Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін сайтты стильдер мен JavaScriptсіз көрсетеміз.
Сұйық биопсия (СБ) - биомедициналық салада тез танымал болып келе жатқан тұжырымдама. Бұл тұжырымдама негізінен әртүрлі тіндерде жасуша өлімінен кейін негізінен ұсақ фрагменттер түрінде бөлінетін айналымдағы жасушадан тыс ДНҚ (ccfДНҚ) фрагменттерін анықтауға негізделген. Бұл фрагменттердің аз бөлігі бөгде (бөтен) тіндерден немесе организмдерден шығады. Ағымдағы жұмыста біз бұл тұжырымдаманы теңіз суының жоғары сүзу қабілетімен танымал күзетші түрі мидияларға қолдандық. Біз мидиялардың табиғи сүзгілер ретінде әрекет ету қабілетін теңіз жағалауындағы экожүйелердің биоәртүрлілігі туралы ақпарат беру үшін әртүрлі көздерден қоршаған ортаның ДНҚ фрагменттерін ұстап алу үшін пайдаланамыз. Біздің нәтижелеріміз мидия гемолимфасында мөлшері бойынша 1-ден 5 кб-қа дейін өзгеретін ДНҚ фрагменттері бар екенін көрсетеді. Мылтықпен секвенирлеу ДНҚ фрагменттерінің көпшілігі бөгде микробтық тектес екенін көрсетті. Олардың ішінде біз бактериялардан, археялардан және вирустардан, соның ішінде жағалаудағы теңіз экожүйелерінде жиі кездесетін әртүрлі иелерді жұқтыратыны белгілі вирустардан ДНҚ фрагменттерін таптық. Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз мидияларға қолданылатын LB тұжырымдамасы теңіз жағалауындағы экожүйелердегі микробтық әртүрлілік туралы бай, бірақ әлі зерттелмеген білім көзі екенін көрсетеді.
Климаттың өзгеруінің (КК) теңіз экожүйелерінің биоәртүрлілігіне әсері зерттеудің қарқынды дамып келе жатқан саласы болып табылады. Жаһандық жылыну тек маңызды физиологиялық күйзелістерді тудырып қана қоймай, сонымен қатар теңіз организмдерінің термиялық тұрақтылығының эволюциялық шектеулерін ығыстырады, бірқатар түрлердің тіршілік ету ортасына әсер етеді, оларды қолайлы жағдайларды іздеуге итермелейді [1, 2]. Метазоандардың биоәртүрлілігіне әсер етумен қатар, КК иесі мен микробтық өзара әрекеттесудің нәзік тепе-теңдігін бұзады. Бұл микробтық дисбактериоз теңіз экожүйелеріне үлкен қауіп төндіреді, себебі ол теңіз организмдерін жұқпалы патогендерге сезімтал етеді [3, 4]. СС жаппай өлімде маңызды рөл атқарады деп есептеледі, бұл жаһандық теңіз экожүйелерін басқару үшін күрделі мәселе болып табылады [5, 6]. Бұл көптеген теңіз түрлерінің экономикалық, экологиялық және тағамдық әсерін ескере отырып, маңызды мәселе. Бұл әсіресе полярлық аймақтарда тіршілік ететін қосжарнақты моллюскаларға қатысты, онда КК әсері жедел және ауыр болады [6, 7]. Шын мәнінде, Mytilus spp. сияқты қосжарнақты моллюскалар КК-ның теңіз экожүйелеріне әсерін бақылау үшін кеңінен қолданылады. Таңқаларлық емес, олардың денсаулығын бақылау үшін салыстырмалы түрде көп биомаркерлер жасалды, көбінесе ферментативті белсенділікке немесе жасушаның тіршілік қабілеті мен фагоцитарлық белсенділік сияқты жасушалық функцияларға негізделген функционалды биомаркерлерді қамтитын екі деңгейлі тәсіл қолданылады [8]. Бұл әдістерге теңіз суының көп мөлшерін сіңіргеннен кейін жұмсақ тіндерде жиналатын нақты қысым көрсеткіштерінің концентрациясын өлшеу де кіреді. Дегенмен, қосжарнақты моллюскалардың жоғары сүзу қабілеті және жартылай ашық қанайналым жүйесі пациенттерді басқарудың қарапайым және минималды инвазивті тәсілі болып табылатын сұйық биопсия (СБ) тұжырымдамасын қолдана отырып, жаңа гемолимфа биомаркерлерін әзірлеуге мүмкіндік береді. қан үлгілері [9, 10]. Адамның СБ-сында айналымдағы молекулалардың бірнеше түрін табуға болатын болса да, бұл тұжырымдама негізінен плазмадағы айналымдағы жасушадан тыс ДНҚ (ccfДНҚ) фрагменттерінің ДНҚ секвенирлеу талдауына негізделген. Шын мәнінде, адам плазмасында айналымдағы ДНҚ-ның болуы 20 ғасырдың ортасынан бері белгілі [11], бірақ тек соңғы жылдары ғана жоғары өнімділіктегі секвенирлеу әдістерінің пайда болуы ccfДНҚ негізінде клиникалық диагноз қоюға әкелді. Бұл айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің болуы ішінара жасуша өлімінен кейін геномдық ДНҚ-ның (ядролық және митохондриялық) пассивті түрде бөлінуіне байланысты. Дені сау адамдарда ккфДНҚ концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялары бар немесе стресске ұшыраған науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі. Дені сау адамдарда ккфДНҚ концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялары бар немесе стресске ұшыраған науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі. У здоровых адамдар концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), бірақ мүмкін повышься в 5-10 раз у үлкен патологиялық немесе подвергающихся стресске, приводящему к повреждению тканей. Дені сау адамдарда кккДНҚ концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл), бірақ әртүрлі патологиялары бар немесе тіндердің зақымдануына әкелетін стресс жағдайында ол 5-10 есе артуы мүмкін.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而毼致羻。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戗 戗中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍 损伍损伤Концентрации ccfDNA обычно азкие (<10 нг/мл) сізде адамдардың денсаулығына, бірақ мүмкін болуы мүмкін 5-10 раз науқастардың түрлі аурулары немесе стрессом, ол приводит к повреждению тканей. Дені сау адамдарда ккфДНҚ концентрациясы әдетте төмен (<10 нг/мл) болады, бірақ әртүрлі патологиялары немесе стрессі бар науқастарда 5-10 есе артуы мүмкін, бұл тіндердің зақымдалуына әкеледі.ccfДНҚ фрагменттерінің мөлшері кеңінен өзгереді, бірақ әдетте 150-ден 200 б.п.-ге дейін ауытқиды. [12]. Өздігінен алынған ccfДНҚ-ны, яғни қалыпты немесе трансформацияланған иесі жасушаларынан алынған ccfДНҚ-ны талдау ядролық және/немесе митохондриялық геномда болатын генетикалық және эпигенетикалық өзгерістерді анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін, осылайша клиниктерге нақты молекулалық-бағытталған терапияны таңдауға көмектеседі [13]. Дегенмен, ccfДНҚ-ны жүктілік кезіндегі ұрық жасушаларынан немесе трансплантацияланған мүшелерден алынған ccfДНҚ сияқты сыртқы көздерден алуға болады [14,15,16,17]. ccfДНҚ сонымен қатар инфекциялық агенттің (бөтен) нуклеин қышқылдарының болуын анықтау үшін маңызды ақпарат көзі болып табылады, бұл қан дақылдарымен анықталмаған кең таралған инфекцияларды инвазивті емес анықтауға мүмкіндік береді, жұқтырған тіндердің инвазивті биопсиясын болдырмауға мүмкіндік береді [18]. Жақында жүргізілген зерттеулер шынымен де адам қанында вирустық және бактериялық патогендерді анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін ақпараттың бай көзі бар екенін және адам плазмасында кездесетін ccfДНҚ-ның шамамен 1%-ы шетелдік тектес екенін көрсетті [19]. Бұл зерттеулер организмнің айналымдағы микробиомының биоәртүрлілігін ccfДНҚ талдауын қолдану арқылы бағалауға болатынын көрсетеді. Дегенмен, жақында ғана бұл ұғым тек адамдарда және аз дәрежеде басқа омыртқалыларда қолданылды [20, 21].
Осы мақалада біз 35 миллион жыл бұрын пайда болған үлкен үстірттің үстіндегі аралдар тобы болып табылатын субантарктикалық Кергелен аралдарында жиі кездесетін оңтүстік түр Aulacomya atra-ның ccfDNA-сын талдау үшін LB потенциалын пайдаланамыз. Жанартау атқылауы. In vitro эксперименттік жүйесін қолдана отырып, теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерінің мидиялармен тез сіңіп, гемолимфа бөліміне енетінін анықтадық. Мылтықпен секвенирлеу мидия гемолимфасы ccfDNA-да өзіндік және өздігінен емес ДНҚ фрагменттері, соның ішінде суық жанартау теңіз жағалауындағы экожүйелерге тән биомдардан алынған симбиотикалық бактериялар мен ДНҚ фрагменттері бар екенін көрсетті. Гемолимфа ccfDNA-да сонымен қатар әртүрлі ие диапазондары бар вирустардан алынған вирустық тізбектер бар. Біз сондай-ақ сүйекті балықтар, теңіз актиниялары, балдырлар және жәндіктер сияқты көп жасушалы жануарлардан алынған ДНҚ фрагменттерін таптық. Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз LB тұжырымдамасын теңіз омыртқасыздарына теңіз экожүйелерінде бай геномдық репертуар жасау үшін сәтті қолдануға болатынын көрсетеді.
Ересек балықтар (ұзындығы 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) және Aulacomya atra (A. atra) 2018 жылдың желтоқсанында Порт-о-Франстың (049°21.235 оңтүстік ендік, 070°13.490 шығыс ендік) тасты жағалауларынан жиналды. Басқа ересек көк мидиялар (Mytilus spp.) коммерциялық жеткізушіден (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард аралы, Канада) алынып, 10-20 л 32‰ жасанды тұзды суы бар (4°C) температурасы бақыланатын (4°C) аэрацияланған бакқа салынды. (жасанды теңіз тұзы Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, АҚШ). Әрбір тәжірибе үшін жеке бақалшақтардың ұзындығы мен салмағы өлшенді.
Бұл бағдарламаға арналған тегін ашық қолжетімділік хаттамасы онлайн режимінде қолжетімді (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Қысқаша айтқанда, LB гемолимфасы [22] сипатталғандай абдуктор бұлшықеттерінен жиналды. Гемолимфа 1200 × g температурада 3 минут бойы центрифугалау арқылы тазартылды, үстіңгі қабат қолданылғанға дейін мұздатылды (-20°C). cfDNA бөліп алу және тазарту үшін үлгілер (1,5-2,0 мл) өндірушінің нұсқауларына сәйкес NucleoSnap cfDNA жинағын (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) пайдаланып ерітіліп, өңделді. ccfDNA қосымша талдауға дейін -80°C температурада сақталды. Кейбір тәжірибелерде ccfDNA QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) көмегімен бөлініп алынды және тазартылды. Тазартылған ДНҚ стандартты PicoGreen талдауын пайдаланып сандық анықталды. Бөлінген ccfДНҚ фрагменттерінің таралуы жоғары сезімталдықтағы ДНҚ жинағын пайдалана отырып, Agilent 2100 биоанализаторын (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) пайдаланып капиллярлық электрофорез арқылы талданды. Талдау өндірушінің нұсқауларына сәйкес 1 мкл ccfДНҚ үлгісін пайдаланып жүргізілді.
Гемолимфа ccfДНҚ фрагменттерін секвенирлеу үшін Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 жинағының Illumina DNA Mix жинағын пайдаланып мылтық кітапханаларын дайындады. Стандартты адаптер (BioO) пайдаланылды. Шикі деректер файлдары NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 және SRR8924809) сайтынан қолжетімді. Негізгі оқу сапасы FastQC [23] көмегімен бағаланды. Trimmomatic [24] қию адаптерлері мен сапасыз оқулар үшін қолданылды. Жұптасқан ұштары бар мылтық оқулары сәйкессіздіктерді болдырмау үшін FLASH кемінде 20 bp қабаттасуымен ұзынырақ бір оқуларға біріктірілді [25]. Біріктірілген оқулар екі жақты NCBI таксономия дерекқорын (e мәні < 1e−3 және 90% гомология) пайдаланып BLASTN арқылы аннотацияланды, ал күрделілігі төмен тізбектерді жасыру DUST [26] көмегімен орындалды. Біріктірілген оқулар екі жақты NCBI таксономия дерекқорын (e мәні < 1e−3 және 90% гомология) пайдаланып BLASTN арқылы аннотацияланды, ал күрделілігі төмен тізбектерді жасыру DUST [26] көмегімен орындалды. Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 және 90% гомологии), а маскирование кейін следовательностей оңай жұмыс істеуге болады. [26]. Біріктірілген оқулар NCBI қосжарнақты таксономия дерекқорын (e мәні < 1e-3 және 90% гомология) пайдаланып BLASTN арқылы аннотацияланды, ал күрделілігі төмен тізбекті маскировкалау DUST [26] көмегімен орындалды.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的的读合并的读帿唼唽唽唽唽唽唽]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 唶6 和进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 және 90% гомологии), а маскирование кейін следовательностей оңай сложности. [26]. Біріктірілген оқулар NCBI қосжарнақты таксономиялық дерекқорын (e мәні <1e-3 және 90% гомология) пайдаланып BLASTN арқылы аннотацияланды, ал төмен күрделіліктегі тізбекті маскировкалау DUST [26] көмегімен орындалды.Оқулар екі топқа бөлінді: қосжарнақты тізбектерге қатысты (мұнда өзін-өзі оқу деп аталады) және байланыссыз (өзін-өзі оқу емес). Екі топ MEGAHIT көмегімен контигтерді жасау үшін бөлек құрастырылды [27]. Сонымен қатар, бөтен микробиом оқуларының таксономиялық таралуы Kraken2 [28] көмегімен жіктелді және Галактикадағы Krona дөңгелек диаграммасымен графикалық түрде көрсетілді [29, 30]. Біздің алдын ала тәжірибелеріміз бойынша оңтайлы кмерлер кмерлер-59 болып анықталды. Содан кейін өзіндік контигтер соңғы аннотация үшін BLASTN (екі жақты NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) көмегімен туралау арқылы анықталды. Содан кейін өзіндік контигтер соңғы аннотация үшін BLASTN (екі жақты NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) көмегімен туралау арқылы анықталды. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%) үшін окончательной аннотации. Содан кейін өзіндік контигтер соңғы аннотация үшін BLASTN (NCBI қосжарнақты дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) бойынша сәйкестендіру арқылы анықталды.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицирование собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 және гомология 60%). Содан кейін өзіндік контигтер BLASTN-мен (NCBI қосжарнақты дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) сәйкестендіру арқылы соңғы аннотация үшін анықталды. Сонымен қатар, өзіндік емес топтық контигтер BLASTN-мен (nt NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) белгіленді. Сонымен қатар, өзіндік емес топтық контигтер BLASTN-мен (nt NCBI дерекқоры, e мәні < 1e−10 және 60% гомология) белгіленді. Параллельно чужеродные групповые контигімен аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%). Сонымен қатар, шетелдік топтық контигтер BLASTN (NT NCBI дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) арқылы белгіленді.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重非参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 және гомология 60%). Сонымен қатар, өзіндік емес топтық контигтер BLASTN (nt NCBI дерекқоры, e мәні <1e-10 және 60% гомология) арқылы белгіленді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq ақуызының NCBI дерекқорларын (e мәні < 1e−10 және 60% гомология) пайдаланып, өзіндік емес контигтерде де жүргізілді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq ақуызының NCBI дерекқорларын (e мәні < 1e−10 және 60% гомология) пайдаланып, өзіндік емес контигтерде де жүргізілді. BLASTX сонымен қатар несамостоятельных контигахтарды пайдалану арқылы баз данных белка nr және RefSeq NCBI (значение e <1e-10 және гомология 60%) арқылы дәлелденді. BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq NCBI ақуыз дерекқорларын (e мәні < 1e-10 және 60% гомология) пайдаланып, өзіндік емес контигтерде де орындалды.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧 BLASTX сондай-ақ несамостоятельных контигахтарды пайдалану арқылы баз данных белка nr және RefSeq NCBI (значение e <1e-10 және гомология 60%). BLASTX сонымен қатар nr және RefSeq NCBI ақуыз дерекқорларын (e мәні <1e-10 және 60% гомология) пайдаланып, өзіндік емес контигтерде де орындалды.Өздігінен байланысты емес BLASTN және BLASTX пулдары соңғы байланысты білдіреді (қосымша файлды қараңыз).
ПТР үшін қолданылатын праймерлер S1 кестесінде келтірілген. ccfДНҚ нысана гендерін күшейту үшін Taq ДНҚ полимеразасы (Bio Basic Canada, Markham, ON) қолданылды. Келесі реакция шарттары қолданылды: 95°C температурада 3 минут денатурация, 1 минут 95°C, 1 минут күйдіру температурасын орнату, 72°C температурада 1 минут элонгация, 35 цикл және соңында 10 минут ішінде 72°C. . ПТР өнімдері 95 В кернеуде SYBRTM қауіпсіз ДНҚ гелінің бояуы (Invitrogen, Берлингтон, ON, Канада) бар агарозды гелдерде (1,5%) электрофорез арқылы бөлінді.
Мидиялар (Mytilus spp.) 500 мл оттегімен қаныққан теңіз суында (32 PSU) 4°C температурада 24 сағат бойы акклиматизацияланды. Адам галектині-7 кДНҚ тізбегін кодтайтын қоспасы бар плазмидті ДНҚ (NCBI тіркеу нөмірі L07769) құтыға 190 мкг/мкл соңғы концентрацияда қосылды. ДНҚ қоспай, сол жағдайларда инкубацияланған мидиялар бақылау болды. Үшінші бақылау ыдысында мидиясыз ДНҚ болды. Теңіз суындағы ДНҚ сапасын бақылау үшін әр ыдыстан көрсетілген уақытта теңіз суының үлгілері (20 мкл; үш қайталау) алынды. Плазмидті ДНҚ-ны бақылау үшін LB мидиялары көрсетілген уақытта жиналып, qPCR және ddPCR арқылы талданды. Теңіз суының тұз мөлшері жоғары болғандықтан, барлық ПТР талдауларынан бұрын аликвоттар ПТР сапалы суда (1:10) сұйылтылды.
Сандық тамшылы ПТР (ddPCR) BioRad QX200 хаттамасын (Миссиссога, Онтарио, Канада) пайдаланып жүргізілді. Оңтайлы температураны анықтау үшін температура профилін пайдаланыңыз (S1 кестесі). Тамшылар QX200 тамшы генераторын (BioRad) пайдаланып жасалды. ddPCR келесідей жүргізілді: 95°C температурада 5 минут, 95°C температураның 50 циклі 30 секунд және берілген күйдіру температурасы 1 минут және 72°C температурада 30 секунд, 4°C температурада 5 минут және 90°C температурада 5 минут ішінде. Тамшылар саны және оң реакциялар (көшірмелер саны/мкл) QX200 тамшы оқу құрылғысын (BioRad) пайдаланып өлшенді. 10 000-нан аз тамшылары бар үлгілер қабылданбады. Үлгіні бақылау ddPCR іске қосылған сайын орындалмады.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) және LGALS7 арнайы праймерлерін қолдану арқылы жүргізілді. Барлық сандық ПТР QuantiFast SYBR Green PCR жинағын (QIAGEN) пайдаланып 20 мкл көлемінде жүргізілді. qPCR 95°C температурада 15 минуттық инкубациядан басталды, содан кейін 95°C температурада 10 секунд бойы және 60°C температурада 60 секунд бойы 40 цикл бір деректер жинаумен басталды. Балқу қисықтары qPCR соңында 95°C температурада 5 секунд, 65°C температурада 60 секунд және 97°C температурада бірінен соң бірін өлшеу арқылы жасалды. Әрбір qPCR бақылау үлгілерінен басқа үш данада жүргізілді.
Мидиялар жоғары сүзу жылдамдығымен танымал болғандықтан, біз алдымен олардың теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерін сүзіп, сақтай алатынын зерттедік. Біз сондай-ақ бұл фрагменттердің жартылай ашық лимфа жүйесінде жиналатынына қызығушылық таныттық. Біз бұл мәселені көк мидия аквариумдарына қосылған еритін ДНҚ фрагменттерінің тағдырын бақылау арқылы эксперименталды түрде шештік. ДНҚ фрагменттерін бақылауды жеңілдету үшін біз адамның галектин-7 генін қамтитын бөгде (өздігінен емес) плазмидалық ДНҚ-ны қолдандық. ddPCR теңіз суындағы және мидиялардағы плазмидалық ДНҚ фрагменттерін бақылайды. Біздің нәтижелеріміз көрсеткендей, егер теңіз суындағы ДНҚ фрагменттерінің мөлшері мидиялар болмаған кезде уақыт өте келе (7 күнге дейін) салыстырмалы түрде тұрақты болып қалса, онда мидиялар болған кезде бұл деңгей 8 сағат ішінде толығымен дерлік жоғалып кетті (1a, b сурет). Экзогендік ДНҚ фрагменттері клапанішілік сұйықтықта және гемолимфада 15 минут ішінде оңай анықталды (1c сурет). Бұл фрагменттерді әсер етуден кейін 4 сағатқа дейін анықтауға болады. ДНҚ фрагменттеріне қатысты бұл сүзу белсенділігі бактериялар мен балдырлардың сүзу белсенділігімен салыстыруға болады [31]. Бұл нәтижелер мидиялардың бөгде ДНҚ-ны сүзіп, сұйық бөлімдерінде жинай алатынын көрсетеді.
Теңіз суындағы плазмидалық ДНҚ-ның мидиялардың қатысуымен (A) немесе қатысусыз (B) салыстырмалы концентрациясы, ddPCR арқылы өлшенеді. A нұсқасында нәтижелер пайызбен көрсетіледі, ал қораптардың шекаралары 75 және 25-ші процентильдерді білдіреді. Логарифмдік қисық қызыл түспен көрсетілген, ал сұр түспен боялған аумақ 95% сенімділік аралығын білдіреді. B нұсқасында қызыл сызық орташа мәнді, ал көк сызық концентрацияның 95% сенімділік аралығын білдіреді. C Плазмидалық ДНҚ қосылғаннан кейін әртүрлі уақытта мидиялардың гемолимфасы мен қақпақша сұйықтығында плазмидалық ДНҚ-ның жиналуы. Нәтижелер анықталған абсолютті көшірмелер/мл (±SE) ретінде ұсынылады.
Әрі қарай, біз антропогендік әсері шектеулі алыс аралдар тобы болып табылатын Кергелен аралдарындағы мидия төсектерінен жиналған мидиялардағы ккфДНҚ-ның шығу тегін зерттедік. Осы мақсатта мидия гемолимфаларынан ккфДНҚ бөлініп алынып, адам ккфДНҚ-сын тазарту үшін кеңінен қолданылатын әдістермен тазартылды [32, 33]. Біз мидиялардағы гемолимфа ккфДНҚ-ның орташа концентрациясы гемолимфаның бір мл-ге төмен микрограмм диапазонында екенін анықтадық (S2 кестесін, қосымша ақпаратты қараңыз). Бұл концентрация диапазоны сау адамдарға қарағанда әлдеқайда үлкен (миллилитрге төмен нанограмм), бірақ сирек жағдайларда қатерлі ісікпен ауыратын науқастарда ккфДНҚ деңгейі миллилитрге бірнеше микрограммға жетуі мүмкін [34, 35]. Гемолимфа ккфДНҚ-ның өлшемдік таралуын талдау бұл фрагменттердің мөлшері бойынша айтарлықтай өзгеретінін, 1000 б.п.-ден 1000 б.п.-ге дейін, 5000 б.п. дейін екенін көрсетті (2-сурет). Ұқсас нәтижелер кремний диоксиді негізіндегі QIAamp Investigator Kit көмегімен алынды, бұл әдіс криминалистикада ccfDNA қоса алғанда, төмен концентрациялы ДНҚ үлгілерінен геномдық ДНҚ-ны тез бөліп алу және тазарту үшін жиі қолданылады [36].
Мидия гемолимфасының типтік ccfДНҚ электрофореграммасы. NucleoSnap Plasma Kit (жоғарғы жағы) және QIAamp ДНҚ зерттеу жинағымен алынған. Мидиялардағы гемолимфа ccfДНҚ концентрациясының (±SE) таралуын көрсететін B скрипка графигі. Қара және қызыл сызықтар медиананы және сәйкесінше бірінші және үшінші квартильдерді білдіреді.
Адамдар мен приматтардағы ккфДНҚ-ның шамамен 1%-ы бөгде көзден тұрады [21, 37]. Қосжарнақтылардың жартылай ашық қанайналым жүйесін, микробтарға бай теңіз суын және мидия ккфДНҚ-ның мөлшерінің таралуын ескере отырып, біз мидия гемолимфа ккфДНҚ-сында микробтық ДНҚ-ның бай және алуан түрлі қоры болуы мүмкін деген болжам жасадық. Бұл гипотезаны тексеру үшін біз Кергелен аралдарынан жиналған Aulacomya atra үлгілерінен алынған гемолимфа ккфДНҚ-ны секвенирледік, нәтижесінде 10 миллионнан астам оқу нәтижесі алынды, оның 97,6%-ы сапа бақылауынан өтті. Содан кейін оқулар BLASTN және NCBI қосжарнақты дерекқорларын пайдаланып, өзіндік және өзіндік емес көздерге сәйкес жіктелді (S1-сурет, қосымша ақпарат).
Адамдарда ядролық және митохондриялық ДНҚ қанға бөлінуі мүмкін [38]. Дегенмен, осы зерттеуде A. atra геномы секвенирленбеген немесе сипатталмағандықтан, мидиялардың ядролық геномдық ДНҚ-сын егжей-тегжейлі сипаттау мүмкін болмады. Дегенмен, біз қосжарнақты кітапхананы пайдаланып, өзімізден шыққан бірқатар ccfDNA фрагменттерін анықтай алдық (S2 сурет, қосымша ақпарат). Біз сондай-ақ секвенирленген A. atra гендерінің бағытталған ПТР күшейтуі арқылы өзімізден шыққан ДНҚ фрагменттерінің бар екенін растадық (3-сурет). Сол сияқты, A. atra митохондриялық геномы жалпыға қолжетімді дерекқорларда қолжетімді болғандықтан, A. atra гемолимфасында митохондриялық ccfDNA фрагменттерінің бар екендігінің дәлелдерін табуға болады. Митохондриялық ДНҚ фрагменттерінің бар екендігі ПТР күшейтуі арқылы расталды (3-сурет).
ПТР арқылы күшейтілген A. atra (қызыл нүктелер – қор нөмірі: SRX5705969) және M. platensis (көк нүктелер – қор нөмірі: SRX5705968) гемолимфасында әртүрлі митохондриялық гендер болды. Сурет Breton et al., 2011 B материалынан алынған. A. atra гемолимфа супернатантының күшейтілуі FTA қағазында сақталған. ПТР қоспасы бар ПТР түтігіне тікелей қосу үшін 3 мм перфораторды пайдаланыңыз.
Теңіз суындағы микробтық заттардың молдығын ескере отырып, біз бастапқыда гемолимфадағы микробтық ДНҚ тізбектерін сипаттауға назар аудардық. Ол үшін біз екі түрлі стратегияны қолданамыз. Бірінші стратегияда BLAST және басқа құралдармен салыстыруға болатын дәлдікпен микробтық тізбектерді анықтай алатын алгоритмге негізделген тізбекті жіктеу бағдарламасы Kraken2 қолданылды [28]. 6719-дан астам көрсеткіш бактериялық шығу тегі болып анықталды, ал 124 және 64 сәйкесінше архейлер мен вирустардан болды (4-сурет). Ең көп таралған бактериялық ДНҚ фрагменттері Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) және Bacteroidetes (17%) болды (4a-сурет). Бұл таралу теңіз көк мидиясының микробиомының бұрынғы зерттеулеріне сәйкес келеді [39, 40]. Гаммапротеобактериялар көптеген Vibrionales-ті қоса алғанда, Proteobacteria-ның негізгі класы болды (44%) (4b-сурет). ddPCR әдісі A. atra гемолимфасының ccfДНҚ-сында Вибрио ДНҚ фрагменттерінің бар екенін растады (4c-сурет) [41]. ccfДНҚ-ның бактериялық шығу тегі туралы қосымша ақпарат алу үшін қосымша тәсіл қолданылды (S2-сурет, Қосымша ақпарат). Бұл жағдайда, қабаттасқан оқулар жұптасқан оқулар ретінде құрастырылды және BLASTN және 1e−3 e мәні және >90% гомологиясы бар шекті мәнді пайдаланып өзіндік (қосжарнақты) немесе өзіндік емес деп жіктелді. Бұл жағдайда, қабаттасқан оқулар жұптасқан оқулар ретінде құрастырылды және BLASTN және 1e−3 e мәні және >90% гомологиясы бар шекті мәнді пайдаланып өзіндік (қосжарнақты) немесе өзіндік емес деп жіктелді. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) немесе чужие по происхождению с использованием BLASTN және значения гомея 190-дан астам. Бұл жағдайда, қабаттасатын оқулар жұптасқан оқулар ретінде жиналды және BLASTN және 1e-3 e мәнін және >90% гомологиямен шекті мәнді пайдаланып, табиғи (екі жақты) немесе түпнұсқа емес деп жіктелді.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 佚用 嚄 用 在 用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами және классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) немесе несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ологи и 19% поро. Бұл жағдайда, қабаттасатын оқулар жұптасқан оқулар ретінде жиналды және e BLASTN және 1e-3 мәндерін және гомология шегі >90% пайдаланып меншікті (қосжарнақты) немесе түпнұсқа емес деп жіктелді.A. atra геномы әлі секвенирленбегендіктен, біз MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ассемблерінің de novo құрастыру стратегиясын қолдандық. Барлығы 147 188 контиг тәуелді (қосжарнақты) шығу тегі ретінде анықталды. Бұл контигтер BLASTN және BLASTX көмегімен 1e-10 e-мәндерімен бөлінді. Бұл стратегия бізге A. atra ccfDNA-да бар 482 қосжарнақты емес фрагменттерді анықтауға мүмкіндік берді. Бұл ДНҚ фрагменттерінің жартысынан көбі (57%) бактериялардан, негізінен сульфотрофты симбионттарды қоса алғанда, желбезек симбионттарынан және желбезек симбионттары Solemya velum-нан алынды (5-сурет).
Тип деңгейіндегі салыстырмалы молшылық. B Екі негізгі филаның (Firmicutes және Proteobacteria) микробтық әртүрлілігі. ddPCR репрезентативті амплификациясы C Vibrio spp. A. Үш атра гемолимфасындағы 16S рРНҚ генінің фрагменттері (көк).
Барлығы 482 жиналған контиг талданды. Метагеномдық контиг аннотацияларының (прокариоттар мен эукариоттар) таксономиялық таралуының жалпы профилі. B BLASTN және BLASTX арқылы анықталған бактериялық ДНҚ фрагменттерінің егжей-тегжейлі таралуы.
Kraken2 талдауы сонымен қатар мидияның ccf ДНҚ-сында архейлік ДНҚ фрагменттері, соның ішінде Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) және Thaurmarcheota (11%) ДНҚ фрагменттері бар екенін көрсетті (6a-сурет). Калифорния мидияларының микробтық қауымдастығында бұрын табылған Euryarchaeota мен Crenarchaeota-дан алынған ДНҚ фрагменттерінің болуы таңқаларлық емес [42]. Euryarchaeota көбінесе экстремалды жағдайлармен байланысты болғанымен, қазір Euryarchaeota да, Crenarcheota да теңіз криогендік ортасындағы ең көп таралған прокариоттардың қатарына жататыны мойындалды [43, 44]. Кергелен үстіртіндегі түбіндегі ағып кетулерден метанның кең ауқымды ағып кетуі туралы соңғы хабарламаларды [45] және Кергелен аралдарының жағалауында байқалған микробтық метан өндірісінің ықтималдығы туралы [46] ескере отырып, мидияларда метаногендік микроорганизмдердің болуы таңқаларлық емес.
Содан кейін біздің назарымыз ДНҚ вирустарынан алынған көрсеткіштерге аударылды. Біздің білуімізше, бұл мидиялардың вирус құрамын зерттеудің алғашқы нысанадан тыс зерттеуі. Күткендей, біз бактериофагтардың (Caudovirales) ДНҚ фрагменттерін таптық (6b-сурет). Дегенмен, ең көп таралған вирустық ДНҚ нуклеоцитовирустар филумынан, сондай-ақ ядролық цитоплазмалық үлкен ДНҚ вирусы (NCLDV) деп аталады, ол кез келген вирустың ең үлкен геномына ие. Бұл филумның ішінде ДНҚ тізбектерінің көпшілігі Mimimidoviridae (58%) және Poxviridae (21%) тұқымдастарына жатады, олардың табиғи иелеріне омыртқалылар мен буынаяқтылар кіреді, ал бұл ДНҚ тізбектерінің аз бөлігі белгілі вирусологиялық балдырларға жатады. Теңіз эукариоттық балдырларын жұқтырады. Тізбектер сонымен қатар кез келген белгілі вирустық туыстардың геномының ең үлкен өлшеміне ие алып вирус - Пандора вирусынан алынды. Бір қызығы, гемолимфа ccfДНҚ секвенирлеу арқылы анықталғандай, вирус жұқтырған деп саналатын иелердің ауқымы салыстырмалы түрде үлкен болды (S3 сурет, қосымша ақпарат). Оған Baculoviridae және Iridoviridae сияқты жәндіктерді жұқтыратын вирустар, сондай-ақ амебаларды, балдырларды және омыртқалыларды жұқтыратын вирустар кіреді. Біз сондай-ақ Pithovirus sibericum геномына сәйкес келетін тізбектерді таптық. Питовирустар («зомби вирустары» деп те аталады) алғаш рет Сібірдегі 30 000 жылдық мәңгілік мұздан бөлініп алынды [47]. Осылайша, біздің нәтижелеріміз осы вирустардың барлық қазіргі түрлері жойылып кетпейтінін [48] және бұл вирустар шалғай субарктикалық теңіз экожүйелерінде болуы мүмкін екенін көрсететін бұрынғы есептерге сәйкес келеді.
Соңында, біз басқа көп жасушалы жануарлардың ДНҚ фрагменттерін таба алатынымызды тексеру үшін сынақтан өткіздік. BLASTN және BLASTX арқылы nt, nr және RefSeq кітапханаларымен (геномдық және ақуыздық) барлығы 482 бөтен контиг анықталды. Біздің нәтижелеріміз көп жасушалы жануарлардың ccf ДНҚ-сының бөтен фрагменттерінің арасында сүйек сүйектерінің ДНҚ-сы басым екенін көрсетеді (5-сурет). Жәндіктер мен басқа түрлердің ДНҚ фрагменттері де табылды. ДНҚ фрагменттерінің салыстырмалы түрде үлкен бөлігі анықталмаған, бұл құрлықтағы түрлермен салыстырғанда геномдық дерекқорларда теңіз түрлерінің көптігінің аз көрсетілуіне байланысты болуы мүмкін [49].
Осы мақалада біз LB тұжырымдамасын мидияларға қолданамыз, гемолимфаның ccfДНҚ түсірілімдерін секвенирлеу теңіз жағалауындағы экожүйелердің құрамын түсінуге мүмкіндік береді деп тұжырымдаймыз. Атап айтқанда, біз 1) мидия гемолимфасында салыстырмалы түрде үлкен (~1-5 кб) айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің салыстырмалы түрде жоғары концентрациясы (микрограмм деңгейі) бар екенін анықтадық; 2) бұл ДНҚ фрагменттері тәуелсіз және тәуелсіз емес; 3) Осы ДНҚ фрагменттерінің шетелдік көздерінің арасында біз бактериялық, архейлік және вирустық ДНҚ-ны, сондай-ақ басқа көп жасушалы жануарлардың ДНҚ-сын таптық; 4) Бұл шетелдік ccfДНҚ фрагменттерінің гемолимфада жиналуы тез жүреді және мидиялардың ішкі сүзу белсенділігіне ықпал етеді. Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз әзірге негізінен биомедицина саласында қолданылып келе жатқан LB тұжырымдамасы күзетші түрлері мен олардың қоршаған ортасы арасындағы өзара әрекеттесуді жақсы түсіну үшін пайдаланылуы мүмкін бай, бірақ зерттелмеген білім көзін кодтайтынын көрсетеді.
Приматтардан басқа, тышқандарда, иттерде, мысықтарда және жылқыларда ccfДНҚ оқшаулануы туралы хабарланған [50, 51, 52]. Дегенмен, біздің білуімізше, біздің зерттеуіміз ашық айналым жүйесі бар теңіз түрлерінде ccfДНҚ-ны анықтау және секвенирлеу туралы хабарлаған алғашқы зерттеу болып табылады. Мидиялардың бұл анатомиялық ерекшелігі мен сүзу қабілеті, кем дегенде ішінара, айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің басқа түрлермен салыстырғанда әртүрлі өлшемдік сипаттамаларын түсіндіруі мүмкін. Адамдарда қанда айналымдағы ДНҚ фрагменттерінің көпшілігі 150-ден 200 б.п. дейінгі өлшемдегі шағын фрагменттер болып табылады, ең жоғары шыңы 167 б.п. [34, 53]. ДНҚ фрагменттерінің шағын, бірақ маңызды бөлігінің өлшемі 300-ден 500 б.п.-ге дейін, ал шамамен 5%-ы 900 б.п.-ден ұзын [54]. Бұл өлшемнің таралуының себебі, плазмадағы ccfДНҚ-ның негізгі көзі жасуша өлімі нәтижесінде пайда болады, бұл жасуша өліміне немесе сау адамдарда қан айналымындағы гемопоэтикалық жасушалардың некрозына немесе қатерлі ісікпен ауыратын науқастарда ісік жасушаларының апоптозына байланысты (қан айналымындағы ісік ДНҚ деп аталады). , ctDNA). Мидиялардан тапқан гемолимфа ccfДНҚ-ның өлшемдік таралуы 1000-нан 5000 б.п.-ға дейін болды, бұл мидия ccfДНҚ-ның шығу тегі басқа екенін көрсетеді. Бұл логикалық гипотеза, себебі мидиялар жартылай ашық тамыр жүйесіне ие және микробтық геномдық ДНҚ-ның жоғары концентрациясы бар теңіз сулы ортасында тіршілік етеді. Шын мәнінде, экзогендік ДНҚ-ны қолданатын зертханалық тәжірибелеріміз мидиялардың теңіз суында ДНҚ фрагменттерін жинайтынын, кем дегенде бірнеше сағаттан кейін жасушалық сіңіруден кейін ыдырайтынын және/немесе босатылатынын және/немесе әртүрлі ұйымдарда сақталатынын көрсетті. Жасушалардың (прокариоттық та, эукариоттық та) сирек кездесетінін ескере отырып, қақпақшаішілік бөлімдерді пайдалану өзіндік көздерден де, шетелдік көздерден де ккфДНҚ мөлшерін азайтады. Қосжарнақты туа біткен иммунитеттің маңыздылығын және айналымдағы фагоциттердің көптігін ескере отырып, біз тіпті шетелдік ккфДНҚ-ның да микроорганизмдерді және/немесе жасушалық қалдықтарды жұтқан кезде бөгде ДНҚ жинайтын айналымдағы фагоциттерге бай екендігі туралы болжам жасадық. Жалпы алғанда, біздің нәтижелеріміз қосжарнақты гемолимфа ккфДНҚ молекулалық ақпараттың бірегей қоймасы екенін және олардың күзетші түрі ретіндегі мәртебесін нығайтатынын көрсетеді.
Біздің деректеріміз бактериялардан алынған гемолимфа ccfДНҚ фрагменттерін секвенирлеу және талдау иесінің бактериялық флорасы және айналадағы теңіз экожүйесінде болатын бактериялар туралы негізгі ақпарат бере алатынын көрсетеді. Шот секвенирлеу әдістері дәстүрлі 16S рРНҚ идентификациялау әдістері қолданылған жағдайда байқалмайтын A. atra gill комменсальды бактерияларының тізбегін анықтады, бұл ішінара анықтамалық кітапхананың бейімділігіне байланысты. Шын мәнінде, Кергелендегі сол мидия қабатындағы M. platensis-тен жиналған LB деректерін пайдалануымыз желбезекпен байланысты бактериялық симбионттардың құрамы екі мидия түрі үшін де бірдей екенін көрсетті (S4 сурет, Қосымша ақпарат). Екі генетикалық жағынан әртүрлі мидияның бұл ұқсастығы Кергеленнің суық, күкіртті және жанартау шөгінділеріндегі бактериялық қауымдастықтардың құрамын көрсетуі мүмкін [55, 56, 57, 58]. Порт-о-Франс жағалауы сияқты биотурбатталған жағалау аймақтарынан мидияларды жинау кезінде күкіртті азайтатын микроорганизмдердің жоғары деңгейлері жақсы сипатталған [59]. Тағы бір мүмкіндік - көлденең беріліс мидияларының комменсальды флорасына әсер етуі мүмкін [60, 61]. Теңіз ортасы, теңіз түбінің беті және мидиялардағы симбиотикалық бактериялардың құрамы арасындағы корреляцияны анықтау үшін көбірек зерттеулер қажет. Бұл зерттеулер қазіргі уақытта жалғасуда.
Гемолимфа ccfДНҚ-ның ұзындығы мен концентрациясы, оны тазартудың қарапайымдылығы және тез мылтықпен секвенирлеуге мүмкіндік беретін жоғары сапасы теңіз жағалауындағы экожүйелердегі биоәртүрлілікті бағалау үшін мидия ccfДНҚ-ны пайдаланудың көптеген артықшылықтарының бірі болып табылады. Бұл тәсіл, әсіресе, берілген экожүйедегі вирустық қауымдастықтарды (виромаларды) сипаттау үшін тиімді [62, 63]. Бактериялардан, археялардан және эукариоттардан айырмашылығы, вирустық геномдарда 16S тізбектері сияқты филогенетикалық тұрғыдан сақталған гендер жоқ. Біздің нәтижелеріміз мидиялар сияқты индикаторлық түрлерден алынған сұйық биопсияларды жағалаудағы теңіз экожүйелерінде әдетте мекендейтін иелерді жұқтыратыны белгілі ccfДНҚ вирус фрагменттерінің салыстырмалы түрде көп мөлшерін анықтау үшін пайдалануға болатынын көрсетеді. Бұған қарапайымдыларды, буынаяқтыларды, жәндіктерді, өсімдіктерді және бактериялық вирустарды (мысалы, бактериофагтарды) жұқтыратыны белгілі вирустар кіреді. Кергелендегі сол мидия қабатында жиналған көк мидиялардың (M. platensis) гемолимфа ccfДНҚ виромын зерттеген кезде ұқсас таралу анықталды (S2 кестесі, Қосымша ақпарат). ccfДНҚ-ны мылтықпен секвенирлеу шынымен де адамдардың немесе басқа түрлердің виромын зерттеуде серпін алып келе жатқан жаңа тәсіл [21, 37, 64]. Бұл тәсіл, әсіресе, қос тізбекті ДНҚ вирустарын зерттеу үшін пайдалы, себебі Балтимордағы ең алуан түрлі және кең вирустар класын білдіретін барлық қос тізбекті ДНҚ вирустарының арасында бірде-бір ген сақталмаған [65]. Бұл вирустардың көпшілігі жіктелмеген күйінде қалып, вирустық әлемнің мүлдем белгісіз бөлігінен алынған вирустарды қамтуы мүмкін болса да [66], біз A. atra және M. platensis мидияларының виромалары мен иелерінің диапазондары екі түрдің арасында ұқсас екенін анықтадық (қосымша ақпарат үшін S3 суретін қараңыз). Бұл ұқсастық таңқаларлық емес, себебі ол қоршаған ортада бар ДНҚ-ны сіңірудегі селективтіліктің болмауын көрсетуі мүмкін. Қазіргі уақытта РНҚ виромын сипаттау үшін тазартылған РНҚ-ны қолданатын болашақ зерттеулер қажет.
Біздің зерттеуімізде біз Коварски мен әріптестерінің [37] жұмысынан бейімделген өте қатаң құбырды қолдандық, олар жергілікті ccfDNA құрастырмас бұрын және кейін біріктірілген оқулар мен контингтерді екі сатылы жоюды қолданды, нәтижесінде картаға түсірілмеген оқулардың көп үлесі пайда болды. Сондықтан, біз картаға түсірілмеген оқулардың кейбіреулерінің әлі де өз шығу тегі болуы мүмкін екенін жоққа шығара алмаймыз, ең алдымен бізде бұл мидия түріне арналған анықтамалық геном жоқ болғандықтан. Біз сондай-ақ бұл құбырды өздігінен және өздігінен емес оқулар арасындағы химераларға және Illumina MiSeq PE75 жасаған оқу ұзақтығына алаңдағандықтан қолдандық. Картаға түсірілмеген оқулардың көпшілігінің тағы бір себебі - теңіз микробтарының көпшілігі, әсіресе Кергуэлен сияқты шалғай аудандарда, аннотацияланбаған. Біз ccfDNA фрагментінің ұзындығы адамның ccfDNA-сына ұқсас деп болжап, Illumina MiSeq PE75 қолдандық. Болашақ зерттеулер үшін, гемолимфаның ccfDNA-сы адамдарға және/немесе сүтқоректілерге қарағанда ұзағырақ оқылатынын көрсететін нәтижелерімізді ескере отырып, біз ұзын ccfDNA фрагменттеріне қолайлы секвенирлеу платформасын пайдалануды ұсынамыз. Бұл тәжірибе тереңірек талдау үшін көбірек көрсеткіштерді анықтауды әлдеқайда жеңілдетеді. Қазіргі уақытта қолжетімді емес толық A. atra ядролық геномының тізбегін алу ccfDNA-ны өзіндік және өзіндік емес көздерден ажыратуды айтарлықтай жеңілдетеді. Біздің зерттеуіміз мидияларға сұйық биопсия тұжырымдамасын қолдану мүмкіндігіне бағытталғандықтан, бұл тұжырымдама болашақ зерттеулерде қолданылғандықтан, мидиялардың микробтық әртүрлілігін зерттеу үшін осы әдістің әлеуетін арттыру үшін жаңа құралдар мен құбырлар әзірленеді деп үміттенеміз. теңіз экожүйесі.
Инвазивті емес клиникалық биомаркер ретінде адам плазмасындағы ccfDNA деңгейінің жоғарылауы әртүрлі аурулармен, тіндердің зақымдануымен және стресстік жағдайлармен байланысты [67,68,69]. Бұл өсу тіндердің зақымдануынан кейін өз шығу тегі бар ДНҚ фрагменттерінің бөлінуімен байланысты. Біз бұл мәселені жедел жылу стрессін қолдану арқылы шештік, онда мидиялар қысқа мерзімге 30 °C температураға ұшырады. Біз бұл талдауды үш тәуелсіз экспериментте үш түрлі мидия түріне жүргіздік. Дегенмен, жедел жылу стрессінен кейін ccfDNA деңгейінде ешқандай өзгеріс таппадық (қосымша ақпарат S5 суретін қараңыз). Бұл жаңалық, кем дегенде ішінара, мидиялардың жартылай ашық қанайналым жүйесіне ие екенін және олардың жоғары сүзу белсенділігіне байланысты көп мөлшерде бөгде ДНҚ жинайтынын түсіндіруі мүмкін. Екінші жағынан, мидиялар, көптеген омыртқасыздар сияқты, стресс тудыратын тіндердің зақымдануына төзімдірек болуы мүмкін, осылайша олардың гемолимфасында ccfDNA бөлінуін шектейді [70, 71].
Бүгінгі күнге дейін су экожүйелеріндегі биоәртүрліліктің ДНҚ талдауы негізінен қоршаған ортаның ДНҚ (eDNA) метабаркодтауына бағытталған. Дегенмен, бұл әдіс праймерлер қолданылған кезде биоәртүрлілікті талдауда әдетте шектеулі болады. Мылтық секвенирлеуді қолдану ПТР шектеулерін және праймер жиынтығын біржақты таңдауды айналып өтеді. Осылайша, белгілі бір мағынада біздің әдісіміз жақында қолданылған жоғары өнімді eDNA мылтық секвенирлеу әдісіне жақын, ол фрагменттелген ДНҚ-ны тікелей тізбектей алады және барлық дерлік организмдерді талдайды [72, 73]. Дегенмен, LB-ны стандартты eDNA әдістерінен ажырататын бірқатар іргелі мәселелер бар. Әрине, eDNA мен LB арасындағы негізгі айырмашылық - табиғи сүзгі иелерін пайдалану. eDNA-ны зерттеу үшін табиғи сүзгі ретінде губкалар мен қосжарнақты моллюскалар (Dresseina spp.) сияқты теңіз түрлерін пайдалану туралы хабарланған [74, 75]. Дегенмен, Дрейсенаның зерттеуінде ДНҚ алынған тін биопсиялары қолданылды. LB-дан алынған ccfDNA талдауы тін биопсиясын, eDNA немесе тін биопсиясымен байланысты мамандандырылған және кейде қымбат жабдықтар мен логистиканы қажет етпейді. Шын мәнінде, біз жақында LB-дан алынған ccfDNA-ны суық тізбекті сақтамай FTA қолдауымен сақтауға және талдауға болатынын хабарладық, бұл шалғай аудандардағы зерттеулер үшін үлкен қиындық тудырады [76]. Сұйық биопсиялардан ccfDNA алу да қарапайым және мылтық секвенирлеу және ПТР талдауы үшін жоғары сапалы ДНҚ береді. Бұл eDNA талдауымен байланысты кейбір техникалық шектеулерді ескере отырып, үлкен артықшылық [77]. Іріктеу әдісінің қарапайымдылығы мен төмен құны ұзақ мерзімді мониторинг бағдарламалары үшін де өте қолайлы. Жоғары сүзу қабілетінен басқа, қосжарнақтылардың тағы бір танымал ерекшелігі - олардың шырышының химиялық мукополисахаридтік құрамы, ол вирустардың сіңуіне ықпал етеді [78, 79]. Бұл қосжарнақтыларды берілген су экожүйесіндегі биоәртүрлілікті және климаттың өзгеруінің әсерін сипаттау үшін тамаша табиғи сүзгі етеді. Хосттан алынған ДНҚ фрагменттерінің болуы әдістің eDNA-мен салыстырғандағы шектеуі ретінде қарастырылуы мүмкін болса да, eDNA-мен салыстырғанда мұндай нативті ccfDNA-ның болуымен байланысты шығындар денсаулық сақтау зерттеулері үшін қолжетімді ақпараттың үлкен көлемімен түсінікті. офсеттік хосты. Бұған хосттың геномына интеграцияланған вирустық тізбектердің болуы кіреді. Бұл әсіресе мидиялар үшін маңызды, өйткені қосжарнақтыларда көлденең берілетін лейкемиялық ретровирустардың болуы [80, 81]. LB-нің eDNA-мен салыстырғандағы тағы бір артықшылығы - ол микроорганизмдерді (және олардың геномдарын) жұтып қоятын гемолимфадағы айналымдағы қан жасушаларының фагоцитарлық белсенділігін пайдаланады. Фагоцитоз - қосжарнақтылардағы қан жасушаларының негізгі қызметі [82]. Соңында, әдіс мидиялардың жоғары сүзу қабілетін (орташа 1,5 л/сағ теңіз суы) және екі күндік айналымды пайдаланады, бұл теңіз суының әртүрлі қабаттарының араласуын арттырады, бұл гетерологиялық eDNA-ны ұстауға мүмкіндік береді. [83, 84]. Осылайша, мидияның ccfDNA талдауы мидиялардың тағамдық, экономикалық және қоршаған ортаға әсерін ескере отырып, қызықты бағыт болып табылады. Адамдардан жиналған LB талдауына ұқсас, бұл әдіс экзогендік заттарға жауап ретінде иесінің ДНҚ-сындағы генетикалық және эпигенетикалық өзгерістерді өлшеу мүмкіндігін ашады. Мысалы, нанопоралық секвенирлеуді қолдана отырып, жергілікті ccfDNA-да геном бойынша метилдену талдауын жүргізу үшін үшінші буын секвенирлеу технологияларын қарастыруға болады. Бұл процесті мидия ccfDNA фрагменттерінің ұзындығы химиялық түрлендірулерді қажет етпей, бір секвенирлеу процесінен геном бойынша ДНҚ метилдену талдауын жүргізуге мүмкіндік беретін ұзақ оқылатын секвенирлеу платформаларымен өте жақсы үйлесімді болуы жеңілдетуі керек.85,86] Бұл қызықты мүмкіндік, себебі ДНҚ метилдену үлгілері қоршаған ортаның күйзелісіне жауапты көрсететіні және көптеген ұрпақтар бойы сақталатыны көрсетілген. Сондықтан, ол климаттың өзгеруіне немесе ластаушы заттарға ұшырағаннан кейінгі реакцияны реттейтін негізгі механизмдер туралы құнды түсінік бере алады [87]. Дегенмен, LB қолдану шектеусіз емес. Әрине, бұл экожүйеде индикаторлық түрлердің болуын талап етеді. Жоғарыда айтылғандай, берілген экожүйенің биоәртүрлілігін бағалау үшін LB пайдалану көзден алынған ДНҚ фрагменттерінің болуын ескеретін қатаң биоинформатикалық құбырды да қажет етеді. Тағы бір маңызды мәселе - теңіз түрлеріне арналған анықтамалық геномдардың болуы. Теңіз сүтқоректілерінің геномдары жобасы және жақында құрылған Fish10k жобасы [88] сияқты бастамалар болашақта мұндай талдауды жеңілдетеді деп үміттенеміз. LB тұжырымдамасын теңіз сүзгісімен қоректенетін организмдерге қолдану секвенирлеу технологиясындағы соңғы жетістіктермен де үйлесімді, бұл оны қоршаған ортаның күйзелісіне жауап ретінде теңіз тіршілік ету ортасының денсаулығы туралы маңызды ақпарат беру үшін көп омды биомаркерлерді әзірлеуге өте қолайлы етеді.
Геномдық секвенирлеу деректері NCBI тізбекті оқу мұрағатына https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 мекенжайы бойынша Bioprojects SRR8924808 бөлімінде сақталды.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Дж. Климаттың өзгеруінің теңіз тіршілігі мен экожүйелеріне әсері. Коул Биология. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S және т.б. Климаттың өзгеруінің және басқа да жергілікті стрессорлардың теңіз ортасына әсерін қарастырыңыз. жалпы ғылыми орта. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P және т.б. ). Бірінші наурыз туралы ғылым. 2020;7:48.
Серонт Л, Никастро КР, Зарди Г.И., Гобервилл Э. Қайталанатын жылу стрессі жағдайында ыстыққа төзімділіктің төмендеуі көк мидиялардың жазғы өлімінің жоғары болуын түсіндіреді. Ғылыми есеп 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сиепиелски А.М., Нуссле С., Сервантес-Йошида К., Хван Дж.Л., Хубер Э.Р. және т.б. Жануарлардың өлімінің жиілігіндегі, себептері мен деңгейіндегі соңғы өзгерістер. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S және т.б. Көптеген түрлерге тән емес патогендер Pinna nobilis-тің жаппай өліміне себеп болуы мүмкін. Өмір. 2020;10:238.
Брэдли М, Куттс С.Дж., Дженкинс Э., О'Хара Т.М. Климаттың өзгеруінің Арктика зооноздық ауруларына ықтимал әсері. Халықаралық Circumpolar денсаулық сақтау журналы. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. және т.б. Көк мидиялар (Mytilus edulis spp.) жағалаудағы ластануды бақылаудағы сигналдық организмдер ретінде: шолу. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравегна Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Қатерлі ісік еміне сұйық биопсияны интеграциялау. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Дж.К.М., Масси К., Гарсия-Корбачо Дж., Мульер Ф., Брентон Дж.Д., Калдас К. және т.б. Сұйық биопсияның жетілуі: ісік ДНҚ-сының айналымына мүмкіндік береді. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метайс П. Адам плазмасындағы нуклеин қышқылдары. Soc Biol еншілес компанияларының жиналыс хаттамалары. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А.Ж., Унгерер В., Холденридер С. Қатерлі ісік ауруын емдеуде молекулалық маркер ретінде жасушасыз ДНҚ-ның жаңа рөлі. Биомолярлық талдауды сандық бағалау. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Джеффри С.С. Сұйық биопсия клиникаға енеді – енгізу мәселелері және болашақтағы қиындықтар. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент ИЛ., Редман К.В. және т.б. Ұрықтың ДНҚ-сы ана плазмасында және сарысуында болады. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Куэйк С.Р. Жүктілік кезінде әйелдердің қанындағы айналымдағы жасушадан тыс РНҚ-ны қолдана отырып, жүктіліктің ағымын және оның асқынуларын зерттеу. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеоун П, Шютц Э, Бек Дж, Стегбауэр Дж және т.б. Сұйық биопсия: бүйрек трансплантатындағы аллогендік зақымдануларды анықтау үшін донорлық жасушасыз ДНҚ қолданылады. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Пренатальды диагностикадағы инновациялар: ана плазмасының геномын секвенирлеу. Анна М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В, Дэн Х, Ли М, Суку ЮД, Аревало С, Страйк Д және т.б. Жұқтырған дене сұйықтықтарын келесі буын метагеномдық секвенирлеу арқылы патогенді жылдам анықтау. Nat Medicine. 2021;27:115-24.