Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সমর্থন সীমিত। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি রেন্ডার করব।
লিকুইড বায়োপসি (এলবি) হলো একটি ধারণা যা বায়োমেডিকেল ক্ষেত্রে দ্রুত জনপ্রিয়তা লাভ করছে। এই ধারণাটি মূলত সঞ্চালনশীল বহিঃকোষীয় ডিএনএ (ccfDNA)-এর খণ্ডাংশ শনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে গঠিত, যা বিভিন্ন টিস্যুতে কোষের মৃত্যুর পর প্রধানত ছোট ছোট খণ্ড হিসেবে নির্গত হয়। এই খণ্ডাংশগুলোর একটি ক্ষুদ্র অংশ বহিরাগত (foreign) টিস্যু বা জীব থেকে আসে। বর্তমান গবেষণায়, আমরা এই ধারণাটি ঝিনুকের উপর প্রয়োগ করেছি, যা একটি সেন্টিনেল প্রজাতি এবং সমুদ্রের পানি পরিস্রাবণের উচ্চ ক্ষমতার জন্য পরিচিত। আমরা সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য সম্পর্কে তথ্য প্রদানের জন্য বিভিন্ন উৎস থেকে পরিবেশগত ডিএনএ খণ্ডাংশ সংগ্রহ করতে ঝিনুকের প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসেবে কাজ করার ক্ষমতাকে ব্যবহার করেছি। আমাদের ফলাফল দেখায় যে ঝিনুকের হিমোলিম্ফে ১ থেকে ৫ কিলোবেস (kb) পর্যন্ত বিভিন্ন আকারের ডিএনএ খণ্ডাংশ রয়েছে। শটগান সিকোয়েন্সিং দেখিয়েছে যে বিপুল সংখ্যক ডিএনএ খণ্ডাংশ বহিরাগত অণুজীবের উৎস থেকে এসেছে। এদের মধ্যে আমরা ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ভাইরাসের ডিএনএ খণ্ডাংশ পেয়েছি, যার মধ্যে উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে সাধারণত পাওয়া যায় এমন বিভিন্ন পোষককে সংক্রমিত করে এমন ভাইরাসও অন্তর্ভুক্ত। উপসংহারে, আমাদের গবেষণা প্রমাণ করে যে ঝিনুকের ক্ষেত্রে প্রয়োগকৃত এলবি (LB) ধারণাটি সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের অণুজীব বৈচিত্র্য সম্পর্কে জ্ঞানের এক সমৃদ্ধ কিন্তু এখনো অনাবিষ্কৃত উৎস।
সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের (CC) প্রভাব একটি দ্রুত বর্ধনশীল গবেষণার ক্ষেত্র। বৈশ্বিক উষ্ণায়ন কেবল গুরুত্বপূর্ণ শারীরবৃত্তীয় চাপই সৃষ্টি করে না, বরং সামুদ্রিক জীবের তাপীয় স্থিতিশীলতার বিবর্তনীয় সীমাকেও ঠেলে দেয়, যা বহু প্রজাতির বাসস্থানকে প্রভাবিত করে এবং তাদের আরও অনুকূল পরিবেশের সন্ধানে উদ্বুদ্ধ করে [১, ২]। বহুকোষী প্রাণীদের জীববৈচিত্র্যকে প্রভাবিত করার পাশাপাশি, জলবায়ু পরিবর্তন পোষক-অণুজীব মিথস্ক্রিয়ার সূক্ষ্ম ভারসাম্যকে বিঘ্নিত করে। এই অণুজীবীয় ডিসব্যাকটেরিওসিস সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জন্য একটি গুরুতর হুমকি সৃষ্টি করে, কারণ এটি সামুদ্রিক জীবকে সংক্রামক জীবাণুর প্রতি আরও বেশি সংবেদনশীল করে তোলে [৩, ৪]। এটা বিশ্বাস করা হয় যে, জলবায়ু পরিবর্তন ব্যাপক মৃত্যুর ক্ষেত্রে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যা বৈশ্বিক সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্র ব্যবস্থাপনার জন্য একটি গুরুতর সমস্যা [৫, ৬]। অনেক সামুদ্রিক প্রজাতির উপর অর্থনৈতিক, পরিবেশগত এবং পুষ্টিগত প্রভাব বিবেচনা করলে এটি একটি গুরুত্বপূর্ণ বিষয়। এটি বিশেষত মেরু অঞ্চলে বসবাসকারী দ্বিকপাটী প্রাণীদের জন্য সত্য, যেখানে জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব আরও তাৎক্ষণিক এবং গুরুতর [৬, ৭]। প্রকৃতপক্ষে, সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব নিরীক্ষণের জন্য মাইটিলাস প্রজাতির মতো দ্বিকপাটী প্রাণী ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। আশ্চর্যের বিষয় নয় যে, তাদের স্বাস্থ্য নিরীক্ষণের জন্য তুলনামূলকভাবে বৃহৎ সংখ্যক বায়োমার্কার তৈরি করা হয়েছে, প্রায়শই একটি দ্বি-স্তরীয় পদ্ধতি ব্যবহার করে যেখানে এনজাইমেটিক কার্যকলাপ বা কোষীয় কার্যাবলী যেমন কোষের কার্যক্ষমতা এবং ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপের উপর ভিত্তি করে কার্যকরী বায়োমার্কার অন্তর্ভুক্ত থাকে [8]। এই পদ্ধতিগুলির মধ্যে নির্দিষ্ট চাপ সূচকের ঘনত্ব পরিমাপও অন্তর্ভুক্ত, যা প্রচুর পরিমাণে সমুদ্রের জল শোষণের পরে নরম টিস্যুতে জমা হয়। যাইহোক, দ্বিকপাটী প্রাণীদের উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতা এবং অর্ধ-উন্মুক্ত সংবহনতন্ত্র লিকুইড বায়োপসি (LB) ধারণা ব্যবহার করে নতুন হিমোলিম্ফ বায়োমার্কার বিকাশের সুযোগ প্রদান করে, যা রোগীর ব্যবস্থাপনার জন্য একটি সহজ এবং ন্যূনতম আক্রমণাত্মক পদ্ধতি। রক্তের নমুনা [9, 10]। যদিও মানুষের LB-তে বিভিন্ন ধরণের সঞ্চালনকারী অণু পাওয়া যেতে পারে, এই ধারণাটি প্রাথমিকভাবে প্লাজমাতে সঞ্চালনকারী এক্সট্রা সেলুলার ডিএনএ (ccfDNA) খণ্ডের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে তৈরি। প্রকৃতপক্ষে, মানব প্লাজমায় সঞ্চালনশীল ডিএনএ-এর উপস্থিতি বিংশ শতাব্দীর মাঝামাঝি সময় থেকেই জানা ছিল [11], কিন্তু সাম্প্রতিক বছরগুলিতে উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির আবির্ভাবের ফলেই ccfDNA-এর উপর ভিত্তি করে ক্লিনিকাল রোগ নির্ণয় সম্ভব হয়েছে। এই সঞ্চালনশীল ডিএনএ খণ্ডগুলির উপস্থিতি আংশিকভাবে কোষ মৃত্যুর পরে জিনোমিক ডিএনএ (নিউক্লিয়ার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল) এর নিষ্ক্রিয় মুক্তির কারণে ঘটে। সুস্থ ব্যক্তিদের দেহে ccfDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/mL) থাকে, কিন্তু বিভিন্ন রোগে আক্রান্ত বা মানসিক চাপে থাকা রোগীদের ক্ষেত্রে এটি ৫-১০ গুণ বেড়ে যেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। সুস্থ ব্যক্তিদের দেহে ccfDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/mL) থাকে, কিন্তু বিভিন্ন রোগে আক্রান্ত বা মানসিক চাপে থাকা রোগীদের ক্ষেত্রে এটি ৫-১০ গুণ বেড়ে যেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныйтой с больныйтох подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. সুস্থ মানুষের শরীরে cccDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL), কিন্তু বিভিন্ন রোগে আক্রান্ত রোগীদের ক্ষেত্রে অথবা টিস্যুর ক্ষতিসাধনকারী মানসিক চাপের কারণে এটি ৫-১০ গুণ বেড়ে যেতে পারে।在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂力5倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 叀承受 叀增加 5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцымистом প্যাটোলজিয়ামি বা стрессом, что приводит к повреждению тканей. সুস্থ ব্যক্তিদের দেহে ccfDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/ml) থাকে, কিন্তু বিভিন্ন রোগ বা মানসিক চাপে থাকা রোগীদের ক্ষেত্রে এটি ৫-১০ গুণ বেড়ে যেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়।ccfDNA খণ্ডের আকার ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, তবে সাধারণত 150 থেকে 200 bp পর্যন্ত হয়ে থাকে। [12]। স্ব-উৎপাদিত ccfDNA, অর্থাৎ, স্বাভাবিক বা রূপান্তরিত পোষক কোষ থেকে প্রাপ্ত ccfDNA-এর বিশ্লেষণ, নিউক্লিয়ার এবং/অথবা মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোমে উপস্থিত জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যার ফলে চিকিৎসকদের নির্দিষ্ট আণবিক-লক্ষ্যযুক্ত থেরাপি নির্বাচন করতে সহায়তা করে [13]। যাইহোক, ccfDNA বিদেশী উৎস থেকেও পাওয়া যেতে পারে, যেমন গর্ভাবস্থায় ভ্রূণ কোষ থেকে বা প্রতিস্থাপিত অঙ্গ থেকে [14,15,16,17]। ccfDNA একটি সংক্রামক এজেন্টের (বিদেশী) নিউক্লিক অ্যাসিডের উপস্থিতি সনাক্ত করার জন্য তথ্যের একটি গুরুত্বপূর্ণ উৎস, যা রক্ত ​​​​কালচার দ্বারা সনাক্ত করা যায় না এমন ব্যাপক সংক্রমণের অ-আক্রমণাত্মক সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়, সংক্রামিত টিস্যুর আক্রমণাত্মক বায়োপসি এড়িয়ে চলে [18]। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে মানুষের রক্তে তথ্যের একটি সমৃদ্ধ উৎস রয়েছে যা ভাইরাস এবং ব্যাকটেরিয়াঘটিত রোগজীবাণু সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, এবং মানুষের প্লাজমায় পাওয়া ccfDNA-এর প্রায় 1% বিদেশী উৎসের [19]। এই গবেষণাগুলি দেখায় যে ccfDNA বিশ্লেষণের মাধ্যমে কোনও জীবের সঞ্চালনশীল মাইক্রোবায়োমের জীববৈচিত্র্য মূল্যায়ন করা যেতে পারে। যাইহোক, সম্প্রতি পর্যন্ত, এই ধারণাটি শুধুমাত্র মানুষের ক্ষেত্রে এবং কিছু পরিমাণে অন্যান্য মেরুদণ্ডী প্রাণীদের ক্ষেত্রে ব্যবহৃত হত [20, 21]।
এই গবেষণাপত্রে, আমরা ৩৫ মিলিয়ন বছর আগে আগ্নেয়গিরির অগ্ন্যুৎপাতের ফলে গঠিত একটি বৃহৎ মালভূমির উপর অবস্থিত দ্বীপপুঞ্জ, উপ-অ্যান্টার্কটিক কার্গুয়েলেন দ্বীপপুঞ্জে সাধারণত প্রাপ্ত দক্ষিণাঞ্চলীয় প্রজাতি Aulacomya atra-এর ccfDNA বিশ্লেষণ করতে LB পটেনশিয়াল ব্যবহার করেছি। একটি ইন ভিট্রো পরীক্ষামূলক সিস্টেম ব্যবহার করে আমরা দেখেছি যে, সামুদ্রিক জলে থাকা ডিএনএ খণ্ডগুলি ঝিনুক দ্বারা দ্রুত শোষিত হয় এবং হিমোলিম্ফ প্রকোষ্ঠে প্রবেশ করে। শটগান সিকোয়েন্সিং দেখিয়েছে যে ঝিনুকের হিমোলিম্ফ ccfDNA-তে নিজস্ব এবং অ-নিজস্ব উৎসের ডিএনএ খণ্ড রয়েছে, যার মধ্যে মিথোজীবী ব্যাকটেরিয়া এবং শীতল আগ্নেয় সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের বৈশিষ্ট্যপূর্ণ বায়োম থেকে প্রাপ্ত ডিএনএ খণ্ড অন্তর্ভুক্ত। হিমোলিম্ফ ccfDNA-তে বিভিন্ন পোষক পরিসরের ভাইরাস থেকে প্রাপ্ত ভাইরাল সিকোয়েন্সও রয়েছে। আমরা অস্থিযুক্ত মাছ, সামুদ্রিক অ্যানিমোন, শৈবাল এবং পোকামাকড়ের মতো বহুকোষী প্রাণীর ডিএনএ খণ্ডও পেয়েছি। উপসংহারে, আমাদের গবেষণা প্রমাণ করে যে সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে একটি সমৃদ্ধ জিনোমিক ভান্ডার তৈরি করার জন্য LB ধারণাটি সামুদ্রিক অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের ক্ষেত্রে সফলভাবে প্রয়োগ করা যেতে পারে।
ডিসেম্বর ২০১৮-তে পোর্ট-অ-ফ্রান্সের (049°21.235 S, 070°13.490 E) কার্গেলেন দ্বীপপুঞ্জের জোয়ার-ভাটার পাথুরে উপকূল থেকে পূর্ণবয়স্ক (৫৫-৭০ মিমি লম্বা) মাইটিলাস প্ল্যাটেনসিস (M. platensis) এবং অলাকোমিয়া অ্যাট্রা (A. atra) সংগ্রহ করা হয়েছিল। অন্যান্য পূর্ণবয়স্ক নীল ঝিনুক (Mytilus spp.) একটি বাণিজ্যিক সরবরাহকারী (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং সেগুলোকে একটি তাপমাত্রা-নিয়ন্ত্রিত (৪°C) বায়ুযুক্ত ট্যাঙ্কে রাখা হয়েছিল, যেটিতে ১০-২০ লিটার ৩২‰ কৃত্রিম ব্রাইন (কৃত্রিম সামুদ্রিক লবণ Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) ছিল। প্রতিটি পরীক্ষার জন্য, প্রতিটি খোলসের দৈর্ঘ্য এবং ওজন পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই প্রোগ্রামের জন্য একটি বিনামূল্যে উন্মুক্ত অ্যাক্সেস প্রোটোকল অনলাইনে উপলব্ধ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)। সংক্ষেপে, [22] এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে অ্যাবডাক্টর পেশী থেকে এলবি হিমোলিম্ফ সংগ্রহ করা হয়েছিল। হিমোলিম্ফকে 1200×g গতিতে 3 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন করে পরিষ্কার করা হয়েছিল এবং সুপারন্যাট্যান্ট ব্যবহারের আগ পর্যন্ত হিমায়িত (-20°C) করে রাখা হয়েছিল। cfDNA পৃথকীকরণ এবং বিশুদ্ধকরণের জন্য, নমুনা (1.5-2.0 মিলি) গলানো হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে নিউক্লিওস্ন্যাপ cfDNA কিট (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ব্যবহার করে প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। পরবর্তী বিশ্লেষণের আগ পর্যন্ত ccfDNA -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। কিছু পরীক্ষায়, QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) ব্যবহার করে ccfDNA পৃথক এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। একটি স্ট্যান্ডার্ড পিকোগ্রিন অ্যাসে ব্যবহার করে বিশুদ্ধ ডিএনএ-র পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। একটি হাই সেনসিটিভিটি ডিএনএ কিট ব্যবহার করে অ্যাজিলেন্ট ২১০০ বায়োঅ্যানালাইজার (অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস ইনক., সান্তা ক্লারা, সিএ) দ্বারা ক্যাপিলারি ইলেক্ট্রোফোরেসিসের মাধ্যমে পৃথকীকৃত ccfDNA-এর খণ্ডাংশ বিন্যাস বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে ১ µl ccfDNA নমুনা ব্যবহার করে এই পরীক্ষাটি সম্পন্ন করা হয়েছিল।
হিমোলিম্ফ ccfDNA খণ্ডাংশের সিকোয়েন্সিং-এর জন্য, Génome Québec (মন্ট্রিয়ল, কুইবেক, কানাডা) Illumina MiSeq PE75 কিটের Illumina DNA Mix কিট ব্যবহার করে শটগান লাইব্রেরি প্রস্তুত করেছে। একটি স্ট্যান্ডার্ড অ্যাডাপ্টার (BioO) ব্যবহার করা হয়েছিল। কাঁচা ডেটা ফাইলগুলি NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভ (SRR8924808 এবং SRR8924809) থেকে পাওয়া যায়। FastQC [23] ব্যবহার করে মৌলিক রিডিং গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। অ্যাডাপ্টার এবং নিম্নমানের রিড ক্লিপিং করার জন্য Trimmomatic [24] ব্যবহার করা হয়েছে। অমিল এড়াতে [25] পেয়ার্ড এন্ড সহ শটগান রিডগুলিকে ন্যূনতম 20 bp ওভারল্যাপ সহ দীর্ঘতর একক রিডে FLASH মার্জ করা হয়েছিল। বাইভালভ এনসিবিআই ট্যাক্সোনমি ডেটাবেস (e মান < 1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে মার্জ করা রিডগুলির অ্যানোটেশন করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার সিকোয়েন্সগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। বাইভালভ এনসিবিআই ট্যাক্সোনমি ডেটাবেস (e মান < 1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে মার্জ করা রিডগুলির অ্যানোটেশন করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার সিকোয়েন্সগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатвых 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [২৬]। NCBI বাইভালভ ট্যাক্সোনমি ডেটাবেস (e মান < 1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে পুল করা রিডগুলির টীকা তৈরি করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার ক্রম মাস্কিং করা হয়েছিল।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买甶D, [ST用DU6]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合幨 读湔] dust 忶类 [2]进行 复杂度 序列 的..。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствохорчам данных (জনাচিনি ই <1e-3 এবং 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [২৬]। NCBI বাইভালভ ট্যাক্সোনমিক ডেটাবেস (e মান <1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে পুল করা রিডগুলির টীকা তৈরি করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার ক্রম মাস্কিং করা হয়েছিল।রিডগুলিকে দুটি দলে ভাগ করা হয়েছিল: বাইভালভ সিকোয়েন্সের সাথে সম্পর্কিত (এখানে সেলফ-রিড বলা হয়েছে) এবং সম্পর্কহীন (নন-সেলফ-রিড)। কন্টিগ তৈরি করার জন্য দুটি দলকে আলাদাভাবে MEGAHIT ব্যবহার করে অ্যাসেম্বল করা হয়েছিল [27]। এদিকে, এলিয়েন মাইক্রোবায়োম রিডগুলির ট্যাক্সোনমিক ডিস্ট্রিবিউশন Kraken2 [28] ব্যবহার করে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল এবং Galaxy [29, 30]-তে একটি ক্রোনা পাই চার্টের মাধ্যমে গ্রাফিকভাবে উপস্থাপন করা হয়েছিল। আমাদের প্রাথমিক পরীক্ষা থেকে kmers-59 কে সর্বোত্তম kmers হিসাবে নির্ধারণ করা হয়েছিল। চূড়ান্ত অ্যানোটেশনের জন্য BLASTN (বাইভালভ এনসিবিআই ডেটাবেস, ই ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যালাইনমেন্টের মাধ্যমে সেলফ কন্টিগগুলো শনাক্ত করা হয়েছিল। চূড়ান্ত অ্যানোটেশনের জন্য BLASTN (বাইভালভ এনসিবিআই ডেটাবেস, ই ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যালাইনমেন্টের মাধ্যমে সেলফ কন্টিগগুলো শনাক্ত করা হয়েছিল। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. চূড়ান্ত অ্যানোটেশনের জন্য সেলফ-কন্টিগগুলোকে BLASTN (NCBI বাইভালভ ডেটাবেস, e ভ্যালু <1e-10 এবং ৬০% হোমোলজি)-এর সাথে মিলিয়ে শনাক্ত করা হয়েছিল।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)। এরপর চূড়ান্ত অ্যানোটেশনের জন্য সেলফ-কন্টিগগুলোকে BLASTN (NCBI বাইভালভ ডেটাবেস, e ভ্যালু <1e-10 এবং 60% হোমোলজি)-এর সাথে মিলিয়ে শনাক্ত করা হয়েছিল। একই সাথে, ননসেলফ গ্রুপ কন্টিগগুলোকে BLASTN (nt NCBI ডেটাবেস, e ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যানোটেট করা হয়েছিল। একই সাথে, ননসেলফ গ্রুপ কন্টিগগুলোকে BLASTN (nt NCBI ডেটাবেস, e ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যানোটেট করা হয়েছিল। Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои)। এর পাশাপাশি, বিদেশী গ্রুপের কন্টিগগুলোকে BLASTN (NT NCBI ডেটাবেস, e value <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যানোটেট করা হয়েছিল।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群। Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt NCBI, гомология 60%)। একই সাথে, নন-সেলফ গ্রুপ কন্টিগগুলোকে BLASTN (nt NCBI ডেটাবেস, e ভ্যালু <1e-10 এবং ৬০% হোমোলজি) ব্যবহার করে অ্যানোটেট করা হয়েছিল। nr এবং RefSeq প্রোটিন NCBI ডেটাবেস ব্যবহার করে ননসেলফ কন্টিগগুলোর উপরেও BLASTX চালানো হয়েছিল (e ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি)। nr এবং RefSeq প্রোটিন NCBI ডেটাবেস ব্যবহার করে ননসেলফ কন্টিগগুলোর উপরেও BLASTX চালানো হয়েছিল (e ভ্যালু < 1e−10 এবং ৬০% হোমোলজি)। ব্লাস্টএক্স ট্যাকজেন এনসিবিআই 60%)। nr এবং RefSeq NCBI প্রোটিন ডেটাবেস ব্যবহার করে নন-সেলফ কন্টিগগুলোর উপরেও BLASTX চালানো হয়েছিল (e ভ্যালু < 1e-10 এবং ৬০% হোমোলজি)।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. ব্লাস্টএক্স ট্যাক্স 60%)। nr এবং RefSeq NCBI প্রোটিন ডেটাবেস ব্যবহার করে নন-সেলফ কন্টিগগুলোর উপরেও BLASTX চালানো হয়েছিল (e ভ্যালু <1e-10 এবং ৬০% হোমোলজি)।অ-স্বকীয় কন্টিগগুলোর BLASTN এবং BLASTX পুলগুলো চূড়ান্ত কন্টিগগুলোকে উপস্থাপন করে (পরিশিষ্ট ফাইল দেখুন)।
PCR-এর জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলো সারণি S1-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। ccfDNA টার্গেট জিনগুলোকে বিবর্ধন করার জন্য Taq DNA পলিমারেজ (বায়ো বেসিক কানাডা, মার্কহাম, ওএন) ব্যবহার করা হয়েছিল। নিম্নলিখিত বিক্রিয়ার শর্তাবলী ব্যবহার করা হয়েছিল: ৯৫°C তাপমাত্রায় ৩ মিনিটের জন্য ডিন্যাচুরেশন, ৯৫°C তাপমাত্রায় ১ মিনিট, ১ মিনিটের জন্য নির্দিষ্ট অ্যানিলিং তাপমাত্রা, ৭২°C তাপমাত্রায় ১ মিনিটের জন্য ইলংগেশন, ৩৫টি চক্র, এবং সবশেষে ১০ মিনিটের মধ্যে ৭২°C তাপমাত্রায়। PCR উৎপাদগুলোকে ৯৫ ভোল্টে SYBRTM সেফ ডিএনএ জেল স্টেইন (ইনভিট্রোজেন, বার্লিংটন, ওএন, কানাডা) যুক্ত অ্যাগারোজ জেলে (১.৫%) ইলেকট্রোফোরেসিসের মাধ্যমে পৃথক করা হয়েছিল।
ঝিনুক (Mytilus spp.)-কে ৪°C তাপমাত্রায় ৫০০ মিলি অক্সিজেনযুক্ত সামুদ্রিক জলে (৩২ PSU) ২৪ ঘণ্টা ধরে পরিবেশের সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়া হয়েছিল। মানব গ্যালেকটিন-৭ সিডিএনএ সিকোয়েন্স (NCBI অ্যাকসেশন নম্বর L07769) এনকোডকারী একটি ইনসার্টযুক্ত প্লাজমিড ডিএনএ ভায়ালে ১৯০ μg/μl চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল। ডিএনএ যোগ না করে একই পরিস্থিতিতে ইনকিউবেট করা ঝিনুকগুলো ছিল কন্ট্রোল। তৃতীয় কন্ট্রোল ট্যাঙ্কে ঝিনুক ছাড়া শুধু ডিএনএ ছিল। সামুদ্রিক জলে ডিএনএ-র গুণমান নিরীক্ষণের জন্য, প্রতিটি ট্যাঙ্ক থেকে নির্দিষ্ট সময়ে সামুদ্রিক জলের নমুনা (২০ μl; তিনটি পুনরাবৃত্তি) নেওয়া হয়েছিল। প্লাজমিড ডিএনএ শনাক্তকরণের জন্য, নির্দিষ্ট সময়ে এলবি ঝিনুক সংগ্রহ করে qPCR এবং ddPCR দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সামুদ্রিক জলের উচ্চ লবণাক্ততার কারণে, সমস্ত পিসিআর পরীক্ষার আগে অ্যালিকোটগুলোকে পিসিআর-উপযোগী জলে (১:১০ অনুপাতে) লঘু করা হয়েছিল।
বায়োরাড QX200 প্রোটোকল (মিসিসাগা, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করে ডিজিটাল ড্রপলেট পিসিআর (ddPCR) করা হয়েছিল। সর্বোত্তম তাপমাত্রা নির্ধারণ করতে তাপমাত্রা প্রোফাইলটি ব্যবহার করুন (সারণী S1)। একটি QX200 ড্রপ জেনারেটর (বায়োরাড) ব্যবহার করে ড্রপ তৈরি করা হয়েছিল। ddPCR নিম্নরূপে সম্পন্ন করা হয়েছিল: ৫ মিনিটের জন্য ৯৫°C, এরপর ৫০টি চক্রে ৩০ সেকেন্ডের জন্য ৯৫°C এবং ১ মিনিটের জন্য একটি নির্দিষ্ট অ্যানিলিং তাপমাত্রা, এবং ৩০ সেকেন্ডের জন্য ৭২°C, ৫ মিনিটের জন্য ৪°C এবং ৫ মিনিটের মধ্যে ৯০°C। একটি QX200 ড্রপ রিডার (বায়োরাড) ব্যবহার করে ড্রপের সংখ্যা এবং পজিটিভ রিঅ্যাকশন (কপির সংখ্যা/µl) পরিমাপ করা হয়েছিল। যে নমুনাগুলিতে ১০,০০০-এর কম ড্রপলেট ছিল, সেগুলি বাতিল করা হয়েছিল। প্রতিবার ddPCR চালানোর সময় প্যাটার্ন কন্ট্রোল করা হয়নি।
Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) এবং LGALS7 নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে qPCR সম্পন্ন করা হয়েছিল। QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ব্যবহার করে সমস্ত কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর ২০ µl আয়তনে করা হয়েছিল। qPCR শুরু করা হয়েছিল ৯৫°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের ইনকিউবেশনের মাধ্যমে, এরপর ৯৫°C তাপমাত্রায় ১০ সেকেন্ড এবং ৬০°C তাপমাত্রায় ৬০ সেকেন্ড করে ৪০টি চক্র সম্পন্ন করা হয় এবং প্রতিবার ডেটা সংগ্রহ করা হয়। qPCR-এর শেষে ৯৫°C তাপমাত্রায় ৫ সেকেন্ড, ৬৫°C তাপমাত্রায় ৬০ সেকেন্ড এবং ৯৭°C তাপমাত্রায় ধারাবাহিক পরিমাপের মাধ্যমে মেল্টিং কার্ভ তৈরি করা হয়েছিল। কন্ট্রোল নমুনা ব্যতীত প্রতিটি qPCR তিনবার করে করা হয়েছিল।
যেহেতু ঝিনুক তাদের উচ্চ পরিস্রাবণ হারের জন্য পরিচিত, তাই আমরা প্রথমে অনুসন্ধান করেছিলাম যে তারা সমুদ্রের জলে উপস্থিত ডিএনএ খণ্ডগুলিকে পরিস্রাবণ ও ধরে রাখতে পারে কিনা। এই খণ্ডগুলি তাদের অর্ধ-উন্মুক্ত লসিকা তন্ত্রে জমা হয় কিনা, সে বিষয়েও আমরা আগ্রহী ছিলাম। আমরা নীল ঝিনুকের ট্যাঙ্কে যোগ করা দ্রবণীয় ডিএনএ খণ্ডগুলির গতিপথ অনুসরণ করে পরীক্ষামূলকভাবে এই সমস্যার সমাধান করেছি। ডিএনএ খণ্ডগুলির গতিপথ অনুসরণ সহজ করার জন্য, আমরা মানুষের গ্যালেকটিন-৭ জিন ধারণকারী বহিরাগত (নিজস্ব নয়) প্লাজমিড ডিএনএ ব্যবহার করেছি। ডিডিপিসিআর সমুদ্রের জল এবং ঝিনুকে প্লাজমিড ডিএনএ খণ্ডগুলির গতিপথ অনুসরণ করে। আমাদের ফলাফল দেখায় যে, ঝিনুকের অনুপস্থিতিতে সমুদ্রের জলে ডিএনএ খণ্ডের পরিমাণ সময়ের সাথে (৭ দিন পর্যন্ত) তুলনামূলকভাবে স্থির থাকলেও, ঝিনুকের উপস্থিতিতে এই মাত্রা ৮ ঘণ্টার মধ্যে প্রায় সম্পূর্ণরূপে অদৃশ্য হয়ে যায় (চিত্র ১ক,খ)। বহিরাগত ডিএনএ-র খণ্ডগুলি অন্তঃকপাটিকার তরল এবং হিমোলিম্ফে ১৫ মিনিটের মধ্যে সহজেই শনাক্ত করা গিয়েছিল (চিত্র ১গ)। সংস্পর্শে আসার ৪ ঘণ্টা পরেও এই খণ্ডগুলি শনাক্ত করা সম্ভব ছিল। ডিএনএ খণ্ডের ক্ষেত্রে এই পরিস্রাবণ কার্যকলাপ ব্যাকটেরিয়া এবং শৈবালের পরিস্রাবণ কার্যকলাপের সাথে তুলনীয় [31]। এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে ঝিনুক তাদের তরল প্রকোষ্ঠে বিদেশী ডিএনএ পরিস্রাবণ এবং জমা করতে পারে।
ঝিনুকের উপস্থিতিতে (A) বা অনুপস্থিতিতে (B) সামুদ্রিক জলে প্লাজমিড ডিএনএ-এর আপেক্ষিক ঘনত্ব, যা ddPCR দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছে। A-তে, ফলাফলগুলি শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে, যেখানে বক্সগুলির সীমানা ৭৫তম এবং ২৫তম পার্সেন্টাইলকে প্রতিনিধিত্ব করে। ফিট করা লগারিদমিক বক্ররেখাটি লাল রঙে দেখানো হয়েছে, এবং ধূসর রঙে ছায়াযুক্ত এলাকাটি ৯৫% কনফিডেন্স ইন্টারভালকে প্রতিনিধিত্ব করে। B-তে, লাল রেখাটি গড় এবং নীল রেখাটি ঘনত্বের জন্য ৯৫% কনফিডেন্স ইন্টারভালকে প্রতিনিধিত্ব করে। C প্লাজমিড ডিএনএ যোগ করার বিভিন্ন সময়ে ঝিনুকের হিমোলিম্ফ এবং ভালভুলার ফ্লুইডে প্লাজমিড ডিএনএ-এর সঞ্চয়ন। ফলাফলগুলি প্রতি মিলিলিটারে সনাক্তকৃত পরম কপি (±SE) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে।
এরপর, আমরা কার্গুয়েলেন দ্বীপপুঞ্জের ঝিনুক ক্ষেত্র থেকে সংগৃহীত ঝিনুকে ccfDNA-এর উৎস অনুসন্ধান করেছি। কার্গুয়েলেন দ্বীপপুঞ্জ হলো একটি প্রত্যন্ত দ্বীপপুঞ্জ যেখানে মানুষের প্রভাব সীমিত। এই উদ্দেশ্যে, ঝিনুকের হিমোলিম্ফ থেকে cccDNA পৃথক করা হয়েছিল এবং মানুষের cccDNA বিশুদ্ধ করার জন্য সাধারণত ব্যবহৃত পদ্ধতি [32, 33] দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। আমরা দেখতে পেয়েছি যে ঝিনুকের হিমোলিম্ফে ccfDNA-এর গড় ঘনত্ব প্রতি মিলিলিটার হিমোলিম্ফে কয়েক মাইক্রোগ্রামের পরিসরে থাকে (টেবিল S2, পরিপূরক তথ্য দেখুন)। এই ঘনত্বের পরিসর সুস্থ মানুষের (প্রতি মিলিলিটারে কয়েক ন্যানোগ্রাম) তুলনায় অনেক বেশি, কিন্তু বিরল ক্ষেত্রে, ক্যান্সার রোগীদের মধ্যে ccfDNA-এর মাত্রা প্রতি মিলিলিটারে কয়েক মাইক্রোগ্রাম পর্যন্ত পৌঁছাতে পারে [34, 35]। হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর আকারের বিন্যাস বিশ্লেষণ করে দেখা গেছে যে এই খণ্ডগুলি আকারে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, যা 1000 bp থেকে 5000 bp পর্যন্ত বিস্তৃত (চিত্র 2)। সিলিকা-ভিত্তিক QIAamp Investigator Kit ব্যবহার করেও একই রকম ফলাফল পাওয়া গেছে, যা ফরেনসিক বিজ্ঞানে সাধারণত কম ঘনত্বের DNA নমুনা, ccfDNA [36] সহ, থেকে জিনোমিক DNA দ্রুত বিচ্ছিন্ন এবং বিশুদ্ধ করার জন্য ব্যবহৃত একটি পদ্ধতি।
ঝিনুকের হিমোলিম্ফের প্রতিনিধিত্বমূলক ccfDNA ইলেক্ট্রোফোরেগ্রাম। নিউক্লিওস্ন্যাপ প্লাজমা কিট (উপরে) এবং কিউআইএঅ্যাম্প ডিএনএ ইনভেস্টিগেটর কিট দিয়ে নিষ্কাশিত। বি ভায়োলিন প্লট যা ঝিনুকের হিমোলিম্ফে ccfDNA ঘনত্বের (±SE) বন্টন দেখাচ্ছে। কালো এবং লাল রেখাগুলো যথাক্রমে মধ্যক এবং প্রথম ও তৃতীয় কোয়ার্টাইলকে নির্দেশ করে।
মানুষ এবং প্রাইমেটদের ccfDNA-এর প্রায় 1% এর একটি বহিরাগত উৎস রয়েছে [21, 37]। বাইভালভদের অর্ধ-উন্মুক্ত সংবহনতন্ত্র, অণুজীব-সমৃদ্ধ সমুদ্রের জল এবং মাসেল ccfDNA-এর আকারের বিন্যাস বিবেচনা করে, আমরা অনুমান করেছিলাম যে মাসেলের হিমোলিম্ফ ccfDNA-তে অণুজীবের ডিএনএ-এর একটি সমৃদ্ধ এবং বৈচিত্র্যময় ভান্ডার থাকতে পারে। এই অনুমানটি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা কার্গেলেন দ্বীপপুঞ্জ থেকে সংগৃহীত Aulacomya atra নমুনা থেকে হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর সিকোয়েন্সিং করেছি, যার ফলে 10 মিলিয়নেরও বেশি রিড পাওয়া গেছে, যার 97.6% গুণমান নিয়ন্ত্রণে উত্তীর্ণ হয়েছে। এরপর BLASTN এবং NCBI বাইভালভ ডেটাবেস ব্যবহার করে রিডগুলিকে স্ব-উৎস এবং অ-স্ব-উৎস অনুসারে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল (চিত্র S1, পরিপূরক তথ্য)।
মানুষের ক্ষেত্রে, নিউক্লিয়ার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল উভয় ডিএনএ-ই রক্তপ্রবাহে নির্গত হতে পারে [38]। যাইহোক, বর্তমান গবেষণায়, ঝিনুকের নিউক্লিয়ার জিনোমিক ডিএনএ বিস্তারিতভাবে বর্ণনা করা সম্ভব হয়নি, কারণ A. atra জিনোম এখনও সিকোয়েন্স করা বা বর্ণনা করা হয়নি। যাইহোক, আমরা বাইভালভ লাইব্রেরি ব্যবহার করে আমাদের নিজস্ব উৎসের বেশ কিছু ccfDNA খণ্ড শনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য)। আমরা সিকোয়েন্স করা A. atra জিনগুলির ডিরেক্টেড পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনের মাধ্যমে আমাদের নিজস্ব উৎসের ডিএনএ খণ্ডগুলির উপস্থিতি নিশ্চিত করেছি (চিত্র 3)। একইভাবে, যেহেতু A. atra-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোম পাবলিক ডেটাবেসে উপলব্ধ, তাই A. atra-এর হিমোলিম্ফে মাইটোকন্ড্রিয়াল ccfDNA খণ্ডগুলির উপস্থিতির প্রমাণ পাওয়া যেতে পারে। পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনের মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ খণ্ডগুলির উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছে (চিত্র 3)।
পিসিআর (PCR) দ্বারা বিবর্ধিত A. atra (লাল বিন্দু – স্টক নম্বর: SRX5705969) এবং M. platensis (নীল বিন্দু – স্টক নম্বর: SRX5705968)-এর হিমোলিম্ফে বিভিন্ন মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন উপস্থিত ছিল। চিত্রটি ব্রেটন এট আল., ২০১১ থেকে গৃহীত। খ. FTA কাগজে সংরক্ষিত A. atra-এর হিমোলিম্ফ সুপারন্যাট্যান্টের বিবর্ধন। পিসিআর মিক্সযুক্ত পিসিআর টিউবে সরাসরি যোগ করার জন্য একটি ৩ মিমি পাঞ্চ ব্যবহার করুন।
সমুদ্রের জলে প্রচুর পরিমাণে অণুজীবের উপস্থিতি বিবেচনা করে, আমরা প্রাথমিকভাবে হিমোলিম্ফে অণুজীবের ডিএনএ সিকোয়েন্সের বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের উপর মনোযোগ দিয়েছিলাম। এটি করার জন্য, আমরা দুটি ভিন্ন কৌশল ব্যবহার করেছি। প্রথম কৌশলটিতে Kraken2 ব্যবহার করা হয়েছে, যা একটি অ্যালগরিদম-ভিত্তিক সিকোয়েন্স শ্রেণিবিন্যাস প্রোগ্রাম এবং এটি BLAST ও অন্যান্য টুলের [28] সাথে তুলনীয় নির্ভুলতার সাথে অণুজীবের সিকোয়েন্স শনাক্ত করতে পারে। 6719টিরও বেশি রিড ব্যাকটেরিয়ার উৎস থেকে এসেছে বলে নির্ধারণ করা হয়েছে, যেখানে 124টি এবং 64টি যথাক্রমে আর্কিয়া এবং ভাইরাস থেকে এসেছে (চিত্র 4)। সবচেয়ে বেশি পরিমাণে থাকা ব্যাকটেরিয়াল ডিএনএ খণ্ডগুলো ছিল ফার্মিকিউটিস (46%), প্রোটিওব্যাকটেরিয়া (27%), এবং ব্যাকটেরয়েডিটিস (17%) (চিত্র 4a)। এই বন্টনটি সামুদ্রিক নীল ঝিনুকের মাইক্রোবায়োম নিয়ে পূর্ববর্তী গবেষণার [39, 40] সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। গামাপ্রোটিওব্যাকটেরিয়া ছিল প্রোটিওব্যাকটেরিয়ার প্রধান শ্রেণি (44%), যার মধ্যে অনেক ভাইব্রিওনালিস অন্তর্ভুক্ত ছিল (চিত্র 4b)। ddPCR পদ্ধতি A. atra হিমোলিম্ফের ccfDNA-তে Vibrio DNA খণ্ডের উপস্থিতি নিশ্চিত করেছে (চিত্র 4c) [41]। ccfDNA-এর ব্যাকটেরিয়াগত উৎস সম্পর্কে আরও তথ্য পাওয়ার জন্য, একটি অতিরিক্ত পদ্ধতি গ্রহণ করা হয়েছিল (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য)। এক্ষেত্রে, ওভারল্যাপ করা রিডগুলোকে পেয়ার্ড-এন্ড রিড হিসেবে অ্যাসেম্বল করা হয়েছিল এবং BLASTN, 1e−3 এর একটি e ভ্যালু ও >90% হোমোলজির একটি কাটঅফ ব্যবহার করে সেগুলোকে স্ব (বাইভালভ) বা পর-উৎস হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। এক্ষেত্রে, ওভারল্যাপ করা রিডগুলোকে পেয়ার্ড-এন্ড রিড হিসেবে অ্যাসেম্বল করা হয়েছিল এবং BLASTN, 1e−3 এর একটি e ভ্যালু ও >90% হোমোলজির একটি কাটঅফ ব্যবহার করে সেগুলোকে স্ব (বাইভালভ) বা পর-উৎস হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами এবং были классифицированы как собести (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомой> এক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলোকে পেয়ার্ড-এন্ডেড রিড হিসেবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং BLASTN, 1e-3 এর e ভ্যালু ও >90% হোমোলজির কাটঅফ ব্যবহার করে সেগুলোকে নেটিভ (বাইভালভ) বা নন-অরিজিনাল হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 ব্লাস্ট 和 和1 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 . . . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%। এক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলোকে পেয়ার্ড-এন্ডেড রিড হিসেবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং eBLASTN, 1e-3 ভ্যালু ও >90% হোমোলজি থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করে সেগুলোকে নিজস্ব (বাইভালভ) বা অ-মৌলিক হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।যেহেতু A. atra জিনোম এখনও সিকোয়েন্স করা হয়নি, তাই আমরা MEGAHIT নেক্সট জেনারেশন সিকোয়েন্সিং (NGS) অ্যাসেম্বলারের ডি নভো অ্যাসেম্বলি কৌশল ব্যবহার করেছি। মোট ১৪৭,১৮৮টি কন্টিগকে নির্ভরশীল (বাইভালভ) উৎস হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছে। এরপর এই কন্টিগগুলোকে BLASTN এবং BLASTX ব্যবহার করে 1e-10 এর e-মান দিয়ে এক্সপ্লোড করা হয়েছিল। এই কৌশলটি আমাদেরকে A. atra ccfDNA-তে উপস্থিত ৪৮২টি নন-বাইভালভ খণ্ডাংশ শনাক্ত করতে সাহায্য করেছে। এই ডিএনএ খণ্ডাংশগুলোর অর্ধেকেরও বেশি (৫৭%) ব্যাকটেরিয়া থেকে, প্রধানত ফুলকার সিম্বায়ন্ট, যার মধ্যে সালফোট্রফিক সিম্বায়ন্ট অন্তর্ভুক্ত, এবং ফুলকার সিম্বায়ন্ট Solemya velum থেকে প্রাপ্ত (চিত্র ৫)।
প্রকার স্তরে আপেক্ষিক প্রাচুর্য। খ. দুটি প্রধান পর্বের (ফার্মিকিউটস এবং প্রোটিওব্যাকটেরিয়া) অণুজীব বৈচিত্র্য। গ. ডিডিপিসিআর-এর প্রতিনিধিত্বমূলক বিবর্ধন। ক. ভিব্রিও প্রজাতি। তিনটি অ্যাট্রা হিমোলিম্ফে ১৬এস আরআরএনএ জিনের (নীল) খণ্ডাংশ।
মোট ৪৮২টি সংগৃহীত কন্টিগ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ক) মেটাজিনোমিক কন্টিগ অ্যানোটেশনের শ্রেণিবিন্যাসগত বণ্টনের সাধারণ রূপরেখা (প্রোক্যারিওট এবং ইউক্যারিওট)। খ) BLASTN এবং BLASTX দ্বারা শনাক্তকৃত ব্যাকটেরিয়াল ডিএনএ খণ্ডাংশসমূহের বিস্তারিত বণ্টন।
Kraken2 বিশ্লেষণ আরও দেখিয়েছে যে ঝিনুকের ccfDNA-তে আর্কিয়াল ডিএনএ খণ্ড রয়েছে, যার মধ্যে Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), এবং Thaurmarcheota (11%) এর ডিএনএ খণ্ড অন্তর্ভুক্ত (চিত্র 6a)। Euryarchaeota এবং Crenarchaeota থেকে প্রাপ্ত ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি, যা পূর্বে ক্যালিফোর্নিয়ান ঝিনুকের অণুজীব সম্প্রদায়ে পাওয়া গিয়েছিল, তা আশ্চর্যজনক নয় [42]। যদিও Euryarchaeota প্রায়শই চরম অবস্থার সাথে যুক্ত, এখন এটি স্বীকৃত যে Euryarchaeota এবং Crenarchaeota উভয়ই সামুদ্রিক ক্রায়োজেনিক পরিবেশে সবচেয়ে সাধারণ প্রোক্যারিওটগুলির মধ্যে অন্যতম [43, 44]। ঝিনুকে মিথেনোজেনিক অণুজীবের উপস্থিতি আশ্চর্যজনক নয়, কারণ সম্প্রতি কার্গেলেন মালভূমিতে তলদেশের ছিদ্র থেকে ব্যাপক মিথেন নিঃসরণের প্রতিবেদন [45] এবং কার্গেলেন দ্বীপপুঞ্জের উপকূলে সম্ভাব্য অণুজীব দ্বারা মিথেন উৎপাদনের পর্যবেক্ষণ [46] পাওয়া গেছে।
এরপর আমাদের মনোযোগ ডিএনএ ভাইরাসের পাঠের দিকে সরে যায়। আমাদের জ্ঞানমতে, ঝিনুকের ভাইরাস উপাদান নিয়ে এটিই প্রথম অফ-টার্গেট গবেষণা। প্রত্যাশিতভাবেই, আমরা ব্যাকটেরিওফাজ (কডোভাইরালেস)-এর ডিএনএ খণ্ডাংশ খুঁজে পেয়েছি (চিত্র ৬খ)। তবে, সবচেয়ে সাধারণ ভাইরাল ডিএনএ এসেছে নিউক্লিওসাইটোভাইরাস নামক একটি ফাইলাম থেকে, যা নিউক্লিয়ার সাইটোপ্লাজমিক লার্জ ডিএনএ ভাইরাস (NCLDV) নামেও পরিচিত এবং যার জিনোম যেকোনো ভাইরাসের মধ্যে বৃহত্তম। এই ফাইলামের মধ্যে, বেশিরভাগ ডিএনএ সিকোয়েন্স মিমিমিডোভিরিডি (৫৮%) এবং পক্সভিরিডি (২১%) পরিবারের অন্তর্গত, যাদের প্রাকৃতিক পোষকের মধ্যে রয়েছে মেরুদণ্ডী প্রাণী এবং আর্থ্রোপড, যদিও এই ডিএনএ সিকোয়েন্সগুলির একটি ক্ষুদ্র অংশ পরিচিত ভাইরোলজিক্যাল শৈবালের অন্তর্গত। এটি সামুদ্রিক ইউক্যারিওটিক শৈবালকে সংক্রমিত করে। সিকোয়েন্সগুলি প্যান্ডোরা ভাইরাস থেকেও পাওয়া গেছে, যা পরিচিত যেকোনো ভাইরাল জেনাসের মধ্যে বৃহত্তম জিনোম আকারের একটি দৈত্যাকার ভাইরাস। মজার ব্যাপার হলো, হিমোলিম্ফ ccfDNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্ধারিত, ভাইরাস দ্বারা সংক্রমিত বলে পরিচিত পোষকের পরিসর তুলনামূলকভাবে বড় ছিল (চিত্র S3, পরিপূরক তথ্য)। এর মধ্যে রয়েছে Baculoviridae এবং Iridoviridae-এর মতো পোকামাকড়কে সংক্রামিতকারী ভাইরাস, সেইসাথে অ্যামিবা, শৈবাল এবং মেরুদণ্ডী প্রাণীদের সংক্রামিতকারী ভাইরাস। আমরা Pithovirus sibericum জিনোমের সাথে মিলে যাওয়া সিকোয়েন্সও খুঁজে পেয়েছি। পিটোভাইরাস (যা "জম্বি ভাইরাস" নামেও পরিচিত) প্রথম সাইবেরিয়ার ৩০,০০০ বছর পুরানো পারমাফ্রস্ট থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল [47]। সুতরাং, আমাদের ফলাফল পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা দেখায় যে এই ভাইরাসগুলির সমস্ত আধুনিক প্রজাতি বিলুপ্ত হয়ে যায়নি [48] এবং এই ভাইরাসগুলি দূরবর্তী সাবআর্কটিক সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত থাকতে পারে।
অবশেষে, আমরা অন্যান্য বহুকোষী প্রাণীর ডিএনএ খণ্ড খুঁজে পেতে পারি কিনা তা পরীক্ষা করে দেখেছি। nt, nr এবং RefSeq লাইব্রেরি (জিনোমিক এবং প্রোটিন) ব্যবহার করে BLASTN এবং BLASTX এর মাধ্যমে মোট 482টি বহিরাগত কন্টিগ শনাক্ত করা হয়েছে। আমাদের ফলাফল দেখায় যে বহুকোষী প্রাণীদের ccfDNA-এর বহিরাগত খণ্ডগুলির মধ্যে অস্থিময় হাড়ের ডিএনএ-ই প্রধান (চিত্র 5)। পোকামাকড় এবং অন্যান্য প্রজাতির ডিএনএ খণ্ডও পাওয়া গেছে। ডিএনএ খণ্ডগুলির একটি তুলনামূলকভাবে বড় অংশ শনাক্ত করা যায়নি, সম্ভবত স্থলজ প্রজাতির তুলনায় জিনোমিক ডেটাবেসে বিপুল সংখ্যক সামুদ্রিক প্রজাতির কম প্রতিনিধিত্বের কারণে [49]।
বর্তমান গবেষণাপত্রে, আমরা ঝিনুকের উপর এলবি (LB) ধারণাটি প্রয়োগ করেছি এবং যুক্তি দিয়েছি যে হিমোলিম্ফের সিসিএফডিএনএ (ccfDNA) শট সিকোয়েন্সিং সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের গঠন সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। বিশেষত, আমরা দেখতে পেয়েছি যে ১) ঝিনুকের হিমোলিম্ফে তুলনামূলকভাবে বড় (~১-৫ কিলোবেস) সঞ্চালনশীল ডিএনএ খণ্ডাংশের ঘনত্ব তুলনামূলকভাবে বেশি (মাইক্রোগ্রাম স্তরে) থাকে; ২) এই ডিএনএ খণ্ডাংশগুলো স্বাধীন এবং অ-স্বাধীন উভয় প্রকারেরই হয়; ৩) এই ডিএনএ খণ্ডাংশগুলোর বহিরাগত উৎসের মধ্যে আমরা ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ভাইরাসের ডিএনএ, সেইসাথে অন্যান্য বহুকোষী প্রাণীর ডিএনএ-ও পেয়েছি; ৪) হিমোলিম্ফে এই বহিরাগত সিসিএফডিএনএ খণ্ডাংশগুলোর সঞ্চয়ন দ্রুত ঘটে এবং এটি ঝিনুকের অভ্যন্তরীণ পরিস্রাবণ কার্যকলাপে অবদান রাখে। উপসংহারে, আমাদের গবেষণাটি প্রমাণ করে যে এলবি (LB) ধারণাটি, যা এখন পর্যন্ত প্রধানত বায়োমেডিসিনের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করা হয়েছে, তা জ্ঞানের এক সমৃদ্ধ কিন্তু অনাবিষ্কৃত উৎসকে ধারণ করে, যা সেন্টিনেল প্রজাতি এবং তাদের পরিবেশের মধ্যেকার মিথস্ক্রিয়াকে আরও ভালোভাবে বোঝার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
প্রাইমেট ছাড়াও, ইঁদুর, কুকুর, বিড়াল এবং ঘোড়া সহ স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে ccfDNA বিচ্ছিন্ন করার খবর পাওয়া গেছে [50, 51, 52]। যাইহোক, আমাদের জ্ঞান অনুসারে, আমাদের গবেষণাটিই প্রথম যা উন্মুক্ত সংবহন ব্যবস্থা সম্পন্ন সামুদ্রিক প্রজাতিতে ccfDNA সনাক্তকরণ এবং সিকোয়েন্সিং-এর প্রতিবেদন করছে। ঝিনুকের এই শারীরবৃত্তীয় বৈশিষ্ট্য এবং পরিস্রাবণ ক্ষমতা, অন্তত আংশিকভাবে, অন্যান্য প্রজাতির তুলনায় সঞ্চালনশীল ডিএনএ খণ্ডগুলির বিভিন্ন আকারের বৈশিষ্ট্য ব্যাখ্যা করতে পারে। মানুষের ক্ষেত্রে, রক্তে সঞ্চালনশীল বেশিরভাগ ডিএনএ খণ্ডগুলি 150 থেকে 200 bp আকারের ছোট খণ্ড, যার সর্বোচ্চ শিখর 167 bp [34, 53]। ডিএনএ খণ্ডগুলির একটি ছোট কিন্তু উল্লেখযোগ্য অংশ 300 থেকে 500 bp আকারের, এবং প্রায় 5% 900 bp এর চেয়ে দীর্ঘ। [54]। এই আকারের বিন্যাসের কারণ হলো, প্লাজমাতে ccfDNA-এর প্রধান উৎস হলো কোষের মৃত্যু, যা সুস্থ ব্যক্তিদের ক্ষেত্রে রক্তে সঞ্চালনশীল হেমাটোপয়েটিক কোষের নেক্রোসিস বা কোষমৃত্যুর কারণে অথবা ক্যান্সার রোগীদের ক্ষেত্রে টিউমার কোষের অ্যাপোপটোসিসের (যা সার্কুলেটিং টিউমার ডিএনএ বা ctDNA নামে পরিচিত) ফলে ঘটে থাকে। ঝিনুকের হিমোলিম্ফে আমরা যে ccfDNA-এর আকার বিন্যাস পেয়েছি, তা ১০০০ থেকে ৫০০০ bp পর্যন্ত বিস্তৃত ছিল, যা থেকে বোঝা যায় যে ঝিনুকের ccfDNA-এর উৎস ভিন্ন। এটি একটি যৌক্তিক অনুমান, কারণ ঝিনুকের একটি অর্ধ-উন্মুক্ত সংবহনতন্ত্র রয়েছে এবং তারা সামুদ্রিক জলজ পরিবেশে বাস করে যেখানে অণুজীবের জিনোমিক ডিএনএ-এর উচ্চ ঘনত্ব বিদ্যমান। প্রকৃতপক্ষে, বহিরাগত ডিএনএ ব্যবহার করে আমাদের পরীক্ষাগারের পরীক্ষাগুলি দেখিয়েছে যে ঝিনুক সমুদ্রের জলে ডিএনএ খণ্ড জমা করে, যা কোষীয় গ্রহণের পর অন্তত কয়েক ঘন্টা পরে ক্ষয়প্রাপ্ত হয় এবং/অথবা নির্গত হয় এবং/অথবা বিভিন্ন সংগঠনে সঞ্চিত হয়। কোষের (প্রোক্যারিওটিক এবং ইউক্যারিওটিক উভয়ই) বিরলতার কারণে, অন্তঃকপাটী প্রকোষ্ঠের ব্যবহার স্ব-উৎস এবং বহিরাগত উৎস উভয় থেকেই ccfDNA-এর পরিমাণ হ্রাস করবে। দ্বিকপাটী প্রাণীর সহজাত অনাক্রম্যতার গুরুত্ব এবং বিপুল সংখ্যক সঞ্চালনশীল ফ্যাগোসাইটের কথা বিবেচনা করে, আমরা আরও অনুমান করি যে এমনকি বহিরাগত ccfDNA-ও সেই সঞ্চালনশীল ফ্যাগোসাইটগুলিতে সমৃদ্ধ হয়, যেগুলি অণুজীব এবং/অথবা কোষীয় ধ্বংসাবশেষ ভক্ষণের পর বহিরাগত ডিএনএ সঞ্চয় করে। সব মিলিয়ে, আমাদের ফলাফল দেখায় যে দ্বিকপাটী প্রাণীর হিমোলিম্ফ ccfDNA আণবিক তথ্যের একটি অনন্য ভান্ডার এবং এটি একটি প্রহরী প্রজাতি হিসেবে তাদের মর্যাদাকে আরও শক্তিশালী করে।
আমাদের তথ্য নির্দেশ করে যে ব্যাকটেরিয়া থেকে প্রাপ্ত হিমোলিম্ফ ccfDNA খণ্ডের সিকোয়েন্সিং এবং বিশ্লেষণ পোষক ব্যাকটেরিয়াল ফ্লোরা এবং পার্শ্ববর্তী সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত ব্যাকটেরিয়া সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করতে পারে। শট সিকোয়েন্সিং কৌশল A. atra-র ফুলকার কমেনসাল ব্যাকটেরিয়ার এমন সিকোয়েন্স প্রকাশ করেছে যা রেফারেন্স লাইব্রেরির পক্ষপাতিত্বের কারণে প্রচলিত 16S rRNA শনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করলে বাদ পড়ে যেত। প্রকৃতপক্ষে, কার্গেলেনের একই ঝিনুক স্তর থেকে M. platensis-এর সংগৃহীত LB ডেটা ব্যবহার করে আমরা দেখেছি যে উভয় ঝিনুক প্রজাতির ফুলকার সাথে যুক্ত ব্যাকটেরিয়াল সিম্বায়ন্টদের গঠন একই ছিল (চিত্র S4, পরিপূরক তথ্য)। জিনগতভাবে ভিন্ন দুটি ঝিনুকের এই সাদৃশ্য কার্গেলেনের ঠান্ডা, সালফারযুক্ত এবং আগ্নেয় শিলাস্তরের ব্যাকটেরিয়াল কমিউনিটির গঠনকে প্রতিফলিত করতে পারে [55, 56, 57, 58]। পোর্ট-অ-ফ্রান্সের উপকূলের মতো বায়োটারবেটেড উপকূলীয় এলাকা থেকে ঝিনুক আহরণের সময় সালফার-হ্রাসকারী অণুজীবের উচ্চ মাত্রা ভালোভাবে বর্ণিত হয়েছে [59]। আরেকটি সম্ভাবনা হলো, সহজীবী ঝিনুকের ফ্লোরা অনুভূমিক সংক্রমণের দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে [60, 61]। সামুদ্রিক পরিবেশ, সমুদ্রতলের উপরিভাগ এবং ঝিনুকের মধ্যে মিথোজীবী ব্যাকটেরিয়ার গঠনের মধ্যে সম্পর্ক নির্ধারণের জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। এই গবেষণাগুলো বর্তমানে চলমান।
সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রে জীববৈচিত্র্য মূল্যায়নের জন্য ঝিনুকের ccfDNA ব্যবহারের অনেক সুবিধার মধ্যে কয়েকটি হলো হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর দৈর্ঘ্য ও ঘনত্ব, এর বিশুদ্ধকরণের সহজলভ্যতা এবং দ্রুত শটগান সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য এর উচ্চ গুণমান। এই পদ্ধতিটি একটি নির্দিষ্ট বাস্তুতন্ত্রে ভাইরাসের গোষ্ঠী (ভাইরোম) চিহ্নিত করার জন্য বিশেষভাবে কার্যকর [62, 63]। ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ইউক্যারিওটের মতো নয়, ভাইরাসের জিনোমে 16S সিকোয়েন্সের মতো ফাইলোজেনেটিক্যালি সংরক্ষিত জিন থাকে না। আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে ঝিনুকের মতো নির্দেশক প্রজাতি থেকে নেওয়া লিকুইড বায়োপসি ব্যবহার করে তুলনামূলকভাবে বৃহৎ সংখ্যক ccfDNA ভাইরাস খণ্ড শনাক্ত করা যেতে পারে, যা সাধারণত উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে বসবাসকারী পোষকদের সংক্রমিত করে বলে পরিচিত। এর মধ্যে রয়েছে প্রোটোজোয়া, আর্থ্রোপড, পোকামাকড়, উদ্ভিদ এবং ব্যাকটেরিয়াল ভাইরাস (যেমন, ব্যাকটেরিওফাজ) সংক্রমিতকারী ভাইরাস। কার্গুয়েলেনের একই ঝিনুক স্তর থেকে সংগৃহীত নীল ঝিনুকের (M. platensis) হিমোলিম্ফ ccfDNA ভাইরোম পরীক্ষা করেও আমরা একই ধরনের বিন্যাস পেয়েছি (সারণী S2, পরিপূরক তথ্য)। ccfDNA-এর শটগান সিকোয়েন্সিং প্রকৃতপক্ষে মানুষ বা অন্যান্য প্রজাতির ভাইরোম অধ্যয়নে গতি লাভকারী একটি নতুন পদ্ধতি [21, 37, 64]। এই পদ্ধতিটি দ্বি-সূত্রক ডিএনএ ভাইরাস অধ্যয়নের জন্য বিশেষভাবে উপযোগী, কারণ সমস্ত দ্বি-সূত্রক ডিএনএ ভাইরাসের মধ্যে কোনো একক জিন সংরক্ষিত থাকে না, যা বাল্টিমোরের ভাইরাসের সবচেয়ে বৈচিত্র্যময় এবং বিস্তৃত শ্রেণীর প্রতিনিধিত্ব করে [65]। যদিও এই ভাইরাসগুলির বেশিরভাগই শ্রেণীবদ্ধ করা হয়নি এবং ভাইরাস জগতের সম্পূর্ণ অজানা অংশের ভাইরাসও অন্তর্ভুক্ত থাকতে পারে [66], আমরা দেখেছি যে A. atra এবং M. platensis ঝিনুকের ভাইরোম এবং পোষক পরিসর একইভাবে দুটি প্রজাতির মধ্যে পড়ে (চিত্র S3, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)। এই সাদৃশ্য আশ্চর্যজনক নয়, কারণ এটি পরিবেশে উপস্থিত ডিএনএ গ্রহণের ক্ষেত্রে নির্বাচনীতার অভাবকে প্রতিফলিত করতে পারে। আরএনএ ভাইরোমের বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য বর্তমানে বিশুদ্ধ আরএনএ ব্যবহার করে ভবিষ্যৎ গবেষণা প্রয়োজন।
আমাদের গবেষণায়, আমরা Kowarski এবং তার সহকর্মীদের [37] কাজ থেকে অভিযোজিত একটি অত্যন্ত কঠোর পাইপলাইন ব্যবহার করেছি, যারা নেটিভ ccfDNA-এর অ্যাসেম্বলির আগে এবং পরে পুলড রিড এবং কন্টিগগুলির দুই-ধাপের ডিলিশন ব্যবহার করেছিলেন, যার ফলে একটি উচ্চ অনুপাতে আনম্যাপড রিড পাওয়া যায়। অতএব, আমরা এই সম্ভাবনাটি উড়িয়ে দিতে পারি না যে এই আনম্যাপড রিডগুলির কয়েকটির নিজস্ব উৎস থাকতে পারে, মূলত কারণ এই ঝিনুক প্রজাতির জন্য আমাদের কাছে কোনো রেফারেন্স জিনোম নেই। আমরা এই পাইপলাইনটি ব্যবহার করেছি কারণ আমরা সেলফ এবং নন-সেলফ রিডের মধ্যে কাইমেরা এবং Illumina MiSeq PE75 দ্বারা উৎপন্ন রিডের দৈর্ঘ্য নিয়ে উদ্বিগ্ন ছিলাম। বেশিরভাগ আনচার্টেড রিডিংয়ের আরেকটি কারণ হল, অনেক সামুদ্রিক অণুজীব, বিশেষ করে কার্গেলেনের মতো প্রত্যন্ত অঞ্চলে, এখনও অ্যানোটেট করা হয়নি। আমরা মানুষের ccfDNA-এর অনুরূপ ccfDNA খণ্ডের দৈর্ঘ্য ধরে নিয়ে Illumina MiSeq PE75 ব্যবহার করেছি। ভবিষ্যৎ গবেষণার জন্য, আমাদের ফলাফল অনুযায়ী হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর রিডগুলো মানুষ এবং/অথবা স্তন্যপায়ী প্রাণীর চেয়ে দীর্ঘতর হওয়ায়, আমরা দীর্ঘতর ccfDNA খণ্ডের জন্য আরও উপযুক্ত একটি সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহারের সুপারিশ করছি। এই পদ্ধতিটি গভীরতর বিশ্লেষণের জন্য আরও ইঙ্গিত শনাক্ত করাকে অনেক সহজ করে তুলবে। বর্তমানে অপ্রাপ্য সম্পূর্ণ A. atra নিউক্লিয়ার জিনোম সিকোয়েন্স প্রাপ্তি, স্ব-উৎস এবং পর-উৎস থেকে প্রাপ্ত ccfDNA-এর মধ্যে পার্থক্য নির্ণয়কেও ব্যাপকভাবে সহজতর করবে। যেহেতু আমাদের গবেষণা ঝিনুকের ক্ষেত্রে লিকুইড বায়োপসি ধারণাটি প্রয়োগের সম্ভাবনার উপর আলোকপাত করেছে, আমরা আশা করি যে ভবিষ্যৎ গবেষণায় এই ধারণাটি ব্যবহৃত হওয়ার সাথে সাথে, ঝিনুকের অণুজীব বৈচিত্র্য অধ্যয়নের জন্য এই পদ্ধতির সম্ভাবনা বৃদ্ধি করতে নতুন সরঞ্জাম এবং পাইপলাইন তৈরি হবে। সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্র।
একটি নন-ইনভেসিভ ক্লিনিক্যাল বায়োমার্কার হিসেবে, মানুষের প্লাজমায় ccfDNA-এর উচ্চ মাত্রা বিভিন্ন রোগ, টিস্যুর ক্ষতি এবং চাপের অবস্থার সাথে সম্পর্কিত [67,68,69]। এই বৃদ্ধি টিস্যুর ক্ষতির পরে নিজস্ব উৎসের ডিএনএ খণ্ডের মুক্তির সাথে সম্পর্কিত। আমরা তীব্র তাপীয় চাপ ব্যবহার করে এই বিষয়টি পরীক্ষা করেছি, যেখানে ঝিনুকগুলিকে অল্প সময়ের জন্য 30 °C তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। আমরা তিনটি ভিন্ন ধরণের ঝিনুকের উপর তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায় এই বিশ্লেষণটি করেছি। যাইহোক, আমরা তীব্র তাপীয় চাপের পরে ccfDNA-এর মাত্রায় কোনও পরিবর্তন খুঁজে পাইনি (চিত্র S5, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)। এই আবিষ্কারটি অন্তত আংশিকভাবে এই বিষয়টি ব্যাখ্যা করতে পারে যে ঝিনুকের একটি অর্ধ-উন্মুক্ত সংবহনতন্ত্র রয়েছে এবং তাদের উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতার কারণে তারা প্রচুর পরিমাণে বহিরাগত ডিএনএ জমা করে। অন্যদিকে, অনেক অমেরুদণ্ডী প্রাণীর মতো ঝিনুকও চাপ-জনিত টিস্যুর ক্ষতির বিরুদ্ধে আরও বেশি প্রতিরোধী হতে পারে, যার ফলে তাদের হিমোলিম্ফে ccfDNA-এর মুক্তি সীমিত থাকে [70, 71]।
আজ পর্যন্ত, জলজ বাস্তুতন্ত্রে জীববৈচিত্র্যের ডিএনএ বিশ্লেষণ প্রধানত পরিবেশগত ডিএনএ (eDNA) মেটাবারকোডিং-এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে। তবে, প্রাইমার ব্যবহার করা হলে জীববৈচিত্র্য বিশ্লেষণে এই পদ্ধতিটি সাধারণত সীমাবদ্ধ থাকে। শটগান সিকোয়েন্সিং-এর ব্যবহার পিসিআর (PCR)-এর সীমাবদ্ধতা এবং প্রাইমার সেটের পক্ষপাতমূলক নির্বাচনকে এড়িয়ে যায়। সুতরাং, এক অর্থে, আমাদের পদ্ধতিটি সম্প্রতি ব্যবহৃত উচ্চ-ক্ষমতাসম্পন্ন eDNA শটগান সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির কাছাকাছি, যা সরাসরি খণ্ডিত ডিএনএ-র সিকোয়েন্স করতে এবং প্রায় সমস্ত জীবকে বিশ্লেষণ করতে সক্ষম [72, 73]। তবে, বেশ কিছু মৌলিক বিষয় রয়েছে যা এলবি (LB)-কে প্রচলিত eDNA পদ্ধতি থেকে আলাদা করে। অবশ্যই, eDNA এবং LB-এর মধ্যে প্রধান পার্থক্য হলো প্রাকৃতিক ফিল্টার হোস্টের ব্যবহার। eDNA অধ্যয়নের জন্য প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসাবে স্পঞ্জ এবং বাইভালভ (Dresseina spp.)-এর মতো সামুদ্রিক প্রজাতির ব্যবহারের কথা জানা গেছে [74, 75]। তবে, ড্রেসেনার গবেষণায় টিস্যু বায়োপসি ব্যবহার করা হয়েছিল যেখান থেকে ডিএনএ নিষ্কাশন করা হয়েছিল। লিকুইড বায়োপসি (LB) থেকে প্রাপ্ত ccfDNA বিশ্লেষণের জন্য টিস্যু বায়োপসি, বিশেষায়িত এবং কখনও কখনও ব্যয়বহুল সরঞ্জাম এবং eDNA বা টিস্যু বায়োপসির সাথে সম্পর্কিত লজিস্টিকসের প্রয়োজন হয় না। প্রকৃতপক্ষে, আমরা সম্প্রতি রিপোর্ট করেছি যে LB থেকে প্রাপ্ত ccfDNA কোল্ড চেইন বজায় না রেখেই FTA সাপোর্টের মাধ্যমে সংরক্ষণ এবং বিশ্লেষণ করা যেতে পারে, যা প্রত্যন্ত অঞ্চলে গবেষণার জন্য একটি বড় চ্যালেঞ্জ [76]। লিকুইড বায়োপসি থেকে ccfDNA নিষ্কাশনও সহজ এবং শটগান সিকোয়েন্সিং এবং PCR বিশ্লেষণের জন্য উচ্চ মানের DNA সরবরাহ করে। eDNA বিশ্লেষণের সাথে সম্পর্কিত কিছু প্রযুক্তিগত সীমাবদ্ধতার পরিপ্রেক্ষিতে এটি একটি বড় সুবিধা [77]। এই নমুনা সংগ্রহের পদ্ধতির সরলতা এবং স্বল্প ব্যয় দীর্ঘমেয়াদী পর্যবেক্ষণ কর্মসূচির জন্যও বিশেষভাবে উপযুক্ত। তাদের উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতার পাশাপাশি, বাইভালভদের আরেকটি সুপরিচিত বৈশিষ্ট্য হলো তাদের শ্লেষ্মার রাসায়নিক মিউকোপলিস্যাকারাইড গঠন, যা ভাইরাস শোষণে সহায়তা করে [78, 79]। এটি বাইভালভদের একটি নির্দিষ্ট জলজ বাস্তুতন্ত্রে জীববৈচিত্র্য এবং জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব চিহ্নিত করার জন্য একটি আদর্শ প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসেবে তৈরি করে। যদিও eDNA-এর তুলনায় পোষক-উদ্ভূত ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি এই পদ্ধতির একটি সীমাবদ্ধতা হিসাবে দেখা যেতে পারে, স্বাস্থ্য গবেষণার জন্য উপলব্ধ বিপুল পরিমাণ তথ্যের কারণে eDNA-এর তুলনায় এই ধরনের একটি দেশীয় ccfDNA পাওয়ার সাথে যুক্ত খরচ একই সাথে বোধগম্য। এর মধ্যে পোষকের জিনোমে একীভূত ভাইরাল সিকোয়েন্সের উপস্থিতি অন্তর্ভুক্ত। এটি ঝিনুকের জন্য বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ, কারণ দ্বিকপাটী প্রাণীদের মধ্যে অনুভূমিকভাবে সংক্রামিত লিউকেমিক রেট্রোভাইরাসের উপস্থিতি রয়েছে [80, 81]। eDNA-এর তুলনায় LB-এর আরেকটি সুবিধা হলো এটি হিমোলিম্ফে সঞ্চালনশীল রক্ত ​​কোষের ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপকে কাজে লাগায়, যা অণুজীবকে (এবং তাদের জিনোমকে) গ্রাস করে। দ্বিকপাটী প্রাণীদের রক্ত ​​কোষের প্রধান কাজ হলো ফ্যাগোসাইটোসিস [82]। পরিশেষে, এই পদ্ধতিটি ঝিনুকের উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতা (গড়ে 1.5 লিটার/ঘন্টা সামুদ্রিক জল) এবং দুই দিনের সঞ্চালনের সুবিধা গ্রহণ করে, যা সামুদ্রিক জলের বিভিন্ন স্তরের মিশ্রণ বাড়ায়, ফলে ভিন্নধর্মী eDNA ক্যাপচার করা সম্ভব হয়। [83, 84]। সুতরাং, ঝিনুকের পুষ্টিগত, অর্থনৈতিক এবং পরিবেশগত প্রভাব বিবেচনা করে ঝিনুকের ccfDNA বিশ্লেষণ একটি আকর্ষণীয় ক্ষেত্র। মানুষের থেকে সংগৃহীত LB বিশ্লেষণের মতোই, এই পদ্ধতিটিও বাহ্যিক পদার্থের প্রতিক্রিয়ায় পোষক ডিএনএ-তে জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তন পরিমাপের সম্ভাবনা তৈরি করে। উদাহরণস্বরূপ, ন্যানোপোর সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে নেটিভ ccfDNA-তে জিনোম-ব্যাপী মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করার জন্য তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি কল্পনা করা যেতে পারে। এই প্রক্রিয়াটি সহজতর হবে কারণ ঝিনুকের ccfDNA খণ্ডগুলির দৈর্ঘ্য লং-রিড সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্মের সাথে আদর্শভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা রাসায়নিক রূপান্তরের প্রয়োজন ছাড়াই একটি একক সিকোয়েন্সিং রান থেকে জিনোম-ব্যাপী ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণের সুযোগ দেয়।৮৫,৮৬] এটি একটি আকর্ষণীয় সম্ভাবনা, কারণ এটি দেখানো হয়েছে যে ডিএনএ মিথাইলেশন প্যাটার্নগুলি পরিবেশগত চাপের প্রতিক্রিয়া প্রতিফলিত করে এবং বহু প্রজন্ম ধরে টিকে থাকে। অতএব, এটি জলবায়ু পরিবর্তন বা দূষণকারীর সংস্পর্শে আসার পরে প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণকারী অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া সম্পর্কে মূল্যবান অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে [৮৭]। তবে, LB ব্যবহারের সীমাবদ্ধতাও রয়েছে। বলা বাহুল্য, এর জন্য বাস্তুতন্ত্রে সূচক প্রজাতির উপস্থিতি প্রয়োজন। উপরে যেমন উল্লেখ করা হয়েছে, একটি প্রদত্ত বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য মূল্যায়ন করার জন্য LB ব্যবহার করতে একটি কঠোর বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইনেরও প্রয়োজন হয় যা উৎস থেকে ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি বিবেচনা করে। আরেকটি প্রধান সমস্যা হলো সামুদ্রিক প্রজাতির জন্য রেফারেন্স জিনোমের প্রাপ্যতা। আশা করা যায় যে মেরিন ম্যামাল জিনোমস প্রজেক্ট এবং সম্প্রতি প্রতিষ্ঠিত ফিশ10কে প্রজেক্ট [88]-এর মতো উদ্যোগগুলি ভবিষ্যতে এই ধরনের বিশ্লেষণকে সহজতর করবে। সামুদ্রিক ফিল্টার-ফিডিং জীবদের ক্ষেত্রে LB ধারণার প্রয়োগ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির সর্বশেষ অগ্রগতির সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা এটিকে পরিবেশগত চাপের প্রতিক্রিয়ায় সামুদ্রিক আবাসস্থলের স্বাস্থ্য সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদানের জন্য মাল্টি-ওহম বায়োমার্কার তৈরির জন্য উপযুক্ত করে তোলে।
জিনোম সিকোয়েন্সিং ডেটা NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভে (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) SRR8924808 বায়োপ্রজেক্টের অধীনে জমা দেওয়া হয়েছে।
ব্রিয়ারলি এএস, কিংসফোর্ড এমজে, সামুদ্রিক জীবন ও বাস্তুতন্ত্রের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব। কোল বায়োলজি। ২০০৯; ১৯: পৃ. ৬০২–৬১৪।
গিসি ই, মানেয়া ই, মাজারিস এডি, ফ্রাশেত্তি এস, আলম্পানিদু ভি, বেভিলাকুয়া এস, প্রমুখ। সামুদ্রিক পরিবেশে জলবায়ু পরিবর্তন এবং অন্যান্য স্থানীয় চাপ সৃষ্টিকারী কারণগুলির সম্মিলিত প্রভাব বিবেচনা করুন। জেনারেল সায়েন্টিফিক এনভায়রনমেন্ট। ২০২১;৭৫৫:১৪২৫৬৪।
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ) পহেলা মার্চের বিজ্ঞান। 2020; 7:48।
সেরন্ট এল, নিকাস্ট্রো সিআর, জার্ডি জিআই, গোবারভিল ই। পুনরাবৃত্ত তাপীয় চাপের পরিস্থিতিতে তাপ সহনশীলতা হ্রাস পাওয়াই নীল ঝিনুকের গ্রীষ্মকালীন উচ্চ মৃত্যুহারের কারণ। বৈজ্ঞানিক প্রতিবেদন ২০১৯; ৯:১৭৪৯৮।
ফে এসবি, সিপিয়েলস্কি এএম, নুসলে এস, সার্ভান্তেস-ইয়োশিদা কে, হওয়ান জেএল, হুবার ইআর, প্রমুখ। প্রাণী মৃত্যুর পৌনঃপুনিকতা, কারণ ও পরিধিতে সাম্প্রতিক পরিবর্তন। প্রসিডিংস অফ দ্য ন্যাশনাল অ্যাকাডেমি অফ সায়েন্সেস ইউএসএ। ২০১৫;১১২:১০৮৩-৮।
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. একাধিক অ-প্রজাতি-নির্দিষ্ট প্যাথোজেন পিন্না নোবিলিসের ব্যাপক মৃত্যুর কারণ হতে পারে। জীবন. 2020; 10:238।
ব্র্যাডলি এম, কাউটস এসজে, জেনকিন্স ই, ও'হারা টিএম। আর্কটিক অঞ্চলের প্রাণিবাহিত রোগের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের সম্ভাব্য প্রভাব। ইন্টারন্যাশনাল জার্নাল অফ সার্কাম্পোলার হেলথ। ২০০৫; ৬৪:৪৬৮–৭৭।
বেয়ার জে., গ্রিন এনডব্লিউ, ব্রুকস এস., অ্যালান আইজে, রুস এ., গোমেজ টি. প্রমুখ। উপকূলীয় দূষণ পর্যবেক্ষণে সংকেত জীব হিসেবে নীল ঝিনুক (Mytilus edulis spp.): একটি পর্যালোচনা। মেরিন এনভায়রনমেন্টাল রিসার্চ ২০১৭; ১৩০:৩৩৮-৬৫।
সিরাভেগনা জি, মারসোনি এস, সিয়েনা এস, বার্দেলি এ। ক্যান্সার চিকিৎসায় লিকুইড বায়োপসির একীকরণ। ন্যাচার রিভিউ ক্লিন অনকোলজি। ২০১৭; ১৪:৫৩১–৪৮।
ওয়ান জেসিএম, ম্যাসি সি, গার্সিয়া-কোরবাচো জে, মৌলিয়ের এফ, ব্রেন্টন জেডি, ক্যালডাস সি, প্রমুখ। লিকুইড বায়োপসি ম্যাচুরেশন: টিউমার ডিএনএ-কে সঞ্চালনের সুযোগ করে দেয়। ন্যাচার রিভিউ ক্যান্সার। ২০১৭;১৭:২২৩–৩৮।
ম্যান্ডেল পি., মেটাইস পি. মানব প্লাজমায় নিউক্লিক অ্যাসিড। সোসাইটি অফ বায়োলজির সহযোগী সংস্থাগুলির সভার কার্যবিবরণী। ১৯৪৮; ১৪২:২৪১-৩।
ব্রঙ্কহর্স্ট এজে, উনগেরার ডব্লিউ, হোল্ডেনরিডার এস। ক্যান্সার চিকিৎসার আণবিক নির্দেশক হিসেবে কোষ-মুক্ত ডিএনএ-এর একটি নতুন ভূমিকা। বায়োমোলার বিশ্লেষণের পরিমাণ নির্ধারণ। ২০১৯;১৭:১০০০০৮৭।
ইগনাটিয়াডিস এম., স্লেজ জিডব্লিউ, জেফরি এসএস লিকুইড বায়োপসি ক্লিনিকের প্রয়োগে প্রবেশ করেছে – বাস্তবায়নগত সমস্যা এবং ভবিষ্যৎ প্রতিবন্ধকতা। ন্যাচার রিভিউ ক্লিনিক্যাল অনকোলজি। ২০২১; ১৮:২৯৭–৩১২।
লো ওয়াইএম, করবেটা এন., চেম্বারলেইন পিএফ, রাই ডব্লিউ., সার্জেন্ট আইএল, রেডম্যান সিডব্লিউ এবং অন্যান্য। মাতৃ প্লাজমা ও সিরামে ভ্রূণীয় ডিএনএ-র উপস্থিতি। ল্যানসেট। ১৯৯৭; ৩৫০:৪৮৫-৭।
মুফাররে এমএন, ওং আরজে, শ জিএম, স্টিভেনসন ডিকে, কোয়েক এসআর। গর্ভাবস্থায় মহিলাদের রক্তে সঞ্চালনশীল বহিঃকোষীয় আরএনএ ব্যবহার করে গর্ভাবস্থার গতিপ্রকৃতি এবং এর জটিলতা বিষয়ক গবেষণা। ডোপেডিয়াট্রিক্স। ২০২০;৮:৬০৫-২১৯।
ওলেরিখ এম, শেরউড কে, কিওন পি, শুটজ ই, বেক জে, স্টেগবাউয়ার জে, প্রমুখ। লিকুইড বায়োপসি: কিডনি গ্রাফটে অ্যালোজেনিক ক্ষত শনাক্ত করতে দাতার কোষ-মুক্ত ডিএনএ ব্যবহার। ন্যাচার রিভিউ নেফ্রোলজি। ২০২১; ১৭:৫৯১–৬০৩।
জুয়ান এফসি, লো ওয়াইএম প্রসবপূর্ব রোগনির্ণয়ে উদ্ভাবন: মাতৃ প্লাজমা জিনোম সিকোয়েন্সিং। আনা এমডি। ২০১৬;৬৭:৪১৯-৩২।
গু ডব্লিউ, ডেং এক্স, লি এম, সুকু ওয়াইডি, আরেভালো এস, স্ট্রাইক ডি, প্রমুখ। সংক্রামিত শারীরিক তরলের নেক্সট-জেনারেশন মেটাজিনোমিক সিকোয়েন্সিংয়ের মাধ্যমে দ্রুত রোগজীবাণু সনাক্তকরণ। ন্যাচার মেডিসিন। ২০২১;২৭:১১৫-২৪।