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液体生検（LB）は、生物医学分野で急速に普及しつつある概念です。この概念は主に、様々な組織で細胞死後に小さな断片として放出される循環細胞外DNA（ccfDNA）の断片の検出に基づいています。これらの断片のごく一部は、異物（外来）組織または生物に由来します。本研究では、海水濾過能力が高いことで知られる指標種であるムール貝にこの概念を適用しました。ムール貝が天然のフィルターとして機能し、様々な供給源からの環境DNA断片を捕捉する能力を利用して、沿岸海洋生態系の生物多様性に関する情報を提供します。私たちの結果は、ムール貝の血リンパには1～5kbと大きく異なるサイズのDNA断片が含まれていることを示しています。ショットガンシーケンスにより、多数のDNA断片が外来微生物由来であることが示されました。その中には、細菌、古細菌、ウイルス由来のDNA断片が含まれており、沿岸海洋生態系で一般的に見られる様々な宿主に感染することが知られているウイルスも含まれています。結論として、本研究は、ムール貝に適用されたLBの概念が、海洋沿岸生態系における微生物多様性に関する豊富でありながら未開拓の知識源であることを示している。
気候変動（CC）が海洋生態系の生物多様性に及ぼす影響は、急速に研究が進んでいる分野です。地球温暖化は重要な生理的ストレスを引き起こすだけでなく、海洋生物の熱安定性の進化限界を押し広げ、多くの種の生息地に影響を与え、より好ましい条件を求めて移動を促します[1, 2]。CCは多細胞動物の生物多様性に影響を与えるだけでなく、宿主と微生物の相互作用の微妙なバランスを崩します。この微生物のディスバクテリオシスは、海洋生物を感染性病原体に対してより脆弱にするため、海洋生態系に深刻な脅威をもたらします[3, 4]。SSは大量死に重要な役割を果たしていると考えられており、これは世界の海洋生態系の管理にとって深刻な問題です[5, 6]。これは、多くの海洋生物の経済的、生態学的、栄養学的影響を考えると重要な問題です。これは特に極地に生息する二枚貝に当てはまります。極地では、CKの影響がより直接的かつ深刻です[6, 7]。実際、ムラサキイガイなどの二枚貝は、海洋生態系に対するCCの影響を監視するために広く使用されています。当然のことながら、その健康状態を監視するために、酵素活性や細胞生存率や貪食活性などの細胞機能に基づく機能的バイオマーカーを含む2段階のアプローチを使用するバイオマーカーが比較的多数開発されています[8]。これらの方法には、大量の海水が吸収された後に軟組織に蓄積する特定の圧力指標の濃度の測定も含まれます。しかし、二枚貝の高い濾過能力と半開放循環系は、患者管理に対するシンプルで低侵襲なアプローチである液体生検（LB）の概念を使用して新しい血リンパバイオマーカーを開発する機会を提供します。血液サンプル[9、10]。ヒトLBではいくつかの種類の循環分子が見つかりますが、この概念は主に血漿中の循環細胞外DNA（ccfDNA）断片のDNAシーケンス解析に基づいています。実際、ヒト血漿中に循環DNAが存在することは20世紀半ばから知られていたが[11]、近年になってようやくハイスループットシーケンス法の登場により、cfDNAに基づく臨床診断が可能になった。これらの循環DNA断片の存在は、細胞死後にゲノムDNA（核DNAおよびミトコンドリアDNA）が受動的に放出されることに起因する。 健康な人では、cfDNAの濃度は通常低い（10 ng/mL未満）が、様々な病状を抱えている患者やストレスにさらされている患者では、5～10倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性がある。 健康な人では、cfDNAの濃度は通常低い（10 ng/mL未満）が、様々な病状を抱えている患者やストレスにさらされている患者では、5～10倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性がある。 У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повыbolаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. 健康な人では、cccDNAの濃度は通常低い（10 ng/mL未満）が、様々な病状を抱える患者や組織損傷につながるストレス下にある患者では、5～10倍に増加することがある。健康な体内では、ccfDNA の濃度は通常これより低い (<10 ng/mL) が、さまざまな病状や圧力に耐えている患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織の過敏を引き起こす可能性があります。健康な体内では、ccfdna の濃度は低い (<10 ng/ml) ですが、さまざまな病状や圧力に耐える患者では、組織が 5 ～ 10 倍に増加する可能性があります。损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. 健康な人では、cfDNA濃度は通常低い（10 ng/ml未満）が、様々な病状やストレスを抱える患者では5～10倍に増加し、組織損傷を引き起こすことがある。ccfDNA断片のサイズは大きく異なりますが、通常は150～200 bpの範囲です[12]。自己由来のccfDNA、すなわち正常または形質転換した宿主細胞由来のccfDNAの分析は、核ゲノムおよび/またはミトコンドリアゲノムに存在する遺伝的およびエピジェネティックな変化を検出するために使用でき、それによって臨床医が特定の分子標的療法を選択するのに役立ちます[13]。ただし、ccfDNAは、妊娠中の胎児細胞または移植臓器からのccfDNAなど、外部ソースから得ることができます[14,15,16,17]。ccfDNAはまた、感染性病原体（外部）の核酸の存在を検出するための重要な情報源であり、血液培養では特定されない広範囲の感染症を非侵襲的に検出することができ、感染組織の侵襲的な生検を回避できます[18]。最近の研究では、ヒトの血液にはウイルスや細菌の病原体を特定するために使用できる豊富な情報源が含まれており、ヒト血漿中に見られる ccfDNA の約 1% が外来由来であることが実際に示されています [19]。これらの研究は、生物の循環マイクロバイオームの生物多様性を ccfDNA 分析を使用して評価できることを示しています。しかし、最近まで、この概念はヒトにのみ使用され、他の脊椎動物ではそれほど多くは使用されていませんでした [20、21]。
本論文では、LBポテンシャルを用いて、亜南極ケルゲレン諸島（3500万年前に火山噴火によって形成された大きな台地の上に浮かぶ島々の集まり）によく見られる南部の種であるAulacomya atraのccfDNAを解析した。in vitro実験システムを用いて、海水中のDNA断片がムール貝に速やかに取り込まれ、血リンパ区画に入ることを発見した。ショットガンシーケンスにより、ムール貝の血リンパccfDNAには、共生細菌や寒冷火山性海洋沿岸生態系に典型的なバイオーム由来のDNA断片など、ムール貝自身のDNA断片と非自己由来のDNA断片が含まれていることが示された。血リンパccfDNAには、異なる宿主範囲を持つウイルス由来のウイルス配列も含まれている。また、硬骨魚類、イソギンチャク、藻類、昆虫などの多細胞動物由来のDNA断片も発見した。結論として、本研究は、LBコンセプトが海洋無脊椎動物にうまく適用でき、海洋生態系において豊富なゲノムレパートリーを生み出すことができることを示している。
成体（体長55～70mm）のムラサキイガイ（Mytilus platensis）とアトライガイ（Aulacomya atra）は、2018年12月にケルゲレン諸島のポルト・オー・フランス（南緯049°21.235、東経070°13.490）の潮間帯の岩礁海岸で採取された。その他の成体のムラサキイガイ（Mytilus spp.）は、市販業者（PEI Mussel King Inc.、プリンスエドワード島、カナダ）から入手し、温度制御（4℃）された曝気タンクに、32‰の人工塩水（人工海塩Reef Crystal、Instant Ocean、バージニア州、米国）10～20Lを入れて入れた。各実験で、個々の貝殻の長さと重量を測定した。
このプログラムの無料オープンアクセスプロトコルはオンラインで入手可能です（https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1）。簡単に説明すると、LB血リンパは[22]に記載されているように外転筋から採取されました。血リンパは1200×gで3分間遠心分離して清澄化し、上清は使用するまで凍結（-20°C）しました。cfDNAの分離と精製のために、サンプル（1.5～2.0 ml）を解凍し、製造元の指示に従ってNucleoSnap cfDNAキット（Macherey-Nagel、ペンシルベニア州ベスレヘン）を使用して処理しました。ccfDNAは、さらに分析するまで-80°Cで保存しました。一部の実験では、ccfDNAはQIAamp DNA Investigator Kit（QIAGEN、カナダ、オンタリオ州トロント）を使用して分離および精製されました。精製されたDNAは、標準的なPicoGreenアッセイを使用して定量しました。単離したccfDNAの断片分布は、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies Inc.、カリフォルニア州サンタクララ）と高感度DNAキットを用いて、キャピラリー電気泳動法により分析した。アッセイは、製造元の指示に従い、1 µlのccfDNAサンプルを用いて実施した。
血リンパccfDNA断片のシーケンスのために、Génome Québec（カナダ、ケベック州モントリオール）は、Illumina MiSeq PE75キットのIllumina DNA Mixキットを使用してショットガンライブラリーを作成した。標準アダプター（BioO）が使用された。生データファイルは、NCBI Sequence Read Archive（SRR8924808およびSRR8924809）から入手可能である。基本的な読み取り品質はFastQC [23]を使用して評価された。アダプターと低品質のリードの切り取りにはTrimmomatic [24]が使用された。ペアエンドのショットガンリードは、ミスマッチを避けるために最小オーバーラップ20 bpでより長いシングルリードにFLASHマージされた[25]。 マージされたリードは、二枚貝のNCBI分類データベース（e値<1e−3、90%相同性）を使用してBLASTNで注釈付けされ、低複雑度配列のマスキングはDUST [26]を使用して実行されました。 マージされたリードは、二枚貝のNCBI分類データベース（e値<1e−3、90%相同性）を使用してBLASTNで注釈付けされ、低複雑度配列のマスキングはDUST [26]を使用して実行されました。 Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии)、а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с DUST とは[26] プールされたリードは、NCBI二枚貝分類データベース（e値<1e-3、90%相同性）を使用してBLASTNで注釈付けされ、DUST [26]を使用して低複雑度配列マスキングが実行されました。デュアルシェジ型 NCBI 分離型データ ベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して、BLASTN を注釈として組み合わせ、DUST [26] を使用して低濃度シーケンスのマスクを実行しました。二重殻型 ncbi 分別 ((<1e-3 および 90% 同一源) と注釈を組み合わせて計算し、ダスト [26] を使用して倍濃度シーケンスを実行します。。掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスクОбъединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности最高ですダスト [26]。 プールされたリードは、NCBI二枚貝分類データベース（e値<1e-3、90%相同性）を使用してBLASTNで注釈付けされ、DUST [26]を使用して低複雑度配列マスキングが実行されました。リードは、二枚貝の配列に関連するもの（ここでは自己リードと呼ぶ）と関連しないもの（非自己リード）の 2 つのグループに分けられました。2 つのグループは、MEGAHIT を使用して個別にアセンブルされ、コンティグが生成されました [27]。一方、外来微生物群集リードの分類学的分布は、Kraken2 を使用して分類され [28]、Galaxy の Krona 円グラフでグラフィカルに表現されました [29, 30]。予備実験から、最適な kmers は kmers-59 であると決定されました。 次に、BLASTN（二枚貝NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60%）とのアライメントにより自己コンティグを特定し、最終的なアノテーションを行った。 次に、BLASTN（二枚貝NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60%）とのアライメントにより自己コンティグを特定し、最終的なアノテーションを行った。 Затем собственные контиги были идентифициров​​аны путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков) NCBI、 значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. 次に、最終的なアノテーションのために、BLASTN（NCBI二枚貝データベース、e値<1e-10、相同性60%）とのマッチングによって自己コンティグを特定した。次に、BLASTN (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) との比較を通じて、最終的な検査を行うために自己重畳集団を認識します。その後、BLASTN (双壳贝類 NCBI データセット) を介して、e 値 < 1e-10 および 60% Затем были идентифициров​​аны собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)。 次に、BLASTN（NCBI二枚貝データベース、e値<1e-10、相同性60%）との照合により、最終的なアノテーションのために自己コンティグが特定された。 並行して、非自己グループコンティグはBLASTN（nt NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60%）で注釈付けされた。 並行して、非自己グループコンティグはBLASTN（nt NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60%）で注釈付けされた。 Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и) 60%）。 並行して、外国グループのコンティグはBLASTN（NT NCBIデータベース、e値<1e-10、相同性60%）で注釈付けされた。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%)。 並行して、非自己グループコンティグはBLASTN（nt NCBIデータベース、e値<1e-10、相同性60%）でアノテーションされた。 BLASTXは、NCBIのnrおよびRefSeqタンパク質データベース（e値<1e−10、相同性60%）を使用して、非自己コンティグに対しても実施されました。 BLASTXは、NCBIのnrおよびRefSeqタンパク質データベース（e値<1e−10、相同性60%）を使用して、非自己コンティグに対しても実施されました。 BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10) и гомология 60%)。 BLASTXは、nrおよびRefSeq NCBIタンパク質データベース（e値<1e-10、相同性60%）を使用して、非自己コンティグに対しても実行されました。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и) 60%）。 BLASTXは、nrおよびRefSeq NCBIタンパク質データベース（e値<1e-10、相同性60%）を使用して、非自己コンティグに対しても実行されました。BLASTNおよびBLASTXによる非自己コンティグのプールは、最終的なコンティグを表します（補足ファイルを参照）。
PCRに使用したプライマーは表S1に記載されています。Taq DNAポリメラーゼ（Bio Basic Canada、Markham、ON）を使用してccfDNA標的遺伝子を増幅しました。以下の反応条件を使用しました：95℃で3分間の変性、95℃で1分間、アニーリング温度で1分間、72℃で1分間の伸長、35サイクル、最後に72℃で10分間。PCR産物は、SYBRTM Safe DNA Gel Stain（Invitrogen、Burlington、ON、Canada）を含む1.5%アガロースゲルで95Vで電気泳動により分離しました。
ムール貝（Mytilus spp.）を500 mlの酸素飽和海水（32 PSU）中で4℃で24時間馴化させた。ヒトガレクチン-7 cDNA配列（NCBIアクセッション番号L07769）をコードする挿入配列を含むプラスミドDNAを、最終濃度190 μg/μlでバイアルに添加した。DNAを添加せずに同じ条件下で培養したムール貝を対照とした。3番目の対照タンクには、ムール貝を含まないDNAを入れた。海水中のDNAの品質を監視するため、各タンクから指定された時間に海水サンプル（20 μl、3回繰り返し）を採取した。プラスミドDNAのトレーサビリティを確保するため、LBムール貝を指定された時間に採取し、qPCRおよびddPCRで分析した。海水の塩分濃度が高いため、すべてのPCRアッセイの前に、分取したサンプルをPCR用水（1:10）で希釈した。
デジタルドロップレットPCR（ddPCR）は、BioRad QX200プロトコル（カナダ、オンタリオ州ミシサガ）を使用して実施した。温度プロファイルを使用して最適温度を決定した（表S1）。ドロップはQX200ドロップジェネレーター（BioRad）を使用して生成した。ddPCRは、95℃で5分間、95℃で30秒間、所定のアニーリング温度で1分間、72℃で30秒間、4℃で5分間、90℃で5分間のサイクルを50回繰り返して実施した。ドロップ数と陽性反応（コピー数/µl）は、QX200ドロップリーダー（BioRad）を使用して測定した。10,000個未満のドロップを含むサンプルは除外した。ddPCRを実行するたびにパターンコントロールは行わなかった。
qPCRは、Rotor-Gene® 3000（Corbett Research、シドニー、オーストラリア）とLGALS7特異的プライマーを使用して実施した。すべての定量的PCRは、QuantiFast SYBR Green PCRキット（QIAGEN）を使用して20 µlで実施した。qPCRは、95℃で15分間のインキュベーションから開始し、続いて95℃で10秒間、60℃で60秒間のサイクルを40回繰り返し、1回のデータ収集を行った。融解曲線は、qPCRの最後に95℃で5秒間、65℃で60秒間、97℃で連続測定して作成した。コントロールサンプルを除き、各qPCRは3回繰り返して実施した。
ムール貝は濾過速度が高いことで知られているため、まず海水中に存在するDNA断片を濾過して保持できるかどうかを調べた。また、これらの断片が半開放型のリンパ系に蓄積するかどうかにも関心があった。そこで、ムール貝の飼育槽に添加した可溶性DNA断片の運命を追跡することで、この問題を実験的に解決した。DNA断片の追跡を容易にするため、ヒトガレクチン-7遺伝子を含む外来（自己ではない）プラスミドDNAを使用した。ddPCRは、海水およびムール貝中のプラスミドDNA断片を追跡する。結果によると、ムール貝がいない場合、海水中のDNA断片の量は時間経過とともに（最大7日間）比較的一定であったが、ムール貝がいる場合は、このレベルは8時間以内にほぼ完全に消失した（図1a、b）。外来DNA断片は、15分以内に弁内液および血リンパ中で容易に検出された（図1c）。これらの断片は、曝露後4時間まで検出可能であった。 DNA断片に対するこの濾過活性は、細菌や藻類の濾過活性に匹敵する[31]。これらの結果は、ムール貝が体液区画に外来DNAを濾過して蓄積できることを示唆している。
ddPCRで測定した、ムール貝が存在する場合（A）または存在しない場合（B）の海水中のプラスミドDNAの相対濃度。Aでは、結果はパーセンテージで表され、ボックスの境界は75パーセンタイルと25パーセンタイルを表します。適合した対数曲線は赤で示され、灰色で網掛けされた領域は95%信頼区間を表します。Bでは、赤線は濃度の平均値を表し、青線は濃度の95%信頼区間を表します。C プラスミドDNA添加後のさまざまな時点でのムール貝の血リンパと弁液中のプラスミドDNAの蓄積。結果は、検出された絶対コピー数/mL（±SE）として示されています。
次に、人為的影響が限られている遠隔の島々であるケルゲレン諸島のムール貝群集から採取したムール貝中のccfDNAの起源を調査した。この目的のために、ムール貝の血リンパからcccDNAを分離し、ヒトcccDNAの精製に一般的に使用される方法で精製した[32, 33]。ムール貝の血リンパccfDNAの平均濃度は、血リンパ1mlあたり低マイクログラムの範囲であることがわかった（補足情報表S2を参照）。この濃度範囲は、健康な人（1ミリリットルあたり低ナノグラム）よりもはるかに大きいが、まれに、癌患者ではccfDNAのレベルが1ミリリットルあたり数マイクログラムに達することがある[34, 35]。血リンパccfDNAのサイズ分布の分析では、これらの断片のサイズは大きく異なり、1000 bpから1000 bpから最大5000 bpの範囲であることがわかった（図2）。シリカベースのQIAamp Investigator Kitを使用した場合も同様の結果が得られました。この方法は、法医学において低濃度のDNAサンプル（ccfDNAを含む）からゲノムDNAを迅速に分離および精製するために一般的に使用されています[36]。
ムール貝の血リンパ液の代表的なccfDNA電気泳動図。NucleoSnap Plasma Kit（上）とQIAamp DNA Investigator Kitを用いて抽出した。B ムール貝の血リンパ液中のccfDNA濃度（±標準誤差）の分布を示すバイオリンプロット。黒線と赤線はそれぞれ中央値と第1四分位数と第3四分位数を表す。
ヒトおよび霊長類の ccfDNA の約 1% は外来由来である [21, 37]。二枚貝の半開放循環系、微生物が豊富な海水、およびムール貝の ccfDNA のサイズ分布を考慮すると、ムール貝の血リンパ ccfDNA には豊富で多様な微生物 DNA プールが含まれている可能性があると我々は仮説を立てた。この仮説を検証するために、ケルゲレン諸島から採取した Aulacomya atra サンプルの血リンパ ccfDNA をシーケンスし、1000 万以上のリードを得たが、その 97.6% が品質管理を通過した。次に、BLASTN および NCBI 二枚貝データベースを使用して、リードを自己および非自己のソースに基づいて分類した (図 S1、補足情報)。
ヒトでは、核DNAとミトコンドリアDNAの両方が血流中に放出される可能性がある[38]。しかし、本研究では、A. atraのゲノムが配列決定も記述もされていないため、ムール貝の核ゲノムDNAを詳細に記述することはできなかった。しかし、二枚貝ライブラリーを使用して、我々の起源のccfDNA断片をいくつか特定することができた（図S2、補足情報）。また、配列決定されたA. atra遺伝子の指向性PCR増幅により、我々の起源のDNA断片の存在を確認した（図3）。同様に、A. atraのミトコンドリアゲノムは公開データベースで入手可能であるため、A. atraの血リンパ中にミトコンドリアccfDNA断片が存在する証拠を見つけることができる。ミトコンドリアDNA断片の存在はPCR増幅により確認された（図3）。
PCRにより増幅されたA. atra（赤点 - ストック番号：SRX5705969）およびM. platensis（青点 - ストック番号：SRX5705968）の血リンパには、さまざまなミトコンドリア遺伝子が存在していた。図はBretonら、2011より改変。B A. atraの血リンパ上清の増幅。FTAペーパーに保存。3 mmパンチを使用して、PCRミックスを含むPCRチューブに直接追加する。
海水中に微生物が豊富に含まれていることから、我々はまず血リンパ中の微生物DNA配列の特性評価に焦点を当てた。そのために、我々は2つの異なる戦略を用いた。最初の戦略では、BLASTや他のツールと同等の精度で微生物配列を識別できるアルゴリズムベースの配列分類プログラムであるKraken2を使用した[28]。6719以上のリードが細菌由来であることが判明し、124と64はそれぞれ古細菌とウイルス由来であった（図4）。最も豊富な細菌DNA断片はFirmicutes（46%）、Proteobacteria（27%）、およびBacteroidetes（17%）であった（図4a）。この分布は、海洋性ムラサキイガイのマイクロバイオームに関する以前の研究と一致している[39, 40]。ガンマプロテオバクテリアはProteobacteriaの主要なクラス（44%）であり、多くのVibrionalesが含まれていた（図4b）。 ddPCR法により、A. atraの血リンパのccfDNA中にビブリオDNA断片が存在することが確認された（図4c）[41]。ccfDNAの細菌由来に関するより詳細な情報を得るために、別のアプローチが取られた（図S2、補足情報）。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとしてアセンブルされ、BLASTNとe値1e−3、90%以上の相同性カットオフを使用して、自己（二枚貝）または非自己由来として分類されました。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとしてアセンブルされ、BLASTNとe値1e−3、90%以上の相同性カットオフを使用して、自己（二枚貝）または非自己由来として分類されました。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифициров​​аны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、BLASTNとe値1e-3、90%以上の相同性カットオフを使用して、ネイティブ（二枚貝）または非オリジナルに分類されました。この場合、反復されたカウントは末端のカウントにまとめられ、BLASTNおよび1e-3のe値および＞90%の同一性の終了値の分割がそれ自体（二重型）または非自己源のものとして使用される。このような場合には、blastn と 1e-3 の値と > 90% の相同性の分別タイプ (二重シベジタイプ) を使用して、再試行数の組合わせを末端の試行数として行います。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифициров​​аны как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и > 90%。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、eBLASTNと1e-3値、相同性閾値>90%を使用して、自己（二枚貝）または非オリジナルとして分類されました。A. atra のゲノムはまだ配列決定されていないため、MEGAHIT 次世代シーケンシング (NGS) アセンブラーの de novo アセンブリ戦略を使用しました。合計 147,188 個のコンティグが、由来が依存的 (二枚貝) であると特定されました。これらのコンティグは、BLASTN および BLASTX を使用して、e 値が 1e-10 で展開されました。この戦略により、A. atra ccfDNA に存在する 482 個の非二枚貝断片を特定することができました。これらの DNA 断片の半分以上 (57%) は、細菌、主に鰓共生細菌 (硫化栄養共生細菌を含む)、および鰓共生細菌 Solemya velum から得られました (図 5)。
タイプレベルでの相対存在量。B 2 つの主要な門 (Firmicutes と Proteobacteria) の微生物多様性。ddPCR の代表的な増幅 C Vibrio spp. A. 3 つのアトラ血リンパ中の 16S rRNA 遺伝子の断片 (青色)。
合計482個の収集されたコンティグが解析された。メタゲノムコンティグ注釈の分類学的分布の一般的なプロファイル（原核生物と真核生物）。B BLASTNおよびBLASTXによって同定された細菌DNA断片の詳細な分布。
Kraken2 の解析では、ムール貝の ccfDNA には、Euryarchaeota (65%)、Crenarchaeota (24%)、Thaurmarcheota (11%) の DNA 断片を含む古細菌の DNA 断片が含まれていることも示されました (図 6a)。カリフォルニア産ムール貝の微生物群集で以前に発見された Euryarchaeota と Crenarchaeota 由来の DNA 断片の存在は、驚くべきことではありません [42]。Euryarchaeota は極限環境と関連付けられることが多いものの、現在では Euryarchaeota と Crenarcheota の両方が海洋の極低温環境で最も一般的な原核生物であることが認識されています [43, 44]。ケルゲレン高原の海底からの大規模なメタン漏洩 [45] や、ケルゲレン諸島沖で観察された微生物によるメタン生成の可能性 [46] の最近の報告を考えると、ムール貝にメタン生成微生物が存在することは驚くべきことではありません。
次に、DNAウイルスの読み取りに注目しました。私たちの知る限り、これはムール貝のウイルス含有量に関する最初のオフターゲット研究です。予想どおり、バクテリオファージ（Caudovirales）のDNA断片が見つかりました（図6b）。しかし、最も一般的なウイルスDNAは、核細胞質大型DNAウイルス（NCLDV）としても知られるヌクレオサイトウイルス門のもので、これはあらゆるウイルスの中で最大のゲノムを持っています。この門の中で、ほとんどのDNA配列は、脊椎動物と節足動物を自然宿主とするミミミドウイルス科（58%）とポックスウイルス科（21%）に属し、これらのDNA配列のごく一部は、既知のウイルス藻類に属しています。海洋真核藻類に感染します。配列は、既知のウイルス属の中で最大のゲノムサイズを持つ巨大ウイルスであるパンドラウイルスからも得られました。興味深いことに、血リンパccfDNAシーケンスによって決定された、ウイルスに感染していることが知られている宿主の範囲は比較的大きかった（図S3、補足情報）。これには、バキュロウイルス科やイリドウイルス科などの昆虫に感染するウイルス、およびアメーバ、藻類、脊椎動物に感染するウイルスが含まれる。また、ピトウイルス・シベリカムのゲノムに一致する配列も見つかった。ピトウイルス（「ゾンビウイルス」としても知られる）は、シベリアの3万年前の永久凍土から初めて分離された[47]。したがって、我々の結果は、これらのウイルスの現代の種がすべて絶滅したわけではないこと[48]、およびこれらのウイルスが遠隔の亜寒帯海洋生態系に存在する可能性があることを示した以前の報告と一致している。
最後に、他の多細胞動物のDNA断片が見つかるかどうかをテストしました。 nt、nr、RefSeqライブラリ（ゲノムおよびタンパク質）を使用してBLASTNおよびBLASTXにより合計482個の異種コンティグが同定されました。 結果によると、多細胞動物のccfDNAの異種断片の中では、骨のDNAが優勢であることが示されています（図5）。 昆虫や他の種のDNA断片も見つかりました。 DNA断片のかなりの部分はまだ同定されていませんが、これはおそらく、陸生種と比較して、ゲノムデータベースにおける海洋種の過小評価によるものと考えられます[49]。
本論文では、LB（生物多様性）の概念をムール貝に適用し、血リンパccfDNAショットシーケンスが海洋沿岸生態系の構成に関する知見を提供できることを論じる。具体的には、1）ムール貝の血リンパには、比較的大きな（約1～5kb）循環DNA断片が比較的高い濃度（マイクログラムレベル）で含まれていること、2）これらのDNA断片は独立しているものと非独立なものの両方があること、3）これらのDNA断片の外部由来としては、細菌、古細菌、ウイルスのDNA、および他の多細胞動物のDNAが見つかったこと、4）これらの外部ccfDNA断片の血リンパへの蓄積は急速に起こり、ムール貝の内部濾過活動に寄与していることがわかった。結論として、これまで主に生物医学分野で適用されてきたLBの概念は、指標種とその環境との相互作用をよりよく理解するために利用できる、豊富だが未開拓の知識源を内包していることを、本研究は示している。
霊長類に加えて、マウス、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳類でもccfDNAの分離が報告されている[50, 51, 52]。しかし、我々の知る限り、開放循環系を持つ海洋生物におけるccfDNAの検出と配列決定を報告した研究は、本研究が初めてである。ムール貝のこの解剖学的特徴と濾過能力は、少なくとも部分的には、他の種と比較して循環DNA断片のサイズ特性が異なることを説明できるかもしれない。ヒトでは、血液中を循環するDNA断片のほとんどは、150～200 bpのサイズの小さな断片であり、最大ピークは167 bpである[34, 53]。DNA断片のごく一部ではあるが重要な部分は300～500 bpのサイズであり、約5%は900 bpより長い[54]。このサイズ分布の理由は、血漿中の ccfDNA の主な発生源が、健康な個体では循環造血細胞の細胞死または壊死による細胞死、あるいは癌患者では腫瘍細胞のアポトーシスによる細胞死（循環腫瘍 DNA、ctDNA として知られる）による細胞死の結果であるからである。ムール貝で発見された血リンパ ccfDNA のサイズ分布は 1000 ～ 5000 bp の範囲であり、ムール貝の ccfDNA は異なる起源を持つことを示唆している。これは、ムール貝が半開放型の血管系を持ち、微生物ゲノム DNA が高濃度で含まれる海洋水生環境に生息していることから、論理的な仮説である。実際、外来 DNA を使用した我々の実験室実験では、ムール貝が海水中に DNA 断片を蓄積し、少なくとも数時間後には細胞に取り込まれた後分解され、放出され、またはさまざまな組織に貯蔵されることが示されている。原核細胞と真核細胞の両方が希少であることから、弁内区画の使用は、自己由来および外来由来のccfDNAの量を減らすことになる。二枚貝の自然免疫の重要性と多数の循環食細胞を考慮すると、外来ccfDNAでさえ、微生物や細胞残骸の摂取時に外来DNAを蓄積する循環食細胞に濃縮されるという仮説が立てられた。総合すると、我々の結果は、二枚貝の血リンパccfDNAが分子情報のユニークな貯蔵庫であり、監視種としての地位を裏付けていることを示している。
我々のデータは、細菌由来の血リンパccfDNA断片のシーケンスと解析により、宿主細菌叢および周囲の海洋生態系に存在する細菌に関する重要な情報が得られることを示している。ショットシーケンス技術により、従来の16S rRNA同定法を使用した場合、参照ライブラリのバイアスなどにより見逃されていたであろう共生細菌A. atra gillの配列が明らかになった。実際、ケルゲレンの同じムール貝層でM. platensisから収集したLBデータを使用したところ、鰓に関連する細菌共生体の構成は両方のムール貝種で同じであることが示された（図S4、補足情報）。遺伝的に異なる2つのムール貝のこの類似性は、ケルゲレンの冷たく硫黄分が多く火山性の堆積物中の細菌群集の構成を反映している可能性がある[55、56、57、58]。ポルト・オー・フランス沿岸のような生物攪乱を受けた沿岸域でムール貝を採取すると、硫黄還元微生物のレベルが高いことがよく報告されている[59]。また、ムール貝の共生細菌叢が水平伝播の影響を受ける可能性もある[60, 61]。海洋環境、海底表面、およびムール貝の共生細菌の構成との相関関係を明らかにするには、さらなる研究が必要である。これらの研究は現在進行中である。
ムール貝のccfDNAの長さと濃度、精製の容易さ、迅速なショットガンシーケンスを可能にする高品質は、海洋沿岸生態系の生物多様性を評価するためにムール貝のccfDNAを使用する多くの利点の一部です。このアプローチは、特定の生態系のウイルス群集（バイローム）を特徴付けるのに特に効果的です[62、63]。細菌、古細菌、真核生物とは異なり、ウイルスゲノムには16S配列などの系統発生的に保存された遺伝子は含まれていません。私たちの結果は、ムール貝などの指標種からの液体生検を使用して、通常沿岸海洋生態系に生息する宿主に感染することが知られている比較的多数のccfDNAウイルス断片を特定できることを示しています。これには、原生動物、節足動物、昆虫、植物、および細菌ウイルス（例：バクテリオファージ）に感染することが知られているウイルスが含まれます。ケルゲレンの同じムール貝層で採取したムラサキイガイ（M. platensis）の血リンパccfDNAウイルスゲノムを調べたところ、同様の分布が見られました（補足情報表S2）。ccfDNAのショットガンシーケンスは、ヒトや他の種のウイルスゲノムの研究において勢いを増している新しいアプローチです[21, 37, 64]。このアプローチは、二本鎖DNAウイルスの研究に特に有用です。なぜなら、すべての二本鎖DNAウイルスの間で保存されている単一の遺伝子はなく、ボルチモアで最も多様で広範なウイルスのクラスを表しているからです[65]。これらのウイルスのほとんどは分類されておらず、ウイルス世界のまったく未知の部分からのウイルスが含まれている可能性がありますが[66]、ムール貝A. atraとM. platensisのウイルスゲノムと宿主範囲は、2つの種の間にあることがわかりました。同様に（追加情報図S3を参照）。この類似性は、環境中に存在するDNAの取り込みにおける選択性の欠如を反映している可能性があり、驚くべきことではない。RNAウイルスのゲノムを特徴づけるためには、精製RNAを用いた今後の研究が必要である。
私たちの研究では、Kowarski らの研究 [37] から改変した非常に厳密なパイプラインを使用しました。このパイプラインでは、ネイティブ ccfDNA のアセンブリの前後にプールされたリードとコンティグの 2 段階削除を使用し、マッピングされていないリードの割合が高くなりました。したがって、このムール貝種の参照ゲノムがないため、これらのマッピングされていないリードの一部が独自の起源を持っている可能性を排除できません。また、自己リードと非自己リード間のキメラと Illumina MiSeq PE75 によって生成されたリードの長さが懸念されたため、このパイプラインを使用しました。未分類のリードの大部分のもう 1 つの理由は、海洋微生物の大部分、特にケルゲレンなどの遠隔地の微生物が注釈付けされていないことです。私たちは、ヒト ccfDNA と同様の ccfDNA 断片長を想定して Illumina MiSeq PE75 を使用しました。今後の研究では、血リンパccfDNAがヒトや哺乳類よりも長いリードを持つという結果を踏まえ、より長いccfDNA断片に適したシーケンスプラットフォームの使用を推奨します。この方法により、より詳細な解析の兆候を特定することがはるかに容易になります。現在入手できない完全なA. atra核ゲノム配列を取得すれば、自己由来と非自己由来のccfDNAの識別も大幅に容易になります。私たちの研究は、液体生検の概念をムール貝に適用する可能性に焦点を当ててきたため、この概念が今後の研究で使用されるにつれて、ムール貝の微生物多様性を研究するためのこの方法の可能性を高める新しいツールとパイプラインが開発されることを期待しています。海洋生態系。
非侵襲的な臨床バイオマーカーとして、ヒト血漿中の ccfDNA レベルの上昇は、さまざまな疾患、組織損傷、およびストレス状態と関連しています [67,68,69]。この増加は、組織損傷後に自身の由来の DNA 断片が放出されることに関連しています。私たちは、ムール貝を 30 °C の温度に短時間さらす急性熱ストレスを使用してこの問題に取り組みました。私たちは、3 種類のムール貝で 3 つの独立した実験でこの分析を実施しました。しかし、急性熱ストレス後に ccfDNA レベルに変化は見られませんでした (図 S5、追加情報を参照)。この発見は、ムール貝が半開放循環系を持ち、高い濾過活動により大量の外来 ​​DNA を蓄積するという事実を、少なくとも部分的に説明できるかもしれません。一方、ムール貝は、多くの無脊椎動物と同様に、ストレス誘発性の組織損傷に対してより耐性があり、それによって血リンパ中の ccfDNA の放出を制限している可能性があります [70, 71]。
これまで、水生生態系の生物多様性のDNA解析は、主に環境DNA（eDNA）メタバーコーディングに焦点を当ててきました。しかし、この方法は、プライマーを使用する場合、生物多様性解析において通常制限があります。ショットガンシーケンスを使用すると、PCRの制限とプライマーセットの選択の偏りを回避できます。したがって、ある意味で、私たちの方法は、断片化されたDNAを直接シーケンスしてほぼすべての生物を分析できる、最近使用されているハイスループットeDNAショットガンシーケンス法に近いと言えます[72、73]。ただし、LBと標準的なeDNA法を区別するいくつかの根本的な問題があります。もちろん、eDNAとLBの主な違いは、天然の濾過宿主の使用です。eDNAを研究するための天然の濾過器官として、海綿や二枚貝（Dresseina spp.）などの海洋生物を使用することが報告されています[74、75]。ただし、Dreissenaの研究では、DNAが抽出された組織生検が使用されました。 LBからのccfDNAの分析には、組織生検、特殊で高価な機器、eDNAや組織生検に伴う物流は必要ありません。実際、私たちは最近、LBからのccfDNAはコールドチェーンを維持せずにFTAサポートで保存および分析できることを報告しました。これは遠隔地での研究における大きな課題です[76]。液体生検からのccfDNAの抽出も簡単で、ショットガンシーケンスとPCR分析用の高品質のDNAを提供します。これは、eDNA分析に伴ういくつかの技術的制約を考慮すると大きな利点です[77]。サンプリング方法の簡便性と低コストは、長期モニタリングプログラムにも特に適しています。二枚貝のもう1つのよく知られた特徴は、高い濾過能力に加えて、粘液の化学的なムコ多糖組成であり、ウイルスの吸収を促進します[78、79]。これにより、二枚貝は、特定の水生生態系における生物多様性と気候変動の影響を特徴付けるための理想的な天然フィルターとなります。宿主由来のDNA断片の存在はeDNAと比較した場合、この方法の限界と見なされるかもしれないが、eDNAと比較した場合、このようなネイティブccfDNAを持つことに関連するコストは、健康研究に利用できる膨大な量の情報を考えると、同時に理解できる。オフセット宿主。これには、宿主のゲノムに組み込まれたウイルス配列の存在が含まれる。これは、二枚貝に水平伝播する白血病レトロウイルスが存在することを考えると、ムール貝にとって特に重要である[80、81]。eDNAに対するLBのもう1つの利点は、微生物（およびそのゲノム）を貪食する血リンパ中の循環血球の貪食活性を利用することである。貪食は、二枚貝の血球の主な機能である[82]。最後に、この方法は、ムール貝の高い濾過能力（平均1.5 l/hの海水）と2日間の循環を利用しており、これにより異なる海水層の混合が増加し、異種eDNAの捕捉が可能になる。 [83, 84]。このように、ムール貝の栄養、経済、環境への影響を考慮すると、ムール貝のccfDNA分析は興味深い分野です。ヒトから採取したLBの分析と同様に、この方法も、外来物質に対する宿主DNAの遺伝的およびエピジェネティックな変化を測定する可能性を開きます。たとえば、ナノポアシーケンスを使用してネイティブccfDNAのゲノムワイドメチル化分析を実行するために、第3世代シーケンス技術が考えられます。このプロセスは、ムール貝のccfDNA断片の長さが、化学的変換を必要とせずに単一のシーケンスランからゲノムワイドDNAメチル化分析を可能にするロングリードシーケンスプラットフォームと理想的に適合するという事実によって促進されるはずです。85,86] これは興味深い可能性です。なぜなら、DNAメチル化パターンは環境ストレスへの応答を反映し、多くの世代にわたって持続することが示されているからです。したがって、気候変動や汚染物質への曝露後の応答を制御する根本的なメカニズムについての貴重な洞察を提供できます[87]。しかし、LBの使用には限界がないわけではありません。言うまでもなく、これには生態系に指標種が存在する必要があります。前述のように、LBを使用して特定の生態系の生物多様性を評価するには、ソースからのDNA断片の存在を考慮した厳密なバイオインフォマティクスパイプラインも必要です。もう1つの大きな問題は、海洋生物の参照ゲノムの入手可能性です。海洋哺乳類ゲノムプロジェクトや最近設立されたFish10kプロジェクト[88]などのイニシアチブが、将来的にこのような分析を促進することが期待されます。海洋濾過摂食生物へのLBコンセプトの適用は、シーケンス技術の最新の進歩とも互換性があり、環境ストレスに対する海洋生息地の健全性に関する重要な情報を提供するマルチオームバイオマーカーの開発に適しています。
ゲノム配列データは、NCBIシーケンスリードアーカイブ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808）のバイオプロジェクトSRR8924808に登録されています。
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