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Die Flüssigbiopsie (LB) gewinnt in der Biomedizin zunehmend an Bedeutung. Sie basiert auf dem Nachweis zirkulierender extrazellulärer DNA (ccfDNA), die nach dem Zelltod in verschiedenen Geweben als kleine Fragmente freigesetzt wird. Ein kleiner Teil dieser Fragmente stammt aus fremdem Gewebe oder Organismus. In der vorliegenden Arbeit haben wir dieses Konzept auf Miesmuscheln angewendet, eine Indikatorart, die für ihre hohe Filtrationskapazität im Meerwasser bekannt ist. Wir nutzen die Fähigkeit der Muscheln, als natürliche Filter zu fungieren, um DNA-Fragmente aus verschiedenen Quellen zu binden und so Informationen über die Biodiversität mariner Küstenökosysteme zu gewinnen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hämolymphe der Muscheln DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (1 bis 5 kb) enthält. Die Shotgun-Sequenzierung ergab, dass viele dieser DNA-Fragmente mikrobiellen Ursprungs sind. Darunter fanden wir DNA-Fragmente von Bakterien, Archaeen und Viren, darunter auch Viren, die bekanntermaßen verschiedene Wirte in marinen Küstenökosystemen infizieren. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das Konzept der LB, angewendet auf Muscheln, eine reichhaltige, aber bisher unerforschte Quelle des Wissens über die mikrobielle Diversität in marinen Küstenökosystemen darstellt.
Die Auswirkungen des Klimawandels auf die Biodiversität mariner Ökosysteme sind ein schnell wachsendes Forschungsgebiet. Die globale Erwärmung verursacht nicht nur erheblichen physiologischen Stress, sondern verschiebt auch die evolutionären Grenzen der thermischen Stabilität mariner Organismen. Dies beeinträchtigt den Lebensraum zahlreicher Arten und veranlasst sie, nach günstigeren Bedingungen zu suchen [1, 2]. Neben den Auswirkungen auf die Biodiversität von Metazoen stört der Klimawandel das empfindliche Gleichgewicht der Wirt-Mikroben-Interaktionen. Diese mikrobielle Dysbiose stellt eine ernsthafte Bedrohung für marine Ökosysteme dar, da sie marine Organismen anfälliger für Infektionserreger macht [3, 4]. Es wird angenommen, dass bakterielles Fischsterben eine wichtige Rolle bei diesem Massensterben spielt, was ein gravierendes Problem für das Management globaler mariner Ökosysteme darstellt [5, 6]. Dies ist angesichts der ökonomischen, ökologischen und ernährungsphysiologischen Folgen für viele marine Arten von großer Bedeutung. Dies gilt insbesondere für Muscheln in den Polarregionen, wo die Auswirkungen des Klimawandels unmittelbarer und schwerwiegender sind [6, 7]. Tatsächlich werden Muscheln wie Mytilus spp. häufig zur Überwachung der Auswirkungen des Klimawandels auf marine Ökosysteme eingesetzt. Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine relativ große Anzahl von Biomarkern zur Überwachung ihres Gesundheitszustands entwickelt wurde. Oftmals wird dabei ein zweistufiger Ansatz verfolgt, der funktionelle Biomarker auf Basis enzymatischer Aktivität oder zellulärer Funktionen wie Zellviabilität und Phagozytoseaktivität einbezieht [8]. Zu diesen Methoden gehört auch die Messung der Konzentration spezifischer Druckindikatoren, die sich nach der Aufnahme großer Mengen Meerwasser im Weichgewebe anreichern. Die hohe Filtrationskapazität und das halboffene Kreislaufsystem von Muscheln bieten jedoch die Möglichkeit, mithilfe des Konzepts der Flüssigbiopsie (LB) – einem einfachen und minimalinvasiven Verfahren zur Patientenversorgung – neue Hämolymph-Biomarker zu entwickeln [9, 10]. Obwohl in der menschlichen LB verschiedene Arten zirkulierender Moleküle gefunden werden können, basiert dieses Konzept primär auf der DNA-Sequenzanalyse zirkulierender extrazellulärer DNA-Fragmente (cfDNA) im Plasma. Tatsächlich ist das Vorhandensein zirkulierender DNA im menschlichen Plasma bereits seit Mitte des 20. Jahrhunderts bekannt [11], doch erst in den letzten Jahren ermöglichte die Entwicklung von Hochdurchsatzsequenzierungsmethoden die klinische Diagnostik auf Basis zellfreier DNA (ccfDNA). Das Vorhandensein dieser zirkulierenden DNA-Fragmente beruht unter anderem auf der passiven Freisetzung genomischer DNA (nukleärer und mitochondrialer DNA) nach dem Zelltod. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von zellfreier DNA (ccfDNA) normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann aber bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress um das 5- bis 10-fache ansteigen, was zu Gewebeschäden führt. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von zellfreier DNA (ccfDNA) normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann aber bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress um das 5- bis 10-fache ansteigen, was zu Gewebeschäden führt. Bei einer höheren Konzentration von weniger als einem Jahr (<10 ng/ml) kann es sich nicht innerhalb von 5–10 Schritten auf eine bestimmte Pathologie auswirken подVERгающихся Streß, vor dem Ende des Prozesses. Bei gesunden Menschen ist die Konzentration von cccDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann aber bei Patienten mit verschiedenen Pathologien oder unter Stress, der zu Gewebeschäden führt, um das 5- bis 10-fache ansteigen.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml）在 健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 (（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Die Konzentration der ccfDNA-Konzentration beträgt nur wenige (<10 ng/ml) in mehreren Jahren, Sie können sie jedoch nicht in 5–10 Abschnitten von Patienten mit verschiedenen Pathologien oder anderen Patienten auflisten Stress, das приводит к повреждению тканей. Die Konzentrationen von zellfreier DNA (ccfDNA) sind bei gesunden Personen in der Regel niedrig (<10 ng/ml), können aber bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress um das 5- bis 10-Fache ansteigen, was zu Gewebeschäden führt.Die Größe von zellfreien zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA) variiert stark, liegt aber üblicherweise zwischen 150 und 200 Basenpaaren (bp) [12]. Die Analyse körpereigener cfDNA, d. h. cfDNA aus normalen oder transformierten Wirtszellen, ermöglicht den Nachweis genetischer und epigenetischer Veränderungen im nukleären und/oder mitochondrialen Genom und unterstützt so die Auswahl spezifischer molekular gezielter Therapien [13]. cfDNA kann jedoch auch aus fremden Quellen gewonnen werden, beispielsweise aus fetalen Zellen während der Schwangerschaft oder aus transplantierten Organen [14, 15, 16, 17]. cfDNA ist zudem eine wichtige Informationsquelle für den Nachweis von Nukleinsäuren fremder Infektionserreger. Dies ermöglicht den nicht-invasiven Nachweis ausgedehnter Infektionen, die in Blutkulturen nicht erfasst werden, und vermeidet invasive Biopsien infizierten Gewebes [18]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass menschliches Blut eine reichhaltige Informationsquelle zur Identifizierung viraler und bakterieller Pathogene darstellt und dass etwa 1 % der im menschlichen Plasma gefundenen cfDNA fremden Ursprungs ist [19]. Diese Studien zeigen, dass die Biodiversität des zirkulierenden Mikrobioms eines Organismus mittels cfDNA-Analyse bestimmt werden kann. Bis vor Kurzem wurde dieses Konzept jedoch ausschließlich beim Menschen und in geringerem Umfang bei anderen Wirbeltieren angewendet [20, 21].
In der vorliegenden Arbeit nutzen wir das Potenzial der Long-Blood-Methode (LB), um die zellfreie DNA (cfDNA) von Aulacomya atra zu analysieren, einer südlichen Muschelart, die häufig auf den subantarktischen Kerguelen-Inseln vorkommt. Diese Inselgruppe entstand vor 35 Millionen Jahren durch einen Vulkanausbruch auf einem großen Plateau. Mithilfe eines In-vitro-Experiments konnten wir zeigen, dass DNA-Fragmente aus Meerwasser schnell von Muscheln aufgenommen werden und in die Hämolymphe gelangen. Sequenzierungsanalysen ergaben, dass die Hämolymphe-cfDNA der Muscheln sowohl DNA-Fragmente eigenen als auch fremden Ursprungs enthält, darunter DNA-Fragmente von symbiotischen Bakterien und DNA-Fragmente aus Biomen, die typisch für kalte vulkanische Küstenökosysteme sind. Die Hämolymphe-cfDNA enthält außerdem virale Sequenzen von Viren mit unterschiedlichem Wirtsspektrum. Wir fanden auch DNA-Fragmente von vielzelligen Tieren wie Knochenfischen, Seeanemonen, Algen und Insekten. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das Long-Blood-Konzept erfolgreich auf marine Wirbellose angewendet werden kann, um ein umfassendes Genom-Repertoire in marinen Ökosystemen zu generieren.
Adulte Exemplare (55–70 mm lang) der Miesmuscheln Mytilus platensis (M. platensis) und Aulacomya atra (A. atra) wurden im Dezember 2018 an den felsigen Gezeitenküsten von Port-au-France (049°21,235'S, 070°13,490'O), Kerguelen-Inseln, gesammelt. Weitere adulte Miesmuscheln (Mytilus spp.) wurden von einem kommerziellen Anbieter (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) bezogen und in ein temperiertes (4 °C), belüftetes Becken mit 10–20 l künstlicher Salzlösung (32 ‰ Salzgehalt; künstliches Meersalz Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) gegeben. Für jedes Experiment wurden Länge und Gewicht der einzelnen Muschelschalen gemessen.
Ein frei zugängliches Protokoll für dieses Programm ist online verfügbar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kurz gesagt, wurde LB-Hämolymphe aus den Abduktorenmuskeln wie beschrieben [22] gewonnen. Die Hämolymphe wurde durch Zentrifugation bei 1200 × g für 3 Minuten geklärt, der Überstand bis zur Verwendung bei -20 °C eingefroren. Zur Isolierung und Reinigung von zellfreier DNA (cfDNA) wurden Proben (1,5–2,0 ml) aufgetaut und mit dem NucleoSnap cfDNA-Kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA, USA) gemäß den Herstellerangaben verarbeitet. Die cfDNA wurde bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert. In einigen Experimenten wurde die cfDNA mit dem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) isoliert und gereinigt. Die gereinigte DNA wurde mittels eines Standard-PicoGreen-Assays quantifiziert. Die Fragmentverteilung der isolierten zellfreien DNA (cfDNA) wurde mittels Kapillarelektrophorese mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) und einem High Sensitivity DNA Kit analysiert. Die Analyse wurde mit 1 µl der cfDNA-Probe gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.
Für die Sequenzierung von Hämolymph-cfDNA-Fragmenten erstellte Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) Shotgun-Bibliotheken mit dem Illumina DNA Mix Kit des Illumina MiSeq PE75 Kits. Es wurde ein Standardadapter (BioO) verwendet. Die Rohdatendateien sind im NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 und SRR8924809) verfügbar. Die grundlegende Lesequalität wurde mit FastQC [23] überprüft. Trimmomatic [24] wurde zum Entfernen von Adaptern und minderwertigen Reads verwendet. Shotgun-Reads mit gepaarten Enden wurden mittels FLASH zu längeren Einzelreads mit einer minimalen Überlappung von 20 bp zusammengeführt, um Fehlpaarungen zu vermeiden [25]. Die zusammengeführten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung einer NCBI-Taxonomiedatenbank für Muscheln annotiert (E-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie). Die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt. Die zusammengeführten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung einer NCBI-Taxonomiedatenbank für Muscheln annotiert (E-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie). Die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt. Allgemeine Informationen wurden mit BLASTN über die Verwendung von Datenbanken dieser neuen NCBI-Modelle (Ergebnisse e < 1e-3 y.) erstellt 90 % Homologie), a Die nachträgliche Maskierung wurde häufig mit der Staubentfernung durchgeführt [26]. Die gepoolten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung der NCBI Bivalve Taxonomy Database annotiert (E-Wert < 1e-3 und 90% Homologie), und eine Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数, 并 使用 Staub [26]进行 复杂度 序列 的。掩蔽 掩蔽 掩蔽Die allgemeinen Datenschutzbestimmungen wurden mit BLASTN über die Verwendung wirtschaftlicher Datenbanken von NCBI (Bewertung e <1e-3) bewertet und 90 % Homologie), Die Maskierung nach kurzer Zeit wurde häufig mit der Verwendung von Staub durchgeführt [26]. Die gepoolten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung der NCBI Bivalve Taxonomic Database annotiert (E-Wert <1e-3 und 90% Homologie), und eine Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt.Die Reads wurden in zwei Gruppen unterteilt: solche, die mit Muschelsequenzen verwandt waren (hier als Selbst-Reads bezeichnet), und solche, die nicht verwandt waren (Nicht-Selbst-Reads). Beide Gruppen wurden separat mit MEGAHIT zu Contigs assembliert [27]. Die taxonomische Verteilung der Reads des fremden Mikrobioms wurde mit Kraken2 [28] klassifiziert und grafisch in einem Krona-Kreisdiagramm auf Galaxy dargestellt [29, 30]. In unseren Vorversuchen wurde kmer-59 als optimales k-Mer ermittelt. Anschließend wurden Selbst-Contigs durch Alignment mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie) für eine endgültige Annotation identifiziert. Anschließend wurden Selbst-Contigs durch Alignment mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie) für eine endgültige Annotation identifiziert. Bei diesen neuen Krankheiten handelt es sich um Identifizierungsdaten, die mit BLASTN verbunden sind (basierend auf den zweitgrößten NCBI-Verkäufern mit einer Klassifizierung von <1e-10 und 100 %). 60%) окончательной аннотации. Anschließend wurden Selbst-Contigs durch Abgleich mit BLASTN (NCBI Muscheldatenbank, E-Wert <1e-10 und 60% Homologie) zur endgültigen Annotation identifiziert.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Es handelte sich dabei um Identifizierungs- und Vergleichskonten für die Einbeziehung von BLASTN-Anfragen (auf der Grundlage dieser NCBI-Angaben für zweitgrößte Mollusken, Konzentration e <1e-10 und Homologie 60 %). Anschließend wurden Selbst-Contigs für die endgültige Annotation durch Abgleich mit BLASTN (NCBI Muscheldatenbank, E-Wert <1e-10 und 60% Homologie) identifiziert. Parallel dazu wurden Nicht-Selbst-Gruppen-Contigs mit BLASTN annotiert (nt NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie). Parallel dazu wurden Nicht-Selbst-Gruppen-Contigs mit BLASTN annotiert (nt NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie). Parallel dazu wurden verschiedene Gruppenkontingente mit BLASTN kommentiert (ab 1999 mit NCBI, Bewertung e <1e-10 und 60 %). Parallel dazu wurden Contigs fremder Gruppen mit BLASTN annotiert (NT NCBI-Datenbank, E-Wert <1e-10 und 60% Homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Parallel dazu wurden keine Kommentare zur Gruppe veröffentlicht, die mit BLASTN (aufgrund von NCBI, Bewertung <1e-10 und Homologie) veröffentlicht wurden 60 %). Parallel dazu wurden Contigs der Nicht-Selbst-Gruppe mit BLASTN annotiert (nt NCBI-Datenbank, E-Wert <1e-10 und 60% Homologie). Zusätzlich wurde ein BLASTX-Test an nicht-selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Proteindatenbanken des NCBI durchgeführt (E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie). Zusätzlich wurde ein BLASTX-Test an nicht-selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Proteindatenbanken des NCBI durchgeführt (E-Wert < 1e−10 und 60% Homologie). BLASTX wurde auch auf mehreren Kontinenten getestet und basiert auf der Grundlage von Weißbuch Nr. und RefSeq NCBI (Bewertung von <1e-10 und 60 %). Zusätzlich wurde ein BLASTX-Test an nicht-selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-NCBI-Proteindatenbanken durchgeführt (E-Wert < 1e-10 und 60 % Homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX wurde auf mehreren Servern mit einer Kapazität von 100 % und RefSeq NCBI verwendet (Wert <1e-10 und 60 %). Zusätzlich wurde ein BLASTX-Test an nicht-selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-NCBI-Proteindatenbanken durchgeführt (E-Wert <1e-10 und 60% Homologie).Die BLASTN- und BLASTX-Pools der Nicht-Selbst-Contigs stellen die endgültigen Contigs dar (siehe Ergänzungsdatei).
Die für die PCR verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Zur Amplifikation der cfDNA-Zielgene wurde Taq-DNA-Polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) verwendet. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen mit jeweils 1 Minute bei 95 °C, Annealing bei der eingestellten Temperatur für 1 Minute, Elongation bei 72 °C für 1 Minute und abschließend 10 Minuten bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese in 1,5%igen Agarosegelen mit SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bei 95 V aufgetrennt.
Miesmuscheln (Mytilus spp.) wurden 24 Stunden lang bei 4 °C in 500 ml sauerstoffangereichertem Meerwasser (32 PSU) akklimatisiert. Plasmid-DNA mit einem Insert, das die cDNA-Sequenz des humanen Galectin-7 kodiert (NCBI-Zugangsnummer L07769), wurde in einer Endkonzentration von 190 μg/μl zugegeben. Muscheln, die unter denselben Bedingungen ohne DNA-Zugabe inkubiert wurden, dienten als Kontrolle. Ein drittes Kontrollgefäß enthielt DNA ohne Muscheln. Zur Überwachung der DNA-Qualität im Meerwasser wurden zu den angegebenen Zeitpunkten jeweils 20 μl Meerwasserproben aus jedem Gefäß entnommen (drei Wiederholungen). Zur Rückverfolgbarkeit der Plasmid-DNA wurden LB-Muscheln zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und mittels qPCR und ddPCR analysiert. Aufgrund des hohen Salzgehalts des Meerwassers wurden die Aliquots vor allen PCR-Assays mit PCR-Wasser (1:10) verdünnt.
Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) wurde gemäß dem BioRad QX200-Protokoll (Mississauga, Ontario, Kanada) durchgeführt. Die optimale Temperatur wurde anhand des Temperaturprofils (Tabelle S1) bestimmt. Die Tröpfchen wurden mit einem QX200-Tröpfchengenerator (BioRad) erzeugt. Die ddPCR wurde wie folgt durchgeführt: 95 °C für 5 min, 50 Zyklen mit 95 °C für 30 s und einer vorgegebenen Annealing-Temperatur für 1 min sowie 72 °C für 30 s, 4 °C für 5 min und 90 °C innerhalb von 5 min. Die Anzahl der Tröpfchen und positiven Reaktionen (Anzahl der Kopien/µl) wurde mit einem QX200-Tröpfchenlesegerät (BioRad) gemessen. Proben mit weniger als 10.000 Tröpfchen wurden verworfen. Eine Musterkontrolle wurde nicht bei jedem ddPCR-Lauf durchgeführt.
Die quantitative PCR (qPCR) wurde mit dem Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) und LGALS7-spezifischen Primern durchgeführt. Alle qPCRs wurden in einem Volumen von 20 µl mit dem QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) durchgeführt. Die qPCR begann mit einer 15-minütigen Inkubation bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 95 °C und 60 Sekunden bei 60 °C, wobei jeweils ein Messwert erfasst wurde. Die Schmelzkurven wurden durch sukzessive Messungen bei 95 °C für 5 Sekunden, 65 °C für 60 Sekunden und 97 °C am Ende der qPCR erstellt. Jede qPCR wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt, mit Ausnahme der Kontrollproben.
Da Muscheln für ihre hohe Filtrationsrate bekannt sind, untersuchten wir zunächst, ob sie im Meerwasser vorhandene DNA-Fragmente filtern und zurückhalten können. Wir interessierten uns auch dafür, ob sich diese Fragmente in ihrem halboffenen Lymphsystem anreichern. Diese Frage klärten wir experimentell, indem wir das Schicksal löslicher DNA-Fragmente verfolgten, die wir Miesmuschelbecken zugaben. Um die DNA-Fragmente besser verfolgen zu können, verwendeten wir fremde (nicht körpereigene) Plasmid-DNA, die das menschliche Galectin-7-Gen enthielt. Mittels ddPCR konnten wir Plasmid-DNA-Fragmente im Meerwasser und in den Muscheln nachweisen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Menge an DNA-Fragmenten im Meerwasser in Abwesenheit von Muscheln über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen relativ konstant blieb, während sie in Anwesenheit von Muscheln innerhalb von 8 Stunden nahezu vollständig abnahm (Abb. 1a, b). Fragmente exogener DNA waren innerhalb von 15 Minuten in der Klappenflüssigkeit und der Hämolymphe leicht nachweisbar (Abb. 1c). Diese Fragmente konnten noch bis zu 4 Stunden nach der Exposition detektiert werden. Diese Filteraktivität in Bezug auf DNA-Fragmente ist vergleichbar mit der Filteraktivität von Bakterien und Algen [31]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Muscheln fremde DNA filtern und in ihren Flüssigkeitskompartimenten anreichern können.
Relative Konzentrationen von Plasmid-DNA im Meerwasser in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von Muscheln, gemessen mittels ddPCR. In A sind die Ergebnisse als Prozentsätze dargestellt, wobei die Grenzen der Boxen das 75. und 25. Perzentil repräsentieren. Die angepasste logarithmische Kurve ist rot dargestellt, der grau schattierte Bereich repräsentiert das 95%-Konfidenzintervall. In B stellt die rote Linie den Mittelwert und die blaue Linie das 95%-Konfidenzintervall für die Konzentration dar. C: Akkumulation von Plasmid-DNA in der Hämolymphe und der Klappenflüssigkeit von Muscheln zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von Plasmid-DNA. Die Ergebnisse werden als absolute Anzahl detektierter Kopien/ml (±SE) angegeben.
Anschließend untersuchten wir den Ursprung der zellfreien zellfreien DNA (ccfDNA) in Muscheln, die in Muschelbänken der Kerguelen-Inseln, einer abgelegenen Inselgruppe mit geringem anthropogenem Einfluss, gesammelt wurden. Zu diesem Zweck wurde cccDNA aus der Hämolymphe der Muscheln isoliert und mit Methoden gereinigt, die üblicherweise zur Reinigung humaner cccDNA verwendet werden [32, 33]. Wir stellten fest, dass die durchschnittliche ccfDNA-Konzentration in der Hämolymphe der Muscheln im niedrigen Mikrogramm-pro-ml-Bereich liegt (siehe Tabelle S2, Zusatzinformationen). Dieser Konzentrationsbereich ist deutlich höher als bei gesunden Menschen (niedrige Nanogramm pro Milliliter), jedoch kann die ccfDNA-Konzentration in seltenen Fällen bei Krebspatienten mehrere Mikrogramm pro Milliliter erreichen [34, 35]. Eine Analyse der Größenverteilung der Hämolymph-ccfDNA zeigte, dass diese Fragmente in ihrer Größe stark variieren und von 1000 bp bis zu 5000 bp reichen (Abb. 2). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem siliziumdioxidbasierten QIAamp Investigator Kit erzielt, einer Methode, die häufig in der forensischen Wissenschaft zur schnellen Isolierung und Reinigung genomischer DNA aus DNA-Proben mit niedriger Konzentration, einschließlich zellfreier DNA (ccfDNA), eingesetzt wird [36].
Repräsentatives ccfDNA-Elektrophoregramm der Hämolymphe von Muscheln. Extrahiert mit dem NucleoSnap Plasma Kit (oben) und dem QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin-Plot mit der Verteilung der ccfDNA-Konzentrationen (±SE) in der Hämolymphe von Muscheln. Die schwarze und die rote Linie stellen den Median bzw. das erste und dritte Quartil dar.
Etwa 1 % der zellfreien zellfreien DNA (cfDNA) bei Menschen und Primaten stammt aus fremden Quellen [21, 37]. Angesichts des halboffenen Kreislaufsystems von Muscheln, des mikrobenreichen Meerwassers und der Größenverteilung der Muschel-cfDNA vermuteten wir, dass die Hämolymph-cfDNA von Muscheln einen reichhaltigen und vielfältigen Pool an mikrobieller DNA enthalten könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, sequenzierten wir Hämolymph-cfDNA von Aulacomya atra-Proben, die auf den Kerguelen-Inseln gesammelt wurden. Dabei erhielten wir über 10 Millionen Sequenzabschnitte, von denen 97,6 % die Qualitätskontrolle bestanden. Die Sequenzabschnitte wurden anschließend mithilfe der BLASTN- und NCBI-Muscheldatenbanken in körpereigene und fremdeigene DNA-Quellen klassifiziert (Abb. S1, Zusatzinformationen).
Beim Menschen können sowohl nukleäre als auch mitochondriale DNA in den Blutkreislauf gelangen [38]. Da das Genom von A. atra bisher weder sequenziert noch beschrieben wurde, war es in der vorliegenden Studie jedoch nicht möglich, die nukleäre genomische DNA von Muscheln detailliert zu beschreiben. Mithilfe der Muschelbibliothek konnten wir jedoch mehrere zellfreie DNA-Fragmente (cfDNA) eigenen Ursprungs identifizieren (Abb. S2, Zusatzinformationen). Das Vorhandensein dieser DNA-Fragmente wurde durch gezielte PCR-Amplifikation der sequenzierten A. atra-Gene bestätigt (Abb. 3). Da das mitochondriale Genom von A. atra in öffentlichen Datenbanken verfügbar ist, lassen sich auch Hinweise auf mitochondriale cfDNA-Fragmente in der Hämolymphe von A. atra finden. Der Nachweis dieser mitochondrialen DNA-Fragmente erfolgte ebenfalls mittels PCR-Amplifikation (Abb. 3).
Verschiedene mitochondriale Gene wurden in der Hämolymphe von A. atra (rote Punkte – Stammnummer: SRX5705969) und M. platensis (blaue Punkte – Stammnummer: SRX5705968) mittels PCR amplifiziert. Abbildung adaptiert nach Breton et al., 2011. B Amplifikation des Hämolymphüberstands von A. atra. Auf FTA-Papier gelagert. Mit einem 3-mm-Stanzer direkt in das PCR-Röhrchen mit der PCR-Mischung geben.
Angesichts des hohen mikrobiellen Gehalts im Meerwasser konzentrierten wir uns zunächst auf die Charakterisierung mikrobieller DNA-Sequenzen in der Hämolymphe. Hierfür verwendeten wir zwei verschiedene Strategien. Die erste Strategie nutzte Kraken2, ein algorithmusbasiertes Sequenzklassifizierungsprogramm, das mikrobielle Sequenzen mit einer Genauigkeit identifizieren kann, die mit BLAST und anderen Tools vergleichbar ist [28]. Mehr als 6719 Sequenzen wurden als bakteriellen Ursprungs bestimmt, während 124 bzw. 64 Sequenzen von Archaeen bzw. Viren stammten (Abb. 4). Die häufigsten bakteriellen DNA-Fragmente waren Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) und Bacteroidetes (17 %) (Abb. 4a). Diese Verteilung stimmt mit früheren Studien zum Mikrobiom der Miesmuschel überein [39, 40]. Gammaproteobacteria waren die Hauptklasse der Proteobacteria (44 %), darunter viele Vibrionales (Abb. 4b). Die ddPCR-Methode bestätigte das Vorhandensein von Vibrio-DNA-Fragmenten in der zellfreien DNA (cfDNA) der Hämolymphe von A. atra (Abb. 4c) [41]. Um weitere Informationen über den bakteriellen Ursprung der cfDNA zu erhalten, wurde ein zusätzlicher Ansatz gewählt (Abb. S2, Zusatzinformationen). In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-End-Reads assembliert und mittels BLASTN und einem e-Wert von 1e−3 sowie einem Schwellenwert von >90% Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst charakterisiert. In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-End-Reads assembliert und mittels BLASTN und einem e-Wert von 1e−3 sowie einem Schwellenwert von >90% Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst charakterisiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Prüfungen nach der Prüfung der Vertragsparteien und nach der Klassifizierung (Zweitbestimmung) durchgeführt Mollusken) oder bei der Herstellung mit der Verwendung von BLASTN und der Empfindlichkeit von 1e-3 und der Abweichung von der Gesundheit> 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als gepaarte Lesevorgänge gesammelt und mittels BLASTN und einem E-Wert von 1e-3 sowie einem Schwellenwert von >90% Homologie als nativ (Muschel) oder nicht original klassifiziert.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90 %同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下, 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数, 使用 使用 使用 Blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Zu diesem Zeitpunkt wurden die Prüfungen aufgrund der Prüfung von Konzessionsverträgen und Klassifizierungen nach der Rechtsgrundlage (zweitrangige Mollusken) durchgeführt. oder Nicht erforderlich bei der Herstellung mit der Verwendung von BLASTN und 1e-3 und mehr als 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als gepaarte Lesevorgänge gesammelt und mithilfe von e BLASTN und 1e-3 Werten und einem Homologieschwellenwert von >90% als eigene (Muscheln) oder nicht-originale klassifiziert.Da das Genom von A. atra noch nicht sequenziert wurde, verwendeten wir die De-novo-Assemblierungsstrategie des MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-Assemblers. Insgesamt wurden 147.188 Contigs als abhängig (von Muscheln) identifiziert. Diese Contigs wurden anschließend mit E-Werten von 1e-10 mittels BLASTN und BLASTX explodiert. Diese Strategie ermöglichte es uns, 482 nicht-muschelartige Fragmente in der zellfreien DNA (cfDNA) von A. atra zu identifizieren. Mehr als die Hälfte (57 %) dieser DNA-Fragmente stammten von Bakterien, hauptsächlich von Kiemensymbionten, darunter sulfotrophe Symbionten, sowie von dem Kiemensymbionten Solemya velum (Abb. 5).
Relative Häufigkeit auf Typenebene. B Mikrobielle Diversität zweier Hauptstämme (Firmicutes und Proteobacteria). Repräsentative Amplifikation mittels ddPCR. C Vibrio spp. A. Fragmente des 16S-rRNA-Gens (blau) in drei Atra-Hämolymphen.
Insgesamt wurden 482 gesammelte Contigs analysiert. Allgemeines Profil der taxonomischen Verteilung metagenomischer Contig-Annotationen (Prokaryoten und Eukaryoten). B Detaillierte Verteilung der mittels BLASTN und BLASTX identifizierten bakteriellen DNA-Fragmente.
Die Kraken2-Analyse zeigte zudem, dass die zellfreie DNA (cfDNA) der Muscheln archaische DNA-Fragmente enthielt, darunter DNA-Fragmente von Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) und Thaurmarcheota (11 %) (Abb. 6a). Das Vorhandensein von DNA-Fragmenten, die von Euryarchaeota und Crenarchaeota stammen und bereits in der mikrobiellen Gemeinschaft kalifornischer Muscheln nachgewiesen wurden, ist nicht überraschend [42]. Obwohl Euryarchaeota häufig mit extremen Bedingungen in Verbindung gebracht werden, ist mittlerweile bekannt, dass sowohl Euryarchaeota als auch Crenarcheota zu den häufigsten Prokaryoten in marinen Tiefseeumgebungen zählen [43, 44]. Das Vorkommen methanogener Mikroorganismen in Muscheln ist angesichts jüngster Berichte über umfangreiche Methanlecks aus dem Meeresboden des Kerguelen-Plateaus [45] und möglicher mikrobieller Methanproduktion vor der Küste der Kerguelen-Inseln [46] nicht verwunderlich.
Unser Fokus verlagerte sich anschließend auf die Sequenzen von DNA-Viren. Unseres Wissens ist dies die erste Off-Target-Studie zum Virusgehalt von Muscheln. Wie erwartet, fanden wir DNA-Fragmente von Bakteriophagen (Caudovirales) (Abb. 6b). Die häufigste virale DNA stammt jedoch von einem Stamm der Nukleozytoviren, auch bekannt als nukleär-zytoplasmatische große DNA-Viren (NCLDV), die das größte Genom aller Viren besitzen. Innerhalb dieses Stammes gehören die meisten DNA-Sequenzen zu den Familien Mimimidoviridae (58 %) und Poxviridae (21 %), deren natürliche Wirte Wirbeltiere und Arthropoden umfassen. Ein kleiner Teil dieser DNA-Sequenzen stammt von bekannten Viren, die marine eukaryotische Algen infizieren. Die Sequenzen wurden auch vom Pandora-Virus gewonnen, dem Riesenvirus mit dem größten Genom aller bekannten Virusgattungen. Interessanterweise war das Spektrum der Wirte, die bekanntermaßen mit dem Virus infiziert sind (bestimmt durch Sequenzierung zellfreier DNA in der Hämolymphe), relativ groß (Abbildung S3, Zusatzinformationen). Es umfasst Viren, die Insekten wie Baculoviridae und Iridoviridae infizieren, sowie Viren, die Amöben, Algen und Wirbeltiere befallen. Wir fanden auch Sequenzen, die mit dem Genom von Pithovirus sibericum übereinstimmen. Pitoviren (auch bekannt als „Zombie-Viren“) wurden erstmals aus 30.000 Jahre altem Permafrost in Sibirien isoliert [47]. Unsere Ergebnisse stimmen somit mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass nicht alle modernen Arten dieser Viren ausgestorben sind [48] und dass diese Viren in abgelegenen subarktischen Meeresökosystemen vorkommen können.
Abschließend untersuchten wir, ob wir DNA-Fragmente anderer vielzelliger Tiere finden konnten. Insgesamt wurden 482 fremde Contigs mittels BLASTN und BLASTX mit nt-, nr- und RefSeq-Bibliotheken (genomisch und proteinbasiert) identifiziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter den fremden cfDNA-Fragmenten vielzelliger Tiere die DNA von Knochen überwiegt (Abb. 5). DNA-Fragmente von Insekten und anderen Arten wurden ebenfalls gefunden. Ein relativ großer Teil der DNA-Fragmente konnte nicht identifiziert werden, möglicherweise aufgrund der Unterrepräsentation zahlreicher mariner Arten in Genomdatenbanken im Vergleich zu terrestrischen Arten [49].
In der vorliegenden Arbeit wenden wir das LB-Konzept auf Muscheln an und argumentieren, dass die Sequenzierung von zellfreier DNA (cfDNA) in der Hämolymphe Einblicke in die Zusammensetzung mariner Küstenökosysteme ermöglicht. Insbesondere fanden wir heraus, dass 1) die Hämolymphe von Muscheln relativ hohe Konzentrationen (Mikrogrammbereich) relativ großer (~1–5 kb) zirkulierender DNA-Fragmente enthält; 2) diese DNA-Fragmente sowohl unabhängig als auch nicht unabhängig vorkommen; 3) unter den Fremdquellen dieser DNA-Fragmente fanden wir bakterielle, archaische und virale DNA sowie DNA anderer vielzelliger Tiere; 4) die Akkumulation dieser fremden cfDNA-Fragmente in der Hämolymphe erfolgt schnell und trägt zur internen Filteraktivität der Muscheln bei. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das LB-Konzept, das bisher hauptsächlich im Bereich der Biomedizin Anwendung fand, eine reichhaltige, aber unerschlossene Wissensquelle darstellt, die genutzt werden kann, um die Interaktion zwischen Indikatorarten und ihrer Umwelt besser zu verstehen.
Neben Primaten wurde die Isolierung zellfreier zellfreier DNA (ccfDNA) auch bei Säugetieren wie Mäusen, Hunden, Katzen und Pferden beschrieben [50, 51, 52]. Unseres Wissens ist unsere Studie jedoch die erste, die den Nachweis und die Sequenzierung von ccfDNA in Meerestieren mit offenem Kreislaufsystem beschreibt. Diese anatomische Besonderheit und die Filterfähigkeit von Muscheln erklären möglicherweise zumindest teilweise die unterschiedlichen Größen der zirkulierenden DNA-Fragmente im Vergleich zu anderen Arten. Beim Menschen sind die meisten im Blut zirkulierenden DNA-Fragmente klein und weisen eine Größe von 150 bis 200 bp mit einem Maximum von 167 bp auf [34, 53]. Ein kleiner, aber signifikanter Anteil der DNA-Fragmente ist zwischen 300 und 500 bp groß, und etwa 5 % sind länger als 900 bp [54]. Die Ursache für diese Größenverteilung liegt darin, dass die Hauptquelle zellfreier DNA (cfDNA) im Plasma Zelltod ist, entweder durch Zelltod oder Nekrose zirkulierender hämatopoetischer Zellen bei gesunden Individuen oder durch Apoptose von Tumorzellen bei Krebspatienten (bekannt als zirkulierende Tumor-DNA, ctDNA). Die von uns in Muscheln gefundene Größenverteilung der Hämolymph-cfDNA reichte von 1000 bis 5000 bp, was auf einen anderen Ursprung der Muschel-cfDNA hindeutet. Dies ist eine plausible Hypothese, da Muscheln ein halboffenes Gefäßsystem besitzen und in marinen aquatischen Umgebungen mit hohen Konzentrationen mikrobieller genomischer DNA leben. Tatsächlich haben unsere Laborexperimente mit exogener DNA gezeigt, dass Muscheln DNA-Fragmente im Meerwasser anreichern, die nach zellulärer Aufnahme zumindest nach einigen Stunden abgebaut und/oder freigesetzt und/oder in verschiedenen Organellen gespeichert werden. Aufgrund der Seltenheit von Zellen (sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen) reduziert die Verwendung intravalvulärer Kompartimente die Menge an zellfreier DNA (cfDNA) sowohl aus körpereigenen als auch aus fremden Quellen. Angesichts der Bedeutung der angeborenen Immunität von Muscheln und der großen Anzahl zirkulierender Phagozyten vermuteten wir weiterhin, dass auch fremde cfDNA in zirkulierenden Phagozyten angereichert ist, die fremde DNA nach der Aufnahme von Mikroorganismen und/oder Zelltrümmern akkumulieren. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die cfDNA in der Hämolymphe von Muscheln ein einzigartiges Reservoir molekularer Information darstellt und ihren Status als Indikatorart unterstreicht.
Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Sequenzierung und Analyse von aus Bakterien stammenden Hämolymph-cfDNA-Fragmenten wichtige Informationen über die Bakterienflora des Wirts und die im umgebenden marinen Ökosystem vorhandenen Bakterien liefern kann. Mithilfe von Shot-Sequenzierungstechniken konnten Sequenzen des kommensalen Kiemenbakteriums A. atra identifiziert werden, die mit herkömmlichen 16S-rRNA-Identifizierungsmethoden – unter anderem aufgrund einer Verzerrung durch die Referenzbibliothek – unentdeckt geblieben wären. Tatsächlich zeigte unsere Analyse von LB-Daten, die von M. platensis in derselben Muschelschicht vor Kerguelen gewonnen wurden, dass die Zusammensetzung der kiemenassoziierten bakteriellen Symbionten bei beiden Muschelarten identisch ist (Abb. S4, Zusatzinformationen). Diese Ähnlichkeit zweier genetisch unterschiedlicher Muscheln könnte die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften in den kalten, schwefelhaltigen und vulkanischen Ablagerungen von Kerguelen widerspiegeln [55, 56, 57, 58]. Höhere Konzentrationen schwefelreduzierender Mikroorganismen wurden bereits bei der Muschelernte in bioturbierten Küstengebieten [59], wie beispielsweise vor der Küste von Port-au-France, nachgewiesen. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die kommensale Muschelflora durch horizontale Übertragung beeinflusst wird [60, 61]. Weitere Forschung ist erforderlich, um den Zusammenhang zwischen mariner Umwelt, Meeresbodenoberfläche und der Zusammensetzung symbiotischer Bakterien in Muscheln zu ermitteln. Diese Studien sind derzeit im Gange.
Die Länge und Konzentration der zellfreien DNA (cfDNA) in der Hämolymphe, ihre einfache Aufreinigung und die hohe Qualität, die eine schnelle Shotgun-Sequenzierung ermöglicht, sind einige der vielen Vorteile der Verwendung von Muschel-cfDNA zur Erfassung der Biodiversität in marinen Küstenökosystemen. Dieser Ansatz eignet sich besonders gut zur Charakterisierung von Virusgemeinschaften (Viromen) in einem bestimmten Ökosystem [62, 63]. Im Gegensatz zu Bakterien, Archaeen und Eukaryoten enthalten Virusgenome keine phylogenetisch konservierten Gene wie 16S-Sequenzen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Flüssigbiopsien von Indikatorarten wie Muscheln genutzt werden können, um relativ große Mengen an cfDNA-Virusfragmenten zu identifizieren, die bekanntermaßen Wirte infizieren, die typischerweise in marinen Küstenökosystemen vorkommen. Dies umfasst Viren, die bekanntermaßen Protozoen, Arthropoden, Insekten, Pflanzen und Bakterienviren (z. B. Bakteriophagen) infizieren. Eine ähnliche Verteilung fanden wir bei der Untersuchung des Hämolymph-cfDNA-Viroms von Miesmuscheln (M. platensis), die in derselben Muschelschicht auf den Kerguelen gesammelt wurden (Tabelle S2, Zusatzinformationen). Die Shotgun-Sequenzierung von cfDNA ist ein neuer Ansatz, der in der Viromforschung von Menschen und anderen Spezies zunehmend an Bedeutung gewinnt [21, 37, 64]. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung doppelsträngiger DNA-Viren, da kein einzelnes Gen unter allen doppelsträngigen DNA-Viren konserviert ist. Diese Viren stellen die vielfältigste und breiteste Virusklasse in Baltimore dar [65]. Obwohl die meisten dieser Viren noch nicht klassifiziert sind und möglicherweise Viren aus einem völlig unbekannten Bereich der Virenwelt umfassen [66], stellten wir fest, dass die Virome und Wirtsspektren der Miesmuscheln A. atra und M. platensis zwischen denen beider Arten liegen (siehe Abbildung S3, Zusatzinformationen). Diese Ähnlichkeit ist nicht überraschend, da sie auf eine mangelnde Selektivität bei der Aufnahme von in der Umwelt vorhandener DNA hindeuten könnte. Zukünftige Studien mit gereinigter RNA sind derzeit erforderlich, um das RNA-Virom zu charakterisieren.
In unserer Studie verwendeten wir eine sehr strenge Pipeline, die auf der Arbeit von Kowarski et al. [37] basiert. Diese nutzten eine zweistufige Deletion gepoolter Reads und Contigs vor und nach der Assemblierung nativer zellfreier DNA (cfDNA), was zu einem hohen Anteil nicht zugeordneter Reads führte. Daher können wir nicht ausschließen, dass einige dieser nicht zugeordneten Reads dennoch einen eigenen Ursprung haben, vor allem, weil uns kein Referenzgenom für diese Muschelart vorliegt. Wir verwendeten diese Pipeline auch, weil wir Bedenken hinsichtlich der Chimären zwischen eigenen und fremden Reads sowie der durch den Illumina MiSeq PE75 generierten Read-Längen hatten. Ein weiterer Grund für die Vielzahl nicht zugeordneter Reads ist, dass viele marine Mikroorganismen, insbesondere in abgelegenen Gebieten wie den Kerguelen, noch nicht annotiert sind. Wir verwendeten den Illumina MiSeq PE75 unter der Annahme, dass die Fragmentlängen der cfDNA denen der menschlichen cfDNA ähneln. Für zukünftige Studien empfehlen wir angesichts unserer Ergebnisse, die längere Leselängen der Hämolymph-cfDNA im Vergleich zu Menschen und/oder Säugetieren zeigen, die Verwendung einer Sequenzierungsplattform, die besser für längere cfDNA-Fragmente geeignet ist. Dies erleichtert die Identifizierung weiterer Indikationen für eine tiefergehende Analyse erheblich. Die derzeit noch nicht verfügbare vollständige Kerngenomsequenz von A. atra würde die Unterscheidung von cfDNA aus körpereigenen und körperfremden Quellen ebenfalls deutlich vereinfachen. Da sich unsere Forschung auf die Anwendbarkeit des Konzepts der Flüssigbiopsie bei Muscheln konzentriert hat, hoffen wir, dass mit der Anwendung dieses Konzepts in zukünftigen Studien neue Werkzeuge und Pipelines entwickelt werden, um das Potenzial dieser Methode zur Untersuchung der mikrobiellen Diversität von Muscheln im marinen Ökosystem zu erweitern.
Als nicht-invasiver klinischer Biomarker werden erhöhte Konzentrationen zellfreier zellfreier DNA (ccfDNA) im menschlichen Plasma mit verschiedenen Erkrankungen, Gewebeschäden und Stresszuständen in Verbindung gebracht [67, 68, 69]. Dieser Anstieg ist mit der Freisetzung von DNA-Fragmenten eigenen Ursprungs nach Gewebeschädigung assoziiert. Wir untersuchten dieses Phänomen mittels akutem Hitzestress, bei dem Muscheln kurzzeitig einer Temperatur von 30 °C ausgesetzt wurden. Diese Analyse führten wir an drei verschiedenen Muschelarten in drei unabhängigen Experimenten durch. Wir konnten jedoch nach akutem Hitzestress keine Veränderung der ccfDNA-Konzentrationen feststellen (siehe Abbildung S5, Zusatzinformationen). Diese Beobachtung könnte zumindest teilweise erklären, warum Muscheln ein halboffenes Kreislaufsystem besitzen und aufgrund ihrer hohen Filteraktivität große Mengen fremder DNA akkumulieren. Andererseits könnten Muscheln, wie viele Wirbellose, resistenter gegenüber stressbedingten Gewebeschäden sein, wodurch die Freisetzung von ccfDNA in ihrer Hämolymphe begrenzt wird [70, 71].
Bisher konzentrierte sich die DNA-Analyse der Biodiversität in aquatischen Ökosystemen hauptsächlich auf das Metabarcoding von Umwelt-DNA (eDNA). Diese Methode stößt jedoch bei der Verwendung von Primern in der Biodiversitätsanalyse häufig an ihre Grenzen. Die Shotgun-Sequenzierung umgeht die Einschränkungen der PCR und die verzerrte Auswahl von Primersätzen. Somit ähnelt unsere Methode in gewisser Weise der kürzlich eingesetzten Hochdurchsatz-eDNA-Shotgun-Sequenzierung, die fragmentierte DNA direkt sequenzieren und nahezu alle Organismen analysieren kann [72, 73]. Es gibt jedoch einige grundlegende Unterschiede zwischen LB und Standard-eDNA-Methoden. Der Hauptunterschied liegt in der Verwendung natürlicher Filterorganismen. Die Verwendung mariner Arten wie Schwämme und Muscheln (Dresseina spp.) als natürliche Filter für die eDNA-Untersuchung wurde bereits beschrieben [74, 75]. In der Studie von Dreissena wurden jedoch Gewebeproben verwendet, aus denen die DNA extrahiert wurde. Die Analyse von zellfreier DNA (cfDNA) aus Flüssigbiopsien erfordert weder eine Gewebeprobe noch die spezialisierte und mitunter kostspielige Ausrüstung und Logistik, die bei der Analyse von Umwelt-DNA (eDNA) oder Gewebeproben anfallen. Wir haben kürzlich berichtet, dass cfDNA aus Flüssigbiopsien mit FTA-Unterstützung gelagert und analysiert werden kann, ohne dass eine Kühlkette aufrechterhalten werden muss – eine große Herausforderung für die Forschung in abgelegenen Gebieten [76]. Die Extraktion von cfDNA aus Flüssigbiopsien ist zudem einfach und liefert DNA hoher Qualität für Shotgun-Sequenzierung und PCR-Analysen. Dies ist angesichts der technischen Einschränkungen der eDNA-Analyse ein großer Vorteil [77]. Die Einfachheit und die geringen Kosten der Probenahmemethode eignen sich besonders für Langzeit-Monitoringprogramme. Neben ihrer hohen Filterleistung ist die chemische Zusammensetzung ihres Schleims aus Mukopolysacchariden ein weiteres bekanntes Merkmal von Muscheln, da sie die Absorption von Viren fördert [78, 79]. Dadurch eignen sich Muscheln ideal als natürliche Filter zur Charakterisierung der Biodiversität und der Auswirkungen des Klimawandels in einem aquatischen Ökosystem. Obwohl das Vorhandensein von wirtseigenen DNA-Fragmenten im Vergleich zu eDNA als Einschränkung der Methode angesehen werden kann, sind die Kosten für die Gewinnung nativer zellfreier DNA (cfDNA) im Vergleich zu eDNA angesichts der Fülle an Informationen, die für Gesundheitsstudien zur Verfügung stehen, verständlich. Dies schließt das Vorhandensein von viralen Sequenzen ein, die in das Genom des Wirts integriert sind. Dies ist besonders wichtig für Muscheln, da in Muscheln horizontal übertragene leukämische Retroviren vorkommen [80, 81]. Ein weiterer Vorteil der LB-Methode gegenüber eDNA besteht darin, dass sie die phagozytische Aktivität zirkulierender Blutzellen in der Hämolymphe nutzt, die Mikroorganismen (und deren Genome) aufnehmen. Phagozytose ist die Hauptfunktion von Blutzellen in Muscheln [82]. Schließlich nutzt die Methode die hohe Filtrationskapazität von Muscheln (durchschnittlich 1,5 l/h Meerwasser) und die zweitägige Zirkulation, wodurch die Durchmischung verschiedener Meerwasserschichten verbessert und die Aufnahme heterologer eDNA ermöglicht wird. [83, 84]. Die Analyse zellfreier Muschel-DNA (cfDNA) stellt daher angesichts der ernährungsphysiologischen, ökonomischen und ökologischen Bedeutung von Muscheln einen vielversprechenden Ansatz dar. Ähnlich der Analyse von aus Menschen gewonnenem Lebergewebe (LB) ermöglicht diese Methode auch die Messung genetischer und epigenetischer Veränderungen der Wirts-DNA als Reaktion auf exogene Substanzen. Beispielsweise könnten Sequenzierungstechnologien der dritten Generation mittels Nanoporensequenzierung eine genomweite Methylierungsanalyse in nativer cfDNA ermöglichen. Dieser Prozess wird dadurch erleichtert, dass die Länge der Muschel-cfDNA-Fragmente ideal mit Langsequenzierungsplattformen kompatibel ist, die eine genomweite DNA-Methylierungsanalyse in einem einzigen Sequenzierungslauf ohne chemische Transformationen ermöglichen. [85, 86] Dies ist eine interessante Möglichkeit, da DNA-Methylierungsmuster nachweislich eine Reaktion auf Umweltstress widerspiegeln und über viele Generationen bestehen bleiben. Daher kann sie wertvolle Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen der Reaktion nach Exposition gegenüber Klimawandel oder Schadstoffen liefern [87]. Die Anwendung von LB ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Selbstverständlich setzt sie das Vorhandensein von Indikatorarten im Ökosystem voraus. Wie bereits erwähnt, erfordert die Nutzung von LB zur Bewertung der Biodiversität eines Ökosystems zudem eine sorgfältige bioinformatische Analyse, die das Vorhandensein von DNA-Fragmenten aus der Quelle berücksichtigt. Ein weiteres großes Problem ist die Verfügbarkeit von Referenzgenomen für marine Arten. Es besteht die Hoffnung, dass Initiativen wie das Marine Mammal Genomes Project und das kürzlich ins Leben gerufene Fish10k-Projekt [88] solche Analysen zukünftig erleichtern werden. Die Anwendung des LB-Konzepts auf marine Filtrierer ist außerdem mit den neuesten Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie kompatibel und eignet sich daher gut für die Entwicklung von Multi-Ohm-Biomarkern, die wichtige Informationen über den Zustand mariner Lebensräume unter Umweltbelastungen liefern.
Genomsequenzierungsdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 unter Bioprojects SRR8924808 hinterlegt.
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