Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд бид сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр үзүүлэх болно.
Шингэн биопси (ШБ) нь биоанагаахын салбарт хурдацтай түгээмэл болж буй ойлголт юм. Энэхүү ойлголт нь голчлон эсийн гаднах ДНХ-ийн (ccfDNA) хэлтэрхийг илрүүлэхэд суурилдаг бөгөөд эдгээр нь янз бүрийн эд эсэд эсийн үхлийн дараа голчлон жижиг хэлтэрхий хэлбэрээр ялгардаг. Эдгээр хэлтэрхийнүүдийн багахан хэсэг нь гадны (гадаад) эд эс эсвэл организмаас гаралтай. Одоогийн ажилд бид энэ ойлголтыг далайн усны өндөр шүүлтүүрийн чадвараараа алдартай харуулын төрөл зүйл болох хясаанд хэрэглэсэн. Бид хясааг байгалийн шүүлтүүр болгон ашиглах чадварыг ашиглан далайн эргийн экосистемийн биологийн олон янз байдлын талаарх мэдээллийг янз бүрийн эх сурвалжаас хүрээлэн буй орчны ДНХ-ийн хэлтэрхийг барьж авдаг. Бидний үр дүнгээс харахад хясааны гемолимф нь 1-5 кб хэмжээтэй ДНХ-ийн хэлтэрхий агуулдаг. Бууны дарааллын судалгаагаар олон тооны ДНХ-ийн хэлтэрхий нь гадны бичил биетний гаралтай болохыг харуулсан. Тэдгээрийн дотроос бид бактери, архей, вирусын ДНХ-ийн хэлтэрхий, түүний дотор эргийн далайн экосистемд түгээмэл тохиолддог янз бүрийн эзэн биетийг халдварладаг вирусыг олжээ. Эцэст нь хэлэхэд, бидний судалгаагаар хясаанд хэрэглэсэн LB ойлголт нь далайн эргийн экосистем дэх бичил биетний олон янз байдлын талаарх баялаг боловч хараахан судлагдаагүй мэдлэгийн эх сурвалж болохыг харуулж байна.
Уур амьсгалын өөрчлөлт (УӨ) нь далайн экосистемийн биологийн олон янз байдалд үзүүлэх нөлөөлөл нь судалгааны хурдацтай хөгжиж буй чиглэл юм. Дэлхийн дулаарал нь зөвхөн чухал физиологийн стрессийг үүсгэдэг төдийгүй далайн организмын дулааны тогтвортой байдлын хувьслын хязгаарыг нэмэгдүүлж, хэд хэдэн зүйлийн амьдрах орчинд нөлөөлж, тэднийг илүү таатай нөхцөл хайхад хүргэдэг [1, 2]. Метазоагийн биологийн олон янз байдалд нөлөөлөхөөс гадна УӨ нь эзэн ба бичил биетний харилцан үйлчлэлийн нарийн тэнцвэрийг алдагдуулдаг. Энэхүү бичил биетний дисбактериоз нь далайн организмыг халдварт эмгэг төрүүлэгчдэд илүү өртөмтгий болгодог тул далайн экосистемд ноцтой аюул учруулж байна [3, 4]. УӨ нь олон нийтийн үхэлд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж үздэг бөгөөд энэ нь дэлхийн далайн экосистемийг удирдахад ноцтой асуудал юм [5, 6]. Энэ нь олон далайн зүйлийн эдийн засаг, экологи, хоол тэжээлийн нөлөөллийг харгалзан үзвэл чухал асуудал юм. Энэ нь ялангуяа туйлын бүс нутагт амьдардаг хоёр хавтаст нянгийн хувьд үнэн бөгөөд тэнд УӨ-ийн нөлөө илүү хурдан бөгөөд ноцтой байдаг [6, 7]. Үнэндээ Mytilus spp. зэрэг хоёр хавтаст нянгуудыг УӨ-ийн далайн экосистемд үзүүлэх нөлөөллийг хянахын тулд өргөн ашигладаг. Тэдний эрүүл мэндийг хянахын тулд харьцангуй олон тооны биомаркеруудыг боловсруулсан нь гайхмаар зүйл биш бөгөөд ихэвчлэн ферментийн идэвхжил эсвэл эсийн амьдрах чадвар, фагоцитын идэвхжил зэрэг эсийн үйл ажиллагаанд суурилсан функциональ биомаркеруудыг хамарсан хоёр түвшний аргыг ашигладаг [8]. Эдгээр аргуудад их хэмжээний далайн усыг шингээсний дараа зөөлөн эдэд хуримтлагддаг тодорхой даралтын индикаторуудын концентрацийг хэмжих арга багтдаг. Гэсэн хэдий ч хоёр хавтаст нялцгай биетний өндөр шүүлтүүрийн багтаамж болон хагас задгай цусны эргэлтийн систем нь өвчтөний менежментийн энгийн бөгөөд хамгийн бага инвазив арга болох шингэн биопси (ШБ) гэсэн ойлголтыг ашиглан шинэ гемолимфийн биомаркеруудыг боловсруулах боломжийг олгодог. цусны дээж [9, 10]. Хүний ШБ-д хэд хэдэн төрлийн эргэлтийн молекулууд байдаг ч энэ ойлголт нь голчлон сийвэн дэх эргэлтийн эсийн гаднах ДНХ (ccfDNA) хэлтэрхийнүүдийн ДНХ-ийн дарааллын шинжилгээнд суурилдаг. Үнэндээ хүний ​​сийвэн дэх эргэлтийн ДНХ байгаа нь 20-р зууны дунд үеэс хойш мэдэгдэж байсан [11], гэхдээ сүүлийн жилүүдэд л өндөр хүчин чадалтай дарааллын аргууд гарч ирснээр ccfDNA дээр суурилсан клиник оношлогоо хийх боломжтой болсон. Эдгээр эргэлдэж буй ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа нь эсийн үхлийн дараа геномын ДНХ (цөмийн болон митохондрийн) идэвхгүй ялгаралттай холбоотой юм. Эрүүл хүмүүст ccfДНХ-ийн концентраци хэвийн үед бага байдаг (<10 нг/мл) боловч янз бүрийн эмгэгтэй эсвэл стресст өртсөн өвчтөнүүдэд 5-10 дахин нэмэгдэж, улмаар эд эсийн гэмтэлд хүргэдэг. Эрүүл хүмүүст ccfДНХ-ийн концентраци хэвийн үед бага байдаг (<10 нг/мл) боловч янз бүрийн эмгэгтэй эсвэл стресст өртсөн өвчтөнүүдэд 5-10 дахин нэмэгдэж, улмаар эд эсийн гэмтэлд хүргэдэг. У здоровых хүмүүсийн төвлөрсөн вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), гэхдээ 5-10 размераас 5-10 дахин их хэмжээний эмгэг, стресст өртөх магадлалтай. Эрүүл хүмүүст cccДНХ-ийн концентраци хэвийн үед бага байдаг (<10 нг/мл), гэхдээ янз бүрийн эмгэгтэй эсвэл эдийн гэмтэлд хүргэдэг стрессийн үед 5-10 дахин нэмэгдэж болно.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致绤综统在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戏 戗 戗中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 椟伍损伤Концентрации ccfDNA нь хүмүүст маш бага (<10 нг/мл) байдаг ч өвчтөнд 5-10 размерийн өвчин тусах эсвэл стресст өртөхөд хүргэдэг. Эрүүл хүмүүст ccfДНХ-ийн концентраци ихэвчлэн бага байдаг (<10 нг/мл) боловч янз бүрийн эмгэг эсвэл стресстэй өвчтөнүүдэд 5-10 дахин нэмэгдэж, эд эсийн гэмтэлд хүргэдэг.ccfDNA хэлтэрхийнүүдийн хэмжээ харилцан адилгүй байдаг ч ихэвчлэн 150-200 б.п. хооронд хэлбэлздэг. [12]. Өөрөө гаргаж авсан ccfDNA, өөрөөр хэлбэл хэвийн эсвэл хувиргасан эзэн эсээс гаргаж авсан ccfDNA-ийн шинжилгээг цөмийн болон/эсвэл митохондрийн геномд байдаг генетикийн болон эпигенетикийн өөрчлөлтийг илрүүлэхэд ашиглаж болох бөгөөд ингэснээр эмч нарт молекулын чиглэсэн тодорхой эмчилгээг сонгоход тусалдаг [13]. Гэсэн хэдий ч ccfDNA-г жирэмсний үед ургийн эсээс эсвэл шилжүүлэн суулгасан эрхтнээс авсан ccfDNA зэрэг гадны эх үүсвэрээс авах боломжтой [14,15,16,17]. ccfDNA нь халдварт бодисын (гадны) нуклейн хүчлийн илрэлийг илрүүлэх мэдээллийн чухал эх сурвалж бөгөөд энэ нь цусны өсгөврөөр тодорхойлогдоогүй өргөн тархсан халдварыг инвазив бус аргаар илрүүлэх, халдвар авсан эдийн инвазив биопси хийхээс зайлсхийх боломжийг олгодог [18]. Сүүлийн үеийн судалгаагаар хүний ​​цус нь вирус, бактерийн эмгэг төрүүлэгчдийг тодорхойлоход ашиглаж болох мэдээллийн баялаг эх үүсвэр агуулдаг бөгөөд хүний ​​сийвэнд байдаг ccfDNA-ийн 1% орчим нь гадны гаралтай болохыг харуулсан [19]. Эдгээр судалгаанууд нь организмын эргэлтийн микробиомын биологийн олон янз байдлыг ccfDNA шинжилгээгээр үнэлж болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч саяхныг хүртэл энэ ойлголтыг зөвхөн хүнд болон бусад сээр нуруутан амьтдад бага хэмжээгээр ашиглаж байсан [20, 21].
Энэхүү өгүүлэлд бид 35 сая жилийн өмнө үүссэн том өндөрлөгийн орой дээр орших арлуудын бүлэг болох Антарктикийн дэд хэсэгт орших Кергелен арлуудад түгээмэл тохиолддог өмнөд зүйл болох Аулакомья атрагийн ccfDNA-г шинжлэхэд LB потенциалыг ашиглана. галт уулын дэлбэрэлт. In vitro туршилтын системийг ашиглан бид далайн усан дахь ДНХ-ийн хэлтэрхий хясаанд хурдан шингэж, гемолимфийн хэсэгт ордог болохыг тогтоожээ. Бууны дарааллын шинжилгээгээр хясааны гемолимф ccfDNA нь хүйтэн галт уулын далайн эргийн экосистемийн ердийн биомоос гаралтай симбиотик бактери, ДНХ-ийн хэлтэрхий зэрэг өөрийн болон өөрөө бус гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий агуулдаг болохыг харуулсан. Гемолимф ccfDNA нь мөн өөр өөр эзэн хүрээтэй вирусээс гаралтай вирусын дарааллыг агуулдаг. Бид мөн ястай загас, далайн анемон, замаг, шавьж зэрэг олон эст амьтдын ДНХ-ийн хэлтэрхийг олжээ. Эцэст нь хэлэхэд, бидний судалгаагаар LB концепцийг далайн сээр нуруугүй амьтдад амжилттай хэрэглэж, далайн экосистемд баялаг геномын сан бий болгож болохыг харуулж байна.
Насанд хүрсэн (55-70 мм урт) Mytilus platensis (M. platensis) болон Aulacomya atra (A. atra)-г 2018 оны 12-р сард Порт-о-Франсын (049°21.235 Өмнөд, 070°13.490 Зүүн) далайн түрлэг дундын хадархаг эргээс цуглуулсан. Кергелен арлууд. Бусад насанд хүрсэн цэнхэр хясааг (Mytilus spp.) арилжааны нийлүүлэгчээс (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард Айланд, Канад) цуглуулж, 10-20 литр 32‰ хиймэл давсны уусмал (хиймэл далайн давс Reef Crystal, Instant Ocean, Виржиниа, АНУ) агуулсан температурын хяналттай (4°C) агааржуулсан саванд хийсэн. Туршилт бүрийн хувьд хясаа тус бүрийн урт, жинг хэмжсэн.
Энэ хөтөлбөрийн үнэгүй нээлттэй хандалтын протоколыг онлайнаар авах боломжтой (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Товчхондоо, [22] тайлбарласны дагуу LB гемолимфийг хулгайлагч булчингаас цуглуулсан. Гемолимфийг 1200×g-д 3 минутын турш центрифугээр тодруулж, дээд давхаргыг хэрэглэх хүртэл (-20°C) хөлдөөсөн. cfDNA-г ялгаж цэвэршүүлэхийн тулд дээжийг (1.5-2.0 мл) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу NucleoSnap cfDNA хэрэгсэл (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ашиглан гэсгээж боловсруулсан. ccfDNA-г цаашдын шинжилгээ хүртэл -80°C-д хадгалсан. Зарим туршилтаар ccfDNA-г QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канад) ашиглан ялгаж цэвэршүүлсэн. Цэвэршүүлсэн ДНХ-г стандарт PicoGreen шинжилгээгээр тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Тусгаарлагдсан ccfDNA-ийн хэлтэрхийн тархалтыг Өндөр мэдрэмжит ДНХ-ийн иж бүрдэл ашиглан Agilent 2100 биоанализатор (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ашиглан хялгасан судасны электрофорезоор шинжилсэн. Шинжилгээг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу 1 µl ccfDNA дээжийг ашиглан гүйцэтгэсэн.
Гемолимфийн ccfДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийг дарааллаар нь тодорхойлохын тулд Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канад) нь Illumina MiSeq PE75 хэрэгслийн Illumina DNA Mix хэрэгслийг ашиглан бууны санг бэлтгэсэн. Стандарт адаптер (BioO) ашигласан. Түүхий өгөгдлийн файлуудыг NCBI дарааллын уншлагын архиваас (SRR8924808 ба SRR8924809) авах боломжтой. Үндсэн уншлагын чанарыг FastQC [23] ашиглан үнэлсэн. Trimmomatic [24]-ийг адаптеруудыг хайчлах болон чанар муутай уншлагад ашигласан. Хосолсон төгсгөлтэй бууны уншлагыг FLASH-аар нэгтгэж, зөрүү гарахаас зайлсхийхийн тулд хамгийн багадаа 20 bp давхцалтайгаар хийсэн [25]. Нэгтгэсэн уншилтыг хоёр хавхлагатай NCBI Таксономийн мэдээллийн сан (e утга < 1e−3 ба 90% гомологи) ашиглан BLASTN-ээр тэмдэглэсэн бөгөөд бага төвөгтэй дарааллын маскжуулалтыг DUST [26] ашиглан гүйцэтгэсэн. Нэгтгэсэн уншилтыг хоёр хавхлагатай NCBI Таксономийн мэдээллийн сан (e утга < 1e−3 ба 90% гомологи) ашиглан BLASTN-ээр тэмдэглэсэн бөгөөд бага төвөгтэй дарааллын маскжуулалтыг DUST [26] ашиглан гүйцэтгэсэн. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологи), a maskirovanie postedovatelnostey iskoyskoy ispolDUST. [26]. Нэгтгэсэн уншилтыг NCBI хоёр хавхлагын ангилал зүйн мэдээллийн санг ашиглан BLASTN-ээр тэмдэглэсэн (e утга < 1e-3 ба 90% гомологи) бөгөөд бага нарийн төвөгтэй дарааллын маскжуулалтыг DUST [26] ашиглан гүйцэтгэсэн.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读合并的读合并的读广2]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 ，类 （（（<1e-3 和进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологи), a maskirovanie postledovatelnostey by DUVARISTITIONS. [26]. Нэгтгэсэн уншилтыг NCBI хоёр хавхлагын таксономик мэдээллийн санг ашиглан BLASTN-ээр тэмдэглэсэн (e утга <1e-3 ба 90% гомологи) бөгөөд бага нарийн төвөгтэй дарааллын маскжуулалтыг DUST [26] ашиглан гүйцэтгэсэн.Уншилтыг хоёр бүлэгт хуваасан: хоёр хавтаст дарааллын холбоотой (энд өөрөө уншдаг гэж нэрлэдэг) болон холбоогүй (өөрөө уншдаггүй). Хоёр бүлгийг MEGAHIT ашиглан тусад нь угсарч, контиг үүсгэсэн [27]. Үүний зэрэгцээ, харь гарагийн микробиомын уншилтын ангилал зүйн тархалтыг Kraken2 [28] ашиглан ангилж, Galaxy дээрх Krona дугуй диаграммаар графикаар дүрсэлсэн [29, 30]. Бидний урьдчилсан туршилтуудаас оновчтой кмерүүдийг кмерс-59 гэж тодорхойлсон. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээ хийхийн тулд BLASTN (хоёр хавхлагт NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% гомологи)-той уялдуулан өөрийн үргэлжлэлүүдийг тодорхойлсон. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээ хийхийн тулд BLASTN (хоёр хавхлагт NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% гомологи)-той уялдуулан өөрийн үргэлжлэлүүдийг тодорхойлсон. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Дараа нь эцсийн тэмдэглэгээ хийхийн тулд BLASTN (NCBI хоёр хавхлагт мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% гомологи)-той харьцуулж, өөрөө холбогдсон зүйлсийг тодорхойлсон.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Дараа нь BLASTN (NCBI хоёр хавхлагын мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% гомологи)-тай харьцуулж эцсийн тэмдэглэгээнд зориулж өөрийн холбоотой зүйлсийг тодорхойлсон. Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% гомологи)-аар тэмдэглэсэн. Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга < 1e−10 ба 60% гомологи)-аар тэмдэглэсэн. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Үүний зэрэгцээ гадаад бүлгийн контигуудыг BLASTN (NT NCBI мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% гомологи)-оор тэмдэглэсэн.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参绾参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参绾参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Үүний зэрэгцээ, өөрөө бус бүлгийн контигуудыг BLASTN (nt NCBI мэдээллийн сан, e утга <1e-10 ба 60% гомологи)-ээр тэмдэглэсэн. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq уургийн NCBI мэдээллийн санг ашиглан өөрөө бус контигууд дээр хийсэн (e утга < 1e−10 ба 60% гомологи). BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq уургийн NCBI мэдээллийн санг ашиглан өөрөө бус контигууд дээр хийсэн (e утга < 1e−10 ба 60% гомологи). BLASTX нь бас данных белка nr болон RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%)-ийг ашиглах боломжтой. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq NCBI уургийн мэдээллийн санг ашиглан өөрөө бус контигууд дээр гүйцэтгэсэн (e утга < 1e-10 ба 60% гомологи).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌扺60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌扺60% 吧 BLASTX нь бас данных белка nr болон RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ба гомология 60%)-ийг ашиглахад зориулагдсан. BLASTX-ийг мөн nr болон RefSeq NCBI уургийн мэдээллийн санг ашиглан өөрөө холбоогүй нийлмэлүүд дээр гүйцэтгэсэн (e утга <1e-10 ба 60% гомологи).Өөрөө холбогддоггүй зүйлсийн BLASTN болон BLASTX сан нь эцсийн оролцоог илэрхийлнэ (Нэмэлт файлыг үзнэ үү).
PCR-д ашигласан праймеруудыг S1 хүснэгтэд жагсаасан болно. ccfДНХ-ийн зорилтот генийг олшруулахын тулд Taq ДНХ полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON)-г ашигласан. Дараах урвалын нөхцлийг ашигласан: 95°C-д 3 минут денатураци, 95°C-д 1 минут, 1 минутын турш хатаах температурыг тохируулах, 72°C-д 1 минутын турш сунгах, 35 цикл, эцэст нь 10 минутын дотор 72°C-д. . PCR бүтээгдэхүүнийг 95 В-д SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) агуулсан агарозын гель (1.5%)-д электрофорезоор ялгасан.
Хясаануудыг (Mytilus spp.) 500 мл хүчилтөрөгчтэй далайн усанд (32 PSU) 4°C температурт 24 цагийн турш дасан зохицуулсан. Хүний галектин-7 кДНХ-ийн дарааллыг кодчилдог оруулга агуулсан плазмид ДНХ (NCBI нэвтрэх дугаар L07769)-ийг 190 мкг/мкл эцсийн концентрацитайгаар шилэн саванд нэмсэн. ДНХ нэмэлгүйгээр ижил нөхцөлд өсгөвөрлөсөн хясаануудыг хяналтын сав болгон ашигласан. Гурав дахь хяналтын саванд хясаагүй ДНХ агуулагдсан. Далайн усан дахь ДНХ-ийн чанарыг хянахын тулд заасан хугацаанд сав бүрээс далайн усны дээж (20 мкл; гурван давталт) авсан. Плазмид ДНХ-ийн ул мөрийг хянахын тулд LB хясаануудыг заасан хугацаанд хурааж, qPCR болон ddPCR-ээр шинжилсэн. Далайн усны давсны агууламж өндөр тул бүх PCR шинжилгээний өмнө аликвотуудыг PCR чанарын усанд (1:10) шингэлсэн.
Дижитал дуслын ПГУ (ddPCR)-ийг BioRad QX200 протокол (Миссиссога, Онтарио, Канад) ашиглан гүйцэтгэсэн. Хамгийн оновчтой температурыг тодорхойлохын тулд температурын профайлыг ашиглана уу (Хүснэгт S1). Дусал үүсгүүрийг QX200 дусал үүсгүүр (BioRad) ашиглан үүсгэсэн. ddPCR-ийг дараах байдлаар гүйцэтгэсэн: 95°C-д 5 минут, 95°C-д 30 секундын 50 цикл, өгөгдсөн хатаах температурыг 1 минут, 72°C-д 30 секунд, 4°C-д 5 минут, 90°C-д 5 минутын дотор хийсэн. Дусал болон эерэг урвалын тоог (хуулбарын тоо/µl) QX200 дусал уншигч (BioRad) ашиглан хэмжсэн. 10,000-аас бага дусалтай дээжийг няцаасан. Хэв маягийн хяналтыг ddPCR ажиллуулах бүрт хийгээгүй.
qPCR-ийг Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австрали) болон LGALS7-д зориулсан тусгай праймер ашиглан гүйцэтгэсэн. Бүх тоон PCR-ийг QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ашиглан 20 µl-д гүйцэтгэсэн. qPCR-ийг 95°C-д 15 минутын инкубаци хийж, дараа нь 95°C-д 10 секундын турш, 60°C-д 60 секундын турш 40 цикл хийж, нэг өгөгдөл цуглуулсан. Хайлах муруйг qPCR-ийн төгсгөлд 95°C-д 5 секундын турш, 65°C-д 60 секундын турш, 97°C-д дараалсан хэмжилтийг ашиглан үүсгэсэн. Хяналтын дээжээс бусад qPCR бүрийг гурван хувь гүйцэтгэсэн.
Дунд хясаа нь өндөр шүүлтүүрийн хурдаараа алдартай тул бид эхлээд далайн усанд байдаг ДНХ-ийн хэлтэрхийг шүүж, хадгалж чадах эсэхийг судалсан. Мөн эдгээр хэлтэрхий нь хагас задгай тунгалгийн системд хуримтлагддаг эсэхийг бид сонирхож байсан. Бид цэнхэр хясааны саванд нэмсэн уусдаг ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн хувь тавиланг мөрдөх замаар энэ асуудлыг туршилтаар шийдсэн. ДНХ-ийн хэлтэрхийг хянахын тулд бид хүний ​​галектин-7 генийг агуулсан гадны (өөрөө биш) плазмид ДНХ-г ашигласан. ddPCR нь далайн ус болон хясаанд плазмид ДНХ-ийн хэлтэрхийг ул мөрийг нь тогтоодог. Бидний үр дүнгээс харахад хэрэв далайн усан дахь ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн хэмжээ хясаа байхгүй үед (7 хүртэл хоног) харьцангуй тогтмол хэвээр байвал хясаа байгаа үед энэ түвшин 8 цагийн дотор бараг бүрэн алга болсон (Зураг 1a, b). Гадны ДНХ-ийн хэлтэрхийг хавхлагын доторх шингэн болон гемолимфэд 15 минутын дотор амархан илрүүлсэн (Зураг 1c). Эдгээр хэлтэрхийг өртсөнөөс хойш 4 цагийн дотор илрүүлж болно. ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн хувьд энэхүү шүүлтүүрийн идэвхжил нь бактери ба замагны шүүлтүүрийн идэвхжилтэй харьцуулах боломжтой [31]. Эдгээр үр дүнгээс харахад хясаа нь шингэний хэсэгтээ гадны ДНХ-г шүүж, хуримтлуулж чаддаг болохыг харуулж байна.
Хясаан байгаа (A) эсвэл байхгүй (B) үед далайн усан дахь плазмид ДНХ-ийн харьцангуй концентрацийг ddPCR-ээр хэмжсэн. А хэсэгт үр дүнг хувиар илэрхийлсэн бөгөөд хайрцагны хил хязгаар нь 75 ба 25 дахь перцентилийг илэрхийлнэ. Логарифмын муруйг улаанаар харуулсан бөгөөд саарал өнгөөр ​​сүүдэрлэсэн хэсэг нь 95%-ийн итгэлцлийн интервалыг илэрхийлнэ. B хэсэгт улаан шугам нь дундаж утгыг, цэнхэр шугам нь концентрацийн 95%-ийн итгэлцлийн интервалыг илэрхийлнэ. C Плазмид ДНХ нэмсний дараа өөр өөр хугацаанд хясааны гемолимф болон хавхлагын шингэнд плазмид ДНХ-ийн хуримтлал. Үр дүнг илрүүлсэн үнэмлэхүй хуулбар/мл (±SE) гэж үзүүлэв.
Дараа нь бид хүний ​​үйл ажиллагааны нөлөө хязгаарлагдмал алслагдсан арлуудын бүлэг болох Кергелен арлуудын хясааны орноос цуглуулсан хясаанаас ccfDNA-ийн гарал үүслийг судалсан. Энэ зорилгоор хясааны гемолимфээс cccDNA-г ялгаж, хүний ​​cccDNA-г цэвэршүүлэхэд түгээмэл хэрэглэгддэг аргуудаар цэвэршүүлсэн [32, 33]. Бид хясаан дахь гемолимф ccfDNA-ийн дундаж агууламж нь гемолимфийн нэг мл тутамд бага микрограммтай байгааг тогтоосон (Хүснэгт S2, Нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү). Энэ концентрацийн хүрээ нь эрүүл хүмүүсийнхээс хамаагүй их байдаг (миллилитр тутамд бага нанограмм), гэхдээ ховор тохиолдолд хорт хавдартай өвчтөнүүдэд ccfDNA-ийн түвшин миллилитр тутамд хэд хэдэн микрограммд хүрч болно [34, 35]. Гемолимф ccfDNA-ийн хэмжээний тархалтын шинжилгээгээр эдгээр хэлтэрхийнүүд хэмжээ нь маш их ялгаатай бөгөөд 1000 bp-ээс 1000 bp хүртэл, 5000 bp хүртэл хэлбэлздэг болохыг харуулсан (Зураг 2). Үүнтэй төстэй үр дүнг цахиурын давхар исэлд суурилсан QIAamp Investigator Kit ашиглан олж авсан бөгөөд энэ нь шүүх эмнэлгийн шинжлэх ухаанд ccfDNA [36] зэрэг бага концентрацитай ДНХ-ийн дээжээс геномын ДНХ-ийг хурдан ялгаж, цэвэршүүлэхэд түгээмэл хэрэглэгддэг арга юм.
Дундасны гемолимфын төлөөллийн ccfDNA электрофореграмм. NucleoSnap Plasma Kit (дээд талд) болон QIAamp ДНХ-ийн судлаачийн хэрэгсэл ашиглан гаргаж авсан. Хясаан дахь гемолимфын ccfDNA концентрацийн (±SE) тархалтыг харуулсан B хийлийн график. Хар ба улаан шугамууд нь медиан болон эхний ба гуравдугаар квартилийг тус тус илэрхийлнэ.
Хүн ба приматуудын ccfDNA-ийн ойролцоогоор 1% нь гадны эх үүсвэртэй байдаг [21, 37]. Хоёр хавтаст амьтдын хагас задгай цусны эргэлтийн систем, бичил биетнээр баялаг далайн ус, хясааны ccfDNA-ийн хэмжээний тархалтыг харгалзан үзвэл бид хясааны гемолимф ccfDNA нь бичил биетний ДНХ-ийн баялаг, олон янзын нөөц агуулсан байж болзошгүй гэсэн таамаглал дэвшүүлсэн. Энэхүү таамаглалыг шалгахын тулд бид Кергелен арлуудаас цуглуулсан Аулакомья атра дээжээс гемолимф ccfDNA-ийн дарааллыг гаргаж, 10 сая гаруй уншлага гаргаж, үүний 97.6% нь чанарын хяналтыг давсан. Дараа нь уншлагыг BLASTN болон NCBI хоёр хавтаст мэдээллийн санг ашиглан өөрийн болон өөрийн бус эх сурвалжаар ангилсан (Зураг S1, Нэмэлт мэдээлэл).
Хүний биед цөмийн болон митохондрийн ДНХ хоёулаа цусны урсгалд ялгарч болно [38]. Гэсэн хэдий ч одоогийн судалгаагаар A. atra геномыг дараалалд оруулаагүй эсвэл тайлбарлаагүй тул хясааны цөмийн геномын ДНХ-г нарийвчлан тайлбарлах боломжгүй байсан. Гэсэн хэдий ч бид хоёр хавтаст санг ашиглан өөрсдийн гаралтай хэд хэдэн ccfDNA хэлтэрхийг тодорхойлж чадсан (Зураг S2, Нэмэлт мэдээлэл). Мөн дараалалд оруулсан A. atra генийг чиглүүлсэн PCR олшруулалтаар өөрсдийн гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий байгааг баталгаажуулсан (Зураг 3). Үүнтэй адилаар, A. atra-ийн митохондрийн геном нь олон нийтийн мэдээллийн санд байдаг тул A. atra-ийн гемолимфт митохондрийн ccfDNA хэлтэрхий байгааг нотлох баримтыг олж болно. Митохондрийн ДНХ-ийн хэлтэрхий байгааг PCR олшруулалтаар баталгаажуулсан (Зураг 3).
PCR-ээр олшруулсан A. atra (улаан цэгүүд - нөөцийн дугаар: SRX5705969) болон M. platensis (цэнхэр цэгүүд - нөөцийн дугаар: SRX5705968)-ийн гемолимфт янз бүрийн митохондрийн генүүд байсан. Зураг нь Breton et al., 2011 B-ээс авсан. A. atra-аас гаргаж авсан гемолимфийн дээд давхаргыг олшруулах нь FTA цаасан дээр хадгалагдсан. PCR хольц агуулсан PCR хоолойд шууд нэмэхийн тулд 3 мм-ийн цоолтуур ашиглана.
Далайн усанд агуулагдах бичил биетний элбэг дэлбэг агууламжийг харгалзан бид эхлээд гемолимф дахь бичил биетний ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлоход анхаарлаа хандуулсан. Үүний тулд бид хоёр өөр стратеги ашигладаг. Эхний стратегид BLAST болон бусад хэрэгслүүдтэй харьцуулахуйц нарийвчлалтайгаар бичил биетний дарааллыг тодорхойлж чадах алгоритм дээр суурилсан дарааллын ангиллын програм болох Kraken2-ийг ашигласан [28]. 6719 гаруй уншлага нь бактерийн гаралтай гэж тогтоогдсон бол 124 ба 64 нь архей болон вирусээс тус тус гарсан (Зураг 4). Хамгийн их элбэг тохиолддог бактерийн ДНХ-ийн хэлтэрхий нь Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), болон Bacteroidetes (17%) байв (Зураг 4a). Энэ тархалт нь далайн цэнхэр хясааны микробиомын өмнөх судалгаануудтай нийцэж байна [39, 40]. Гаммапротеобактери нь олон Vibrionales зэрэг Протеобактерийн гол ангилал (44%) байв (Зураг 4b). ddPCR арга нь A. atra hemolymph-ийн ccfDNA-д Vibrio ДНХ-ийн хэлтэрхий байгааг баталгаажуулсан (Зураг 4c) [41]. ccfDNA-ийн бактерийн гарал үүслийн талаар илүү их мэдээлэл авахын тулд нэмэлт арга барилыг ашигласан (Зураг S2, Нэмэлт мэдээлэл). Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншилт гэж угсарсан бөгөөд BLASTN болон 1e−3 гэсэн e утга, >90% гомологитой таслалтыг ашиглан өөрөө (хоёр хавхлагатай) эсвэл өөрөө бус гаралтай гэж ангилсан. Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншилт гэж угсарсан бөгөөд BLASTN болон 1e−3 гэсэн e утга, >90% гомологитой таслалтыг ашиглан өөрөө (хоёр хавхлагатай) эсвэл өөрөө бус гаралтай гэж ангилсан. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) эсвэл чужие по происхождению с использованием BLASTN болон значения с гомей 190-%. Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншилт гэж цуглуулж, BLASTN болон 1e-3-ийн e утгыг ашиглан уугуул (хоёр хавхлагатай) эсвэл оригинал бус гэж ангилж, >90% гомологитой таслав.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 的用 嚄用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) эсвэл несобственные по происхождению с происхождению с использованием значений e BLASTN ологи и 19%. Энэ тохиолдолд давхцсан уншилтыг хос төгсгөлтэй уншилт гэж цуглуулж, e BLASTN болон 1e-3 утгууд болон гомологийн босго >90% ашиглан өөрийн (хоёр хавхлагатай) эсвэл анхны бус гэж ангилсан.A. atra геномыг хараахан дараалалжуулаагүй тул бид MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) угсрагчийн de novo угсралтын стратегийг ашигласан. Нийт 147,188 контигийг гарал үүслээс хамааралтай (хоёр хавхлагатай) гэж тодорхойлсон. Дараа нь эдгээр контигуудыг BLASTN болон BLASTX ашиглан 1e-10 e-утгаар задалсан. Энэхүү стратеги нь бидэнд A. atra ccfDNA-д байдаг 482 хоёр хавхлагагүй хэлтэрхийг тодорхойлох боломжийг олгосон. Эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн талаас илүү хувь нь (57%) бактериас, голчлон сульфотрофик симбионтуудыг оролцуулан заламгайн симбионтуудаас болон заламгайн симбионт Solemya velum-аас авсан (Зураг 5).
Төрлийн түвшинд харьцангуй элбэгшил. B Хоёр үндсэн төрөл (Firmicutes ба Proteobacteria)-ийн бичил биетний олон янз байдал. ddPCR-ийн төлөөллийн олшруулалт C Vibrio spp. A. Гурван тосгуурын гемолимф дахь 16S rRNA генийн хэлтэрхий (цэнхэр).
Нийт 482 цуглуулсан контигийг шинжилсэн. Метагеномик контигийн тэмдэглэгээний (прокариот ба эукариот) ангилал зүйн тархалтын ерөнхий профайл. B BLASTN ба BLASTX-ээр тодорхойлогдсон бактерийн ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн нарийвчилсан тархалт.
Kraken2 шинжилгээгээр хясааны ccf ДНХ нь археалын ДНХ-ийн хэлтэрхий, түүний дотор Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), болон Thaurmarcheota (11%)-ийн ДНХ-ийн хэлтэрхий агуулдаг болохыг харуулсан (Зураг 6a). Калифорнийн хясааны бичил биетний бүлгэмд өмнө нь олддог байсан Euryarchaeota болон Crenarchaeota-аас гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа нь гайхмаар зүйл биш юм [42]. Euryarchaeota нь ихэвчлэн онцгой нөхцөлтэй холбоотой байдаг ч Euryarchaeota болон Crenarcheota хоёулаа далайн криоген орчинд хамгийн түгээмэл тохиолддог прокариотуудын нэг гэдгийг одоо хүлээн зөвшөөрч байна [43, 44]. Кергелен өндөрлөг дээрх ёроолын нэвчилтээс метан гоожиж байгаа тухай саяхны мэдээллүүд [45] болон Кергелен арлуудын эргээс микроб метан үүсэх магадлалтай байгааг харгалзан үзвэл хясаанд метан үүсгэгч бичил биетнүүд байгаа нь гайхмаар зүйл биш юм [46].
Дараа нь бидний анхаарал ДНХ вирусын уншилт руу шилжсэн. Бидний мэдэхийн хэрээр энэ нь хясааны вирусын агууламжийн анхны зорилтот бус судалгаа юм. Хүлээгдэж байсанчлан бид бактериофагуудын (Caudovirales) ДНХ-ийн хэлтэрхийг олсон (Зураг 6b). Гэсэн хэдий ч хамгийн түгээмэл вирусын ДНХ нь нуклеоцитовирусын нэг хэлбэрээс гаралтай бөгөөд энэ нь бусад вирусын хамгийн том геномтой цөмийн цитоплазмын том ДНХ вирус (NCLDV) гэгддэг. Энэ хэлбэрт ДНХ-ийн ихэнх дараалал нь сээр нуруутан амьтад болон үе хөлтнүүд багтдаг Mimimidoviridae (58%) болон Poxviridae (21%) овогт хамаардаг бол эдгээр ДНХ-ийн дарааллын багахан хэсэг нь мэдэгдэж буй вирусологийн замагт хамаардаг. Далайн эукариот замаг халдварладаг. Дарааллыг мөн мэдэгдэж буй вирусын төрлүүдийн хамгийн том геномын хэмжээтэй аварга том вирус болох Пандора вирусаас авсан. Сонирхолтой нь, гемолимф ccfДНХ-ийн дарааллаар тодорхойлогдсон вирусын халдвар авсан гэж мэдэгдэж буй эздийн хүрээ харьцангуй том байсан (Зураг S3, Нэмэлт мэдээлэл). Үүнд Baculoviridae болон Iridoviridae зэрэг шавьжийг халдварладаг вирусууд, мөн амеба, замаг, сээр нуруутан амьтдыг халдварладаг вирусууд багтдаг. Бид мөн Pithovirus sibericum геномтой тохирох дарааллыг олсон. Питовирус (мөн "зомби вирус" гэгддэг)-ийг анх Сибирийн 30,000 жилийн настай мөнх цэвдэгээс тусгаарласан [47]. Тиймээс бидний үр дүн нь эдгээр вирусын орчин үеийн бүх зүйл устаж үгүй ​​​​болсонгүй [48] бөгөөд эдгээр вирусууд алслагдсан субарктикийн далайн экосистемд байж болзошгүйг харуулсан өмнөх тайлангуудтай нийцэж байна.
Эцэст нь бид бусад олон эст амьтдын ДНХ-ийн хэлтэрхийг олж чадах эсэхийг шалгахын тулд туршилт хийсэн. BLASTN болон BLASTX-ээр нийт 482 гадаад контигийг nt, nr болон RefSeq сангууд (геномын болон уураг)-тайгаар тодорхойлсон. Бидний үр дүнгээс харахад олон эст амьтдын ccfДНХ-ийн гадаад хэлтэрхийнүүдийн дунд ясны ясны ДНХ давамгайлдаг (Зураг 5). Шавьж болон бусад зүйлийн ДНХ-ийн хэлтэрхий бас олдсон. ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн харьцангуй их хэсгийг тогтоогоогүй байгаа нь хуурай газрын зүйлүүдтэй харьцуулахад геномын мэдээллийн санд олон тооны далайн зүйлийн төлөөлөл бага байгаатай холбоотой байж болох юм [49].
Одоогийн өгүүлэлд бид LB концепцийг хясаанд хэрэглэж, гемолимфын ccfDNA-ийн дарааллыг тогтоох нь далайн эргийн экосистемийн найрлагын талаар ойлголт өгөх боломжтой гэж үзэж байна. Ялангуяа бид 1) хясааны гемолимф нь харьцангуй том (~1-5 кб) эргэлддэг ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн харьцангуй өндөр концентраци (микрограммын түвшин) агуулдаг болохыг тогтоосон; 2) эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхий нь бие даасан болон бие даасан бус байдаг; 3) Эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн гадаад эх үүсвэрүүдийн дунд бид бактерийн, археал болон вирусын ДНХ, түүнчлэн бусад олон эст амьтдын ДНХ-ийг олсон; 4) Эдгээр гадаад ccfDNA хэлтэрхийнүүд гемолимфт хуримтлагдах нь хурдан явагддаг бөгөөд хясааны дотоод шүүлтүүрийн үйл ажиллагаанд хувь нэмэр оруулдаг. Эцэст нь хэлэхэд, бидний судалгаагаар одоогоор голчлон биоанагаахын салбарт хэрэглэгдэж ирсэн LB концепц нь харуулын төрөл зүйл болон тэдгээрийн хүрээлэн буй орчны харилцан үйлчлэлийг илүү сайн ойлгоход ашиглаж болох баялаг боловч судлагдаагүй мэдлэгийн эх сурвалжийг кодчилдог болохыг харуулж байна.
Приматуудаас гадна хулгана, нохой, муур, морь зэрэг хөхтөн амьтдад ccfDNA-ийн тусгаарлалт илэрсэн тухай мэдээлсэн [50, 51, 52]. Гэсэн хэдий ч бидний мэдэж байгаагаар бидний судалгаа нь нээлттэй эргэлтийн системтэй далайн төрөл зүйлд ccfDNA-г илрүүлэх, дарааллыг тогтоох талаар мэдээлсэн анхны судалгаа юм. Хясааны энэхүү анатомийн онцлог болон шүүлтүүрийн чадвар нь бусад зүйлтэй харьцуулахад эргэлтэд байгаа ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн өөр өөр хэмжээний шинж чанарыг дор хаяж хэсэгчлэн тайлбарлаж болох юм. Хүний цусанд эргэлдэж буй ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн ихэнх нь 150-200 б.п. хэмжээтэй жижиг хэлтэрхий бөгөөд хамгийн их оргил нь 167 б.п. байдаг [34, 53]. ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн бага боловч мэдэгдэхүйц хэсэг нь 300-500 б.п. хэмжээтэй бөгөөд ойролцоогоор 5% нь 900 б.п.-ээс урт байдаг [54]. Энэхүү хэмжээний тархалтын шалтгаан нь сийвэн дэх ccfDNA-ийн гол эх үүсвэр нь эсийн үхлийн үр дүнд үүсдэг бөгөөд энэ нь эсийн үхэл эсвэл эрүүл хүмүүсийн цусны эргэлтийн эсийн үхжил, эсвэл хорт хавдартай өвчтөнүүдийн хавдрын эсийн апоптозын улмаас үүсдэг (цусны эргэлтийн хавдрын ДНХ гэж нэрлэдэг). , ctDNA). Бидний хясаанаас олсон гемолимф ccfDNA-ийн хэмжээний тархалт 1000-5000 bp хооронд хэлбэлзэж байсан нь хясааны ccfDNA нь өөр гарал үүсэлтэй болохыг харуулж байна. Энэ бол логик таамаглал юм, учир нь хясаа нь хагас задгай судасны системтэй бөгөөд бичил биетний геномын ДНХ-ийн өндөр агууламжтай далайн усны орчинд амьдардаг. Үнэндээ бидний гадны ДНХ ашиглан хийсэн лабораторийн туршилтууд нь хясаа нь далайн усанд ДНХ-ийн хэлтэрхий хуримтлуулдаг бөгөөд ядаж хэдэн цагийн дараа эсийн шингээлтийн дараа задарч,/эсвэл ялгарч,/эсвэл янз бүрийн байгууллагад хадгалагддаг болохыг харуулсан. Эсүүд (прокариот ба эукариот эсүүд хоёулаа) ховор байдаг тул хавхлагын доторх тасалгаануудыг ашиглах нь өөрийн болон гадны эх үүсвэрээс үүсэх ccfDNA-ийн хэмжээг бууруулна. Хоёр хавтаст эсийн төрөлхийн дархлаа болон цусны эргэлтэнд байгаа олон тооны фагоцитын ач холбогдлыг харгалзан үзвэл бид гадны ccfDNA нь бичил биетэн болон/эсвэл эсийн хог хаягдлыг залгих үед гадны ДНХ хуримтлуулдаг цусны эргэлтийн фагоцитоор баяждаг гэсэн таамаглалыг дэвшүүлсэн. Бидний үр дүнг нэгтгэн үзвэл хоёр хавтаст эсийн гемолимф ccfDNA нь молекулын мэдээллийн өвөрмөц хадгалалт бөгөөд тэдний харуулын зүйл гэсэн статусыг бататгаж байна.
Бидний өгөгдөл нь бактериас гаралтай гемолимф ccfДНХ-ийн хэлтэрхийнүүдийн дараалал тогтоох, шинжлэх нь эзэн бактерийн ургамал болон хүрээлэн буй далайн экосистемд байдаг бактерийн талаарх гол мэдээллийг өгч чадна гэдгийг харуулж байна. Шот дарааллын аргууд нь уламжлалт 16S rRNA тодорхойлох аргыг ашигласан бол алдагдаж болох байсан A. atra gill комменсал бактерийн дарааллыг илрүүлсэн бөгөөд энэ нь лавлагааны номын сангийн алдаатай холбоотой юм. Үнэндээ Кергелений ижил хясааны давхаргад M. platensis-ээс цуглуулсан LB өгөгдлийг ашиглах нь заламгайтай холбоотой бактерийн симбионтуудын найрлага нь хясааны хоёр зүйлийн хувьд ижил байгааг харуулсан (Зураг S4, Нэмэлт мэдээлэл). Генетикийн хувьд өөр хоёр хясааны энэхүү ижил төстэй байдал нь Кергелений хүйтэн, хүхэрлэг, галт уулын орд дахь бактерийн бүлгэмдлийн найрлагыг тусгаж болох юм [55, 56, 57, 58]. Порт-о-Францын эрэг гэх мэт биологийн турбулаттай эргийн бүсээс хясаа хураах үед хүхэр бууруулдаг бичил биетний өндөр түвшинг сайн тодорхойлсон байдаг [59]. Өөр нэг боломж бол хэвтээ дамжуулалт нь комменсал хясааны ургамалд нөлөөлж болзошгүй юм [60, 61]. Далайн орчин, далайн ёроолын гадаргуу болон хясааны симбиотик бактерийн найрлага хоорондын хамаарлыг тодорхойлохын тулд илүү их судалгаа шаардлагатай байна. Эдгээр судалгаанууд одоогоор үргэлжилж байна.
Гемолимфын ccfDNA-ийн урт ба концентраци, цэвэршүүлэхэд хялбар байдал, хурдан дарааллыг тогтоох өндөр чанар нь далайн эргийн экосистемийн биологийн олон янз байдлыг үнэлэхэд хясааны ccfDNA ашиглах олон давуу талуудын зарим нь юм. Энэ арга нь тухайн экосистем дэх вирусын бүлгэмдэл (виром)-ыг тодорхойлоход онцгой үр дүнтэй байдаг [62, 63]. Бактери, архей, эукариотуудаас ялгаатай нь вирусын геном нь 16S дараалал гэх мэт филогенетикийн хувьд хадгалагдсан ген агуулдаггүй. Бидний үр дүнгээс харахад хясаа зэрэг индикатор зүйлийн шингэн биопси нь далайн эргийн экосистемд ихэвчлэн амьдардаг эзэн биетүүдийг халдварладаг харьцангуй олон тооны ccfDNA вирусын хэлтэрхийг тодорхойлоход ашиглагдаж болохыг харуулж байна. Үүнд энгийн биет, үе хөлт, шавьж, ургамал, бактерийн вирус (жишээ нь, бактериофаг)-ийг халдварладаг вирусууд багтана. Кергуэлен дэх ижил хясааны давхаргад цуглуулсан цэнхэр хясааны (M. platensis) гемолимфын ccfDNA виромыг судлахад ижил төстэй тархалт ажиглагдсан (Хүснэгт S2, Нэмэлт мэдээлэл). ccfДНХ-ийн бууны дарааллыг тодорхойлох нь хүн болон бусад зүйлийн виромын судалгаанд эрч хүчээ авч буй шинэ арга юм [21, 37, 64]. Энэ арга нь давхар судалтай ДНХ вирусыг судлахад онцгой ач холбогдолтой юм, учир нь Балтимор дахь хамгийн олон янзын, өргөн хүрээтэй вирусын ангиллыг төлөөлдөг бүх давхар судалтай ДНХ вирусын дунд ганц ч ген хадгалагдаагүй байна [65]. Эдгээр вирусын ихэнх нь ангилагдаагүй хэвээр байгаа бөгөөд вирусын ертөнцийн бүрэн үл мэдэгдэх хэсгээс гаралтай вирусыг багтааж болох боловч [66], бид A. atra болон M. platensis хясааны виром болон эзэн хүрээ нь хоёр зүйлийн хооронд оршдог болохыг тогтоосон. Үүнтэй адил (S3 зураг, нэмэлт мэдээллийг үзнэ үү). Энэхүү ижил төстэй байдал нь гайхмаар зүйл биш юм, учир нь энэ нь хүрээлэн буй орчинд байгаа ДНХ-ийн шингээлтийн сонгомол чанар дутмаг байгааг харуулж магадгүй юм. Цэвэршүүлсэн РНХ ашиглан ирээдүйн судалгааг одоогоор РНХ виромыг тодорхойлох шаардлагатай байна.
Бидний судалгаанд бид Коварски болон түүний хамтрагчдын [37] бүтээлээс сэдэвлэсэн маш нарийн шугам хоолойг ашигласан бөгөөд тэд уугуул ccfDNA угсрахаас өмнө болон дараа нэгтгэсэн уншилт болон холбоосыг хоёр үе шаттайгаар устгасан бөгөөд үүний үр дүнд зураглагдаагүй уншилт өндөр хувьтай болсон. Тиймээс бид эдгээр зураглагдаагүй уншилтуудын зарим нь өөрийн гэсэн гарал үүсэлтэй хэвээр байж болохыг үгүйсгэх аргагүй бөгөөд энэ нь голчлон бидэнд энэ хясааны зүйлийн лавлагаа геном байхгүйтэй холбоотой юм. Бид мөн энэ шугам хоолойг ашигласан, учир нь бид өөрөө болон өөрөө бус уншилтуудын хоорондох химерүүд болон Illumina MiSeq PE75-ийн үүсгэсэн уншилтын уртын талаар санаа зовж байсан. Судалгаалагдаагүй уншилтуудын дийлэнх нь далайн бичил биетүүдийн ихэнх нь, ялангуяа Кергуэлен зэрэг алслагдсан бүс нутагт тэмдэглэгээ хийгдээгүй байдаг. Бид ccfDNA хэлтэрхийн урт нь хүний ​​ccfDNA-тай төстэй гэж үзэн Illumina MiSeq PE75-ийг ашигласан. Ирээдүйн судалгаануудад гемолимфын ccfDNA нь хүн болон/эсвэл хөхтөн амьтдаас илүү урт уншилттай болохыг харуулсан бидний үр дүнг харгалзан үзвэл бид урт ccfDNA хэлтэрхийд илүү тохиромжтой дарааллын платформ ашиглахыг зөвлөж байна. Энэхүү дадал нь илүү гүнзгий дүн шинжилгээ хийх илүү олон заалтыг тодорхойлоход илүү хялбар болгоно. Одоогоор байхгүй байгаа A. atra цөмийн геномын бүрэн дарааллыг олж авах нь ccfDNA-г өөрийн болон өөрөө бус эх үүсвэрээс ялгахад ихээхэн дөхөм болно. Бидний судалгаа нь шингэн биопсийн ойлголтыг хясаанд хэрэгжүүлэх боломжид анхаарлаа хандуулсан тул энэхүү ойлголтыг ирээдүйн судалгаанд ашиглахын хэрээр хясааны бичил биетний олон янз байдлыг судлах энэ аргын боломжийг нэмэгдүүлэх шинэ хэрэгсэл, дамжуулах хоолойг боловсруулна гэж найдаж байна. далайн экосистем.
Инвазив бус клиник биомаркер болох хүний ​​сийвэн дэх ccfDNA-ийн түвшин өндөр байх нь янз бүрийн өвчин, эдийн гэмтэл, стрессийн нөхцөл байдалтай холбоотой байдаг [67,68,69]. Энэхүү өсөлт нь эд эсийн гэмтлийн дараа өөрийн гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий ялгардагтай холбоотой юм. Бид энэ асуудлыг цочмог дулааны стресс ашиглан шийдсэн бөгөөд энэ үед хясааг 30 °C температурт түр хугацаагаар өртүүлсэн. Бид энэ шинжилгээг гурван бие даасан туршилтаар гурван өөр төрлийн хясаан дээр хийсэн. Гэсэн хэдий ч цочмог дулааны стрессийн дараа ccfDNA-ийн түвшинд ямар ч өөрчлөлт гараагүй (S5-р зургийг үзнэ үү, нэмэлт мэдээлэл). Энэхүү нээлт нь хясаа нь хагас задгай цусны эргэлтийн системтэй бөгөөд өндөр шүүлтүүрийн идэвхжилийн улмаас их хэмжээний гадны ДНХ хуримтлуулдаг гэсэн баримтыг дор хаяж хэсэгчлэн тайлбарлаж болох юм. Нөгөөтэйгүүр, олон сээр нуруугүй амьтдын нэгэн адил хясаа нь стрессээс үүдэлтэй эдийн гэмтэлд илүү тэсвэртэй байж болох бөгөөд ингэснээр тэдний гемолимф дахь ccfDNA-ийн ялгаралтыг хязгаарладаг [70, 71].
Өнөөдрийг хүртэл усны экосистем дэх биологийн олон янз байдлын ДНХ-ийн шинжилгээ нь голчлон хүрээлэн буй орчны ДНХ (eDNA) метабаркодлолд анхаарлаа хандуулж ирсэн. Гэсэн хэдий ч энэ арга нь праймер ашиглах үед биологийн олон янз байдлын шинжилгээнд ихэвчлэн хязгаарлагдмал байдаг. Бууны дарааллыг ашиглах нь PCR-ийн хязгаарлалт болон праймерын багцын хэвийсэн сонголтыг тойрч гардаг. Тиймээс, нэг талаараа бидний арга нь саяхан ашиглагдаж байсан өндөр хүчин чадалтай eDNA Бууны дарааллын аргатай илүү ойр бөгөөд энэ нь хуваагдсан ДНХ-ийг шууд дарааллаар нь тогтоож, бараг бүх организмыг шинжлэх чадвартай [72, 73]. Гэсэн хэдий ч LB-г стандарт eDNA аргуудаас ялгаж салгадаг хэд хэдэн үндсэн асуудал байдаг. Мэдээжийн хэрэг, eDNA болон LB-ийн хоорондох гол ялгаа нь байгалийн шүүлтүүрийн эздийг ашиглах явдал юм. eDNA-г судлахын тулд хөвөн, хоёр хавтаст (Dresseina spp.) зэрэг далайн зүйлүүдийг байгалийн шүүлтүүр болгон ашигласан тухай мэдээлсэн [74, 75]. Гэсэн хэдий ч Дрейсенагийн судалгаанд ДНХ-г гаргаж авсан эдийн биопси ашигласан. LB-ээс авсан ccfDNA-г шинжлэхэд эдийн биопси, eDNA эсвэл эдийн биопситой холбоотой тусгай, заримдаа үнэтэй тоног төхөөрөмж, ложистик шаардлагагүй. Үнэндээ бид саяхан LB-ээс авсан ccfDNA-г хүйтэн гинжийг хадгалахгүйгээр FTA-ийн дэмжлэгтэйгээр хадгалж, шинжлэх боломжтой гэж мэдээлсэн бөгөөд энэ нь алслагдсан бүс нутгийн судалгааны томоохон бэрхшээл юм [76]. Шингэн биопсиос ccfDNA-г гаргаж авах нь бас энгийн бөгөөд бууны дараалал тогтоох, PCR шинжилгээнд өндөр чанартай ДНХ өгдөг. Энэ нь eDNA шинжилгээтэй холбоотой зарим техникийн хязгаарлалтыг харгалзан үзвэл маш том давуу тал юм [77]. Дээж авах аргын энгийн байдал, хямд өртөг нь урт хугацааны хяналтын хөтөлбөрүүдэд онцгой тохиромжтой. Өндөр шүүлтүүрийн чадвараас гадна хоёр хавтаст нялцгай биетний өөр нэг сайн мэддэг шинж чанар нь тэдний салстын химийн мукополисахаридын найрлага бөгөөд энэ нь вирусын шингээлтийг дэмждэг [78, 79]. Энэ нь хоёр хавтаст нялцгай биетийг тухайн усны экосистемд биологийн олон янз байдал болон уур амьсгалын өөрчлөлтийн нөлөөллийг тодорхойлоход тохиромжтой байгалийн шүүлтүүр болгодог. Хэдийгээр эзэн биеэс гаралтай ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа нь eDNA-тай харьцуулахад уг аргын хязгаарлалт гэж үзэж болох ч eDNA-тай харьцуулахад ийм уугуул ccfDNA-тай байхтай холбоотой зардал нь эрүүл мэндийн судалгаанд зориулсан асар их хэмжээний мэдээллийн хувьд нэгэн зэрэг ойлгомжтой юм. офсет эзэн. Үүнд эзэн биений геномд нэгтгэгдсэн вирусын дараалал орно. Энэ нь ялангуяа хоёр хавтаст нялцгай биетэнд хэвтээ дамжуулалттай лейкемийн ретровирусууд байгааг харгалзан үзвэл хясааны хувьд чухал юм [80, 81]. LB-ийн eDNA-тай харьцуулахад өөр нэг давуу тал нь бичил биетнийг (болон тэдгээрийн геномыг) залгидаг гемолимф дэх цусны эргэлтийн эсийн фагоцитын идэвхийг ашигладаг явдал юм. Фагоцитоз бол хоёр хавтаст нялцгай биетний цусны эсийн гол үүрэг юм [82]. Эцэст нь хэлэхэд, энэ арга нь хясааны өндөр шүүлтүүрийн хүчин чадал (дунджаар 1.5 л/цаг далайн ус) болон хоёр өдрийн эргэлтийг ашигладаг бөгөөд энэ нь далайн усны янз бүрийн давхаргын холилдолтыг нэмэгдүүлж, гетерологийн eDNA-г барих боломжийг олгодог. [83, 84]. Тиймээс хясааны ccfDNA шинжилгээ нь хясааны хоол тэжээл, эдийн засаг, байгаль орчинд үзүүлэх нөлөөллийг харгалзан үзвэл сонирхолтой чиглэл юм. Хүнээс цуглуулсан LB-ийн шинжилгээтэй адил энэ арга нь гадны бодисуудад хариу үйлдэл үзүүлэх үед эзэн ДНХ-ийн генетикийн болон эпигенетикийн өөрчлөлтийг хэмжих боломжийг нээж өгдөг. Жишээлбэл, нано нүх сүвний дарааллыг ашиглан уугуул ccfDNA-д геномын хэмжээнд метилжилтийн шинжилгээ хийх гурав дахь үеийн дарааллын технологийг төсөөлж болно. Энэ үйл явцыг хясааны ccfDNA хэлтэрхийнүүдийн урт нь химийн хувиргалт хийх шаардлагагүйгээр нэг дарааллын гүйлтээс геномын хэмжээнд ДНХ-ийн метилжилтийн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог урт унших дарааллын платформуудтай хамгийн тохиромжтой нийцтэй байдагтай холбон тайлбарлах хэрэгтэй.85,86] Энэ бол сонирхолтой боломж юм, учир нь ДНХ-ийн метилжилтийн хэв маяг нь хүрээлэн буй орчны стрессийн хариу урвалыг тусгаж, олон үе дамжин үргэлжилдэг болохыг харуулсан. Тиймээс энэ нь уур амьсгалын өөрчлөлт эсвэл бохирдуулагч бодист өртсөний дараа хариу үйлдлийг зохицуулах үндсэн механизмын талаар үнэ цэнэтэй ойлголт өгөх боломжтой [87]. Гэсэн хэдий ч LB-ийн хэрэглээ хязгаарлагдмал биш юм. Энэ нь экосистемд индикатор зүйлийн оршихуйг шаарддаг гэж хэлэх нь илүүц биз. Дээр дурдсанчлан, өгөгдсөн экосистемийн биологийн олон янз байдлыг үнэлэхийн тулд LB ашиглах нь эх үүсвэрээс ДНХ-ийн хэлтэрхий байгаа эсэхийг харгалзан үздэг хатуу биоинформатикийн шугам хоолой шаарддаг. Өөр нэг томоохон асуудал бол далайн зүйлийн лавлагаа геномын бэлэн байдал юм. Далайн хөхтөн амьтдын геномын төсөл болон саяхан байгуулагдсан Fish10k төсөл [88] зэрэг санаачилгууд ирээдүйд ийм дүн шинжилгээ хийхэд дөхөм болно гэж найдаж байна. LB концепцийг далайн шүүлтүүрээр хооллодог организмд хэрэглэх нь дарааллын технологийн хамгийн сүүлийн үеийн дэвшилтэй нийцэж байгаа тул хүрээлэн буй орчны стрессийн хариуд далайн амьдрах орчны эрүүл мэндийн талаар чухал мэдээлэл өгөх олон ом биомаркеруудыг боловсруулахад тохиромжтой юм.
Геномын дарааллын өгөгдлийг NCBI дарааллын унших архивт https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 хаягаар Bioprojects SRR8924808 хаягаар хадгалсан болно.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Ж. Уур амьсгалын өөрчлөлтийн далайн амьдрал ба экосистемд үзүүлэх нөлөө. Коул Биологи. 2009; 19: P602–P614.
Гисси Э, Манеа Э, Мазарис А.Д., Фрасчетти С, Алпаниду В, Бевилаква С, нар. Уур амьсгалын өөрчлөлт болон бусад орон нутгийн стресс үүсгэгчдийн далайн орчинд үзүүлэх нөлөөллийг авч үзье. Ерөнхий шинжлэх ухааны орчин. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Гуравдугаар сарын нэгний шинжлэх ухаан. 2020;7:48.
Серонт Л, Никастро КР, Зарди ГИ, Гобервилл Э. Давтагдах дулааны стрессийн нөхцөлд дулаан тэсвэрлэлт буурсан нь цэнхэр хясааны зуны улиралд өндөр нас баралтыг тайлбарладаг. Шинжлэх ухааны тайлан 2019; 9:17498.
Фэй СБ, Сиепиелски АМ, Нуссле С, Сервантес-Йошида К, Хван ЖЛ, Хубер ЭР, нар. Амьтны үхлийн давтамж, шалтгаан, цар хүрээний сүүлийн үеийн өөрчлөлтүүд. АНУ-ын Шинжлэх Ухааны Үндэсний Академийн эмхэтгэл. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Олон төрлийн өвөрмөц бус эмгэг төрүүлэгчид нь Pinna nobilis-ийн үхэлд хүргэж болзошгүй юм. Амьдрал. 2020;10:238.
Брэдли М, Коутс СЖ, Женкинс Э, О'Хара ТМ. Уур амьсгалын өөрчлөлт нь Арктикийн зооноз өвчинд үзүүлэх болзошгүй нөлөө. Олон улсын Циркумполяр эрүүл мэндийн сэтгүүл. 2005; 64:468–77.
Бейер Ж., Грин Баруун Хойд, Брукс С., Аллан ИЖ, Руус А., Гомез Т. нар. Цэнхэр хясаа (Mytilus edulis spp.) нь эргийн бохирдлын хяналт шинжилгээнд дохионы организм болгон ашигладаг: тойм. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравенья Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Хорт хавдрын эмчилгээнд шингэн биопсийн нэгдэл. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Ж.К.М., Масси К., Гарсиа-Корбачо Ж., Моулиере Ф., Брентон Ж.Д., Калдас К., нар. Шингэн биопсийн боловсорч гүйцэх нь: Хавдрын ДНХ-ийн эргэлтийг зөвшөөрдөг. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандел П., Метайс П. Хүний сийвэн дэх нуклейн хүчил. Soc Biol охин компаниудын хурлын тэмдэглэл. 1948; 142:241-3.
Бронхорст АЖ, Унгерер В, Холденридер С. Хорт хавдрын эмчилгээний молекулын маркер болох эсгүй ДНХ-ийн шинэ үүрэг. Биомолын шинжилгээний тоон үзүүлэлт. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж ГВ, Жеффри С.С. Шингэн биопси эмнэлэгт нэвтэрч байна - хэрэгжилтийн асуудлууд ба ирээдүйн бэрхшээлүүд. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Саржент ИЛ., Редман К.В. болон бусад. Ургийн ДНХ нь эхийн сийвэн болон ийлдсэнд байдаг. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррэй МН, Вонг РЖ, Шоу ГМ, Стивенсон ДК, Квэйк СР Жирэмсний үед эмэгтэйчүүдийн цусан дахь эсийн гаднах РНХ-г ашиглан жирэмсний явц болон түүний хүндрэлийг судлах нь. Допедиатик. 2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеовн П, Шютц Э, Бек Ж, Стегбауэр Ж, нар. Шингэн биопси: бөөрний залгаас дахь аллогенийн гэмтэлийг илрүүлэхэд донорын эсгүй ДНХ-ийг ашигладаг. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Жуан Ф.К., Ло Ю.М. Жирэмсний өмнөх оношлогооны инноваци: эхийн сийвэнгийн геномын дарааллыг тогтоох. Анна MD. 2016;67:419-32.
Гу В, Дэн Х, Ли М, Суку ЮД, Аревало С, Страйк Д, нар. Халдвар авсан биеийн шингэнийг дараагийн үеийн метагеномик дарааллаар нь хурдан илрүүлэх. Nat Medicine. 2021;27:115-24.