Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
திரவ பயாப்ஸி (LB) என்பது உயிர்மருத்துவத் துறையில் வேகமாகப் பிரபலமடைந்து வரும் ஒரு கருத்தாகும். இந்தக் கருத்து, முக்கியமாக பல்வேறு திசுக்களில் செல் இறப்பிற்குப் பிறகு சிறிய துண்டுகளாக வெளியிடப்படும், சுழற்சியில் உள்ள புறச்செல் டி.என்.ஏ (ccfDNA) துண்டுகளைக் கண்டறிவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இந்தத் துண்டுகளில் ஒரு சிறிய பகுதி அந்நிய (அயல்) திசுக்கள் அல்லது உயிரினங்களிலிருந்து உருவாகின்றன. தற்போதைய ஆய்வில், அதிக கடல்நீர் வடிகட்டும் திறனுக்காக அறியப்பட்ட ஒரு கண்காணிப்பு இனமான மட்டிகளுக்கு இந்தக் கருத்தை நாங்கள் பயன்படுத்தியுள்ளோம். கடல்சார் கடலோரச் சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிர் பெருக்கம் பற்றிய தகவல்களை வழங்குவதற்காக, பல்வேறு மூலங்களிலிருந்து சுற்றுச்சூழல் டி.என்.ஏ துண்டுகளைப் பிடிக்க, மட்டிகளின் இயற்கை வடிகட்டிகளாகச் செயல்படும் திறனை நாங்கள் பயன்படுத்துகிறோம். மட்டியின் ஹீமோலிம்பில் 1 முதல் 5 kb வரை அளவில் பெரிதும் மாறுபடும் டி.என்.ஏ துண்டுகள் உள்ளன என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. ஷாட்கன் வரிசைமுறைப்படுத்தல், அதிக எண்ணிக்கையிலான டி.என்.ஏ துண்டுகள் அயல் நுண்ணுயிரிகளின் தோற்றம் கொண்டவை என்பதைக் காட்டியது. அவற்றுள், பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்களின் டி.என்.ஏ துண்டுகளை நாங்கள் கண்டறிந்தோம்; இதில் கடலோரக் கடல்சார் சூழல் அமைப்புகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் பல்வேறு ஓம்புயிர்களைத் தொற்றக்கூடிய வைரஸ்களும் அடங்கும். முடிவாக, சிப்பிகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் LB கருத்தாக்கமானது, கடல்சார் கடலோரச் சூழல் அமைப்புகளில் உள்ள நுண்ணுயிர்ப் பன்முகத்தன்மை குறித்த வளமான, ஆனால் இதுவரை ஆராயப்படாத ஓர் அறிவுப் புதையலாக விளங்குகிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
கடல்சார் சூழல் அமைப்புகளின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தின் மீதான காலநிலை மாற்றத்தின் (CC) தாக்கம், வேகமாக வளர்ந்து வரும் ஒரு ஆராய்ச்சித் துறையாகும். புவி வெப்பமயமாதல் முக்கியமான உடலியல் அழுத்தங்களை ஏற்படுத்துவதோடு மட்டுமல்லாமல், கடல்வாழ் உயிரினங்களின் வெப்ப நிலைத்தன்மையின் பரிணாம வரம்புகளையும் விரிவுபடுத்துகிறது. இது பல உயிரினங்களின் வாழ்விடத்தைப் பாதித்து, அவற்றை மிகவும் சாதகமான நிலைமைகளைத் தேடத் தூண்டுகிறது [1, 2]. பலசெல் உயிரினங்களின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தைப் பாதிப்பதோடு மட்டுமல்லாமல், காலநிலை மாற்றம் புரவலன்-நுண்ணுயிர் இடைவினைகளின் நுட்பமான சமநிலையையும் சீர்குலைக்கிறது. இந்த நுண்ணுயிர் சமநிலையின்மை, கடல்வாழ் உயிரினங்களைத் தொற்று நோய்க்கிருமிகளுக்கு எளிதில் பாதிக்கப்படக்கூடியதாக மாற்றுவதால், கடல்சார் சூழல் அமைப்புகளுக்கு ஒரு கடுமையான அச்சுறுத்தலாக அமைகிறது [3, 4]. பெருமளவிலான இறப்புகளில் திடக் குறைபாடுகள் (SS) ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிப்பதாக நம்பப்படுகிறது, இது உலகளாவிய கடல்சார் சூழல் அமைப்புகளின் மேலாண்மைக்கு ஒரு தீவிரமான பிரச்சனையாகும் [5, 6]. பல கடல்வாழ் உயிரினங்களின் பொருளாதார, சூழலியல் மற்றும் ஊட்டச்சத்து தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது இது ஒரு முக்கியமான பிரச்சினையாகும். இது குறிப்பாக துருவப் பகுதிகளில் வாழும் இருவால்வு உயிரினங்களுக்குப் பொருந்தும், அங்கு காலநிலை மாற்றத்தின் விளைவுகள் மிகவும் உடனடியானதாகவும் கடுமையானதாகவும் உள்ளன [6, 7]. உண்மையில், மைட்டிலஸ் இனங்கள் போன்ற இருவால்வு உயிரினங்கள்... கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் காலநிலை மாற்றத்தின் விளைவுகளைக் கண்காணிக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. ஆச்சரியப்படத்தக்க வகையில், அவற்றின் ஆரோக்கியத்தைக் கண்காணிக்க ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான உயிர் குறிப்பான்கள் உருவாக்கப்பட்டுள்ளன, பெரும்பாலும் நொதி செயல்பாடு அல்லது செல் உயிர்வாழ்வு மற்றும் விழுங்குதல் செயல்பாடு போன்ற செல்லுலார் செயல்பாடுகளை அடிப்படையாகக் கொண்ட செயல்பாட்டு உயிர் குறிப்பான்களை உள்ளடக்கிய இரு-படிநிலை அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி [8]. இந்த முறைகளில் அதிக அளவு கடல் நீரை உறிஞ்சிய பிறகு மென்மையான திசுக்களில் குவியும் குறிப்பிட்ட அழுத்தக் குறிகாட்டிகளின் செறிவை அளவிடுவதும் அடங்கும். இருப்பினும், இருவால்வு உயிரினங்களின் அதிக வடிகட்டும் திறன் மற்றும் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு, திரவ பயாப்ஸி (LB) என்ற கருத்தைப் பயன்படுத்தி புதிய ஹீமோலிம்ப் உயிர் குறிப்பான்களை உருவாக்க ஒரு வாய்ப்பை வழங்குகிறது, இது நோயாளி மேலாண்மைக்கு ஒரு எளிய மற்றும் குறைந்தபட்ச ஊடுருவல் அணுகுமுறையாகும். இரத்த மாதிரிகள் [9, 10]. மனித LB-யில் பல வகையான சுற்றும் மூலக்கூறுகளைக் காண முடிந்தாலும், இந்தக் கருத்து முதன்மையாக பிளாஸ்மாவில் உள்ள சுற்றும் புற-செல்லுலார் டிஎன்ஏ (ccfDNA) துண்டுகளின் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை பகுப்பாய்வை அடிப்படையாகக் கொண்டது. உண்மையில், மனித பிளாஸ்மாவில் சுற்றும் டிஎன்ஏ இருப்பது 20 ஆம் நூற்றாண்டின் நடுப்பகுதியில் இருந்து அறியப்பட்டிருந்தாலும் [11], சமீபத்திய ஆண்டுகளில் தான் அதிக செயல்திறன் கொண்ட வரிசைப்படுத்தல் முறைகளின் வருகை ccfDNA அடிப்படையிலான மருத்துவ நோயறிதலுக்கு வழிவகுத்தது. இந்த சுற்றும் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பு, செல் இறப்பிற்குப் பிறகு மரபணு டிஎன்ஏ (அணுக்கரு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல்) செயலற்ற முறையில் வெளியிடப்படுவதால் ஓரளவு ஏற்படுகிறது. ஆரோக்கியமான நபர்களில் ccfDNA-வின் செறிவு பொதுவாகக் குறைவாகவே (<10 ng/mL) இருக்கும். ஆனால், பல்வேறு நோய்களால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு உள்ளாகும் நோயாளிகளில் இதன் அளவு 5 முதல் 10 மடங்கு வரை அதிகரித்து, திசு சேதத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும். ஆரோக்கியமான நபர்களில் ccfDNA-வின் செறிவு பொதுவாகக் குறைவாகவே (<10 ng/mL) இருக்கும். ஆனால், பல்வேறு நோய்களால் பாதிக்கப்பட்ட அல்லது மன அழுத்தத்திற்கு உள்ளாகும் நோயாளிகளில் இதன் அளவு 5 முதல் 10 மடங்கு வரை அதிகரித்து, திசு சேதத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும். У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 в 5-10 ராஸ்லிச்னோய் படோலோகி அல்லது போட்வேர்காயுஷியா ஸ்ட்ரெஸ்ஸு, ப்ரிவோட்யாஷெமு கே பொவ்ரேஜ்டெனியு ட்கனேய். ஆரோக்கியமான நபர்களில், cccDNA-வின் செறிவு பொதுவாகக் குறைவாகவே (<10 ng/mL) இருக்கும். ஆனால், பல்வேறு நோய்களால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளிடமோ அல்லது திசு சேதத்தை ஏற்படுத்தும் மன அழுத்தத்தின் கீழோ இது 5 முதல் 10 மடங்கு வரை அதிகரிக்கக்கூடும்.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织在 健康 个体 中 , ccfdna எடுத்துக்காட்டாக损伤கோன்சென்ட்ராசி ccfDNA நெறிமுறைகள் (<10 ng/ml) ராஸ்லிச்னிமி படோலோகியாமி அல்லது கட்டமைப்பு ஆரோக்கியமான நபர்களில் ccfDNA செறிவுகள் பொதுவாகக் குறைவாகவே (<10 ng/ml) இருக்கும், ஆனால் பல்வேறு நோய்கள் அல்லது மன அழுத்தம் உள்ள நோயாளிகளில் இது 5-10 மடங்கு வரை அதிகரித்து, திசு சேதத்தை விளைவிக்கக்கூடும்.ccfDNA துண்டுகளின் அளவு பரவலாக வேறுபடுகிறது, ஆனால் பொதுவாக 150 முதல் 200 bp வரை இருக்கும். [12]. சுய-பெறப்பட்ட ccfDNA, அதாவது, சாதாரண அல்லது உருமாற்றப்பட்ட புரவலர் செல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட ccfDNA, அணுக்கரு மற்றும்/அல்லது மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுவில் உள்ள மரபணு மற்றும் புறமரபணு மாற்றங்களைக் கண்டறியப் பயன்படுத்தப்படலாம், இதன் மூலம் மருத்துவர்கள் குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு-இலக்கு சிகிச்சைகளைத் தேர்ந்தெடுக்க உதவுகிறது [13]. இருப்பினும், கர்ப்ப காலத்தில் கரு செல்கள் அல்லது மாற்று உறுப்புகளிலிருந்து பெறப்படும் ccfDNA போன்ற வெளி மூலங்களிலிருந்தும் ccfDNA-வைப் பெறலாம் [14,15,16,17]. ccfDNA என்பது ஒரு தொற்று முகவரின் (வெளிநாட்டு) நியூக்ளிக் அமிலங்களின் இருப்பைக் கண்டறிவதற்கான ஒரு முக்கியமான தகவல் மூலமாகும், இது இரத்தக் கலாச்சாரங்களால் அடையாளம் காணப்படாத பரவலான தொற்றுகளை ஊடுருவல் அல்லாத முறையில் கண்டறிய அனுமதிக்கிறது, பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களின் ஊடுருவல் பயாப்ஸியைத் தவிர்க்கிறது [18]. சமீபத்திய ஆய்வுகள், மனித இரத்தம் வைரஸ் மற்றும் பாக்டீரியா நோய்க்கிருமிகளை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தக்கூடிய தகவல்களின் வளமான மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது என்பதையும், மனித பிளாஸ்மாவில் காணப்படும் ccfDNA-வில் சுமார் 1% வெளிநாட்டு தோற்றம் கொண்டது என்பதையும் காட்டியுள்ளன [19]. ccfDNA பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஒரு உயிரினத்தின் சுற்றும் மைக்ரோபயோமின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தை மதிப்பிட முடியும் என்பதை இந்த ஆய்வுகள் நிரூபிக்கின்றன. இருப்பினும், சமீப காலம் வரை, இந்தக் கருத்து மனிதர்களில் பிரத்தியேகமாகவும், குறைந்த அளவில் மற்ற முதுகெலும்பிகளிலும் பயன்படுத்தப்பட்டது [20, 21].
தற்போதைய ஆய்வறிக்கையில், 35 மில்லியன் ஆண்டுகளுக்கு முன்பு எரிமலை வெடிப்பினால் உருவான ஒரு பெரிய பீடபூமியின் மீது அமைந்துள்ள தீவுக் குழுவான, துணை அண்டார்டிக் கெர்குலன் தீவுகளில் பொதுவாகக் காணப்படும் ஒரு தெற்கு இனமான ஆலகோமியா அட்ராவின் ccfDNA-வை பகுப்பாய்வு செய்ய, நாங்கள் LB பொட்டன்ஷியலைப் பயன்படுத்துகிறோம். ஒரு இன் விட்ரோ சோதனை அமைப்பைப் பயன்படுத்தி, கடல்நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகள் மட்டிகளால் விரைவாக எடுத்துக்கொள்ளப்பட்டு, அவற்றின் ஹீமோலிம்ஃப் பகுதிக்குள் நுழைகின்றன என்பதைக் கண்டறிந்தோம். ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் மூலம், மட்டியின் ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வில், கூட்டுவாழ் பாக்டீரியாக்கள் மற்றும் குளிர் எரிமலைக் கடலோரச் சூழல் மண்டலங்களில் காணப்படும் உயிரின வாழ்விடங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎன்ஏ துண்டுகள் உட்பட, அதன் சொந்த மற்றும் பிற மூலங்களின் டிஎன்ஏ துண்டுகள் உள்ளன என்பது தெரியவந்துள்ளது. ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வில், வெவ்வேறு ஓம்புயிரி வரம்புகளைக் கொண்ட வைரஸ்களிலிருந்து பெறப்பட்ட வைரஸ் வரிசைகளும் உள்ளன. எலும்பு மீன்கள், கடல் அனிமோன்கள், பாசிகள் மற்றும் பூச்சிகள் போன்ற பலசெல்லுயிரிகளின் டிஎன்ஏ துண்டுகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். முடிவாக, கடல் சூழல் மண்டலங்களில் ஒரு செழுமையான மரபணுத் தொகுப்பை உருவாக்க, கடல் முதுகெலும்பற்ற உயிரினங்களுக்கு LB கருத்தை வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்த முடியும் என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
டிசம்பர் 2018-ல், போர்ட்-ஆ-பிரான்ஸ் (049°21.235 தெற்கு, 070°13.490 கிழக்கு) கெர்குலன் தீவுகளின் ஓத இடைப்பாலை கடற்கரைகளிலிருந்து, முதிர்ந்த (55-70 மிமீ நீளமுள்ள) மைட்டிலஸ் பிளாடென்சிஸ் (எம். பிளாடென்சிஸ்) மற்றும் ஆலகோமியா அட்ரா (ஏ. அட்ரா) ஆகியவை சேகரிக்கப்பட்டன. மற்ற முதிர்ந்த நீல மட்டிகள் (மைட்டிலஸ் இனங்கள்) ஒரு வணிக விநியோகஸ்தரிடமிருந்து (PEI மஸ்ஸல் கிங் இன்க்., பிரின்ஸ் எட்வர்ட் தீவு, கனடா) பெறப்பட்டு, 10-20 லிட்டர் 32‰ செயற்கை உப்புநீர் (செயற்கை கடல் உப்பு ரீஃப் கிரிஸ்டல், இன்ஸ்டன்ட் ஓஷன், வர்ஜீனியா, அமெரிக்கா) கொண்ட, வெப்பநிலை கட்டுப்படுத்தப்பட்ட (4°C) காற்றோட்டமுள்ள தொட்டியில் வைக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு பரிசோதனைக்கும், தனித்தனி ஓடுகளின் நீளம் மற்றும் எடை அளவிடப்பட்டன.
இந்த நிரலுக்கான இலவச திறந்த அணுகல் நெறிமுறை ஆன்லைனில் கிடைக்கிறது (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). சுருக்கமாக, [22] இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி அப்டக்டர் தசைகளிலிருந்து LB ஹீமோலிம்ப் சேகரிக்கப்பட்டது. ஹீமோலிம்ப் 3 நிமிடங்களுக்கு 1200×g இல் மையவிலக்கு மூலம் தெளிவுபடுத்தப்பட்டது, மேல்தேங்கிய திரவம் பயன்படுத்தப்படும் வரை உறைய வைக்கப்பட்டது (-20°C). cfDNA-ஐப் பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் தூய்மைப்படுத்துதலுக்காக, மாதிரிகள் (1.5-2.0 மிலி) உருகவைக்கப்பட்டு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி NucleoSnap cfDNA கிட் (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) பயன்படுத்திச் செயலாக்கப்பட்டன. ccfDNA மேலதிக பகுப்பாய்வு வரை -80°C இல் சேமிக்கப்பட்டது. சில சோதனைகளில், QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) பயன்படுத்தி ccfDNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டு தூய்மைப்படுத்தப்பட்டது. தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட DNA ஒரு நிலையான பைகோகிரீன் மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ccfDNA-வின் துண்டுப் பரவலானது, உயர் உணர்திறன் கொண்ட DNA கிட்டைப் பயன்படுத்தி, அஜிலென்ட் 2100 பயோஅனலைசர் (அஜிலென்ட் டெக்னாலஜிஸ் இன்க்., சாண்டா கிளாரா, CA) மூலம் நுண்குழாய் மின்பகுப்பு முறையில் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி, 1 µl ccfDNA மாதிரியைப் பயன்படுத்தி இந்தச் சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது.
ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA துண்டுகளை வரிசைப்படுத்துவதற்காக, ஜெனோம் கியூபெக் (மான்ட்ரியல், கியூபெக், கனடா) இல்லுமினா MiSeq PE75 கிட்டின் இல்லுமினா DNA மிக்ஸ் கிட்டைப் பயன்படுத்தி ஷாட்கன் லைப்ரரிகளைத் தயாரித்தது. ஒரு நிலையான அடாப்டர் (பயோஓ) பயன்படுத்தப்பட்டது. மூலத் தரவுக் கோப்புகள் NCBI சீக்வென்ஸ் ரீட் ஆர்க்கைவிலிருந்து (SRR8924808 மற்றும் SRR8924809) கிடைக்கின்றன. அடிப்படை வாசிப்புத் தரம் FastQC [23] ஐப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது. அடாப்டர்கள் மற்றும் தரம் குறைந்த ரீட்களை கிளிப்பிங் செய்ய ட்ரிம்மோமேட்டிக் [24] பயன்படுத்தப்பட்டது. பொருந்தாத் தன்மைகளைத் தவிர்க்க [25], இணை முனைகளைக் கொண்ட ஷாட்கன் ரீட்கள், குறைந்தபட்சம் 20 bp ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும்படி நீண்ட ஒற்றை ரீட்களாக ஃபிளாஷ் மெர்ஜ் செய்யப்பட்டன. இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள், இருவால்வு NCBI வகைப்பாட்டுத் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு < 1e−3 மற்றும் 90% ஹோமாலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் குறிக்கப்பட்டன, மேலும் குறைந்த சிக்கலான வரிசைகளின் முகமூடி DUST [26] ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. இணைக்கப்பட்ட வாசிப்புகள், இருவால்வு NCBI வகைப்பாட்டுத் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு < 1e−3 மற்றும் 90% ஹோமாலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் குறிக்கப்பட்டன, மேலும் குறைந்த சிக்கலான வரிசைகளின் முகமூடி DUST [26] ஐப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது. ஒலிபெருக்கிகள் моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% கோமலோகிகள்), ஒரு மாஸ்கிரோவனி போஸ்லேடோவட்டல்னோஸ்டை நிஸ்காய் ஸ்லோக்னோஸ்டி பைலோ வைபோல்னெனோ ஸ் இஸ்போல்னெனோ [இஸ்போல் 26] டி.எஸ்.டி. NCBI பைவால்வ் வகைப்பாட்டுத் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு < 1e-3 மற்றும் 90% ஹோமாலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் பூல் செய்யப்பட்ட ரீடுகள் குறிக்கப்பட்டன, மேலும் DUST [26] ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை முகமூடி செய்யப்பட்டது.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 மற்றும் 90%进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ஒலிபெருக்கிகள் மோலிஸ்கோவ் என்சிபிஐ (பொதுவான இ <1e-3 மற்றும் 90% கோமோலோஜி), ஒரு மாஸ்கிரோவனி போஸ்லேடோவட்டேல்னோஸ்டெய் நிஸ்கோய் ஸ்லோஜினோஸ்டி பிலோ வைபோல்னேனோ ஸ்.2.6. NCBI பைவால்வ் வகைப்பாட்டுத் தரவுத்தளத்தைப் (e மதிப்பு <1e-3 மற்றும் 90% ஹோமாலஜி) பயன்படுத்தி BLASTN உடன் பூல் செய்யப்பட்ட ரீடுகள் குறிக்கப்பட்டன, மேலும் DUST [26] ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த சிக்கலான வரிசை முகமூடி செய்யப்பட்டது.ரீடுகள் இரண்டு குழுக்களாகப் பிரிக்கப்பட்டன: பைவால்வ் வரிசைகளுடன் தொடர்புடையவை (இங்கே சுய-ரீடுகள் என்று அழைக்கப்படுகின்றன) மற்றும் தொடர்பற்றவை (சுய-ரீடுகள் அல்லாதவை). கான்டிக்களை உருவாக்க MEGAHIT ஐப் பயன்படுத்தி இரண்டு குழுக்களும் தனித்தனியாக ஒன்றிணைக்கப்பட்டன [27]. இதற்கிடையில், ஏலியன் மைக்ரோபயோம் ரீடுகளின் வகைப்பாட்டுப் பரவல் Kraken2 [28] ஐப் பயன்படுத்தி வகைப்படுத்தப்பட்டது மற்றும் Galaxy [29, 30] இல் ஒரு க்ரோனா பை விளக்கப்படத்தால் வரைபடமாகப் பிரதிநிதிப்படுத்தப்பட்டது. எங்கள் ஆரம்ப சோதனைகளிலிருந்து உகந்த kmers, kmers-59 எனத் தீர்மானிக்கப்பட்டது. பின்னர், இறுதி விளக்கக்குறிப்பிற்காக, BLASTN (இருவால்வு NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) கொண்டு சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிக்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. பின்னர், இறுதி விளக்கக்குறிப்பிற்காக, BLASTN (இருவால்வு NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) கொண்டு சீரமைப்பதன் மூலம் சுய கான்டிக்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. கேத்தம் சோப்ஸ்ட்வென்னி கான்டிகி பைலி ஐடென்டிஃபிசிரோவனி புடெம் சோபோஸ்டாவ்லேனியா மற்றும் பிளாஸ்ட்ன் NCBI, значение e <1e-10 и கோமலோஜியா 60%) பின்னர், இறுதி விளக்கக்குறிப்பிற்காக, BLASTN (NCBI இருவால்வு தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) உடன் பொருத்தி சுய-தொடர் துண்டுகள் அடையாளம் காணப்பட்டன.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% கேத்தம் பைலி ஐடெண்டிஃபிட்கள் dannыh NCBI வரை двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). பின்னர், BLASTN (NCBI இருவால்வு தரவுத்தளம், e மதிப்பு <1e-10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) உடன் பொருத்துவதன் மூலம், இறுதி விளக்கக்குறிப்பிற்காக சுய-தொடர் துண்டுகள் அடையாளம் காணப்பட்டன. இணையாக, சுயமற்ற குழு கான்டிக்கள் BLASTN (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) கொண்டு குறிக்கப்பட்டன. இணையாக, சுயமற்ற குழு கான்டிக்கள் BLASTN (nt NCBI தரவுத்தளம், e மதிப்பு < 1e−10 மற்றும் 60% ஒத்த தன்மை) கொண்டு குறிக்கப்பட்டன. பாரல்லெல்னோ சுஜெரோட்னி க்ருப்போவி கான்டிகி பைலி அன்னோடிரோவனி எஸ் போமோஷியு பிளாஸ்ட்ன் (பாசா டான்சி என்சிபிஐ,
PCR-க்கு பயன்படுத்தப்பட்ட பிரைமர்கள் அட்டவணை S1-இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. ccfDNA இலக்கு மரபணுக்களைப் பெருக்குவதற்கு Taq DNA பாலிமரேஸ் (பயோ பேசிக் கனடா, மார்க்கம், ON) பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்வரும் வினை நிபந்தனைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன: 3 நிமிடங்களுக்கு 95°C-இல் சிதைத்தல், 1 நிமிடத்திற்கு 95°C-இல், 1 நிமிடத்திற்கு நிர்ணயிக்கப்பட்ட அனீலிங் வெப்பநிலை, 1 நிமிடத்திற்கு 72°C-இல் நீட்டித்தல், 35 சுழற்சிகள், மற்றும் இறுதியாக 10 நிமிடங்களுக்குள் 72°C-இல் வைத்தல். SYBRTM சேஃப் DNA ஜெல் ஸ்டெயின் (இன்விட்ரோஜென், பர்லிங்டன், ON, கனடா) கொண்ட அகரோஸ் ஜெல்களில் (1.5%) 95 V மின்னழுத்தத்தில், PCR விளைபொருட்கள் எலக்ட்ரோஃபோரெசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்பட்டன.
சிப்பிகள் (மைட்டிலஸ் இனங்கள்) 500 மிலி ஆக்சிஜன் கலந்த கடல்நீரில் (32 PSU) 4°C வெப்பநிலையில் 24 மணி நேரம் பழக்கப்படுத்தப்பட்டன. மனித கேலக்டின்-7 cDNA வரிசையை (NCBI அணுகல் எண் L07769) குறியீடாக்கும் ஒரு செருகலைக் கொண்ட பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ, 190 μg/μl என்ற இறுதிச் செறிவில் குப்பியில் சேர்க்கப்பட்டது. டிஎன்ஏ சேர்க்கப்படாமல் அதே நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட சிப்பிகள் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவாக இருந்தன. மூன்றாவது கட்டுப்பாட்டுக் தொட்டியில் சிப்பிகள் இல்லாமல் டிஎன்ஏ இருந்தது. கடல்நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ-வின் தரத்தைக் கண்காணிக்க, ஒவ்வொரு தொட்டியிலிருந்தும் குறிப்பிட்ட நேரத்தில் கடல்நீர் மாதிரிகள் (20 μl; மூன்று முறை) எடுக்கப்பட்டன. பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ-வின் தடமறிதலுக்காக, LB சிப்பிகள் குறிப்பிட்ட நேரங்களில் அறுவடை செய்யப்பட்டு qPCR மற்றும் ddPCR மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. கடல்நீரில் அதிக உப்புச்சத்து இருப்பதால், அனைத்து PCR சோதனைகளுக்கும் முன்னர், மாதிரிகள் PCR தர நீரில் (1:10) நீர்க்கப்பட்டன.
பயோராட் QX200 நெறிமுறையைப் (மிசிசாகா, ஒன்டாரியோ, கனடா) பயன்படுத்தி டிஜிட்டல் துளி பிசிஆர் (ddPCR) செய்யப்பட்டது. உகந்த வெப்பநிலையைத் தீர்மானிக்க வெப்பநிலை விவரக்குறிப்பைப் பயன்படுத்தவும் (அட்டவணை S1). QX200 துளி ஜெனரேட்டரைப் (பயோராட்) பயன்படுத்தி துளிகள் உருவாக்கப்பட்டன. ddPCR பின்வருமாறு மேற்கொள்ளப்பட்டது: 5 நிமிடங்களுக்கு 95°C, 50 சுழற்சிகளுக்கு 30 விநாடிகளுக்கு 95°C மற்றும் 1 நிமிடத்திற்கு ஒரு குறிப்பிட்ட அனீலிங் வெப்பநிலை, மேலும் 30 விநாடிகளுக்கு 72°C, 5 நிமிடங்களுக்கு 4°C மற்றும் 5 நிமிடங்களுக்குள் 90°C. துளிகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் நேர்மறை எதிர்வினைகள் (நகல்களின் எண்ணிக்கை/µl) ஆகியவை QX200 துளி ரீடரைப் (பயோராட்) பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன. 10,000 துளிகளுக்கும் குறைவாக உள்ள மாதிரிகள் நிராகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு முறையும் ddPCR இயக்கப்படும்போது பேட்டர்ன் கட்டுப்பாடு செய்யப்படவில்லை.
ரோட்டார்-ஜீன்® 3000 (கார்பெட் ரிசர்ச், சிட்னி, ஆஸ்திரேலியா) மற்றும் LGALS7 பிரத்யேக பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி qPCR செய்யப்பட்டது. அனைத்து அளவுசார் PCR-களும் குவாண்டிஃபாஸ்ட் SYBR கிரீன் PCR கிட் (QIAGEN) பயன்படுத்தி 20 µl அளவில் செய்யப்பட்டன. qPCR ஆனது 95°C-ல் 15 நிமிட அடைகாத்தலுடன் தொடங்கப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து, ஒரு தரவு சேகரிப்புடன், 95°C-ல் 10 வினாடிகளுக்கும் மற்றும் 60°C-ல் 60 வினாடிகளுக்கும் என 40 சுழற்சிகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன. qPCR-ன் முடிவில், 95°C-ல் 5 விநாடிகள், 65°C-ல் 60 விநாடிகள் மற்றும் 97°C-ல் தொடர்ச்சியான அளவீடுகளைப் பயன்படுத்தி உருகு வளைவுகள் உருவாக்கப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளைத் தவிர, ஒவ்வொரு qPCR-ம் மும்முறை செய்யப்பட்டது.
சிப்பிகள் அவற்றின் அதிக வடிகட்டுதல் திறனுக்காக அறியப்படுவதால், கடல்நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளை அவற்றால் வடிகட்டித் தக்கவைக்க முடியுமா என்பதை நாங்கள் முதலில் ஆராய்ந்தோம். இந்தத் துண்டுகள் அவற்றின் அரை-திறந்த நிணநீர் மண்டலத்தில் குவிகின்றனவா என்பதிலும் நாங்கள் ஆர்வமாக இருந்தோம். நீலச் சிப்பித் தொட்டிகளில் சேர்க்கப்பட்ட கரையக்கூடிய டிஎன்ஏ துண்டுகளின் போக்கைக் கண்காணிப்பதன் மூலம், இந்தச் சிக்கலை நாங்கள் சோதனை ரீதியாகத் தீர்த்தோம். டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்காணிப்பதை எளிதாக்க, மனித கேலக்டின்-7 மரபணுவைக் கொண்ட அயல் (சுயமல்லாத) பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ-வை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். டிடிபிசிஆர் (ddPCR) கடல்நீர் மற்றும் சிப்பிகளில் உள்ள பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்காணிக்கிறது. சிப்பிகள் இல்லாத நிலையில் கடல்நீரில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளின் அளவு காலப்போக்கில் (7 நாட்கள் வரை) ஒப்பீட்டளவில் நிலையானதாக இருந்தால், சிப்பிகள் இருக்கும்போது இந்த அளவு 8 மணி நேரத்திற்குள் கிட்டத்தட்ட முழுமையாக மறைந்துவிட்டது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 1a,b). புற டிஎன்ஏ துண்டுகள் வால்வுகளுக்குள் உள்ள திரவம் மற்றும் ஹீமோலிம்பில் 15 நிமிடங்களுக்குள் எளிதாகக் கண்டறியப்பட்டன (படம் 1c). இந்தத் துண்டுகளை வெளிப்படுத்திய 4 மணி நேரம் வரை கண்டறிய முடிந்தது. டிஎன்ஏ துண்டுகள் தொடர்பான இந்த வடிகட்டுதல் செயல்பாடு பாக்டீரியா மற்றும் பாசிகளின் வடிகட்டுதல் செயல்பாட்டிற்கு ஒப்பிடத்தக்கது [31]. இந்த முடிவுகள், மட்டிகள் வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவை வடிகட்டி அவற்றின் திரவப் பகுதிகளில் குவிக்க முடியும் என்று கூறுகின்றன.
ddPCR மூலம் அளவிடப்பட்ட, சிப்பிகள் இருக்கும் (A) அல்லது இல்லாத (B) நிலையில் கடல்நீரில் உள்ள பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ-வின் சார்புச் செறிவுகள். A-இல், முடிவுகள் சதவீதங்களாக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன, பெட்டிகளின் எல்லைகள் 75-வது மற்றும் 25-வது சதவிகிதங்களைக் குறிக்கின்றன. பொருத்தப்பட்ட மடக்கை வளைவு சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது, மேலும் சாம்பல் நிறத்தில் நிழலிடப்பட்ட பகுதி 95% நம்பிக்கை இடைவெளியைக் குறிக்கிறது. B-இல், சிவப்பு கோடு சராசரியையும், நீல கோடு செறிவுக்கான 95% நம்பிக்கை இடைவெளியையும் குறிக்கிறது. C பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ சேர்க்கப்பட்ட பிறகு வெவ்வேறு நேரங்களில் சிப்பிகளின் ஹீமோலிம்ஃப் மற்றும் வால்வுலர் திரவத்தில் பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ குவிதல். முடிவுகள் கண்டறியப்பட்ட முழுமையான பிரதிகள்/mL (±SE) என வழங்கப்பட்டுள்ளன.
அடுத்து, குறைந்த மனிதத் தலையீடுகளைக் கொண்ட தொலைதூரத் தீவுக் குழுமமான கெர்குலன் தீவுகளில் உள்ள மட்டிப் படுக்கைகளிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட மட்டிகளில் ccfDNA-வின் தோற்றத்தை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். இந்த நோக்கத்திற்காக, மட்டி ஹீமோலிம்ஃப்களிலிருந்து cccDNA, மனித cccDNA-வை சுத்திகரிக்கப் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் முறைகளைப் பயன்படுத்திப் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்டது [32, 33]. மட்டிகளில் சராசரி ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA செறிவுகள், ஒரு மில்லி ஹீமோலிம்ஃபிற்கு குறைந்த மைக்ரோகிராம் வரம்பில் இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (அட்டவணை S2, துணைத் தகவலைப் பார்க்கவும்). இந்தச் செறிவு வரம்பு ஆரோக்கியமான மனிதர்களை விட (ஒரு மில்லிலிட்டருக்கு குறைந்த நானோகிராம்) மிகவும் பெரியது, ஆனால் அரிதான சந்தர்ப்பங்களில், புற்றுநோயாளிகளில், ccfDNA-வின் அளவு ஒரு மில்லிலிட்டருக்கு பல மைக்ரோகிராம்களை எட்டக்கூடும் [34, 35]. ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வின் அளவுப் பரவல் பற்றிய ஒரு பகுப்பாய்வு, இந்தத் துண்டுகள் 1000 bp முதல் 5000 bp வரை அளவில் பெரிதும் வேறுபடுகின்றன என்பதைக் காட்டியது (படம் 2). குறைந்த செறிவுள்ள டிஎன்ஏ மாதிரிகளிலிருந்து, ccfDNA உட்பட [36], மரபணு டிஎன்ஏவை விரைவாகப் பிரித்தெடுக்கவும் சுத்திகரிக்கவும் தடயவியல் அறிவியலில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு முறையான சிலிக்கா அடிப்படையிலான QIAamp இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட்டைப் பயன்படுத்தி இதே போன்ற முடிவுகள் பெறப்பட்டன.
சிப்பி ஹீமோலிம்பின் ccfDNA எலக்ட்ரோஃபோரோகிராமின் ஒரு மாதிரிப் படம். இது நியூக்ளியோஸ்நாப் பிளாஸ்மா கிட் (மேலே) மற்றும் QIAamp DNA இன்வெஸ்டிகேட்டர் கிட் ஆகியவற்றைக் கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. B. சிப்பிகளில் உள்ள ஹீமோலிம்ப் ccfDNA செறிவுகளின் (±SE) பரவலைக் காட்டும் வயலின் வரைபடம். கருப்பு மற்றும் சிவப்பு கோடுகள் முறையே இடைநிலை மற்றும் முதல் மற்றும் மூன்றாம் கால்மானங்களைக் குறிக்கின்றன.
மனிதர்கள் மற்றும் முதனிகளில் உள்ள ccfDNA-வில் சுமார் 1% வெளிநாட்டு மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது [21, 37]. இருவால்வு உயிரினங்களின் அரை-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பு, நுண்ணுயிரிகள் நிறைந்த கடல்நீர் மற்றும் மட்டி ccfDNA-வின் அளவுப் பரவல் ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டு, மட்டியின் ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வில் வளமான மற்றும் பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த நுண்ணுயிர் DNA தொகுப்பு இருக்கலாம் என்று நாங்கள் கருதுகோள் செய்தோம். இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க, கெர்குலன் தீவுகளிலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட Aulacomya atra மாதிரிகளின் ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வை நாங்கள் வரிசைப்படுத்தினோம், இதன் மூலம் 10 மில்லியனுக்கும் அதிகமான வாசிப்புகள் கிடைத்தன, அவற்றில் 97.6% தரக்கட்டுப்பாட்டில் தேர்ச்சி பெற்றன. பின்னர் அந்த வாசிப்புகள், BLASTN மற்றும் NCBI இருவால்வு தரவுத்தளங்களைப் பயன்படுத்தி சுய மற்றும் சுயமற்ற மூலங்களின்படி வகைப்படுத்தப்பட்டன (படம் S1, துணைத் தகவல்).
மனிதர்களில், உட்கரு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ இரண்டும் இரத்த ஓட்டத்தில் வெளியிடப்படலாம் [38]. இருப்பினும், தற்போதைய ஆய்வில், A. atra மரபணு வரிசைப்படுத்தப்படவோ அல்லது விவரிக்கப்படவோ இல்லாததால், மட்டிகளின் உட்கரு மரபணு டிஎன்ஏவை விரிவாக விவரிக்க முடியவில்லை. இருப்பினும், இருவால்வு நூலகத்தைப் பயன்படுத்தி எங்களின் சொந்த மூலத்தின் பல ccfDNA துண்டுகளை எங்களால் அடையாளம் காண முடிந்தது (படம் S2, துணைத் தகவல்). வரிசைப்படுத்தப்பட்ட அந்த A. atra மரபணுக்களை நெறிப்படுத்தப்பட்ட PCR பெருக்கம் செய்வதன் மூலமும் எங்களின் சொந்த மூலத்தின் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம் (படம் 3). இதேபோல், A. atra-வின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு பொது தரவுத்தளங்களில் கிடைப்பதால், A. atra-வின் ஹீமோலிம்பில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் ccfDNA துண்டுகள் இருப்பதற்கான ஆதாரங்களைக் காணலாம். மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பு PCR பெருக்கம் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம் 3).
PCR மூலம் பெருக்கப்பட்ட A. atra (சிவப்புப் புள்ளிகள் – இருப்பு எண்: SRX5705969) மற்றும் M. platensis (நீலப் புள்ளிகள் – இருப்பு எண்: SRX5705968) ஆகியவற்றின் ஹீமோலிம்பில் பல்வேறு மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுக்கள் இருந்தன. படம் Breton et al., 2011 B-இலிருந்து தழுவப்பட்டது. FTA தாளில் சேமிக்கப்பட்ட A. atra-வின் ஹீமோலிம்ப் சூப்பர்நேட்டன்ட்டின் பெருக்கம். PCR கலவை உள்ள PCR குழாயில் நேரடியாகச் சேர்க்க 3 மிமீ பஞ்சைப் பயன்படுத்தவும்.
கடல் நீரில் அதிக அளவில் நுண்ணுயிரிகள் இருப்பதால், நாங்கள் ஆரம்பத்தில் ஹீமோலிம்பில் உள்ள நுண்ணுயிரி டிஎன்ஏ வரிசைகளின் பண்புகளைக் கண்டறிவதில் கவனம் செலுத்தினோம். இதைச் செய்ய, நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு உத்திகளைப் பயன்படுத்தினோம். முதல் உத்தியானது, BLAST மற்றும் பிற கருவிகளுக்கு [28] ஒப்பிடக்கூடிய துல்லியத்துடன் நுண்ணுயிரி வரிசைகளை அடையாளம் காணக்கூடிய ஒரு வழிமுறை அடிப்படையிலான வரிசை வகைப்படுத்தல் நிரலான Kraken2-ஐப் பயன்படுத்தியது. 6719-க்கும் மேற்பட்ட ரீடுகள் பாக்டீரியா தோற்றம் கொண்டவை எனத் தீர்மானிக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் 124 மற்றும் 64 முறையே ஆர்க்கியா மற்றும் வைரஸ்களிலிருந்து வந்தவை (படம் 4). மிகவும் அதிகமாகக் காணப்படும் பாக்டீரியா டிஎன்ஏ துண்டுகள் ஃபர்மிகியூட்ஸ் (46%), புரோட்டியோபாக்டீரியா (27%), மற்றும் பாக்டீரியாய்டீஸ் (17%) ஆகும் (படம் 4a). இந்த பரவல், கடல் நீல மட்டியின் மைக்ரோபயோம் பற்றிய முந்தைய ஆய்வுகளுடன் [39, 40] ஒத்துப்போகிறது. காமாபுரோட்டியோபாக்டீரியா, புரோட்டியோபாக்டீரியாவின் முக்கிய வகுப்பாக (44%) இருந்தது, இதில் பல வைப்ரியோனேல்ஸ் அடங்கும் (படம் 4b). ddPCR முறையானது A. atra ஹீமோலிம்பின் ccfDNA-வில் விப்ரியோ DNA துண்டுகள் இருப்பதை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 4c) [41]. ccfDNA-வின் பாக்டீரிய தோற்றம் பற்றிய கூடுதல் தகவல்களைப் பெற, ஒரு கூடுதல் அணுகுமுறை மேற்கொள்ளப்பட்டது (படம் S2, துணைத் தகவல்). இந்த நேர்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்திய வாசிப்புகள் இணைமுனை வாசிப்புகளாகத் தொகுக்கப்பட்டு, BLASTN, 1e−3 என்ற e மதிப்பு மற்றும் >90% ஒத்த தன்மை கொண்ட ஒரு வரம்பு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, அவை தன்மூலம் (இருவால்வு உயிரிகள்) அல்லது அயல்மூலம் என வகைப்படுத்தப்பட்டன. இந்த நேர்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்திய வாசிப்புகள் இணைமுனை வாசிப்புகளாகத் தொகுக்கப்பட்டு, BLASTN, 1e−3 என்ற e மதிப்பு மற்றும் >90% ஒத்த தன்மை கொண்ட ஒரு வரம்பு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, அவை தன்மூலம் (இருவால்வு உயிரிகள்) அல்லது அயல்மூலம் என வகைப்படுத்தப்பட்டன. எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவயுசியஸ் பைலி சோப்ரானி காக் செக்டெனியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் பைலி கிளாஸ்ஸி சோப்ஸ்ட்வென்னி (டிவியூஸ்ட்வார்ட் மோலிஸ்கி) அல்லது சுசி போ ப்ரோயிஷோஜெடனியூ எஸ் இஸ்போல்சோவனிம் பிளாஸ்ட்ன் மற்றும் ஜான்செனியா இ 1இ-3 மற்றும் гомологией> 90%. இந்த நேர்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் ரீடுகள், இணைமுனை ரீடுகளாகச் சேகரிக்கப்பட்டு, BLASTN, 1e-3 என்ற e மதிப்பு மற்றும் >90% ஹோமாலஜி கொண்ட கட்ஆஃப் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, இயல்பானவை (பைவால்வ்) அல்லது அசல் அல்லாதவை என வகைப்படுத்தப்பட்டன.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e>90%值和同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。மேலும்和> 90% 同源性 的 分类 自身 非 壳类） எடோம் ஸ்லுச்சே பெரெக்ரிவைசியஸ் பைலி சோப்ரானி காக் செட்னியா எஸ் பார்னிமி கோன்சமி மற்றும் கிளாசிக்விஷ்ஸ் சோப்ஸ்ட்வென்னி மோலிஸ்கி) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN மற்றும் 1e-3 மற்றும் விளையாட்டு% 90 இந்த நேர்வில், ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் ரீடுகள், இணைமுனை ரீடுகளாகச் சேகரிக்கப்பட்டு, eBLASTN மற்றும் 1e-3 மதிப்புகள் மற்றும் 90%-க்கும் அதிகமான ஒருபடித்தன்மை வரம்பைப் பயன்படுத்தி, சொந்தமானவை (இருவால்வு உயிரிகள்) அல்லது அசல் அல்லாதவை என வகைப்படுத்தப்பட்டன.A. atra மரபணுத்தொகுதி இன்னும் வரிசைப்படுத்தப்படாததால், நாங்கள் MEGAHIT அடுத்த தலைமுறை வரிசைப்படுத்தல் (NGS) அசெம்ப்ளரின் டி நோவோ அசெம்ப்ளி உத்தியைப் பயன்படுத்தினோம். மொத்தம் 147,188 கான்டிக்கள், தோற்றம் சார்ந்த (இருவால்வு) உயிரினங்களாக அடையாளம் காணப்பட்டன. இந்தக் கான்டிக்கள் பின்னர் BLASTN மற்றும் BLASTX-ஐப் பயன்படுத்தி 1e-10 என்ற e-மதிப்புகளுடன் எக்ஸ்ப்ளோட் செய்யப்பட்டன. இந்த உத்தி, A. atra ccfDNA-வில் உள்ள 482 இருவால்வு அல்லாத துண்டுகளை அடையாளம் காண எங்களுக்கு உதவியது. இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகளில் பாதிக்கும் மேற்பட்டவை (57%), பாக்டீரியாக்களிலிருந்து, முக்கியமாக செவுள் கூட்டுயிரிகள், சல்ஃபோட்ரோபிக் கூட்டுயிரிகள் உட்பட, மற்றும் செவுள் கூட்டுயிரியான சோலெமியா வெலம் (படம் 5) ஆகியவற்றிலிருந்து பெறப்பட்டன.
வகை மட்டத்தில் சார்பு மிகுதி. B இரண்டு முக்கியத் தொகுதிகளின் (ஃபர்மிகியூட்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோபாக்டீரியா) நுண்ணுயிர்ப் பன்முகத்தன்மை. ddPCR-இன் மாதிரிப் பெருக்கம். C விப்ரியோ சிற்றினங்கள். A. மூன்று அட்ரா ஹீமோலிம்ஃப்களில் உள்ள 16S rRNA மரபணுவின் (நீலம்) துண்டுகள்.
சேகரிக்கப்பட்ட மொத்தம் 482 கான்டிக்டுகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. மெட்டாஜீனமிக் கான்டிக் குறிப்புகளின் வகைப்பாட்டுப் பரவலின் பொதுவான விவரக்குறிப்பு (புரோகேரியோட்டுகள் மற்றும் யூகேரியோட்டுகள்). B BLASTN மற்றும் BLASTX மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட பாக்டீரியல் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் விரிவான பரவல்.
Kraken2 பகுப்பாய்வில், மட்டி ccfDNA-வில் ஆர்க்கீயல் டிஎன்ஏ துண்டுகள் இருப்பதும் தெரியவந்தது. இதில் யூரியார்க்கியோட்டா (65%), கிரெனார்க்கியோட்டா (24%), மற்றும் தௌர்மார்ச்சியோட்டா (11%) ஆகியவற்றின் டிஎன்ஏ துண்டுகளும் அடங்கும் (படம் 6a). கலிஃபோர்னிய மட்டிகளின் நுண்ணுயிர் சமூகத்தில் முன்னர் கண்டறியப்பட்ட யூரியார்க்கியோட்டா மற்றும் கிரெனார்க்கியோட்டாவிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பு ஆச்சரியப்படுவதற்கில்லை [42]. யூரியார்க்கியோட்டா பெரும்பாலும் தீவிர நிலைமைகளுடன் தொடர்புடையதாக இருந்தாலும், யூரியார்க்கியோட்டா மற்றும் கிரெனார்ச்சியோட்டா ஆகிய இரண்டும் கடல்சார் கிரையோஜெனிக் சூழலில் மிகவும் பொதுவான புரோகாரியோட்டுகளில் அடங்கும் என்பது இப்போது அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது [43, 44]. கெர்குலன் பீடபூமியில் அடிமட்டக் கசிவுகளிலிருந்து பரவலான மீத்தேன் கசிவுகள் [45] மற்றும் கெர்குலன் தீவுகளின் கடற்கரையில் காணப்பட்ட சாத்தியமான நுண்ணுயிர் மீத்தேன் உற்பத்தி [46] பற்றிய சமீபத்திய அறிக்கைகளைக் கருத்தில் கொண்டால், மட்டிகளில் மீத்தேன் உருவாக்கும் நுண்ணுயிரிகளின் இருப்பு ஆச்சரியப்படுவதற்கில்லை.
பின்னர் எங்கள் கவனம் டி.என்.ஏ வைரஸ்களின் அளவீடுகள் மீது திரும்பியது. எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, மட்டிகளின் வைரஸ் உள்ளடக்கம் குறித்த முதல் இலக்கற்ற ஆய்வு இதுவாகும். எதிர்பார்த்தபடியே, பாக்டீரியோஃபேஜ்களின் (காடோவிரேல்ஸ்) டி.என்.ஏ துண்டுகளை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 6b). இருப்பினும், மிகவும் பொதுவான வைரஸ் டி.என்.ஏ, நியூக்ளியோசைட்டோவைரஸ்களின் ஒரு தொகுதியிலிருந்து வருகிறது; இது நியூக்ளியர் சைட்டோபிளாஸ்மிக் லார்ஜ் டி.என்.ஏ வைரஸ் (NCLDV) என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, மேலும் இது மற்ற எந்த வைரஸையும் விட மிகப்பெரிய மரபணுத்தொகுதியைக் கொண்டுள்ளது. இந்தத் தொகுதிக்குள், பெரும்பாலான டி.என்.ஏ வரிசைகள் மிமிமிடோவிரிடே (58%) மற்றும் பாக்ஸ்விரிடே (21%) குடும்பங்களைச் சேர்ந்தவை, இவற்றின் இயற்கையான புரவலன்களில் முதுகெலும்பிகள் மற்றும் கணுக்காலிகள் அடங்கும். அதே சமயம், இந்த டி.என்.ஏ வரிசைகளின் ஒரு சிறிய பகுதி, அறியப்பட்ட வைரஸ் பாசிகளைச் சேர்ந்தவை. இது கடல்சார் யூகேரியோடிக் பாசிகளைத் தொற்றுகிறது. அறியப்பட்ட எந்த வைரஸ் பேரினத்திலும் மிகப்பெரிய மரபணுத்தொகுதி அளவைக் கொண்ட மாபெரும் வைரஸான பண்டோரா வைரஸிலிருந்தும் இந்த வரிசைகள் பெறப்பட்டன. சுவாரஸ்யமாக, ஹீமோலிம்ப் ccfDNA வரிசைமுறைப்படுத்தல் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டபடி, வைரஸால் பாதிக்கப்பட்டதாக அறியப்பட்ட ஹோஸ்ட்களின் வரம்பு ஒப்பீட்டளவில் பெரியதாக இருந்தது (படம் S3, துணைத் தகவல்). இதில் பேக்குலோவிரிடே மற்றும் இரிடோவிரிடே போன்ற பூச்சிகளைத் தாக்கும் வைரஸ்கள், அத்துடன் அமீபா, பாசிகள் மற்றும் முதுகெலும்பிகளைத் தாக்கும் வைரஸ்களும் அடங்கும். பித்தோவைரஸ் சைபீரிகம் மரபணுவுடன் பொருந்தக்கூடிய வரிசைமுறைகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். பிட்டோவைரஸ்கள் ("ஸோம்பி வைரஸ்கள்" என்றும் அழைக்கப்படுகின்றன) முதன்முதலில் சைபீரியாவில் உள்ள 30,000 ஆண்டுகள் பழமையான நிரந்தர உறைபனியிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டன [47]. இவ்வாறு, இந்த வைரஸ்களின் அனைத்து நவீன இனங்களும் அழிந்துவிடவில்லை [48] மற்றும் இந்த வைரஸ்கள் தொலைதூர துணை ஆர்க்டிக் கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளில் இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டும் முந்தைய அறிக்கைகளுடன் எங்கள் முடிவுகள் ஒத்துப்போகின்றன.
இறுதியாக, மற்ற பலசெல்லுலார் விலங்குகளிலிருந்து டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் கண்டுபிடிக்க முடியுமா என்று சோதித்தோம். nt, nr மற்றும் RefSeq நூலகங்களுடன் (மரபணு மற்றும் புரதம்) BLASTN மற்றும் BLASTX மூலம் மொத்தம் 482 வெளிநாட்டு கான்டிக்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. பலசெல்லுலார் விலங்குகளின் ccfDNA-வின் வெளிநாட்டு துண்டுகளில், எலும்புகளின் டிஎன்ஏ ஆதிக்கம் செலுத்துகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன (படம் 5). பூச்சிகள் மற்றும் பிற இனங்களின் டிஎன்ஏ துண்டுகளும் கண்டறியப்பட்டுள்ளன. டிஎன்ஏ துண்டுகளின் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய பகுதி அடையாளம் காணப்படவில்லை, ஒருவேளை நிலவாழ் இனங்களுடன் ஒப்பிடும்போது மரபணு தரவுத்தளங்களில் அதிக எண்ணிக்கையிலான கடல்வாழ் இனங்கள் குறைவாகப் பிரதிநிதித்துவப்படுத்தப்படுவதால் இருக்கலாம் [49].
தற்போதைய ஆய்வறிக்கையில், நாங்கள் LB கருத்தை மட்டிகளுக்குப் பயன்படுத்துகிறோம். மேலும், ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA ஷாட் சீக்வென்சிங், கடல்சார் கடலோரச் சூழல் அமைப்புகளின் கலவை குறித்த நுண்ணறிவை வழங்க முடியும் என்று வாதிடுகிறோம். குறிப்பாக, நாங்கள் கண்டறிந்தவை: 1) மட்டியின் ஹீமோலிம்ஃபில் ஒப்பீட்டளவில் பெரிய (~1-5 kb) சுழலும் டிஎன்ஏ துண்டுகள் ஒப்பீட்டளவில் அதிக செறிவுகளில் (மைக்ரோகிராம் அளவில்) உள்ளன; 2) இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகள் சார்பற்றவையாகவும் சார்பற்றவை அல்லாதவையாகவும் உள்ளன; 3) இந்த டிஎன்ஏ துண்டுகளின் அயல் மூலங்களில், பாக்டீரியா, ஆர்க்கீயா மற்றும் வைரஸ் டிஎன்ஏ, அத்துடன் பிற பலசெல்லுயிரிகளின் டிஎன்ஏ ஆகியவற்றையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்; 4) ஹீமோலிம்ஃபில் இந்த அயல் ccfDNA துண்டுகளின் குவிப்பு வேகமாக நிகழ்கிறது மற்றும் மட்டிகளின் உள் வடிகட்டுதல் செயல்பாட்டிற்குப் பங்களிக்கிறது. முடிவாக, இதுவரை முக்கியமாக உயிர்மருத்துவத் துறையில் பயன்படுத்தப்பட்டு வந்த LB கருத்து, கண்காணிப்பு உயிரினங்களுக்கும் அவற்றின் சுற்றுச்சூழலுக்கும் இடையிலான தொடர்பை நன்கு புரிந்துகொள்ளப் பயன்படுத்தக்கூடிய, வளமான ஆனால் ஆராயப்படாத அறிவு மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது என்பதை எங்கள் ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
பிரைமேட்டுகள் தவிர, எலிகள், நாய்கள், பூனைகள் மற்றும் குதிரைகள் உள்ளிட்ட பாலூட்டிகளிலும் ccfDNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டதாகப் பதிவாகியுள்ளது [50, 51, 52]. இருப்பினும், எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, திறந்த சுழற்சி அமைப்பைக் கொண்ட கடல்வாழ் உயிரினங்களில் ccfDNA-வைக் கண்டறிந்து வரிசைப்படுத்துவதைப் பதிவுசெய்யும் முதல் ஆய்வு இதுவாகும். மட்டிகளின் இந்த உடற்கூறியல் அம்சம் மற்றும் வடிகட்டும் திறன், மற்ற உயிரினங்களுடன் ஒப்பிடும்போது, சுழற்சியில் உள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளின் வெவ்வேறு அளவு பண்புகளை ஓரளவு விளக்கக்கூடும். மனிதர்களில், இரத்தத்தில் சுழலும் பெரும்பாலான டிஎன்ஏ துண்டுகள் 150 முதல் 200 bp வரையிலான அளவில் சிறிய துண்டுகளாகும், இதன் அதிகபட்ச உச்சம் 167 bp ஆகும் [34, 53]. டிஎன்ஏ துண்டுகளின் ஒரு சிறிய ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க பகுதி 300 முதல் 500 bp அளவுடையது, மற்றும் சுமார் 5% 900 bp-ஐ விட நீளமானவை [54]. இந்த அளவுப் பரவலுக்கான காரணம் என்னவென்றால், பிளாஸ்மாவில் உள்ள ccfDNA-வின் முக்கிய ஆதாரம், ஆரோக்கியமான நபர்களில் சுற்றும் குருதியாக்க செல்களின் செல் இறப்பு அல்லது நசிவு காரணமாகவோ, அல்லது புற்றுநோயாளிகளில் கட்டி செல்களின் அப்போப்டோசிஸ் காரணமாகவோ (சுற்றும் கட்டி டிஎன்ஏ, ctDNA என அழைக்கப்படுகிறது) ஏற்படும் செல் இறப்பின் விளைவாகவே நிகழ்கிறது. மட்டிகளில் நாங்கள் கண்டறிந்த ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-வின் அளவுப் பரவல் 1000 முதல் 5000 bp வரை இருந்தது, இது மட்டி ccfDNA ஒரு வேறுபட்ட மூலத்தைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது. இது ஒரு தர்க்கரீதியான கருதுகோள் ஆகும், ஏனெனில் மட்டிகள் ஒரு பகுதி-திறந்த வாஸ்குலர் அமைப்பைக் கொண்டுள்ளன மற்றும் அதிக செறிவுள்ள நுண்ணுயிர் மரபணு டிஎன்ஏவைக் கொண்ட கடல் நீர் சூழல்களில் வாழ்கின்றன. உண்மையில், புற டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி நாங்கள் செய்த ஆய்வக சோதனைகள், மட்டிகள் கடல்நீரில் டிஎன்ஏ துண்டுகளைக் குவிக்கின்றன என்பதைக் காட்டியுள்ளன; குறைந்தபட்சம் சில மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு, அவை செல்லுலார் உட்கொள்ளலுக்குப் பின் சிதைக்கப்படுகின்றன மற்றும்/அல்லது வெளியிடப்படுகின்றன மற்றும்/அல்லது பல்வேறு அமைப்புகளில் சேமிக்கப்படுகின்றன. புரோகேரியாட்டிக் மற்றும் யூகேரியாட்டிக் ஆகிய இருவகை செல்களின் அரிதான தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு, வால்வுகளுக்குள்ளான அறைகளைப் பயன்படுத்துவது, சுய மூலங்களிலிருந்தும் அயல் மூலங்களிலிருந்தும் வரும் ccfDNA-வின் அளவைக் குறைக்கும். இருவால்வு உயிரினங்களின் உள்ளார்ந்த நோய் எதிர்ப்பு சக்தியின் முக்கியத்துவத்தையும், சுழற்சியில் உள்ள அதிக எண்ணிக்கையிலான விழுங்கு செல்களையும் கருத்தில் கொண்டு, நுண்ணுயிரிகள் மற்றும்/அல்லது செல் சிதைவுகளை உட்கொள்ளும்போது அயல் டிஎன்ஏ-வைச் சேகரிக்கும் சுழற்சி விழுங்கு செல்களில், அயல் ccfDNA கூட செறிவூட்டப்படுகிறது என்று நாங்கள் மேலும் கருதுகோள் கொண்டோம். மொத்தத்தில், இருவால்வு உயிரினங்களின் ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA என்பது மூலக்கூறு தகவல்களின் ஒரு தனித்துவமான களஞ்சியம் என்பதையும், ஒரு கண்காணிப்பு இனமாக அவற்றின் நிலையை இது வலுப்படுத்துகிறது என்பதையும் எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
பாக்டீரியாவிலிருந்து பெறப்பட்ட ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA துண்டுகளின் வரிசைப்படுத்தல் மற்றும் பகுப்பாய்வு, புரவலன் பாக்டீரியல் தாவரங்கள் மற்றும் சுற்றியுள்ள கடல் சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் இருக்கும் பாக்டீரியாக்கள் பற்றிய முக்கிய தகவல்களை வழங்க முடியும் என்பதை எங்கள் தரவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன. ஷாட் வரிசைப்படுத்தல் நுட்பங்கள், வழக்கமான 16S rRNA அடையாள முறைகள் பயன்படுத்தப்பட்டிருந்தால் தவறவிடப்பட்டிருக்கக்கூடிய, கூட்டுவாழ் பாக்டீரியாவான A. atra செவுளின் வரிசைகளை வெளிப்படுத்தியுள்ளன; இதற்கு ஒரு பகுதி காரணம் குறிப்பு நூலக சார்பு ஆகும். உண்மையில், கெர்குலனில் உள்ள அதே மட்டி அடுக்கில் M. platensis-இலிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட LB தரவுகளை நாங்கள் பயன்படுத்தியபோது, செவுளுடன் தொடர்புடைய பாக்டீரியல் கூட்டுவாழ் உயிரினங்களின் கலவை இரண்டு மட்டி இனங்களுக்கும் ஒரே மாதிரியாக இருந்தது (படம் S4, துணைத் தகவல்). மரபணு ரீதியாக வேறுபட்ட இரண்டு மட்டிகளின் இந்த ஒற்றுமை, கெர்குலனின் குளிர், கந்தகம் மற்றும் எரிமலைப் படிவுகளில் உள்ள பாக்டீரியல் சமூகங்களின் கலவையைப் பிரதிபலிக்கக்கூடும் [55, 56, 57, 58]. போர்ட்-ஆ-பிரான்ஸ் கடற்கரை போன்ற, உயிரி-குழப்பம் உள்ள கடலோரப் பகுதிகளில் இருந்து மட்டிகளை அறுவடை செய்யும் போது, கந்தகத்தைக் குறைக்கும் நுண்ணுயிரிகளின் அதிக அளவுகள் நன்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன [59]. மற்றொரு சாத்தியம் என்னவென்றால், மட்டிகளின் கூட்டுவாழ்வுத் தாவரங்கள் கிடைமட்டப் பரவலால் பாதிக்கப்படலாம் [60, 61]. கடல் சூழல், கடலடி மேற்பரப்பு மற்றும் மட்டிகளில் உள்ள கூட்டுவாழ்வு பாக்டீரியாக்களின் கலவை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பைத் தீர்மானிக்க மேலும் ஆராய்ச்சி தேவைப்படுகிறது. இந்த ஆய்வுகள் தற்போது நடைபெற்று வருகின்றன.
கடல் கடலோரச் சூழல் அமைப்புகளில் பல்லுயிர் பெருக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்கு மட்டி ccfDNA-ஐப் பயன்படுத்துவதன் பல நன்மைகளில், ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA-இன் நீளம் மற்றும் செறிவு, அதனை எளிதில் தூய்மைப்படுத்துதல் மற்றும் விரைவான ஷாட்கன் வரிசைப்படுத்தலை அனுமதிக்கும் அதன் உயர் தரம் ஆகியவை அடங்கும். இந்த அணுகுமுறை, ஒரு குறிப்பிட்ட சூழல் அமைப்பில் உள்ள வைரஸ் சமூகங்களை (வைரோம்கள்) வகைப்படுத்துவதற்கு குறிப்பாகப் பயனுள்ளதாக இருக்கிறது [62, 63]. பாக்டீரியா, ஆர்க்கியா மற்றும் யூக்கரியோட்டுகளைப் போலல்லாமல், வைரஸ் மரபணுக்களில் 16S வரிசைமுறைகள் போன்ற இனவகை மரபுரீதியாகப் பாதுகாக்கப்பட்ட மரபணுக்கள் இல்லை. கடலோரக் கடல் சூழல் அமைப்புகளில் பொதுவாக வாழும் ஓம்புயிர்களைத் தொற்றக்கூடியதாக அறியப்பட்ட ccfDNA வைரஸ் துண்டுகளை, ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையில் அடையாளம் காண, மட்டிகள் போன்ற குறிகாட்டி இனங்களிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட திரவ பயாப்ஸிகளைப் பயன்படுத்தலாம் என்று எங்கள் முடிவுகள் குறிப்பிடுகின்றன. இதில் புரோட்டோசோவா, கணுக்காலிகள், பூச்சிகள், தாவரங்கள் மற்றும் பாக்டீரியா வைரஸ்களை (எ.கா., பாக்டீரியோஃபேஜ்கள்) தொற்றக்கூடியதாக அறியப்பட்ட வைரஸ்கள் அடங்கும். கெர்குலனில் உள்ள அதே மட்டி அடுக்கில் சேகரிக்கப்பட்ட நீல மட்டிகளின் (M. platensis) ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA வைரோம்களை நாங்கள் ஆய்வு செய்தபோது இதேபோன்ற பரவல் காணப்பட்டது (அட்டவணை S2, துணைத் தகவல்). ccfDNA-வின் ஷாட்கன் வரிசைமுறைப்படுத்தல் என்பது உண்மையில் மனிதர்கள் அல்லது பிற உயிரினங்களின் வைரோம்களைப் பற்றிய ஆய்வில் வேகம் பெற்றுவரும் ஒரு புதிய அணுகுமுறையாகும் [21, 37, 64]. இந்த அணுகுமுறை இரட்டைச் சரம் கொண்ட டிஎன்ஏ வைரஸ்களைப் படிப்பதற்கு குறிப்பாகப் பயனுள்ளதாக இருக்கிறது, ஏனெனில் அனைத்து இரட்டைச் சரம் கொண்ட டிஎன்ஏ வைரஸ்களிலும் ஒரே ஒரு மரபணு பாதுகாக்கப்படவில்லை, இது பால்டிமோரில் உள்ள வைரஸ்களின் மிகவும் மாறுபட்ட மற்றும் பரந்த வகையைக் குறிக்கிறது [65]. இந்த வைரஸ்களில் பெரும்பாலானவை வகைப்படுத்தப்படாமல் இருந்தாலும், வைரஸ் உலகின் முற்றிலும் அறியப்படாத பகுதியிலிருந்து வரும் வைரஸ்களை உள்ளடக்கியிருக்கலாம் [66], A. atra மற்றும் M. platensis மட்டிகளின் வைரோம்களும் ஓம்புயிரி வரம்புகளும் இரண்டு இனங்களுக்கும் இடையில் ஒரே மாதிரியாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் S3, கூடுதல் தகவலைப் பார்க்கவும்). இந்த ஒற்றுமை ஆச்சரியப்படுவதற்கில்லை, ஏனெனில் இது சுற்றுச்சூழலில் உள்ள டிஎன்ஏ-வை உட்கொள்வதில் தேர்ந்தெடுப்பு இல்லாததைக் காட்டக்கூடும். ஆர்.என்.ஏ வைரஸ் தொகுப்பின் தன்மைகளை வரையறுப்பதற்கு, தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட ஆர்.என்.ஏ-வைப் பயன்படுத்தும் எதிர்கால ஆய்வுகள் தற்போது தேவைப்படுகின்றன.
எங்கள் ஆய்வில், கோவார்ஸ்கி மற்றும் சக ஊழியர்களின் [37] பணியிலிருந்து தழுவப்பட்ட மிகவும் கடுமையான வழிமுறையை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம், அவர்கள் நேட்டிவ் ccfDNA அசெம்பிளிக்கு முன்னும் பின்னும் பூல்டு ரீட்ஸ் மற்றும் கான்டிக்சின் இரண்டு-படி நீக்கத்தைப் பயன்படுத்தினர், இதன் விளைவாக அதிக விகிதத்தில் மேப் செய்யப்படாத ரீட்ஸ் கிடைத்தன. எனவே, இந்த மேப் செய்யப்படாத ரீட்ஸ்களில் சில இன்னும் அவற்றின் சொந்த மூலத்தைக் கொண்டிருக்கலாம் என்பதை நாங்கள் நிராகரிக்க முடியாது, முக்கியமாக இந்த மஸ்ஸல் இனத்திற்கு எங்களிடம் ஒரு குறிப்பு மரபணு இல்லை. சுய மற்றும் சுயமற்ற ரீட்ஸ்களுக்கு இடையிலான கைமிராக்கள் மற்றும் இல்லுமினா MiSeq PE75 ஆல் உருவாக்கப்பட்ட ரீட் நீளங்கள் குறித்து நாங்கள் கவலைப்பட்டதாலும் இந்த வழிமுறையைப் பயன்படுத்தினோம். பெரும்பாலான ரீடிங்ஸ் விளக்கப்படாமல் இருப்பதற்கான மற்றொரு காரணம், பெரும்பாலான கடல் நுண்ணுயிரிகள், குறிப்பாக கெர்குலன் போன்ற தொலைதூரப் பகுதிகளில், குறிக்கப்படவில்லை. மனித ccfDNA போன்ற ccfDNA துண்டு நீளங்களைக் கருதி, நாங்கள் இல்லுமினா MiSeq PE75 ஐப் பயன்படுத்தினோம். மனிதர்கள் மற்றும்/அல்லது பாலூட்டிகளை விட ஹீமோலிம்ஃப் ccfDNA நீண்ட வாசிப்புகளைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டும் எங்கள் முடிவுகளைக் கருத்தில் கொண்டு, எதிர்கால ஆய்வுகளுக்கு, நீண்ட ccfDNA துண்டுகளுக்கு மிகவும் பொருத்தமான ஒரு வரிசைப்படுத்தல் தளத்தைப் பயன்படுத்த நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம். இந்த நடைமுறை, ஆழமான பகுப்பாய்விற்கான கூடுதல் அறிகுறிகளைக் கண்டறிவதை மிகவும் எளிதாக்கும். தற்போது கிடைக்காத முழுமையான A. atra உட்கரு மரபணு வரிசையைப் பெறுவது, சுய மற்றும் அயல் மூலங்களிலிருந்து வரும் ccfDNA-வை வேறுபடுத்துவதையும் பெரிதும் எளிதாக்கும். எங்கள் ஆராய்ச்சி, திரவ பயாப்ஸி என்ற கருத்தை மட்டிகளுக்குப் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளில் கவனம் செலுத்தியுள்ளதால், எதிர்கால ஆராய்ச்சியில் இந்தக் கருத்து பயன்படுத்தப்படும்போது, மட்டிகளின் நுண்ணுயிர்ப் பன்முகத்தன்மையை ஆய்வு செய்வதற்கான இந்த முறையின் திறனை அதிகரிக்க புதிய கருவிகளும் வழிமுறைகளும் உருவாக்கப்படும் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.
ஒரு ஊடுருவாத மருத்துவ உயிர் அடையாளமாக, மனித பிளாஸ்மாவில் ccfDNA-வின் உயர்ந்த அளவுகள் பல்வேறு நோய்கள், திசு சேதம் மற்றும் மன அழுத்த நிலைகளுடன் தொடர்புடையவை [67,68,69]. இந்த அதிகரிப்பு, திசு சேதத்திற்குப் பிறகு அதன் சொந்த மூலத்தின் டிஎன்ஏ துண்டுகள் வெளியிடப்படுவதோடு தொடர்புடையது. கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்தைப் பயன்படுத்தி இந்த சிக்கலை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம், இதில் மட்டிகள் சுருக்கமாக 30 °C வெப்பநிலைக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. மூன்று தனித்தனி சோதனைகளில் மூன்று வெவ்வேறு வகையான மட்டிகளில் இந்த பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம். இருப்பினும், கடுமையான வெப்ப அழுத்தத்திற்குப் பிறகு ccfDNA அளவுகளில் எந்த மாற்றத்தையும் நாங்கள் காணவில்லை (கூடுதல் தகவலுக்கு படம் S5-ஐப் பார்க்கவும்). இந்த கண்டுபிடிப்பு, மட்டிகள் ஒரு பகுதி-திறந்த சுற்றோட்ட அமைப்பைக் கொண்டிருப்பதையும், அவற்றின் அதிக வடிகட்டும் செயல்பாட்டின் காரணமாக அதிக அளவு வெளிநாட்டு டிஎன்ஏ-வை குவிப்பதையும் ஓரளவு விளக்கக்கூடும். மறுபுறம், பல முதுகெலும்பற்ற உயிரினங்களைப் போலவே, மட்டிகளும் மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட திசு சேதத்திற்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டவையாக இருக்கலாம், இதனால் அவற்றின் ஹீமோலிம்பில் ccfDNA வெளியீட்டைக் கட்டுப்படுத்துகின்றன [70, 71].
இன்றுவரை, நீர்வாழ் சூழல் அமைப்புகளில் உள்ள பல்லுயிர் பெருக்கத்தின் டிஎன்ஏ பகுப்பாய்வு முக்கியமாக சுற்றுச்சூழல் டிஎன்ஏ (eDNA) மெட்டாபார்கோடிங்கில் கவனம் செலுத்தி வருகிறது. இருப்பினும், பிரைமர்கள் பயன்படுத்தப்படும்போது பல்லுயிர் பெருக்கப் பகுப்பாய்வில் இந்த முறை பொதுவாக வரம்புக்குட்பட்டதாக உள்ளது. ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் முறையானது, பிசிஆரின் வரம்புகளையும் பிரைமர் தொகுப்புகளின் ஒருதலைப்பட்சமான தேர்வையும் தவிர்க்கிறது. எனவே, ஒரு வகையில், நமது முறையானது சமீபத்தில் பயன்படுத்தப்பட்ட உயர்-செயல்திறன் கொண்ட eDNA ஷாட்கன் சீக்வென்சிங் முறைக்கு நெருக்கமாக உள்ளது. இந்த முறை துண்டாக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவை நேரடியாக வரிசைப்படுத்தி, கிட்டத்தட்ட அனைத்து உயிரினங்களையும் பகுப்பாய்வு செய்யக்கூடியது [72, 73]. இருப்பினும், நிலையான eDNA முறைகளிலிருந்து LB-ஐ வேறுபடுத்தும் பல அடிப்படை சிக்கல்கள் உள்ளன. நிச்சயமாக, eDNA மற்றும் LB-க்கு இடையிலான முக்கிய வேறுபாடு இயற்கை வடிகட்டி ஹோஸ்ட்களின் பயன்பாடு ஆகும். கடற்பஞ்சுகள் மற்றும் இருவால்வு உயிரினங்கள் (Dresseina spp.) போன்ற கடல்வாழ் உயிரினங்களை eDNA-வை ஆய்வு செய்வதற்கான இயற்கை வடிகட்டியாகப் பயன்படுத்துவது குறித்து அறிக்கை செய்யப்பட்டுள்ளது [74, 75]. இருப்பினும், டிரெய்செனாவின் ஆய்வில், டிஎன்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்ட திசு பயாப்ஸிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. LB-யிலிருந்து ccfDNA-வை பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு, eDNA அல்லது திசு பயாப்ஸியுடன் தொடர்புடைய திசு பயாப்ஸி, சிறப்பு வாய்ந்த மற்றும் சில நேரங்களில் விலையுயர்ந்த உபகரணங்கள் மற்றும் தளவாடங்கள் தேவையில்லை. உண்மையில், தொலைதூரப் பகுதிகளில் ஆராய்ச்சிக்கு ஒரு பெரிய சவாலாக இருக்கும் குளிர் சங்கிலியைப் பராமரிக்காமல், FTA ஆதரவுடன் LB-யிலிருந்து ccfDNA-வை சேமித்து பகுப்பாய்வு செய்ய முடியும் என்று நாங்கள் சமீபத்தில் தெரிவித்தோம் [76]. திரவ பயாப்ஸிகளிலிருந்து ccfDNA-வைப் பிரித்தெடுப்பதும் எளிமையானது மற்றும் ஷாட்கன் வரிசைமுறை மற்றும் PCR பகுப்பாய்விற்கு உயர்தர DNA-வை வழங்குகிறது. eDNA பகுப்பாய்வுடன் தொடர்புடைய சில தொழில்நுட்ப வரம்புகளைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது இது ஒரு பெரிய நன்மையாகும் [77]. மாதிரி எடுக்கும் முறையின் எளிமை மற்றும் குறைந்த செலவு ஆகியவை நீண்ட கால கண்காணிப்பு திட்டங்களுக்கும் குறிப்பாகப் பொருத்தமானவை. அவற்றின் அதிக வடிகட்டும் திறனுக்கு கூடுதலாக, இருவால்வு உயிரினங்களின் மற்றொரு நன்கு அறியப்பட்ட அம்சம் அவற்றின் சளியின் வேதியியல் மியூகோபாலிசாக்கரைடு கலவையாகும், இது வைரஸ்களை உறிஞ்சுவதை ஊக்குவிக்கிறது [78, 79]. இது ஒரு குறிப்பிட்ட நீர்வாழ் சூழல் அமைப்பில் பல்லுயிர் மற்றும் காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கத்தை வகைப்படுத்துவதற்கு இருவால்வு உயிரினங்களை ஒரு சிறந்த இயற்கை வடிகட்டியாக ஆக்குகிறது. eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது, புரவலரிடமிருந்து பெறப்பட்ட DNA துண்டுகளின் இருப்பு இந்த முறையின் ஒரு வரம்பாகக் கருதப்பட்டாலும், சுகாதார ஆய்வுகளுக்குக் கிடைக்கும் பரந்த அளவிலான தகவல்களைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, eDNA உடன் ஒப்பிடும்போது அத்தகைய இயல்பான ccfDNA ஐப் பெறுவதற்கான செலவும் அதே நேரத்தில் புரிந்துகொள்ளக்கூடியதாகவே உள்ளது. இதில் புரவலரின் மரபணுவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட வைரஸ் வரிசைகளின் இருப்பும் அடங்கும். இருவால்வு உயிரினங்களில் கிடைமட்டமாகப் பரவும் லுகேமிக் ரெட்ரோவைரஸ்கள் இருப்பதால், இது குறிப்பாக மட்டிகளுக்கு மிகவும் முக்கியமானது [80, 81]. eDNA ஐ விட LB இன் மற்றொரு நன்மை என்னவென்றால், அது ஹீமோலிம்பில் உள்ள சுழலும் இரத்த செல்களின் விழுங்கும் செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்துகிறது, இது நுண்ணுயிரிகளை (மற்றும் அவற்றின் மரபணுக்களை) விழுங்குகிறது. விழுங்குதல் என்பது இருவால்வு உயிரினங்களில் இரத்த செல்களின் முக்கிய செயல்பாடாகும் [82]. இறுதியாக, இந்த முறை மட்டிகளின் அதிக வடிகட்டும் திறன் (சராசரியாக 1.5 லி/மணி கடல்நீர்) மற்றும் இரண்டு நாள் சுழற்சியைப் பயன்படுத்துகிறது, இது கடல்நீரின் வெவ்வேறு அடுக்குகளின் கலவையை அதிகரித்து, மாறுபட்ட eDNA ஐப் பிடிக்க அனுமதிக்கிறது. [83, 84]. எனவே, மட்டிகளின் ஊட்டச்சத்து, பொருளாதாரம் மற்றும் சுற்றுச்சூழல் தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொண்டு, மட்டி ccfDNA பகுப்பாய்வு ஒரு சுவாரஸ்யமான வழியாகும். மனிதர்களிடமிருந்து சேகரிக்கப்பட்ட LB-யின் பகுப்பாய்வைப் போலவே, இந்த முறையும் புறப் பொருட்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக ஹோஸ்ட் டிஎன்ஏவில் ஏற்படும் மரபணு மற்றும் எபிஜெனெடிக் மாற்றங்களை அளவிடுவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளைத் திறக்கிறது. எடுத்துக்காட்டாக, நானோபோர் வரிசைப்படுத்தலைப் பயன்படுத்தி, இயற்கையான ccfDNA-வில் மரபணு முழுவதுமான மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வைச் செய்ய மூன்றாம் தலைமுறை வரிசைப்படுத்தல் தொழில்நுட்பங்களைக் கருத்தில் கொள்ளலாம். மட்டி ccfDNA துண்டுகளின் நீளம், இரசாயன மாற்றங்கள் தேவையின்றி ஒரே வரிசைப்படுத்தல் ஓட்டத்தில் மரபணு முழுவதுமான டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வை அனுமதிக்கும் லாங்-ரீட் வரிசைப்படுத்தல் தளங்களுடன் மிகச்சரியாகப் பொருந்துவதால், இந்த செயல்முறை எளிதாக்கப்பட வேண்டும்.85,86] இது ஒரு சுவாரஸ்யமான சாத்தியமாகும், ஏனெனில் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் வடிவங்கள் சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கான பதிலைப் பிரதிபலிப்பதாகவும், பல தலைமுறைகளாக நீடிப்பதாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது. எனவே, காலநிலை மாற்றம் அல்லது மாசுபடுத்திகளுக்கு ஆட்பட்ட பிறகு பதிலைக் கட்டுப்படுத்தும் அடிப்படை வழிமுறைகள் குறித்த மதிப்புமிக்க நுண்ணறிவை இது வழங்க முடியும் [87]. இருப்பினும், LB-யின் பயன்பாடு வரம்புகள் இல்லாமல் இல்லை. சொல்லத் தேவையில்லை, இதற்கு சுற்றுச்சூழல் அமைப்பில் குறிகாட்டி இனங்கள் இருப்பது அவசியம். மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி, ஒரு குறிப்பிட்ட சுற்றுச்சூழல் அமைப்பின் பல்லுயிர் பெருக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்கு LB-ஐப் பயன்படுத்துவதற்கு, மூலத்திலிருந்து வரும் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் இருப்பைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளும் ஒரு கடுமையான பயோஇன்ஃபர்மேடிக்ஸ் பைப்லைன் தேவைப்படுகிறது. மற்றொரு முக்கிய பிரச்சனை கடல்வாழ் உயிரினங்களுக்கான குறிப்பு மரபணுக்களின் கிடைக்கும் தன்மை ஆகும். கடல் பாலூட்டி மரபணுக்கள் திட்டம் மற்றும் சமீபத்தில் நிறுவப்பட்ட Fish10k திட்டம் [88] போன்ற முயற்சிகள் எதிர்காலத்தில் இத்தகைய பகுப்பாய்வை எளிதாக்கும் என்று நம்பப்படுகிறது. கடல் வடிகட்டி-உணவு உயிரினங்களுக்கு LB கருத்தைப் பயன்படுத்துவது, வரிசைப்படுத்தல் தொழில்நுட்பத்தில் உள்ள சமீபத்திய முன்னேற்றங்களுடன் இணக்கமாக உள்ளது, இது சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கு பதிலளிக்கும் வகையில் கடல் வாழ்விடங்களின் ஆரோக்கியம் பற்றிய முக்கியமான தகவல்களை வழங்க மல்டி-ஓம் பயோமார்க்கர்களை உருவாக்குவதற்கு மிகவும் பொருத்தமானதாக அமைகிறது.
மரபணு வரிசைப்படுத்தல் தரவு, NCBI வரிசைமுறை வாசிப்பு காப்பகத்தில் (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) SRR8924808 என்ற உயிரியல் திட்டத்தின் கீழ் சமர்ப்பிக்கப்பட்டுள்ளது.
பிரியர்லி ஏ.எஸ்., கிங்ஸ்ஃபோர்ட் எம்.ஜே. கடல்வாழ் உயிரினங்கள் மற்றும் சூழல் அமைப்புகள் மீதான காலநிலை மாற்றத்தின் தாக்கம். கோல் பயாலஜி. 2009; 19: பக்.602–பக்.614.
கிஸ்ஸி இ, மனேயா இ, மஸாரிஸ் ஏடி, ஃபிராஷெட்டி எஸ், அல்ம்பனிடூ வி, பெவிலாக்வா எஸ், மற்றும் பலர். கடல்சார் சூழலில் காலநிலை மாற்றம் மற்றும் பிற உள்ளூர் அழுத்தங்களின் ஒருங்கிணைந்த தாக்கங்களைக் கருத்தில் கொள்க. பொது அறிவியல் சூழல். 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, மற்றும் பலர். ) மார்ச் முதல் அறிவியல். 2020;7:48.
செரோன்ட் எல், நிகாஸ்ட்ரோ சிஆர், சார்டி ஜிஐ, கோபர்வில் இ. தொடர்ச்சியான வெப்ப அழுத்தச் சூழ்நிலைகளில் குறைக்கப்பட்ட வெப்ப சகிப்புத்தன்மை, நீல மட்டிகளின் அதிக கோடைக்கால இறப்பை விளக்குகிறது. அறிவியல் அறிக்கை 2019; 9:17498.
ஃபே எஸ்.பி., சீபியல்ஸ்கி ஏ.எம்., நஸ்லே எஸ்., செர்வாண்டஸ்-யோஷிடா கே., ஹ்வான் ஜே.எல்., ஹூபர் இ.ஆர்., மற்றும் பலர். விலங்கு இறப்புகளின் நிகழ்வெண், காரணங்கள் மற்றும் அளவில் சமீபத்திய மாற்றங்கள். ப்ரோக் நேஷனல் அகாட் சயின்ஸ் யுஎஸ்ஏ. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, மற்றும் பலர். பல இனங்கள் அல்லாத குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமிகள் பின்னா நோபிலிஸின் வெகுஜன இறப்பை ஏற்படுத்தியிருக்கலாம். வாழ்க்கை. 2020;10:238.
பிராட்லி எம், கௌட்ஸ் எஸ்ஜே, ஜென்கின்ஸ் இ, ஓ'ஹாரா டிஎம். ஆர்க்டிக் விலங்குவழி நோய்கள் மீது காலநிலை மாற்றத்தின் சாத்தியமான தாக்கம். சர்வதேச துருவப்பகுதி சுகாதார இதழ். 2005; 64:468–77.
பேயர் ஜே., கிரீன் என்.டபிள்யூ., புரூக்ஸ் எஸ்., ஆலன் ஐ.ஜே., ரூஸ் ஏ., கோமஸ் டி. மற்றும் பலர். கடலோர மாசுபாடு கண்காணிப்பில் சமிக்ஞை உயிரினங்களாக நீல மட்டிகள் (மைட்டிலஸ் எடுலிஸ் இனங்கள்): ஒரு ஆய்வு. மரைன் என்விரான்மென்டல் ரிசர்ச் 2017; 130:338-65.
சிராவெக்னா ஜி, மார்சோனி எஸ், சியனா எஸ், பர்டெல்லி ஏ. புற்றுநோய் சிகிச்சையில் திரவ பயாப்ஸியின் ஒருங்கிணைப்பு. நேச்சர் ரிவியூஸ் கிளீன் ஆன்காலஜி. 2017; 14:531–48.
வான் ஜே.சி.எம், மாஸ்ஸி சி, கார்சியா-கார்பாச்சோ ஜே, மௌலியர் எஃப், பிரென்டன் ஜே.டி, கால்டாஸ் சி, மற்றும் பலர். திரவ பயாப்ஸி முதிர்ச்சி: கட்டி டி.என்.ஏ-வை சுழற்சி செய்ய அனுமதிக்கிறது. நேச்சர் ரிவியூஸ் கேன்சர். 2017;17:223–38.
மண்டேல் பி., மெட்டாய்ஸ் பி. மனித பிளாஸ்மாவில் உள்ள நியூக்ளிக் அமிலங்கள். உயிரியல் சங்க துணை நிறுவனங்களின் கூட்டக் குறிப்புகள். 1948; 142:241-3.
ப்ரோன்கோர்ஸ்ட் ஏஜே, உங்கேரர் டபிள்யூ, ஹோல்டன்ரைடர் எஸ். புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான மூலக்கூறு குறிப்பானாக செல்-சாரா டிஎன்ஏ-வின் ஒரு புதிய பங்கு. பயோமோலார் பகுப்பாய்வின் அளவு நிர்ணயம். 2019;17:100087.
இக்னாடியாடிஸ் எம்., ஸ்லெட்ஜ் ஜி.டபிள்யூ., ஜெஃப்ரி எஸ்.எஸ். திரவ பயாப்ஸி மருத்துவப் பயன்பாட்டிற்கு வருகிறது – செயல்படுத்தல் சிக்கல்களும் எதிர்கால சவால்களும். நேச்சர் ரிவியூஸ் கிளினிக்கல் ஆன்காலஜி. 2021; 18:297–312.
லோ ஒய்.எம்., கார்பெட்டா என்., சேம்பர்லைன் பி.எஃப்., ராய் டபிள்யூ., சார்ஜென்ட் ஐ.எல்., ரெட்மேன் சி.டபிள்யூ. மற்றும் பலர். தாயின் பிளாஸ்மா மற்றும் சீரத்தில் கருவின் டி.என்.ஏ. உள்ளது. லான்செட். 1997; 350:485-7.
முஃபர்ரே எம்.என், வோங் ஆர்.ஜே, ஷா ஜி.எம், ஸ்டீவன்சன் டி.கே, குவேக் எஸ்.ஆர். கர்ப்ப காலத்தில் பெண்களின் இரத்தத்தில் சுழலும் புற உயிரணு ஆர்.என்.ஏ-வைப் பயன்படுத்தி கர்ப்பத்தின் போக்கையும் அதன் சிக்கல்களையும் பற்றிய ஆய்வு. டோபீடியாட்ரிக்ஸ். 2020;8:605219.
ஓலரிச் எம், ஷெர்வுட் கே, கியோன் பி, ஷுட்ஸ் இ, பெக் ஜே, ஸ்டெக்பாயர் ஜே, மற்றும் பலர். திரவ பயாப்ஸி: சிறுநீரக மாற்று அறுவை சிகிச்சையில் பிறர் உறுப்பு பாதிப்புகளைக் கண்டறிய கொடையாளியின் செல்-சாரா டி.என்.ஏ பயன்படுத்தப்படுகிறது. நேச்சர் ரிவியூஸ் நெஃப்ராலஜி. 2021; 17:591–603.
ஜுவான் எஃப்.சி., லோ ஒய்.எம். மகப்பேறுக்கு முந்தைய நோயறிதலில் புதுமைகள்: தாய்வழி பிளாஸ்மா மரபணு வரிசைப்படுத்தல். அன்னா எம்.டி. 2016;67:419-32.
கு டபிள்யூ, டெங் எக்ஸ், லீ எம், சுகு ஒய்.டி, அரேவலோ எஸ், ஸ்ட்ரைக் டி, மற்றும் பலர். பாதிக்கப்பட்ட உடல் திரவங்களின் அடுத்த தலைமுறை மெட்டாஜெனாமிக் வரிசைமுறை மூலம் நோய்க்கிருமிகளை விரைவாகக் கண்டறிதல். நேச்சர் மெடிசின். 2021;27:115-24.
பதிவிட்ட நேரம்: ஆகஸ்ட் 14, 2022
