oo wareegaya oo aad u weyn (~1-5 kb); 2) jajabyadan DNA-da labaduba waa kuwo madax-bannaan oo aan madax-bannaanayn 3) Ilaha shisheeye ee jajabyadan DNA-da, waxaan ka helnay DNA-da bakteeriyada, qadiimiga iyo fayraska, iyo sidoo kale DNA-da xayawaanka kale ee unugyada badan; 4) Ururinta jajabyadan ccfDNA ee shisheeye ee hemolymph si dhakhso ah ayay u dhacdaa waxayna gacan ka geysataa dhaqdhaqaaqa shaandhaynta gudaha ee mussels. Gunaanadkii, daraasaddeennu waxay muujinaysaa in fikradda LB, oo ilaa hadda inta badan lagu dabaqay cilmiga bayoolojiga, ay dejiso il aqoon oo hodan ah laakiin aan la sahamin oo loo isticmaali karo in si fiican loo fahmo isdhexgalka noocyada sentinel iyo deegaankooda.
Marka laga soo tago xayawaanada duurjoogta ah, go'doominta ccfDNA ayaa laga soo sheegay naasleyda, oo ay ku jiraan jiirarka, eeyaha, bisadaha, iyo fardaha [50, 51, 52]. Si kastaba ha ahaatee, inta aan ognahay, daraasaddeennu waa tii ugu horreysay ee soo sheegta ogaanshaha iyo isku xigxiga ccfDNA ee noocyada badda iyadoo leh nidaam wareeg furan. Sifadan qaab-dhismeedka iyo awoodda shaandhaynta ee mussels waxay, ugu yaraan qayb ahaan, sharxi kartaa astaamaha cabbirka kala duwan ee jajabyada DNA-da ee wareegaya marka loo eego noocyada kale. Aadanaha, inta badan jajabyada DNA-da ee ku wareegaya dhiigga waa jajabyo yaryar oo cabbirkoodu u dhexeeyo 150 ilaa 200 bp. iyadoo ugu badnaan ay tahay 167 bp [34, 53]. Qayb yar laakiin muhiim ah oo ka mid ah jajabyada DNA-da ayaa u dhexeeya 300 iyo 500 bp cabbir ahaan, qiyaastii 5% waxay ka dheer yihiin 900 bp. [54]. Sababta qaybinta cabbirkan ayaa ah in isha ugu weyn ee ccfDNA ee plasma-ga ay ka dhalato dhimashada unugyada, ha ahaato dhimashada unugyada ama sabab u ah necrosis unugyada dhiigga ku wareegaya ee shakhsiyaadka caafimaadka qaba ama sabab u ah apoptosis unugyada burooyinka ee bukaanada kansarka (oo loo yaqaan DNA-da burooyinka wareegaya). , ctDNA). Qaybinta cabbirka ee hemolymph ccfDNA ee aan ka helnay mussels waxay u dhaxaysay 1000 ilaa 5000 bp, taasoo soo jeedinaysa in mussel ccfDNA uu leeyahay asal ka duwan. Tani waa mala-awaal macquul ah, maadaama mussels ay leeyihiin nidaam xidid oo nus-furan waxayna ku nool yihiin deegaannada biyaha badda oo ay ku jiraan xaddi badan oo DNA-da hidde-sideyaasha microbial ah. Xaqiiqdii, tijaabooyinkayada shaybaarka ee isticmaalaya DNA-da dibadda ah ayaa muujiyay in mussels ay ku ururaan jajabyada DNA-da biyaha badda, ugu yaraan saacado yar ka dib waxay burburaan ka dib qaadashada unugyada iyo/ama la sii daayo iyo/ama lagu kaydiyo ururo kala duwan. Marka la eego naadirnimada unugyada (labadaba prokaryotic iyo eukaryotic), isticmaalka qaybaha gudaha ee valvular-ka ayaa yarayn doona xaddiga ccfDNA ee ka yimaada ilo-is-weydaarsiyada iyo sidoo kale ilo-wareedyada shisheeye. Marka la eego muhiimadda difaaca jirka ee bivalve iyo tirada badan ee phagocytes-ka wareegaya, waxaan sii saadaalinay in xitaa ccfDNA shisheeye ay ku badan tahay phagocytes-ka wareegaya kuwaas oo ururiya DNA-da shisheeye marka la cuno noolaha yaryar iyo/ama haraaga unugyada. Marka la isku soo wada duubo, natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in bivalve hemolymph ccfDNA ay tahay kayd gaar ah oo macluumaadka molecular-ka ah waxayna xoojisaa xaaladdooda ah noocyada sentinel-ka.
Xogtayadu waxay tilmaamaysaa in isku xigxiga iyo falanqaynta jajabyada ccfDNA ee hemolymph ee laga helo bakteeriyada ay bixin karaan macluumaad muhiim ah oo ku saabsan flora bakteeriyada martida loo yahay iyo bakteeriyada ku jirta nidaamka deegaanka badda ee ku xeeran. Farsamooyinka isku xigxiga ee toogashada ayaa shaaca ka qaaday taxanaha bakteeriyada isku-dhafan ee A. atra gill oo la seegi lahaa haddii la isticmaali lahaa hababka aqoonsiga 16S rRNA ee caadiga ah, taasoo qayb ahaan sabab u ah eex maktabad tixraac ah. Xaqiiqdii, isticmaalka xogta LB ee laga soo ururiyay M. platensis ee isla lakabka mussel ee Kerguelen wuxuu muujiyay in isku-dhafka walxaha bakteeriyada ee la xiriira gill ay isku mid ahaayeen labada nooc ee mussel (Jaantuska S4, Macluumaadka Dheeraadka ah). Isku ekaanshahan laba mussels oo hidde ahaan kala duwan ayaa laga yaabaa inay ka tarjumayaan isku-dhafka bulshooyinka bakteeriyada ee ku jira kaydka qabow, sulfurous, iyo foolkaanaha ee Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Heerarka sare ee noolaha yareeya sulfur-ka ayaa si fiican loogu sharraxay markii la goosanayay mussels meelaha xeebaha ee bayoolaji ah [59], sida xeebta Port-au-France. Suurtagal kale ayaa ah in dhirta mussel-ka ee commensal ay saameyn karto gudbinta toosan [60, 61]. Cilmi-baaris dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo go'aamiyo isku xirnaanta ka dhaxaysa deegaanka badda, dusha sare ee badda, iyo isku-dhafka bakteeriyada isku-dhafan ee mussels-ka. Daraasadahani hadda way socdaan.
Dhererka iyo fiirsashada hemolymph ccfDNA, fudeydkeeda nadiifinta, iyo tayada sare si loogu oggolaado isku xigxiga qoryaha darandooriga u dhaca ayaa ah qaar ka mid ah faa'iidooyinka badan ee isticmaalka mussel ccfDNA si loo qiimeeyo kala duwanaanshaha noolaha ee nidaamyada deegaanka xeebaha badda. Habkani wuxuu si gaar ah waxtar ugu leeyahay qeexidda bulshooyinka fayraska (viromes) ee ku jira nidaam deegaan oo la bixiyay [62, 63]. Si ka duwan bakteeriyada, archaea, iyo eukaryotes, hidde-sideyaasha fayrasku kuma jiraan hidde-sideyaal la ilaaliyo sida taxanaha 16S. Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in biopsies dareere ah oo ka yimid noocyada tilmaamayaasha sida mussels loo isticmaali karo in lagu aqoonsado tiro badan oo jajabyada fayraska ccfDNA ah oo loo yaqaan inay ku dhacaan martigeliyeyaasha kuwaas oo caadiyan ku nool nidaamyada deegaanka badda ee xeebaha. Tan waxaa ka mid ah fayrasyada loo yaqaan inay ku dhacaan protozoa, arthropods, cayayaanka, dhirta, iyo fayrasyada bakteeriyada (tusaale ahaan, bakteeriyada). Qaybin la mid ah ayaa la helay markii aan baarnay fayraska hemolymph ccfDNA ee mussels buluugga ah (M. platensis) oo lagu soo ururiyay isla lakabka mussel ee Kerguelen (Jadwalka S2, Macluumaadka Dheeraadka ah). Taxanaha qoriga ee ccfDNA runtii waa hab cusub oo kordhiya kobaca daraasadda fayraska aadanaha ama noocyada kale [21, 37, 64]. Habkani wuxuu si gaar ah waxtar ugu leeyahay barashada fayraska DNA-da laba-laaban, maadaama aan hal hiddo-wade lagu ilaalin dhammaan fayrasyada DNA-da laba-laaban, taasoo matalaysa nooca ugu kala duwan uguna ballaaran ee fayrasyada ee Baltimore [65]. Inkasta oo inta badan fayrasyadani aan la kala saarin oo ay ku jiri karaan fayrasyo ​​ka yimid qayb gebi ahaanba aan la garanayn oo ka mid ah adduunka fayraska [66], waxaan ogaanay in fayrasyada iyo noocyada martida loo yahay ee mussels A. atra iyo M. platensis ay u dhexeeyaan labada nooc. si la mid ah (fiiri jaantuska S3, macluumaad dheeraad ah). Isku ekaanshahani ma aha mid la yaab leh, maadaama ay muujin karto la'aanta xulashada qaadashada DNA-da ee ku jirta deegaanka. Daraasado mustaqbalka ah oo la adeegsanayo RNA la safeeyey ayaa hadda loo baahan yahay si loo garto fayraska RNA.
Daraasaddeenna, waxaan isticmaalnay tuubo aad u adag oo laga soo qaatay shaqada Kowarski iyo asxaabtiisa [37], kuwaas oo isticmaalay tirtirid laba-tallaabo ah oo ah akhrinta iyo isku-xidhka la isku daray ka hor iyo ka dib isu-imaatinka ccfDNA-da asalka ah, taasoo keentay qayb sare oo akhrin aan la kharibin. Sidaa darteed, ma diidi karno in qaar ka mid ah akhrinta aan la kharibin ay wali leeyihiin asal u gaar ah, ugu horreyn sababtoo ah ma hayno hiddo-wadaha tixraaca ee nooca mussel-kan. Waxaan sidoo kale u isticmaalnay dhuumahan sababtoo ah waxaan ka walaacsanayn chimeras-ka u dhexeeya akhrinta nafta iyo kuwa aan nafta ahayn iyo dhererka akhriska ee ay soo saarto Illumina MiSeq PE75. Sabab kale oo badan oo akhrinta aan la kharibin ayaa ah in inta badan microbes-ka badda, gaar ahaan meelaha fogfog sida Kerguelen, aan la sharxin. Waxaan isticmaalnay Illumina MiSeq PE75, annagoo u qaadanayna dhererka jajabka ccfDNA oo la mid ah ccfDNA aadanaha. Daraasadaha mustaqbalka, marka la eego natiijooyinkayaga muujinaya in hemolymph ccfDNA ay leedahay akhris ka dheer aadanaha iyo/ama naasleyda, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho madal isku xigxigta oo ku habboon jajabyada ccfDNA ee dheer. Dhaqankani wuxuu aad u fududayn doonaa in la aqoonsado tilmaamo badan oo loogu talagalay falanqayn qoto dheer. Helitaanka taxanaha hidde-sideyaasha nukliyeerka A. atra ee dhammaystiran ee aan hadda la heli karin ayaa sidoo kale si weyn u fududeyn doona kala soocidda ccfDNA laga helo ilo nafeed iyo kuwa aan nafteed ahayn. Maadaama cilmi-baariskayagu uu diiradda saaray suurtagalnimada in fikradda baaritaanka dareeraha ah ee mussels-ka loo adeegsado mussels-ka, waxaan rajeyneynaa in maadaama fikraddan loo isticmaalo cilmi-baarista mustaqbalka, qalab cusub iyo dhuumaha la horumarin doono si loo kordhiyo awoodda habkan si loo barto kala duwanaanshaha microbial ee mussels-ka. nidaamka deegaanka badda.
Maadaama ay tahay calaamad muujinaysa kiliinikada aan duullaan ahayn, heerarka sare ee plasma-ga aadanaha ee ccfDNA waxay la xiriiraan cudurro kala duwan, dhaawaca unugyada, iyo xaaladaha walbahaarka [67,68,69]. Kordhintani waxay la xiriirtaa sii deynta jajabyada DNA-da ee asal ahaan ka soo jeeda ka dib dhaawaca unugyada. Waxaan wax ka qabanay arrintan annagoo adeegsanayna cadaadiska kulaylka daran, kaas oo mussels-ku si kooban loogu soo bandhigay heerkul dhan 30 °C. Waxaan ku sameynay falanqayntan saddex nooc oo mussels ah saddex tijaabo oo madax-bannaan. Si kastaba ha ahaatee, ma aanan helin wax isbeddel ah oo ku yimid heerarka ccfDNA ka dib cadaadiska kulaylka daran (fiiri Jaantuska S5, macluumaad dheeraad ah). Daahfurkan wuxuu sharxi karaa, ugu yaraan qayb ahaan, xaqiiqda ah in mussels-ku ay leeyihiin nidaam wareeg ah oo nus-furan oo ay ururiyaan xaddi badan oo DNA shisheeye ah sababtoo ah firfircoonidooda shaandhaynta sare. Dhanka kale, mussels-ka, sida laf-dhabarta badan, waxay u adkeysan karaan dhaawaca unugyada ee ay keento walbahaarka, taasoo xaddidaysa sii deynta ccfDNA ee hemolymph-kooda [70, 71].
Ilaa hadda, falanqaynta DNA-da ee kala duwanaanshaha noolaha ee nidaamyada biyaha ayaa inta badan diiradda saartay metabarcode-ka DNA-da deegaanka (eDNA). Si kastaba ha ahaatee, habkani badanaa wuu xaddidan yahay falanqaynta kala duwanaanshaha noolaha marka la isticmaalo primers. Isticmaalka taxanaha qoriga ayaa ka gudbaya xaddidaadaha PCR iyo xulashada eexda ee qaybaha primers-ka. Sidaa darteed, macno ahaan, habkayagu wuxuu u dhow yahay habka taxanaha qoriga eDNA ee aadka loo isticmaalay ee dhawaan la isticmaalay, kaas oo awood u leh inuu si toos ah u kala saaro DNA-da kala qaybsan oo uu falanqeeyo ku dhawaad ​​​​dhammaan noolaha [72, 73]. Si kastaba ha ahaatee, waxaa jira dhowr arrimood oo aasaasi ah oo kala soocaya LB iyo hababka eDNA ee caadiga ah. Dabcan, farqiga ugu weyn ee u dhexeeya eDNA iyo LB waa isticmaalka martigeliyeyaasha shaandhada dabiiciga ah. Isticmaalka noocyada badda sida isbuunyada iyo bivalves (Dresseina spp.) oo ah shaandho dabiici ah oo loogu talagalay barashada eDNA ayaa la soo sheegay [74, 75]. Si kastaba ha ahaatee, daraasadda Dreissena waxay isticmaashay bayoolojiyada unugyada ee laga soo saaray DNA-da. Falanqaynta ccfDNA ee LB uma baahna baaritaanka unugyada, qalab gaar ah oo mararka qaar qaali ah iyo saadka la xiriira eDNA ama baaritaanka unugyada. Xaqiiqdii, dhawaan waxaan soo sheegnay in ccfDNA laga helo LB lagu kaydin karo oo lagu falanqeyn karo taageerada FTA iyada oo aan la ilaalin silsilad qabow, taas oo ah caqabad weyn oo cilmi-baarista meelaha fogfog ah [76]. Soo saarista ccfDNA ee baaritaanka dareeraha ah sidoo kale waa mid fudud waxayna bixisaa DNA tayo sare leh oo loogu talagalay taxanaha qoryaha iyo falanqaynta PCR. Tani waa faa'iido weyn marka la eego qaar ka mid ah xaddidaadaha farsamo ee la xiriira falanqaynta eDNA [77]. Fududeynta iyo kharashka yar ee habka muunad qaadista ayaa sidoo kale si gaar ah ugu habboon barnaamijyada kormeerka muddada dheer. Marka laga soo tago awooddooda shaandhaynta sare, astaamo kale oo caan ah oo ka mid ah bivalves waa halabuurka kiimikada mucopolysaccharide ee xabkooda, kaas oo kor u qaada nuugista fayrasyada [78, 79]. Tani waxay ka dhigaysaa bivalves shaandho dabiici ah oo ku habboon si loo garto kala duwanaanshaha noolaha iyo saameynta isbeddelka cimilada ee nidaamka deegaanka biyaha ee la bixiyay. In kasta oo jiritaanka jajabyada DNA-da ee laga soo qaatay martida loo arki karo inay tahay xaddidaad habka marka la barbar dhigo eDNA, kharashka la xiriira haysashada ccfDNA-da asalka ah marka loo eego eDNA waa mid si isku mid ah loo fahmi karo tirada badan ee macluumaadka laga heli karo daraasadaha caafimaadka. offset host. Tan waxaa ka mid ah joogitaanka taxanaha fayraska ee ku dhex jira hidde-sideyaasha martida loo yahay. Tani waxay si gaar ah muhiim ugu tahay mussels-ka, marka la eego jiritaanka retroviruses leukemic ee si toosan loogu gudbiyo bivalves [80, 81]. Faa'iido kale oo LB ka badan eDNA ayaa ah inay ka faa'iidaysato dhaqdhaqaaqa phagocytic ee unugyada dhiigga ee wareegaya ee hemolymph, kaas oo ku milma noolaha yaryar (iyo genome-yadooda). Phagocytosis waa shaqada ugu weyn ee unugyada dhiigga ee bivalves [82]. Ugu dambeyntii, habku wuxuu ka faa'iidaysanayaa awoodda shaandhaynta sare ee mussels (celcelis ahaan 1.5 l/h oo biyo badda ah) iyo wareegga laba maalmood ah, kaas oo kordhiya isku darka lakabyada kala duwan ee biyaha badda, taasoo u oggolaanaysa qabashada eDNA heterologous. [83, 84]. Sidaa darteed, falanqaynta mussel ccfDNA waa waddo xiiso leh marka la eego saameynta nafaqada, dhaqaalaha, iyo deegaanka ee mussels. Sida falanqaynta LB ee laga soo ururiyey aadanaha, habkani wuxuu sidoo kale furayaa suurtagalnimada in la cabbiro isbeddellada hidde-sideyaasha iyo epigenetic-ga ee DNA-da martida loo yahay si looga jawaabo walxaha dibadda ka soo jeeda. Tusaale ahaan, tiknoolajiyada taxanaha jiilka saddexaad ayaa la saadaalin karaa inay sameeyaan falanqaynta methylation-ka genome-ka oo dhan ee ccfDNA-da asalka ah iyadoo la adeegsanayo taxanaha nanopore. Habkani waa in lagu fududeeyaa xaqiiqda ah in dhererka jajabyada ccfDNA ee mussel uu si fiican ula jaanqaado goobaha taxanaha ee la akhriyey ee u oggolaanaya falanqaynta methylation-ka DNA-da oo dhan hal mar oo taxane ah iyada oo aan loo baahnayn isbeddellada kiimikada.85,86] Tani waa suurtagal xiiso leh, maadaama la muujiyay in qaababka methylation-ka DNA-du ay ka tarjumayaan jawaab celinta walbahaarka deegaanka oo ay sii jiraan jiilal badan. Sidaa darteed, waxay bixin kartaa aragti qiimo leh oo ku saabsan hababka hoose ee maamula jawaabta ka dib soo-gaadhista isbeddelka cimilada ama wasakhowga [87]. Si kastaba ha ahaatee, isticmaalka LB ma aha mid aan xaddidnayn. Looma baahna in la yiraahdo, tani waxay u baahan tahay joogitaanka noocyada tilmaamayaasha ee ku jira nidaamka deegaanka. Sida kor ku xusan, isticmaalka LB si loo qiimeeyo kala duwanaanshaha noolaha ee nidaam la bixiyay waxay sidoo kale u baahan tahay dhuumaha bioinformatics ee adag kaas oo tixgelinaya jiritaanka jajabyada DNA-da ee ka imanaya isha. Dhibaato kale oo weyn ayaa ah helitaanka hidde-sideyaasha tixraaca ee noocyada badda. Waxaa la rajeynayaa in dadaallada sida Mashruuca Hidde-sidayaasha Naasleyda Badda iyo mashruuca Fish10k ee dhawaan la aasaasay [88] ay fududeyn doonaan falanqaynta noocaas ah mustaqbalka. Adeegsiga fikradda LB ee noolaha quudinta shaandhada badda ayaa sidoo kale la jaan qaadaya horumarkii ugu dambeeyay ee tignoolajiyada isku xigxiga, taasoo ka dhigaysa mid ku habboon horumarinta biomarkers-ka badan-ohm si ay u bixiyaan macluumaad muhiim ah oo ku saabsan caafimaadka deegaannada badda si looga jawaabo cadaadiska deegaanka.
Xogta taxanaha hidde-sideyaasha waxaa lagu shubay Taxanaha NCBI Akhri Kaydka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 iyadoo la raacayo Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Saamaynta isbeddelka cimiladu ku leedahay nolosha badda iyo nidaamyada deegaanka. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, iwm. Ka fiirso saameynta isku dhafan ee isbeddelka cimilada iyo walwalka kale ee maxalliga ah ee ku yeelan kara deegaanka badda. deegaanka sayniska guud. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, iyo al. ). Sayniska ugu horreeya ee March. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Dulqaadka kulaylka oo yaraada marka xaaladaha cadaadiska kulaylka ee soo noqnoqda ay sharxaan dhimashada xagaaga ee sare ee mussels buluugga ah. Warbixinta sayniska 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, iwm. Isbeddellada dhawaanahan ee ku yimid soo noqnoqoshada, sababaha iyo heerka dhimashada xayawaanka. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, iyo al. Waxyeelo badan oo aan nooc-gaar ah ahayn ayaa laga yaabaa inay sababeen dhimashada tirada badan ee Pinna nobilis. Nolosha. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Saamaynta suurtagalka ah ee isbeddelka cimiladu ku yeelan karo cudurrada xayawaanka ee Arctic. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mussels buluug ah (Mytilus edulis spp.) oo ah noolaha calaamadaha u ah la socodka wasakhowga xeebaha: dib u eegis. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Isku-darka baaritaanka dheecaanka ee daaweynta kansarka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, iwm. Bisaylka dheecaanka laga qaado: Waxay u oggolaanaysaa DNA-da burooyinka inay wareegto. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asiidhyada Nukliyeerka ee ku jira balaasmaha aadanaha. Kulanka daqiiqadaha shirkadaha hoos yimaada Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Door cusub oo loogu talagalay DNA-da aan unugyada lahayn oo ah calaamadeeye molecular ah oo loogu talagalay daaweynta kansarka. Tirada falanqaynta biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsy-ga dareeraha ah ayaa galaya xarunta caafimaadka - arrimaha hirgelinta iyo caqabadaha mustaqbalka. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW iyo kuwa kale. DNA-da uurjiifka waxay ku jirtaa balaasmaha hooyada iyo seeramka. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Daraasad ku saabsan habka uurka iyo dhibaatooyinkiisa iyadoo la adeegsanayo RNA-ga ka baxsan unugyada dhiigga haweenka inta lagu jiro uurka. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, iwm. Baaritaanka dareeraha ah: DNA-da unugyada deeq-bixiyeyaasha waxaa loo isticmaalaa in lagu ogaado nabarrada allogeneic ee ku jira tallaalka kelyaha. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Hal-abuurrada ku saabsan ogaanshaha cudurrada dhalmada ka hor: taxanaha hiddo-wadaha dhiigga hooyada. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, iwm. Ogaanshaha cudurka faafa ee degdegga ah iyadoo la adeegsanayo taxanaha metagenomic ee jiilka xiga ee dareeraha jirka ee cudurka qaba. Daawada Nat. 2021;27:115-24.