Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Biopsy ya kioevu (LB) ni dhana inayopata umaarufu haraka katika uwanja wa biomedical. Dhana hii inategemea zaidi kugundua vipande vya DNA ya nje inayozunguka (ccfDNA), ambayo hutolewa zaidi kama vipande vidogo baada ya kifo cha seli katika tishu mbalimbali. Sehemu ndogo ya vipande hivi hutoka kwa tishu au viumbe vya kigeni (vya kigeni). Katika kazi ya sasa, tumetumia dhana hii kwa kome, spishi ya walinzi inayojulikana kwa uwezo wao mkubwa wa kuchuja maji ya bahari. Tunatumia uwezo wa kome kufanya kazi kama vichujio vya asili ili kunasa vipande vya DNA vya mazingira kutoka vyanzo mbalimbali ili kutoa taarifa kuhusu bioanuwai ya mifumo ikolojia ya pwani ya bahari. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa hemolymph ya kome ina vipande vya DNA ambavyo hutofautiana sana kwa ukubwa, kuanzia 1 hadi 5 kb. Mfuatano wa bunduki ulionyesha kuwa idadi kubwa ya vipande vya DNA vina asili ya vijidudu vya kigeni. Miongoni mwao, tulipata vipande vya DNA kutoka kwa bakteria, archaea, na virusi, ikiwa ni pamoja na virusi vinavyojulikana kuambukiza aina mbalimbali za wenyeji ambao hupatikana katika mifumo ikolojia ya bahari ya pwani. Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kwamba dhana ya LB inayotumika kwa kome inawakilisha chanzo tajiri cha maarifa lakini ambacho hakijachunguzwa kuhusu utofauti wa vijidudu katika mifumo ikolojia ya pwani ya baharini.
Athari za mabadiliko ya hali ya hewa (CC) kwenye bioanuwai ya mifumo ikolojia ya baharini ni eneo linalokua kwa kasi la utafiti. Ongezeko la joto duniani halisababishi tu mikazo muhimu ya kisaikolojia, lakini pia husukuma mipaka ya mageuko ya utulivu wa joto wa viumbe vya baharini, na kuathiri makazi ya spishi kadhaa, na kuwafanya watafute hali nzuri zaidi [1, 2]. Mbali na kuathiri bioanuwai ya metazoa, CC huvuruga usawa dhaifu wa mwingiliano wa viumbe hai na vijidudu. Dysbacteriosis hii ya vijidudu inaleta tishio kubwa kwa mifumo ikolojia ya baharini kwani inafanya viumbe vya baharini kuathiriwa zaidi na vimelea vya kuambukiza [3, 4]. Inaaminika kuwa SS ina jukumu muhimu katika vifo vya wingi, ambalo ni tatizo kubwa kwa usimamizi wa mifumo ikolojia ya baharini duniani [5, 6]. Hili ni suala muhimu kutokana na athari za kiuchumi, kiikolojia na lishe za spishi nyingi za baharini. Hii ni kweli hasa kwa bivalves wanaoishi katika maeneo ya ncha, ambapo athari za CK ni za haraka na kali zaidi [6, 7]. Kwa kweli, bivalves kama vile Mytilus spp. hutumika sana kufuatilia athari za CC kwenye mifumo ikolojia ya baharini. Haishangazi kwamba idadi kubwa ya biomarkers zimetengenezwa ili kufuatilia afya zao, mara nyingi kwa kutumia mbinu ya ngazi mbili inayohusisha biomarkers zinazofanya kazi kulingana na shughuli za kimeng'enya au kazi za seli kama vile uhai wa seli na shughuli ya phagocytic [8]. Mbinu hizi pia zinajumuisha kipimo cha mkusanyiko wa viashiria maalum vya shinikizo vinavyojikusanya katika tishu laini baada ya kunyonya kiasi kikubwa cha maji ya bahari. Hata hivyo, uwezo mkubwa wa kuchuja na mfumo wa mzunguko wa damu wa bivalves hutoa fursa ya kutengeneza biomarkers mpya za hemolymph kwa kutumia dhana ya biopsy ya kioevu (LB), mbinu rahisi na isiyovamia sana ya usimamizi wa mgonjwa. sampuli za damu [9, 10]. Ingawa aina kadhaa za molekuli zinazozunguka zinaweza kupatikana katika LB ya binadamu, dhana hii inategemea hasa uchambuzi wa mpangilio wa DNA wa vipande vya DNA ya nje ya seli (ccfDNA) vinavyozunguka katika plasma. Kwa kweli, uwepo wa DNA inayozunguka katika plasma ya binadamu umejulikana tangu katikati ya karne ya 20 [11], lakini ni katika miaka ya hivi karibuni tu ambapo ujio wa mbinu za mpangilio wa juu wa matokeo umesababisha utambuzi wa kimatibabu kulingana na ccfDNA. Uwepo wa vipande hivi vya DNA vinavyozunguka unatokana na sehemu ya kutolewa kwa DNA ya jenomu (nyuklia na mitochondria) baada ya kifo cha seli. Kwa watu wenye afya njema, mkusanyiko wa ccfDNA kwa kawaida huwa chini (<10 ng/mL) lakini unaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wanaougua magonjwa mbalimbali au wanaokabiliwa na msongo wa mawazo, na kusababisha uharibifu wa tishu. Kwa watu wenye afya njema, mkusanyiko wa ccfDNA kwa kawaida huwa chini (<10 ng/mL) lakini unaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wanaougua magonjwa mbalimbali au wanaokabiliwa na msongo wa mawazo, na kusababisha uharibifu wa tishu. Уздоровых людей концентрация вккДНК katika норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться katika 5–10 подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Kwa watu wenye afya njema, mkusanyiko wa cccDNA kwa kawaida huwa chini (<10 ng/mL), lakini unaweza kuongezeka kwa mara 5-10 kwa wagonjwa wenye magonjwa mbalimbali au walio chini ya msongo wa mawazo unaosababisha uharibifu wa tishu.在健康个体中，ccfDNA的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患1者倍，从而导致组织损伤.2 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены katika 5-10 раз у пациентонтовый стрессом, что приводит к повреждению тканей. Viwango vya ccfDNA kwa kawaida huwa chini (<10 ng/ml) kwa watu wenye afya njema, lakini vinaweza kuongezeka mara 5-10 kwa wagonjwa walio na magonjwa au msongo wa mawazo mbalimbali, na kusababisha uharibifu wa tishu.Ukubwa wa vipande vya ccfDNA hutofautiana sana, lakini kwa kawaida huanzia bp 150 hadi 200. [12]. Uchambuzi wa ccfDNA inayotokana na yenyewe, yaani ccfDNA kutoka kwa seli za kawaida au zilizobadilishwa, unaweza kutumika kugundua mabadiliko ya kijenetiki na epigenetic yaliyopo katika jenomu ya nyuklia na/au mitochondrial, na hivyo kuwasaidia madaktari kuchagua tiba maalum zinazolengwa na molekuli [13]. Hata hivyo, ccfDNA inaweza kupatikana kutoka vyanzo vya kigeni kama vile ccfDNA kutoka kwa seli za fetasi wakati wa ujauzito au kutoka kwa viungo vilivyopandikizwa [14,15,16,17]. ccfDNA pia ni chanzo muhimu cha taarifa kwa ajili ya kugundua uwepo wa asidi za kiini za wakala wa kuambukiza (kigeni), ambayo inaruhusu ugunduzi usio vamizi wa maambukizi yaliyoenea ambayo hayajatambuliwa na tamaduni za damu, na kuepuka biopsy vamizi ya tishu zilizoambukizwa [18]. Uchunguzi wa hivi karibuni umeonyesha kuwa damu ya binadamu ina chanzo kikubwa cha taarifa ambacho kinaweza kutumika kutambua vimelea vya virusi na bakteria, na kwamba karibu 1% ya ccfDNA inayopatikana katika plasma ya binadamu ina asili ya kigeni [19]. Tafiti hizi zinaonyesha kwamba bioanuwai ya microbiome inayozunguka ya kiumbe inaweza kutathminiwa kwa kutumia uchambuzi wa ccfDNA. Hata hivyo, hadi hivi karibuni, dhana hii ilitumika pekee kwa wanadamu na, kwa kiwango kidogo, kwa wanyama wengine wenye uti wa mgongo [20, 21].
Katika karatasi ya sasa, tunatumia uwezo wa LB kuchambua ccfDNA ya Aulacomya atra, spishi ya kusini inayopatikana sana katika Visiwa vya Kerguelen vilivyo chini ya Antaktiki, kundi la visiwa vilivyo juu ya uwanda mkubwa ulioundwa miaka milioni 35 iliyopita. Mlipuko wa volkano. Kwa kutumia mfumo wa majaribio wa ndani ya vitro, tuligundua kuwa vipande vya DNA katika maji ya bahari huchukuliwa haraka na kome na kuingia kwenye sehemu ya hemolymph. Mfuatano wa bunduki umeonyesha kuwa hemolymph ya kome ccfDNA ina vipande vya DNA vya asili yake na visivyo vya yenyewe, ikiwa ni pamoja na bakteria wa kutegemeana na vipande vya DNA kutoka kwa biome zinazofanana na mifumo ikolojia ya pwani ya bahari ya volkeno baridi. Hemolymph ccfDNA pia ina mfuatano wa virusi unaotokana na virusi vyenye safu tofauti za mwenyeji. Pia tulipata vipande vya DNA kutoka kwa wanyama wenye seli nyingi kama vile samaki wa mifupa, anemoni za baharini, mwani na wadudu. Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kuwa dhana ya LB inaweza kutumika kwa mafanikio kwa wanyama wasio na uti wa mgongo wa baharini ili kutoa mkusanyiko mzuri wa kijenomu katika mifumo ikolojia ya baharini.
Samaki wakubwa (urefu wa milimita 55-70) Mytilus platensis (M. platensis) na Aulacomya atra (A. atra) walikusanywa kutoka kwenye mwamba wa Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Visiwa vya Kerguelen mnamo Desemba 2018. Samaki wengine wakubwa wa bluu (Mytilus spp.) walipatikana kutoka kwa muuzaji wa kibiashara (PEI Mussel King Inc., Kisiwa cha Prince Edward, Kanada) na kuwekwa kwenye tanki lenye hewa linalodhibitiwa na halijoto (4°C) lenye lita 10–20 za chumvi bandia ya 32‰. (chumvi bandia ya baharini Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, Marekani). Kwa kila jaribio, urefu na uzito wa magamba ya mtu binafsi ulipimwa.
Itifaki ya ufikiaji wazi ya bure ya programu hii inapatikana mtandaoni (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kwa ufupi, hemolymph ya LB ilikusanywa kutoka kwa misuli ya abductor kama ilivyoelezwa [22]. Hemolymph ilifafanuliwa kwa kutumia centrifugation kwa 1200×g kwa dakika 3, supernatant iligandishwa (-20°C) hadi itumike. Kwa ajili ya kutenga na kusafisha cfDNA, sampuli (1.5-2.0 ml) ziliyeyushwa na kusindika kwa kutumia NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) kulingana na maagizo ya mtengenezaji. ccfDNA ilihifadhiwa kwa -80°C hadi uchambuzi zaidi. Katika baadhi ya majaribio, ccfDNA ilitengwa na kusafishwa kwa kutumia QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA iliyosafishwa ilipimwa kwa kutumia kipimo cha kawaida cha PicoGreen. Usambazaji wa vipande vya ccfDNA iliyotengwa ulichambuliwa kwa kutumia elektrophoresis ya kapilari kwa kutumia kichambuzi cha kibiolojia cha Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) kwa kutumia Kitengo cha DNA cha Unyeti wa Juu. Jaribio lilifanywa kwa kutumia 1 µl ya sampuli ya ccfDNA kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Kwa mpangilio wa vipande vya hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) aliandaa maktaba za bunduki kwa kutumia kifaa cha Illumina DNA Mix cha kifaa cha Illumina MiSeq PE75. Adapta ya kawaida (BioO) ilitumika. Faili mbichi za data zinapatikana kutoka kwa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 na SRR8924809). Ubora wa msingi wa usomaji ulipimwa kwa kutumia FastQC [23]. Trimmomatic [24] imetumika kwa ajili ya kukata adapta na usomaji duni wa ubora. Usomaji wa bunduki zenye ncha zilizounganishwa ziliunganishwa FLASH katika usomaji mrefu zaidi wa moja kwa moja na mwingiliano wa chini wa bp 20 ili kuepuka kutolingana [25]. Usomaji uliounganishwa uliandikwa kwa kutumia BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya Uainishaji wa NCBI ya bivalve (thamani ya e < 1e−3 na homolojia ya 90%), na ufichaji wa mfuatano wa ugumu mdogo ulifanywa kwa kutumia VUMBU [26]. Usomaji uliounganishwa uliandikwa kwa kutumia BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya Uainishaji wa NCBI ya bivalve (thamani ya e < 1e−3 na homolojia ya 90%), na ufichaji wa mfuatano wa ugumu mdogo ulifanywa kwa kutumia VUMBU [26]. Maelezo ya BLASTN yamechangiwa na BLASTN na BLASTN kwa kutumia данных таксономии двустворчатых моллюсков% NCBI -30% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием VUMBI [26]. Usomaji uliounganishwa uliandikwa kwa kutumia BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya uainishaji wa NCBI bivalve (thamani ya e < 1e-3 na homolojia ya 90%), na ufichaji wa mfuatano wenye utata mdogo ulifanywa kwa kutumia VUMBI [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 na 90% 同源） 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使平强 [26] . .Maelezo ya BLASTN yamechangiwa na BLASTN na BLASTN kwa ajili ya matumizi ya kila siku <9% NCBI гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием VUMBI [26]. Usomaji uliounganishwa uliandikwa kwa kutumia BLASTN kwa kutumia hifadhidata ya taksonomiki ya NCBI bivalve taxonomic (thamani ya e <1e-3 na homolojia ya 90%), na ufichaji wa mfuatano wenye utata mdogo ulifanywa kwa kutumia VUMBI [26].Visomo viligawanywa katika makundi mawili: yanayohusiana na mfuatano wa bivalve (hapa huitwa usomaji wa kibinafsi) na yasiyohusiana (yasiyo ya usomaji wa kibinafsi). Makundi mawili yalikusanywa tofauti kwa kutumia MEGAHIT ili kutoa mikusanyiko [27]. Wakati huo huo, usambazaji wa taksonomiki wa visomo vya viumbe hai vya kigeni uliainishwa kwa kutumia Kraken2 [28] na kuwakilishwa kimchoro na chati ya pai ya Krona kwenye Galaxy [29, 30]. Kilomita bora zaidi zilibainishwa kuwa kilomita-59 kutoka kwa majaribio yetu ya awali. Viunganishi vya kibinafsi vilitambuliwa kwa kuoanishwa na BLASTN (hifadhidata ya bivalve NCBI, thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%) kwa maelezo ya mwisho. Viunganishi vya kibinafsi vilitambuliwa kwa kuoanishwa na BLASTN (hifadhidata ya bivalve NCBI, thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%) kwa maelezo ya mwisho. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, 1мо6010 e) для окончательной аннотации. Viunganishi vya kibinafsi vilitambuliwa kwa kulinganisha dhidi ya BLASTN (hifadhidata ya NCBI bivalve, thamani ya e <1e-10 na homolojia ya 60%) kwa maelezo ya mwisho.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐來识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления kwa BLASTN (baada ya данных NCBI ND значение e <1e-10 na гомология 60%). Viunganishi vya kibinafsi vilitambuliwa kwa ajili ya ufafanuzi wa mwisho kwa kulinganisha dhidi ya BLASTN (hifadhidata ya NCBI bivalve, thamani ya e <1e-10 na homolojia ya 60%). Sambamba, mikusanyiko ya vikundi visivyo vya kibinafsi iliandikwa kwa kutumia BLASTN (hifadhidata ya nt NCBI, thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%). Sambamba, mikusanyiko ya vikundi visivyo vya kibinafsi iliandikwa kwa kutumia BLASTN (hifadhidata ya nt NCBI, thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 na гомология 60%). Sambamba na hilo, makundi ya kigeni yaliandikwa kwa kutumia BLASTN (hifadhidata ya NT NCBI, thamani ya e <1e-10 na homolojia ya 60%).平行地, 用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地, 用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, знагогние e и 1e-1%). Sambamba na hilo, mikusanyiko ya vikundi visivyo vya kibinafsi iliandikwa kwa kutumia BLASTN (hifadhidata ya nt NCBI, thamani ya e <1e-10 na homolojia ya 60%). BLASTX pia ilifanywa kwenye viunganishi visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za protini ya nr na RefSeq NCBI (thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%). BLASTX pia ilifanywa kwenye viunganishi visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za protini ya nr na RefSeq NCBI (thamani ya e < 1e−10 na homolojia ya 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и 6%). BLASTX pia ilifanywa kwenye viunganishi visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za protini za nr na RefSeq NCBI (thamani ya e < 1e-10 na homolojia ya 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием bila данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 na 60%). BLASTX pia ilifanywa kwenye viunganishi visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za protini za nr na RefSeq NCBI (thamani ya e <1e-10 na homolojia ya 60%).Makundi ya BLASTN na BLASTX ya yasiyo ya kujiunganisha yanawakilisha makundi ya mwisho (tazama faili ya ziada).
Vipimo vya awali vilivyotumika kwa PCR vimeorodheshwa katika Jedwali S1. Polima ya Taq DNA (Bio Basic Canada, Markham, ON) ilitumika kukuza jeni lengwa la ccfDNA. Hali zifuatazo za mmenyuko zilitumika: denaturation katika 95°C kwa dakika 3, 95°C kwa dakika 1, kuweka joto la annealing kwa dakika 1, urefu katika 72°C kwa dakika 1, mizunguko 35, na hatimaye 72°C ndani ya dakika 10. . Bidhaa za PCR zilitenganishwa kwa electrophoresis katika jeli za agarose (1.5%) zenye SYBRTM Salama DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) katika 95 V.
Kome (Mytilus spp.) walizoea katika maji ya bahari yenye oksijeni ya mililita 500 (32 PSU) kwa saa 24 kwa joto la 4°C. DNA ya plasmid iliyo na kiingilio kinachosimba mfuatano wa cDNA ya binadamu galectin-7 (nambari ya upatanishi ya NCBI L07769) iliongezwa kwenye chupa kwa mkusanyiko wa mwisho wa 190 μg/μl. Kome waliowekwa chini ya hali sawa bila kuongezwa kwa DNA walikuwa wadhibiti. Tangi la tatu la kudhibiti lilikuwa na DNA bila kome. Ili kufuatilia ubora wa DNA katika maji ya bahari, sampuli za maji ya bahari (20 μl; marudio matatu) zilichukuliwa kutoka kwa kila tanki kwa wakati ulioonyeshwa. Kwa ufuatiliaji wa DNA ya plasmid, kome za LB zilivunwa kwa nyakati zilizoonyeshwa na kuchambuliwa na qPCR na ddPCR. Kutokana na kiwango cha juu cha chumvi cha maji ya bahari, aliquots zilipunguzwa katika maji ya ubora wa PCR (1:10) kabla ya majaribio yote ya PCR.
PCR ya matone ya kidijitali (ddPCR) ilifanywa kwa kutumia itifaki ya BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Tumia wasifu wa halijoto ili kubaini halijoto bora zaidi (Jedwali S1). Matone yalitolewa kwa kutumia jenereta ya matone ya QX200 (BioRad). ddPCR ilifanywa kama ifuatavyo: 95°C kwa dakika 5, mizunguko 50 ya 95°C kwa sekunde 30 na halijoto fulani ya annealing kwa dakika 1 na 72°C kwa sekunde 30, 4°C kwa dakika 5 na 90°C ndani ya dakika 5. Idadi ya matone na athari chanya (idadi ya nakala/µl) zilipimwa kwa kutumia kisomaji matone cha QX200 (BioRad). Sampuli zenye matone chini ya 10,000 zilikataliwa. Udhibiti wa ruwaza haukufanywa kila wakati ddPCR ilipoendeshwa.
qPCR ilifanywa kwa kutumia Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) na vitangulizi maalum vya LGALS7. PCR zote za kiasi zilifanywa kwa µl 20 kwa kutumia QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR ilianzishwa kwa kuangushwa kwa dakika 15 kwa joto la 95°C ikifuatiwa na mizunguko 40 kwa joto la 95°C kwa sekunde 10 na kwa joto la 60°C kwa sekunde 60 kwa mkusanyiko mmoja wa data. Mikunjo ya kuyeyuka ilitengenezwa kwa kutumia vipimo mfululizo kwa joto la 95°C kwa sekunde 5, 65°C kwa sekunde 60, na 97°C mwishoni mwa qPCR. Kila qPCR ilifanywa kwa nakala tatu, isipokuwa sampuli za udhibiti.
Kwa kuwa kome wanajulikana kwa kiwango chao cha juu cha kuchuja, kwanza tulichunguza kama wangeweza kuchuja na kuhifadhi vipande vya DNA vilivyopo kwenye maji ya bahari. Pia tulikuwa na hamu ya kujua kama vipande hivi hujikusanya katika mfumo wao wa limfu ulio wazi nusu. Tulitatua suala hili kwa majaribio kwa kufuatilia hatima ya vipande vya DNA vinavyoyeyuka vilivyoongezwa kwenye matangi ya kome ya bluu. Ili kurahisisha ufuatiliaji wa vipande vya DNA, tulitumia DNA ya plasmidi ya kigeni (sio yenyewe) iliyo na jeni la galectin-7 la binadamu. ddPCR hufuatilia vipande vya DNA ya plasmidi katika maji ya bahari na kome. Matokeo yetu yanaonyesha kwamba ikiwa kiasi cha vipande vya DNA katika maji ya bahari kilibaki sawa kwa muda (hadi siku 7) bila kome, basi mbele ya kome kiwango hiki kilitoweka karibu kabisa ndani ya saa 8 (Mchoro 1a,b). Vipande vya DNA ya nje viligunduliwa kwa urahisi ndani ya dakika 15 katika umajimaji wa ndani ya vali na hemolymph (Mchoro 1c). Vipande hivi bado vinaweza kugunduliwa hadi saa 4 baada ya kuambukizwa. Shughuli hii ya kuchuja kuhusiana na vipande vya DNA inafanana na shughuli ya kuchuja ya bakteria na mwani [31]. Matokeo haya yanaonyesha kwamba kome wanaweza kuchuja na kukusanya DNA ya kigeni katika sehemu zao za umajimaji.
Viwango vya DNA ya plasmidi katika maji ya bahari mbele ya (A) au kutokuwepo (B) kwa kome, hupimwa kwa ddPCR. Katika A, matokeo yanaonyeshwa kama asilimia, huku mipaka ya visanduku ikiwakilisha asilimia ya 75 na 25. Mkunjo wa logarithmiki uliowekwa unaonyeshwa kwa rangi nyekundu, na eneo lililofunikwa kwa kijivu linawakilisha muda wa kujiamini wa 95%. Katika B, mstari mwekundu unawakilisha wastani na mstari wa bluu unawakilisha muda wa kujiamini wa 95% kwa mkusanyiko. C Mkusanyiko wa DNA ya plasmidi katika hemolymph na maji ya valvular ya kome kwa nyakati tofauti baada ya kuongezwa kwa DNA ya plasmidi. Matokeo yanawasilishwa kama nakala kamili zilizogunduliwa/mL (±SE).
Kisha, tulichunguza asili ya ccfDNA katika kome zilizokusanywa kutoka kwenye vitanda vya kome kwenye Visiwa vya Kerguelen, kundi la visiwa vilivyo mbali lenye ushawishi mdogo wa kibinadamu. Kwa kusudi hili, cccDNA kutoka hemolymph za kome ilitengwa na kusafishwa kwa njia zinazotumika sana kusafisha cccDNA ya binadamu [32, 33]. Tuligundua kuwa wastani wa viwango vya hemolymph ccfDNA katika kome viko katika mikrogramu za chini kwa kila ml ya hemolymph (tazama Jedwali S2, Taarifa za Ziada). Kiwango hiki cha viwango ni kikubwa zaidi kuliko kwa watu wenye afya njema (nanogramu za chini kwa kila mililita), lakini katika hali nadra, kwa wagonjwa wa saratani, kiwango cha ccfDNA kinaweza kufikia mikrogramu kadhaa kwa kila mililita [34, 35]. Uchambuzi wa usambazaji wa ukubwa wa hemolymph ccfDNA ulionyesha kuwa vipande hivi hutofautiana sana kwa ukubwa, kuanzia 1000 bp hadi 1000 bp. hadi 5000 bp (Mchoro 2). Matokeo kama hayo yalipatikana kwa kutumia Kifaa cha Upelelezi cha QIAamp chenye msingi wa silika, mbinu inayotumika sana katika sayansi ya uchunguzi wa kisayansi ili kutenganisha na kusafisha DNA ya jenomu haraka kutoka kwa sampuli za DNA zenye viwango vya chini, ikiwa ni pamoja na ccfDNA [36].
Kielelezo cha ccfDNA electrophoregramu ya hemolymph ya kome. Imetolewa kwa kutumia NucleoSnap Plasma Kit (juu) na Kielelezo cha Mchunguzi wa DNA cha QIAmp. Kielelezo cha B cha violin kinachoonyesha usambazaji wa viwango vya hemolymph ccfDNA (±SE) katika kome. Mistari nyeusi na nyekundu inawakilisha robo ya wastani na ya kwanza na ya tatu, mtawalia.
Takriban 1% ya ccfDNA kwa binadamu na nyani ina chanzo kigeni [21, 37]. Kwa kuzingatia mfumo wa mzunguko wa damu wa bivalves, maji ya bahari yenye vijidudu vingi, na usambazaji wa ukubwa wa ccfDNA ya kome, tulidhani kwamba hemolymph ccfDNA ya kome inaweza kuwa na dimbwi kubwa na tofauti la DNA ya vijidudu. Ili kujaribu dhana hii, tulipanga mfuatano wa hemolymph ccfDNA kutoka kwa sampuli za atra za Aulacomya zilizokusanywa kutoka Visiwa vya Kerguelen, na kutoa zaidi ya usomaji milioni 10, 97.6% kati ya hizo zilifaulu udhibiti wa ubora. Usomaji huo kisha uliainishwa kulingana na vyanzo vya kibinafsi na visivyo vya kibinafsi kwa kutumia hifadhidata za BLASTN na NCBI bivalve (Mchoro S1, Taarifa ya Ziada).
Kwa binadamu, DNA ya nyuklia na mitochondrial inaweza kutolewa kwenye damu [38]. Hata hivyo, katika utafiti huu, haikuwezekana kuelezea kwa undani DNA ya jenomu ya nyuklia ya kome, ikizingatiwa kwamba jenomu ya A. atra haijapangwa au kuelezewa. Hata hivyo, tuliweza kutambua vipande kadhaa vya ccfDNA vya asili yetu wenyewe kwa kutumia maktaba ya bivalve (Mchoro S2, Taarifa za Ziada). Pia tulithibitisha uwepo wa vipande vya DNA vya asili yetu wenyewe kwa kuongeza PCR kwa jeni hizo za A. atra zilizopangwa (Mchoro 3). Vile vile, ikizingatiwa kwamba jenomu ya mitochondrial ya A. atra inapatikana katika hifadhidata za umma, mtu anaweza kupata ushahidi wa uwepo wa vipande vya ccfDNA vya mitochondrial katika hemolymph ya A. atra. Uwepo wa vipande vya DNA vya mitochondrial ulithibitishwa na kuongeza PCR (Mchoro 3).
Jeni mbalimbali za mitochondrial zilikuwepo katika hemolimfu ya A. atra (nukta nyekundu - nambari ya hisa: SRX5705969) na M. platensis (nukta za bluu - nambari ya hisa: SRX5705968) iliyokuzwa na PCR. Mchoro uliorekebishwa kutoka Breton et al., 2011 B Upanuzi wa supernatant ya hemolimfu kutoka A. atra Imehifadhiwa kwenye karatasi ya FTA. Tumia ngumi ya 3 mm kuongeza moja kwa moja kwenye mirija ya PCR iliyo na mchanganyiko wa PCR.
Kwa kuzingatia kiwango kikubwa cha vijidudu katika maji ya bahari, mwanzoni tulilenga katika uainishaji wa mfuatano wa DNA ya vijidudu katika hemolymph. Ili kufanya hivyo, tunatumia mikakati miwili tofauti. Mkakati wa kwanza ulitumia Kraken2, mpango wa uainishaji wa mfuatano unaotegemea algoriti ambao unaweza kutambua mfuatano wa vijidudu kwa usahihi unaofanana na BLAST na zana zingine [28]. Zaidi ya usomaji 6719 ulibainika kuwa wa asili ya bakteria, huku 124 na 64 zikitoka kwa archaea na virusi, mtawalia (Mchoro 4). Vipande vya DNA vya bakteria vilivyo vingi zaidi vilikuwa Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), na Bacteroidetes (17%) (Mchoro 4a). Usambazaji huu unaendana na tafiti za awali za microbiome ya kome la bluu la baharini [39, 40]. Gammaproteobacteria walikuwa kundi kuu la Proteobacteria (44%), ikiwa ni pamoja na Vibrionales nyingi (Mchoro 4b). Mbinu ya ddPCR ilithibitisha uwepo wa vipande vya DNA ya Vibrio katika ccfDNA ya A. atra hemolymph (Mchoro 4c) [41]. Ili kupata taarifa zaidi kuhusu asili ya bakteria ya ccfDNA, mbinu ya ziada ilichukuliwa (Mchoro S2, Taarifa za Ziada). Katika hali hii, visomo vilivyoingiliana vilikusanywa kama visomo vya pande mbili na viliainishwa kama vya nafsi (bivalves) au asili isiyo ya nafsi kwa kutumia BLASTN na thamani ya e ya 1e−3 na kipunguzo chenye homolojia ya >90%. Katika hali hii, visomo vilivyoingiliana vilikusanywa kama visomo vya pande mbili na viliainishwa kama vya nafsi (bivalves) au asili isiyo ya nafsi kwa kutumia BLASTN na thamani ya e ya 1e−3 na kipunguzo chenye homolojia ya >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами na были классифицированы как собственный мобильные чужие по происхождению с использованием BLASTN na значения e 1e-3 na отсечения с гомологией> 90%. Katika hali hii, usomaji unaoingiliana ulikusanywa kama usomaji wenye ncha mbili na uliainishwa kama asili (bivalve) au isiyo asili kwa kutumia thamani ya BLASTN na e ya 1e-3 na kukatwa kwa ulinganifu wa >90%.在這种情况下，重叠的读数组装為配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 zako na>90%同源性的截止值分类為自身（双壳类）或非自身來源.在 這 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 為 配 末端 读数 , 使用 使用 blastn na 1e-3 的 值% na > 90%自身 （双 壳类） 非 自身。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами na классифицированы как собственные (двустворство) несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN na 1e-3 na matokeo ya гомологии> 90%. Katika hali hii, usomaji unaoingiliana ulikusanywa kama usomaji wenye ncha mbili na kuainishwa kama ule wa kibinafsi (bivalve) au usio wa asili kwa kutumia thamani za e BLASTN na 1e-3 na kizingiti cha homolojia >90%.Kwa kuwa jenomu ya A. atra bado haijapangwa kwa mpangilio, tulitumia mkakati wa mkusanyiko mpya wa kikusanyaji cha MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Jumla ya viunganishi 147,188 vimetambuliwa kama tegemezi (bivalve) vya asili. Viunganishi hivi vililipuliwa kwa thamani ya kielektroniki ya 1e-10 kwa kutumia BLASTN na BLASTX. Mkakati huu ulituwezesha kutambua vipande 482 visivyo vya bivalve vilivyopo katika A. atra ccfDNA. Zaidi ya nusu (57%) ya vipande hivi vya DNA vilipatikana kutoka kwa bakteria, hasa kutoka kwa viunganishi vya gill, ikiwa ni pamoja na viunganishi vya sulfotrophic, na kutoka kwa viunganishi vya gill Solemya velum (Mchoro 5).
Wingi wa kiasi katika kiwango cha aina. B Utofauti wa vijidudu vya phyla mbili kuu (Firmicutes na Proteobacteria). Uongezaji wakilishi wa ddPCR C Vibrio spp. A. Vipande vya jeni la rRNA la 16S (bluu) katika hemolimfa tatu za atra.
Jumla ya viunganishi 482 vilivyokusanywa vilichambuliwa. Wasifu wa jumla wa usambazaji wa taksonomiki wa maelezo ya viunganishi vya metagenomiki (prokaryoti na yukariyoti). B Usambazaji wa kina wa vipande vya DNA vya bakteria vilivyotambuliwa na BLASTN na BLASTX.
Uchambuzi wa Kraken2 pia ulionyesha kwamba ccfDNA ya kome ilikuwa na vipande vya DNA vya kale, ikiwa ni pamoja na vipande vya DNA vya Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), na Thaurmarcheota (11%) (Mchoro 6a). Uwepo wa vipande vya DNA vilivyotokana na Euryarchaeota na Crenarchaeota, vilivyopatikana hapo awali katika jumuiya ya vijidudu vya kome wa California, haupaswi kuwa mshangao [42]. Ingawa Euryarchaeota mara nyingi huhusishwa na hali mbaya, sasa inatambulika kwamba Euryarchaeota na Crenarcheota ni miongoni mwa prokaryoti za kawaida katika mazingira ya cryogenic ya baharini [43, 44]. Uwepo wa vijidudu vya methanogenic katika kome haishangazi, kutokana na ripoti za hivi karibuni za uvujaji mkubwa wa methane kutoka kwa uvujaji wa chini kwenye Uwanda wa Kerguelen [45] na uwezekano wa uzalishaji wa methane ya vijidudu unaoonekana nje ya pwani ya Visiwa vya Kerguelen [46].
Kisha umakini wetu ukahamia kwenye usomaji kutoka kwa virusi vya DNA. Kwa kadri tunavyojua, huu ni utafiti wa kwanza usiolenga wa kiwango cha virusi vya kome. Kama ilivyotarajiwa, tulipata vipande vya DNA vya bakteriofagi (Caudovirales) (Mchoro 6b). Hata hivyo, DNA ya virusi inayopatikana zaidi hutoka kwenye filimbi ya virusi vya nucleocytovirus, pia inajulikana kama virusi vya DNA kubwa vya nyuklia (NCLDV), ambavyo vina jenomu kubwa zaidi kuliko virusi vyovyote. Ndani ya filimbi hii, mfuatano mwingi wa DNA ni wa familia za Mimimidoviridae (58%) na Poxviridae (21%), ambazo wenyeji wake wa asili ni pamoja na wanyama wenye uti wa mgongo na arthropodi, huku sehemu ndogo ya mfuatano huu wa DNA ikiwa ya mwani unaojulikana wa virusi. Huambukiza mwani wa yukariyoti wa baharini. Mfuatano huo pia ulipatikana kutoka kwa virusi vya Pandora, virusi vikubwa vyenye ukubwa mkubwa zaidi wa jenomu kuliko jenasi yoyote inayojulikana ya virusi. Cha kufurahisha ni kwamba, idadi ya wenyeji wanaojulikana kuwa wameambukizwa virusi, kama ilivyoamuliwa na mpangilio wa hemolymph ccfDNA, ilikuwa kubwa kiasi (Mchoro S3, Taarifa za Ziada). Inajumuisha virusi vinavyoambukiza wadudu kama vile Baculoviridae na Iridoviridae, pamoja na virusi vinavyoambukiza amoeba, mwani na wanyama wenye uti wa mgongo. Pia tulipata mfuatano unaolingana na jenomu ya Pithovirus sibericum. Virusi vya Pitovirus (pia vinajulikana kama "virusi vya zombie") vilitengwa kwa mara ya kwanza kutoka kwa permafrost yenye umri wa miaka 30,000 huko Siberia [47]. Kwa hivyo, matokeo yetu yanaendana na ripoti za awali zinazoonyesha kwamba sio spishi zote za kisasa za virusi hivi zimetoweka [48] na kwamba virusi hivi vinaweza kuwepo katika mifumo ikolojia ya baharini ya mbali ya subarctic.
Hatimaye, tulijaribu ili kuona kama tunaweza kupata vipande vya DNA kutoka kwa wanyama wengine wenye seli nyingi. Jumla ya viunganishi 482 vya kigeni vilitambuliwa na BLASTN na BLASTX vyenye maktaba za nt, nr na RefSeq (jenomu na protini). Matokeo yetu yanaonyesha kuwa miongoni mwa vipande vya kigeni vya ccfDNA ya wanyama wenye seli nyingi, DNA ya mifupa ya mifupa inatawala (Mchoro 5). Vipande vya DNA kutoka kwa wadudu na spishi zingine pia vimepatikana. Sehemu kubwa ya vipande vya DNA haijatambuliwa, labda kutokana na uwakilishi mdogo wa idadi kubwa ya spishi za baharini katika hifadhidata za jenomu ikilinganishwa na spishi za ardhini [49].
Katika karatasi ya sasa, tunatumia dhana ya LB kwa kome, tukisema kwamba mpangilio wa risasi wa hemolymph ccfDNA unaweza kutoa ufahamu kuhusu muundo wa mifumo ikolojia ya pwani ya baharini. Hasa, tuligundua kuwa 1) hemolymph ya kome ina viwango vya juu kiasi (viwango vya mikrogramu) vya vipande vya DNA vikubwa kiasi (~1-5 kb) vinavyozunguka; 2) vipande hivi vya DNA ni huru na havijitegemea 3) Miongoni mwa vyanzo vya kigeni vya vipande hivi vya DNA, tulipata DNA ya bakteria, ya kale na ya virusi, pamoja na DNA ya wanyama wengine wenye seli nyingi; 4) Mkusanyiko wa vipande hivi vya kigeni vya ccfDNA katika hemolymph hutokea haraka na huchangia shughuli ya kuchuja ya ndani ya kome. Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kwamba dhana ya LB, ambayo hadi sasa imetumika hasa katika uwanja wa biomedicine, ina chanzo tajiri lakini ambacho hakijachunguzwa cha maarifa ambacho kinaweza kutumika kuelewa vyema mwingiliano kati ya spishi za sentinel na mazingira yao.
Mbali na nyani, kutengwa kwa ccfDNA kumeripotiwa kwa mamalia, ikiwa ni pamoja na panya, mbwa, paka, na farasi [50, 51, 52]. Hata hivyo, kwa ufahamu wetu, utafiti wetu ndio wa kwanza kuripoti ugunduzi na mpangilio wa ccfDNA katika spishi za baharini zenye mfumo wazi wa mzunguko. Kipengele hiki cha anatomia na uwezo wa kuchuja wa kome vinaweza, angalau kwa sehemu, kuelezea sifa tofauti za ukubwa wa vipande vya DNA vinavyozunguka ikilinganishwa na spishi zingine. Kwa wanadamu, vipande vingi vya DNA vinavyozunguka katika damu ni vipande vidogo vyenye ukubwa kuanzia 150 hadi 200 bp. vyenye kilele cha juu cha 167 bp [34, 53]. Sehemu ndogo lakini muhimu ya vipande vya DNA ni kati ya 300 na 500 bp kwa ukubwa, na karibu 5% ni ndefu kuliko 900 bp. [54]. Sababu ya usambazaji huu wa ukubwa ni kwamba chanzo kikuu cha ccfDNA katika plasma hutokea kama matokeo ya kifo cha seli, ama kutokana na kifo cha seli au kutokana na necrosis ya seli za hematopoietic zinazozunguka kwa watu wenye afya njema au kutokana na apoptosis ya seli za uvimbe kwa wagonjwa wa saratani (inayojulikana kama DNA ya uvimbe inayozunguka). , ctDNA). Usambazaji wa ukubwa wa hemolymph ccfDNA ambao tulipata katika kome ulikuwa kati ya 1000 hadi 5000 bp, ikidokeza kwamba ccfDNA ya kome ina asili tofauti. Hii ni dhana ya kimantiki, kwa kuwa kome wana mfumo wa mishipa ulio wazi nusu na wanaishi katika mazingira ya majini ya baharini yenye viwango vya juu vya DNA ya jenomu ya vijidudu. Kwa kweli, majaribio yetu ya maabara kwa kutumia DNA ya nje yameonyesha kuwa kome hukusanya vipande vya DNA katika maji ya bahari, angalau baada ya saa chache huharibika baada ya kunyonya kwa seli na/au kutolewa na/au kuhifadhiwa katika mashirika mbalimbali. Kwa kuzingatia uhaba wa seli (prokaryotic na yukariyoti), matumizi ya sehemu za ndani ya vali yatapunguza kiasi cha ccfDNA kutoka kwa vyanzo vya kibinafsi na pia kutoka kwa vyanzo vya kigeni. Kwa kuzingatia umuhimu wa kinga ya asili ya bivalve na idadi kubwa ya fagocytes zinazozunguka, tulidhani zaidi kwamba hata ccfDNA ya kigeni imetajiriwa katika fagocytes zinazozunguka ambazo hukusanya DNA ya kigeni wakati wa kumeza vijidudu na/au uchafu wa seli. Kwa pamoja, matokeo yetu yanaonyesha kwamba bivalve hemolymph ccfDNA ni hazina ya kipekee ya taarifa za molekuli na huimarisha hadhi yao kama spishi ya mlinzi.
Takwimu zetu zinaonyesha kwamba mpangilio na uchambuzi wa vipande vya hemolymph ccfDNA vinavyotokana na bakteria vinaweza kutoa taarifa muhimu kuhusu mimea ya bakteria mwenyeji na bakteria waliopo katika mfumo ikolojia wa baharini unaozunguka. Mbinu za mpangilio wa risasi zimefichua mfuatano wa gill ya bakteria ya commensal A. atra ambayo ingekuwa imekosekana kama mbinu za kawaida za utambuzi wa rRNA ya 16S zingetumika, kutokana na upendeleo wa maktaba ya marejeleo. Kwa kweli, matumizi yetu ya data ya LB iliyokusanywa kutoka kwa M. platensis katika safu moja ya kome huko Kerguelen ilionyesha kuwa muundo wa symbionts za bakteria zinazohusiana na gill ulikuwa sawa kwa spishi zote mbili za kome (Mchoro S4, Taarifa ya Ziada). Kufanana huku kwa kome wawili tofauti kijenetiki kunaweza kuonyesha muundo wa jamii za bakteria katika amana baridi, za salfa, na za volkeno za Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Viwango vya juu vya vijidudu vinavyopunguza salfa vimeelezewa vyema wakati wa kuvuna kome kutoka maeneo ya pwani yenye bioturbated [59], kama vile pwani ya Port-au-France. Uwezekano mwingine ni kwamba mimea ya kome ya kawaida inaweza kuathiriwa na uenezaji mlalo [60, 61]. Utafiti zaidi unahitajika ili kubaini uhusiano kati ya mazingira ya baharini, uso wa sakafu ya bahari, na muundo wa bakteria wa kutegemeana katika kome. Masomo haya yanaendelea kwa sasa.
Urefu na mkusanyiko wa hemolymph ccfDNA, urahisi wake wa utakaso, na ubora wa juu ili kuruhusu mpangilio wa haraka wa risasi ni baadhi ya faida nyingi za kutumia kome ccfDNA kutathmini bioanuwai katika mifumo ikolojia ya pwani ya baharini. Mbinu hii inafaa sana kwa kuainisha jamii za virusi (viromes) katika mfumo ikolojia fulani [62, 63]. Tofauti na bakteria, akea, na yukariyoti, jenomu za virusi hazina jeni zilizohifadhiwa kifiziolojia kama vile mfuatano wa 16S. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa biopsy za kioevu kutoka kwa spishi za viashiria kama vile kome zinaweza kutumika kutambua idadi kubwa ya vipande vya virusi vya ccfDNA vinavyojulikana kuambukiza wenyeji ambao kwa kawaida huishi katika mifumo ikolojia ya baharini ya pwani. Hii inajumuisha virusi vinavyojulikana kuambukiza protozoa, arthropods, wadudu, mimea, na virusi vya bakteria (km, bacteriophages). Usambazaji kama huo ulipatikana tulipochunguza hemolymph ccfDNA virome ya kome ya bluu (M. platensis) iliyokusanywa katika safu moja ya kome huko Kerguelen (Jedwali S2, Maelezo ya Ziada). Mpangilio wa bunduki wa ccfDNA kwa kweli ni mbinu mpya inayopata kasi katika utafiti wa virome ya binadamu au spishi zingine [21, 37, 64]. Mbinu hii ni muhimu sana kwa kusoma virusi vya DNA vyenye nyuzi mbili, kwa kuwa hakuna jeni moja iliyohifadhiwa kati ya virusi vyote vya DNA vyenye nyuzi mbili, vinavyowakilisha kundi la virusi tofauti na pana zaidi huko Baltimore [65]. Ingawa virusi vingi hivi havijaainishwa na vinaweza kujumuisha virusi kutoka sehemu isiyojulikana kabisa ya ulimwengu wa virusi [66], tuligundua kuwa virome na safu za mwenyeji wa kome A. atra na M. platensis huanguka kati ya spishi hizo mbili. Vile vile (tazama mchoro S3, maelezo ya ziada). Kufanana huku si jambo la kushangaza, kwani kunaweza kuonyesha ukosefu wa uteuzi katika ufyonzaji wa DNA iliyopo katika mazingira. Masomo ya baadaye yanayotumia RNA iliyosafishwa kwa sasa yanahitajika ili kuainisha virome ya RNA.
Katika utafiti wetu, tulitumia bomba lenye ukali sana lililochukuliwa kutoka kwa kazi ya Kowarski na wenzake [37], ambao walitumia hatua mbili za kufuta usomaji na mikusanyiko iliyounganishwa kabla na baada ya mkusanyiko wa ccfDNA asilia, na kusababisha idadi kubwa ya usomaji usio na ramani. Kwa hivyo, hatuwezi kukataa kwamba baadhi ya usomaji huu usio na ramani bado unaweza kuwa na asili yao wenyewe, haswa kwa sababu hatuna jenomu ya marejeleo ya spishi hii ya kome. Pia tulitumia bomba hili kwa sababu tulikuwa na wasiwasi kuhusu chimera kati ya usomaji wa kibinafsi na usio na kibinafsi na urefu wa usomaji unaozalishwa na Illumina MiSeq PE75. Sababu nyingine ya usomaji mwingi usio na chati ni kwamba vijidudu vingi vya baharini, haswa katika maeneo ya mbali kama vile Kerguelen, havijafafanuliwa. Tulitumia Illumina MiSeq PE75, tukichukulia urefu wa vipande vya ccfDNA sawa na ccfDNA ya binadamu. Kwa tafiti zijazo, kutokana na matokeo yetu yanayoonyesha kuwa hemolymph ccfDNA ina usomaji mrefu zaidi kuliko binadamu na/au mamalia, tunapendekeza kutumia jukwaa la mfuatano linalofaa zaidi kwa vipande virefu vya ccfDNA. Zoezi hili litafanya iwe rahisi zaidi kutambua dalili zaidi kwa uchambuzi wa kina. Kupata mfuatano kamili wa jenomu ya nyuklia ya A. atra ambao haupatikani kwa sasa pia kutawezesha sana utofautishaji wa ccfDNA kutoka kwa vyanzo vya kibinafsi na visivyo vya kibinafsi. Kwa kuzingatia kwamba utafiti wetu umezingatia uwezekano wa kutumia dhana ya biopsy ya kioevu kwa kome, tunatumai kwamba kadri dhana hii inavyotumika katika utafiti wa siku zijazo, zana na mabomba mapya yatatengenezwa ili kuongeza uwezo wa njia hii kusoma utofauti wa vijidudu vya kome.
Kama alama ya kliniki isiyo vamizi, viwango vya juu vya ccfDNA katika plasma ya binadamu vinahusishwa na magonjwa mbalimbali, uharibifu wa tishu, na hali ya msongo wa mawazo [67,68,69]. Ongezeko hili linahusishwa na kutolewa kwa vipande vya DNA vya asili yake baada ya uharibifu wa tishu. Tulishughulikia suala hili kwa kutumia msongo wa joto kali, ambapo kome waliwekwa wazi kwa muda mfupi kwenye halijoto ya 30 °C. Tulifanya uchanganuzi huu kwenye aina tatu tofauti za kome katika majaribio matatu huru. Hata hivyo, hatukupata mabadiliko yoyote katika viwango vya ccfDNA baada ya msongo wa joto kali (tazama Mchoro S5, maelezo ya ziada). Ugunduzi huu unaweza kuelezea, angalau kwa sehemu, ukweli kwamba kome wana mfumo wa mzunguko wa damu ulio wazi nusu na hukusanya kiasi kikubwa cha DNA ya kigeni kutokana na shughuli zao za kuchuja nyingi. Kwa upande mwingine, kome, kama wanyama wengi wasio na uti wa mgongo, wanaweza kuwa sugu zaidi kwa uharibifu wa tishu unaosababishwa na msongo wa mawazo, na hivyo kupunguza kutolewa kwa ccfDNA katika hemolymph yao [70, 71].
Hadi sasa, uchambuzi wa DNA wa bioanuwai katika mifumo ikolojia ya majini umejikita zaidi kwenye metabarcoding ya DNA ya mazingira (eDNA). Hata hivyo, njia hii kwa kawaida huwa na kikomo katika uchambuzi wa bioanuwai wakati primers zinatumika. Matumizi ya mpangilio wa shotgun huepuka mapungufu ya PCR na uteuzi wa upendeleo wa seti za primers. Kwa hivyo, kwa namna fulani, mbinu yetu iko karibu na mbinu ya mpangilio wa eDNA Shotgun iliyotumika hivi karibuni, ambayo inaweza kupanga DNA iliyogawanyika moja kwa moja na kuchambua karibu viumbe vyote [72, 73]. Hata hivyo, kuna masuala kadhaa ya msingi ambayo yanatofautisha LB na mbinu za kawaida za eDNA. Bila shaka, tofauti kuu kati ya eDNA na LB ni matumizi ya wenyeji wa vichujio asilia. Matumizi ya spishi za baharini kama vile sifongo na bivalves (Dresseina spp.) kama kichujio asilia cha kusoma eDNA yameripotiwa [74, 75]. Hata hivyo, utafiti wa Dreissena ulitumia biopsies za tishu ambazo DNA ilitolewa. Uchambuzi wa ccfDNA kutoka LB hauhitaji biopsy ya tishu, vifaa maalum na wakati mwingine vya gharama kubwa na vifaa vinavyohusiana na eDNA au biopsy ya tishu. Kwa kweli, hivi majuzi tuliripoti kwamba ccfDNA kutoka LB inaweza kuhifadhiwa na kuchanganuliwa kwa usaidizi wa FTA bila kudumisha mnyororo baridi, ambayo ni changamoto kubwa kwa utafiti katika maeneo ya mbali [76]. Uchimbaji wa ccfDNA kutoka kwa biopsy ya kioevu pia ni rahisi na hutoa DNA ya hali ya juu kwa mpangilio wa risasi na uchambuzi wa PCR. Hii ni faida kubwa kutokana na baadhi ya mapungufu ya kiufundi yanayohusiana na uchambuzi wa eDNA [77]. Urahisi na gharama ya chini ya njia ya sampuli pia inafaa haswa kwa programu za ufuatiliaji wa muda mrefu. Mbali na uwezo wao mkubwa wa kuchuja, sifa nyingine inayojulikana ya bivalves ni muundo wa kemikali wa mucopolysaccharide wa kamasi yao, ambayo inakuza unyonyaji wa virusi [78, 79]. Hii hufanya bivalves kuwa kichujio bora cha asili cha kuainisha bioanuwai na athari za mabadiliko ya hali ya hewa katika mfumo ikolojia fulani wa majini. Ingawa uwepo wa vipande vya DNA vinavyotokana na mwenyeji unaweza kuonekana kama kizuizi cha mbinu ikilinganishwa na eDNA, gharama inayohusiana na kuwa na ccfDNA asilia kama hiyo ikilinganishwa na eDNA inaeleweka kwa wakati mmoja kwa kiasi kikubwa cha taarifa zinazopatikana kwa ajili ya tafiti za afya. Hii inajumuisha uwepo wa mfuatano wa virusi vilivyojumuishwa kwenye jenomu ya mwenyeji mwenyeji. Hii ni muhimu hasa kwa kome, kutokana na uwepo wa retrovirusi za leukemia zinazosambazwa kwa usawa katika bivalves [80, 81]. Faida nyingine ya LB kuliko eDNA ni kwamba hutumia shughuli ya phagocytic ya seli za damu zinazozunguka kwenye hemolymph, ambayo humeza vijidudu (na jenomu zao). Fagosaitosisi ndiyo kazi kuu ya seli za damu katika bivalves [82]. Hatimaye, njia hiyo inachukua fursa ya uwezo mkubwa wa kuchuja wa kome (wastani wa lita 1.5/saa ya maji ya bahari) na mzunguko wa siku mbili, ambao huongeza mchanganyiko wa tabaka tofauti za maji ya bahari, na kuruhusu kukamatwa kwa eDNA ya heterologous. [83, 84]. Kwa hivyo, uchambuzi wa kome ccfDNA ni njia ya kuvutia kutokana na athari za lishe, kiuchumi, na kimazingira za kome. Sawa na uchambuzi wa LB uliokusanywa kutoka kwa binadamu, njia hii pia inafungua uwezekano wa kupima mabadiliko ya kijenetiki na epigenetic katika DNA mwenyeji ili kukabiliana na vitu vya nje. Kwa mfano, teknolojia za mpangilio wa kizazi cha tatu zinaweza kutarajiwa kufanya uchambuzi wa methylation ya jenomu nzima katika ccfDNA asilia kwa kutumia mpangilio wa nanopores. Mchakato huu unapaswa kuwezeshwa na ukweli kwamba urefu wa vipande vya ccfDNA ya kome unaendana vyema na majukwaa ya mpangilio yaliyosomwa kwa muda mrefu ambayo huruhusu uchambuzi wa methylation ya jenomu nzima ya DNA kutoka kwa mpangilio mmoja bila hitaji la mabadiliko ya kemikali.85,86] Huu ni uwezekano wa kuvutia, kwani imeonyeshwa kuwa mifumo ya methylation ya DNA inaonyesha mwitikio wa msongo wa mazingira na hudumu kwa vizazi vingi. Kwa hivyo, inaweza kutoa ufahamu muhimu kuhusu mifumo ya msingi inayosimamia mwitikio baada ya kuathiriwa na mabadiliko ya hali ya hewa au uchafuzi [87]. Hata hivyo, matumizi ya LB hayana mapungufu. Bila shaka, hii inahitaji uwepo wa spishi za kiashiria katika mfumo ikolojia. Kama ilivyotajwa hapo juu, kutumia LB kutathmini bioanuwai ya mfumo ikolojia fulani pia kunahitaji bomba kali la bioinformatiki linalozingatia uwepo wa vipande vya DNA kutoka chanzo. Tatizo jingine kubwa ni upatikanaji wa jenomu za marejeleo kwa spishi za baharini. Inatarajiwa kwamba mipango kama vile Mradi wa Jenomu za Mamalia wa Baharini na mradi wa Fish10k ulioanzishwa hivi karibuni [88] itawezesha uchambuzi kama huo katika siku zijazo. Matumizi ya dhana ya LB kwa viumbe vinavyolisha vichujio vya baharini pia yanaendana na maendeleo ya hivi karibuni katika teknolojia ya mfuatano, na kuifanya iweze kufaa kwa maendeleo ya biomarkers za multi-ohm ili kutoa taarifa muhimu kuhusu afya ya makazi ya baharini katika kukabiliana na msongo wa mazingira.
Data ya mpangilio wa jenomu imewekwa kwenye Kumbukumbu ya Kusoma Mfuatano wa NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 chini ya Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Athari za mabadiliko ya hali ya hewa kwa viumbe vya baharini na mifumo ikolojia. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Fikiria athari za pamoja za mabadiliko ya hali ya hewa na vichocheo vingine vya ndani kwenye mazingira ya baharini. mazingira ya kisayansi kwa ujumla. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ) Sayansi ya kwanza ya Machi. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kupungua kwa uvumilivu wa joto chini ya hali ya mkazo wa joto unaorudiwa kunaelezea vifo vingi vya kome wa bluu wakati wa kiangazi. Ripoti ya kisayansi 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Mabadiliko ya hivi karibuni katika marudio, sababu na kiwango cha vifo vya wanyama. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Viini vingi visivyo vya spishi maalum vinaweza kusababisha vifo vingi vya Pinna nobilis. Maisha. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Athari zinazowezekana za mabadiliko ya hali ya hewa kwenye magonjwa ya zoonotiki ya Aktiki. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Kome wa bluu (Mytilus edulis spp.) kama viumbe vya ishara katika ufuatiliaji wa uchafuzi wa pwani: mapitio. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Ujumuishaji wa biopsy ya kioevu katika matibabu ya saratani. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Ukomavu wa biopsy ya kioevu: Huruhusu DNA ya uvimbe kuzunguka. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asidi za nyuklia katika plasma ya binadamu. Kumbukumbu za mkutano wa matawi ya Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Jukumu jipya la DNA isiyo na seli kama alama ya molekuli kwa ajili ya matibabu ya saratani. Upimaji wa uchambuzi wa biomola. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsy ya kioevu inaingia kliniki - masuala ya utekelezaji na changamoto za baadaye. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW na wengine. DNA ya fetasi ipo katika plasma na seramu ya mama. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Utafiti wa kipindi cha ujauzito na matatizo yake kwa kutumia RNA inayozunguka nje ya seli katika damu ya wanawake wakati wa ujauzito. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsy ya kioevu: DNA isiyo na seli ya wafadhili hutumika kugundua vidonda vya alojeni kwenye kipandikizi cha figo. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Ubunifu katika uchunguzi wa ujauzito: mpangilio wa jenomu ya plasma ya mama. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Ugunduzi wa haraka wa vimelea kwa kutumia mpangilio wa metagenomiki wa kizazi kijacho wa majimaji ya mwili yaliyoambukizwa. Nat Medicine. 2021;27:115-24.