Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Vloeibare biopsie (LB) is een concept dat snel aan populariteit wint in de biomedische sector. Het concept is voornamelijk gebaseerd op de detectie van fragmenten van circulerend extracellulair DNA (ccfDNA), die na celdood in verschillende weefsels voornamelijk als kleine fragmenten vrijkomen. Een klein deel van deze fragmenten is afkomstig van vreemde (vreemde) weefsels of organismen. In ons huidige onderzoek hebben we dit concept toegepast op mosselen, een soort die bekendstaat om zijn hoge filtratievermogen. We gebruiken het vermogen van mosselen om als natuurlijke filters te fungeren om DNA-fragmenten uit de omgeving van diverse bronnen te verzamelen en zo informatie te verschaffen over de biodiversiteit van mariene kustecosystemen. Onze resultaten tonen aan dat de hemolymfe van mosselen DNA-fragmenten bevat die sterk in grootte variëren, van 1 tot 5 kb. Shotgun-sequencing toonde aan dat een groot aantal DNA-fragmenten van vreemde microbiële oorsprong is. Daaronder vonden we DNA-fragmenten van bacteriën, archaea en virussen, waaronder virussen waarvan bekend is dat ze diverse gastheren infecteren die veel voorkomen in mariene kustecosystemen. Concluderend toont ons onderzoek aan dat het LB-concept toegepast op mosselen een rijke, maar nog onontgonnen bron van kennis vertegenwoordigt over de microbiële diversiteit in mariene kustecosystemen.
De impact van klimaatverandering (CC) op de biodiversiteit van mariene ecosystemen is een snelgroeiend onderzoeksgebied. De opwarming van de aarde veroorzaakt niet alleen belangrijke fysiologische stressfactoren, maar verlegt ook de evolutionaire grenzen van de thermische stabiliteit van mariene organismen, waardoor de habitat van een aantal soorten wordt aangetast en ze op zoek gaan naar gunstiger omstandigheden [1, 2]. Naast het beïnvloeden van de biodiversiteit van metazoa, verstoort CC het delicate evenwicht van gastheer-microbiële interacties. Deze microbiële dysbacteriose vormt een ernstige bedreiging voor mariene ecosystemen, omdat het mariene organismen vatbaarder maakt voor infectieuze pathogenen [3, 4]. Er wordt aangenomen dat SS een belangrijke rol spelen bij massale sterfgevallen, wat een ernstig probleem is voor het beheer van wereldwijde mariene ecosystemen [5, 6]. Dit is een belangrijk probleem gezien de economische, ecologische en nutritionele gevolgen van veel mariene soorten. Dit geldt met name voor tweekleppigen die in de poolgebieden leven, waar de effecten van CK directer en ernstiger zijn [6, 7]. Sterker nog, tweekleppigen zoals Mytilus spp. worden veel gebruikt om de effecten van CC op mariene ecosystemen te monitoren. Het is niet verrassend dat er een relatief groot aantal biomarkers is ontwikkeld om hun gezondheid te monitoren, vaak met behulp van een tweeledige benadering met functionele biomarkers gebaseerd op enzymatische activiteit of cellulaire functies zoals cellevensvatbaarheid en fagocytische activiteit [8]. Deze methoden omvatten ook de meting van de concentratie van specifieke drukindicatoren die zich ophopen in zachte weefsels na de absorptie van grote hoeveelheden zeewater. De hoge filtratiecapaciteit en het halfopen circulatiesysteem van tweekleppigen bieden echter een mogelijkheid om nieuwe hemolymfebiomarkers te ontwikkelen met behulp van het concept van vloeibare biopsie (LB), een eenvoudige en minimaal invasieve benadering van patiëntmanagement. bloedmonsters [9, 10]. Hoewel er verschillende soorten circulerende moleculen kunnen worden gevonden in humane LB, is dit concept voornamelijk gebaseerd op DNA-sequentieanalyse van circulerende extracellulaire DNA (ccfDNA)-fragmenten in plasma. De aanwezigheid van circulerend DNA in menselijk plasma is al sinds het midden van de twintigste eeuw bekend [11], maar pas de laatste jaren heeft de komst van high-throughput sequencing-methoden geleid tot klinische diagnose op basis van ccfDNA. De aanwezigheid van deze circulerende DNA-fragmenten is deels te wijten aan het passief vrijkomen van genomisch DNA (nucleair en mitochondriaal) na celdood. Bij gezonde personen is de concentratie ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml). Bij patiënten die aan verschillende pathologieën lijden of aan stress worden blootgesteld, kan de concentratie echter 5–10 keer hoger zijn, met weefselschade tot gevolg. Bij gezonde personen is de concentratie ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml). Bij patiënten die aan verschillende pathologieën lijden of aan stress worden blootgesteld, kan de concentratie echter 5–10 keer hoger zijn, met weefselschade tot gevolg. U kunt de waarde van uw product in een lagere temperatuur (<10 нг/мл), ножет повышаться in 5–10 раз у больных с различной патологией или Zorg ervoor dat u de juiste keuze maakt. Bij gezonde mensen is de concentratie cccDNA normaal gesproken laag (<10 ng/ml), maar bij patiënten met verschillende pathologieën of onder stress die leidt tot weefselschade, kan de concentratie met een factor 5 tot 10 toenemen.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml,，但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍,从而导致组织损伤。健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤ccfDNA-gegevens (<10 нг/мл) zijn mogelijk, ногут быть увеличены in 5-10 jaar geleden Als u dit doet, moet u dit doen. De concentraties van ccfDNA zijn doorgaans laag (<10 ng/ml) bij gezonde personen, maar kunnen bij patiënten met verschillende pathologieën of stress met een factor 5 tot 10 toenemen, met weefselschade tot gevolg.De grootte van ccfDNA-fragmenten varieert sterk, maar ligt gewoonlijk tussen de 150 en 200 bp. [12]. Analyse van zelf-afgeleid ccfDNA, d.w.z. ccfDNA uit normale of getransformeerde gastheercellen, kan worden gebruikt om genetische en epigenetische veranderingen te detecteren die aanwezig zijn in het nucleaire en/of mitochondriale genoom, waardoor clinici specifieke moleculair gerichte therapieën kunnen selecteren [13]. CCFDNA kan echter ook worden verkregen uit vreemde bronnen, zoals ccfDNA uit foetale cellen tijdens de zwangerschap of uit getransplanteerde organen [14,15,16,17]. CCFDNA is ook een belangrijke informatiebron voor het detecteren van de aanwezigheid van nucleïnezuren van een infectieus agens (vreemd), wat niet-invasieve detectie van wijdverspreide infecties mogelijk maakt die niet door bloedkweken worden geïdentificeerd, waardoor invasieve biopsie van geïnfecteerd weefsel wordt vermeden [18]. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat menselijk bloed een rijke bron aan informatie bevat die kan worden gebruikt om virale en bacteriële pathogenen te identificeren, en dat ongeveer 1% van het ccfDNA in menselijk plasma van vreemde oorsprong is [19]. Deze studies tonen aan dat de biodiversiteit van het circulerende microbioom van een organisme kan worden beoordeeld met behulp van ccfDNA-analyse. Tot voor kort werd dit concept echter uitsluitend bij mensen gebruikt en, in mindere mate, bij andere gewervelde dieren [20, 21].
In dit artikel gebruiken we het LB-potentieel om het ccfDNA te analyseren van Aulacomya atra, een zuidelijke soort die veel voorkomt op de subantarctische Kerguelen-eilanden, een eilandengroep op een groot plateau dat 35 miljoen jaar geleden is ontstaan. vulkaanuitbarsting. Met behulp van een in-vitro-experimenteel systeem ontdekten we dat DNA-fragmenten in zeewater snel door mosselen worden opgenomen en in het hemolymfecompartiment terechtkomen. Shotgun-sequencing heeft aangetoond dat het hemolymfe-ccfDNA van mosselen DNA-fragmenten van eigen en niet-eigen oorsprong bevat, waaronder symbiotische bacteriën en DNA-fragmenten uit biomen die typisch zijn voor koude vulkanische mariene kustecosystemen. Hemolymfe-ccfDNA bevat ook virale sequenties afkomstig van virussen met verschillende gastheerbereiken. We vonden ook DNA-fragmenten van meercellige dieren zoals beenvissen, zeeanemonen, algen en insecten. Concluderend toont onze studie aan dat het LB-concept succesvol kan worden toegepast op ongewervelde zeedieren om een ​​rijk genomisch repertoire in mariene ecosystemen te genereren.
Volwassen (55-70 mm lang) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) werden verzameld aan de getijdenrotsen van Port-au-France (049°21.235 ZB, 070°13.490 E). Kerguelen-eilanden in december 2018. Andere volwassen blauwe mosselen (Mytilus spp.) werden verkregen van een commerciële leverancier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) en geplaatst in een temperatuurgecontroleerde (4°C) beluchte tank met 10-20 liter kunstmatige pekel van 32‰ (kunstmatig zeezout Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, VS). Voor elk experiment werden de lengte en het gewicht van individuele schelpen gemeten.
Een gratis open access-protocol voor dit programma is online beschikbaar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kort gezegd werd LB-hemolymfe verzameld uit abductorspieren zoals beschreven [22]. De hemolymfe werd opgehelderd door centrifugatie bij 1200×g gedurende 3 minuten, de supernatant werd ingevroren (-20°C) tot gebruik. Voor isolatie en zuivering van cfDNA werden monsters (1,5-2,0 ml) ontdooid en verwerkt met behulp van de NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) volgens de instructies van de fabrikant. ccfDNA werd bewaard bij -80°C tot verdere analyse. In sommige experimenten werd ccfDNA geïsoleerd en gezuiverd met behulp van de QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Gezuiverd DNA werd gekwantificeerd met behulp van een standaard PicoGreen-assay. De fragmentdistributie van het geïsoleerde ccfDNA werd geanalyseerd door middel van capillaire elektroforese met een Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) en een High Sensitivity DNA Kit. De assay werd uitgevoerd met 1 µl ccfDNA-monster volgens de instructies van de fabrikant.
Voor het sequencen van hemolymfe-ccfDNA-fragmenten heeft Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) shotgun-bibliotheken samengesteld met behulp van de Illumina DNA Mix-kit van de Illumina MiSeq PE75-kit. Er werd een standaardadapter (BioO) gebruikt. Bestanden met onbewerkte gegevens zijn beschikbaar via het NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809). De basiskwaliteit van de uitlezing werd beoordeeld met FastQC [23]. Trimmomatic [24] is gebruikt voor clipping-adapters en reads van slechte kwaliteit. Shotgun-reads met gepaarde uiteinden werden met FLASH samengevoegd tot langere enkele reads met een minimale overlap van 20 bp om mismatches te voorkomen [25]. Samengevoegde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een tweekleppige NCBI Taxonomy-database (e-waarde < 1e−3 en 90% homologie), en maskering van sequenties met lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. Samengevoegde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een tweekleppige NCBI Taxonomy-database (e-waarde < 1e−3 en 90% homologie), en maskering van sequenties met lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. Maak gebruik van de BLASTN-technologie met behulp van de beste manier om dit te doen таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 en 90% van de kosten) en een betere kredietwaardigheid использованием STOF [26]. Gepoolde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI bivalve taxonomie database (e-waarde < 1e-3 en 90% homologie), en er werd een maskering van de sequentie met lage complexiteit uitgevoerd met behulp van DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用STOF [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 (((<1e-3 和 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 stof [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Maak gebruik van de BLASTN-technologie met behulp van de BLASTN-technologie данных двустворчатых моллюсков NCBI e <1e-3 en 90% гомологии), een маскирование ыполнено сложности использованием STOF [26]. Gepoolde reads werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI bivalve taxonomische database (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en er werd een maskering van de sequentie met lage complexiteit uitgevoerd met behulp van DUST [26].De reads werden verdeeld in twee groepen: gerelateerd aan tweekleppige sequenties (hier self-reads genoemd) en niet-gerelateerd (niet-self-reads). Twee groepen werden afzonderlijk samengesteld met behulp van MEGAHIT om contigs te genereren [27]. Ondertussen werd de taxonomische distributie van reads van buitenaardse microbiomen geclassificeerd met behulp van Kraken2 [28] en grafisch weergegeven met een Krona-cirkeldiagram op Galaxy [29, 30]. De optimale kmers werden bepaald als kmers-59 op basis van onze voorlopige experimenten. Zelf-contigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (bivalve NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. Zelf-contigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (bivalve NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. Het is mogelijk om de kredietwaardigheid van BLASTN (via BLASTN) te vergroten NCBI, значение e <1e-10 en 60%) van de producten. Zelf-aangrenzende exemplaren werden vervolgens geïdentificeerd door vergelijking met BLASTN (NCBI bivalve database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie) voor de uiteindelijke annotatie.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Het is belangrijk dat u een goed beeld krijgt van uw persoonlijke levenssfeer сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для gemiddelde temperatuur, waarde e <1e-10 en gemiddeld 60%). Zelf-aangrenzende exemplaren werden vervolgens geïdentificeerd voor uiteindelijke annotatie door vergelijking met BLASTN (NCBI-database voor tweekleppigen, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). Tegelijkertijd werden niet-zelf-groepscontigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Tegelijkertijd werden niet-zelf-groepscontigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Het is mogelijk om uw kredietwaardigheid te vergroten met behulp van BLASTN (ook bekend als BLASTN NCBI, значение e <1e-10 en гомология 60%). Tegelijkertijd werden buitenlandse groepscontigs geannoteerd met BLASTN (NT NCBI-database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Als u een bedrijf koopt, kunt u dit niet doen met BLASTN (meer dan NCBI, значение e <1e-10 en гомология 60%). Tegelijkertijd werden niet-zelf-groep contigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf contigs met behulp van de NCBI-databases nr en RefSeq-eiwit (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf contigs met behulp van de NCBI-databases nr en RefSeq-eiwit (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX kan niet worden gebruikt op de juiste manier met het nummer en RefSeq NCBI (значение e <1e-10 en гомология 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf-contigs met behulp van de nr en RefSeq NCBI proteïnedatabases (e-waarde < 1e-10 en 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX maakt gebruik van een gegevensbestand met een nummer en RefSeq NCBI (значение e <1e-10 en гомология 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-zelf-contigs met behulp van de nr en RefSeq NCBI proteïnedatabases (e-waarde <1e-10 en 60% homologie).De BLASTN- en BLASTX-pools van niet-zelf-contigs vertegenwoordigen de uiteindelijke contigs (zie aanvullend bestand).
De voor PCR gebruikte primers staan ​​vermeld in tabel S1. Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) werd gebruikt om de ccfDNA-doelgenen te amplificeren. De volgende reactieomstandigheden werden gebruikt: denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, 95 °C gedurende 1 minuut, ingestelde annealingtemperatuur gedurende 1 minuut, verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut, 35 cycli en uiteindelijk 72 °C binnen 10 minuten. PCR-producten werden gescheiden door elektroforese in agarosegels (1,5%) met SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) bij 95 V.
Mosselen (Mytilus spp.) werden 24 uur geacclimatiseerd in 500 ml zuurstofrijk zeewater (32 PSU) bij 4 °C. Plasmide-DNA met een insert dat codeert voor de cDNA-sequentie van humane galectine-7 (NCBI-toegangsnummer L07769) werd aan het flesje toegevoegd in een eindconcentratie van 190 μg/μl. Mosselen die onder dezelfde omstandigheden zonder DNA-toevoeging waren geïncubeerd, dienden als controle. De derde controletank bevatte DNA zonder mosselen. Om de kwaliteit van het DNA in het zeewater te controleren, werden op het aangegeven tijdstip zeewatermonsters (20 μl; drie herhalingen) uit elke tank genomen. Voor de traceerbaarheid van het plasmide-DNA werden LB-mosselen op de aangegeven tijdstippen geoogst en geanalyseerd met qPCR en ddPCR. Vanwege het hoge zoutgehalte van het zeewater werden aliquots vóór alle PCR-tests verdund in water van PCR-kwaliteit (1:10).
Digitale druppel-PCR (ddPCR) werd uitgevoerd met behulp van het BioRad QX200-protocol (Mississauga, Ontario, Canada). Gebruik het temperatuurprofiel om de optimale temperatuur te bepalen (tabel S1). Druppels werden gegenereerd met een QX200-druppelgenerator (BioRad). ddPCR werd als volgt uitgevoerd: 95 °C gedurende 5 minuten, 50 cycli van 95 °C gedurende 30 seconden en een gegeven annealing-temperatuur gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 30 seconden, 4 °C gedurende 5 minuten en 90 °C binnen 5 minuten. Het aantal druppels en positieve reacties (aantal kopieën/µl) werden gemeten met een QX200-druppellezer (BioRad). Monsters met minder dan 10.000 druppels werden afgekeurd. Er werd niet bij elke ddPCR-run een patrooncontrole uitgevoerd.
qPCR werd uitgevoerd met Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australië) en specifieke LGALS7-primers. Alle kwantitatieve PCR's werden uitgevoerd in 20 µl met behulp van de QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR werd gestart met een incubatie van 15 minuten bij 95 °C, gevolgd door 40 cycli bij 95 °C gedurende 10 seconden en bij 60 °C gedurende 60 seconden met één dataverzameling. Smeltcurven werden gegenereerd met behulp van opeenvolgende metingen bij 95 °C gedurende 5 seconden, 65 °C gedurende 60 seconden en 97 °C aan het einde van de qPCR. Elke qPCR werd in drievoud uitgevoerd, met uitzondering van de controlemonsters.
Omdat mosselen bekend staan ​​om hun hoge filtratiesnelheid, onderzochten we eerst of ze DNA-fragmenten in zeewater konden filteren en vasthouden. We waren ook geïnteresseerd in de vraag of deze fragmenten zich ophopen in hun semi-open lymfestelsel. We losten dit probleem experimenteel op door het lot te traceren van oplosbare DNA-fragmenten die aan blauwe mosseltanks werden toegevoegd. Om het traceren van DNA-fragmenten te vergemakkelijken, gebruikten we vreemd (niet eigen) plasmide-DNA dat het menselijke galectine-7-gen bevat. ddPCR traceert plasmide-DNA-fragmenten in zeewater en mosselen. Onze resultaten tonen aan dat als de hoeveelheid DNA-fragmenten in zeewater relatief constant bleef in de tijd (tot 7 dagen) in afwezigheid van mosselen, dit niveau in aanwezigheid van mosselen binnen 8 uur bijna volledig verdween (Fig. 1a,b). Fragmenten van exogeen DNA werden binnen 15 minuten gemakkelijk gedetecteerd in intravalvulaire vloeistof en hemolymfe (Fig. 1c). Deze fragmenten konden tot 4 uur na blootstelling nog steeds worden gedetecteerd. Deze filteractiviteit met betrekking tot DNA-fragmenten is vergelijkbaar met de filteractiviteit van bacteriën en algen [31]. Deze resultaten suggereren dat mosselen vreemd DNA in hun vloeistofcompartimenten kunnen filteren en accumuleren.
Relatieve concentraties van plasmide-DNA in zeewater in aanwezigheid (A) of afwezigheid (B) van mosselen, gemeten met ddPCR. In A worden de resultaten weergegeven als percentages, waarbij de randen van de vakjes het 75e en 25e percentiel vertegenwoordigen. De aangepaste logaritmische curve is rood weergegeven en het grijs gearceerde gebied geeft het 95%-betrouwbaarheidsinterval weer. In B geeft de rode lijn het gemiddelde weer en de blauwe lijn het 95%-betrouwbaarheidsinterval voor de concentratie. C Accumulatie van plasmide-DNA in de hemolymfe en klepvloeistof van mosselen op verschillende tijdstippen na de toevoeging van plasmide-DNA. De resultaten worden weergegeven als absolute kopieën gedetecteerd/ml (±SE).
Vervolgens onderzochten we de oorsprong van ccfDNA in mosselen verzameld uit mosselbanken op de Kerguelen-eilanden, een afgelegen eilandengroep met beperkte antropogene invloed. Voor dit doel werd cccDNA uit mosselhemolymfen geïsoleerd en gezuiverd met methoden die gewoonlijk worden gebruikt om menselijk cccDNA te zuiveren [32, 33]. We ontdekten dat de gemiddelde concentraties ccfDNA in hemolymfe in mosselen in het lage bereik van microgram per ml hemolymfe liggen (zie Tabel S2, Aanvullende Informatie). Dit concentratiebereik is veel groter dan bij gezonde mensen (lage nanogram per milliliter), maar in zeldzame gevallen, bij kankerpatiënten, kan het ccfDNA-niveau enkele microgrammen per milliliter bereiken [34, 35]. Een analyse van de grootteverdeling van hemolymfe-ccfDNA toonde aan dat deze fragmenten sterk in grootte variëren, variërend van 1000 bp tot 1000 bp en zelfs 5000 bp (Fig. 2). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van de op silica gebaseerde QIAamp Investigator Kit, een methode die vaak wordt gebruikt in de forensische wetenschap om snel genomisch DNA te isoleren en te zuiveren uit DNA-monsters met een lage concentratie, waaronder ccfDNA [36].
Representatief ccfDNA-elektroforegram van de hemolymfe van mosselen. Geëxtraheerd met de NucleoSnap Plasma Kit (boven) en de QIAamp DNA Investigator Kit. B Viooldiagram dat de verdeling van de ccfDNA-concentraties (±SE) in hemolymfe in mosselen weergeeft. De zwarte en rode lijnen geven respectievelijk de mediaan en het eerste en derde kwartiel weer.
Ongeveer 1% van het ccfDNA bij mensen en primaten heeft een vreemde bron [21, 37]. Gezien de semi-open bloedsomloop van tweekleppigen, het microbiële rijke zeewater en de grootteverdeling van mossel-ccfDNA, veronderstelden we dat het hemolymfe-ccfDNA van mosselen een rijke en diverse pool aan microbieel DNA zou kunnen bevatten. Om deze hypothese te testen, hebben we hemolymfe-ccfDNA gesequenced uit monsters van Aulacomya atra, verzameld op de Kerguelen-eilanden. Dit leverde meer dan 10 miljoen reads op, waarvan 97,6% de kwaliteitscontrole doorstond. De reads werden vervolgens geclassificeerd volgens eigen en niet-eigen bronnen met behulp van de BLASTN- en NCBI-databases voor tweekleppigen (Fig. S1, Aanvullende Informatie).
Bij mensen kan zowel nucleair als mitochondriaal DNA in de bloedbaan terechtkomen [38]. In de huidige studie was het echter niet mogelijk om het nucleaire genomische DNA van mosselen gedetailleerd te beschrijven, aangezien het A. atra-genoom niet is gesequenced of beschreven. We waren echter wel in staat om een ​​aantal ccfDNA-fragmenten van onze eigen oorsprong te identificeren met behulp van de bivalvebibliotheek (Fig. S2, Aanvullende informatie). We hebben ook de aanwezigheid van DNA-fragmenten van onze eigen oorsprong bevestigd door middel van gerichte PCR-amplificatie van de A. atra-genen die werden gesequenced (Fig. 3). Evenzo, aangezien het mitochondriale genoom van A. atra beschikbaar is in openbare databases, kan men bewijs vinden voor de aanwezigheid van mitochondriale ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe van A. atra. De aanwezigheid van mitochondriale DNA-fragmenten werd bevestigd door middel van PCR-amplificatie (Fig. 3).
Verschillende mitochondriale genen waren aanwezig in de hemolymfe van A. atra (rode stippen – voorraadnummer: SRX5705969) en M. platensis (blauwe stippen – voorraadnummer: SRX5705968), geamplificeerd met PCR. Figuur aangepast van Breton et al., 2011 B Amplificatie van hemolymfesupernatant van A. atra. Bewaren op FTA-papier. Gebruik een pons van 3 mm om direct toe te voegen aan de PCR-buis met de PCR-mix.
Gezien de overvloedige microbiële inhoud in zeewater, hebben we ons aanvankelijk gericht op de karakterisering van microbiële DNA-sequenties in hemolymfe. Om dit te doen, gebruiken we twee verschillende strategieën. De eerste strategie gebruikte Kraken2, een op algoritmen gebaseerd sequentieclassificatieprogramma dat microbiële sequenties kan identificeren met een nauwkeurigheid vergelijkbaar met BLAST en andere tools [28]. Meer dan 6719 reads werden bepaald als van bacteriële oorsprong, terwijl 124 en 64 respectievelijk afkomstig waren van archaea en virussen (Fig. 4). De meest voorkomende bacteriële DNA-fragmenten waren Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Deze verdeling komt overeen met eerdere studies van het mariene blauwe mosselmicrobioom [39, 40]. Gammaproteobacteria vormden de belangrijkste klasse van Proteobacteria (44%), waaronder veel Vibrionales (Fig. 4b). De ddPCR-methode bevestigde de aanwezigheid van Vibrio-DNA-fragmenten in het ccfDNA van A. atra hemolymfe (Fig. 4c) [41]. Om meer informatie te verkrijgen over de bacteriële oorsprong van het ccfDNA werd een aanvullende aanpak gebruikt (Fig. S2, Aanvullende Informatie). In dit geval werden de overlappende reads samengevoegd als paired-end reads en geclassificeerd als van eigen (tweekleppigen) of niet-eigen oorsprong met behulp van BLASTN en een e-waarde van 1e−3 en een cutoff met >90% homologie. In dit geval werden de overlappende reads samengevoegd als paired-end reads en geclassificeerd als van eigen (tweekleppigen) of niet-eigen oorsprong met behulp van BLASTN en een e-waarde van 1e−3 en een cutoff met >90% homologie. U kunt uw geld verdienen met het kopen van een creditcard en een creditcard классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) of чужие по происхождению с использованием BLASTN en значения e 1e-3 en отсечения с гомологией> 90%. In dit geval werden overlappende reads verzameld als paired-ended reads en geclassificeerd als native (tweekleppig) of niet-origineel met behulp van BLASTN en een e-waarde van 1e-3 en een cutoff met >90% homologie.90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 (双 壳类) 非 自身。。。。。。。。。 Als u een kredietverzekering wilt afsluiten met een kredietkaart en классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) of несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 en порога гомологии> 90%. In dit geval werden overlappende reads verzameld als paired-ended reads en geclassificeerd als eigen (tweekleppigen) of niet-origineel met behulp van e BLASTN- en 1e-3-waarden en een homologiedrempel van > 90%.Omdat het genoom van A. atra nog niet is gesequenced, hebben we de de novo-assemblagestrategie van de MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assembler gebruikt. In totaal zijn 147.188 contigs geïdentificeerd als afhankelijk (tweekleppig) van oorsprong. Deze contigs werden vervolgens geëxplodeerd met e-waarden van 1e-10 met behulp van BLASTN en BLASTX. Deze strategie stelde ons in staat om 482 niet-tweekleppige fragmenten te identificeren die aanwezig zijn in het ccfDNA van A. atra. Meer dan de helft (57%) van deze DNA-fragmenten werd verkregen uit bacteriën, voornamelijk uit kieuwsymbionten, waaronder sulfotrofe symbionten, en uit kieuwsymbionten zoals Solemya velum (Fig. 5).
Relatieve abundantie op typeniveau. B Microbiële diversiteit van twee hoofdstammen (Firmicutes en Proteobacteria). Representatieve amplificatie van ddPCR. C Vibrio spp. A. Fragmenten van het 16S rRNA-gen (blauw) in drie atrahemolymfen.
In totaal werden 482 verzamelde contigs geanalyseerd. Algemeen profiel van de taxonomische distributie van metagenomische contigannotaties (prokaryoten en eukaryoten). B Gedetailleerde distributie van bacteriële DNA-fragmenten geïdentificeerd door BLASTN en BLASTX.
Uit Kraken2-analyse bleek ook dat mossel-ccfDNA archeale DNA-fragmenten bevatte, waaronder DNA-fragmenten van Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (fig. 6a). De aanwezigheid van DNA-fragmenten afkomstig van Euryarchaeota en Crenarchaeota, die eerder werden aangetroffen in de microbiële gemeenschap van Californische mosselen, zou geen verrassing moeten zijn [42]. Hoewel Euryarchaeota vaak wordt geassocieerd met extreme omstandigheden, wordt nu erkend dat zowel Euryarchaeota als Crenarcheota tot de meest voorkomende prokaryoten in de cryogene mariene omgeving behoren [43, 44]. De aanwezigheid van methaanvormende micro-organismen in mosselen is niet verrassend, gezien recente rapporten over uitgebreide methaanlekken uit bodemlekken op het Kerguelen-plateau [45] en mogelijke microbiële methaanproductie die is waargenomen voor de kust van de Kerguelen-eilanden [46].
Onze aandacht verschoof vervolgens naar metingen van DNA-virussen. Voor zover wij weten is dit de eerste off-target studie naar de virusinhoud van mosselen. Zoals verwacht vonden we DNA-fragmenten van bacteriofagen (Caudovirales) (Fig. 6b). Het meest voorkomende virale DNA is echter afkomstig van een phylum van nucleocytovirussen, ook bekend als het nucleaire cytoplasmatische grote DNA-virus (NCLDV), dat het grootste genoom van alle virussen heeft. Binnen dit phylum behoren de meeste DNA-sequenties tot de families Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), waarvan de natuurlijke gastheren gewervelde dieren en geleedpotigen zijn, terwijl een klein deel van deze DNA-sequenties toebehoort aan bekende virologische algen. Infecteert mariene eukaryotische algen. De sequenties werden ook verkregen van het Pandora-virus, het reuzenvirus met de grootste genoomomvang van alle bekende virale geslachten. Interessant genoeg was het bereik van gastheren waarvan bekend is dat ze met het virus geïnfecteerd zijn, zoals bepaald door hemolymfe-ccfDNA-sequencing, relatief groot (Figuur S3, Aanvullende informatie). Het omvat virussen die insecten infecteren zoals Baculoviridae en Iridoviridae, evenals virussen die amoeben, algen en gewervelde dieren infecteren. We vonden ook sequenties die overeenkwamen met het genoom van Pithovirus sibericum. Pitovirussen (ook bekend als "zombievirussen") werden voor het eerst geïsoleerd uit 30.000 jaar oude permafrost in Siberië [47]. Onze resultaten komen dus overeen met eerdere rapporten die aantonen dat niet alle moderne soorten van deze virussen zijn uitgestorven [48] en dat deze virussen mogelijk aanwezig zijn in afgelegen subarctische mariene ecosystemen.
Ten slotte hebben we getest of we DNA-fragmenten van andere meercellige dieren konden vinden. In totaal werden 482 vreemde contigs geïdentificeerd door BLASTN en BLASTX met nt-, nr- en RefSeq-bibliotheken (genomisch en eiwit). Onze resultaten laten zien dat onder de vreemde fragmenten van ccfDNA van meercellige dieren het DNA van benige botten overheerst (Fig. 5). Er zijn ook DNA-fragmenten van insecten en andere soorten gevonden. Een relatief groot deel van de DNA-fragmenten is niet geïdentificeerd, mogelijk vanwege de ondervertegenwoordiging van een groot aantal mariene soorten in genomische databases in vergelijking met terrestrische soorten [49].
In dit artikel passen we het LB-concept toe op mosselen en stellen we dat sequentiebepaling van hemolymfe-ccfDNA-shots inzicht kan bieden in de samenstelling van mariene kustecosystemen. In het bijzonder ontdekten we dat 1) de hemolymfe van mosselen relatief hoge concentraties (microgramniveaus) van relatief grote (~1-5 kb) circulerende DNA-fragmenten bevat; 2) deze DNA-fragmenten zowel onafhankelijk als niet-onafhankelijk zijn; 3) Onder de vreemde bronnen van deze DNA-fragmenten vonden we bacterieel, archaeaal en viraal DNA, evenals DNA van andere meercellige dieren; 4) de accumulatie van deze vreemde ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe snel verloopt en bijdraagt ​​aan de interne filteractiviteit van mosselen. Concluderend toont onze studie aan dat het LB-concept, dat tot nu toe voornamelijk in de biomedische wetenschap is toegepast, een rijke maar onontgonnen bron van kennis bevat die kan worden gebruikt om de interactie tussen schildwachtsoorten en hun omgeving beter te begrijpen.
Naast primaten is isolatie van ccfDNA gerapporteerd bij zoogdieren, waaronder muizen, honden, katten en paarden [50, 51, 52]. Voor zover wij weten is onze studie echter de eerste die de detectie en sequentiebepaling van ccfDNA rapporteert in mariene soorten met een open circulatiesysteem. Deze anatomische eigenschap en het filtervermogen van mosselen kunnen, ten minste gedeeltelijk, de verschillende groottekarakteristieken van circulerende DNA-fragmenten verklaren in vergelijking met andere soorten. Bij mensen zijn de meeste DNA-fragmenten die in het bloed circuleren kleine fragmenten met een grootte variërend van 150 tot 200 bp, met een maximale piek van 167 bp [34, 53]. Een klein maar significant deel van de DNA-fragmenten is tussen de 300 en 500 bp groot en ongeveer 5% is langer dan 900 bp. [54]. De reden voor deze grootteverdeling is dat de belangrijkste bron van ccfDNA in plasma optreedt als gevolg van celdood, hetzij door celdood, hetzij door necrose van circulerende hematopoëtische cellen bij gezonde individuen, of door apoptose van tumorcellen bij kankerpatiënten (bekend als circulerend tumor-DNA). , ctDNA). De grootteverdeling van hemolymfe-ccfDNA dat we in mosselen vonden, varieerde van 1000 tot 5000 bp, wat suggereert dat mossel-ccfDNA een andere oorsprong heeft. Dit is een logische hypothese, aangezien mosselen een halfopen vaatstelsel hebben en leven in mariene aquatische omgevingen met hoge concentraties microbieel genomisch DNA. Onze laboratoriumexperimenten met exogeen DNA hebben namelijk aangetoond dat mosselen DNA-fragmenten in zeewater accumuleren; ten minste na een paar uur worden ze afgebroken na cellulaire opname en/of vrijgegeven en/of opgeslagen in verschillende organisaties. Gezien de zeldzaamheid van cellen (zowel prokaryotisch als eukaryotisch) zal het gebruik van intravalvulaire compartimenten de hoeveelheid ccfDNA uit zowel eigen als vreemde bronnen verminderen. Gezien het belang van de aangeboren immuniteit van tweekleppigen en het grote aantal circulerende fagocyten, veronderstelden we verder dat zelfs vreemd ccfDNA verrijkt is in circulerende fagocyten die vreemd DNA accumuleren na opname van micro-organismen en/of celresten. Al met al tonen onze resultaten aan dat het hemolymfe-ccfDNA van tweekleppigen een unieke opslagplaats van moleculaire informatie is en hun status als schildwachtsoort versterkt.
Onze gegevens geven aan dat sequentiebepaling en analyse van ccfDNA-fragmenten uit bacteriële hemolymfe belangrijke informatie kunnen verschaffen over de bacteriële flora van de gastheer en de bacteriën die aanwezig zijn in het omringende mariene ecosysteem. Met behulp van shot-sequencingtechnieken zijn sequenties van de commensale bacterie A. atra aan het licht gekomen die gemist zouden zijn bij conventionele 16S rRNA-identificatiemethoden, deels als gevolg van een vertekening door de referentiebibliotheek. Ons gebruik van LB-gegevens, verzameld van M. platensis in dezelfde mossellaag in Kerguelen, toonde aan dat de samenstelling van kieuwgeassocieerde bacteriële symbionten voor beide mosselsoorten hetzelfde was (Fig. S4, Aanvullende informatie). Deze gelijkenis tussen twee genetisch verschillende mosselen kan een weerspiegeling zijn van de samenstelling van bacteriële gemeenschappen in de koude, zwavelhoudende en vulkanische afzettingen van Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Hogere niveaus van zwavelreducerende micro-organismen zijn goed beschreven bij de oogst van mosselen in bioturbeerde kustgebieden [59], zoals de kust van Port-au-France. Een andere mogelijkheid is dat de commensale mosselflora wordt beïnvloed door horizontale transmissie [60, 61]. Meer onderzoek is nodig om de correlatie tussen het mariene milieu, het zeebodemoppervlak en de samenstelling van symbiotische bacteriën in mosselen te bepalen. Deze studies zijn momenteel gaande.
De lengte en concentratie van hemolymfe-ccfDNA, de eenvoudige zuivering en de hoge kwaliteit die snelle shotgun-sequencing mogelijk maakt, zijn enkele van de vele voordelen van het gebruik van mossel-ccfDNA om de biodiversiteit in mariene kustecosystemen te beoordelen. Deze aanpak is vooral effectief voor het karakteriseren van virale gemeenschappen (viromen) in een bepaald ecosysteem [62, 63]. In tegenstelling tot bacteriën, archaea en eukaryoten bevatten virale genomen geen fylogenetisch geconserveerde genen zoals 16S-sequenties. Onze resultaten geven aan dat vloeibare biopten van indicatorsoorten zoals mosselen gebruikt kunnen worden om relatief grote aantallen ccfDNA-virusfragmenten te identificeren waarvan bekend is dat ze gastheren infecteren die doorgaans in mariene kustecosystemen voorkomen. Dit omvat virussen waarvan bekend is dat ze protozoa, geleedpotigen, insecten, planten en bacteriële virussen (bijv. bacteriofagen) infecteren. Een vergelijkbare verdeling werd gevonden toen we het hemolymfe-ccfDNA-viroom van blauwe mosselen (M. platensis) onderzochten, verzameld in dezelfde mossellaag in Kerguelen (Tabel S2, Aanvullende informatie). Shotgun-sequencing van ccfDNA is inderdaad een nieuwe aanpak die aan populariteit wint in de studie van het viroom van mensen of andere soorten [21, 37, 64]. Deze aanpak is met name nuttig voor het bestuderen van dubbelstrengs-DNA-virussen, aangezien geen enkel gen bewaard is gebleven onder alle dubbelstrengs-DNA-virussen, die de meest diverse en brede klasse van virussen in Baltimore vertegenwoordigen [65]. Hoewel de meeste van deze virussen ongeclassificeerd blijven en mogelijk virussen uit een volledig onbekend deel van de virale wereld omvatten [66], ontdekten we dat de viromen en gastheerbereiken van de mosselen A. atra en M. platensis op vergelijkbare wijze tussen de twee soorten in vallen (zie figuur S3, aanvullende informatie). Deze gelijkenis is niet verrassend, aangezien het kan wijzen op een gebrek aan selectiviteit bij de opname van DNA dat in de omgeving aanwezig is. Er zijn verdere studies nodig met gezuiverd RNA om het RNA-viroom te karakteriseren.
In onze studie gebruikten we een zeer rigoureuze pijplijn die was aangepast van het werk van Kowarski en collega's [37], die een tweestaps deletie van gepoolde reads en contigs gebruikten vóór en na de assemblage van native ccfDNA, wat resulteerde in een hoog percentage niet-gemapte reads. Daarom kunnen we niet uitsluiten dat sommige van deze niet-gemapte reads nog steeds hun eigen oorsprong hebben, voornamelijk omdat we geen referentiegenoom hebben voor deze mosselsoort. We gebruikten deze pijplijn ook omdat we ons zorgen maakten over de chimaera's tussen zelf- en niet-zelf-reads en de readlengtes die werden gegenereerd door de Illumina MiSeq PE75. Een andere reden voor de meerderheid van de niet-gemapte readings is dat veel van de mariene microben, vooral in afgelegen gebieden zoals Kerguelen, niet zijn geannoteerd. We gebruikten Illumina MiSeq PE75, ervan uitgaande dat de fragmentlengtes van ccfDNA vergelijkbaar zijn met die van menselijk ccfDNA. Voor toekomstig onderzoek, gezien onze resultaten die aantonen dat hemolymfe-ccfDNA langere reads heeft dan mensen en/of zoogdieren, raden we aan een sequencingplatform te gebruiken dat geschikter is voor langere ccfDNA-fragmenten. Deze aanpak zal het veel gemakkelijker maken om meer indicaties voor diepgaandere analyse te identificeren. Het verkrijgen van de momenteel niet beschikbare volledige nucleaire genoomsequentie van A. atra zou ook het onderscheiden van ccfDNA uit eigen en niet-eigen bronnen aanzienlijk vergemakkelijken. Aangezien ons onderzoek zich heeft gericht op de mogelijkheid om het concept van vloeibare biopsie toe te passen op mosselen, hopen we dat, naarmate dit concept in toekomstig onderzoek wordt gebruikt, nieuwe tools en pipelines zullen worden ontwikkeld om de mogelijkheden van deze methode voor het bestuderen van de microbiële diversiteit van mosselen te vergroten.
Als niet-invasieve klinische biomarker worden verhoogde plasmaconcentraties van ccfDNA in het menselijk lichaam geassocieerd met diverse ziekten, weefselschade en stressomstandigheden [67,68,69]. Deze toename wordt geassocieerd met het vrijkomen van DNA-fragmenten van eigen oorsprong na weefselschade. We hebben dit probleem aangepakt met behulp van acute hittestress, waarbij mosselen kortstondig werden blootgesteld aan een temperatuur van 30 °C. We hebben deze analyse uitgevoerd op drie verschillende soorten mosselen in drie onafhankelijke experimenten. We vonden echter geen verandering in de ccfDNA-niveaus na acute hittestress (zie Figuur S5, aanvullende informatie). Deze ontdekking kan, ten minste gedeeltelijk, verklaren waarom mosselen een halfopen bloedsomloop hebben en grote hoeveelheden vreemd DNA accumuleren vanwege hun hoge filteractiviteit. Aan de andere kant zijn mosselen, net als veel ongewervelden, mogelijk beter bestand tegen stressgeïnduceerde weefselschade, waardoor de vrijlating van ccfDNA in hun hemolymfe wordt beperkt [70, 71].
Tot op heden heeft de DNA-analyse van biodiversiteit in aquatische ecosystemen zich voornamelijk gericht op metabarcoding van omgevings-DNA (eDNA). Deze methode is echter meestal beperkt in biodiversiteitsanalyse wanneer primers worden gebruikt. Het gebruik van shotgun-sequencing omzeilt de beperkingen van PCR en de bevooroordeelde selectie van primersets. In zekere zin komt onze methode dus dichter in de buurt van de recent gebruikte high-throughput eDNA shotgun-sequencingmethode, die in staat is om gefragmenteerd DNA direct te sequencen en bijna alle organismen te analyseren [72, 73]. Er zijn echter een aantal fundamentele kwesties die LB onderscheiden van standaard eDNA-methoden. Het belangrijkste verschil tussen eDNA en LB is natuurlijk het gebruik van natuurlijke filtergastheren. Het gebruik van mariene soorten zoals sponzen en tweekleppigen (Dresseina spp.) als een natuurlijk filter voor het bestuderen van eDNA is gerapporteerd [74, 75]. Dreissena's studie maakte echter gebruik van weefselbiopsieën waaruit DNA werd geëxtraheerd. Analyse van ccfDNA uit LB vereist geen weefselbiopsie, gespecialiseerde en soms dure apparatuur en logistiek die gepaard gaan met eDNA of weefselbiopsie. We hebben onlangs zelfs gemeld dat ccfDNA uit LB kan worden opgeslagen en geanalyseerd met FTA-ondersteuning zonder dat er een koelketen nodig is, wat een grote uitdaging is voor onderzoek in afgelegen gebieden [76]. De extractie van ccfDNA uit vloeibare biopten is ook eenvoudig en levert DNA van hoge kwaliteit op voor shotgun-sequencing en PCR-analyse. Dit is een groot voordeel gezien enkele technische beperkingen die gepaard gaan met eDNA-analyse [77]. De eenvoud en lage kosten van de bemonsteringsmethode maken het ook bijzonder geschikt voor langetermijnmonitoringprogramma's. Naast hun hoge filtervermogen is een andere bekende eigenschap van tweekleppigen de chemische mucopolysaccharidesamenstelling van hun slijm, die de absorptie van virussen bevordert [78, 79]. Dit maakt tweekleppigen een ideaal natuurlijk filter voor het karakteriseren van biodiversiteit en de impact van klimaatverandering op een bepaald aquatisch ecosysteem. Hoewel de aanwezigheid van van de gastheer afkomstige DNA-fragmenten gezien kan worden als een beperking van de methode ten opzichte van eDNA, zijn de kosten die gepaard gaan met het hebben van zo'n natuurlijk ccfDNA in vergelijking met eDNA tegelijkertijd begrijpelijk gezien de enorme hoeveelheid informatie die beschikbaar is voor gezondheidsstudies. offset host. Dit omvat de aanwezigheid van virale sequenties die geïntegreerd zijn in het genoom van de gastheer. Dit is vooral belangrijk voor mosselen, gezien de aanwezigheid van horizontaal overgedragen leukemische retrovirussen in tweekleppigen [80, 81]. Een ander voordeel van LB ten opzichte van eDNA is dat het gebruikmaakt van de fagocyterende activiteit van circulerende bloedcellen in de hemolymfe, die micro-organismen (en hun genomen) opslokt. Fagocytose is de belangrijkste functie van bloedcellen in tweekleppigen [82]. Ten slotte maakt de methode gebruik van het hoge filtervermogen van mosselen (gemiddeld 1,5 l/u zeewater) en de tweedaagse circulatie, die de menging van verschillende lagen zeewater vergroten, waardoor heteroloog eDNA kan worden opgevangen. [83, 84]. De analyse van mossel-ccfDNA is daarom een ​​interessante mogelijkheid, gezien de nutritionele, economische en milieu-impact van mosselen. Net als de analyse van LB verzameld bij mensen, opent deze methode ook de mogelijkheid om genetische en epigenetische veranderingen in gastheer-DNA te meten als reactie op exogene stoffen. Zo kunnen bijvoorbeeld derde-generatie sequencingtechnologieën worden overwogen om genoombrede methyleringsanalyse uit te voeren in natuurlijk ccfDNA met behulp van nanopore-sequencing. Dit proces zou moeten worden vergemakkelijkt door het feit dat de lengte van de mossel-ccfDNA-fragmenten ideaal compatibel is met long-read sequencing-platforms die genoombrede DNA-methyleringsanalyse mogelijk maken vanuit één enkele sequencingrun zonder de noodzaak van chemische transformaties.85,86] Dit is een interessante mogelijkheid, aangezien is aangetoond dat DNA-methyleringspatronen een reactie op omgevingsstress weerspiegelen en vele generaties lang aanhouden. Daarom kan het waardevolle inzichten bieden in de onderliggende mechanismen die de reactie na blootstelling aan klimaatverandering of vervuilende stoffen bepalen [87]. Nederlands Het gebruik van LB kent echter geen beperkingen. Het spreekt voor zich dat hiervoor de aanwezigheid van indicatorsoorten in het ecosysteem vereist is. Zoals hierboven vermeld, vereist het gebruik van LB om de biodiversiteit van een bepaald ecosysteem te beoordelen ook een rigoureuze bioinformatica-pijplijn die rekening houdt met de aanwezigheid van DNA-fragmenten van de bron. Een ander groot probleem is de beschikbaarheid van referentiegenomen voor mariene soorten. Er wordt gehoopt dat initiatieven zoals het Marine Mammal Genomes Project en het recent opgerichte Fish10k-project [88] dergelijke analyses in de toekomst zullen vergemakkelijken. De toepassing van het LB-concept op mariene filtervoedende organismen is ook compatibel met de nieuwste ontwikkelingen in sequentietechnologie, waardoor het zeer geschikt is voor de ontwikkeling van multi-ohm-biomarkers om belangrijke informatie te verschaffen over de gezondheid van mariene habitats als reactie op milieustress.
Gegevens over genoomsequentie zijn gedeponeerd in het NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 onder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impact van klimaatverandering op het zeeleven en ecosystemen. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Beschouw de gecombineerde effecten van klimaatverandering en andere lokale stressoren op het mariene milieu. Algemene wetenschappelijke omgeving. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Wetenschap van 1 maart. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Verminderde hittetolerantie onder herhaaldelijke hittestress verklaart de hoge zomersterfte van blauwe mosselen. Wetenschappelijk rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Recente veranderingen in de frequentie, oorzaken en omvang van dierensterfte. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Meerdere niet-soortspecifieke pathogenen hebben mogelijk de massale sterfte van Pinna nobilis veroorzaakt. Leven. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Mogelijke impact van klimaatverandering op zoönotische ziekten in het Arctisch gebied. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blauwe mosselen (Mytilus edulis spp.) als signaalorganismen in de monitoring van kustvervuiling: een review. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integratie van vloeibare biopsie in kankerbehandeling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Vloeibare biopsierijping: laat tumor-DNA circuleren. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleïnezuren in menselijk plasma. Notulen van vergaderingen van dochterondernemingen van Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Een nieuwe rol voor celvrij DNA als moleculaire marker voor kankerbehandeling. Kwantificering van biomolaire analyse. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vloeibare biopsie doet zijn intrede in de kliniek – implementatieproblemen en toekomstige uitdagingen. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en anderen. Foetaal DNA is aanwezig in maternaal plasma en serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Onderzoek naar het verloop van de zwangerschap en de complicaties ervan met behulp van circulerend extracellulair RNA in het bloed van vrouwen tijdens de zwangerschap. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Vloeibare biopsie: donorcelvrij DNA wordt gebruikt om allogene laesies in een niertransplantaat op te sporen. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaties in prenatale diagnostiek: sequentiebepaling van het maternale plasmagenoom. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Snelle detectie van pathogenen met next-generation metagenomische sequentiebepaling van geïnfecteerde lichaamsvloeistoffen. Nat Medicine. 2021;27:115-24.