Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Vloeibare biopsie (LB) is een concept dat snel aan populariteit wint in de biomedische wereld. Het concept is voornamelijk gebaseerd op de detectie van fragmenten van circulerend extracellulair DNA (ccfDNA), die voornamelijk als kleine fragmenten vrijkomen na celdood in verschillende weefsels. Een klein deel van deze fragmenten is afkomstig van vreemd weefsel of organismen. In dit onderzoek hebben we dit concept toegepast op mosselen, een indicatorsoort die bekend staat om zijn hoge filtercapaciteit voor zeewater. We gebruiken het vermogen van mosselen om als natuurlijke filters te fungeren om omgevings-DNA-fragmenten uit verschillende bronnen op te vangen en zo informatie te verkrijgen over de biodiversiteit van mariene kustecosystemen. Onze resultaten tonen aan dat de hemolymfe van mosselen DNA-fragmenten bevat die sterk variëren in grootte, van 1 tot 5 kb. Shotgun-sequencing toonde aan dat een groot aantal DNA-fragmenten van vreemde, microbiële oorsprong is. Onder deze fragmenten vonden we DNA-fragmenten van bacteriën, archaea en virussen, waaronder virussen die bekend staan ​​om het infecteren van diverse gastheren die veel voorkomen in mariene kustecosystemen. Kortom, ons onderzoek toont aan dat het concept van LB, toegepast op mosselen, een rijke maar nog onontdekte bron van kennis vormt over microbiële diversiteit in mariene kustecosystemen.
De impact van klimaatverandering (KV) op de biodiversiteit van mariene ecosystemen is een snelgroeiend onderzoeksgebied. De opwarming van de aarde veroorzaakt niet alleen belangrijke fysiologische stress, maar verlegt ook de evolutionaire grenzen van de thermische stabiliteit van mariene organismen, waardoor het leefgebied van een aantal soorten wordt aangetast en ze op zoek gaan naar gunstigere omstandigheden [1, 2]. Naast de gevolgen voor de biodiversiteit van meercellige organismen, verstoort KV het delicate evenwicht van interacties tussen gastheer en microben. Deze microbiële dysbacteriose vormt een ernstige bedreiging voor mariene ecosystemen, omdat het mariene organismen vatbaarder maakt voor infectieuze pathogenen [3, 4]. Men vermoedt dat klimaatverandering een belangrijke rol speelt bij massale sterfte, wat een ernstig probleem is voor het beheer van mondiale mariene ecosystemen [5, 6]. Dit is een belangrijk probleem gezien de economische, ecologische en nutritionele gevolgen voor veel mariene soorten. Dit geldt met name voor tweekleppigen die in de poolgebieden leven, waar de effecten van klimaatverandering directer en ernstiger zijn [6, 7]. Tweekleppigen zoals Mytilus spp. worden veelvuldig gebruikt om de effecten van CC op mariene ecosystemen te monitoren. Het is dan ook niet verwonderlijk dat er relatief veel biomarkers zijn ontwikkeld om hun gezondheid te monitoren, vaak met behulp van een tweeledige aanpak waarbij functionele biomarkers worden gebruikt die gebaseerd zijn op enzymatische activiteit of cellulaire functies zoals cellevensvatbaarheid en fagocytische activiteit [8]. Deze methoden omvatten ook de meting van de concentratie van specifieke drukindicatoren die zich ophopen in zachte weefsels na de absorptie van grote hoeveelheden zeewater. De hoge filtratiecapaciteit en het semi-open circulatiesysteem van tweekleppigen bieden echter de mogelijkheid om nieuwe hemolymfebiomarkers te ontwikkelen met behulp van het concept van vloeibare biopsie (LB), een eenvoudige en minimaal invasieve benadering voor patiëntenzorg. bloedmonsters [9, 10]. Hoewel verschillende soorten circulerende moleculen in menselijke LB kunnen worden gevonden, is dit concept primair gebaseerd op DNA-sequentieanalyse van circulerende extracellulaire DNA (ccfDNA)-fragmenten in plasma. De aanwezigheid van circulerend DNA in menselijk plasma is al sinds het midden van de 20e eeuw bekend [11], maar pas de laatste jaren heeft de komst van high-throughput sequencing-methoden geleid tot klinische diagnoses gebaseerd op ccfDNA. De aanwezigheid van deze circulerende DNA-fragmenten is deels te danken aan de passieve vrijgave van genomisch DNA (nucleair en mitochondriaal) na celdood. Bij gezonde personen is de concentratie van ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/mL), maar deze kan 5 tot 10 keer zo hoog zijn bij patiënten met diverse aandoeningen of die aan stress worden blootgesteld, wat kan leiden tot weefselschade. Bij gezonde personen is de concentratie van ccfDNA normaal gesproken laag (<10 ng/mL), maar deze kan 5 tot 10 keer zo hoog zijn bij patiënten met diverse aandoeningen of die aan stress worden blootgesteld, wat kan leiden tot weefselschade. U kunt de waarde van uw product in een lagere temperatuur (<10 нг/мл), ножет повышаться in 5–10 раз у больных с различной патологией или Zorg ervoor dat u de juiste keuze maakt. Bij gezonde mensen is de concentratie van cccDNA normaal gesproken laag (<10 ng/mL), maar deze kan 5 tot 10 keer zo hoog worden bij patiënten met diverse aandoeningen of onder stress die leidt tot weefselschade.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml,，但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍,从而导致组织损伤。健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤ccfDNA-gegevens (<10 нг/мл) zijn mogelijk, ногут быть увеличены in 5-10 jaar geleden Als u dit doet, moet u dit doen. De concentraties van ccfDNA zijn bij gezonde personen doorgaans laag (<10 ng/ml), maar kunnen bij patiënten met diverse aandoeningen of stress 5 tot 10 keer zo hoog zijn, wat kan leiden tot weefselschade.De grootte van ccfDNA-fragmenten varieert sterk, maar ligt meestal tussen de 150 en 200 bp [12]. Analyse van zelf-afgeleid ccfDNA, dat wil zeggen ccfDNA van normale of getransformeerde gastheercellen, kan worden gebruikt om genetische en epigenetische veranderingen in het nucleaire en/of mitochondriale genoom op te sporen, waardoor clinici specifieke moleculair gerichte therapieën kunnen selecteren [13]. ccfDNA kan echter ook afkomstig zijn van vreemde bronnen, zoals ccfDNA van foetale cellen tijdens de zwangerschap of van getransplanteerde organen [14,15,16,17]. ccfDNA is ook een belangrijke informatiebron voor het detecteren van de aanwezigheid van nucleïnezuren van een infectieus agens (vreemd), waardoor niet-invasieve detectie van wijdverspreide infecties mogelijk is die niet door bloedkweken worden geïdentificeerd, waardoor invasieve biopsie van geïnfecteerd weefsel wordt vermeden [18]. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat menselijk bloed een rijke bron van informatie bevat die gebruikt kan worden om virale en bacteriële pathogenen te identificeren, en dat ongeveer 1% van het ccfDNA dat in menselijk plasma wordt aangetroffen van vreemde oorsprong is [19]. Deze studies tonen aan dat de biodiversiteit van het circulerende microbioom van een organisme kan worden beoordeeld met behulp van ccfDNA-analyse. Tot voor kort werd dit concept echter uitsluitend bij mensen en in mindere mate bij andere gewervelde dieren gebruikt [20, 21].
In dit artikel gebruiken we het LB-potentieel om het ccfDNA van Aulacomya atra te analyseren, een zuidelijke soort die veel voorkomt op de subantarctische Kerguelen-eilanden, een eilandengroep bovenop een groot plateau dat 35 miljoen jaar geleden is ontstaan ​​door een vulkaanuitbarsting. Met behulp van een in vitro experimenteel systeem ontdekten we dat DNA-fragmenten in zeewater snel worden opgenomen door mosselen en in het hemolymfecompartiment terechtkomen. Shotgun-sequencing heeft aangetoond dat het ccfDNA in de hemolymfe van mosselen DNA-fragmenten van eigen en niet-eigen oorsprong bevat, waaronder symbiotische bacteriën en DNA-fragmenten van biomen die kenmerkend zijn voor koude vulkanische mariene kustecosystemen. Het ccfDNA in de hemolymfe bevat ook virale sequenties afkomstig van virussen met verschillende gastheerbereiken. We vonden ook DNA-fragmenten van meercellige dieren zoals beenvissen, zeeanemonen, algen en insecten. Kortom, onze studie toont aan dat het LB-concept met succes kan worden toegepast op mariene ongewervelden om een ​​rijk genomisch repertoire in mariene ecosystemen te genereren.
Volwassen exemplaren (55-70 mm lang) van de soorten Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) werden verzameld aan de rotsachtige kusten van Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E), Kerguelen-eilanden, in december 2018. Andere volwassen blauwe mosselen (Mytilus spp.) werden verkregen van een commerciële leverancier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) en geplaatst in een temperatuurgecontroleerde (4 °C) beluchte tank met 10-20 liter kunstmatig pekelwater van 32‰ (kunstmatig zeezout Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, VS). Voor elk experiment werden de lengte en het gewicht van de individuele schelpen gemeten.
Een gratis open access-protocol voor dit programma is online beschikbaar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kort gezegd werd LB-hemolymfe verzameld uit abductorspieren zoals beschreven [22]. De hemolymfe werd geklaard door centrifugatie bij 1200×g gedurende 3 minuten, waarna het supernatant werd ingevroren (-20°C) tot gebruik. Voor de isolatie en zuivering van cfDNA werden monsters (1,5-2,0 ml) ontdooid en verwerkt met behulp van de NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) volgens de instructies van de fabrikant. ccfDNA werd bewaard bij -80°C tot verdere analyse. In sommige experimenten werd ccfDNA geïsoleerd en gezuiverd met behulp van de QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Gezuiverd DNA werd gekwantificeerd met behulp van een standaard PicoGreen-assay. De fragmentverdeling van het geïsoleerde ccfDNA werd geanalyseerd met behulp van capillaire elektroforese met een Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) en een High Sensitivity DNA Kit. De analyse werd uitgevoerd met 1 µl van het ccfDNA-monster volgens de instructies van de fabrikant.
Voor het sequencen van hemolymfe ccfDNA-fragmenten heeft Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) shotgun-bibliotheken voorbereid met behulp van de Illumina DNA Mix-kit van de Illumina MiSeq PE75-kit. Er werd een standaardadapter (BioO) gebruikt. Ruwe databestanden zijn beschikbaar in het NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809). De basiskwaliteit van de sequenties werd beoordeeld met FastQC [23]. Trimmomatic [24] werd gebruikt voor het verwijderen van adapters en sequenties van slechte kwaliteit. Shotgun-sequenties met gepaarde uiteinden werden met FLASH samengevoegd tot langere, enkele sequenties met een minimale overlap van 20 bp om mismatches te voorkomen [25]. De samengevoegde sequenties werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een NCBI-taxonomiedatabase voor tweekleppigen (e-waarde < 1e−3 en 90% homologie), en het maskeren van sequenties met een lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. De samengevoegde sequenties werden geannoteerd met BLASTN met behulp van een NCBI-taxonomiedatabase voor tweekleppigen (e-waarde < 1e−3 en 90% homologie), en het maskeren van sequenties met een lage complexiteit werd uitgevoerd met behulp van DUST [26]. Maak gebruik van de BLASTN-technologie met behulp van de beste manier om dit te doen таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 en 90% (90%), en een betere kredietwaardigheid van de bevolking использованием STOF [26]. De samengevoegde sequenties werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI-taxonomiedatabase voor tweekleppigen (e-waarde < 1e-3 en 90% homologie), en er werd een maskering van sequenties met lage complexiteit uitgevoerd met behulp van DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用STOF [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 (((<1e-3 和 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 stof [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Maak gebruik van de BLASTN-technologie met behulp van de BLASTN-technologie данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение <1e-3 en 90% percentage), en een goed resultaat kan worden bereikt использованием STOF [26]. De gecombineerde leessequenties werden geannoteerd met BLASTN met behulp van de NCBI-taxonomische database voor tweekleppigen (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en er werd een maskering van sequenties met lage complexiteit uitgevoerd met behulp van DUST [26].De reads werden verdeeld in twee groepen: gerelateerd aan sequenties van tweekleppigen (hier self-reads genoemd) en niet-gerelateerd (non-self-reads). De twee groepen werden afzonderlijk geassembleerd met behulp van MEGAHIT om contigs te genereren [27]. Ondertussen werd de taxonomische verdeling van de reads van het buitenaardse microbioom geclassificeerd met behulp van Kraken2 [28] en grafisch weergegeven door een Krona-cirkeldiagram op Galaxy [29, 30]. Uit onze voorlopige experimenten werd vastgesteld dat kmers-59 de optimale kmers is. De zelf-contigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (bivalve NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. De zelf-contigs werden vervolgens geïdentificeerd door uitlijning met BLASTN (bivalve NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) voor een definitieve annotatie. Het is mogelijk om de kredietwaardigheid van BLASTN (via BLASTN) te vergroten NCBI, значение e <1e-10 en 60%) van de producten. Vervolgens werden zelf-contigs geïdentificeerd door vergelijking met BLASTN (NCBI-database voor tweekleppigen, e-waarde <1e-10 en 60% homologie) voor de uiteindelijke annotatie.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Het is belangrijk dat u een goed beeld krijgt van uw persoonlijke levenssfeer сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 en гомология 60%). Vervolgens werden zelf-contigs geïdentificeerd voor definitieve annotatie door middel van een vergelijking met BLASTN (NCBI-database voor tweekleppigen, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). Parallel daaraan werden de niet-zelf-groepcontigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Parallel daaraan werden de niet-zelf-groepcontigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Het is mogelijk om uw kredietwaardigheid te vergroten met behulp van BLASTN (ook bekend als BLASTN NCBI, значение e <1e-10 en гомология 60%). Parallel daaraan werden de contigs van de vreemde groep geannoteerd met BLASTN (NT NCBI-database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Als u een bedrijf koopt, kunt u dit niet doen met BLASTN (meer dan NCBI, значение e <1e-10 en гомология 60%). Parallel daaraan werden de niet-eigen groep-contigs geannoteerd met BLASTN (nt NCBI-database, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). Er werd ook een BLASTX-analyse uitgevoerd op niet-eigen contigs met behulp van de nr- en RefSeq-eiwitdatabases van NCBI (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Er werd ook een BLASTX-analyse uitgevoerd op niet-eigen contigs met behulp van de nr- en RefSeq-eiwitdatabases van NCBI (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX kan niet worden gebruikt op de juiste manier met het nummer en RefSeq NCBI (значение e <1e-10 en гомология 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-eigen contigs met behulp van de nr- en RefSeq NCBI-eiwitdatabases (e-waarde < 1e-10 en 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX maakt gebruik van een gegevensbestand met een nummer en RefSeq NCBI (значение e <1e-10 en гомология 60%). BLASTX werd ook uitgevoerd op niet-eigen contigs met behulp van de nr- en RefSeq NCBI-eiwitdatabases (e-waarde <1e-10 en 60% homologie).De BLASTN- en BLASTX-pools van niet-zelf-contigs vertegenwoordigen de uiteindelijke contigs (zie aanvullend bestand).
De primers die voor PCR werden gebruikt, staan ​​vermeld in Tabel S1. Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) werd gebruikt om de ccfDNA-doelgenen te amplificeren. De volgende reactieomstandigheden werden gebruikt: denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, 95 °C gedurende 1 minuut, annealingstemperatuur gedurende 1 minuut, elongatie bij 72 °C gedurende 1 minuut, 35 cycli, en ten slotte 72 °C gedurende 10 minuten. De PCR-producten werden gescheiden door elektroforese in agarosegels (1,5%) met SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) bij 95 V.
Mosselen (Mytilus spp.) werden gedurende 24 uur geacclimatiseerd in 500 ml zuurstofrijk zeewater (32 PSU) bij 4°C. Plasmid-DNA met een insert dat codeert voor de humane galectine-7 cDNA-sequentie (NCBI-toegangsnummer L07769) werd aan het flesje toegevoegd in een eindconcentratie van 190 μg/μl. Mosselen die onder dezelfde omstandigheden werden geïncubeerd zonder toevoeging van DNA dienden als controle. De derde controletank bevatte DNA zonder mosselen. Om de kwaliteit van het DNA in zeewater te controleren, werden op de aangegeven tijdstippen zeewatermonsters (20 μl; drie herhalingen) uit elke tank genomen. Voor de traceerbaarheid van het plasmid-DNA werden LB-mosselen op de aangegeven tijdstippen geoogst en geanalyseerd met qPCR en ddPCR. Vanwege het hoge zoutgehalte van zeewater werden aliquots vóór alle PCR-analyses verdund in PCR-kwaliteit water (1:10).
Digitale druppel-PCR (ddPCR) werd uitgevoerd met behulp van het BioRad QX200-protocol (Mississauga, Ontario, Canada). Gebruik het temperatuurprofiel om de optimale temperatuur te bepalen (Tabel S1). Druppels werden gegenereerd met een QX200-druppelgenerator (BioRad). ddPCR werd als volgt uitgevoerd: 95 °C gedurende 5 min, 50 cycli van 95 °C gedurende 30 s en een bepaalde annealingstemperatuur gedurende 1 min en 72 °C gedurende 30 s, 4 °C gedurende 5 min en 90 °C binnen 5 min. Het aantal druppels en positieve reacties (aantal kopieën/µl) werden gemeten met een QX200-druppellezer (BioRad). Monsters met minder dan 10.000 druppels werden afgewezen. Patrooncontrole werd niet elke keer uitgevoerd wanneer ddPCR werd uitgevoerd.
qPCR werd uitgevoerd met behulp van Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australië) en LGALS7-specifieke primers. Alle kwantitatieve PCR's werden uitgevoerd in 20 µl met behulp van de QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). De qPCR werd gestart met een incubatie van 15 minuten bij 95 °C, gevolgd door 40 cycli van 10 seconden bij 95 °C en 60 seconden bij 60 °C, met één dataverzameling. Smeltcurven werden gegenereerd met behulp van opeenvolgende metingen bij 95 °C gedurende 5 seconden, 65 °C gedurende 60 seconden en 97 °C aan het einde van de qPCR. Elke qPCR werd in drievoud uitgevoerd, met uitzondering van de controlesamples.
Omdat mosselen bekend staan ​​om hun hoge filtratiesnelheid, onderzochten we eerst of ze DNA-fragmenten in zeewater konden filteren en vasthouden. We waren ook geïnteresseerd in de vraag of deze fragmenten zich ophopen in hun semi-open lymfestelsel. We losten dit probleem experimenteel op door het lot te volgen van oplosbare DNA-fragmenten die aan tanks met blauwe mosselen werden toegevoegd. Om het volgen van DNA-fragmenten te vergemakkelijken, gebruikten we vreemd (niet-eigen) plasmide-DNA dat het humane galectine-7-gen bevatte. ddPCR traceert plasmide-DNA-fragmenten in zeewater en mosselen. Onze resultaten laten zien dat als de hoeveelheid DNA-fragmenten in zeewater relatief constant bleef gedurende een bepaalde tijd (tot 7 dagen) in afwezigheid van mosselen, dit niveau in aanwezigheid van mosselen binnen 8 uur vrijwel volledig verdween (Fig. 1a,b). Fragmenten van exogeen DNA waren gemakkelijk te detecteren binnen 15 minuten in intravalvulaire vloeistof en hemolymfe (Fig. 1c). Deze fragmenten konden tot 4 uur na blootstelling nog steeds worden gedetecteerd. Deze filteractiviteit met betrekking tot DNA-fragmenten is vergelijkbaar met de filteractiviteit van bacteriën en algen [31]. Deze resultaten suggereren dat mosselen vreemd DNA kunnen filteren en accumuleren in hun vloeistofcompartimenten.
Relatieve concentraties van plasmide-DNA in zeewater in aanwezigheid (A) of afwezigheid (B) van mosselen, gemeten met ddPCR. In A worden de resultaten weergegeven als percentages, waarbij de randen van de vakjes het 75e en 25e percentiel vertegenwoordigen. De aangepaste logaritmische curve is in rood weergegeven en het grijs gearceerde gebied vertegenwoordigt het 95% betrouwbaarheidsinterval. In B vertegenwoordigt de rode lijn het gemiddelde en de blauwe lijn het 95% betrouwbaarheidsinterval voor de concentratie. C Accumulatie van plasmide-DNA in de hemolymfe en klepvloeistof van mosselen op verschillende tijdstippen na toevoeging van plasmide-DNA. De resultaten worden weergegeven als absolute gedetecteerde kopieën/ml (±SE).
Vervolgens onderzochten we de oorsprong van ccfDNA in mosselen verzameld uit mosselbanken op de Kerguelen-eilanden, een afgelegen eilandengroep met beperkte menselijke invloed. Hiervoor werd cccDNA uit mosselhemolymfe geïsoleerd en gezuiverd met behulp van methoden die gewoonlijk worden gebruikt voor de zuivering van menselijk cccDNA [32, 33]. We ontdekten dat de gemiddelde concentraties ccfDNA in de hemolymfe van mosselen in het lage microgram per ml hemolymfebereik liggen (zie Tabel S2, Aanvullende informatie). Dit concentratiebereik is veel groter dan bij gezonde mensen (lage nanogram per milliliter), maar in zeldzame gevallen, bij kankerpatiënten, kan het ccfDNA-niveau enkele microgram per milliliter bereiken [34, 35]. Een analyse van de grootteverdeling van ccfDNA in de hemolymfe toonde aan dat deze fragmenten sterk variëren in grootte, van 1000 bp tot 1000 bp tot 5000 bp (Fig. 2). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van de op silica gebaseerde QIAamp Investigator Kit, een methode die in de forensische wetenschap vaak wordt gebruikt om snel genomisch DNA te isoleren en te zuiveren uit DNA-monsters met een lage concentratie, waaronder ccfDNA [36].
Representatief ccfDNA-elektroforegram van mosselhemolymfe. Geëxtraheerd met de NucleoSnap Plasma Kit (boven) en de QIAamp DNA Investigator Kit. B Vioolplot die de verdeling van de ccfDNA-concentraties (±SE) in de hemolymfe van mosselen weergeeft. De zwarte en rode lijnen representeren respectievelijk de mediaan en het eerste en derde kwartiel.
Ongeveer 1% van het ccfDNA bij mensen en primaten heeft een vreemde bron [21, 37]. Gezien het semi-open circulatiesysteem van tweekleppigen, het microbieelrijke zeewater en de grootteverdeling van het ccfDNA van mosselen, veronderstelden we dat het ccfDNA in de hemolymfe van mosselen een rijke en diverse pool van microbieel DNA zou kunnen bevatten. Om deze hypothese te testen, hebben we het ccfDNA in de hemolymfe van Aulacomya atra-monsters, verzameld op de Kerguelen-eilanden, gesequenced. Dit leverde meer dan 10 miljoen reads op, waarvan 97,6% de kwaliteitscontrole doorstond. De reads werden vervolgens geclassificeerd op basis van eigen en niet-eigen bronnen met behulp van de BLASTN- en NCBI-databases voor tweekleppigen (Fig. S1, Aanvullende informatie).
Bij mensen kan zowel nucleair als mitochondriaal DNA in de bloedbaan terechtkomen [38]. In deze studie was het echter niet mogelijk om het nucleaire genomische DNA van mosselen gedetailleerd te beschrijven, aangezien het genoom van A. atra niet is gesequenced of beschreven. We konden echter wel een aantal ccfDNA-fragmenten van onze eigen oorsprong identificeren met behulp van de bivalve-bibliotheek (Fig. S2, Aanvullende informatie). We bevestigden ook de aanwezigheid van DNA-fragmenten van onze eigen oorsprong door middel van gerichte PCR-amplificatie van de gesequenced A. atra-genen (Fig. 3). Aangezien het mitochondriale genoom van A. atra beschikbaar is in openbare databases, kan men eveneens bewijs vinden voor de aanwezigheid van mitochondriale ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe van A. atra. De aanwezigheid van mitochondriale DNA-fragmenten werd bevestigd door PCR-amplificatie (Fig. 3).
Verschillende mitochondriale genen waren aanwezig in de hemolymfe van A. atra (rode stippen – stocknummer: SRX5705969) en M. platensis (blauwe stippen – stocknummer: SRX5705968), geamplificeerd met PCR. Figuur aangepast van Breton et al., 2011. B Amplificatie van hemolymfe-supernatant van A. atra. Opgeslagen op FTA-papier. Gebruik een pons van 3 mm om direct toe te voegen aan het PCR-buisje met het PCR-mengsel.
Gezien de overvloedige microbiële inhoud van zeewater, richtten we ons aanvankelijk op de karakterisering van microbiële DNA-sequenties in hemolymfe. Hiervoor gebruikten we twee verschillende strategieën. De eerste strategie maakte gebruik van Kraken2, een op algoritmen gebaseerd sequentieclassificatieprogramma dat microbiële sequenties kan identificeren met een nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met BLAST en andere tools [28]. Meer dan 6719 reads bleken van bacteriële oorsprong te zijn, terwijl 124 en 64 respectievelijk afkomstig waren van archaea en virussen (Fig. 4). De meest voorkomende bacteriële DNA-fragmenten waren Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Deze verdeling komt overeen met eerdere studies van het microbioom van de blauwe zeemossel [39, 40]. Gammaproteobacteria vormden de belangrijkste klasse van Proteobacteria (44%), waaronder veel Vibrionales (Fig. 4b). De ddPCR-methode bevestigde de aanwezigheid van Vibrio-DNA-fragmenten in het ccfDNA van de hemolymfe van A. atra (Fig. 4c) [41]. Om meer informatie te verkrijgen over de bacteriële oorsprong van het ccfDNA werd een aanvullende benadering gekozen (Fig. S2, Aanvullende informatie). In dit geval werden overlappende sequenties samengevoegd tot gepaarde sequenties en geclassificeerd als afkomstig van eigen (tweekleppige) of niet-eigen oorsprong met behulp van BLASTN, een e-waarde van 1e−3 en een drempelwaarde van >90% homologie. In dit geval werden overlappende sequenties samengevoegd tot gepaarde sequenties en geclassificeerd als afkomstig van eigen (tweekleppige) of niet-eigen oorsprong met behulp van BLASTN, een e-waarde van 1e−3 en een drempelwaarde van >90% homologie. U kunt uw geld verdienen met het kopen van een creditcard en een creditcard классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) of чужие по происхождению с использованием BLASTN en значения e 1e-3 en отсечения с гомологией> 90%. In dit geval werden overlappende sequenties verzameld als gepaarde sequenties en geclassificeerd als inheems (tweekleppig) of niet-origineel met behulp van BLASTN, een e-waarde van 1e-3 en een drempelwaarde van >90% homologie.90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 (双 壳类) 非 自身。。。。。。。。。 Als u een kredietverzekering wilt afsluiten met een kredietkaart en классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) of несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 en порога гомологии> 90%. In dit geval werden overlappende sequenties verzameld als gepaarde sequenties en geclassificeerd als eigen (tweekleppigen) of niet-origineel met behulp van eBLASTN en 1e-3 waarden en een homologiedrempel van >90%.Aangezien het genoom van A. atra nog niet is gesequenced, hebben we de de novo-assemblagestrategie van de MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler gebruikt. In totaal werden 147.188 contigs geïdentificeerd als afkomstig van tweekleppigen. Deze contigs werden vervolgens geëxplodeerd met e-waarden van 1e-10 met behulp van BLASTN en BLASTX. Deze strategie stelde ons in staat om 482 niet-tweekleppige fragmenten te identificeren die aanwezig zijn in het ccfDNA van A. atra. Meer dan de helft (57%) van deze DNA-fragmenten was afkomstig van bacteriën, voornamelijk van kieuwsymbionten, waaronder sulfotrofe symbionten, en van de kieuwsymbiont Solemya velum (Fig. 5).
Relatieve abundantie op typeniveau. B. Microbiële diversiteit van twee belangrijke fyla (Firmicutes en Proteobacteria). Representatieve amplificatie van ddPCR. C. Vibrio spp. A. Fragmenten van het 16S rRNA-gen (blauw) in drie atra hemolymfen.
In totaal werden 482 verzamelde contigs geanalyseerd. Algemeen profiel van de taxonomische verdeling van metagenomische contig-annotaties (prokaryoten en eukaryoten). B Gedetailleerde verdeling van bacteriële DNA-fragmenten geïdentificeerd door BLASTN en BLASTX.
Uit de Kraken2-analyse bleek ook dat het ccfDNA van mosselen archaeale DNA-fragmenten bevatte, waaronder DNA-fragmenten van Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). De aanwezigheid van DNA-fragmenten afkomstig van Euryarchaeota en Crenarchaeota, die eerder in de microbiële gemeenschap van Californische mosselen werden aangetroffen, zou geen verrassing moeten zijn [42]. Hoewel Euryarchaeota vaak wordt geassocieerd met extreme omstandigheden, wordt nu erkend dat zowel Euryarchaeota als Crenarcheota tot de meest voorkomende prokaryoten in de mariene cryogene omgeving behoren [43, 44]. De aanwezigheid van methanogene micro-organismen in mosselen is niet verrassend, gezien recente rapporten over omvangrijke methaanlekken uit bodemlekken op het Kerguelenplateau [45] en mogelijke microbiële methaanproductie die voor de kust van de Kerguelen-eilanden is waargenomen [46].
Onze aandacht richtte zich vervolgens op de analyses van DNA-virussen. Voor zover wij weten, is dit de eerste off-target studie naar de virusinhoud van mosselen. Zoals verwacht vonden we DNA-fragmenten van bacteriofagen (Caudovirales) (Fig. 6b). Het meest voorkomende virale DNA is echter afkomstig van een fylum van nucleocytovirussen, ook wel bekend als het nucleair-cytoplasmatisch groot-DNA-virus (NCLDV), dat het grootste genoom van alle virussen heeft. Binnen dit fylum behoren de meeste DNA-sequenties tot de families Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), waarvan de natuurlijke gastheren gewervelde dieren en geleedpotigen zijn, terwijl een klein deel van deze DNA-sequenties afkomstig is van bekende virologische algen. Deze algen infecteren mariene eukaryotische algen. Er werden ook sequenties verkregen van het Pandora-virus, het reuzenvirus met het grootste genoom van alle bekende virale geslachten. Interessant genoeg was het scala aan gastheren waarvan bekend is dat ze geïnfecteerd zijn met het virus, zoals bepaald door ccfDNA-sequencing van de hemolymfe, relatief groot (Figuur S3, Aanvullende informatie). Het omvat virussen die insecten infecteren, zoals Baculoviridae en Iridoviridae, maar ook virussen die amoeben, algen en gewervelde dieren infecteren. We vonden ook sequenties die overeenkwamen met het genoom van Pithovirus sibericum. Pitovirussen (ook wel bekend als "zombievirussen") werden voor het eerst geïsoleerd uit 30.000 jaar oude permafrost in Siberië [47]. Onze resultaten komen dus overeen met eerdere rapporten die aantonen dat niet alle moderne soorten van deze virussen zijn uitgestorven [48] en dat deze virussen aanwezig kunnen zijn in afgelegen subarctische mariene ecosystemen.
Ten slotte hebben we getest of we DNA-fragmenten van andere meercellige dieren konden vinden. In totaal werden 482 vreemde contigs geïdentificeerd met BLASTN en BLASTX met nt-, nr- en RefSeq-bibliotheken (genomisch en eiwit). Onze resultaten laten zien dat onder de vreemde fragmenten van ccfDNA van meercellige dieren DNA van botten overheerst (Fig. 5). Er zijn ook DNA-fragmenten van insecten en andere soorten gevonden. Een relatief groot deel van de DNA-fragmenten is niet geïdentificeerd, mogelijk vanwege de ondervertegenwoordiging van een groot aantal mariene soorten in genomische databases in vergelijking met landsoorten [49].
In dit artikel passen we het LB-concept toe op mosselen en betogen we dat ccfDNA-sequencing van hemolymfe inzicht kan geven in de samenstelling van mariene kustecosystemen. We ontdekten met name dat: 1) de hemolymfe van mosselen relatief hoge concentraties (microgrammen) van relatief grote (~1-5 kb) circulerende DNA-fragmenten bevat; 2) deze DNA-fragmenten zowel onafhankelijk als niet-onafhankelijk zijn; 3) onder de vreemde bronnen van deze DNA-fragmenten vonden we bacterieel, archaeaal en viraal DNA, evenals DNA van andere meercellige organismen; 4) de accumulatie van deze vreemde ccfDNA-fragmenten in de hemolymfe snel plaatsvindt en bijdraagt ​​aan de interne filteractiviteit van mosselen. Kortom, onze studie toont aan dat het LB-concept, dat tot nu toe vooral in de biomedische sector is toegepast, een rijke maar nog onontdekte bron van kennis bevat die kan worden gebruikt om de interactie tussen indicatorsoorten en hun omgeving beter te begrijpen.
Naast primaten is de isolatie van ccfDNA ook gerapporteerd bij zoogdieren, waaronder muizen, honden, katten en paarden [50, 51, 52]. Voor zover wij weten, is onze studie echter de eerste die de detectie en sequentiebepaling van ccfDNA in mariene soorten met een open circulatiesysteem beschrijft. Deze anatomische eigenschap en het filtervermogen van mosselen kunnen, althans gedeeltelijk, de verschillende groottekenmerken van circulerende DNA-fragmenten ten opzichte van andere soorten verklaren. Bij mensen zijn de meeste DNA-fragmenten die in het bloed circuleren kleine fragmenten met een grootte van 150 tot 200 bp, met een maximale piek van 167 bp [34, 53]. Een klein maar significant deel van de DNA-fragmenten is tussen de 300 en 500 bp groot, en ongeveer 5% is langer dan 900 bp [54]. De reden voor deze grootteverdeling is dat de belangrijkste bron van ccfDNA in plasma het gevolg is van celdood, hetzij door celdood of door necrose van circulerende hematopoëtische cellen bij gezonde individuen, hetzij door apoptose van tumorcellen bij kankerpatiënten (bekend als circulerend tumor-DNA, ctDNA). De grootteverdeling van het hemolymfe-ccfDNA dat we in mosselen aantroffen, varieerde van 1000 tot 5000 bp, wat suggereert dat mossel-ccfDNA een andere oorsprong heeft. Dit is een logische hypothese, aangezien mosselen een semi-open vaatstelsel hebben en leven in mariene wateromgevingen met hoge concentraties microbieel genomisch DNA. Onze laboratoriumexperimenten met exogeen DNA hebben inderdaad aangetoond dat mosselen DNA-fragmenten in zeewater accumuleren, die, ten minste na enkele uren, na cellulaire opname worden afgebroken en/of vrijgegeven en/of opgeslagen in verschillende structuren. Gezien de zeldzaamheid van cellen (zowel prokaryotische als eukaryotische), zal het gebruik van intravalvulaire compartimenten de hoeveelheid ccfDNA van zowel lichaamseigen als vreemde bronnen verminderen. Gezien het belang van de aangeboren immuniteit van tweekleppigen en het grote aantal circulerende fagocyten, veronderstelden we bovendien dat zelfs vreemd ccfDNA wordt verrijkt in circulerende fagocyten die vreemd DNA accumuleren na de opname van micro-organismen en/of celresten. Samengevat tonen onze resultaten aan dat ccfDNA in de hemolymfe van tweekleppigen een unieke opslagplaats is van moleculaire informatie en hun status als indicatorsoort versterkt.
Onze gegevens wijzen erop dat sequentiebepaling en analyse van bacteriële hemolymfe ccfDNA-fragmenten belangrijke informatie kunnen verschaffen over de bacteriële flora van de gastheer en de bacteriën die aanwezig zijn in het omringende mariene ecosysteem. Shot-sequentietechnieken hebben sequenties van de commensale bacterie A. atra gill aan het licht gebracht die gemist zouden zijn als conventionele 16S rRNA-identificatiemethoden waren gebruikt, mede door een vertekening in de referentiebibliotheek. Sterker nog, ons gebruik van LB-gegevens verzameld van M. platensis in dezelfde mossellaag bij Kerguelen toonde aan dat de samenstelling van de kieuwgeassocieerde bacteriële symbionten hetzelfde was voor beide mosselsoorten (Fig. S4, Aanvullende informatie). Deze gelijkenis tussen twee genetisch verschillende mosselen kan de samenstelling van bacteriële gemeenschappen in de koude, zwavelhoudende en vulkanische afzettingen van Kerguelen weerspiegelen [55, 56, 57, 58]. Er is al eerder beschreven dat er hogere aantallen zwavelreducerende micro-organismen voorkomen bij het oogsten van mosselen uit door bioturbatie bewerkte kustgebieden [59], zoals de kust van Port-au-France. Een andere mogelijkheid is dat de commensale mosselflora beïnvloed kan worden door horizontale overdracht [60, 61]. Meer onderzoek is nodig om de correlatie tussen het mariene milieu, het zeebodemoppervlak en de samenstelling van symbiotische bacteriën in mosselen te bepalen. Deze studies zijn momenteel gaande.
De lengte en concentratie van hemolymfe-ccfDNA, het gemak waarmee het gezuiverd kan worden en de hoge kwaliteit die snelle shotgun-sequencing mogelijk maakt, zijn enkele van de vele voordelen van het gebruik van mossel-ccfDNA om de biodiversiteit in mariene kustecosystemen te beoordelen. Deze aanpak is met name effectief voor het karakteriseren van virale gemeenschappen (viromen) in een bepaald ecosysteem [62, 63]. In tegenstelling tot bacteriën, archaea en eukaryoten bevatten virale genomen geen fylogenetisch geconserveerde genen zoals 16S-sequenties. Onze resultaten geven aan dat vloeibare biopsies van indicatorsoorten zoals mosselen gebruikt kunnen worden om relatief grote aantallen ccfDNA-virusfragmenten te identificeren waarvan bekend is dat ze gastheren infecteren die typisch voorkomen in mariene kustecosystemen. Dit omvat virussen waarvan bekend is dat ze protozoa, geleedpotigen, insecten, planten en bacteriële virussen (bijv. bacteriofagen) infecteren. Een vergelijkbare verdeling werd gevonden toen we het hemolymfe-ccfDNA-viroom van blauwe mosselen (M. platensis) onderzochten, verzameld in dezelfde mossellaag bij Kerguelen (Tabel S2, Aanvullende informatie). Shotgun-sequencing van ccfDNA is inderdaad een nieuwe benadering die aan populariteit wint in de studie van het viroom van mensen of andere soorten [21, 37, 64]. Deze benadering is met name nuttig voor het bestuderen van dubbelstrengs-DNA-virussen, aangezien geen enkel gen geconserveerd is onder alle dubbelstrengs-DNA-virussen, die de meest diverse en brede klasse virussen in Baltimore vertegenwoordigen [65]. Hoewel de meeste van deze virussen ongeclassificeerd blijven en mogelijk virussen uit een volledig onbekend deel van de virale wereld omvatten [66], vonden we dat de viromen en gastheerbereiken van de mosselen A. atra en M. platensis tussen die van de twee soorten in liggen (zie figuur S3, aanvullende informatie). Deze gelijkenis is niet verrassend, aangezien het een gebrek aan selectiviteit in de opname van DNA uit de omgeving kan weerspiegelen. Toekomstige studies met gezuiverd RNA zijn momenteel nodig om het RNA-viroom te karakteriseren.
In ons onderzoek hebben we een zeer rigoureuze pijplijn gebruikt, aangepast van het werk van Kowarski en collega's [37], die een tweestaps deletie van gepoolde reads en contigs gebruikten vóór en na de assemblage van natief ccfDNA, wat resulteerde in een hoog percentage niet-toegewezen reads. Daarom kunnen we niet uitsluiten dat sommige van deze niet-toegewezen reads nog steeds een eigen oorsprong hebben, voornamelijk omdat we geen referentiegenome hebben voor deze mosselsoort. We hebben deze pijplijn ook gebruikt omdat we ons zorgen maakten over de chimera's tussen zelf- en niet-zelf-reads en de readlengtes die gegenereerd werden door de Illumina MiSeq PE75. Een andere reden voor het merendeel van de niet-toegewezen reads is dat veel van de mariene microben, vooral in afgelegen gebieden zoals Kerguelen, nog niet geannoteerd zijn. We gebruikten de Illumina MiSeq PE75, ervan uitgaande dat de lengtes van de ccfDNA-fragmenten vergelijkbaar waren met die van menselijk ccfDNA. Gezien onze resultaten waaruit blijkt dat ccfDNA in hemolymfe langere fragmenten bevat dan bij mensen en/of zoogdieren, raden we voor toekomstig onderzoek aan om een ​​sequentieplatform te gebruiken dat beter geschikt is voor langere ccfDNA-fragmenten. Deze aanpak zal het veel gemakkelijker maken om meer aanwijzingen voor diepgaande analyse te vinden. Het verkrijgen van de momenteel niet beschikbare complete nucleaire genoomsequentie van A. atra zou de differentiatie van ccfDNA van eigen en vreemde bronnen ook aanzienlijk vergemakkelijken. Aangezien ons onderzoek zich heeft gericht op de mogelijkheid om het concept van vloeibare biopsie toe te passen op mosselen, hopen we dat naarmate dit concept in toekomstig onderzoek wordt gebruikt, er nieuwe tools en pipelines zullen worden ontwikkeld om het potentieel van deze methode voor het bestuderen van de microbiële diversiteit van mosselen in het mariene ecosysteem te vergroten.
Als niet-invasieve klinische biomarker worden verhoogde ccfDNA-niveaus in menselijk plasma geassocieerd met diverse ziekten, weefselschade en stressomstandigheden [67,68,69]. Deze toename is gerelateerd aan de afgifte van DNA-fragmenten van eigen oorsprong na weefselschade. We hebben dit onderzocht met behulp van acute hittestress, waarbij mosselen kortstondig werden blootgesteld aan een temperatuur van 30 °C. We hebben deze analyse uitgevoerd op drie verschillende soorten mosselen in drie onafhankelijke experimenten. We vonden echter geen verandering in de ccfDNA-niveaus na acute hittestress (zie Figuur S5, aanvullende informatie). Deze bevinding kan, althans gedeeltelijk, verklaren waarom mosselen een semi-open circulatiesysteem hebben en grote hoeveelheden vreemd DNA accumuleren als gevolg van hun hoge filteractiviteit. Aan de andere kant zijn mosselen, net als veel ongewervelden, mogelijk resistenter tegen door stress veroorzaakte weefselschade, waardoor de afgifte van ccfDNA in hun hemolymfe wordt beperkt [70, 71].
Tot nu toe heeft DNA-analyse van biodiversiteit in aquatische ecosystemen zich voornamelijk gericht op metabarcoding van omgevings-DNA (eDNA). Deze methode is echter meestal beperkt in biodiversiteitsanalyse wanneer primers worden gebruikt. Het gebruik van shotgun-sequencing omzeilt de beperkingen van PCR en de bevooroordeelde selectie van primersets. In zekere zin staat onze methode dus dichter bij de recent gebruikte high-throughput eDNA shotgun-sequencingmethode, die in staat is om gefragmenteerd DNA direct te sequencen en bijna alle organismen te analyseren [72, 73]. Er zijn echter een aantal fundamentele kwesties die LB onderscheiden van standaard eDNA-methoden. Het belangrijkste verschil tussen eDNA en LB is natuurlijk het gebruik van natuurlijke filtergastheren. Het gebruik van mariene soorten zoals sponzen en tweekleppigen (Dresseina spp.) als natuurlijk filter voor het bestuderen van eDNA is gerapporteerd [74, 75]. In het onderzoek van Dreissena werden echter weefselbiopsieën gebruikt waaruit DNA werd geëxtraheerd. Analyse van ccfDNA uit LB vereist geen weefselbiopsie, gespecialiseerde en soms dure apparatuur en de logistiek die gepaard gaat met eDNA of weefselbiopsie. Sterker nog, we hebben onlangs gerapporteerd dat ccfDNA uit LB kan worden opgeslagen en geanalyseerd met FTA-ondersteuning zonder een koudeketen te hoeven handhaven, wat een grote uitdaging is voor onderzoek in afgelegen gebieden [76]. De extractie van ccfDNA uit vloeibare biopsies is ook eenvoudig en levert DNA van hoge kwaliteit op voor shotgun-sequencing en PCR-analyse. Dit is een groot voordeel gezien enkele van de technische beperkingen die gepaard gaan met eDNA-analyse [77]. De eenvoud en lage kosten van de bemonsteringsmethode zijn ook bijzonder geschikt voor langetermijnmonitoringprogramma's. Naast hun hoge filtervermogen is een ander bekend kenmerk van tweekleppigen de chemische mucopolysaccharide-samenstelling van hun slijm, die de absorptie van virussen bevordert [78, 79]. Dit maakt tweekleppigen een ideaal natuurlijk filter voor het karakteriseren van biodiversiteit en de impact van klimaatverandering in een bepaald aquatisch ecosysteem. Hoewel de aanwezigheid van van de gastheer afkomstige DNA-fragmenten als een beperking van de methode kan worden beschouwd in vergelijking met eDNA, zijn de kosten die gepaard gaan met het hebben van dergelijk inheems ccfDNA in vergelijking met eDNA tegelijkertijd begrijpelijk gezien de enorme hoeveelheid informatie die beschikbaar is voor gezondheidsonderzoek. Dit omvat de aanwezigheid van virale sequenties die in het genoom van de gastheer zijn geïntegreerd. Dit is vooral belangrijk voor mosselen, gezien de aanwezigheid van horizontaal overgedragen leukemische retrovirussen in tweekleppigen [80, 81]. Een ander voordeel van LB ten opzichte van eDNA is dat het gebruikmaakt van de fagocytische activiteit van circulerende bloedcellen in de hemolymfe, die micro-organismen (en hun genomen) inslikken. Fagocytose is de belangrijkste functie van bloedcellen in tweekleppigen [82]. Ten slotte profiteert de methode van de hoge filtercapaciteit van mosselen (gemiddeld 1,5 l/u zeewater) en de tweedaagse circulatie, die de menging van verschillende zeewaterlagen vergroot, waardoor heteroloog eDNA kan worden vastgelegd. [83, 84]. De analyse van ccfDNA van mosselen is dus een interessante onderzoeksrichting gezien de nutritionele, economische en milieu-impact van mosselen. Net als bij de analyse van LB verzameld van mensen, biedt deze methode ook de mogelijkheid om genetische en epigenetische veranderingen in gastheer-DNA te meten als reactie op exogene stoffen. Zo kunnen bijvoorbeeld sequencingtechnologieën van de derde generatie worden ingezet om een ​​genoombrede methyleringsanalyse uit te voeren in natief ccfDNA met behulp van nanopore-sequencing. Dit proces zou moeten worden vergemakkelijkt door het feit dat de lengte van de ccfDNA-fragmenten van mosselen ideaal compatibel is met long-read sequencingplatforms die een genoombrede DNA-methyleringsanalyse mogelijk maken vanuit één enkele sequencingrun zonder de noodzaak van chemische transformaties. [85, 86] Dit is een interessante mogelijkheid, aangezien is aangetoond dat DNA-methyleringspatronen een reactie op milieustress weerspiegelen en gedurende vele generaties aanhouden. Daarom kan het waardevolle inzichten verschaffen in de onderliggende mechanismen die de reactie na blootstelling aan klimaatverandering of verontreinigende stoffen bepalen [87]. Het gebruik van LB kent echter beperkingen. Het spreekt voor zich dat hiervoor de aanwezigheid van indicatorsoorten in het ecosysteem vereist is. Zoals hierboven vermeld, vereist het gebruik van LB om de biodiversiteit van een bepaald ecosysteem te beoordelen ook een rigoureuze bio-informatica-pipeline die rekening houdt met de aanwezigheid van DNA-fragmenten uit de bron. Een ander groot probleem is de beschikbaarheid van referentiegenomen voor mariene soorten. Er wordt gehoopt dat initiatieven zoals het Marine Mammal Genomes Project en het recent opgerichte Fish10k-project [88] dergelijke analyses in de toekomst zullen vergemakkelijken. De toepassing van het LB-concept op mariene filtervoedende organismen is ook compatibel met de nieuwste ontwikkelingen in sequencingtechnologie, waardoor het zeer geschikt is voor de ontwikkeling van multi-ohm biomarkers die belangrijke informatie verschaffen over de gezondheid van mariene habitats in reactie op milieustress.
De genoomsequentiedata zijn gedeponeerd in het NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 onder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ. De impact van klimaatverandering op het leven en de ecosystemen in zee. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Overweeg de gecombineerde effecten van klimaatverandering en andere lokale stressfactoren op het mariene milieu. General Scientific Environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Wetenschap van 1 maart. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Verminderde hittebestendigheid onder herhaalde hittestressomstandigheden verklaart de hoge zomersterfte van blauwe mosselen. Wetenschappelijk rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Recente veranderingen in de frequentie, oorzaken en omvang van sterfgevallen bij dieren. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Meerdere niet-soortspecifieke pathogenen hebben mogelijk de massale sterfte van Pinna nobilis veroorzaakt. Leven. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potentiële impact van klimaatverandering op zoönotische ziekten in het Arctisch gebied. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blauwe mosselen (Mytilus edulis spp.) als signaalorganismen bij de monitoring van kustverontreiniging: een overzicht. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integratie van vloeibare biopsie in de kankerbehandeling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Vloeibare biopsie-rijping: maakt circulatie van tumor-DNA mogelijk. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleïnezuren in menselijk plasma. Notulen van de vergaderingen van dochterondernemingen van Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Een nieuwe rol voor celvrij DNA als moleculaire marker voor kankerbehandeling. Kwantificering van biomolaire analyse. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. Vloeibare biopsie doet zijn intrede in de kliniek – implementatieproblemen en toekomstige uitdagingen. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en anderen. Foetaal DNA is aanwezig in maternaal plasma en serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Studie naar het verloop van de zwangerschap en de complicaties ervan met behulp van circulerend extracellulair RNA in het bloed van zwangere vrouwen. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Vloeibare biopsie: donorcelvrij DNA wordt gebruikt om allogene laesies in een niertransplantaat op te sporen. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaties in prenatale diagnostiek: genoomsequencing van maternaal plasma. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Snelle detectie van pathogenen met behulp van next-generation metagenomische sequencing van geïnfecteerde lichaamsvloeistoffen. Nat Medicine. 2021;27:115-24.