Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Течна биопсија (ТБ) је концепт који брзо добија на популарности у биомедицинској области. Концепт се углавном заснива на детекцији фрагмената циркулишуће екстрацелуларне ДНК (ccfDNA), који се углавном ослобађају као мали фрагменти након ћелијске смрти у различитим ткивима. Мали део ових фрагмената потиче из страних (страних) ткива или организама. У тренутном раду, применили смо овај концепт на дагње, врсту стражар познату по свом високом капацитету филтрације морске воде. Користимо способност дагњи ​​да делују као природни филтери за хватање фрагмената ДНК из животне средине из различитих извора како бисмо пружили информације о биодиверзитету морских приобалних екосистема. Наши резултати показују да хемолимфа дагњи ​​садржи фрагменте ДНК који се значајно разликују по величини, од 1 до 5 kb. Секвенцирање сачмарицом показало је да је велики број фрагмената ДНК страног микробног порекла. Међу њима смо пронашли фрагменте ДНК од бактерија, археја и вируса, укључујући вирусе за које се зна да инфицирају различите домаћине који се обично налазе у приобалним морским екосистемима. Закључно, наша студија показује да концепт ЛБ примењен на дагње представља богат, али још увек неистражен извор знања о микробној разноликости у морским приобалним екосистемима.
Утицај климатских промена (КП) на биодиверзитет морских екосистема је брзо растуће подручје истраживања. Глобално загревање не само да изазива важне физиолошке стресове, већ и помера еволутивне границе термичке стабилности морских организама, утичући на станиште бројних врста, подстичући их да траже повољније услове [1, 2]. Поред тога што утиче на биодиверзитет метазоа, КП нарушава деликатну равнотежу интеракција домаћина и микроба. Ова микробна дисбактериоза представља озбиљну претњу морским екосистемима јер чини морске организме подложнијим заразним патогенима [3, 4]. Верује се да шкољке играју важну улогу у масовним угинулима, што је озбиљан проблем за управљање глобалним морским екосистемима [5, 6]. Ово је важно питање с обзиром на економске, еколошке и нутритивне утицаје многих морских врста. Ово посебно важи за шкољке које живе у поларним регионима, где су ефекти КП непосреднији и озбиљнији [6, 7]. У ствари, шкољке попут Mytilus spp. се широко користе за праћење ефеката КП на морске екосистеме. Није изненађујуће да је развијен релативно велики број биомаркера за праћење њиховог здравља, често користећи двостепени приступ који укључује функционалне биомаркере засноване на ензимској активности или ћелијским функцијама као што су виталност ћелија и фагоцитна активност [8]. Ове методе такође укључују мерење концентрације специфичних индикатора притиска који се акумулирају у меким ткивима након апсорпције великих количина морске воде. Међутим, висок капацитет филтрације и полуотворени циркулаторни систем шкољки пружају могућност за развој нових биомаркера хемолимфе користећи концепт течне биопсије (ТБ), једноставног и минимално инвазивног приступа лечењу пацијената. узорци крви [9, 10]. Иако се неколико врста циркулишућих молекула може наћи у људској ТБ, овај концепт се првенствено заснива на анализи секвенцирања ДНК фрагмената циркулишуће екстрацелуларне ДНК (ccfDNA) у плазми. У ствари, присуство циркулишуће ДНК у људској плазми познато је од средине 20. века [11], али је тек последњих година појава метода секвенцирања високог протока довела до клиничке дијагнозе засноване на ccfDNA. Присуство ових циркулишућих фрагмената ДНК делимично је последица пасивног ослобађања геномске ДНК (нуклеарне и митохондријалне) након ћелијске смрти. Код здравих особа, концентрација ccfDNA је нормално ниска (<10 нг/мл), али се може повећати 5-10 пута код пацијената који пате од различитих патологија или су изложени стресу, што доводи до оштећења ткива. Код здравих особа, концентрација ccfDNA је нормално ниска (<10 нг/мл), али се може повећати 5-10 пута код пацијената који пате од различитих патологија или су изложени стресу, што доводи до оштећења ткива. У здорових лудеј концентрација вккДНК в нормале низкаа (<10 нг/мл), но може повишатьса в 5–10 раз в больних с различној патологији или подложних стрессусов, приводасему к повреждениу тканеј. Код здравих људи, концентрација цццДНК је нормално ниска (<10 нг/мл), али се може повећати 5-10 пута код пацијената са различитим патологијама или под стресом који доводи до оштећења ткива.在健康个体中，ццфДНА 的浓度通常较低（<10 нг/мЛ）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍, 从而导臍瀌导致在 健康 个体 中, ццфдна 的 浓度 较 低 （(<10 нг/мл)中 可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损损伤Концентрации ццфДНА обично низкие (<10 нг/мл) у здорових лудеј, но могут бить увеличени в 5-10 раз у пациентов с различитим патологиами или стресом, что приводе к повреждениу тканеј. Концентрације ccfDNA су обично ниске (<10 нг/мл) код здравих особа, али могу бити повећане 5-10 пута код пацијената са различитим патологијама или стресом, што доводи до оштећења ткива.Величина фрагмената ccfDNA варира у великој мери, али се обично креће од 150 до 200 бп. [12]. Анализа самоизведене ccfDNA, тј. ccfDNA из нормалних или трансформисаних ћелија домаћина, може се користити за откривање генетских и епигенетских промена присутних у нуклеарном и/или митохондријалном геному, чиме се помаже клиничарима да одаберу специфичне молекуларно циљане терапије [13]. Међутим, ccfDNA се може добити из страних извора као што је ccfDNA из феталних ћелија током трудноће или из трансплантираних органа [14,15,16,17]. ccfDNA је такође важан извор информација за откривање присуства нуклеинских киселина инфективног агенса (страног), што омогућава неинвазивно откривање широко распрострањених инфекција које нису идентификоване хемокултурама, избегавајући инвазивну биопсију инфицираног ткива [18]. Недавне студије су заиста показале да људска крв садржи богат извор информација које се могу користити за идентификацију вирусних и бактеријских патогена, и да је око 1% ccfDNA пронађене у људској плазми страног порекла [19]. Ове студије показују да се биодиверзитет циркулишућег микробиома организма може проценити коришћењем ccfDNA анализе. Међутим, донедавно се овај концепт користио искључиво код људи и, у мањој мери, код других кичмењака [20, 21].
У овом раду, користимо ЛБ потенцијал за анализу ццфДНК Аулакомја атре, јужне врсте која се често налази на субантарктичким Кергеленским острвима, групи острва на врху велике висоравни која се формирала пре 35 милиона година након вулканске ерупције. Користећи ин витро експериментални систем, открили смо да фрагменте ДНК у морској води брзо апсорбују дагње и улазе у одељак хемолимфе. Секвенцирање сачмарицом показало је да ццфДНК хемолимфе дагњи ​​садржи фрагменте ДНК сопственог и туђег порекла, укључујући симбиотске бактерије и фрагменте ДНК из биома типичних за хладне вулканске морске приобалне екосистеме. ЦцфДНК хемолимфе такође садржи вирусне секвенце изведене од вируса са различитим распонима домаћина. Такође смо пронашли фрагменте ДНК из вишећелијских животиња као што су коштуњаве рибе, морске анемоне, алге и инсекти. Закључно, наша студија показује да се концепт ЛБ може успешно применити на морске бескичмењаке како би се генерисао богат геномски репертоар у морским екосистемима.
Одрасле јединке (дужине 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) сакупљене су са међуплимних стеновитих обала Порт о Франса (049°21.235 Ј, 070°13.490 И.Д.) на острвима Кергелен у децембру 2018. године. Остале одрасле плаве дагње (Mytilus spp.) набављене су од комерцијалног добављача (PEI Mussel King Inc., Острво Принца Едварда, Канада) и смештене у температурно контролисани (4°C) аерирани резервоар који је садржао 10–20 Л вештачке слане воде од 32‰ (вештачка морска со Reef Crystal, Instant Ocean, Вирџинија, САД). За сваки експеримент мерене су дужина и тежина појединачних шкољки.
Бесплатан протокол отвореног приступа за овај програм доступан је онлајн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Укратко, LB хемолимфа је сакупљена из абдукторских мишића као што је описано [22]. Хемолимфа је разјашњена центрифугирањем на 1200×g током 3 минута, супернатант је замрзнут (-20°C) до употребе. За изолацију и пречишћавање cfDNA, узорци (1,5-2,0 ml) су одмрзнути и обрађени коришћењем NucleoSnap cfDNA комплета (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) према упутствима произвођача. ccfDNA је чувана на -80°C до даље анализе. У неким експериментима, ccfDNA је изолована и пречишћена коришћењем QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада). Пречишћена ДНК је квантификована коришћењем стандардног PicoGreen теста. Дистрибуција фрагмената изоловане ccfDNA анализирана је капиларном електрофорезом коришћењем Agilent 2100 биоанализатора (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорнија) уз употребу High Sensitivity DNA Kit-а. Тест је извршен коришћењем 1 µl узорка ccfDNA према упутствима произвођача.
За секвенцирање фрагмената ccfDNA хемолимфе, Génome Québec (Монтреал, Квебек, Канада) је припремио „shotgun“ библиотеке користећи Illumina DNA Mix комплет из Illumina MiSeq PE75 комплета. Коришћен је стандардни адаптер (BioO). Датотеке са сировим подацима доступне су из NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 и SRR8924809). Основни квалитет очитавања процењен је помоћу FastQC [23]. Trimmomatic [24] је коришћен за адаптере за исецање и очитавања лошег квалитета. „shotgun“ очитавања са упареним крајевима су FLASH спојена у дужа појединачна очитавања са минималним преклапањем од 20 bp како би се избегла неусклађеност [25]. Спојени очитавања су анотирана помоћу BLASTN-а користећи базу података таксономије шкољки NCBI (вредност e < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирање секвенци ниске сложености је извршено помоћу DUST-а [26]. Спојени очитавања су анотирана помоћу BLASTN-а користећи базу података таксономије шкољки NCBI (вредност e < 1e−3 и 90% хомологија), а маскирање секвенци ниске сложености је извршено помоћу DUST-а [26]. Объединенние чтениа били аннотировани с помосьу БЛАСТН с пользователами бази данних таксономии двустворчатих моллусков НЦБИ (значение е < 1е-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательних низкој сложености било использовано с использованием ДУСТ [26]. Збирни очитани подаци су анотирани помоћу BLASTN-а користећи NCBI базу података таксономије шкољки (вредност е < 1e-3 и 90% хомологија), а маскирање секвенци ниске сложености је извршено помоћу DUST-а [26].使用双壳类НЦБИ 分类数据库（е 值< 1е-3 和90% 同源性）用БЛАСТН 注释合并的读数（使用双和90% 同源性）用БЛАСТН 注释合并的合并的读数进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 нцби 分类 （（（<1е-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 缻数 （并 缻数 Ｖ进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенние чтениа били аннотировани с помосьу БЛАСТН с использованием таксономическој бази данних двустворчатих моллусков НЦБИ (значение е <1е-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательних низкој сложности использовано с использованием ДУСТ [26]. Збирни очитани подаци су анотирани помоћу BLASTN-а користећи NCBI базу података о таксономији шкољки (е вредност <1e-3 и 90% хомологија), а маскирање секвенци ниске сложености је извршено помоћу DUST-а [26].Очитавања су подељена у две групе: повезана са секвенцама шкољки (овде названа самоочитавања) и неповезана (несамоочитавања). Две групе су одвојено састављене коришћењем MEGAHIT-а за генерисање контига [27]. У међувремену, таксономска дистрибуција очитавања ванземаљског микробиома је класификована коришћењем Kraken2 [28] и графички представљена Krona кружним дијаграмом на Galaxy [29, 30]. Оптимални kmers је одређен као kmers-59 на основу наших прелиминарних експеримената. Сопствени контиги су затим идентификовани поравнањем са BLASTN-ом (база података шкољки NCBI, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија) за коначну анотацију. Сопствени контиги су затим идентификовани поравнањем са BLASTN-ом (база података шкољки NCBI, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија) за коначну анотацију. Затем собственние контиги били идентификовани путем составлениа с БЛАСТН (база данних двустворчатих моллусков НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%) дла окончательној аннотации. Самоконтиги су затим идентификовани упаривањем са BLASTN-ом (NCBI база података шкољки, вредност e <1e-10 и 60% хомологија) за коначну анотацију.然后通过与БЛАСТН (双壳贝类НЦБИ 数据库, е 值< 1е-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与БЛАСТН (双壳贝类НЦБИ 数据库, е 值< 1е-10 和60% Затем били идентификовани собственние контиги дла окончательној аннотации путем составлениа с БЛАСТН (база данних НЦБИ дла двустворчатих моллусков, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Самоконтиги су затим идентификовани за коначну анотацију упаривањем са BLASTN-ом (NCBI база података шкољки, вредност e <1e-10 и 60% хомологија). Паралелно, контизи који нису део сопствене групе су анотирани помоћу BLASTN-а (nt NCBI база података, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). Паралелно, контизи који нису део сопствене групе су анотирани помоћу BLASTN-а (nt NCBI база података, вредност e < 1e−10 и 60% хомологија). Параллельно чужеродние групповие контиги били аннотировани с помосьу БЛАСТН (база данних нт НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Паралелно, контизи страних група су анотирани помоћу BLASTN-а (NT NCBI база података, вредност e <1e-10 и 60% хомологија).平行地, 用БЛАСТН (нт НЦБИ 数据库, е 值< 1е-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠平行地, 用БЛАСТН (нт НЦБИ 数据库, е 值< 1е-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠 Параллельно контиги, не относасиеса к сопственој групи, били аннотировани с помосьу БЛАСТН (база данних нт НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Паралелно, контизи који нису сопствене групе су анотирани помоћу BLASTN-а (nt NCBI база података, вредност e <1e-10 и 60% хомологија). BLASTX је такође спроведен на не-сопственим контизима коришћењем nr и RefSeq протеинских NCBI база података (e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). BLASTX је такође спроведен на не-сопственим контизима коришћењем nr и RefSeq протеинских NCBI база података (e вредност < 1e−10 и 60% хомологија). БЛАСТКС је такође био спроведен на несамостоательних контигах с использованием базе данних белк нр и РефСек НЦБИ (значење е <1е-10 и гомологиа 60%). BLASTX је такође спроведен на не-сопственим контизима коришћењем nr и RefSeq NCBI база података протеина (е вредност < 1e-10 и 60% хомологија).还使用нр 和РефСек 蛋白НЦБИ 数据库对非自身重叠群进行了БЛАСТКС (е 值< 1е-10 咧 60% 咧)还使用нр 和РефСек 蛋白НЦБИ 数据库对非自身重叠群进行了БЛАСТКС (е 值< 1е-10 咧 60% 咧) БЛАСТКС также виполнал на несамостоательних контигах с использованием баз данних белка нр и РефСек НЦБИ (значење е <1е-10 и гомологиа 60%). BLASTX је такође спроведен на не-сопственим контизима коришћењем nr и RefSeq NCBI база података протеина (е вредност <1e-10 и 60% хомологија).BLASTN и BLASTX базени не-самоконтига представљају коначне контиге (видети Додатну датотеку).
Прајмери ​​коришћени за ПЦР наведени су у Табели S1. Taq ДНК полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON) је коришћена за амплификацију циљних гена ccfDNA. Коришћени су следећи реакциони услови: денатурација на 95°C током 3 минута, 95°C током 1 минут, подешена температура жарења током 1 минута, елонгација на 72°C током 1 минут, 35 циклуса и коначно 72°C у року од 10 минута. . ПЦР производи су раздвојени електрофорезом у агарозним геловима (1,5%) који садрже SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) на 95 V.
Дагње (Mytilus spp.) су аклиматизоване у 500 мл оксигенисане морске воде (32 PSU) током 24 сата на 4°C. Плазмидна ДНК која садржи уметак који кодира секвенцу цДНК људског галектина-7 (NCBI приступни број L07769) додата је у бочицу у коначној концентрацији од 190 μг/μл. Дагње инкубиране под истим условима без додавања ДНК биле су контрола. Трећи контролни резервоар садржао је ДНК без дагњи. Да би се пратио квалитет ДНК у морској води, узорци морске воде (20 μл; три понављања) узети су из сваког резервоара у назначено време. Ради следљивости плазмидне ДНК, LB дагње су сакупљене у назначено време и анализиране помоћу qPCR и ddPCR. Због високог садржаја соли у морској води, аликвоти су разблажени у води PCR квалитета (1:10) пре свих PCR тестова.
Дигитална ПЦР капљица (ддПЦР) је извршена коришћењем протокола BioRad QX200 (Мисисага, Онтарио, Канада). Користите температурни профил да бисте одредили оптималну температуру (Табела С1). Капи су генерисане коришћењем генератора капи QX200 (BioRad). ддПЦР је спроведен на следећи начин: 95°C током 5 минута, 50 циклуса од 95°C током 30 секунди и дата температура жарења током 1 минута и 72°C током 30 секунди, 4°C током 5 минута и 90°C у року од 5 минута. Број капи и позитивних реакција (број копија/µl) су мерени коришћењем читача капи QX200 (BioRad). Узорци са мање од 10.000 капљица су одбачени. Контрола обрасца није вршена сваки пут када је ддПЦР покретан.
кПЦР је изведен коришћењем Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сиднеј, Аустралија) и LGALS7 специфичних прајмера. Све квантитативне ПЦР су изведене у 20 µl коришћењем QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). кПЦР је започет са 15 минута инкубације на 95°C, након чега је уследило 40 циклуса на 95°C током 10 секунди и на 60°C током 60 секунди са једним прикупљањем података. Криве топљења су генерисане коришћењем узастопних мерења на 95°C током 5 секунди, 65°C током 60 секунди и 97°C на крају кПЦР. Свака кПЦР је изведена у три примерка, осим за контролне узорке.
Пошто су дагње познате по својој високој брзини филтрације, прво смо истражили да ли могу да филтрирају и задрже фрагменте ДНК присутне у морској води. Такође нас је занимало да ли се ови фрагменти акумулирају у њиховом полуотвореном лимфном систему. Ово питање смо експериментално решили праћењем судбине растворљивих фрагмената ДНК додатих у резервоаре са плавим дагњама. Да бисмо олакшали праћење фрагмената ДНК, користили смо страну (не сопствену) плазмидну ДНК која садржи људски ген галектин-7. ddPCR прати фрагменте плазмидне ДНК у морској води и дагњама. Наши резултати показују да ако је количина фрагмената ДНК у морској води остала релативно константна током времена (до 7 дана) у одсуству дагњи, онда је у присуству дагњи ​​овај ниво скоро потпуно нестао у року од 8 сати (Сл. 1а,б). Фрагменти егзогене ДНК су лако детектовани у року од 15 минута у интравалвуларној течности и хемолимфи (Сл. 1ц). Ови фрагменти су се и даље могли детектовати до 4 сата након излагања. Ова активност филтрирања у односу на фрагменте ДНК је упоредива са активношћу филтрирања бактерија и алги [31]. Ови резултати указују на то да дагње могу филтрирати и акумулирати страну ДНК у својим течним одељцима.
Релативне концентрације плазмидне ДНК у морској води у присуству (А) или одсуству (Б) дагњи, мерене ddPCR-ом. У А, резултати су изражени као проценти, при чему границе оквира представљају 75. и 25. перцентил. Уклопљена логаритамска крива је приказана црвеном бојом, а површина осенчена сивом бојом представља 95% интервал поверења. У Б, црвена линија представља средњу вредност, а плава линија представља 95% интервал поверења за концентрацију. Ц Акумулација плазмидне ДНК у хемолимфи и валвуларној течности дагњи ​​у различитим временима након додавања плазмидне ДНК. Резултати су представљени као апсолутни број детектованих копија/мл (±SE).
Затим смо истражили порекло ccfDNA у дагњама сакупљеним из лежишта дагњи ​​на острвима Кергелен, удаљеној групи острва са ограниченим антропогеним утицајем. У ту сврху, cccDNA из хемолимфи дагњи ​​је изолована и пречишћена методама које се уобичајено користе за пречишћавање људске cccDNA [32, 33]. Открили смо да су просечне концентрације ccfDNA хемолимфе у дагњама у опсегу ниских микрограма по мл хемолимфе (видети Табелу С2, Додатне информације). Овај опсег концентрација је много већи него код здравих људи (ниски нанограми по милилитру), али у ретким случајевима, код пацијената оболелих од рака, ниво ccfDNA може достићи неколико микрограма по милилитру [34, 35]. Анализа расподеле величине ccfDNA хемолимфе показала је да се ови фрагменти значајно разликују по величини, у распону од 1000 bp до 1000 bp, па све до 5000 bp (Слика 2). Слични резултати су добијени коришћењем QIAamp Investigator Kit-а на бази силицијум диоксида, методе која се често користи у форензичкој науци за брзу изолацију и пречишћавање геномске ДНК из узорака ДНК ниске концентрације, укључујући ccfDNA [36].
Репрезентативни ccfDNA електрофореграм хемолимфе шкољки. Екстраховано помоћу NucleoSnap Plasma Kit-а (горе) и QIAamp DNA Investigator Kit-а. B Виолински дијаграм који приказује расподелу концентрација ccfDNA хемолимфе (±SE) код шкољки. Црне и црвене линије представљају медијану и први и трећи квартил, респективно.
Приближно 1% ccfDNA код људи и примата има страни извор [21, 37]. С обзиром на полуотворени циркулаторни систем шкољки, морску воду богату микробима и расподелу величине ccfDNA дагњи, поставили смо хипотезу да ccfDNA хемолимфе шкољки може да садржи богат и разноврстан пул микробне ДНК. Да бисмо тестирали ову хипотезу, секвенцирали смо ccfDNA хемолимфе из узорака Aulacomya atra прикупљених са острва Кергелен, што је дало преко 10 милиона очитавања, од којих је 97,6% прошло контролу квалитета. Очитавања су затим класификована према сопственим и туђим изворима користећи базе података о шкољкама BLASTN и NCBI (Сл. S1, Додатне информације).
Код људи, и нуклеарна и митохондријална ДНК могу се ослободити у крвоток [38]. Међутим, у овој студији није било могуће детаљно описати нуклеарну геномску ДНК дагњи, с обзиром на то да геном A. atra није секвенциран или описан. Међутим, успели смо да идентификујемо бројне фрагменте ccfDNA нашег сопственог порекла користећи библиотеку шкољки (Сл. S2, Додатне информације). Такође смо потврдили присуство фрагмената ДНК нашег сопственог порекла усмереном PCR амплификацијом оних гена A. atra који су секвенцирани (Сл. 3). Слично томе, с обзиром на то да је митохондријални геном A. atra доступан у јавним базама података, могу се пронаћи докази о присуству фрагмената митохондријалне ccfDNA у хемолимфи A. atra. Присуство фрагмената митохондријалне ДНК потврђено је PCR амплификацијом (Сл. 3).
Различити митохондријални гени били су присутни у хемолимфи A. atra (црвене тачке – број залиха: SRX5705969) и M. platensis (плаве тачке – број залиха: SRX5705968) амплификованим PCR-ом. Слика адаптирана из Breton et al., 2011 B Амплификација супернатанта хемолимфе из A. atra Чувано на FTA папиру. Користите бушилицу од 3 mm да бисте директно додали у PCR епрувету која садржи PCR смесу.
С обзиром на обилан садржај микроба у морској води, првобитно смо се фокусирали на карактеризацију секвенци микробне ДНК у хемолимфи. Да бисмо то урадили, користили смо две различите стратегије. Прва стратегија је користила Kraken2, програм за класификацију секвенци заснован на алгоритму који може да идентификује микробне секвенце са тачношћу упоредивом са BLAST-ом и другим алатима [28]. Више од 6719 очитавања је утврђено да је бактеријског порекла, док је 124 и 64 потицало од археја и вируса, респективно (Сл. 4). Најзаступљенији фрагменти бактеријске ДНК били су Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (Сл. 4а). Ова дистрибуција је у складу са претходним студијама микробиома морске плаве дагње [39, 40]. Gammaproteobacteria су биле главна класа Proteobacteria (44%), укључујући многе Vibrionales (Сл. 4б). ddPCR метода је потврдила присуство фрагмената Vibrio ДНК у ccfDNA хемолимфе A. atra (Сл. 4ц) [41]. Да би се добило више информација о бактеријском пореклу ccfDNA, коришћен је додатни приступ (Сл. S2, Додатне информације). У овом случају, очитавања која су се преклапала састављена су као очитавања упарених крајева и класификована су као сопствена (шкољке) или несопственог порекла коришћењем BLASTN-а и е вредности од 1e−3 и граничне вредности са >90% хомологије. У овом случају, очитавања која су се преклапала састављена су као очитавања упарених крајева и класификована су као сопствена (шкољке) или несопственог порекла коришћењем BLASTN-а и е вредности од 1e−3 и граничне вредности са >90% хомологије. В етом случае перекриваусааса чтениа били собрание как чтениа с парними концами и били классифицировани как собственние (двустворчатие моллуски) или чужие по происхождениу с использованием БЛАСТН и значениа е 1е-3 и отсечениа с гомологиеј> 90%. У овом случају, преклапајућа очитавања су прикупљена као упарена очитавања и класификована су као природна (шкољке) или неоригинална коришћењем BLASTN-а и е вредности од 1e-3 и граничне вредности са >90% хомологије.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用БЛАСТН 和1е-3 的е>值%和е 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使甌 1 бласт值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。. В етом случае перекриваусихса чтениа били собрание как чтениа с парними концами и классифицировани как собственние (двустворчатие моллуски) или несобственние по происхождениу с использованием значениа е БЛАСТН и 1е-3 и порога гомологии> 90%. У овом случају, преклапајућа очитавања су сакупљена као упарена очитавања и класификована као сопствена (шкољке) или неоригинална коришћењем вредности e BLASTN и 1e-3 ​​и прага хомологије >90%.Пошто геном A. atra још увек није секвенциран, користили смо de novo стратегију асемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Укупно 147.188 контига је идентификовано као зависно (шкољке) порекло. Ови контизи су затим експлодирани са е-вредностима од 1e-10 коришћењем BLASTN и BLASTX. Ова стратегија нам је омогућила да идентификујемо 482 фрагмента који нису шкољке присутна у ccfDNA A. atra. Више од половине (57%) ових ДНК фрагмената је добијено од бактерија, углавном од шкржних симбионта, укључујући сулфотрофне симбионте, и од шкржних симбионта Solemya velum (Сл. 5).
Релативна абулуемост на нивоу типа. Б Микробна разноликост два главна фила (Firmicutes и Proteobacteria). Репрезентативна амплификација ddPCR Ц Vibrio spp. А. Фрагменти гена 16S рРНК (плаво) у три атра хемолимфе.
Анализирано је укупно 482 прикупљена контига. Општи профил таксономске дистрибуције метагеномских контиг анотација (прокариоти и еукариоти). Б Детаљна дистрибуција бактеријских ДНК фрагмената идентификованих помоћу BLASTN и BLASTX.
Анализа Kraken2 је такође показала да ccfDNA дагњи ​​садржи фрагменте археалне ДНК, укључујући фрагменте ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (Сл. 6а). Присуство фрагмената ДНК изведених из Euryarchaeota и Crenarchaeota, раније пронађених у микробној заједници калифорнијских дагњи, не би требало да буде изненађење [42]. Иако се Euryarchaeota често повезује са екстремним условима, сада је препознато да су и Euryarchaeota и Crenarcheota међу најчешћим прокариотима у морском криогеном окружењу [43, 44]. Присуство метаногених микроорганизама у дагњама није изненађујуће, с обзиром на недавне извештаје о великим цурењима метана са дна на платоу Кергелен [45] и могућој микробној производњи метана примећеној код обале острва Кергелен [46].
Наша пажња се затим пребацила на очитавања ДНК вируса. Колико нам је познато, ово је прва ванциљна студија садржаја вируса у дагњама. Као што се и очекивало, пронашли смо фрагменте ДНК бактериофага (Caudovirales) (Сл. 6б). Међутим, најчешћа вирусна ДНК потиче из типа нуклеоцитовируса, познатог и као нуклеарни цитоплазматски велики ДНК вирус (NCLDV), који има највећи геном од било ког вируса. Унутар овог типа, већина ДНК секвенци припада породицама Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чији природни домаћини укључују кичмењаке и зглавкароноше, док мали део ових ДНК секвенци припада познатим вирусолошким алгама. Инфицира морске еукариотске алге. Секвенце су такође добијене из вируса Пандора, џиновског вируса са највећом величином генома од свих познатих вирусних родова. Занимљиво је да је опсег домаћина за које се зна да су заражени вирусом, утврђен секвенцирањем ccfDNA хемолимфе, био релативно велики (Слика S3, Додатне информације). Укључује вирусе који инфицирају инсекте као што су Baculoviridae и Iridoviridae, као и вирусе који инфицирају амебе, алге и кичмењаке. Такође смо пронашли секвенце које се подударају са геномом Pithovirus sibericum. Питовируси (познати и као „зомби вируси“) први пут су изоловани из пермафроста старог 30.000 година у Сибиру [47]. Стога су наши резултати у складу са претходним извештајима који показују да нису све модерне врсте ових вируса изумрле [48] и да ови вируси могу бити присутни у удаљеним субарктичким морским екосистемима.
Коначно, тестирали смо да ли можемо пронаћи фрагменте ДНК из других вишећелијских животиња. Укупно 482 страна контига су идентификована помоћу BLASTN и BLASTX са nt, nr и RefSeq библиотекама (геномским и протеинским). Наши резултати показују да међу страним фрагментима ccfDNA вишећелијских животиња преовлађује ДНК коштаних костију (Сл. 5). Пронађени су и фрагменти ДНК инсеката и других врста. Релативно велики део фрагмената ДНК није идентификован, вероватно због недовољне заступљености великог броја морских врста у геномским базама података у поређењу са копненим врстама [49].
У овом раду примењујемо концепт ЛБ на дагње, тврдећи да секвенцирање ccfDNA хемолимфе може пружити увид у састав морских приобалних екосистема. Конкретно, открили смо да 1) хемолимфа дагњи ​​садржи релативно високе концентрације (микрограмски нивои) релативно великих (~1-5 kb) циркулишућих фрагмената ДНК; 2) ови фрагменти ДНК су и независни и не-независни 3) Међу страним изворима ових фрагмената ДНК пронашли смо бактеријску, архејску и вирусну ДНК, као и ДНК других вишећелијских животиња; 4) Акумулација ових страних ccfDNA фрагмената у хемолимфи се одвија брзо и доприноси унутрашњој активности филтрирања дагњи. Закључно, наша студија показује да концепт ЛБ, који је до сада примењиван углавном у области биомедицине, кодира богат, али неистражен извор знања који се може користити за боље разумевање интеракције између сентинел врста и њиховог окружења.
Поред примата, изолација ccfDNA је забележена и код сисара, укључујући мишеве, псе, мачке и коње [50, 51, 52]. Међутим, колико нам је познато, наша студија је прва која је објавила детекцију и секвенцирање ccfDNA код морских врста са отвореним системом циркулације. Ова анатомска карактеристика и способност филтрирања дагњи ​​могу, барем делимично, објаснити различите карактеристике величине циркулишућих фрагмената ДНК у поређењу са другим врстама. Код људи, већина фрагмената ДНК који циркулишу у крви су мали фрагменти величине од 150 до 200 bp са максималним врхом од 167 bp [34, 53]. Мали, али значајан део фрагмената ДНК је величине између 300 и 500 bp, а око 5% је дуже од 900 bp. [54]. Разлог за ову дистрибуцију величине је тај што главни извор ццфДНК у плазми настаје као резултат ћелијске смрти, било због ћелијске смрти или због некрозе циркулишућих хематопоетских ћелија код здравих особа или због апоптозе туморских ћелија код пацијената оболелих од рака (познато као циркулишућа туморска ДНК). , цтДНК). Дистрибуција величине ццфДНК хемолимфе коју смо пронашли код дагњи ​​кретала се од 1000 до 5000 бп, што сугерише да ццфДНК дагњи ​​има другачије порекло. Ово је логична хипотеза, јер дагње имају полуотворени васкуларни систем и живе у морским воденим срединама које садрже високе концентрације микробне геномске ДНК. У ствари, наши лабораторијски експерименти који користе егзогену ДНК показали су да дагње акумулирају фрагменте ДНК у морској води, барем након неколико сати они се разграђују након ћелијског уноса и/или ослобађају и/или складиште у различитим организацијама. С обзиром на реткост ћелија (и прокариотских и еукариотских), употреба интравалвуларних одељака ће смањити количину ццфДНК из сопствених извора, као и из страних извора. Узимајући у обзир важност урођеног имунитета шкољки и велики број фагоцита у циркулацији, додатно смо поставили хипотезу да је чак и страна ццфДНК обогаћена циркулишућим фагоцитима који акумулирају страну ДНК након уноса микроорганизама и/или ћелијских остатака. Узети заједно, наши резултати показују да је ццфДНК хемолимфе шкољки јединствено спремиште молекуларних информација и потврђује њихов статус чуварске врсте.
Наши подаци указују да секвенцирање и анализа фрагмената ccfDNA хемолимфе изведених из бактерија може пружити кључне информације о флори домаћина бактерија и бактеријама присутним у околном морском екосистему. Технике секвенцирања шутовима откриле су секвенце комензалних бактерија A. atra (шкрге) које би биле пропуштене да су коришћене конвенционалне методе идентификације 16S рРНК, делимично због пристрасности референтне библиотеке. У ствари, наша употреба LB података прикупљених од M. platensis у истом слоју дагњи ​​у Кергелену показала је да је састав бактеријских симбионата повезаних са шкргама био исти за обе врсте дагњи ​​(Сл. S4, Додатне информације). Ова сличност две генетски различите дагње може одражавати састав бактеријских заједница у хладним, сумпорним и вулканским наслагама Кергелена [55, 56, 57, 58]. Виши нивои микроорганизама који редукују сумпор добро су описани приликом сакупљања дагњи ​​из биотурбираних приобалних подручја [59], као што је обала Порт о Франса. Друга могућност је да је флора комензалних дагњи ​​погођена хоризонталним преношењем [60, 61]. Потребна су додатна истраживања како би се утврдила корелација између морског окружења, површине морског дна и састава симбиотских бактерија у дагњама. Ове студије су тренутно у току.
Дужина и концентрација ccfDNA хемолимфе, лакоћа пречишћавања и висок квалитет који омогућава брзо секвенцирање методом „сачмар“ су неке од многих предности коришћења ccfDNA дагњи ​​за процену биодиверзитета у морским приобалним екосистемима. Овај приступ је посебно ефикасан за карактеризацију вирусних заједница (вирома) у датом екосистему [62, 63]. За разлику од бактерија, археја и еукариота, вирусни геноми не садрже филогенетски конзервиране гене као што су 16S секвенце. Наши резултати указују да се течни биопсијски узорци из индикаторских врста као што су дагње могу користити за идентификацију релативно великог броја фрагмената вируса ccfDNA за које се зна да инфицирају домаћине који обично насељавају приобалне морске екосистеме. Ово укључује вирусе за које се зна да инфицирају протозое, зглавкаре, инсекте, биљке и бактеријске вирусе (нпр. бактериофаге). Слична дистрибуција је пронађена када смо испитали виром ccfDNA хемолимфе плавих дагњи ​​(M. platensis) сакупљен у истом слоју дагњи ​​у Кергелену (Табела S2, Додатне информације). Секвенцирање ццфДНК методом сачмарице је заиста нови приступ који добија на замаху у проучавању вирома људи или других врста [21, 37, 64]. Овај приступ је посебно користан за проучавање дволанчаних ДНК вируса, јер ниједан ген није конзервиран међу свим дволанчаним ДНК вирусима, што представља најразноврснију и најширу класу вируса у Балтимору [65]. Иако већина ових вируса остаје некласификована и може укључивати вирусе из потпуно непознатог дела вирусног света [66], открили смо да се вироми и распони домаћина дагњи ​​A. atra и M. platensis налазе између ове две врсте слично (видети слику S3, додатне информације). Ова сличност није изненађујућа, јер може одражавати недостатак селективности у апсорпцији ДНК присутне у окружењу. Тренутно су потребне будуће студије које користе пречишћену РНК да би се окарактерисао РНК виром.
У нашој студији, користили смо веома ригорозан процес секвенцирања адаптиран из рада Коварског и колега [37], који су користили двостепено брисање обједињених очитавања и контига пре и после склапања нативне ccfDNA, што је резултирало високим уделом немапираних очитавања. Стога, не можемо искључити да нека од ових немапираних очитавања и даље могу имати своје порекло, првенствено зато што немамо референтни геном за ову врсту дагњи. Такође смо користили овај процес секвенцирања јер смо били забринути због химера између сопствених и туђих очитавања и дужина очитавања које је генерисао Illumina MiSeq PE75. Још један разлог за већину неистражених очитавања је тај што велики део морских микроба, посебно у удаљеним подручјима као што је Кергелен, није анотиран. Користили смо Illumina MiSeq PE75, претпостављајући да су дужине фрагмената ccfDNA сличне дужинама људске ccfDNA. За будуће студије, с обзиром на наше резултате који показују да ccfDNA хемолимфе има дуже очитавање него људи и/или сисари, препоручујемо употребу платформе за секвенцирање која је погоднија за дуже фрагменте ccfDNA. Ова пракса ће знатно олакшати идентификацију више индикација за дубљу анализу. Добијање тренутно недоступне комплетне секвенце нуклеарног генома A. atra такође би значајно олакшало разликовање ццфДНК од сопствених и туђих извора. С обзиром на то да се наше истраживање фокусирало на могућност примене концепта течне биопсије на дагње, надамо се да ће, како се овај концепт буде користио у будућим истраживањима, бити развијени нови алати и цевоводи како би се повећао потенцијал ове методе за проучавање микробне разноликости дагњи. морског екосистема.
Као неинвазивни клинички биомаркер, повишени нивои ccfDNA у људској плазми повезани су са различитим болестима, оштећењем ткива и стресним стањима [67,68,69]. Ово повећање је повезано са ослобађањем фрагмената ДНК сопственог порекла након оштећења ткива. Овим проблемом смо се позабавили користећи акутни топлотни стрес, у којем су дагње кратко биле изложене температури од 30 °C. Ову анализу смо спровели на три различите врсте дагњи ​​у три независна експеримента. Међутим, нисмо пронашли никакву промену у нивоима ccfDNA након акутног топлотног стреса (видети слику S5, додатне информације). Ово откриће може објаснити, барем делимично, чињеницу да дагње имају полуотворени циркулаторни систем и акумулирају велике количине стране ДНК због своје високе активности филтрирања. С друге стране, дагње, као и многи бескичмењаци, могу бити отпорније на оштећење ткива изазвано стресом, чиме се ограничава ослобађање ccfDNA у њиховој хемолимфи [70, 71].
До данас, ДНК анализа биодиверзитета у воденим екосистемима углавном се фокусирала на метабаркодовање еколошке ДНК (еДНК). Међутим, ова метода је обично ограничена у анализи биодиверзитета када се користе прајмери. Употреба секвенцирања „shotgun“ заобилази ограничења PCR-а и пристрасан избор скупова прајмера. Стога, у извесном смислу, наша метода је ближа недавно коришћеној методи секвенцирања еДНК „shotgun“ високог протока, која је у стању да директно секвенцира фрагментирану ДНК и анализира скоро све организме [72, 73]. Међутим, постоји низ фундаменталних проблема који разликују LB од стандардних еДНК метода. Наравно, главна разлика између еДНК и LB је употреба природних домаћина филтера. Пријављена је употреба морских врста као што су сунђери и шкољке (Dresseina spp.) као природног филтера за проучавање еДНК [74, 75]. Међутим, Драјсенина студија је користила биопсије ткива из којих је ДНК екстрахована. Анализа ccfДНК из LB не захтева биопсију ткива, специјализовану и понекад скупу опрему и логистику повезану са еДНК или биопсијом ткива. У ствари, недавно смо известили да се ццфДНК из ЛБ може чувати и анализирати уз подршку ФТА без одржавања хладног ланца, што је велики изазов за истраживања у удаљеним подручјима [76]. Екстракција ццфДНК из течних биопсија је такође једноставна и обезбеђује висококвалитетну ДНК за секвенцирање „сачмаром“ и ПЦР анализу. Ово је велика предност с обзиром на нека техничка ограничења повезана са анализом еДНК [77]. Једноставност и ниска цена методе узорковања су такође посебно погодни за дугорочне програме праћења. Поред њихове високе способности филтрирања, још једна добро позната карактеристика шкољки је хемијски мукополисахаридни састав њиховог слузи, који подстиче апсорпцију вируса [78, 79]. Ово чини шкољке идеалним природним филтером за карактеризацију биодиверзитета и утицаја климатских промена у датом воденом екосистему. Иако се присуство фрагмената ДНК изведених из домаћина може посматрати као ограничење методе у поређењу са еДНК, трошкови повезани са поседовањем такве нативне ццфДНК у поређењу са еДНК су истовремено разумљиви због огромне количине информација доступних за здравствене студије. офсет домаћин. Ово укључује присуство вирусних секвенци интегрисаних у геном домаћина. Ово је посебно важно за дагње, с обзиром на присуство хоризонтално преношених леукемијских ретровируса код шкољки [80, 81]. Још једна предност ЛБ у односу на еДНК је то што користи фагоцитну активност циркулишућих крвних ћелија у хемолимфи, које захватају микроорганизме (и њихове геноме). Фагоцитоза је главна функција крвних ћелија код шкољки [82]. Коначно, метода користи висок капацитет филтрирања дагњи ​​(просечно 1,5 л/х морске воде) и дводневну циркулацију, што повећава мешање различитих слојева морске воде, омогућавајући хватање хетерологне еДНК. [83, 84]. Стога је анализа ccfDNA дагњи ​​занимљив пут с обзиром на нутритивне, економске и еколошке утицаје дагњи. Слично анализи ЛБ прикупљене од људи, ова метода такође отвара могућност мерења генетских и епигенетских промена у ДНК домаћина као одговор на егзогене супстанце. На пример, технологије секвенцирања треће генерације могу се предвидети за извођење анализе метилације целог генома у нативној ccfDNA коришћењем нанопорског секвенцирања. Овај процес би требало да буде олакшан чињеницом да је дужина фрагмената ccfDNA дагњи ​​идеално компатибилна са платформама за секвенцирање дугог читања које омогућавају анализу метилације ДНК целог генома из једног секвенцирања без потребе за хемијским трансформацијама.85,86] Ово је занимљива могућност, јер је показано да обрасци метилације ДНК одражавају одговор на стрес у животној средини и трају током многих генерација. Стога, може пружити драгоцен увид у основне механизме који управљају одговором након излагања климатским променама или загађивачима [87]. Међутим, употреба LB није без ограничења. Непотребно је рећи да ово захтева присуство индикаторских врста у екосистему. Као што је горе поменуто, коришћење LB за процену биодиверзитета датог екосистема такође захтева ригорозан биоинформатички процес који узима у обзир присуство фрагмената ДНК из извора. Још један велики проблем је доступност референтних генома за морске врсте. Нада се да ће иницијативе попут Пројекта генома морских сисара и недавно основаног пројекта Fish10k [88] олакшати такву анализу у будућности. Примена ЛБ концепта на морске организме који се хране филтрирањем воде такође је компатибилна са најновијим достигнућима у технологији секвенцирања, што је чини веома погодном за развој вишеомских биомаркера како би се пружиле важне информације о здрављу морских станишта као одговор на стрес из животне средине.
Подаци о секвенцирању генома депоновани су у NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Брајерли АС, Кингсфорд МЈ Утицај климатских промена на морски живот и екосистеме. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Гиси Е, Манеа Е, Мазарис АД, Фрашети С, Алмпаниду В, Бевилаква С, и др. Размотрите комбиноване утицаје климатских промена и других локалних стресора на морску средину. општа научна животна средина. 2021;755:142564.
Царелла Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П, ет ал. ). Наука првог марта. 2020;7:48.
Серонт Л, Никастро ЦР, Зарди ГИ, Гобервил Е. Смањена толеранција на топлоту у условима понављајућег топлотног стреса објашњава високу летњу смртност плавих дагњи. Научни извештај 2019; 9:17498.
Феј СБ, Сипиелски АМ, Нусле С, Сервантес-Јошида К, Хван ЈЛ, Хубер ЕР, и др. Недавне промене у учесталости, узроцима и обиму угинућа животиња. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Сцарпа Ф, Санна Д, Аззена И, Мугхетти Д, Церрути Ф, Хоссеини С, ет ал. Вишеструки неспецифични патогени су можда изазвали масовну смртност Пинна нобилис. Живот. 2020;10:238.
Бредли М, Коутс СЈ, Џенкинс Е, О'Хара ТМ. Потенцијални утицај климатских промена на арктичке зоонотске болести. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Бејер Ј., Грин НВ, Брукс С., Алан ИЈ, Рус А., Гомез Т. и др. Плаве дагње (Mytilus edulis spp.) као сигнални организми у праћењу загађења обале: преглед. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравегна Г, Марсони С, Сијена С, Бардели А. Интеграција течне биопсије у лечење рака. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван ЈЦМ, Маси Ц, Гарсија-Корбачо Ј, Мулијер Ф, Брентон ЈД, Калдас Ц, и др. Сазревање течне биопсије: Омогућава циркулацију туморске ДНК. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандел П., Метаис П. Нуклеинске киселине у људској плазми. Записник са састанака подружница Соц Биол. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст АЈ, Унгерер В, Холденридер С. Нова улога ДНК без ћелија као молекуларног маркера за лечење рака. Квантификација биомоларне анализе. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж ГВ, Џефри СС Течна биопсија улази у клинику – проблеми имплементације и будући изазови. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло ЈМ, Корбета Н., Чемберлен ПФ, Раи В., Сарџент ИЛ, Редман ЦВ и други. Фетална ДНК је присутна у мајчиној плазми и серуму. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфареј МН, Вонг РЈ, Шо ГМ, Стивенсон ДК, Квејк СР Студија тока трудноће и њених компликација коришћењем циркулишуће екстрацелуларне РНК у крви жена током трудноће. Допедијатрија. 2020;8:605219.
Олерих М, Шервуд К, Кион П, Шуц Е, Бек Ј, Стегбауер Ј и др. Течна биопсија: ДНК без ћелија донора се користи за откривање алогених лезија у калемљеном бубрегу. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.Ц., Ло Ј.М. Иновације у пренаталној дијагностици: секвенцирање генома мајчине плазме. Ана М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В, Денг X, Ли М, Суку ЈД, Аревало С, Страјк Д, и др. Брза детекција патогена помоћу метагеномског секвенцирања инфицираних телесних течности следеће генерације. Nat Medicine. 2021;27:115-24.