Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Byopsi likid (LB) se yon konsèp k ap vin popilè rapidman nan domèn byomedikal la. Konsèp la baze sitou sou deteksyon fragman ADN ekstraselilè k ap sikile (ccfDNA), ki lage sitou kòm ti fragman apre lanmò selilè nan divès tisi. Yon ti pwopòsyon nan fragman sa yo soti nan tisi oswa òganis etranje (etranje). Nan travay aktyèl la, nou aplike konsèp sa a sou moul, yon espès santinèl ke yo rekonèt pou gwo kapasite filtraj dlo lanmè yo. Nou itilize kapasite moul yo pou aji kòm filtè natirèl pou kaptire fragman ADN anviwònman an ki soti nan plizyè sous pou bay enfòmasyon sou byodiversite ekosistèm kotyè maren yo. Rezilta nou yo montre ke emolinf moul gen fragman ADN ki varye anpil nan gwosè, soti nan 1 a 5 kb. Sekansaj shotgun te montre ke yon gwo kantite fragman ADN gen orijin mikwòb etranje. Pami yo, nou te jwenn fragman ADN ki soti nan bakteri, ake, ak viris, ki gen ladan viris ke yo konnen ki enfekte yon varyete lame yo jwenn souvan nan ekosistèm kotyè maren yo. An konklizyon, etid nou an demontre ke konsèp LB aplike nan moul reprezante yon sous konesans rich men ki poko eksplore sou divèsite mikwòb nan ekosistèm kotyè maren yo.
Enpak chanjman klimatik (CC) sou divèsite byolojik ekosistèm maren yo se yon domèn rechèch k ap grandi rapidman. Rechofman planèt la pa sèlman lakòz gwo estrès fizyolojik, men tou, li pouse limit evolisyonè estabilite tèmik òganis maren yo, sa ki afekte abita yon kantite espès, sa ki pouse yo chèche kondisyon ki pi favorab [1, 2]. Anplis afekte divèsite byolojik metazoè yo, CC deranje balans delika entèraksyon lame-mikwòb yo. Disbakteryoz mikwòb sa a poze yon menas grav pou ekosistèm maren yo paske li fè òganis maren yo pi sansib a patojèn enfeksyon [3, 4]. Yo kwè ke SS jwe yon wòl enpòtan nan lanmò an mas, ki se yon pwoblèm grav pou jesyon ekosistèm maren mondyal yo [5, 6]. Sa a se yon pwoblèm enpòtan lè nou konsidere enpak ekonomik, ekolojik ak nitrisyonèl anpil espès maren yo. Sa a se vre espesyalman pou bivalv k ap viv nan rejyon polè yo, kote efè CK yo pi imedya ak grav [6, 7]. Anfèt, bivalv tankou Mytilus spp. yo lajman itilize pou kontwole efè CC sou ekosistèm maren yo. Li pa etonan ke yo devlope yon kantite relativman gwo byomarkè pou kontwole sante yo, souvan lè l sèvi avèk yon apwòch de nivo ki enplike byomarkè fonksyonèl ki baze sou aktivite anzimatik oswa fonksyon selilè tankou viabilité selilè ak aktivite fagositik [8]. Metòd sa yo gen ladan tou mezi konsantrasyon endikatè presyon espesifik ki akimile nan tisi mou apre absòpsyon gwo kantite dlo lanmè. Sepandan, gwo kapasite filtraj ak sistèm sikilatwa semi-ouvè bivalv yo bay yon opòtinite pou devlope nouvo byomarkè emolinf lè l sèvi avèk konsèp byopsi likid (LB), yon apwòch senp epi minim pwogrese pou jesyon pasyan yo. echantiyon san [9, 10]. Malgre ke plizyè kalite molekil sikile ka jwenn nan LB imen, konsèp sa a baze prensipalman sou analiz sekans ADN nan fragman ADN ekstraselilè sikile (ccfDNA) nan plasma. Anfèt, prezans ADN sikile nan plasma imen te konnen depi mitan 20yèm syèk la [11], men se sèlman nan dènye ane yo ke avenman metòd sekans wo-debi te mennen nan dyagnostik klinik ki baze sou ccfDNA. Prezans fragman ADN sikile sa yo se an pati akòz liberasyon pasif ADN jenomik (nikleyè ak mitokondriyal) apre lanmò selilè. Nan moun ki an sante, konsantrasyon ccfDNA a nòmalman ba (<10 ng/mL) men li ka ogmante 5-10 fwa nan pasyan ki soufri divès patoloji oswa ki sibi estrès, sa ki lakòz domaj nan tisi yo. Nan moun ki an sante, konsantrasyon ccfDNA a nòmalman ba (<10 ng/mL) men li ka ogmante 5-10 fwa nan pasyan ki soufri divès patoloji oswa ki sibi estrès, sa ki lakòz domaj nan tisi yo. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатьсу в 5–10 больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. Nan moun ki an sante, konsantrasyon cccDNA a nòmalman ba (<10 ng/mL), men li ka ogmante 5-10 fwa nan pasyan ki gen divès patoloji oswa ki anba estrès ki lakòz domaj nan tisi.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滍炟炣在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 扅理 或 扅理 或 扅中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны 10 увеличе ны пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Konsantrasyon ccfDNA yo anjeneral ba (<10 ng/ml) nan moun ki an sante, men yo ka ogmante 5-10 fwa nan pasyan ki gen divès patoloji oswa estrès, sa ki lakòz domaj nan tisi yo.Gwosè fragman ccfDNA yo varye anpil, men anjeneral li varye ant 150 ak 200 bp. [12]. Analiz ccfDNA ki sòti nan pwòp selil yo, sa vle di ccfDNA ki soti nan selil lame nòmal oswa transfòme, ka itilize pou detekte chanjman jenetik ak epigenetik ki prezan nan jenòm nikleyè ak/oswa mitokondriyal la, kidonk ede klinisyen yo chwazi terapi espesifik ki vize molekilè [13]. Sepandan, yo ka jwenn ccfDNA nan sous etranje tankou ccfDNA ki soti nan selil fetis pandan gwosès oswa nan ògàn transplante [14,15,16,17]. ccfDNA se yon sous enfòmasyon enpòtan tou pou detekte prezans asid nikleyik yon ajan enfeksyon (etranje), ki pèmèt deteksyon ki pa pwogrese nan enfeksyon toupatou ki pa idantifye pa kilti san, evite byopsi pwogrese nan tisi enfekte [18]. Etid resan yo montre tout bon ke san moun gen yon sous enfòmasyon rich ki ka itilize pou idantifye patojèn viral ak bakteri, epi ke anviwon 1% nan ccfDNA ki jwenn nan plasma moun gen orijin etranje [19]. Etid sa yo demontre ke yo ka evalye byodiversite mikwobyòm sikile yon òganis lè yo itilize analiz ccfDNA. Sepandan, jiska dènyèman, yo te itilize konsèp sa a sèlman nan moun e, nan yon pi piti mezi, nan lòt vètebre [20, 21].
Nan atik sa a, nou itilize potansyèl LB a pou analize ccfDNA Aulacomya atra, yon espès sid ki souvan jwenn nan Zile Kerguelen subantatik yo, yon gwoup zile ki anlè yon gwo plato ki te fòme 35 milyon ane de sa. Lè nou itilize yon sistèm eksperimantal in vitro, nou te jwenn ke fragman ADN nan dlo lanmè yo absòbe byen vit pa moul yo epi antre nan konpatiman emolinf la. Sekansaj shotgun te montre ke ccfDNA emolinf moul yo gen fragman ADN ki gen pwòp orijin li ak ki pa soti nan pwòp orijin li, ki gen ladan bakteri senbyotik ak fragman ADN ki soti nan byòm tipik nan ekosistèm kotyè maren vòlkanik frèt yo. ccfDNA emolinf la gen ladan l tou sekans viral ki sòti nan viris ki gen diferan seri lame. Nou te jwenn tou fragman ADN ki soti nan bèt miltiselilè tankou pwason zo, anemòn lanmè, alg ak ensèk. An konklizyon, etid nou an demontre ke konsèp LB a ka aplike avèk siksè nan envètebre maren pou jenere yon repètwa jenomik rich nan ekosistèm maren yo.
Yo te kolekte granmoun (55-70 mm longè) Mytilus platensis (M. platensis) ak Aulacomya atra (A. atra) sou rivaj wòch entèmare Pòtofrans (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Zile Kerguelen an Desanm 2018. Yo te jwenn lòt moul ble granmoun (Mytilus spp.) nan men yon founisè komèsyal (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) epi yo te mete yo nan yon tank aere ki gen tanperati kontwole (4°C) ki gen 10-20 L sèl atifisyèl 32‰ (sèl lanmè atifisyèl Reef Crystal, Instant Ocean, Vijini, Etazini). Pou chak eksperyans, yo te mezire longè ak pwa chak kokiy.
Yon pwotokòl aksè ouvè gratis pou pwogram sa a disponib sou entènèt (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). An brèf, yo te kolekte emolinf LB nan misk abdukteur jan sa dekri [22]. Yo te klarifye emolinf la pa santrifijasyon a 1200×g pandan 3 minit, yo te konjele sipernatant la (-20°C) jiskaske yo te itilize li. Pou izolasyon ak pirifikasyon cfDNA, yo te dekonjle echantiyon yo (1.5-2.0 ml) epi trete yo lè l sèvi avèk twous NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te estoke ccfDNA a -80°C jiskaske yo fè plis analiz. Nan kèk eksperyans, yo te izole epi pirifye ccfDNA lè l sèvi avèk twous QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Yo te kantifye ADN pirifye a lè l sèvi avèk yon tès PicoGreen estanda. Yo te analize distribisyon fragman ccfDNA izole a pa elektwoforèz kapilè lè l sèvi avèk yon bioanalizè Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ak yon Twous ADN Segondè Sansiblite. Yo te fè tès la lè l sèvi avèk 1 µl echantiyon ccfDNA a dapre enstriksyon manifakti a.
Pou sekans fragman ccfDNA emolinf yo, Génome Québec (Monreyal, Kebèk, Kanada) te prepare bibliyotèk shotgun lè l sèvi avèk twous Illumina DNA Mix nan twous Illumina MiSeq PE75 la. Yo te itilize yon adaptè estanda (BioO). Fichye done brit yo disponib nan Achiv Lekti Sekans NCBI (SRR8924808 ak SRR8924809). Yo te evalye kalite lekti debaz la lè l sèvi avèk FastQC [23]. Yo te itilize Trimmomatic [24] pou adaptè koupe ak lekti ki gen move kalite. Lekti shotgun ki gen bout pè yo te fusionné FLASH nan lekti endividyèl ki pi long ak yon sipèpoze minimòm de 20 bp pou evite matche [25]. Lekti ki te rantre yo te fè anotasyon avèk BLASTN lè l sèvi avèk yon baz done taksonomi NCBI bivalv (valè e < 1e−3 ak 90% omoloji), epi maskaj sekans ki pa twò konplèks yo te fèt lè l sèvi avèk DUST [26]. Lekti ki te rantre yo te fè anotasyon avèk BLASTN lè l sèvi avèk yon baz done taksonomi NCBI bivalv (valè e < 1e−3 ak 90% omoloji), epi maskaj sekans ki pa twò konplèks yo te fèt lè l sèvi avèk DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных такисон таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 è 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй ностель сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Yo te fè anotasyon lekti gwoupe yo avèk BLASTN lè l sèvi avèk baz done taksonomi bivalv NCBI a (valè e < 1e-3 ak 90% omoloji), epi yo te fè maskaj sekans ki gen konpleksite ki ba lè l sèvi avèk DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数诌数，）用BLASTN [D62]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ｈ 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой Ѕнотированы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 è 90% гомологии), а маскирование последовательй ностель сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Yo te fè anotasyon lekti gwoupe yo avèk BLASTN lè l sèvi avèk baz done taksonomik bivalv NCBI a (valè e <1e-3 ak 90% omoloji), epi yo te fè maskaj sekans ki gen konpleksite ki ba lè l sèvi avèk DUST [26].Lekti yo te divize an de gwoup: sa ki gen rapò ak sekans bivalv (yo rele yo lekti pwòp tèt ou isit la) ak sa ki pa gen rapò (lekti ki pa pwòp tèt ou). De gwoup te rasanble separeman lè l sèvi avèk MEGAHIT pou jenere kontig [27]. Pandansetan, distribisyon taksonomik lekti mikwobyòm etranje yo te klase lè l sèvi avèk Kraken2 [28] epi reprezante grafikman pa yon graf sikilè Krona sou Galaxy [29, 30]. Kmer optimal yo te detèmine kòm kmers-59 apati eksperyans preliminè nou yo. Apre sa, yo te idantifye pwòp kontig yo pa aliyman ak BLASTN (baz done bivalv NCBI, valè e < 1e−10 ak 60% omoloji) pou yon anotasyon final. Apre sa, yo te idantifye pwòp kontig yo pa aliyman ak BLASTN (baz done bivalv NCBI, valè e < 1e−10 ak 60% omoloji) pou yon anotasyon final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Apre sa, yo te idantifye pwòp kontig yo lè yo te konpare yo ak BLASTN (baz done bivalv NCBI, valè e <1e-10 ak 60% omoloji) pou anotasyon final la.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сонтиги данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Apre sa, yo te idantifye pwòp kontig yo pou anotasyon final la lè yo te fè yo matche ak BLASTN (baz done bivalv NCBI, valè e <1e-10 ak 60% omoloji). An paralèl, kontig gwoup ki pa pwòp tèt yo te anote ak BLASTN (baz done nt NCBI, valè e < 1e−10 ak 60% omoloji). An paralèl, kontig gwoup ki pa pwòp tèt yo te anote ak BLASTN (baz done nt NCBI, valè e < 1e−10 ak 60% omoloji). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных nt <1e-10 ak гомология 60%). An paralèl, kontig gwoup etranje yo te anote ak BLASTN (baz done NT NCBI, valè e <1e-10 ak 60% omoloji).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью нотированы с помощью на BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). An paralèl, kontig gwoup ki pa pwòp tèt yo te anote ak BLASTN (baz done nt NCBI, valè e <1e-10 ak 60% omoloji). Yo te fè BLASTX tou sou kontig ki pa pwòp tèt yo lè l sèvi avèk baz done pwoteyin nr ak RefSeq NCBI yo (valè e < 1e−10 ak 60% omoloji). Yo te fè BLASTX tou sou kontig ki pa pwòp tèt yo lè l sèvi avèk baz done pwoteyin nr ak RefSeq NCBI yo (valè e < 1e−10 ak 60% omoloji). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeqн NCBI e <1e-10 и гомология 60%). Yo te fè BLASTX tou sou kontig ki pa pwòp tèt yo lè l sèvi avèk baz done pwoteyin nr ak RefSeq NCBI yo (valè e < 1e-10 ak 60% omoloji).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性 60%。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性 60%。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безкна NC BI (Ref. <1e-10 ak гомология 60%). Yo te fè BLASTX tou sou kontig ki pa pwòp tèt yo lè l sèvi avèk baz done pwoteyin nr ak RefSeq NCBI yo (valè e <1e-10 ak 60% omoloji).Gwoup BLASTN ak BLASTX ki gen kontig ki pa pwòp tèt yo reprezante kontig final yo (gade fichye siplemantè a).
Yo bay lis primè yo itilize pou PCR nan Tablo S1. Yo te itilize Taq ADN polimeraz (Bio Basic Canada, Markham, ON) pou anplifye jèn sib ccfDNA yo. Yo te itilize kondisyon reyaksyon sa yo: denaturasyon a 95°C pandan 3 minit, 95°C pandan 1 minit, tanperati rekwis fiks pandan 1 minit, elongasyon a 72°C pandan 1 minit, 35 sik, epi finalman 72°C nan lespas 10 minit. Pwodui PCR yo te separe pa elektwoforèz nan jèl agaroz (1.5%) ki genyen SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) a 95 V.
Yo te aklimate moul yo (Mytilus spp.) nan 500 ml dlo lanmè oksijene (32 PSU) pandan 24 èdtan a 4°C. Yo te ajoute ADN plasmid ki gen yon insert ki kode sekans ADNc galectin-7 imen an (nimewo aksè NCBI L07769) nan ti boutèy la nan yon konsantrasyon final 190 μg/μl. Moul yo te enkube nan menm kondisyon yo san adisyon ADN te sèvi kòm kontwòl. Twazyèm tank kontwòl la te gen ADN san moul. Pou kontwole kalite ADN nan dlo lanmè a, yo te pran echantiyon dlo lanmè (20 μl; twa repetisyon) nan chak tank nan moman ki endike a. Pou trasabilite ADN plasmid, yo te rekòlte moul LB nan moman ki endike yo epi yo te analize yo pa qPCR ak ddPCR. Akòz gwo kontni sèl nan dlo lanmè a, yo te delye alikòt yo nan dlo kalite PCR (1:10) anvan tout tès PCR yo.
Yo te fè PCR goutlèt dijital (ddPCR) la lè l sèvi avèk pwotokòl BioRad QX200 la (Mississauga, Ontario, Kanada). Sèvi ak pwofil tanperati a pou detèmine tanperati optimal la (Tablo S1). Yo te pwodui gout yo lè l sèvi avèk yon dèlko gout QX200 (BioRad). Yo te fè ddPCR a jan sa a: 95°C pandan 5 min, 50 sik 95°C pandan 30 s ak yon tanperati rekwis bay pandan 1 min ak 72°C pandan 30 s, 4°C pandan 5 min ak 90°C nan 5 minit. Yo te mezire kantite gout yo ak reyaksyon pozitif yo (kantite kopi/µl) lè l sèvi avèk yon lektè gout QX200 (BioRad). Yo te rejte echantiyon ki gen mwens pase 10,000 goutlèt. Yo pa t fè kontwòl modèl chak fwa yo te fè ddPCR.
Yo te fè qPCR a avèk Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ostrali) ak primer espesifik LGALS7. Tout PCR kantitatif yo te fèt nan 20 µl avèk Kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). Yo te kòmanse qPCR a avèk yon enkubasyon 15 minit nan 95°C, ki te swiv pa 40 sik nan 95°C pandan 10 segonn ak nan 60°C pandan 60 segonn avèk yon sèl koleksyon done. Yo te pwodui koub fizyon yo lè yo te itilize mezi siksesif nan 95°C pandan 5 s, 65°C pandan 60 s, ak 97°C nan fen qPCR a. Yo te fè chak qPCR an triplika, eksepte pou echantiyon kontwòl yo.
Piske moul yo konnen pou gwo vitès filtraj yo, nou te premye envestige si yo te kapab filtre epi kenbe fragman ADN ki prezan nan dlo lanmè. Nou te enterese tou pou konnen si fragman sa yo akimile nan sistèm lenfatik semi-ouvè yo a. Nou te rezoud pwoblèm sa a eksperimantalman lè nou te swiv sò fragman ADN idrosolubl yo te ajoute nan tank moul ble yo. Pou fasilite swivi fragman ADN yo, nou te itilize ADN plasmid etranje (pa pwòp tèt) ki gen jèn galectin-7 imen an. ddPCR trase fragman ADN plasmid nan dlo lanmè ak moul. Rezilta nou yo montre ke si kantite fragman ADN nan dlo lanmè te rete relativman konstan sou tan (jiska 7 jou) nan absans moul, alò nan prezans moul nivo sa a prèske disparèt nèt nan 8 èdtan (Fig. 1a,b). Fragman ADN ekzojèn yo te fasil pou detekte nan 15 minit nan likid entravalvulè ak emolinf (Fig. 1c). Fragman sa yo te kapab toujou detekte jiska 4 èdtan apre ekspozisyon. Aktivite filtraj sa a anrapò ak fragman ADN yo konparab ak aktivite filtraj bakteri ak alg [31]. Rezilta sa yo sijere ke moul yo ka filtre epi akimile ADN etranje nan konpatiman likid yo.
Konsantrasyon relatif ADN plasmid nan dlo lanmè an prezans (A) oswa absans (B) moul, mezire pa ddPCR. Nan A, rezilta yo eksprime kòm pousantaj, ak limit bwat yo ki reprezante 75yèm ak 25yèm persentil yo. Koub logaritmik ajiste a montre an wouj, epi zòn ki gen koulè gri a reprezante entèval konfyans 95% la. Nan B, liy wouj la reprezante mwayèn nan epi liy ble a reprezante entèval konfyans 95% pou konsantrasyon an. C Akimilasyon ADN plasmid nan emolinf ak likid valvulè moul yo nan diferan moman apre adisyon ADN plasmid la. Rezilta yo prezante kòm kopi absoli detekte/mL (±SE).
Apre sa, nou te envestige orijin ccfDNA nan moul yo te kolekte nan kabann moul sou Zile Kerguelen yo, yon gwoup zile izole ki gen enfliyans antropojèn limite. Pou rezon sa a, nou te izole epi pirifye cccDNA ki soti nan emolinf moul yo pa metòd yo itilize souvan pou pirifye cccDNA imen [32, 33]. Nou te jwenn ke konsantrasyon mwayèn ccfDNA emolinf nan moul yo nan seri mikwogram ki ba pou chak ml emolinf (gade Tablo S2, Enfòmasyon Siplemantè). Seri konsantrasyon sa a pi gwo pase nan moun ki an sante (nanogram ki ba pou chak mililit), men nan ka ki ra, nan pasyan kansè, nivo ccfDNA a ka rive nan plizyè mikwogram pou chak mililit [34, 35]. Yon analiz sou distribisyon gwosè ccfDNA emolinf la te montre ke fragman sa yo varye anpil nan gwosè, soti nan 1000 bp a 1000 bp jiska 5000 bp (Fig. 2). Yo te jwenn rezilta menm jan an lè yo te itilize Twous QIAamp Investigator ki baze sou silica a, yon metòd yo itilize souvan nan syans forensik pou izole ak pirifye ADN jenomik rapidman nan echantiyon ADN ki gen yon konsantrasyon ki ba, tankou ccfDNA [36].
Elektwoforegram ccfDNA reprezantatif nan emolinf moul. Ekstrè ak NucleoSnap Plasma Kit (anlè) ak QIAamp DNA Investigator Kit. B Dyagram Vyolon ki montre distribisyon konsantrasyon ccfDNA emolinf (±SE) nan moul. Liy nwa ak wouj yo reprezante medyàn lan ak premye ak twazyèm katil yo, respektivman.
Apeprè 1% nan ccfDNA nan moun ak primat gen yon sous etranje [21, 37]. Etandone sistèm sikilatwa semi-ouvè bivalv yo, dlo lanmè ki rich an mikwòb, ak distribisyon gwosè ccfDNA moul yo, nou te fè ipotèz ke ccfDNA emolenf moul yo ka gen yon pisin ADN mikwòb rich ak divès. Pou teste ipotèz sa a, nou te sekansye ccfDNA emolenf nan echantiyon Aulacomya atra yo te kolekte nan Zile Kerguelen yo, sa ki te bay plis pase 10 milyon lekti, 97.6% ladan yo te pase kontwòl kalite. Apre sa, nou te klase lekti yo dapre sous pwòp ak sous ki pa pwòp lè l sèvi avèk baz done bivalv BLASTN ak NCBI yo (Fig. S1, Enfòmasyon Siplemantè).
Nan moun, ni ADN nikleyè ni ADN mitokondriyal ka lage nan san an [38]. Sepandan, nan etid sa a, li pa t posib pou dekri an detay ADN jenomik nikleyè moul yo, etandone yo pa t sekansye oswa dekri jenòm A. atra a. Sepandan, nou te kapab idantifye yon kantite fragman ccfDNA ki soti nan pwòp orijin nou lè nou te itilize bibliyotèk bivalv la (Fig. S2, Enfòmasyon Siplemantè). Nou te konfime tou prezans fragman ADN ki soti nan pwòp orijin nou yo pa anplifikasyon PCR dirije jèn A. atra sa yo ki te sekansye yo (Fig. 3). Menm jan an tou, etandone jenòm mitokondriyal A. atra a disponib nan baz done piblik yo, yon moun ka jwenn prèv pou prezans fragman ccfDNA mitokondriyal nan emolinf A. atra a. Prezans fragman ADN mitokondriyal yo te konfime pa anplifikasyon PCR (Fig. 3).
Plizyè jèn mitokondriyo te prezan nan emolinf A. atra (pwen wouj – nimewo stock: SRX5705969) ak M. platensis (pwen ble – nimewo stock: SRX5705968) anplifye pa PCR. Figi adapte soti nan Breton et al., 2011 B Anplifikasyon sipènatant emolinf ki soti nan A. atra Sere sou papye FTA. Sèvi ak yon pwenson 3 mm pou ajoute dirèkteman nan tib PCR ki gen melanj PCR a.
Etandone kantite mikwòb ki genyen nan dlo lanmè a, okòmansman nou te konsantre sou karakterizasyon sekans ADN mikwòb nan emolinf. Pou fè sa, nou itilize de estrateji diferan. Premye estrateji a te itilize Kraken2, yon pwogram klasifikasyon sekans ki baze sou algoritm ki ka idantifye sekans mikwòb ak yon presizyon konparab ak BLAST ak lòt zouti [28]. Yo te detèmine ke plis pase 6719 lekti te gen orijin bakteri, alòske 124 ak 64 te soti nan ake ak viris, respektivman (Fig. 4). Fragman ADN bakteri ki pi abondan yo se te Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ak Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Distribisyon sa a konsistan avèk etid anvan yo sou mikwobyòm moul ble maren an [39, 40]. Gammaproteobacteria te prensipal klas Proteobacteria (44%), ki gen ladan anpil Vibrionales (Fig. 4b). Metòd ddPCR a te konfime prezans fragman ADN Vibrio nan ccfDNA emolenf A. atra a (Fig. 4c) [41]. Pou jwenn plis enfòmasyon sou orijin bakteri ccfDNA a, yo te pran yon lòt apwòch (Fig. S2, Enfòmasyon Siplemantè). Nan ka sa a, lekti ki te sipèpoze yo te rasanble kòm lekti pè epi yo te klase kòm lekti pwòp tèt ou (bivalv) oswa ki pa pwòp tèt ou lè l sèvi avèk BLASTN ak yon valè e 1e−3 ak yon papòt ak >90% omoloji. Nan ka sa a, lekti ki te sipèpoze yo te rasanble kòm lekti pè epi yo te klase kòm lekti pwòp tèt ou (bivalv) oswa ki pa pwòp tèt ou lè l sèvi avèk BLASTN ak yon valè e 1e−3 ak yon papòt ak >90% omoloji. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны с парными концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование моллюски отсечения с гомологией> 90%. Nan ka sa a, lekti ki sipèpoze yo te kolekte kòm lekti pè epi yo te klase kòm natif natal (bivalv) oswa ki pa orijinal lè l sèvi avèk BLASTN ak valè e 1e-3 ak yon papòt ak yon omoloji >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 的 3e值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классикфи класны собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использовани e BLAS зование 1e-3 ak порога гомологии> 90%. Nan ka sa a, lekti ki sipèpoze yo te kolekte kòm lekti pè epi klase kòm pwòp (bivalv) oswa ki pa orijinal lè l sèvi avèk valè e BLASTN ak 1e-3 ak yon papòt omoloji >90%.Piske yo poko sekansye jenòm A. atra a, nou te itilize estrateji asanblaj de novo nan asanbleur MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) la. Yo te idantifye yon total 147,188 kontig kòm depandan (bivalv) de orijin. Apre sa, yo te eksploze kontig sa yo ak valè e 1e-10 lè l sèvi avèk BLASTN ak BLASTX. Estrateji sa a te pèmèt nou idantifye 482 fragman ki pa bivalv ki prezan nan ccfDNA A. atra a. Plis pase mwatye (57%) nan fragman ADN sa yo te jwenn nan bakteri, sitou nan senbyon branchièl, ki gen ladan senbyon sulfotwofik, ak nan senbyon branchièl Solemya velum (Fig. 5).
Abondans relatif nan nivo tip la. B Divèsite mikwòb nan de prensipal filòm yo (Firmicutes ak Proteobacteria). Anplifikasyon reprezantatif ddPCR C Vibrio spp. A. Fragman jèn 16S rRNA (ble) nan twa emolenf atra.
Yo te analize yon total 482 kontig kolekte. Pwofil jeneral distribisyon taksonomik anotasyon kontig metajenomik (prokaryot ak eukaryot). B Distribisyon detaye fragman ADN bakteri idantifye pa BLASTN ak BLASTX.
Analiz Kraken2 a te montre tou ke ccfDNA moul yo te genyen fragman ADN akeyal, tankou fragman ADN Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ak Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Prezans fragman ADN ki sòti nan Euryarchaeota ak Crenarchaeota, ke yo te jwenn anvan nan kominote mikwòb moul Kalifòni yo, pa ta dwe yon sipriz [42]. Malgre ke Euryarchaeota souvan asosye avèk kondisyon ekstrèm, kounye a yo rekonèt ke tou de Euryarchaeota ak Crenarcheota se pami prokaryot ki pi komen nan anviwònman kriyojenik maren an [43, 44]. Prezans mikwo-òganis metanojenik nan moul yo pa etonan, etandone rapò resan sou flit metàn vaste ki soti nan flit anba Plato Kerguelen an [45] ak posib pwodiksyon metàn mikwòb ki obsève sou kòt Zile Kerguelen yo [46].
Apre sa, atansyon nou te chanje pou nou te konsantre sou lekti ki soti nan viris ADN yo. Nan sa nou konnen, sa a se premye etid ki pa fèt sou sib la sou kontni viris ki nan moul yo. Jan nou te espere a, nou te jwenn fragman ADN bakteriofaj (Caudovirales) (Fig. 6b). Sepandan, ADN viral ki pi komen an soti nan yon filòm nikleositoviris, ke yo rele tou viris gwo ADN sitoplasmik nikleyè (NCLDV), ki gen pi gwo jenòm nan tout viris yo. Nan filòm sa a, pifò sekans ADN yo fè pati fanmi Mimimidoviridae (58%) ak Poxviridae (21%), ki gen lame natirèl yo enkli vètebre ak atwopòd, pandan ke yon ti pwopòsyon nan sekans ADN sa yo fè pati alg virolojik yo konnen. Li enfekte alg ekaryotik maren. Sekans yo te jwenn tou nan viris Pandora a, viris jeyan ki gen pi gwo gwosè jenòm nan tout jenerasyon viral yo konnen. Sa ki enteresan, seri lame yo konnen ki enfekte ak viris la, jan yo detèmine pa sekans ccfDNA emolinf la, te relativman gwo (Figi S3, Enfòmasyon Siplemantè). Li gen ladan viris ki enfekte ensèk tankou Baculoviridae ak Iridoviridae, ansanm ak viris ki enfekte amib, alg ak vètebre. Nou te jwenn tou sekans ki koresponn ak jenòm Pithovirus sibericum lan. Pitovirus yo (ke yo rele tou "viris zonbi") te premye izole nan pèmafrost ki gen 30,000 ane nan Siberia [47]. Kidonk, rezilta nou yo konsistan avèk rapò anvan yo ki montre ke se pa tout espès modèn viris sa yo ki disparèt [48] e ke viris sa yo ka prezan nan ekosistèm maren subarktik ki lwen yo.
Finalman, nou te fè tès pou wè si nou te ka jwenn fragman ADN ki soti nan lòt bèt miltiselilè. BLASTN ak BLASTX te idantifye yon total 482 kontig etranje avèk bibliyotèk nt, nr ak RefSeq (jenomik ak pwoteyin). Rezilta nou yo montre ke pami fragman etranje ccfDNA bèt miltiselilè yo, ADN zo yo predomine (Fig. 5). Yo te jwenn tou fragman ADN ki soti nan ensèk ak lòt espès. Yo pa ko idantifye yon pati relativman gwo nan fragman ADN yo, petèt akòz sou-reprezantasyon yon gwo kantite espès maren nan baz done jenomik yo konpare ak espès terès yo [49].
Nan atik sa a, nou aplike konsèp LB a nan moul, nou diskite ke sekansaj ADN ccf emolinf la ka bay plis enfòmasyon sou konpozisyon ekosistèm kotyè maren yo. An patikilye, nou te jwenn ke 1) emolinf moul gen konsantrasyon relativman wo (nivo mikwogram) nan fragman ADN sikile relativman gwo (~1-5 kb); 2) fragman ADN sa yo endepandan e non-endepandan 3) Pami sous etranje fragman ADN sa yo, nou te jwenn ADN bakteri, akeyal ak viral, ansanm ak ADN lòt bèt miltiselilè; 4) Akimilasyon fragman ccfDNA etranje sa yo nan emolinf la rive rapidman epi li kontribye nan aktivite filtraj entèn moul yo. An konklizyon, etid nou an demontre ke konsèp LB a, ki jiskaprezan te aplike sitou nan domèn byomedsin, kode yon sous konesans rich men ki poko eksplore ki ka itilize pou pi byen konprann entèraksyon ki genyen ant espès santinèl yo ak anviwònman yo.
Anplis primat, yo rapòte izolasyon ccfDNA nan mamifè, tankou sourit, chen, chat ak chwal [50, 51, 52]. Sepandan, nan konesans nou, etid nou an se premye a ki rapòte deteksyon ak sekans ccfDNA nan espès maren ki gen yon sistèm sikilasyon ouvè. Karakteristik anatomik sa a ak kapasite filtraj moul yo ka, omwen an pati, eksplike diferan karakteristik gwosè fragman ADN k ap sikile yo konpare ak lòt espès yo. Nan moun, pifò fragman ADN k ap sikile nan san an se ti fragman ki varye nan gwosè ant 150 ak 200 bp. ak yon pik maksimòm de 167 bp [34, 53]. Yon ti pòsyon men siyifikatif nan fragman ADN yo gen ant 300 ak 500 bp nan gwosè, epi anviwon 5% yo pi long pase 900 bp. [54]. Rezon pou distribisyon gwosè sa a se ke sous prensipal ccfDNA nan plasma a rive kòm rezilta lanmò selilè, swa akòz lanmò selilè oswa akòz nekwoz selil ematopoyetik k ap sikile nan moun ki an sante oswa akòz apoptoz selil timè nan pasyan kansè (ke yo rekonèt kòm ADN timè k ap sikile, ctDNA). Distribisyon gwosè ccfDNA emolinf ke nou te jwenn nan moul yo te varye ant 1000 ak 5000 bp, sa ki sijere ke ccfDNA moul yo gen yon orijin diferan. Sa a se yon ipotèz lojik, piske moul yo gen yon sistèm vaskilè semi-ouvè epi yo viv nan anviwònman akwatik maren ki gen gwo konsantrasyon ADN jenomik mikwòb. Anfèt, eksperyans laboratwa nou yo lè l sèvi avèk ADN ekzojèn yo te montre ke moul yo akimile fragman ADN nan dlo lanmè, omwen apre kèk èdtan yo degrade apre absòpsyon selilè ak/oswa lage ak/oswa estoke nan divès òganizasyon. Etandone rarite selil yo (tou de prokaryotik ak eukaryotik), itilizasyon konpatiman entravalvulè yo pral diminye kantite ccfDNA ki soti nan sous pwòp tèt yo osi byen ke nan sous etranje yo. Lè nou konsidere enpòtans iminite natirèl bivalv yo ak gwo kantite fagosit ki sikile nan san an, nou te plis fè ipotèz ke menm ccfDNA etranje a rich nan fagosit ki sikile nan san an ki akimile ADN etranje lè yo enjèste mikwo-òganis ak/oswa debri selilè. Lè nou mete tout ansanm, rezilta nou yo montre ke ccfDNA emolenf bivalv la se yon depo inik enfòmasyon molekilè epi li ranfòse estati yo kòm yon espès santinèl.
Done nou yo endike ke sekans ak analiz fragman ccfDNA emolenf ki sòti nan bakteri yo ka bay enfòmasyon kle sou flora bakteri lame a ak bakteri ki prezan nan ekosistèm maren ki antoure a. Teknik sekans pa piki yo te revele sekans bakteri komensal A. atra gill ki pa ta ka wè si yo te itilize metòd idantifikasyon 16S rRNA konvansyonèl yo, an pati akòz yon patipri bibliyotèk referans. Anfèt, itilizasyon nou te fè nan done LB ki te kolekte nan M. platensis nan menm kouch moul nan Kerguelen te montre ke konpozisyon senbyon bakteri ki asosye ak lamèl yo te menm pou tou de espès moul yo (Fig. S4, Enfòmasyon Siplemantè). Resanblans sa a ant de moul jenetikman diferan ka reflete konpozisyon kominote bakteri yo nan depo frèt, souf ak vòlkanik Kerguelen yo [55, 56, 57, 58]. Yo byen dekri nivo ki pi wo nan mikwo-òganis ki diminye souf lè y ap rekòlte moul nan zòn kotyè ki byoturbe [59], tankou kòt Pòtofrans. Yon lòt posibilite se ke flora moul komensal la ka afekte pa transmisyon orizontal [60, 61]. Plis rechèch nesesè pou detèmine korelasyon ki genyen ant anviwònman maren an, sifas fon lanmè a, ak konpozisyon bakteri senbyotik nan moul yo. Etid sa yo ap kontinye kounye a.
Longè ak konsantrasyon ccfDNA emolinf la, fasilite pirifikasyon li, ak bon jan kalite li ki pèmèt sekans rapid shotgun se kèk nan anpil avantaj ki genyen nan itilizasyon ccfDNA moul pou evalye byodiversite nan ekosistèm kotyè maren yo. Apwòch sa a patikilyèman efikas pou karakterize kominote viral (viròm) nan yon ekosistèm bay [62, 63]. Kontrèman ak bakteri, ake, ak eukaryot, jenòm viral yo pa gen jèn konsève filojenetikman tankou sekans 16S. Rezilta nou yo endike ke byopsi likid ki soti nan espès endikatè tankou moul yo ka itilize pou idantifye yon kantite relativman gwo fragman viris ccfDNA ke yo konnen ki enfekte lame ki tipikman abite ekosistèm marin kotyè yo. Sa gen ladan viris ke yo konnen ki enfekte protozoa, atropòd, ensèk, plant, ak viris bakteri (pa egzanp, bakteriofaj). Yo te jwenn yon distribisyon menm jan an lè nou te egzamine viròm ccfDNA emolinf moul ble yo (M. platensis) ki te kolekte nan menm kouch moul nan Kerguelen (Tablo S2, Enfòmasyon Siplemantè). Sekansaj rapid ccfDNA a se vreman yon nouvo apwòch k ap pran momantòm nan etid virim moun oswa lòt espès [21, 37, 64]. Apwòch sa a patikilyèman itil pou etidye viris ADN doub-brin, piske pa gen okenn jèn ki konsève nan mitan tout viris ADN doub-brin yo, sa ki reprezante klas viris ki pi divès ak laj nan Baltimore [65]. Malgre ke pifò nan viris sa yo rete san klasifikasyon epi yo ka gen ladan viris ki soti nan yon pati konplètman enkoni nan mond viral la [66], nou te jwenn ke virim yo ak seri lame moul A. atra ak M. platensis yo tonbe ant de espès yo. Menm jan an tou (gade figi S3, enfòmasyon adisyonèl). Resanblans sa a pa etonan, piske li ka reflete yon mank selektivite nan absòpsyon ADN ki prezan nan anviwònman an. Kounye a, yo bezwen plis etid nan lavni lè l sèvi avèk ARN pirifye pou karakterize virim ARN lan.
Nan etid nou an, nou te itilize yon pwosesis trè rigoureux adapte apati travay Kowarski ak kòlèg li yo [37], ki te itilize yon sipresyon an de etap nan lekti ak kontig gwoupe anvan ak apre asanblaj ccfDNA natif natal la, sa ki lakòz yon gwo pwopòsyon lekti ki pa mape. Se poutèt sa, nou pa ka eskli ke kèk nan lekti sa yo ki pa mape ka toujou gen pwòp orijin yo, sitou paske nou pa gen yon jenòm referans pou espès moul sa a. Nou te itilize pwosesis sa a tou paske nou te enkyete sou chimè ki genyen ant lekti pwòp tèt ou ak lekti ki pa pwòp tèt ou ak longè lekti ki pwodui pa Illumina MiSeq PE75 la. Yon lòt rezon pou majorite lekti ki pa mape yo se ke anpil nan mikwòb maren yo, espesyalman nan zòn aleka tankou Kerguelen, pa te anote. Nou te itilize Illumina MiSeq PE75, sipoze longè fragman ccfDNA ki sanble ak ccfDNA imen an. Pou etid nan lavni, etandone rezilta nou yo ki montre ke ccfDNA emolinf la gen lekti ki pi long pase moun ak/oswa mamifè yo, nou rekòmande pou itilize yon platfòm sekans ki pi apwopriye pou fragman ccfDNA ki pi long yo. Pratik sa a pral fè li pi fasil pou idantifye plis endikasyon pou yon analiz pi pwofon. Jwenn sekans konplè jenòm nikleyè A. atra a, ki pa disponib kounye a, ta fasilite anpil tou diskriminasyon ccfDNA soti nan sous pwòp ak sous ki pa pwòp. Etandone rechèch nou an te konsantre sou posiblite pou aplike konsèp byopsi likid la sou moul, nou espere ke pandan n ap itilize konsèp sa a nan rechèch nan lavni, nou pral devlope nouvo zouti ak pwosesis pou ogmante potansyèl metòd sa a pou etidye divèsite mikwòb moul yo nan ekosistèm maren an.
Kòm yon byomarkè klinik ki pa anvayisan, nivo ccfDNA ki wo nan plasma imen yo asosye avèk divès maladi, domaj tisi, ak kondisyon estrès [67,68,69]. Ogmantasyon sa a asosye avèk liberasyon fragman ADN ki soti nan pwòp orijin li apre domaj tisi. Nou te adrese pwoblèm sa a lè nou te itilize estrès chalè egi, kote moul yo te ekspoze pou yon ti tan a yon tanperati 30 °C. Nou te fè analiz sa a sou twa diferan kalite moul nan twa eksperyans endepandan. Sepandan, nou pa t jwenn okenn chanjman nan nivo ccfDNA apre estrès chalè egi (gade Figi S5, enfòmasyon adisyonèl). Dekouvèt sa a ka eksplike, omwen an pati, lefèt ke moul yo gen yon sistèm sikilatwa semi-ouvè epi yo akimile gwo kantite ADN etranje akòz aktivite filtraj segondè yo. Nan lòt men an, moul yo, tankou anpil envètebre, ka pi rezistan a domaj tisi ki pwovoke pa estrès, kidonk limite liberasyon ccfDNA nan emolinf yo [70, 71].
Jiska prezan, analiz ADN sou divèsite byolojik nan ekosistèm akwatik yo te sitou konsantre sou metabarcoding ADN anviwònman an (eDNA). Sepandan, metòd sa a anjeneral limite nan analiz divèsite byolojik lè yo itilize amorseur. Itilizasyon sekansaj shotgun kontoune limitasyon PCR ak seleksyon patipri nan seri amorseur yo. Kidonk, nan yon sans, metòd nou an pi pre metòd sekansaj eDNA Shotgun ki fèk itilize a, ki kapab sekansye ADN fragmenté dirèkteman epi analize prèske tout òganis [72, 73]. Sepandan, gen yon kantite pwoblèm fondamantal ki distenge LB ak metòd eDNA estanda yo. Natirèlman, prensipal diferans ki genyen ant eDNA ak LB se itilizasyon lame filtè natirèl. Yo rapòte itilizasyon espès maren tankou eponj ak bivalv (Dreisseina spp.) kòm yon filtè natirèl pou etidye eDNA [74, 75]. Sepandan, etid Dreissena a te itilize byopsi tisi kote yo te ekstrè ADN. Analiz ccfDNA ki soti nan LB pa mande byopsi tisi, ekipman espesyalize e pafwa chè ak lojistik ki asosye ak eDNA oswa byopsi tisi. Anfèt, nou te rapòte dènyèman ke ccfDNA ki soti nan LB ka estoke epi analize avèk sipò FTA san yo pa kenbe yon chèn frèt, ki se yon gwo defi pou rechèch nan zòn aleka [76]. Ekstraksyon ccfDNA nan byopsi likid tou senp epi li bay ADN kalite siperyè pou sekans shotgun ak analiz PCR. Sa a se yon gwo avantaj lè nou konsidere kèk nan limitasyon teknik ki asosye ak analiz eDNA [77]. Senplisite ak pri ki ba metòd echantiyonaj la patikilyèman apwopriye tou pou pwogram siveyans alontèm. Anplis kapasite filtraj segondè yo, yon lòt karakteristik byen koni nan bivalv yo se konpozisyon chimik mukopolisakarid nan larim yo, ki ankouraje absòpsyon viris yo [78, 79]. Sa fè bivalv yo yon filtè natirèl ideyal pou karakterize byodiversite ak enpak chanjman klimatik nan yon ekosistèm akwatik bay. Malgre ke prezans fragman ADN ki sòti nan lame a ka wè kòm yon limitasyon nan metòd la konpare ak eDNA, pri ki asosye ak genyen yon ccfDNA natif natal konsa konpare ak eDNA an menm tan konprann pou gwo kantite enfòmasyon ki disponib pou etid sante lame konpanse. Sa gen ladan l prezans sekans viral entegre nan jenòm lame a. Sa a patikilyèman enpòtan pou moul yo, etandone prezans retroviris lesemi ki transmèt orizontalman nan bivalv yo [80, 81]. Yon lòt avantaj LB sou ADN e se ke li eksplwate aktivite fagositar selil san ki sikile nan emolinf la, ki anglouti mikwo-òganis yo (ak jenòm yo). Fagositoz se fonksyon prensipal selil san nan bivalv yo [82]. Finalman, metòd la pwofite gwo kapasite filtraj moul yo (an mwayèn 1.5 l/h dlo lanmè) ak sikilasyon de jou, ki ogmante melanj diferan kouch dlo lanmè, sa ki pèmèt kaptire ADN etewojèn. [83, 84]. Kidonk, analiz ccfDNA moul yo se yon avni enteresan etandone enpak nitrisyonèl, ekonomik ak anviwònman moul yo. Menm jan ak analiz LB kolekte nan men moun, metòd sa a ouvè tou posiblite pou mezire chanjman jenetik ak epigenetik nan ADN lame a an repons a sibstans ekzojèn. Pa egzanp, yo ka prevwa teknoloji sekansaj twazyèm jenerasyon pou fè analiz metilasyon sou tout jenòm nan ccfDNA natif natal lè l sèvi avèk sekansaj nanopò. Pwosesis sa a ta dwe fasilite pa lefèt ke longè fragman ccfDNA moul yo ideyalman konpatib ak platfòm sekansaj lekti long ki pèmèt analiz metilasyon ADN sou tout jenòm nan yon sèl sekansaj san yo pa bezwen transfòmasyon chimik.85,86] Sa a se yon posibilite enteresan, paske yo te montre ke modèl metilasyon ADN reflete yon repons a estrès anviwònman an epi pèsiste sou plizyè jenerasyon. Se poutèt sa, li ka bay enfòmasyon enpòtan sou mekanis fondamantal ki gouvène repons apre ekspozisyon a chanjman klima oswa polisyon [87]. Sepandan, itilizasyon LB a pa san limit. Li evidan, sa mande prezans espès endikatè nan ekosistèm nan. Jan yo mansyone pi wo a, itilizasyon LB pou evalye byodiversite yon ekosistèm bay mande tou yon tiyo byoenformatik solid ki pran an kont prezans fragman ADN ki soti nan sous la. Yon lòt gwo pwoblèm se disponiblite jenòm referans pou espès maren yo. Yo espere ke inisyativ tankou Pwojè Jenòm Mamifè Marin yo ak pwojè Fish10k ki fèk etabli a [88] pral fasilite analiz sa yo nan lavni. Aplikasyon konsèp LB a nan òganis maren ki manje pa filtè a konpatib tou ak dènye avansman nan teknoloji sekansyasyon, sa ki fè li byen adapte pou devlopman byomarkè milti-ohm pou bay enfòmasyon enpòtan sou sante abita maren yo an repons a estrès anviwònman an.
Yo depoze done sekansaj jenòm nan Achiv Lekti Sekans NCBI a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 anba Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Enpak chanjman klimatik sou lavi maren ak ekosistèm yo. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Konsidere enpak konbine chanjman klimatik ak lòt faktè estrès lokal yo sou anviwònman maren an. anviwònman syantifik jeneral. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Syans nan premye mwa Mas la. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tolerans chalè redwi anba kondisyon estrès chalè repetitif eksplike gwo mòtalite moul ble yo pandan ete a. Rapò syantifik 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Chanjman resan nan frekans, kòz ak limit lanmò bèt yo. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Plizyè patojèn ki pa espesifik pou espès yo ka lakòz mòtalite an mas Pinna nobilis. Lavi. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Enpak potansyèl chanjman klimatik sou maladi zoonotik Aktik yo. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Moul ble (Mytilus edulis spp.) kòm òganis siyal nan siveyans polisyon kotyè: yon revizyon. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Entegrasyon byopsi likid nan tretman kansè. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Matirasyon byopsi likid: Pèmèt ADN timè a sikile. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asid nikleyik nan plasma imen. Pwosè-vèbal reyinyon filiyal Soc Biol yo. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Yon nouvo wòl pou ADN san selil kòm yon makè molekilè pou tretman kansè. Kantifikasyon analiz byomolè. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Byopsi likid antre nan klinik la - pwoblèm aplikasyon ak defi nan lavni. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ak lòt moun. ADN fetal la prezan nan plasma ak serom matènèl. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Etid sou evolisyon gwosès la ak konplikasyon li yo lè l sèvi avèk ARN ekstraselilè ki sikile nan san fanm pandan gwosès. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Byopsi likid: yo itilize ADN san selil donatè pou detekte lezyon alojenik nan yon grèf ren. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasyon nan dyagnostik prenatal: sekansaj jenòm plasma matènèl. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Deteksyon rapid patojèn ak sekans metajenomik pwochen jenerasyon likid kòporèl enfekte yo. Nat Medicine. 2021;27:115-24.