Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা সাইটটিকে স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই রেন্ডার করব।
তরল বায়োপসি (LB) হল জৈব চিকিৎসা ক্ষেত্রে দ্রুত জনপ্রিয়তা অর্জনকারী একটি ধারণা। এই ধারণাটি মূলত বিভিন্ন টিস্যুতে কোষের মৃত্যুর পরে ছোট ছোট টুকরো হিসাবে নির্গত হয় এমন সঞ্চালনকারী বহির্কোষীয় DNA (ccfDNA) এর টুকরো সনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে তৈরি। এই টুকরোগুলির একটি ছোট অংশ বিদেশী (বিদেশী) টিস্যু বা জীব থেকে উদ্ভূত হয়। বর্তমান কাজে, আমরা এই ধারণাটি ঝিনুকের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করেছি, যা তাদের উচ্চ সমুদ্রের জল পরিস্রাবণ ক্ষমতার জন্য পরিচিত একটি প্রহরী প্রজাতি। আমরা সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য সম্পর্কে তথ্য প্রদানের জন্য বিভিন্ন উৎস থেকে পরিবেশগত DNA টুকরো ক্যাপচার করার জন্য প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসাবে কাজ করার জন্য ঝিনুকের ক্ষমতা ব্যবহার করি। আমাদের ফলাফল দেখায় যে ঝিনুকের হেমোলিম্ফে DNA টুকরো থাকে যা আকারে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, 1 থেকে 5 kb পর্যন্ত। শটগান সিকোয়েন্সিং দেখিয়েছে যে বিপুল সংখ্যক DNA টুকরো বিদেশী জীবাণু উৎপত্তির। এর মধ্যে, আমরা ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ভাইরাস থেকে DNA টুকরো পেয়েছি, যার মধ্যে রয়েছে উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে সাধারণত পাওয়া বিভিন্ন ধরণের হোস্টকে সংক্রামিত করার জন্য পরিচিত ভাইরাস। উপসংহারে, আমাদের গবেষণায় দেখা গেছে যে ঝিনুকের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করা LB ধারণাটি সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীবাণু বৈচিত্র্য সম্পর্কে জ্ঞানের একটি সমৃদ্ধ কিন্তু এখনও অনাবিষ্কৃত উৎসের প্রতিনিধিত্ব করে।
সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের (CC) প্রভাব গবেষণার একটি দ্রুত বর্ধনশীল ক্ষেত্র। বিশ্ব উষ্ণায়ন কেবল গুরুত্বপূর্ণ শারীরবৃত্তীয় চাপ সৃষ্টি করে না, বরং সামুদ্রিক জীবের তাপীয় স্থিতিশীলতার বিবর্তনীয় সীমাকেও ঠেলে দেয়, যা বেশ কয়েকটি প্রজাতির আবাসস্থলকে প্রভাবিত করে, তাদের আরও অনুকূল পরিস্থিতির সন্ধান করতে প্ররোচিত করে [1, 2]। মেটাজোয়ানের জীববৈচিত্র্যকে প্রভাবিত করার পাশাপাশি, CC হোস্ট-মাইক্রোবিয়াল মিথস্ক্রিয়ার সূক্ষ্ম ভারসাম্যকে ব্যাহত করে। এই মাইক্রোবিয়াল ডিসব্যাকটেরিওসিস সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জন্য একটি গুরুতর হুমকি তৈরি করে কারণ এটি সামুদ্রিক জীবকে সংক্রামক রোগজীবাণুর প্রতি আরও সংবেদনশীল করে তোলে [3, 4]। এটা বিশ্বাস করা হয় যে SS গণ মৃত্যুর ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যা বিশ্বব্যাপী সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের ব্যবস্থাপনার জন্য একটি গুরুতর সমস্যা [5, 6]। অনেক সামুদ্রিক প্রজাতির অর্থনৈতিক, পরিবেশগত এবং পুষ্টিগত প্রভাবের কারণে এটি একটি গুরুত্বপূর্ণ বিষয়। এটি বিশেষ করে মেরু অঞ্চলে বসবাসকারী বাইভালভদের জন্য সত্য, যেখানে CK এর প্রভাব আরও তাৎক্ষণিক এবং গুরুতর [6, 7]। প্রকৃতপক্ষে, মাইটিলাস spp এর মতো বাইভালভ। সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের উপর CC এর প্রভাব নিরীক্ষণের জন্য ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। অবাক হওয়ার কিছু নেই যে, তাদের স্বাস্থ্য নিরীক্ষণের জন্য তুলনামূলকভাবে প্রচুর সংখ্যক বায়োমার্কার তৈরি করা হয়েছে, প্রায়শই এনজাইমেটিক কার্যকলাপ বা কোষের কার্যকারিতা এবং ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপের মতো কোষীয় ফাংশনের উপর ভিত্তি করে কার্যকরী বায়োমার্কার জড়িত দ্বি-স্তরের পদ্ধতি ব্যবহার করা হয় [8]। এই পদ্ধতিগুলিতে সমুদ্রের জলের প্রচুর পরিমাণে শোষণের পরে নরম টিস্যুতে জমা হওয়া নির্দিষ্ট চাপ সূচকগুলির ঘনত্বের পরিমাপও অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। যাইহোক, উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতা এবং বাইভালভের আধা-খোলা সংবহন ব্যবস্থা তরল বায়োপসি (LB) ধারণা ব্যবহার করে নতুন হিমোলিম্ফ বায়োমার্কার বিকাশের সুযোগ প্রদান করে, যা রোগীর রক্তের নমুনা পরিচালনার জন্য একটি সহজ এবং ন্যূনতম আক্রমণাত্মক পদ্ধতি [9, 10]। যদিও মানুষের LB-তে বিভিন্ন ধরণের সঞ্চালন অণু পাওয়া যায়, এই ধারণাটি মূলত প্লাজমাতে সঞ্চালিত বহির্কোষীয় DNA (ccfDNA) খণ্ডগুলির DNA সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে। প্রকৃতপক্ষে, মানুষের প্লাজমাতে সঞ্চালিত ডিএনএর উপস্থিতি বিংশ শতাব্দীর মাঝামাঝি থেকেই জানা গেছে [11], কিন্তু সাম্প্রতিক বছরগুলিতেই উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির আবির্ভাবের ফলে ccfDNA-এর উপর ভিত্তি করে ক্লিনিকাল রোগ নির্ণয় করা সম্ভব হয়েছে। এই সঞ্চালিত ডিএনএ খণ্ডগুলির উপস্থিতি আংশিকভাবে কোষের মৃত্যুর পরে জিনোমিক ডিএনএ (নিউক্লিয়ার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল) নিষ্ক্রিয় মুক্তির কারণে। সুস্থ ব্যক্তিদের ক্ষেত্রে, ccfDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL) কিন্তু বিভিন্ন রোগে ভুগছেন বা চাপের শিকার রোগীদের ক্ষেত্রে এটি 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। সুস্থ ব্যক্তিদের ক্ষেত্রে, ccfDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL) কিন্তু বিভিন্ন রোগে ভুগছেন বা চাপের শিকার রোগীদের ক্ষেত্রে এটি 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныйтой с больныйтох подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. সুস্থ মানুষের ক্ষেত্রে, cccDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL), তবে বিভিন্ন রোগে আক্রান্ত বা চাপের মধ্যে থাকা রোগীদের ক্ষেত্রে এটি 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে যা টিস্যুর ক্ষতির দিকে পরিচালিত করে।在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂力5倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 叀承受 叀增加 5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцымистом патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে ccfDNA ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/ml), তবে বিভিন্ন রোগ বা চাপযুক্ত রোগীদের ক্ষেত্রে এটি 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়।ccfDNA খণ্ডের আকার ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, তবে সাধারণত 150 থেকে 200 bp পর্যন্ত হয়। [12]। স্ব-উদ্ভূত ccfDNA, অর্থাৎ, স্বাভাবিক বা রূপান্তরিত হোস্ট কোষ থেকে ccfDNA বিশ্লেষণ, নিউক্লিয়ার এবং/অথবা মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোমে উপস্থিত জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যার ফলে চিকিত্সকরা নির্দিষ্ট আণবিক-লক্ষ্যযুক্ত থেরাপি নির্বাচন করতে সহায়তা করে [13]। যাইহোক, গর্ভাবস্থায় ভ্রূণ কোষ থেকে বা প্রতিস্থাপন করা অঙ্গ থেকে ccfDNA এর মতো বিদেশী উৎস থেকে ccfDNA পাওয়া যেতে পারে [14,15,16,17]। ccfDNA একটি সংক্রামক এজেন্ট (বিদেশী) এর নিউক্লিক অ্যাসিডের উপস্থিতি সনাক্ত করার জন্য তথ্যের একটি গুরুত্বপূর্ণ উৎসও, যা রক্তের সংস্কৃতি দ্বারা চিহ্নিত না হওয়া ব্যাপক সংক্রমণের অ-আক্রমণাত্মক সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়, সংক্রামিত টিস্যুর আক্রমণাত্মক বায়োপসি এড়িয়ে যায় [18]। সাম্প্রতিক গবেষণায় প্রকৃতপক্ষে দেখা গেছে যে মানুষের রক্তে তথ্যের একটি সমৃদ্ধ উৎস রয়েছে যা ভাইরাল এবং ব্যাকটেরিয়াজনিত রোগজীবাণু সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং মানুষের প্লাজমাতে পাওয়া ccfDNA এর প্রায় 1% বিদেশী উৎসের [19]। এই গবেষণাগুলি দেখায় যে ccfDNA বিশ্লেষণ ব্যবহার করে একটি জীবের সঞ্চালিত মাইক্রোবায়োমের জীববৈচিত্র্য মূল্যায়ন করা যেতে পারে। যাইহোক, সম্প্রতি পর্যন্ত, এই ধারণাটি কেবলমাত্র মানুষের মধ্যে এবং কম পরিমাণে অন্যান্য মেরুদণ্ডী প্রাণীদের মধ্যে ব্যবহৃত হত [20, 21]।
বর্তমান গবেষণাপত্রে, আমরা Aulacomya atra-এর ccfDNA বিশ্লেষণ করার জন্য LB সম্ভাব্যতা ব্যবহার করি, যা সাধারণত উপ-আন্তর্কটিক কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জে পাওয়া যায়, যা 35 মিলিয়ন বছর আগে গঠিত একটি বৃহৎ মালভূমির উপরে অবস্থিত দ্বীপগুলির একটি দল। আগ্নেয়গিরির অগ্ন্যুৎপাত। একটি ইন ভিট্রো পরীক্ষামূলক ব্যবস্থা ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে সমুদ্রের জলে থাকা DNA খণ্ডগুলি দ্রুত ঝিনুক দ্বারা শোষিত হয় এবং হিমোলিম্ফ কম্পার্টমেন্টে প্রবেশ করে। শটগান সিকোয়েন্সিং দেখিয়েছে যে ঝিনুকের হিমোলিম্ফ ccfDNA-তে নিজস্ব এবং অ-স্ব-উত্সের DNA খণ্ড রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে সিম্বিওটিক ব্যাকটেরিয়া এবং ঠান্ডা আগ্নেয়গিরির সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের সাধারণ জৈববস্তু থেকে প্রাপ্ত DNA খণ্ড। Hemolymph ccfDNA-তে বিভিন্ন হোস্ট রেঞ্জের ভাইরাস থেকে প্রাপ্ত ভাইরাল ক্রমও রয়েছে। আমরা হাড়ের মাছ, সামুদ্রিক অ্যানিমোন, শৈবাল এবং পোকামাকড়ের মতো বহুকোষী প্রাণীর DNA খণ্ডও পেয়েছি। উপসংহারে, আমাদের গবেষণা দেখায় যে LB ধারণাটি সামুদ্রিক অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের উপর সফলভাবে প্রয়োগ করা যেতে পারে যাতে সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে একটি সমৃদ্ধ জিনোমিক ভাণ্ডার তৈরি করা যায়।
প্রাপ্তবয়স্ক (৫৫-৭০ মিমি লম্বা) মাইটিলাস প্লাটেনসিস (এম. প্লাটেনসিস) এবং আউলাকোমিয়া আত্রা (এ. আত্রা) পোর্ট-অ-ফ্রান্সের আন্তঃজলোয়ার পাথুরে উপকূল (০৪৯°২১.২৩৫ দক্ষিণ, ০৭০°১৩.৪৯০ পূর্ব .) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। ডিসেম্বর ২০১৮ সালে কেরগুয়েলেন দ্বীপপুঞ্জ। অন্যান্য প্রাপ্তবয়স্ক নীল ঝিনুক (মাইটিলাস স্পপি.) একটি বাণিজ্যিক সরবরাহকারী (PEI মুসেল কিং ইনকর্পোরেটেড, প্রিন্স এডওয়ার্ড আইল্যান্ড, কানাডা) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং একটি তাপমাত্রা নিয়ন্ত্রিত (৪°সে) বায়ুযুক্ত ট্যাঙ্কে রাখা হয়েছিল যার মধ্যে ১০-২০ লিটার ৩২‰ কৃত্রিম লবণ থাকে। (কৃত্রিম সমুদ্র লবণ রিফ ক্রিস্টাল, ইনস্ট্যান্ট ওশান, ভার্জিনিয়া, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র)। প্রতিটি পরীক্ষার জন্য, পৃথক খোলসের দৈর্ঘ্য এবং ওজন পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই প্রোগ্রামের জন্য একটি বিনামূল্যের উন্মুক্ত অ্যাক্সেস প্রোটোকল অনলাইনে পাওয়া যাচ্ছে (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)। সংক্ষেপে, বর্ণনা অনুসারে [22] অপহরণকারী পেশী থেকে LB হিমোলিম্ফ সংগ্রহ করা হয়েছিল। হিমোলিম্ফকে 1200×g তাপমাত্রায় 3 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে স্পষ্ট করা হয়েছিল, সুপারন্যাট্যান্ট ব্যবহার না করা পর্যন্ত (-20°C) হিমায়িত করা হয়েছিল। cfDNA বিচ্ছিন্নকরণ এবং পরিশোধনের জন্য, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে নমুনা (1.5-2.0 মিলি) গলানো হয়েছিল এবং NucleoSnap cfDNA কিট (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ব্যবহার করে প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। পরবর্তী বিশ্লেষণ না হওয়া পর্যন্ত ccfDNA -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। কিছু পরীক্ষায়, QIAamp DNA ইনভেস্টিগেটর কিট (QIAGEN, টরন্টো, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করে ccfDNA বিচ্ছিন্ন এবং পরিশোধিত করা হয়েছিল। একটি স্ট্যান্ডার্ড PicoGreen অ্যাস ব্যবহার করে পরিশোধিত DNA পরিমাপ করা হয়েছিল। বিচ্ছিন্ন ccfDNA-এর খণ্ড বন্টনটি Agilent 2100 জৈববিশ্লেষক (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ব্যবহার করে উচ্চ সংবেদনশীলতা DNA কিট ব্যবহার করে কৈশিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ccfDNA নমুনার 1 µl ব্যবহার করে পরীক্ষাটি করা হয়েছিল।
হেমোলিম্ফ ccfDNA টুকরোগুলির সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) Illumina MiSeq PE75 কিটের Illumina DNA Mix কিট ব্যবহার করে শটগান লাইব্রেরি তৈরি করেছে। একটি স্ট্যান্ডার্ড অ্যাডাপ্টার (BioO) ব্যবহার করা হয়েছে। NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভ (SRR8924808 এবং SRR8924809) থেকে কাঁচা ডেটা ফাইল পাওয়া যায়। FastQC [23] ব্যবহার করে মৌলিক পঠনের মান মূল্যায়ন করা হয়েছে। অ্যাডাপ্টার ক্লিপিং এবং নিম্নমানের পঠনের জন্য ট্রিমোম্যাটিক [24] ব্যবহার করা হয়েছে। জোড়া প্রান্ত সহ শটগান রিডগুলিকে FLASH-কে দীর্ঘ একক রিডে একত্রিত করা হয়েছিল যাতে অমিল এড়ানো যায় [25]। একটি বাইভালভ NCBI ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (e মান < 1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN-এর সাথে মার্জ করা রিডগুলি টীকা করা হয়েছিল, এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার ক্রমগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। একটি বাইভালভ NCBI ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (e মান < 1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN-এর সাথে মার্জ করা রিডগুলি টীকা করা হয়েছিল, এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার ক্রমগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатвых 1e-3 এবং 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [২৬]। NCBI বাইভালভ ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (e মান < 1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে পুল করা রিডগুলি টীকা করা হয়েছিল, এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার সিকোয়েন্স মাস্কিং করা হয়েছিল।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买甶D, [ST用DU6]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合幨 读湔] dust 忶类 [2]进行 复杂度 序列 的..。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствохорчам данных (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности NCBI বাইভালভ ট্যাক্সোনমিক ডাটাবেস (e মান <1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN দিয়ে পুল করা রিডগুলি টীকা করা হয়েছিল, এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার সিকোয়েন্স মাস্কিং করা হয়েছিল।রিডগুলিকে দুটি গ্রুপে ভাগ করা হয়েছিল: বাইভালভ সিকোয়েন্সের সাথে সম্পর্কিত (এখানে স্ব-পঠন বলা হয়) এবং সম্পর্কহীন (অ-স্ব-পঠন)। কনটিগ তৈরি করতে MEGAHIT ব্যবহার করে দুটি গ্রুপ আলাদাভাবে একত্রিত করা হয়েছিল [27]। ইতিমধ্যে, এলিয়েন মাইক্রোবায়োম রিডের ট্যাক্সোনমিক বিতরণকে Kraken2 [28] ব্যবহার করে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল এবং Galaxy [29, 30]-এ একটি Krona পাই চার্ট দ্বারা গ্রাফিক্যালি উপস্থাপন করা হয়েছিল। আমাদের প্রাথমিক পরীক্ষাগুলি থেকে সর্বোত্তম kmers kmers-59 হিসাবে নির্ধারিত হয়েছিল। এরপর চূড়ান্ত টীকা তৈরির জন্য BLASTN (bivalve NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে সারিবদ্ধকরণের মাধ্যমে স্ব-সংলগ্ন স্থানগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল। এরপর চূড়ান্ত টীকা তৈরির জন্য BLASTN (bivalve NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে সারিবদ্ধকরণের মাধ্যমে স্ব-সংলগ্ন স্থানগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. এরপর চূড়ান্ত টীকার জন্য BLASTN (NCBI বাইভালভ ডাটাবেস, e মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে মিল করে স্ব-সংলগ্নতা সনাক্ত করা হয়েছিল।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)। এরপর BLASTN (NCBI বাইভালভ ডাটাবেস, e মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে মিল করে চূড়ান্ত টীকার জন্য স্ব-সংলগ্নতা চিহ্নিত করা হয়েছিল। সমান্তরালভাবে, নন-সেলফ গ্রুপ কনটিগগুলিকে BLASTN (nt NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা দেওয়া হয়েছিল। সমান্তরালভাবে, নন-সেলফ গ্রুপ কনটিগগুলিকে BLASTN (nt NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা দেওয়া হয়েছিল। Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои)। সমান্তরালভাবে, বিদেশী গ্রুপ কনটিগগুলিকে BLASTN (NT NCBI ডাটাবেস, e মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা দেওয়া হয়েছিল।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群। Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt NCBI, গোমোলজি 60%)। সমান্তরালভাবে, নন-সেল্ফ গ্রুপ কনটিগগুলিকে BLASTN (nt NCBI ডাটাবেস, e মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা দেওয়া হয়েছিল। nr এবং RefSeq প্রোটিন NCBI ডাটাবেস (e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে নন-সেলফ কনটিগগুলিতেও BLASTX পরিচালিত হয়েছিল। nr এবং RefSeq প্রোটিন NCBI ডাটাবেস (e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে নন-সেলফ কনটিগগুলিতেও BLASTX পরিচালিত হয়েছিল। ব্লাস্টএক্স ট্যাকজেন এনসিবিআই 60%)। nr এবং RefSeq NCBI প্রোটিন ডাটাবেস (e মান < 1e-10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে নন-সেলফ কনটিগগুলিতেও BLASTX সঞ্চালিত হয়েছিল।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. ব্লাস্টএক্স ট্যাক্স 60%)। nr এবং RefSeq NCBI প্রোটিন ডাটাবেস (e মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে নন-সেলফ কনটিগগুলিতেও BLASTX সঞ্চালিত হয়েছিল।নন-সেলফ-কন্টিগের BLASTN এবং BLASTX পুলগুলি চূড়ান্ত কন্টিগগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে (পরিপূরক ফাইল দেখুন)।
PCR-এর জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি সারণি S1-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। Taq DNA পলিমারেজ (বায়ো বেসিক কানাডা, মার্কহ্যাম, ON) ccfDNA টার্গেট জিনগুলিকে প্রশস্ত করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। নিম্নলিখিত প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: 95°C তাপমাত্রায় 3 মিনিটের জন্য বিকৃতকরণ, 95°C তাপমাত্রায় 1 মিনিটের জন্য, 1 মিনিটের জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা সেট করুন, 72°C তাপমাত্রায় 1 মিনিটের জন্য প্রসারিত করুন, 35টি চক্র এবং অবশেষে 10 মিনিটের মধ্যে 72°C তাপমাত্রায়। । PCR পণ্যগুলিকে 95 V তাপমাত্রায় SYBRTM সেফ DNA জেল স্টেইন (ইনভিট্রোজেন, বার্লিংটন, ON, কানাডা) ধারণকারী অ্যাগারোজ জেলগুলিতে (1.5%) ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল।
ঝিনুক (Mytilus spp.) কে ৪°C তাপমাত্রায় ২৪ ঘন্টার জন্য ৫০০ মিলি অক্সিজেনযুক্ত সমুদ্রের জলে (৩২ PSU) অভ্যস্ত করা হয়েছিল। ১৯০ μg/μl এর চূড়ান্ত ঘনত্বে মানব গ্যালেক্টিন-৭ cDNA সিকোয়েন্স (NCBI অ্যাকসেসন নম্বর L07769) এনকোডিং সন্নিবেশযুক্ত প্লাজমিড ডিএনএ ভায়ালে যোগ করা হয়েছিল। DNA সংযোজন ছাড়াই একই পরিস্থিতিতে ইনকিউবেট করা ঝিনুকগুলি নিয়ন্ত্রণ ছিল। তৃতীয় নিয়ন্ত্রণ ট্যাঙ্কে ঝিনুক ছাড়াই ডিএনএ ছিল। সমুদ্রের জলে DNA এর মান পর্যবেক্ষণ করার জন্য, নির্দেশিত সময়ে প্রতিটি ট্যাঙ্ক থেকে সমুদ্রের জলের নমুনা (২০ μl; তিনটি পুনরাবৃত্তি) নেওয়া হয়েছিল। প্লাজমিড DNA ট্রেসেবিলিটির জন্য, নির্দেশিত সময়ে LB ঝিনুক সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং qPCR এবং ddPCR দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সমুদ্রের জলে লবণের পরিমাণ বেশি থাকার কারণে, সমস্ত PCR পরীক্ষার আগে PCR মানের জলে (১:১০) অ্যালিকোটগুলিকে পাতলা করা হয়েছিল।
ডিজিটাল ড্রপলেট পিসিআর (ddPCR) BioRad QX200 প্রোটোকল (মিসিসাউগা, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। সর্বোত্তম তাপমাত্রা নির্ধারণের জন্য তাপমাত্রা প্রোফাইল ব্যবহার করুন (টেবিল S1)। QX200 ড্রপ জেনারেটর (BioRad) ব্যবহার করে ড্রপ তৈরি করা হয়েছিল। ddPCR নিম্নরূপে সঞ্চালিত হয়েছিল: 5 মিনিটের জন্য 95°C, 30 সেকেন্ডের জন্য 95°C এর 50টি চক্র এবং 1 মিনিটের জন্য একটি নির্দিষ্ট অ্যানিলিং তাপমাত্রা এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72°C, 5 মিনিটের জন্য 4°C এবং 5 মিনিটের মধ্যে 90°C। QX200 ড্রপ রিডার (BioRad) ব্যবহার করে ড্রপের সংখ্যা এবং ইতিবাচক প্রতিক্রিয়া (কপি/µl সংখ্যা) পরিমাপ করা হয়েছিল। 10,000 এর কম ফোঁটা সহ নমুনাগুলি প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। প্রতিবার ddPCR চালানোর সময় প্যাটার্ন নিয়ন্ত্রণ করা হয়নি।
qPCR পরীক্ষাটি Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) এবং LGALS7 নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে করা হয়েছিল। QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ব্যবহার করে 20 μl এ সমস্ত পরিমাণগত PCR পরীক্ষা করা হয়েছিল। qPCR পরীক্ষাটি 95°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের ইনকিউবেশন দিয়ে শুরু হয়েছিল, তারপরে 95°C তাপমাত্রায় 10 সেকেন্ডের জন্য 40টি চক্র এবং 60°C তাপমাত্রায় 60 সেকেন্ডের জন্য একটি ডেটা সংগ্রহের মাধ্যমে করা হয়েছিল। 5 সেকেন্ডের জন্য 95°C, 60 সেকেন্ডের জন্য 65°C এবং qPCR পরীক্ষার শেষে 97°C তাপমাত্রায় ধারাবাহিক পরিমাপ ব্যবহার করে গলনাঙ্ক তৈরি করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ নমুনা ছাড়া প্রতিটি qPCR তিনটি প্রতিলিপিতে করা হয়েছিল।
যেহেতু ঝিনুকগুলি তাদের উচ্চ পরিস্রাবণ হারের জন্য পরিচিত, তাই আমরা প্রথমে অনুসন্ধান করেছিলাম যে তারা সমুদ্রের জলে উপস্থিত ডিএনএ টুকরো ফিল্টার করতে এবং ধরে রাখতে পারে কিনা। আমরা এই টুকরোগুলি তাদের আধা-খোলা লিম্ফ্যাটিক সিস্টেমে জমা হয় কিনা তা নিয়েও আগ্রহী ছিলাম। নীল ঝিনুকের ট্যাঙ্কে যোগ করা দ্রবণীয় ডিএনএ টুকরোগুলির ভাগ্য সনাক্ত করে আমরা পরীক্ষামূলকভাবে এই সমস্যাটি সমাধান করেছি। ডিএনএ টুকরো ট্র্যাকিং সহজতর করার জন্য, আমরা মানুষের গ্যালেক্টিন-7 জিন ধারণকারী বিদেশী (স্বয়ংক্রিয় নয়) প্লাজমিড ডিএনএ ব্যবহার করেছি। ddPCR সমুদ্রের জল এবং ঝিনুকের মধ্যে প্লাজমিড ডিএনএ টুকরোগুলি সনাক্ত করে। আমাদের ফলাফল দেখায় যে যদি ঝিনুকের অনুপস্থিতিতে সমুদ্রের জলে ডিএনএ টুকরোগুলির পরিমাণ সময়ের সাথে তুলনামূলকভাবে স্থির থাকে (7 দিন পর্যন্ত), তবে ঝিনুকের উপস্থিতিতে এই স্তরটি 8 ঘন্টার মধ্যে প্রায় সম্পূর্ণরূপে অদৃশ্য হয়ে যায় (চিত্র 1a, b)। বহির্মুখী ডিএনএর টুকরোগুলি ইন্ট্রাভালভুলার তরল এবং হিমোলিম্ফে 15 মিনিটের মধ্যে সহজেই সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 1c)। এই টুকরোগুলি এক্সপোজারের 4 ঘন্টা পর্যন্ত সনাক্ত করা যেতে পারে। ডিএনএ খণ্ডের ক্ষেত্রে এই ফিল্টারিং কার্যকলাপ ব্যাকটেরিয়া এবং শৈবালের ফিল্টারিং কার্যকলাপের সাথে তুলনীয় [31]। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ঝিনুকগুলি তাদের তরল বগিতে বিদেশী ডিএনএ ফিল্টার এবং জমা করতে পারে।
ঝিনুকের উপস্থিতি (A) বা অনুপস্থিতিতে (B) সমুদ্রের জলে প্লাজমিড ডিএনএর আপেক্ষিক ঘনত্ব, ddPCR দ্বারা পরিমাপ করা হয়। A-তে, ফলাফলগুলি শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়, বাক্সগুলির সীমানা 75 তম এবং 25 তম শতাংশকে প্রতিনিধিত্ব করে। লাগানো লগারিদমিক বক্ররেখা লাল রঙে দেখানো হয়েছে, এবং ধূসর রঙে ছায়াযুক্ত এলাকাটি 95% আত্মবিশ্বাস ব্যবধানকে প্রতিনিধিত্ব করে। B-তে, লাল রেখা গড়কে প্রতিনিধিত্ব করে এবং নীল রেখা ঘনত্বের জন্য 95% আত্মবিশ্বাস ব্যবধানকে প্রতিনিধিত্ব করে। C প্লাজমিড ডিএনএ যোগ করার পরে বিভিন্ন সময়ে ঝিনুকের হেমোলিম্ফ এবং ভালভুলার তরলে প্লাজমিড ডিএনএ জমা হওয়া। ফলাফলগুলি সনাক্ত করা পরম কপি/mL (±SE) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়।
এরপর, আমরা কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জের ঝিনুকের বিছানা থেকে সংগৃহীত ঝিনুকের মধ্যে ccfDNA-এর উৎপত্তি তদন্ত করেছি, যা সীমিত নৃতাত্ত্বিক প্রভাব সহ একটি প্রত্যন্ত দ্বীপপুঞ্জ। এই উদ্দেশ্যে, ঝিনুকের হেমোলিম্ফ থেকে cccDNA বিচ্ছিন্ন করে মানুষের cccDNA বিশুদ্ধ করার জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতি ব্যবহার করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল [32, 33]। আমরা দেখতে পেয়েছি যে ঝিনুকের গড় হিমোলিম্ফ ccfDNA ঘনত্ব প্রতি মিলি হিমোলিম্ফ পরিসরে কম মাইক্রোগ্রাম (টেবিল S2, পরিপূরক তথ্য দেখুন)। ঘনত্বের এই পরিসর সুস্থ মানুষের তুলনায় অনেক বেশি (প্রতি মিলিলিটারে কম ন্যানোগ্রাম), তবে বিরল ক্ষেত্রে, ক্যান্সার রোগীদের ক্ষেত্রে, ccfDNA-এর মাত্রা প্রতি মিলিলিটারে বেশ কয়েকটি মাইক্রোগ্রামে পৌঁছাতে পারে [34, 35]। হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর আকার বন্টনের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই টুকরোগুলি আকারে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, 1000 bp থেকে 1000 bp পর্যন্ত। 5000 bp পর্যন্ত (চিত্র 2)। সিলিকা-ভিত্তিক QIAamp ইনভেস্টিগেটর কিট ব্যবহার করে অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে, যা সাধারণত ফরেনসিক বিজ্ঞানে ccfDNA সহ কম ঘনত্বের DNA নমুনা থেকে জিনোমিক DNA দ্রুত বিচ্ছিন্ন এবং বিশুদ্ধ করার জন্য ব্যবহৃত হয় [36]।
ঝিনুকের হেমোলিম্ফের প্রতিনিধিত্বকারী ccfDNA ইলেক্ট্রোফোরেগ্রাম। নিউক্লিওস্ন্যাপ প্লাজমা কিট (শীর্ষ) এবং QIAamp DNA ইনভেস্টিগেটর কিট দিয়ে নিষ্কাশিত। B ভায়োলিন প্লট ঝিনুকের মধ্যে হেমোলিম্ফ ccfDNA ঘনত্ব (±SE) বন্টন দেখায়। কালো এবং লাল রেখাগুলি যথাক্রমে মধ্যমা এবং প্রথম এবং তৃতীয় কোয়ার্টাইলকে প্রতিনিধিত্ব করে।
মানুষ এবং প্রাইমেটদের মধ্যে প্রায় ১% ccfDNA এর একটি বিদেশী উৎস রয়েছে [21, 37]। বাইভালভের আধা-খোলা সংবহনতন্ত্র, জীবাণু সমৃদ্ধ সমুদ্রের জল এবং ঝিনুকের ccfDNA এর আকার বন্টনের কারণে, আমরা অনুমান করেছি যে ঝিনুকের হেমোলিম্ফ ccfDNA তে জীবাণু DNA এর একটি সমৃদ্ধ এবং বৈচিত্র্যময় পুল থাকতে পারে। এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা Kerguelen দ্বীপপুঞ্জ থেকে সংগৃহীত Aulacomya atra নমুনা থেকে hemolymph ccfDNA সিকোয়েন্স করেছি, যার মধ্যে ১ কোটিরও বেশি রিড পাওয়া গেছে, যার মধ্যে ৯৭.৬% মান নিয়ন্ত্রণে উত্তীর্ণ হয়েছে। এরপর BLASTN এবং NCBI বাইভালভ ডাটাবেস ব্যবহার করে রিডিংগুলিকে স্ব-এবং-স্ব-উৎস অনুসারে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল (চিত্র S1, পরিপূরক তথ্য)।
মানুষের ক্ষেত্রে, নিউক্লিয়ার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল উভয় ডিএনএই রক্তপ্রবাহে নির্গত হতে পারে [38]। তবে, বর্তমান গবেষণায়, ঝিনুকের নিউক্লিয়ার জিনোমিক ডিএনএ বিস্তারিতভাবে বর্ণনা করা সম্ভব হয়নি, কারণ A. atra জিনোমকে ক্রমানুসারে বা বর্ণনা করা হয়নি। তবে, আমরা বাইভালভ লাইব্রেরি ব্যবহার করে আমাদের নিজস্ব উৎপত্তির বেশ কয়েকটি ccfDNA টুকরো সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য)। আমরা সিকোয়েন্স করা A. atra জিনগুলির নির্দেশিত PCR পরিবর্ধনের মাধ্যমে আমাদের নিজস্ব উৎপত্তির DNA টুকরোগুলির উপস্থিতিও নিশ্চিত করেছি (চিত্র 3)। একইভাবে, যেহেতু A. atra-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোম পাবলিক ডাটাবেসে পাওয়া যায়, তাই A. atra-এর হিমোলিম্ফে মাইটোকন্ড্রিয়াল ccfDNA টুকরোগুলির উপস্থিতির প্রমাণ পাওয়া যেতে পারে। পিসিআর পরিবর্ধনের মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ টুকরোগুলির উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল (চিত্র 3)।
A. atra (লাল বিন্দু - স্টক নম্বর: SRX5705969) এবং M. platensis (নীল বিন্দু - স্টক নম্বর: SRX5705968) এর হিমোলিম্ফে বিভিন্ন মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন উপস্থিত ছিল যা PCR দ্বারা পরিবর্ধিত করা হয়েছিল। চিত্রটি Breton et al., 2011 B থেকে গৃহীত। A. atra থেকে হিমোলিম্ফ সুপারনাট্যান্টের পরিবর্ধন FTA কাগজে সংরক্ষিত। PCR মিশ্রণ ধারণকারী PCR টিউবে সরাসরি যোগ করতে 3 মিমি পাঞ্চ ব্যবহার করুন।
সমুদ্রের জলে প্রচুর পরিমাণে জীবাণুঘটিত উপাদান থাকায়, আমরা প্রথমে হিমোলিম্ফে জীবাণুঘটিত ডিএনএ সিকোয়েন্সের বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছিলাম। এটি করার জন্য, আমরা দুটি ভিন্ন কৌশল ব্যবহার করি। প্রথম কৌশলটি Kraken2 ব্যবহার করে, একটি অ্যালগরিদম-ভিত্তিক সিকোয়েন্স শ্রেণীবিভাগ প্রোগ্রাম যা BLAST এবং অন্যান্য সরঞ্জামের সাথে তুলনীয় নির্ভুলতার সাথে জীবাণুঘটিত সিকোয়েন্স সনাক্ত করতে পারে [28]। 6719 টিরও বেশি রিড ব্যাকটেরিয়া উৎপত্তির বলে নির্ধারিত হয়েছিল, যেখানে 124 এবং 64 যথাক্রমে আর্কিয়া এবং ভাইরাস থেকে ছিল (চিত্র 4)। সর্বাধিক প্রচুর ব্যাকটেরিয়া ডিএনএ খণ্ড ছিল Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), এবং Bacteroidetes (17%) (চিত্র 4a)। এই বন্টনটি সামুদ্রিক নীল ঝিনুকের মাইক্রোবায়োমের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ [39, 40]। গামাপ্রোটোব্যাকটেরিয়া ছিল প্রোটিওব্যাকটেরিয়ার (44%) প্রধান শ্রেণী, যার মধ্যে অনেক Vibrionales (চিত্র 4b) অন্তর্ভুক্ত ছিল। ddPCR পদ্ধতি A. atra hemolymph (চিত্র 4c) [41] এর ccfDNA-তে Vibrio DNA খণ্ডের উপস্থিতি নিশ্চিত করেছে। ccfDNA-এর ব্যাকটেরিয়া উৎপত্তি সম্পর্কে আরও তথ্য পেতে, একটি অতিরিক্ত পদ্ধতি গ্রহণ করা হয়েছিল (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য)। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপ করা রিডগুলিকে পেয়ারড-এন্ড রিড হিসাবে একত্রিত করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e−3 এর e মান এবং >90% হোমোলজি সহ একটি কাটঅফ ব্যবহার করে স্ব (দ্বিভালভ) বা অ-স্ব উৎপত্তি হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপ করা রিডগুলিকে পেয়ারড-এন্ড রিড হিসাবে একত্রিত করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e−3 এর e মান এবং >90% হোমোলজি সহ একটি কাটঅফ ব্যবহার করে স্ব (দ্বিভালভ) বা অ-স্ব উৎপত্তি হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как совыстерустем моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 এবং отсечения с гомологией> 90%। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলিকে জোড়া-সমাপ্ত রিড হিসাবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e-3 এর e মান এবং 90% সমতুল্যতার সাথে কাটঅফ ব্যবহার করে স্থানীয় (বাইভালভ) বা অ-মৌলিক হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 ব্লাস্ট 和 和1 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 . . . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলিকে জোড়া-সমাপ্ত রিড হিসাবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং e BLASTN এবং 1e-3 মান এবং একটি হোমোলজি থ্রেশহোল্ড >90% ব্যবহার করে নিজস্ব (দ্বিভালভ) বা অ-মৌলিক হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।যেহেতু A. atra জিনোম এখনও সিকোয়েন্স করা হয়নি, তাই আমরা MEGAHIT নেক্সট জেনারেশন সিকোয়েন্সিং (NGS) অ্যাসেম্বলারের ডি নভো অ্যাসেম্বলি কৌশল ব্যবহার করেছি। মোট 147,188টি কনটিগকে নির্ভরশীল (বাইভালভ) উৎপত্তিস্থল হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছে। এই কনটিগগুলিকে BLASTN এবং BLASTX ব্যবহার করে 1e-10 এর e-মান দিয়ে বিস্ফোরিত করা হয়েছিল। এই কৌশলটি আমাদের A. atra ccfDNA-তে উপস্থিত 482টি নন-বাইভালভ টুকরো সনাক্ত করতে সাহায্য করেছিল। এই DNA টুকরোগুলির অর্ধেকেরও বেশি (57%) ব্যাকটেরিয়া থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল, প্রধানত ফুলকা প্রতীক থেকে, যার মধ্যে সালফোট্রফিক প্রতীক রয়েছে, এবং ফুলকা প্রতীক থেকে Solemya velum (চিত্র 5)।
টাইপ স্তরে আপেক্ষিক প্রাচুর্য। B দুটি প্রধান ফাইলার (ফার্মিকিউটস এবং প্রোটিওব্যাকটেরিয়া) মাইক্রোবায়াল বৈচিত্র্য। ddPCR এর প্রতিনিধিত্বমূলক প্রসারণ C Vibrio spp। A. তিনটি অ্যাট্রা হিমোলিম্ফে 16S rRNA জিনের (নীল) টুকরো।
মোট ৪৮২টি সংগৃহীত কন্টিগ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মেটাজেনমিক কন্টিগ টীকাগুলির (প্রোক্যারিওট এবং ইউক্যারিওট) ট্যাক্সোনমিক বিতরণের সাধারণ প্রোফাইল। B BLASTN এবং BLASTX দ্বারা চিহ্নিত ব্যাকটেরিয়া ডিএনএ খণ্ডের বিস্তারিত বিতরণ।
Kraken2 বিশ্লেষণে আরও দেখা গেছে যে ঝিনুকের ccfDNA-তে আর্কিয়াল ডিএনএ টুকরো রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে ইউরিয়ার্চাওটা (65%), ক্রেনারচাওটা (24%) এবং থাউরমারচাওটা (11%) এর ডিএনএ টুকরো (চিত্র 6a)। ক্যালিফোর্নিয়ার ঝিনুকের জীবাণু সম্প্রদায়ে পূর্বে পাওয়া ইউরিয়ার্চাওটা এবং ক্রেনারচাওটা থেকে প্রাপ্ত ডিএনএ টুকরোর উপস্থিতি অবাক করার মতো নয় [42]। যদিও ইউরিয়ার্চাওটা প্রায়শই চরম অবস্থার সাথে যুক্ত, এখন এটি স্বীকৃত যে ইউরিয়ার্চাওটা এবং ক্রেনারচাওটা উভয়ই সামুদ্রিক ক্রায়োজেনিক পরিবেশে সবচেয়ে সাধারণ প্রোক্যারিওটগুলির মধ্যে একটি [43, 44]। কেরগুয়েলেন মালভূমিতে তলদেশের লিক থেকে ব্যাপক মিথেন লিক এবং কেরগুয়েলেন দ্বীপপুঞ্জের উপকূলে সম্ভাব্য মাইক্রোবিয়াল মিথেন উৎপাদনের সাম্প্রতিক প্রতিবেদনের পরিপ্রেক্ষিতে ঝিনুকগুলিতে মিথেনোজেনিক অণুজীবের উপস্থিতি আশ্চর্যজনক নয় [45]।
এরপর আমাদের মনোযোগ ডিএনএ ভাইরাস থেকে প্রাপ্ত তথ্যের দিকে চলে যায়। আমাদের জ্ঞান অনুসারে, এটি ঝিনুকের ভাইরাসের উপাদানের প্রথম অফ-টার্গেট গবেষণা। যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল, আমরা ব্যাকটিরিওফেজ (কৌডোভাইরালস) এর ডিএনএ টুকরো পেয়েছি (চিত্র 6b)। তবে, সবচেয়ে সাধারণ ভাইরাল ডিএনএ নিউক্লিওসাইটোভাইরাসের একটি ফাইলাম থেকে আসে, যা নিউক্লিয়ার সাইটোপ্লাজমিক লার্জ ডিএনএ ভাইরাস (NCLDV) নামেও পরিচিত, যার জিনোম যেকোনো ভাইরাসের মধ্যে সবচেয়ে বড়। এই ফাইলামের মধ্যে, বেশিরভাগ ডিএনএ সিকোয়েন্স মিমিমিডোভিরিডে (58%) এবং পক্সভিরিডে (21%) পরিবারের অন্তর্গত, যাদের প্রাকৃতিক হোস্ট মেরুদণ্ডী প্রাণী এবং আর্থ্রোপড, যখন এই ডিএনএ সিকোয়েন্সের একটি ছোট অংশ পরিচিত ভাইরোলজিক্যাল শৈবালের অন্তর্গত। সামুদ্রিক ইউক্যারিওটিক শৈবালকে সংক্রামিত করে। সিকোয়েন্সগুলি প্যান্ডোরা ভাইরাস থেকেও প্রাপ্ত হয়েছিল, যে কোনও পরিচিত ভাইরাল জেনারার বৃহত্তম জিনোম আকারের বিশাল ভাইরাস। মজার বিষয় হল, হেমোলিম্ফ ccfDNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্ধারিত ভাইরাস দ্বারা সংক্রামিত বলে পরিচিত হোস্টের পরিসর তুলনামূলকভাবে বড় ছিল (চিত্র S3, পরিপূরক তথ্য)। এতে Baculoviridae এবং Iridoviridae এর মতো পোকামাকড়কে সংক্রামিত করে এমন ভাইরাস, সেইসাথে অ্যামিবা, শৈবাল এবং মেরুদণ্ডী প্রাণীদের সংক্রামিত করে এমন ভাইরাসও অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। আমরা Pithovirus sibericum জিনোমের সাথে মিলিত ক্রমগুলিও খুঁজে পেয়েছি। Pitovirus ("zombie virus" নামেও পরিচিত) প্রথমে সাইবেরিয়ার 30,000 বছরের পুরনো পারমাফ্রস্ট থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল [47]। সুতরাং, আমাদের ফলাফল পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে দেখায় যে এই ভাইরাসগুলির সমস্ত আধুনিক প্রজাতি বিলুপ্ত নয় [48] এবং এই ভাইরাসগুলি দূরবর্তী উপ-আর্কটিক সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত থাকতে পারে।
অবশেষে, আমরা পরীক্ষা করে দেখলাম যে আমরা অন্যান্য বহুকোষী প্রাণীর ডিএনএ টুকরো খুঁজে পেতে পারি কিনা। nt, nr এবং RefSeq লাইব্রেরি (জিনোমিক এবং প্রোটিন) ব্যবহার করে BLASTN এবং BLASTX দ্বারা মোট 482টি বিদেশী কনটিগ সনাক্ত করা হয়েছিল। আমাদের ফলাফল দেখায় যে বহুকোষী প্রাণীর ccfDNA এর বিদেশী টুকরোগুলির মধ্যে হাড়ের হাড়ের ডিএনএ প্রাধান্য পায় (চিত্র 5)। পোকামাকড় এবং অন্যান্য প্রজাতির ডিএনএ টুকরোও পাওয়া গেছে। ডিএনএ টুকরোগুলির একটি অপেক্ষাকৃত বড় অংশ সনাক্ত করা যায়নি, সম্ভবত স্থলজ প্রজাতির তুলনায় জিনোমিক ডাটাবেসে বিপুল সংখ্যক সামুদ্রিক প্রজাতির কম প্রতিনিধিত্বের কারণে [49]।
বর্তমান গবেষণাপত্রে, আমরা ঝিনুকের ক্ষেত্রে LB ধারণাটি প্রয়োগ করেছি, যুক্তি দিয়েছি যে হিমোলিম্ফ ccfDNA শট সিকোয়েন্সিং সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের গঠন সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। বিশেষ করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে 1) ঝিনুকের হিমোলিম্ফে তুলনামূলকভাবে উচ্চ ঘনত্ব (মাইক্রোগ্রাম স্তর) রয়েছে যা তুলনামূলকভাবে বড় (~1-5 kb) সঞ্চালিত DNA খণ্ড; 2) এই DNA খণ্ডগুলি স্বাধীন এবং অ-স্বাধীন উভয়ই 3) এই DNA খণ্ডগুলির বিদেশী উৎসগুলির মধ্যে, আমরা ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়েল এবং ভাইরাল DNA, সেইসাথে অন্যান্য বহুকোষী প্রাণীর DNA খুঁজে পেয়েছি; 4) হিমোলিম্ফে এই বিদেশী ccfDNA খণ্ডগুলির জমা দ্রুত ঘটে এবং ঝিনুকের অভ্যন্তরীণ ফিল্টারিং কার্যকলাপে অবদান রাখে। উপসংহারে, আমাদের গবেষণা দেখায় যে LB ধারণাটি, যা এখনও পর্যন্ত প্রধানত জৈব চিকিৎসা ক্ষেত্রে প্রয়োগ করা হয়েছে, জ্ঞানের একটি সমৃদ্ধ কিন্তু অনাবিষ্কৃত উৎসকে এনকোড করে যা সেন্টিনেল প্রজাতি এবং তাদের পরিবেশের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া আরও ভালভাবে বোঝার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
প্রাইমেট ছাড়াও, স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে ccfDNA বিচ্ছিন্নতার খবর পাওয়া গেছে, যার মধ্যে রয়েছে ইঁদুর, কুকুর, বিড়াল এবং ঘোড়া [50, 51, 52]। তবে, আমাদের জানা মতে, আমাদের গবেষণাটিই প্রথম যেখানে উন্মুক্ত সঞ্চালন ব্যবস্থা সহ সামুদ্রিক প্রজাতির ccfDNA সনাক্তকরণ এবং ক্রম নির্ধারণের রিপোর্ট করা হয়েছে। ঝিনুকের এই শারীরবৃত্তীয় বৈশিষ্ট্য এবং ফিল্টারিং ক্ষমতা, অন্তত আংশিকভাবে, অন্যান্য প্রজাতির তুলনায় সঞ্চালনকারী DNA খণ্ডগুলির বিভিন্ন আকারের বৈশিষ্ট্য ব্যাখ্যা করতে পারে। মানুষের ক্ষেত্রে, রক্তে সঞ্চালিত বেশিরভাগ DNA খণ্ড হল ছোট ছোট টুকরো যার আকার 150 থেকে 200 bp পর্যন্ত। যার সর্বোচ্চ সর্বোচ্চ 167 bp [34, 53]। DNA খণ্ডগুলির একটি ছোট কিন্তু উল্লেখযোগ্য অংশ 300 থেকে 500 bp আকারের মধ্যে, এবং প্রায় 5% 900 bp এর চেয়ে দীর্ঘ। [54]। এই আকার বন্টনের কারণ হল, প্লাজমাতে ccfDNA-এর প্রধান উৎস কোষের মৃত্যুর ফলে ঘটে, হয় কোষের মৃত্যুর কারণে অথবা সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে সঞ্চালিত হেমাটোপয়েটিক কোষের নেক্রোসিসের কারণে অথবা ক্যান্সার রোগীদের টিউমার কোষের অ্যাপোপটোসিসের কারণে (যা সঞ্চালিত টিউমার DNA নামে পরিচিত)। , ctDNA)। ঝিনুকগুলিতে আমরা যে হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর আকার বন্টন পেয়েছি তা 1000 থেকে 5000 bp পর্যন্ত ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে ঝিনুকের ccfDNA-এর একটি ভিন্ন উৎস রয়েছে। এটি একটি যৌক্তিক অনুমান, যেহেতু ঝিনুকের একটি আধা-খোলা ভাস্কুলার সিস্টেম থাকে এবং তারা মাইক্রোবিয়াল জিনোমিক DNA-এর উচ্চ ঘনত্বযুক্ত সামুদ্রিক জলজ পরিবেশে বাস করে। প্রকৃতপক্ষে, বহির্মুখী DNA ব্যবহার করে আমাদের পরীক্ষাগার পরীক্ষায় দেখা গেছে যে ঝিনুক সমুদ্রের জলে DNA টুকরো জমা করে, অন্তত কয়েক ঘন্টা পরে কোষীয় শোষণের পরে এগুলি অবনমিত হয় এবং/অথবা বিভিন্ন সংস্থায় মুক্তি পায় এবং/অথবা সংরক্ষণ করা হয়। কোষের বিরলতা (প্রোক্যারিওটিক এবং ইউক্যারিওটিক উভয়) বিবেচনা করে, ইন্ট্রাভালভুলার কম্পার্টমেন্ট ব্যবহার স্ব-উৎসের পাশাপাশি বিদেশী উৎস থেকে ccfDNA-এর পরিমাণ হ্রাস করবে। বাইভালভ সহজাত অনাক্রম্যতার গুরুত্ব এবং প্রচুর পরিমাণে সঞ্চালিত ফ্যাগোসাইটের গুরুত্ব বিবেচনা করে, আমরা আরও অনুমান করেছি যে বিদেশী ccfDNAও সঞ্চালিত ফ্যাগোসাইটে সমৃদ্ধ হয় যা অণুজীব এবং/অথবা কোষীয় ধ্বংসাবশেষ গ্রহণের পরে বিদেশী ডিএনএ জমা করে। একসাথে নেওয়া হলে, আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে বাইভালভ হেমোলিম্ফ ccfDNA আণবিক তথ্যের একটি অনন্য ভাণ্ডার এবং একটি সেন্টিনেল প্রজাতি হিসাবে তাদের অবস্থানকে শক্তিশালী করে।
আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে ব্যাকটেরিয়া থেকে প্রাপ্ত হেমোলিম্ফ ccfDNA খণ্ডের সিকোয়েন্সিং এবং বিশ্লেষণ হোস্ট ব্যাকটেরিয়া উদ্ভিদ এবং আশেপাশের সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত ব্যাকটেরিয়া সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করতে পারে। শট সিকোয়েন্সিং কৌশলগুলি কমেন্সাল ব্যাকটেরিয়া A. atra gill এর সিকোয়েন্স প্রকাশ করেছে যা প্রচলিত 16S rRNA সনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করা হলে মিস হত, কারণ এটি একটি রেফারেন্স লাইব্রেরি পক্ষপাত। প্রকৃতপক্ষে, Kerguelen-এ একই ঝিনুক স্তরে M. platensis থেকে সংগৃহীত LB ডেটার আমাদের ব্যবহারে দেখা গেছে যে ফুলকা-সম্পর্কিত ব্যাকটেরিয়া প্রতীকগুলির গঠন উভয় ঝিনুক প্রজাতির জন্য একই ছিল (চিত্র S4, পরিপূরক তথ্য)। দুটি জিনগতভাবে ভিন্ন ঝিনুকের এই মিল Kerguelen-এর ঠান্ডা, সালফারযুক্ত এবং আগ্নেয়গিরির জমাতে ব্যাকটেরিয়া সম্প্রদায়ের গঠন প্রতিফলিত করতে পারে [55, 56, 57, 58]। জৈব-টার্বেটেড উপকূলীয় অঞ্চল [59], যেমন পোর্ট-অ-ফ্রান্সের উপকূল থেকে ঝিনুক সংগ্রহ করার সময় সালফার-হ্রাসকারী অণুজীবের উচ্চ মাত্রা ভালভাবে বর্ণনা করা হয়েছে [59]। আরেকটি সম্ভাবনা হল, কমেন্সাল ঝিনুকের উদ্ভিদ অনুভূমিক সংক্রমণ দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে [60, 61]। সামুদ্রিক পরিবেশ, সমুদ্রতল পৃষ্ঠ এবং ঝিনুকের সিম্বিওটিক ব্যাকটেরিয়ার গঠনের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক নির্ধারণের জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। এই গবেষণাগুলি বর্তমানে চলমান।
সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রে জীববৈচিত্র্য মূল্যায়নের জন্য ঝিনুক ccfDNA ব্যবহারের অনেক সুবিধার মধ্যে হেমোলিম্ফ ccfDNA এর দৈর্ঘ্য এবং ঘনত্ব, এর পরিশোধনের সহজতা এবং দ্রুত শটগান সিকোয়েন্সিং করার জন্য উচ্চ মানের। এই পদ্ধতিটি একটি নির্দিষ্ট বাস্তুতন্ত্রে ভাইরাল সম্প্রদায় (ভাইরোম) চিহ্নিত করার জন্য বিশেষভাবে কার্যকর [62, 63]। ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ইউক্যারিওটের বিপরীতে, ভাইরাল জিনোমে 16S সিকোয়েন্সের মতো ফাইলোজেনেটিকভাবে সংরক্ষিত জিন থাকে না। আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ঝিনুকের মতো সূচক প্রজাতির তরল বায়োপসি ব্যবহার করে উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে বসবাসকারী হোস্টগুলিকে সংক্রামিত করার জন্য পরিচিত তুলনামূলকভাবে বৃহৎ সংখ্যক ccfDNA ভাইরাসের টুকরো সনাক্ত করা যেতে পারে। এর মধ্যে প্রোটোজোয়া, আর্থ্রোপড, পোকামাকড়, উদ্ভিদ এবং ব্যাকটেরিয়া ভাইরাস (যেমন, ব্যাকটেরিওফেজ) সংক্রামিত করার জন্য পরিচিত ভাইরাস অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। কেরগুয়েলেনে একই ঝিনুক স্তরে সংগৃহীত নীল ঝিনুকের (এম. প্লাটেনসিস) হেমোলিম্ফ ccfDNA ভাইরোম পরীক্ষা করার সময় একই ধরণের বিতরণ পাওয়া গেছে (টেবিল S2, পরিপূরক তথ্য)। ccfDNA-এর শটগান সিকোয়েন্সিং প্রকৃতপক্ষে মানুষ বা অন্যান্য প্রজাতির ভাইরাসের গবেষণায় গতি পাচ্ছে এমন একটি নতুন পদ্ধতি [21, 37, 64]। এই পদ্ধতিটি ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ ভাইরাস অধ্যয়নের জন্য বিশেষভাবে কার্যকর, কারণ বাল্টিমোরের সবচেয়ে বৈচিত্র্যময় এবং বিস্তৃত শ্রেণীর ভাইরাসের প্রতিনিধিত্বকারী সমস্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ ভাইরাসের মধ্যে কোনও একক জিন সংরক্ষিত নেই [65]। যদিও এই ভাইরাসগুলির বেশিরভাগই অশ্রেণীবদ্ধ রয়ে গেছে এবং ভাইরাল জগতের সম্পূর্ণ অজানা অংশের ভাইরাস অন্তর্ভুক্ত থাকতে পারে [66], আমরা দেখেছি যে ঝিনুক A. atra এবং M. platensis-এর ভাইরাস এবং হোস্ট রেঞ্জ দুটি প্রজাতির মধ্যে পড়ে। একইভাবে (চিত্র S3, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)। এই সাদৃশ্যটি আশ্চর্যজনক নয়, কারণ এটি পরিবেশে উপস্থিত DNA গ্রহণের ক্ষেত্রে নির্বাচনীতার অভাবকে প্রতিফলিত করতে পারে। RNA ভাইরাসের বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের জন্য বর্তমানে বিশুদ্ধ RNA ব্যবহার করে ভবিষ্যতের গবেষণা প্রয়োজন।
আমাদের গবেষণায়, আমরা কোয়ারস্কি এবং তার সহকর্মীদের [37] কাজের উপর ভিত্তি করে একটি অত্যন্ত কঠোর পাইপলাইন ব্যবহার করেছি, যারা নেটিভ ccfDNA এর সমাবেশের আগে এবং পরে পুল করা রিড এবং কনটিগের দ্বি-পদক্ষেপ মুছে ফেলার পদ্ধতি ব্যবহার করেছিলেন, যার ফলে আনম্যাপ করা রিডের একটি উচ্চ অনুপাত তৈরি হয়েছিল। অতএব, আমরা এই বিষয়টি উড়িয়ে দিতে পারি না যে এই আনম্যাপ করা রিডগুলির কিছুর এখনও নিজস্ব উৎপত্তি থাকতে পারে, মূলত কারণ আমাদের কাছে এই ঝিনুক প্রজাতির জন্য কোনও রেফারেন্স জিনোম নেই। আমরা এই পাইপলাইনটিও ব্যবহার করেছি কারণ আমরা স্ব-এবং-স্ব-পঠনের মধ্যে কাইমেরা এবং ইলুমিনা MiSeq PE75 দ্বারা উৎপন্ন পঠন দৈর্ঘ্য সম্পর্কে উদ্বিগ্ন ছিলাম। বেশিরভাগ অ-চার্টেড রিডিংয়ের আরেকটি কারণ হল, বেশিরভাগ সামুদ্রিক জীবাণু, বিশেষ করে কেরগুয়েলেনের মতো প্রত্যন্ত অঞ্চলে, টীকা দেওয়া হয়নি। আমরা ইলুমিনা MiSeq PE75 ব্যবহার করেছি, ধরে নিচ্ছি যে ccfDNA খণ্ডের দৈর্ঘ্য মানুষের ccfDNA এর মতো। ভবিষ্যতের গবেষণার জন্য, আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে হিমোলিম্ফ ccfDNA মানুষ এবং/অথবা স্তন্যপায়ী প্রাণীর তুলনায় দীর্ঘতর পাঠযোগ্য, আমরা দীর্ঘতর ccfDNA খণ্ডগুলির জন্য উপযুক্ত একটি সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি। এই অনুশীলনটি আরও গভীর বিশ্লেষণের জন্য আরও ইঙ্গিত সনাক্ত করা অনেক সহজ করে তুলবে। বর্তমানে অনুপলব্ধ সম্পূর্ণ A. atra নিউক্লিয়ার জিনোম সিকোয়েন্স প্রাপ্তি স্ব-এবং অ-স্ব-উৎস থেকে ccfDNA-এর পার্থক্যকে ব্যাপকভাবে সহজতর করবে। যেহেতু আমাদের গবেষণা ঝিনুকের ক্ষেত্রে তরল বায়োপসির ধারণা প্রয়োগের সম্ভাবনার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে, আমরা আশা করি যে ভবিষ্যতের গবেষণায় এই ধারণাটি ব্যবহার করা হচ্ছে, ঝিনুকের জীবাণু বৈচিত্র্য অধ্যয়নের জন্য এই পদ্ধতির সম্ভাবনা বৃদ্ধি করার জন্য নতুন সরঞ্জাম এবং পাইপলাইন তৈরি করা হবে। সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্র।
একটি নন-ইনভেসিভ ক্লিনিক্যাল বায়োমার্কার হিসেবে, মানুষের প্লাজমায় ccfDNA এর উচ্চ মাত্রা বিভিন্ন রোগ, টিস্যুর ক্ষতি এবং চাপের অবস্থার সাথে সম্পর্কিত [67,68,69]। এই বৃদ্ধি টিস্যুর ক্ষতির পরে তার নিজস্ব উৎপত্তির DNA টুকরো মুক্তির সাথে সম্পর্কিত। আমরা তীব্র তাপ চাপ ব্যবহার করে এই সমস্যাটি সমাধান করেছি, যেখানে ঝিনুকগুলিকে 30 °C তাপমাত্রার সংস্পর্শে আনা হয়েছিল। আমরা তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায় তিনটি ভিন্ন ধরণের ঝিনুকের উপর এই বিশ্লেষণটি করেছি। তবে, তীব্র তাপ চাপের পরে আমরা ccfDNA স্তরে কোনও পরিবর্তন পাইনি (চিত্র S5, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)। এই আবিষ্কারটি অন্তত আংশিকভাবে ব্যাখ্যা করতে পারে যে ঝিনুকের একটি আধা-খোলা সংবহনতন্ত্র থাকে এবং তাদের উচ্চ ফিল্টারিং কার্যকলাপের কারণে প্রচুর পরিমাণে বিদেশী DNA জমা হয়। অন্যদিকে, অনেক অমেরুদণ্ডী প্রাণীর মতো ঝিনুকও চাপ-প্ররোচিত টিস্যুর ক্ষতির প্রতি বেশি প্রতিরোধী হতে পারে, যার ফলে তাদের হিমোলিম্ফে ccfDNA মুক্তি সীমিত হয় [70, 71]।
আজ অবধি, জলজ বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের ডিএনএ বিশ্লেষণ মূলত পরিবেশগত ডিএনএ (eDNA) মেটাবারকোডিংয়ের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে। তবে, প্রাইমার ব্যবহার করার সময় জীববৈচিত্র্য বিশ্লেষণে এই পদ্ধতিটি সাধারণত সীমিত। শটগান সিকোয়েন্সিং ব্যবহার পিসিআরের সীমাবদ্ধতা এবং প্রাইমার সেটের পক্ষপাতদুষ্ট নির্বাচনকে এড়িয়ে যায়। সুতরাং, এক অর্থে, আমাদের পদ্ধতিটি সম্প্রতি ব্যবহৃত উচ্চ-থ্রুপুট ইডিএনএ শটগান সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির কাছাকাছি, যা সরাসরি খণ্ডিত ডিএনএ সিকোয়েন্স করতে এবং প্রায় সমস্ত জীব বিশ্লেষণ করতে সক্ষম [72, 73]। তবে, বেশ কয়েকটি মৌলিক সমস্যা রয়েছে যা স্ট্যান্ডার্ড ইডিএনএ পদ্ধতি থেকে এলবিকে আলাদা করে। অবশ্যই, ইডিএনএ এবং এলবি-র মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল প্রাকৃতিক ফিল্টার হোস্টের ব্যবহার। ইডিএনএ অধ্যয়নের জন্য প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসাবে স্পঞ্জ এবং বাইভালভ (ড্রেসিনা এসপিপি) এর মতো সামুদ্রিক প্রজাতির ব্যবহার রিপোর্ট করা হয়েছে [74, 75]। তবে, ড্রেইসেনার গবেষণায় টিস্যু বায়োপসি ব্যবহার করা হয়েছিল যেখান থেকে ডিএনএ বের করা হয়েছিল। LB থেকে ccfDNA বিশ্লেষণের জন্য টিস্যু বায়োপসি, বিশেষায়িত এবং কখনও কখনও ব্যয়বহুল সরঞ্জাম এবং eDNA বা টিস্যু বায়োপসির সাথে সম্পর্কিত সরবরাহের প্রয়োজন হয় না। প্রকৃতপক্ষে, আমরা সম্প্রতি রিপোর্ট করেছি যে LB থেকে ccfDNA একটি কোল্ড চেইন বজায় না রেখে FTA সহায়তার মাধ্যমে সংরক্ষণ এবং বিশ্লেষণ করা যেতে পারে, যা প্রত্যন্ত অঞ্চলে গবেষণার জন্য একটি বড় চ্যালেঞ্জ [76]। তরল বায়োপসি থেকে ccfDNA নিষ্কাশনও সহজ এবং শটগান সিকোয়েন্সিং এবং PCR বিশ্লেষণের জন্য উচ্চ মানের DNA প্রদান করে। eDNA বিশ্লেষণের সাথে সম্পর্কিত কিছু প্রযুক্তিগত সীমাবদ্ধতার কারণে এটি একটি দুর্দান্ত সুবিধা [77]। নমুনা পদ্ধতির সরলতা এবং কম খরচ দীর্ঘমেয়াদী পর্যবেক্ষণ প্রোগ্রামের জন্যও বিশেষভাবে উপযুক্ত। তাদের উচ্চ ফিল্টারিং ক্ষমতা ছাড়াও, বাইভালভের আরেকটি সুপরিচিত বৈশিষ্ট্য হল তাদের শ্লেষ্মার রাসায়নিক মিউকোপলিস্যাকারাইড গঠন, যা ভাইরাসের শোষণকে উৎসাহিত করে [78, 79]। এটি বাইভালভকে একটি আদর্শ প্রাকৃতিক ফিল্টার করে তোলে জীববৈচিত্র্য এবং একটি নির্দিষ্ট জলজ বাস্তুতন্ত্রে জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব চিহ্নিত করার জন্য। যদিও eDNA-এর তুলনায় হোস্ট-উদ্ভূত DNA খণ্ডের উপস্থিতি পদ্ধতির সীমাবদ্ধতা হিসেবে দেখা যেতে পারে, স্বাস্থ্য গবেষণার জন্য উপলব্ধ বিপুল পরিমাণ তথ্যের জন্য eDNA-এর তুলনায় এই ধরনের নেটিভ ccfDNA থাকার খরচ একই সাথে বোধগম্য। অফসেট হোস্ট। এর মধ্যে হোস্ট হোস্টের জিনোমে সংহত ভাইরাল সিকোয়েন্সের উপস্থিতি অন্তর্ভুক্ত। বাইভালভে অনুভূমিকভাবে প্রেরিত লিউকেমিক রেট্রোভাইরাসের উপস্থিতি বিবেচনা করে ঝিনুকের জন্য এটি বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ [80, 81]। eDNA-এর তুলনায় LB-এর আরেকটি সুবিধা হল এটি হিমোলিম্ফে সঞ্চালিত রক্তকণিকার ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপকে কাজে লাগায়, যা অণুজীব (এবং তাদের জিনোম) গ্রাস করে। ফ্যাগোসাইটোসিস হল বাইভালভে রক্তকণিকার প্রধান কাজ [82]। অবশেষে, পদ্ধতিটি ঝিনুকের উচ্চ ফিল্টারিং ক্ষমতা (গড় 1.5 লি/ঘন্টা সমুদ্রের জল) এবং দুই দিনের সঞ্চালনের সুবিধা গ্রহণ করে, যা সমুদ্রের জলের বিভিন্ন স্তরের মিশ্রণ বৃদ্ধি করে, হেটেরোলগাস eDNA ক্যাপচারের অনুমতি দেয়। [83, 84]। সুতরাং, ঝিনুকের পুষ্টি, অর্থনৈতিক এবং পরিবেশগত প্রভাব বিবেচনা করে ঝিনুকের ccfDNA বিশ্লেষণ একটি আকর্ষণীয় উপায়। মানুষের কাছ থেকে সংগৃহীত LB বিশ্লেষণের অনুরূপ, এই পদ্ধতিটি বহিরাগত পদার্থের প্রতিক্রিয়ায় হোস্ট DNA-তে জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তন পরিমাপের সম্ভাবনাও উন্মুক্ত করে। উদাহরণস্বরূপ, ন্যানোপোর সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে স্থানীয় ccfDNA-তে জিনোম-ওয়াইড মিথাইলেশন বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি কল্পনা করা যেতে পারে। এই প্রক্রিয়াটি সহজতর করা উচিত কারণ ঝিনুকের ccfDNA খণ্ডগুলির দৈর্ঘ্য দীর্ঘ-পঠিত সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্মের সাথে আদর্শভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা রাসায়নিক রূপান্তরের প্রয়োজন ছাড়াই একক সিকোয়েন্সিং থেকে জিনোম-ওয়াইড ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ পরিচালনা করতে দেয়।85,86] এটি একটি আকর্ষণীয় সম্ভাবনা, কারণ এটি দেখানো হয়েছে যে DNA মিথাইলেশন প্যাটার্ন পরিবেশগত চাপের প্রতিক্রিয়া প্রতিফলিত করে এবং বহু প্রজন্ম ধরে স্থায়ী হয়। অতএব, এটি জলবায়ু পরিবর্তন বা দূষণকারীর সংস্পর্শে আসার পরে প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণকারী অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলির মূল্যবান অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে [87]। তবে, LB ব্যবহারের সীমাবদ্ধতা নেই। বলা বাহুল্য, এর জন্য বাস্তুতন্ত্রে সূচক প্রজাতির উপস্থিতি প্রয়োজন। উপরে উল্লিখিত হিসাবে, একটি নির্দিষ্ট বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য মূল্যায়নের জন্য LB ব্যবহার করার জন্য একটি কঠোর জৈব তথ্য প্রযুক্তিগত পাইপলাইনেরও প্রয়োজন যা উৎস থেকে DNA খণ্ডের উপস্থিতি বিবেচনা করে। আরেকটি প্রধান সমস্যা হল সামুদ্রিক প্রজাতির জন্য রেফারেন্স জিনোমের প্রাপ্যতা। আশা করা যায় যে মেরিন ম্যামাল জিনোমস প্রকল্প এবং সম্প্রতি প্রতিষ্ঠিত Fish10k প্রকল্প [88] এর মতো উদ্যোগগুলি ভবিষ্যতে এই ধরনের বিশ্লেষণকে সহজতর করবে। সামুদ্রিক ফিল্টার-খাওয়া জীবের ক্ষেত্রে LB ধারণার প্রয়োগ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির সর্বশেষ অগ্রগতির সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা পরিবেশগত চাপের প্রতিক্রিয়ায় সামুদ্রিক আবাসস্থলের স্বাস্থ্য সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদানের জন্য মাল্টি-ওহম বায়োমার্কারগুলির বিকাশের জন্য এটিকে উপযুক্ত করে তোলে।
জিনোম সিকোয়েন্সিং ডেটা NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808-এ বায়োপ্রজেক্টস SRR8924808-এর অধীনে জমা করা হয়েছে।
ব্রিয়ারলি এএস, কিংসফোর্ড এমজে সামুদ্রিক জীবন এবং বাস্তুতন্ত্রের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব। কোল জীববিজ্ঞান। ২০০৯; ১৯: পি৬০২–পি৬১৪।
গিসি ই, মানিয়া ই, মাজারিস এডি, ফ্রাশেটি এস, আলামপানিডো ভি, বেভিলাকোয়া এস, প্রমুখ। জলবায়ু পরিবর্তন এবং অন্যান্য স্থানীয় চাপের সম্মিলিত প্রভাব বিবেচনা করুন। সাধারণ বৈজ্ঞানিক পরিবেশ। 2021;755:142564।
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ) পহেলা মার্চের বিজ্ঞান। 2020; 7:48।
সেরন্ট এল, নিকাস্ট্রো সিআর, জারদি জিআই, গোবারভিল ই। পুনরাবৃত্তিমূলক তাপ চাপের পরিস্থিতিতে তাপ সহনশীলতা হ্রাস নীল ঝিনুকের গ্রীষ্মকালীন উচ্চ মৃত্যুহার ব্যাখ্যা করে। বৈজ্ঞানিক প্রতিবেদন 2019; 9:17498।
ফে এসবি, সিপিয়েলস্কি এএম, নাসলে এস, সার্ভান্তেস-ইয়োশিদা কে, হোয়ান জেএল, হুবার ইআর, প্রমুখ। প্রাণী মৃত্যুর ফ্রিকোয়েন্সি, কারণ এবং ব্যাপ্তিতে সাম্প্রতিক পরিবর্তন। প্রোক ন্যাশনাল অ্যাকাড সায়েন্স ইউএসএ। ২০১৫;১১২:১০৮৩-৮।
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. একাধিক অ-প্রজাতি-নির্দিষ্ট প্যাথোজেন পিন্না নোবিলিসের ব্যাপক মৃত্যুর কারণ হতে পারে। জীবন. 2020; 10:238।
ব্র্যাডলি এম, কাউটস এসজে, জেনকিন্স ই, ও'হারা টিএম। আর্কটিক জুনোটিক রোগের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের সম্ভাব্য প্রভাব। ইন্টারন্যাশনাল জে সার্কাম্পোলার হেলথ। ২০০৫; ৬৪:৪৬৮–৭৭।
বেয়ার জে., গ্রিন এনডব্লিউ, ব্রুকস এস., অ্যালান আইজে, রুস এ., গোমেজ টি. প্রমুখ। উপকূলীয় দূষণ পর্যবেক্ষণে সংকেত জীব হিসেবে নীল ঝিনুক (মাইটিলাস এডুলিস স্পপি.): একটি পর্যালোচনা। মার্চ এনভায়রন রেস ২০১৭; ১৩০:৩৩৮-৬৫।
সিরাভেগনা জি, মার্সোনি এস, সিয়েনা এস, বারডেলি এ। ক্যান্সার চিকিৎসায় তরল বায়োপসির একীকরণ। ন্যাট রেভ ক্লিন অনকোল। ২০১৭; ১৪:৫৩১–৪৮।
ওয়ান জেসিএম, ম্যাসি সি, গার্সিয়া-করবাচো জে, মৌলিয়ের এফ, ব্রেন্টন জেডি, ক্যালডাস সি, প্রমুখ। তরল বায়োপসি পরিপক্কতা: টিউমার ডিএনএ সঞ্চালনের অনুমতি দেয়। ন্যাট রেভ ক্যান্সার। ২০১৭;১৭:২২৩–৩৮।
ম্যান্ডেল পি., মেটাইস পি. মানব প্লাজমাতে নিউক্লিক অ্যাসিড। সোক বায়োল সাবসিডিয়ারির সভার কার্যবিবরণী। ১৯৪৮; ১৪২:২৪১-৩।
ব্রঙ্কহোর্স্ট এজে, উঙ্গেরার ডব্লিউ, হোল্ডেনরিডার এস। ক্যান্সার চিকিৎসার জন্য আণবিক চিহ্নিতকারী হিসেবে কোষ-মুক্ত ডিএনএর একটি নতুন ভূমিকা। জৈবিক বিশ্লেষণের পরিমাণ নির্ধারণ। 2019;17:100087।
ইগনাটিয়াদিস এম., স্লেজ জিডব্লিউ, জেফ্রি এসএস লিকুইড বায়োপসি ক্লিনিকে প্রবেশ করেছে - বাস্তবায়ন সমস্যা এবং ভবিষ্যতের চ্যালেঞ্জ। ন্যাট রেভ ক্লিন অনকোল। ২০২১; ১৮:২৯৭–৩১২।
লো ওয়াইএম, করবেটা এন., চেম্বারলেইন পিএফ, রাই ডব্লিউ., সার্জেন্ট আইএল, রেডম্যান সিডব্লিউ এবং অন্যান্য। ভ্রূণের ডিএনএ মাতৃত্বকালীন প্লাজমা এবং সিরামে উপস্থিত থাকে। ল্যানসেট। 1997; 350:485-7।
মুফারে এমএন, ওং আরজে, শ জিএম, স্টিভেনসন ডিকে, কোয়েক এসআর গর্ভাবস্থায় মহিলাদের রক্তে সঞ্চালিত বহির্কোষীয় আরএনএ ব্যবহার করে গর্ভাবস্থার গতিপথ এবং এর জটিলতাগুলির উপর অধ্যয়ন। ডোপিডিয়াট্রিক্স। ২০২০;৮:৬০৫২১৯।
অলেরিক এম, শেরউড কে, কেওন পি, শুটজ ই, বেক জে, স্টেগবাউয়ার জে, প্রমুখ। তরল বায়োপসি: কিডনি গ্রাফ্টে অ্যালোজেনিক ক্ষত সনাক্ত করতে দাতা কোষ-মুক্ত ডিএনএ ব্যবহার করা হয়। ন্যাট রেভ নেফ্রল। ২০২১; ১৭:৫৯১–৬০৩।
জুয়ান এফসি, লো ওয়াইএম প্রসবপূর্ব রোগ নির্ণয়ে উদ্ভাবন: মাতৃত্বকালীন প্লাজমা জিনোম সিকোয়েন্সিং। আনা এমডি। ২০১৬;৬৭:৪১৯-৩২।
গু ডব্লিউ, ডেং এক্স, লি এম, সুকু ওয়াইডি, আরেভালো এস, স্ট্রাইক ডি, প্রমুখ। সংক্রামিত শারীরিক তরলের পরবর্তী প্রজন্মের মেটাজেনোমিক সিকোয়েন্সিংয়ের মাধ্যমে দ্রুত রোগজীবাণু সনাক্তকরণ। ন্যাট মেডিসিন। ২০২১;২৭:১১৫-২৪।