Nature.com をご利用いただきありがとうございます。ご利用のブラウザバージョンでは、CSS のサポートが制限されています。最適なエクスペリエンスを得るには、最新のブラウザをご利用いただくか、Internet Explorer の互換モードを無効にしてください。サポートを継続するため、当面の間、サイトはスタイルと JavaScript を無効にして表示します。
液体生検（LB）は、生物医学分野で急速に普及しつつある概念です。この概念は主に、様々な組織における細胞死後に小さな断片として放出される循環細胞外DNA（ccfDNA）断片の検出に基づいています。これらの断片の一部は、外来（外来）組織または生物に由来します。現在、私たちはこの概念を、高い海水濾過能力で知られる哨戒種であるムール貝に適用しています。私たちは、ムール貝が天然のフィルターとして機能する能力を利用して、様々な発生源から環境DNA断片を捕捉し、海洋沿岸生態系の生物多様性に関する情報を提供しています。私たちの研究結果によると、ムール貝の血リンパには、1 kbから5 kbまで、サイズが大きく異なるDNA断片が含まれていることがわかりました。ショットガンシーケンスの結果、多数のDNA断片が外来微生物由来であることが示されました。その中には、細菌、古細菌、そしてウイルスのDNA断片が含まれており、その中には沿岸海洋生態系に広く見られる様々な宿主に感染することが知られているウイルスも含まれていました。結論として、私たちの研究は、ムール貝に適用された LB の概念が、海洋沿岸生態系の微生物多様性に関する豊富だが未開拓の知識源を表していることを示しています。
気候変動（CC）が海洋生態系の生物多様性に与える影響は、急速に研究が進んでいる分野です。地球温暖化は、重大な生理学的ストレスを引き起こすだけでなく、海洋生物の熱安定性の進化的限界を押し広げ、多くの種の生息地に影響を与え、より好ましい条件を探すよう促しています[1、2]。後生動物の生物多様性に影響を及ぼすことに加えて、CCは宿主と微生物との微妙な相互作用のバランスを崩します。この微生物の細菌異常症は、海洋生物を感染性病原体に対してより感受性にするため、海洋生態系に深刻な脅威をもたらします[3、4]。SSは大量死に重要な役割を果たしていると考えられており、これは地球規模の海洋生態系の管理にとって深刻な問題です[5、6]。これは、多くの海洋種が経済的、生態学的、栄養学的に影響を受けることを考えると重要な問題です。これは特に、CK の影響がより直接的かつ重篤な極地に生息する二枚貝に当てはまります [6, 7]。実際、Mytilus spp. などの二枚貝は、CC が海洋生態系に及ぼす影響のモニタリングに広く使用されています。当然のことながら、それらの健康状態をモニタリングするために比較的多数のバイオマーカーが開発されており、多くの場合、酵素活性または細胞生存率や貪食活性などの細胞機能に基づく機能バイオマーカーを含む 2 層アプローチが使用されています [8]。これらの方法には、大量の海水を吸収した後に軟組織に蓄積する特定の圧力指標の濃度測定も含まれます。しかし、二枚貝の高い濾過能力と半開放型循環系は、患者管理に対するシンプルで低侵襲的なアプローチである液体生検 (LB) の概念を使用して、新しい血リンパバイオマーカーを開発する機会を提供します。血液サンプル [9, 10]。ヒトLBには数種類の循環分子が存在します。しかし、この概念は主に血漿中の循環細胞外DNA（ccfDNA）断片のDNAシーケンシング解析に基づいています。実際、ヒト血漿中の循環DNAの存在は20世紀半ばから知られていました[11]が、近年になってハイスループットシーケンシング法の登場により、ccfDNAに基づく臨床診断が可能になりました。これらの循環DNA断片の存在は、細胞死後のゲノムDNA（核DNAおよびミトコンドリアDNA）の受動的な放出に一部起因しています。 健康な人では、ccfDNA の濃度は通常は低い (<10 ng/mL) ですが、さまざまな病状に罹患している患者やストレスを受けている患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性があります。 健康な人では、ccfDNA の濃度は通常は低い (<10 ng/mL) ですが、さまざまな病状に罹患している患者やストレスを受けている患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織損傷を引き起こす可能性があります。 У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повыbolаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. 健康な人では、cccDNA の濃度は通常は低い (<10 ng/mL) ですが、さまざまな病状の患者や組織の損傷につながるストレス下にある患者では 5 ～ 10 倍に増加する可能性があります。健康な体内では、ccfDNA の濃度は通常これより低い (<10 ng/mL) が、さまざまな病状や圧力に耐えている患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織の過敏を引き起こす可能性があります。健康な体内では、ccfdna の濃度は低い (<10 ng/ml) ですが、さまざまな病状や圧力に耐える患者では、組織が 5 ～ 10 倍に増加する可能性があります。损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA 濃度は健康な人では通常は低い（10 ng/ml 未満）のですが、さまざまな病状やストレスのある患者では 5 ～ 10 倍に増加し、組織の損傷を引き起こす可能性があります。ccfDNA 断片のサイズは大きく異なりますが、通常は 150～200 bp の範囲です [12]。自己由来の ccfDNA、つまり正常または形質転換した宿主細胞由来の ccfDNA の分析は、核ゲノムやミトコンドリアゲノムに存在する遺伝的およびエピジェネティックな変化を検出するために使用でき、それによって臨床医が特定の分子標的療法を選択するのに役立ちます [13] 。しかし、ccfDNA は、妊娠中の胎児細胞または移植臓器からの ccfDNA など、外来源から取得される可能性があります [14,15,16,17]。ccfDNA は、感染因子 (外来) の核酸の存在を検出するための重要な情報源でもあり、血液培養では特定されない広範囲の感染を非侵襲的に検出し、感染組織の侵襲的な生検を回避できます [18]。近年の研究では、ヒトの血液にはウイルスや細菌の病原体を特定するために活用できる豊富な情報源が含まれていること、またヒト血漿中に含まれるccfDNAの約1%が外来由来であることが示されています[19]。これらの研究は、ccfDNA分析を用いることで、生物の循環マイクロバイオームの生物多様性を評価できることを実証しています。しかしながら、最近までこの概念はヒトにのみ適用されており、他の脊椎動物にも、それほど広くは適用されていませんでした[20, 21]。
本論文では、LB ポテンシャルを使用して、亜南極ケルゲレン諸島でよく見られる南方の種である Aulacomya atra の ccfDNA を分析します。ケルゲレン諸島は、3,500 万年前に形成された大きな台地の上にある島々のグループです。火山噴火。in vitro 実験システムを使用して、海水中の DNA 断片がムール貝にすぐに取り込まれ、血リンパ コンパートメントに入ることを発見しました。ショットガン シーケンスにより、ムール貝の血リンパ ccfDNA には、共生細菌や冷たい火山性海洋沿岸生態系に典型的なバイオームの DNA 断片など、自分自身の起源と非自己起源の DNA 断片が含まれていることがわかりました。血リンパ ccfDNA には、異なる宿主域を持つウイルスに由来するウイルス配列も含まれています。また、硬骨魚類、イソギンチャク、藻類、昆虫などの多細胞動物の DNA 断片も見つかりました。結論として、私たちの研究は、LB コンセプトを海洋無脊椎動物にうまく適用して、海洋生態系に豊富なゲノムレパートリーを生成できることを示しています。
成貝（体長55～70 mm）のMytilus platensis（M. platensis）およびAulacomya atra（A. atra）は、2018年12月にケルゲレン諸島のポルトーフランス（049°21.235 S, 070°13.490 E）の潮間帯の岩礁海岸で収集されました。その他のムール貝（Mytilus spp.）の成貝は、商業サプライヤー（PEI Mussel King Inc.、プリンスエドワード島、カナダ）から入手し、温度管理（4°C）された10～20 Lの32‰人工塩水（人工海塩：Reef Crystal、Instant Ocean、バージニア州、米国）を入れた通気水槽に入れました。各実験では、個々の貝の長さと重量を測定した。
このプログラムの無料のオープンアクセスプロトコルはオンラインで入手できます（https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1）。簡単に説明すると、[22]で説明したように、外転筋からLB血リンパを採取しました。血リンパを1200×gで3分間遠心分離して清澄化し、上清を使用するまで凍結（-20°C）しました。cfDNAの単離および精製のために、サンプル（1.5～2.0 ml）を解凍し、NucleoSnap cfDNAキット（Macherey-Nagel、ペンシルベニア州ベスレヘン）を使用して製造元の指示に従って処理しました。ccfDNAは、さらに分析するまで-80°Cで保存しました。一部の実験では、ccfDNAはQIAamp DNA Investigator Kit（QIAGEN、オンタリオ州トロント、カナダ）を使用して単離および精製しました。精製されたDNAは、標準的なPicoGreenアッセイを使用して定量しました。単離されたccfDNAの断片分布は、Agilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies Inc.、カリフォルニア州サンタクララ）と高感度DNAキットを用いたキャピラリー電気泳動によって分析された。アッセイは、メーカーの指示に従って、ccfDNAサンプル1µlを用いて実施された。
血リンパccfDNA断片のシーケンシングには、Génome Québec（カナダ、ケベック州モントリオール）がIllumina MiSeq PE75キットのIllumina DNA Mixキットを用いてショットガンライブラリーを調製した。標準アダプター（BioO）を使用した。生データファイルはNCBI Sequence Read Archive（SRR8924808およびSRR8924809）から入手可能である。基本的な読み取り品質はFastQC [23]を用いて評価した。アダプターのクリッピングや低品質の読み取りにはTrimmomatic [24]が使用されている。ペアエンドを持つショットガンリードは、ミスマッチを回避するため、最小20 bpのオーバーラップを持つ長いシングルリードにFLASHマージされた[25]。 マージされたリードは二枚貝NCBI Taxonomyデータベース（e値<1e−3かつ相同性90%）を使用してBLASTNでアノテーションされ、低複雑性配列のマスキングはDUST [26]を使用して行われた。 マージされたリードは二枚貝NCBI Taxonomyデータベース（e値<1e−3かつ相同性90%）を使用してBLASTNでアノテーションされ、低複雑性配列のマスキングはDUST [26]を使用して行われた。 Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии)、а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с説明:ダスト[26] プールされたリードはNCBI二枚貝分類データベース（e値<1e-3かつ相同性90%）を使用してBLASTNでアノテーションされ、DUST [26]を使用して低複雑性配列マスキングが行われた。デュアルシェジ型 NCBI 分離型データ ベース (e 値 < 1e-3 および 90% の相同性) を使用して、BLASTN を注釈として組み合わせ、DUST [26] を使用して低濃度シーケンスのマスクを実行しました。二重殻型 ncbi 分別 ((<1e-3 および 90% 同一源) と注釈を組み合わせて計算し、ダスト [26] を使用して倍濃度シーケンスを実行します。。掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスク 掩マスクОбъединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности最高ですダスト [26]。 プールされたリードはNCBI二枚貝分類データベース（e値<1e-3および90%の相同性）を使用してBLASTNでアノテーションされ、DUST [26]を使用して低複雑性配列マスキングが行われた。リードは二枚貝の配列に関連するもの（ここでは自己リードと呼ぶ）と無関係なもの（非自己リードと呼ぶ）の2つのグループに分けられた。2つのグループはそれぞれMEGAHITを用いてアセンブルされ、コンティグが生成された[27]。一方、異星微生物叢リードの分類学的分布はKraken2 [28]を用いて分類され、Galaxy [29, 30]上のKrona円グラフによってグラフ化された。予備実験の結果、最適なkmersはkmers-59と決定された。 その後、最終的な注釈として、BLASTN（二枚貝NCBIデータベース、e値<1e-10、相同性60%）とのアライメントによって自己コンティグが識別されました。 その後、最終的な注釈として、BLASTN（二枚貝NCBIデータベース、e値<1e-10、相同性60%）とのアライメントによって自己コンティグが識別されました。 Затем собственные контиги были идентифициров​​аны путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков) NCBI、 значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. その後、最終的な注釈付けのために、BLASTN (NCBI 二枚貝データベース、e 値 <1e-10、相同性 60%) と照合して自己コンティグを識別しました。次に、BLASTN (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) との比較を通じて、最終的な検査を行うために自己重畳集団を認識します。その後、BLASTN (双壳贝類 NCBI データセット) を介して、e 値 < 1e-10 および 60% Затем были идентифициров​​аны собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)。 次に、BLASTN (NCBI二枚貝データベース、e値<1e-10、相同性60%) とのマッチングにより、最終的な注釈付けのために自己コンティグが識別されました。 並行して、非自己グループコンティグにBLASTN（nt NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60％）でアノテーションを付与した。 並行して、非自己グループコンティグにBLASTN（nt NCBIデータベース、e値<1e−10、相同性60％）でアノテーションを付与した。 Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и) 60%）。 並行して、外来グループのコンティグに BLASTN (NT NCBI データベース、e 値 <1e-10、相同性 60%) で注釈を付けました。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。並行して、BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非集合集団自体を登録します。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%)。 並行して、非自己グループコンティグに BLASTN (nt NCBI データベース、e 値 <1e-10、相同性 60%) で注釈を付けました。 nrおよびRefSeqタンパク質NCBIデータベース（e値<1e−10および60％の相同性）を使用して、非自己コンティグに対してBLASTXも実行されました。 nrおよびRefSeqタンパク質NCBIデータベース（e値<1e−10および60％の相同性）を使用して、非自己コンティグに対してBLASTXも実行されました。 BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10) и гомология 60%)。 BLASTX は、nr および RefSeq NCBI タンパク質データベース (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を使用して、非自己コンティグに対しても実行されました。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。また、nr および RefSeq タンパク質 NCBI データ ベースを使用して、非自己重畳集団に対して BLASTX (e 値 < 1e-10 および 60% の相同性) を実行しました。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и) 60%）。 BLASTX は、nr および RefSeq NCBI タンパク質データベース (e 値 <1e-10、相同性 60%) を使用して非自己コンティグに対しても実行されました。非自己コンティグの BLASTN および BLASTX プールは最終的なコンティグを表します (補足ファイルを参照)。
PCRに使用したプライマーは表S1に示す。ccfDNA標的遺伝子の増幅には、Taq DNAポリメラーゼ（Bio Basic Canada、オンタリオ州マーカム）を使用した。反応条件は、変性：95℃で3分、95℃で1分、アニーリング温度設定で1分、伸長反応：72℃で1分、これを35サイクル繰り返し、最後に72℃で10分以内とした。PCR産物は、SYBRTM Safe DNA Gel Stain（Invitrogen、オンタリオ州バーリントン、カナダ）を含むアガロースゲル（1.5%）で95Vの電気泳動により分離した。
ムール貝（Mytilus spp.）を500 mlの酸素化海水（32 PSU）に4°Cで24時間馴致しました。ヒトガレクチン-7 cDNA配列（NCBIアクセッション番号L07769）をコードするインサートを含むプラスミドDNAを、最終濃度190 μg/μlでバイアルに加えました。DNAを添加せずに同じ条件下でインキュベートしたムール貝をコントロールとしました。3つ目のコントロールタンクには、ムール貝を入れずにDNAを入れました。海水中のDNAの品質をモニタリングするために、各タンクから指定の時間に海水サンプル（20 μl、3回繰り返し）を採取しました。プラスミドDNAのトレーサビリティを確保するため、指定の時間にLBムール貝を収穫し、qPCRおよびddPCRで分析しました。海水の塩分濃度が高いため、すべてのPCRアッセイの前に、アリコートをPCR品質の水（1:10）で希釈しました。
デジタルドロップレットPCR（ddPCR）は、BioRad QX200プロトコル（カナダ、オンタリオ州ミシサガ）を使用して実施しました。温度プロファイルを使用して最適温度を決定します（表S1）。ドロップは、QX200ドロップジェネレーター（BioRad）を使用して生成しました。ddPCRは次のように実施しました：95°Cで5分、95°Cで30秒間、所定のアニーリング温度で1分間、72°Cで30秒間、4°Cで5分間、90°Cで5分以内を50サイクル。ドロップ数と陽性反応（コピー数/µl）は、QX200ドロップリーダー（BioRad）を使用して測定しました。ドロップ数が10,000未満のサンプルは除外しました。パターンコントロールは、ddPCRを実行するたびには実行されませんでした。
qPCRは、Rotor-Gene® 3000（Corbett Research、オーストラリア、シドニー）とLGALS7特異的プライマーを用いて実施しました。すべての定量PCRは、QuantiFast SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）を用いて20 µlで実施しました。qPCRは、95℃で15分間のインキュベーションから開始し、その後、95℃で10秒間、60℃で60秒間のインキュベーションを40サイクル行い、1回のデータ収集を行いました。融解曲線は、95℃で5秒間、65℃で60秒間、そしてqPCR終了時に97℃で連続測定することにより作成しました。各qPCRは、コントロールサンプルを除き、3回繰り返して実施しました。
ムール貝は高い濾過速度で知られているため、我々はまず、海水中に存在する DNA 断片を濾過して保持できるかどうかを調べました。また、これらの断片が半開放型リンパ系に蓄積するかどうかも興味がありました。この問題は、ムール貝の水槽に添加した可溶性 DNA 断片の運命を追跡することで実験的に解決しました。DNA 断片の追跡を容易にするために、ヒトガレクチン 7 遺伝子を含む外来の（自己ではない）プラスミド DNA を使用しました。ddPCR は、海水とムール貝中のプラスミド DNA 断片を追跡します。その結果、ムール貝が存在しない状態では海水中の DNA 断片の量が時間の経過とともに（最大 7 日間）比較的一定のままであったのに対し、ムール貝が存在すると、このレベルは 8 時間以内にほぼ完全に消失しました（図 1a、b）。外来 DNA の断片は、弁内液と血リンパで 15 分以内に容易に検出されました（図 1c）。 DNA断片に対するこの濾過活性は、細菌や藻類の濾過活性に匹敵する[31]。これらの結果は、ムール貝が体液コンパートメント内に外来DNAを濾過し蓄積できることを示唆している。
ddPCR法を用いて測定した、ムール貝存在下（A）または非存在下（B）の海水中のプラスミドDNAの相対濃度。Aでは、結果はパーセンテージで表され、ボックスの境界は75パーセンタイルと25パーセンタイルを表す。フィッティングされた対数曲線は赤色で示され、灰色の領域は95%信頼区間を表す。Bでは、赤色の線は濃度の平均値、青色の線は95%信頼区間を表す。C：プラスミドDNA添加後の異なる時間におけるムール貝の血リンパ液および弁膜液中のプラスミドDNAの蓄積。結果は、検出された絶対コピー数/mL（±SE）として示されている。
次に、人為的影響が限られている遠隔諸島であるケルゲレン諸島のムール貝の養殖場から採取されたムール貝のccfDNAの起源を調査した。この目的のために、ムール貝の血リンパからcccDNAを分離し、ヒトのcccDNAの精製に一般的に用いられる方法[32, 33]で精製した。その結果、ムール貝の血リンパ中のccfDNA濃度は平均して低マイクログラム/mlの範囲であることがわかった（表S2、補足情報を参照）。この濃度範囲は健康な人（低ナノグラム/ml）よりもはるかに高いが、まれに、がん患者ではccfDNAのレベルが数マイクログラム/mlに達することがある[34, 35]。血リンパccfDNAのサイズ分布を分析したところ、これらの断片のサイズは1000 bpから1000 bp、最大5000 bpまで大きく変動することがわかった（図2）。法医学ではccfDNAを含む低濃度DNAサンプルからゲノムDNAを迅速に分離・精製するために一般的に使用されている方法であるシリカベースのQIAamp Investigator Kitを使用しても同様の結果が得られました[36]。
ムール貝の血リンパ中のccfDNAの代表的な電気泳動図。NucleoSnap Plasma Kit（上）およびQIAamp DNA Investigator Kitを用いて抽出。B バイオリンプロットは、ムール貝の血リンパ中のccfDNA濃度（±SE）の分布を示す。黒線と赤線はそれぞれ中央値、第1四分位値、第3四分位値を表す。
ヒトおよび霊長類のccfDNAの約1%は外来起源である[21, 37]。二枚貝の半開放循環系、微生物に富む海水、そしてムール貝のccfDNAのサイズ分布を考慮し、ムール貝の血リンパccfDNAには豊富で多様な微生物DNAプールが含まれている可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するため、ケルゲレン諸島で採取されたAulacomya atraのサンプルから血リンパccfDNAを配列決定し、1,000万以上のリード数を得た。そのうち97.6%が品質管理に合格した。その後、BLASTNおよびNCBI二枚貝データベースを用いて、リードは自己起源と非自己起源に分類された（図S1、補足情報）。
ヒトでは、核DNAとミトコンドリアDNAの両方が血流に放出される可能性がある[38]。しかし、本研究では、A. atraゲノムが配列決定されておらず、記述もされていないため、ムール貝の核ゲノムDNAを詳細に記述することはできなかった。しかし、二枚貝ライブラリーを用いて、ヒト由来のccfDNA断片をいくつか同定することはできた（図S2、補足情報）。また、配列決定されたA. atra遺伝子のダイレクトPCR増幅により、ヒト由来のDNA断片の存在も確認した（図3）。同様に、A. atraのミトコンドリアゲノムが公的データベースで利用可能であることを考えると、A. atraの血リンパ中にミトコンドリアccfDNA断片が存在する証拠を見つけることができる。ミトコンドリアDNA断片の存在はPCR増幅により確認された（図3）。
PCR増幅されたA. atra（赤点 – ストック番号：SRX5705969）およびM. platensis（青点 – ストック番号：SRX5705968）の血リンパには、様々なミトコンドリア遺伝子が含まれていました。図はBreton et al., 2011より改変。B A. atraの血リンパ上清の増幅。FTA紙に保存。3mmのパンチを使用して、PCRミックスが入ったPCRチューブに直接添加してください。
海水中の微生物含有量が豊富であることから、我々はまず血リンパ中の微生物 DNA 配列の特性評価に焦点を当てました。これを行うために、2 つの異なる戦略を使用します。最初の戦略では、BLAST やその他のツールに匹敵する精度で微生物配列を識別できるアルゴリズムベースの配列分類プログラムである Kraken2 を使用しました [28]。6719 を超えるリードが細菌起源と判定され、124 が古細菌に、64 がウイルスに由来しました (図 4)。最も豊富な細菌 DNA 断片は、Firmicutes (46%)、Proteobacteria (27%)、Bacteroidetes (17%) でした (図 4a)。この分布は、海洋のムール貝のマイクロバイオームの以前の研究と一致しています [39, 40]。Gammaproteobacteria は Proteobacteria の主なクラス (44%) で、多くの Vibrionales を含みます (図 4b)。 ddPCR法によって、A. atraの体液中のccfDNA中にビブリオDNA断片が存在することが確認された（図4c）[41]。ccfDNAの細菌起源についてより詳細な情報を得るために、追加のアプローチが行われた（図S2、補足情報）。 この場合、重複したリードはペアエンドリードとしてアセンブルされ、BLASTN と e 値 1e−3、相同性 > 90% のカットオフを使用して、自己（二枚貝）または非自己起源として分類されました。 この場合、重複したリードはペアエンドリードとしてアセンブルされ、BLASTN と e 値 1e−3、相同性 > 90% のカットオフを使用して、自己（二枚貝）または非自己起源として分類されました。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифициров​​аны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90％です。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、BLASTN と e 値 1e-3、相同性が 90% を超えるカットオフを使用して、ネイティブ (二枚貝) または非オリジナルとして分類されました。この場合、反復されたカウントは末端のカウントにまとめられ、BLASTNおよび1e-3のe値および＞90%の同一性の終了値の分割がそれ自体（二重型）または非自己源のものとして使用される。このような場合には、blastn と 1e-3 の値と > 90% の相同性の分別タイプ (二重シベジタイプ) を使用して、再試行数の組合わせを末端の試行数として行います。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифициров​​аны как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и > 90%。 この場合、重複するリードはペアエンドリードとして収集され、e BLASTN と 1e-3 値、および 90% を超える相同性しきい値を使用して、独自 (二枚貝) または非オリジナルとして分類されました。A. atraのゲノムはまだ配列決定されていないため、MEGAHIT次世代シーケンシング（NGS）アセンブラのde novoアセンブリ戦略を使用しました。その結果、合計147,188個のコンティグが二枚貝由来であることが特定されました。これらのコンティグは、BLASTNおよびBLASTXを用いて、e値1e-10で爆発的に増加しました。この戦略により、A. atraのccfDNAに存在する482個の非二枚貝由来のDNA断片を同定することができました。これらのDNA断片の半分以上（57%）は、主に鰓共生菌（硫酸栄養性共生菌を含む）および鰓共生菌Solemya velum由来の細菌由来でした（図5）。
タイプレベルでの相対的存在量。B. 2つの主要門（フィルミクテス門とプロテオバクテリア門）の微生物多様性。ddPCRによる増幅例。C. ビブリオ属。A. 3つの腹腔血リンパにおける16S rRNA遺伝子（青）の断片。
収集された合計482個のコンティグが解析されました。メタゲノムコンティグアノテーション（原核生物および真核生物）の分類学的分布の概略図。B BLASTNおよびBLASTXによって同定された細菌DNA断片の詳細な分布。
Kraken2 分析では、ムール貝の ccfDNA に古細菌の DNA 断片が含まれており、その中にはユーリアーキオータ (65%)、クレンアーキオータ (24%)、およびタウルマーキオータ (11%) の DNA 断片が含まれていたことが示されました (図 6a)。 カリフォルニア産ムール貝の微生物群集で以前に発見されたユーリアーキオータとクレンアーキオータ由来の DNA 断片の存在は、驚くべきことではない [42]。 ユーリアーキオータは極限条件と関連付けられることが多いが、現在ではユーリアーキオータとクレンアーキオータの両種が海洋極低温環境で最も一般的な原核生物であることが認識されている [43, 44]。 ケルゲレン高原の海底漏出からの大規模なメタン漏出に関する最近の報告 [45] やケルゲレン諸島沖で微生物によるメタン生成の可能性が観測されている [46] ことを考えると、ムール貝にメタン生成微生物が存在することは驚くべきことではない。
次に、DNAウイルスの読み取りに注目が移りました。私たちが知る限り、これはムール貝のウイルス含有量に関する初のオフターゲット研究です。予想通り、バクテリオファージ（Caudovirales）のDNA断片を発見しました（図6b）。しかし、最も一般的なウイルスDNAは、核細胞ウイルス門、別名核細胞質巨大DNAウイルス（NCLDV）に由来し、あらゆるウイルスの中で最大のゲノムを持っています。この門の中で、DNA配列の大部分は、脊椎動物と節足動物を自然宿主とするミミミドウイルス科（58%）とポックスウイルス科（21%）に属し、これらのDNA配列のごく一部は既知のウイルス性藻類に属しています。海洋真核藻類に感染します。これらの配列は、既知のウイルス属の中で最大のゲノムサイズを持つ巨大ウイルスであるパンドラウイルスからも得られました。興味深いことに、血リンパccfDNAシーケンシングによって判明した、ウイルス感染が判明している宿主の範囲は比較的広かった（図S3、補足情報）。バキュロウイルス科やイリドウイルス科といった昆虫に感染するウイルスに加え、アメーバ、藻類、脊椎動物に感染するウイルスも含まれる。また、ピトウイルス・シベリカムのゲノムと一致する配列も発見した。ピトウイルス（別名「ゾンビウイルス」）は、シベリアの3万年前の永久凍土から初めて単離された[47]。したがって、今回の結果は、これらのウイルスの現生種がすべて絶滅しているわけではないこと[48]、そしてこれらのウイルスが遠隔地の亜北極海洋生態系に存在する可能性があることを示す過去の報告と一致している。
最後に、他の多細胞動物由来のDNA断片が見つかるかどうかを検証しました。nt、nr、RefSeqライブラリ（ゲノムおよびタンパク質）を用いたBLASTNおよびBLASTXにより、合計482個の外来コンティグが同定されました。その結果、多細胞動物由来のccfDNAの外来断片の中では、骨のDNAが優勢であることが示されました（図5）。昆虫やその他の種のDNA断片も発見されました。DNA断片の比較的大きな部分は同定されていませんが、これはおそらく、陸生種と比較して多くの海洋種がゲノムデータベースに過少に収録されていることが原因と考えられます[49]。
本論文では、LB 概念をムール貝に適用し、血リンパ ccfDNA ショットシーケンスによって海洋沿岸生態系の構成に関する知見が得られると主張しています。具体的には、1) ムール貝の血リンパには、比較的大きな (~1-5 kb) 循環 DNA 断片が比較的高濃度 (マイクログラムレベル) で含まれていること、2) これらの DNA 断片には独立性と非独立性があること、3) これらの DNA 断片の外来起源の中には、細菌、古細菌、ウイルスの DNA に加え、他の多細胞動物の DNA が含まれていること、4) これらの外来 ccfDNA 断片は血リンパに急速に蓄積し、ムール貝の内部濾過活動に寄与していることが分かりました。結論として、これまで主に生物医学分野に適用されてきた LB 概念は、センチネル種とその環境との相互作用をより深く理解するために活用できる、豊富だが未開拓の知識源をコードしていることが本研究によって実証されました。
霊長類に加えて、マウス、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳類でもccfDNAの分離が報告されている[50, 51, 52]。しかし、我々の知る限り、本研究は開放循環系を持つ海洋生物種におけるccfDNAの検出と配列決定を報告した初の研究である。このムール貝の解剖学的特徴と濾過能力は、少なくとも部分的には、他の種と比較して循環DNA断片のサイズ特性が異なることを説明できるかもしれない。ヒトの場合、血液中を循環するDNA断片のほとんどは、150～200 bpのサイズの小さな断片であり、最大ピークは167 bpである[34, 53]。DNA断片の小さいが重要な部分は300～500 bpのサイズであり、約5％は900 bpより長い[54]。このサイズ分布の理由は、血漿中のccfDNAの主な発生源が、細胞死の結果として発生するためであり、細胞死は健康な人の循環造血細胞の壊死、または癌患者の腫瘍細胞のアポトーシスによるものです（循環腫瘍DNAとして知られています）。 、ctDNA）。私たちがムール貝で発見した体液ccfDNAのサイズ分布は1000～5000 bpの範囲であり、ムール貝のccfDNAは別の起源を持っていることを示唆しています。これは論理的な仮説です。なぜなら、ムール貝は半開放型の血管系を持ち、高濃度の微生物ゲノムDNAを含む海洋水生環境に生息しているからです。実際、外来DNAを使用した私たちの実験室実験では、ムール貝は海水中にDNA断片を蓄積し、少なくとも数時間は細胞に取り込まれた後分解され、および/または放出され、および/またはさまざまな組織に保管されることが示されています。細胞（原核生物および真核生物の両方）の希少性を考慮すると、弁内コンパートメントの使用により、自己由来および外来由来のccfDNAの量を削減できます。二枚貝の自然免疫の重要性と循環する貪食細胞の多さを考慮し、微生物や細胞片を摂取して外来DNAを蓄積する循環貪食細胞には、外来ccfDNAも豊富に含まれているという仮説をさらに立てました。これらの結果を総合すると、二枚貝の体液ccfDNAは分子情報のユニークな宝庫であり、二枚貝が監視役としての地位を強固なものにしていることがわかります。
我々のデータは、細菌由来の血リンパccfDNA断片の配列決定と分析が、宿主の細菌叢と周囲の海洋生態系に存在する細菌に関する重要な情報を提供できることを示している。ショットシーケンス法によって、従来の16S rRNA同定法では参照ライブラリの偏りなどにより見逃されていたであろう、常在細菌A. atra gillの配列が明らかになった。実際、ケルゲレン島の同じムール貝層でM. platensisから採取したLBデータを使用したところ、鰓に関連する共生細菌の構成は両種で同じであることが示された（図S4、補足情報）。遺伝的に異なる2種のムール貝のこの類似性は、ケルゲレン島の冷たく硫黄を含んだ火山性の堆積物中の細菌群集の構成を反映している可能性がある[55, 56, 57, 58]。ポルトーフランス沿岸のような生物擾乱を受けた沿岸域でムール貝を採取すると、硫黄還元微生物のレベルが高くなることが報告されている[59]。もう一つの可能​​性として、ムール貝の共生フローラが水平伝播の影響を受けている可能性も考えられる[60, 61]。海洋環境、海底表面、そしてムール貝の共生細菌組成との相関関係を明らかにするには、さらなる研究が必要であり、これらの研究は現在進行中である。
体液ccfDNAの長さと濃度、精製の容易さ、迅速なショットガンシーケンスを可能にする高品質は、ムール貝ccfDNAを用いて海洋沿岸生態系の生物多様性を評価する多くの利点の一部です。このアプローチは、特定の生態系におけるウイルス群集（ウイローム）の特性評価に特に効果的です[62, 63]。細菌、古細菌、真核生物とは異なり、ウイルスゲノムには16S配列などの系統学的に保存された遺伝子は含まれていません。私たちの研究結果は、ムール貝などの指標種からの液体生検を用いて、沿岸海洋生態系に典型的に生息する宿主に感染することが知られている比較的多数のccfDNAウイルス断片を同定できることを示しています。これには、原生動物、節足動物、昆虫、植物、細菌ウイルス（バクテリオファージなど）に感染することが知られているウイルスが含まれます。ケルゲレン島の同じイガイ層で採取されたムール貝 (M. platensis) の血リンパ ccfDNA ウイロームを調べたところ、同様の分布が見つかりました (表 S2、補足情報)。ccfDNA のショットガンシーケンスは、確かに、ヒトや他の種のウイロームの研究で勢いを増している新しいアプローチです [21, 37, 64]。このアプローチは、ボルチモアで最も多様で広範なウイルスクラスを代表するすべての二本鎖 DNA ウイルス間で保存されている単一の遺伝子がないため、二本鎖 DNA ウイルスの研究に特に有用です [65]。これらのウイルスのほとんどは未分類のままであり、ウイルス界で完全に未知の部分のウイルスが含まれている可能性がありますが [66]、イガイ A. atra と M. platensis のウイロームと宿主域は、2 つの種の間に位置することがわかりました。同様に (図 S3、追加情報を参照)。この類似性は驚くべきものではなく、環境中に存在するDNAの取り込みにおける選択性の欠如を反映している可能性があります。RNAウイロームの特性を明らかにするには、精製RNAを用いた今後の研究が必要です。
本研究では、Kowarskiらの研究 [37] を改変した非常に厳密なパイプラインを使用しました。彼らは、ネイティブccfDNAのアセンブリの前後にプールされたリードとコンティグの2段階削除を使用しており、マッピングされていないリードの割合が高くなっています。そのため、主にこのムール貝種の参照ゲノムを持っていないため、これらのマッピングされていないリードの一部が依然として独自の起源を持っている可能性を排除できません。また、自己リードと非自己リード間のキメラと、Illumina MiSeq PE75によって生成されたリード長について懸念があったため、このパイプラインを使用しました。読み取り値が未解析のものが大部分を占めるもう1つの理由は、特にケルゲレン島などの遠隔地の海洋微生物の多くはアノテーションされていないことです。ccfDNAのフラグメント長がヒトのccfDNAと同様であると仮定して、Illumina MiSeq PE75を使用しました。今後の研究では、血リンパccfDNAはヒトや哺乳類よりも長いリードを持つという結果を踏まえ、より長いccfDNA断片に適したシーケンシングプラットフォームの使用を推奨します。これにより、より詳細な分析のためのより多くの兆候を特定しやすくなります。現在入手不可能なA. atraの完全な核ゲノム配列を入手できれば、自己由来および非自己由来のccfDNAの識別も大幅に容易になります。私たちの研究は、液体生検の概念をムール貝に適用する可能性に焦点を当ててきたため、この概念が今後の研究で活用されるにつれて、ムール貝の微生物多様性を研究するためのこの手法の可能性を高めるための新しいツールやパイプラインが開発されることを期待しています。海洋生態系。
非侵襲性の臨床バイオマーカーとして、ヒト血漿中のccfDNA濃度の上昇は、様々な疾患、組織損傷、ストレス状態と関連付けられています[67,68,69]。この増加は、組織損傷後に自己由来のDNA断片が放出されることと関連しています。我々はこの問題を、ムール貝を30℃の温度に短時間さらすという急性熱ストレスを用いて検討しました。この分析は、3つの異なる種類のムール貝を用いて3回の独立した実験で行いました。しかし、急性熱ストレス後のccfDNA濃度の変化は認められませんでした（図S5、追加情報を参照）。この発見は、ムール貝が半開放型循環系を有し、高い濾過活性のために大量の外来DNAを蓄積するという事実を、少なくとも部分的に説明できるかもしれません。一方、ムール貝は多くの無脊椎動物と同様に、ストレス誘発性の組織損傷に対する抵抗力が強く、そのため血リンパ中へのccfDNAの放出が制限されている可能性があります[70, 71]。
現在まで、水生生態系の生物多様性の DNA 解析は、主に環境 DNA (eDNA) メタバーコーディングに焦点を当ててきました。しかし、この方法は、プライマーを使用する場合、生物多様性解析において通常限界があります。ショットガンシーケンスの使用は、PCR の限界とプライマーセットの偏った選択を回避します。したがって、ある意味では、我々の方法は、断片化された DNA を直接シーケンスし、ほぼすべての生物を解析することができる、最近使用されているハイスループット eDNA ショットガンシーケンス法に近いものです [72, 73]。ただし、LB 法と標準的な eDNA 法を区別する基本的な問題がいくつかあります。もちろん、eDNA と LB 法の主な違いは、天然のフィルターホストを使用することです。eDNA を研究するための天然フィルターとして、スポンジや二枚貝 (Dresseina spp.) などの海洋種を使用することが報告されています [74, 75]。ただし、Dreissena の研究では、DNA が抽出された組織生検が使用されました。 LB からの ccfDNA の分析には、組織生検、eDNA または組織生検に関連する特殊で場合によっては高価な機器やロジスティクスは必要ありません。実際、私たちは最近、LB からの ccfDNA は、遠隔地での研究にとって大きな課題であるコールドチェーンを維持することなく、FTA サポートを使用して保存および分析できることを報告しました [76]。液体生検からの ccfDNA の抽出も簡単で、ショットガンシーケンスと PCR 分析に使用できる高品質の DNA を提供します。これは、eDNA 分析に関連するいくつかの技術的な制限を考慮すると、大きな利点です [77]。サンプリング方法の単純さと低コストは、長期モニタリングプログラムにも特に適しています。高い濾過能力に加えて、二枚貝のもう 1 つのよく知られた特徴は、粘液の化学的ムコ多糖類組成で、これがウイルスの吸収を促進することです [78, 79]。このため、二枚貝は特定の水生生態系における生物多様性と気候変動の影響を特徴付けるための理想的な天然フィルターとなります。宿主由来の DNA 断片の存在は、eDNA と比較した場合のこの方法の制約と見なすことができますが、eDNA と比較してこのようなネイティブ ccfDNA を持つことに伴うコストは、健康研究に利用できる情報量が膨大であることを考えると、同時に理解できます。オフセット宿主。これには、宿主のゲノムに組み込まれたウイルス配列の存在が含まれます。二枚貝には水平伝播する白血病レトロウイルスが存在することを考えると、これはムール貝にとって特に重要です [80, 81]。eDNA に対する LB のもう 1 つの利点は、微生物 (およびそのゲノム) を貪食する、血リンパ中の循環血球の貪食活動を利用することです。貪食は、二枚貝の血球の主な機能です [82]。最後に、この方法では、ムール貝の高い濾過能力 (平均 1.5 l/h の海水) と 2 日間の循環を利用して、異なる層の海水の混合を増やし、異種の eDNA を捕捉できるようにします。 [83, 84]。このように、ムール貝のccfDNA分析は、その栄養面、経済面、環境面への影響を考えると、興味深い手法である。ヒトから採取したLBの分析と同様に、この手法は、外因性物質に対する宿主DNAの遺伝的およびエピジェネティックな変化を測定する可能性も開く。例えば、第三世代シーケンシング技術は、ナノポアシーケンシングを用いてネイティブccfDNAのゲノムワイドなメチル化解析を行うことが想定される。このプロセスは、ムール貝のccfDNA断片の長さが、化学変換を必要とせずに1回のシーケンシングランでゲノムワイドなDNAメチル化解析を可能にするロングリードシーケンシングプラットフォームと理想的に適合しているという事実によって促進されるはずである。[85,86] DNAメチル化パターンは環境ストレスへの応答を反映し、何世代にもわたって持続することが示されているため、これは興味深い可能性である。したがって、気候変動や汚染物質への曝露後の応答を支配する根底にあるメカニズムに関する貴重な知見を提供できる可能性がある[87]。しかし、LB の使用には制限がないわけではありません。言うまでもなく、これには生態系内に指標種が存在することが必要です。前述のように、LB を使用して特定の生態系の生物多様性を評価するには、ソースからの DNA 断片の存在を考慮に入れた厳密なバイオインフォマティクス パイプラインも必要です。もう 1 つの大きな問題は、海洋種の参照ゲノムが利用できるかどうかです。海洋哺乳類ゲノム プロジェクトや最近設立された Fish10k プロジェクト [88] などのイニシアチブにより、将来このような分析が容易になることが期待されます。LB コンセプトの海洋濾過摂食生物への適用は、最新のシーケンス技術の進歩とも互換性があり、環境ストレスに対する海洋生息地の健全性に関する重要な情報を提供するマルチオームバイオマーカーの開発に適しています。
ゲノム配列データは、NCBI Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) の Bioprojects SRR8924808 に保存されています。
Brierley AS、Kingsford MJ「気候変動による海洋生物と生態系への影響」Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. 気候変動とその他の局所的ストレス要因が海洋環境に及ぼす複合的な影響を考慮する。一般科学環境。2021;755:142564。
Carella F、Antuofermo E、Farina S、Salati F、Mandas D、Prado P、他。 ）。 3 月 1 日の科学。 2020;7:48。
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. 反復的な熱ストレス条件下での耐熱性の低下が、ムール貝の夏季の死亡率の高さを説明する。科学レポート 2019; 9:17498.
Fey SB、Siepielski AM、Nussle S、Cervantes-Yoshida K、Hwan JL、Huber ER他「動物の死亡頻度、原因、死亡規模の近年の変化」Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
スカルパ F、サンナ D、アッツェナ I、ムゲッティ D、セルッティ F、ホッセイニ S、他複数の非種特異的病原体が耳介の大量死亡を引き起こした可能性があります。人生。 2020;10:238。
ブラッドリーM、クーツSJ、ジェンキンスE、オハラTM. 気候変動が北極圏の人獣共通感染症に及ぼす潜在的影響. 国際周極地健康誌. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. 他「沿岸汚染モニタリングにおけるシグナル生物としてのムラサキイガイ（Mytilus edulis spp.）に関するレビュー」Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. がん治療における液体生検の統合. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. 液体生検の成熟：腫瘍DNAの循環を可能にする. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P.「ヒト血漿中の核酸」Soc Biol関連部会議事録. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. がん治療における分子マーカーとしての遊離DNAの新たな役割。バイオモル分析の定量化。2019;17:100087。
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS「液体生検の臨床導入 ― 導入上の課題と今後の課題」Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW他「胎児DNAは母体血漿および血清中に存在する」Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN、Wong RJ、Shaw GM、Stevenson DK、Quake SR「妊娠中の女性の血液中の循環細胞外RNAを用いた妊娠経過と合併症の研究」Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. 液体生検：ドナーの遊離DNAを用いた腎移植における同種病変の検出. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC、Lo YM「出生前診断における革新：母体血漿ゲノム配列解析」Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. 感染体液の次世代メタゲノムシーケンシングによる迅速な病原体検出．Nat Medicine. 2021;27:115-24.