Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን እንዲያሰናክሉ)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
ፈሳሽ ባዮፕሲ (LB) በባዮሜዲካል መስክ በፍጥነት ተወዳጅነትን እያገኘ ያለ ጽንሰ-ሀሳብ ነው። ጽንሰ-ሐሳቡ በዋናነት የተመሰረተው በተለያዩ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ከሴል ሞት በኋላ እንደ ትናንሽ ቁርጥራጮች የሚለቀቁ የሚዘዋወሩ ከሴሉላር ውጭ ያሉ ዲኤንኤ (ccfDNA) ቁርጥራጮችን በመለየት ላይ ነው። ከእነዚህ ቁርጥራጮች ውስጥ አነስተኛ ድርሻ የሚመጣው ከውጭ (የውጭ) ሕብረ ሕዋሳት ወይም ፍጥረታት ነው። በአሁኑ ሥራ፣ ይህንን ጽንሰ-ሀሳብ በከፍተኛ የባህር ውሃ ማጣሪያ አቅማቸው በሚታወቀው የሴንቲነል ዝርያ ላይ ተግባራዊ አድርገናል። የሙሰልስን ችሎታ ከተለያዩ ምንጮች የአካባቢ ዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ለመያዝ እንደ ተፈጥሯዊ ማጣሪያዎች በመጠቀም የባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮች ብዝሃ-ህይወት መረጃ እናቀርባለን። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት የሙሰል ሄሞሊምፍ መጠን ከ1 እስከ 5 ኪ.ባ. የሚለያዩ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ይይዛል። የሾትገን ቅደም ተከተል እንደሚያሳየው ብዙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ከውጭ ማይክሮባላዊ መነሻ ያላቸው ናቸው። ከእነዚህም መካከል ከባክቴሪያ፣ አርኬያ እና ቫይረሶች የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን አግኝተናል፣ ይህም በባህር ዳርቻ የባህር ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ በብዛት የሚገኙትን የተለያዩ አስተናጋጆችን እንደሚያጠቁ የሚታወቁ ቫይረሶችን ያካትታል። ለማጠቃለል ያህል፣ ጥናታችን እንደሚያሳየው በሙሰል ላይ የተተገበረው የኤልቢ ጽንሰ-ሀሳብ በባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ ስላለው የማይክሮባላዊ ልዩነት የበለፀገ ነገር ግን እስካሁን ያልተመረመረ የእውቀት ምንጭን ይወክላል።
የአየር ንብረት ለውጥ (CC) በባህር ሥነ-ምህዳሮች ባዮሎጂያዊ ልዩነት ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በፍጥነት እያደገ የመጣ የምርምር መስክ ነው። የአለም ሙቀት መጨመር አስፈላጊ የሆኑ የፊዚዮሎጂ ጭንቀቶችን ከማስከተል ባለፈ የባህር ፍጥረታት የሙቀት መረጋጋት የዝግመተ ለውጥ ገደቦችን ይገፋፋል፣ ይህም የበርካታ ዝርያዎችን መኖሪያ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል፣ ይህም የበለጠ ምቹ ሁኔታዎችን እንዲፈልጉ ያነሳሳቸዋል [1፣ 2]። የሜታዞአን ባዮሎጂያዊ ልዩነትን ከመጉዳት በተጨማሪ፣ CC የአስተናጋጅ-ማይክሮባላዊ ግንኙነቶችን ስስ ሚዛን ያደናቅፋል። ይህ ማይክሮባላዊ ዲስባክቴሪዮሲስ የባህር ፍጥረታትን ለተላላፊ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን የበለጠ ተጋላጭ ስለሚያደርግ ለባህር ሥነ-ምህዳሮች ከባድ ስጋት ይፈጥራል [3፣ 4]። ኤስኤስ በጅምላ ሞት ውስጥ ትልቅ ሚና እንደሚጫወት ይታመናል፣ ይህም ለዓለም አቀፍ የባህር ሥነ-ምህዳሮች አስተዳደር ከባድ ችግር ነው [5፣ 6]። ይህ በብዙ የባህር ዝርያዎች ኢኮኖሚያዊ፣ ሥነ-ምህዳራዊ እና የአመጋገብ ተፅእኖዎች ከግምት ውስጥ በማስገባት አስፈላጊ ጉዳይ ነው። ይህ በተለይ የ CK ተፅእኖዎች ፈጣን እና ከባድ በሆኑባቸው በፖላር ክልሎች ውስጥ ለሚኖሩ ባይቫልቭስ እውነት ነው [6፣ 7]። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ እንደ ማይቲለስ ስፕ. ያሉ ባይቫልቭስ በባህር ሥነ-ምህዳሮች ላይ የሲሲን ተፅእኖ ለመከታተል በስፋት ጥቅም ላይ ይውላሉ። ምንም እንኳን በአንጻራዊ ሁኔታ ሲታይ ብዙ ባዮማርከሮች ጤንነታቸውን ለመከታተል መዘጋጀታቸው አያስደንቅም፣ ብዙውን ጊዜ በኢንዛይማቲክ እንቅስቃሴ ወይም እንደ ሴል ህያውነት እና ፋጎሳይቲክ እንቅስቃሴ ባሉ የሴሉላር ተግባራት ላይ የተመሰረቱ ተግባራዊ ባዮማርከሮችን የሚያካትት ባለ ሁለት ደረጃ አቀራረብን በመጠቀም። እነዚህ ዘዴዎች ከፍተኛ መጠን ያለው የባህር ውሃ ከተወሰደ በኋላ ለስላሳ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የሚከማቹ የተወሰኑ የግፊት አመልካቾችን ክምችት መለካትንም ያካትታሉ። ሆኖም፣ ከፍተኛ የማጣሪያ አቅም እና የቢቫልቭስ ከፊል ክፍት የደም ዝውውር ስርዓት የፈሳሽ ባዮፕሲ (LB) ጽንሰ-ሀሳብን በመጠቀም አዳዲስ የሂሞሊምፍ ባዮማርከሮችን ለማዳበር እድል ይሰጣሉ፣ ይህም ቀላል እና አነስተኛ ወራሪ የታካሚ አስተዳደር አቀራረብ ነው። የደም ናሙናዎች [9፣ 10]። ምንም እንኳን በርካታ የሚዘዋወሩ ሞለኪውሎች በሰው ልጅ የደም ናሙና ውስጥ ሊገኙ ቢችሉም፣ ይህ ጽንሰ-ሀሳብ በዋናነት በፕላዝማ ውስጥ የሚዘዋወሩ የሴሉላር ዲኤንኤ (ccfDNA) ቁርጥራጮች የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ትንተና ላይ የተመሠረተ ነው። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ በሰው ልጅ ፕላዝማ ውስጥ የሚዘዋወረው ዲኤንኤ መኖር ከ20ኛው ክፍለ ዘመን አጋማሽ ጀምሮ ይታወቃል [11]፣ ነገር ግን ከፍተኛ-ውጤት ቅደም ተከተል ዘዴዎች መምጣት በccfDNA ላይ የተመሠረተ ክሊኒካዊ ምርመራ ያስከተለው በቅርብ ዓመታት ውስጥ ብቻ ነው። የእነዚህ የሚዘዋወሩ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸው በከፊል የሕዋስ ሞት ከተከሰተ በኋላ የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ (ኒኩሌር እና ሚቶኮንድሪያል) መለቀቅ ምክንያት ነው። በጤናማ ሰዎች ላይ የ ccfDNA ክምችት በተለምዶ ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL) ነገር ግን በተለያዩ በሽታዎች ወይም ለጭንቀት በተጋለጡ ታካሚዎች ላይ ከ5-10 እጥፍ ሊጨምር ይችላል፣ ይህም የቲሹ ጉዳት ያስከትላል። በጤናማ ሰዎች ላይ የ ccfDNA ክምችት በተለምዶ ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL) ነገር ግን በተለያዩ በሽታዎች ወይም ለጭንቀት በተጋለጡ ታካሚዎች ላይ ከ5-10 እጥፍ ሊጨምር ይችላል፣ ይህም የቲሹ ጉዳት ያስከትላል። У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. በጤናማ ሰዎች ላይ የcccDNA ክምችት በተለምዶ ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL)፣ ነገር ግን የተለያዩ በሽታዎች ባለባቸው ወይም በጭንቀት ውስጥ ባሉ ታካሚዎች ላይ ወደ ሕብረ ሕዋሳት ጉዳት የሚያመራ በ5-10 እጥፍ ሊጨምር ይችላል።在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）。倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度较 低 （<10 ng/ml）增加 5-10 , 从而组织。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. የ ccfDNA ክምችት በጤናማ ሰዎች ላይ አብዛኛውን ጊዜ ዝቅተኛ ነው (<10 ng/ml)፣ ነገር ግን የተለያዩ በሽታዎች ወይም ውጥረት ባለባቸው ታካሚዎች ላይ በ5-10 እጥፍ ሊጨምር ይችላል፣ ይህም የቲሹ ጉዳት ያስከትላል።የ ccfDNA ቁርጥራጮች መጠን በስፋት ይለያያል፣ ነገር ግን አብዛኛውን ጊዜ ከ150 እስከ 200 ቢፒ ይደርሳል። [12]። ከመደበኛ ወይም ከተለወጡ የአስተናጋጅ ሴሎች የሚገኘው ccfDNA በራስ የተገኘ የ ccfDNA ትንተና፣ ማለትም ከመደበኛ ወይም ከተለወጡ የአስተናጋጅ ሴሎች የሚገኘው ccfDNA፣ በኑክሌር እና/ወይም በማይቶኮንድሪያል ጂኖም ውስጥ ያሉትን የጄኔቲክ እና የኤፒጄኔቲክ ለውጦችን ለመለየት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፣ በዚህም ምክንያት ክሊኒኮች የተወሰኑ ሞለኪውላዊ-ተኮር ሕክምናዎችን እንዲመርጡ ይረዳል [13]። ሆኖም፣ ccfDNA በእርግዝና ወቅት ከፅንስ ሴሎች እንደ ccfDNA ካሉ የውጭ ምንጮች ወይም ከተተከሉ የአካል ክፍሎች ሊገኝ ይችላል [14,15,16,17]። ccfDNA እንዲሁም ተላላፊ ወኪል (የውጭ) ኒውክሊክ አሲዶች መኖርን ለመለየት አስፈላጊ የመረጃ ምንጭ ነው፣ ይህም በደም ባህሎች የማይታወቁ ሰፊ ኢንፌክሽኖችን ወራሪ ያልሆነ ለይቶ ለማወቅ ያስችላል፣ የተበከለውን ሕብረ ሕዋስ ወራሪ ባዮፕሲ ያስወግዳል [18]። የቅርብ ጊዜ ጥናቶች በእርግጥም የሰው ደም የቫይረስ እና የባክቴሪያ በሽታ አምጪዎችን ለመለየት ሊያገለግል የሚችል የበለፀገ የመረጃ ምንጭ እንዳለው እና በሰው ፕላዝማ ውስጥ የሚገኘው ccfDNA 1% የሚሆነው ከውጭ የመጣ መሆኑን [19] አሳይተዋል። እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአንድ ኦርጋኒክ የሚዘዋወር ማይክሮባዮም የብዝሃ ሕይወት በccfDNA ትንተና ሊገመገም ይችላል። ሆኖም ግን፣ እስከ ቅርብ ጊዜ ድረስ፣ ይህ ጽንሰ-ሀሳብ በሰዎች ላይ ብቻ እና በተወሰነ ደረጃ በሌሎች የጀርባ አጥንቶች ላይ ጥቅም ላይ ውሏል [20፣ 21]።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ የአውላኮሚያ አትራ ccfDNAን ለመተንተን የኤልቢ አቅምን እንጠቀማለን፣ ይህም ከ35 ሚሊዮን ዓመታት በፊት በተፈጠረው ትልቅ አምባ ላይ በሚገኙት በከርጉለን ደሴቶች ውስጥ በብዛት የሚገኘው የደሴቶች ቡድን ነው። የእሳተ ገሞራ ፍንዳታ። በብልቃጥ ውስጥ የሙከራ ስርዓትን በመጠቀም፣ በባህር ውሃ ውስጥ ያሉ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች በፍጥነት በሙሰል ተወስደው ወደ ሄሞሊምፍ ክፍል እንደሚገቡ ደርሰንበታል። የሾትገን ቅደም ተከተል እንደሚያሳየው የሙሰል ሄሞሊምፍ ccfDNA የራሱ እና የራሱ ያልሆነ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ይይዛል፣ ይህም ከቀዝቃዛ የእሳተ ገሞራ የባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮች የተለመዱ ባዮሞች የመጡ ሲምባዮቲክ ባክቴሪያ እና የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ያካትታል። የሄሞሊምፍ ccfDNA እንዲሁም ከተለያዩ የአስተናጋጅ ክልሎች ካላቸው ቫይረሶች የተገኙ የቫይረስ ቅደም ተከተሎችን ይዟል። እንዲሁም እንደ አጥንት ዓሳ፣ የባህር አኒሞኖች፣ አልጌ እና ነፍሳት ካሉ ባለብዙ ሴሉላር እንስሳት የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን አግኝተናል። በማጠቃለያው፣ ጥናታችን የኤልቢ ፅንሰ-ሀሳብ በባህር ውስጥ ስነ-ምህዳሮች ውስጥ የበለፀገ የጂኖሚክ ሪዘርቭ ለመፍጠር በባህር ውስጥ ኢንቨርቴብቶች ላይ በተሳካ ሁኔታ ሊተገበር እንደሚችል ያሳያል።
አዋቂዎች (55-70 ሚሜ ርዝመት) ማይቲለስ ፕላቴንሲስ (ኤም. ፕላቴንሲስ) እና አውላኮሚያ አትራ (ኤ. አትራ) ከፖርት-ኦ-ፍራንስ (049°21.235 ሴ፣ 070°13.490 ኢ.) መካከል ከሚገኙት ድንጋያማ የባህር ዳርቻዎች የተሰበሰቡ ናቸው። በታህሳስ 2018 የከርጉለን ደሴቶች። ሌሎች የአዋቂ ሰማያዊ ሙሰል (ማይቲለስ ስፕ.) ከንግድ አቅራቢ (PEI Mussel King Inc.፣ Prince Edward Island፣ Canada) የተገኙ ሲሆን ከ10-20 ሊትር 32‰ አርቲፊሻል ብሪን የያዘ የሙቀት መጠን ቁጥጥር የሚደረግበት (4°ሴ) አየር በተሞላበት ማጠራቀሚያ ውስጥ ተቀምጠዋል። (አርቲፊሻል የባህር ጨው ሪፍ ክሪስታል፣ ኢንስታንት ኦሽን፣ ቨርጂኒያ፣ አሜሪካ)። ለእያንዳንዱ ሙከራ የግለሰብ ዛጎሎች ርዝመት እና ክብደት ተለክተዋል።
ለዚህ ፕሮግራም ነፃ የሆነ የክፍት መዳረሻ ፕሮቶኮል በመስመር ላይ ይገኛል (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)። በአጭሩ፣ LB ሄሞሊምፍ እንደተገለጸው ከጠላፊ ጡንቻዎች ተሰብስቧል [22]። ሄሞሊምፍ በ1200×g ለ3 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጌሽን ተብራርቷል፣ የሱፐርናታንቱ ጥቅም ላይ እስኪውል ድረስ (-20°C) ቀዝቅዟል። የcfDNA ን ለይቶ ለማውጣት እና ለማጣራት፣ ናሙናዎች (1.5-2.0 ሚሊ ሊትር) በአምራቹ መመሪያ መሠረት በNucleoSnap cfDNA ኪት (Macherey-Nagel፣ Bethlehen፣ PA) ቀልጠው ተሰርተዋል። ccfDNA እስከ ተጨማሪ ትንተና ድረስ በ-80°C ተከማችቷል። በአንዳንድ ሙከራዎች፣ ccfDNA በQIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN፣ ቶሮንቶ፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) ተለይቶ ተጠርጓል። የተጣራ ዲኤንኤ በመደበኛ PicoGreen ምርመራ ተለካ። የተገለለው የccfDNA ክፍልፋይ ስርጭት በካፒላሪ ኤሌክትሮፎረሲስ አማካኝነት በAgilent 2100 ባዮአናሊዘር (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) በመጠቀም ከፍተኛ የስሜት ህዋሳት ዲኤንኤ ኪት በመጠቀም ተተነተነ። ምርመራው የተከናወነው በአምራቹ መመሪያ መሰረት 1 µl የccfDNA ናሙና በመጠቀም ነው።
የሂሞሊምፍ ccfDNA ቁርጥራጮችን ቅደም ተከተል ለማስያዝ፣ ጂኖም ኩቤክ (ሞንትሪያል፣ ኩቤክ፣ ካናዳ) የኢሉሚና ሚሴክ PE75 ኪት የኢሉሚና ዲኤንኤ ድብልቅ ኪት በመጠቀም የሾትገን ቤተ-መጻሕፍትን አዘጋጅቷል። መደበኛ አስማሚ (ባዮኦ) ጥቅም ላይ ውሏል። ጥሬ የውሂብ ፋይሎች ከNCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 እና SRR8924809) ይገኛሉ። መሰረታዊ የንባብ ጥራት የተገመገመው FastQC [23]ን በመጠቀም ነው። ትሪሞማቲክ [24] አስማሚዎችን ለመቁረጥ እና ደካማ ጥራት ያላቸውን ንባቦች ለመቁረጥ ጥቅም ላይ ውሏል። የተጣመሩ ጫፎች ያላቸው የሾትገን ንባቦች FLASH ወደ ረጅም ነጠላ ንባቦች ተዋህደዋል እና አለመጣጣሞችን ለማስወገድ ቢያንስ 20 bp መደራረብ አለባቸው [25]። የተዋሃዱ ንባቦች በቢቫልቭ NCBI ታክሶኖሚ ዳታቤዝ (e value < 1e−3 እና 90% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በBLASTN ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸውን ቅደም ተከተሎች በDUST [26] በመጠቀም ጭምብል ማድረግ ተከናውኗል። የተዋሃዱ ንባቦች በቢቫልቭ NCBI ታክሶኖሚ ዳታቤዝ (e value < 1e−3 እና 90% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በBLASTN ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸውን ቅደም ተከተሎች በDUST [26] በመጠቀም ጭምብል ማድረግ ተከናውኗል። Объединеные чтения были анотированы спомощью BLASTN с NCBI (значение e < 1e-3 እና 90% гомологии), амаскирование последовательностей [26] የተሰባሰቡ ንባቦች በ NCBI ባይቫልቭ ታክሶኖሚ ዳታቤዝ (e value < 1e-3 እና 90% homology) በመጠቀም በBLASTN ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያለው የቅደም ተከተል ጭምብል በ DUST [26] በመጠቀም ተከናውኗል።使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 和 90% 同源）进行复杂度 序列 的。。。。。。。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединеные чтения были анотированы спомощью BLASTN с моллюсков NCBI (значение e <1e-3 እና 90% гомологии), а маскирование использованием አቧራ [26]። የተሰባሰቡ ንባቦች በ NCBI ባይቫልቭ ታክሶኖሚክ ዳታቤዝ (e value <1e-3 እና 90% homology) በመጠቀም በBLASTN ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያለው የቅደም ተከተል ጭምብል በ DUST [26] በመጠቀም ተከናውኗል።ንባቦች በሁለት ቡድኖች የተከፈለ ነበር፡- ከባይቫልቭ ቅደም ተከተሎች (እዚህ የራስ ንባብ ይባላል) እና ከማይዛመዱ (ራስን የማንበብ ችሎታ የሌላቸው) ጋር የተያያዙ። ሁለት ቡድኖች ኮንቲግስ ​​ለማመንጨት በMEGAHIT በመጠቀም ለየብቻ ተሰብስበዋል [27]። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ የባዕድ ማይክሮባዮም ንባቦች የታክሶኖሚክ ስርጭት በክራከን2 [28] በመጠቀም እና በጋላክሲ ላይ በክሮና ኬክ ገበታ በግራፊክ መልኩ ተወክሏል [29፣ 30]። ከቅድመ ሙከራዎቻችን የተወሰዱ ምርጥ ኪመሮች ኪመሮች-59 እንደሆኑ ተወስኗል። ከዚያም የራስ-ነክ ጉዳቶች ከBLASTN (የቢቫልቭ NCBI የውሂብ ጎታ፣ e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) ጋር በማጣጣም ተለይተዋል። ከዚያም የራስ-ነክ ጉዳቶች ከBLASTN (የቢቫልቭ NCBI የውሂብ ጎታ፣ e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) ጋር በማጣጣም ተለይተዋል። Затем собственые контиги были идентифированы путем сопоставления с BLASTN значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. ከዚያም ለመጨረሻ ማብራሪያ ከBLASTN (የNCBI ባይቫልቭ ዳታቤዝ፣ የኢ እሴት <1e-10 እና 60% ተመሳሳይነት) ጋር በማዛመድ የራስ-ነክ በሽታዎች ተለይተዋል።ፍንዳታ（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。ፍንዳታ（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифированы собственные контиги ዳይ для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 እና гомология 60%). ከዚያም የራስ-ነክ ጉዳቶች ከBLASTN (የNCBI ባይቫልቭ ዳታቤዝ፣ የኢ እሴት <1e-10 እና 60% ተመሳሳይነት) ጋር በማዛመድ ለመጨረሻ ማብራሪያ ተለይተዋል። በተመሳሳይ ጊዜ፣ የራስ-ያልሆኑ የቡድን ግንኙነቶች በBLASTN (nt NCBI የውሂብ ጎታ፣ e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) ተብራርተዋል። በተመሳሳይ ጊዜ፣ የራስ-ያልሆኑ የቡድን ግንኙነቶች በBLASTN (nt NCBI የውሂብ ጎታ፣ e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) ተብራርተዋል። Параллельно чужеродные групповые контиги были анотированы с помощью BLASTN гомология 60%). በተመሳሳይ ጊዜ፣ የውጭ ቡድን ተያያዥ ጉዳዮች በBLASTN (የNT NCBI የውሂብ ጎታ፣ የe እሴት <1e-10 እና 60% ተመሳሳይነት) ተብራርተዋል።平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственой группе, были аннотированы с помощью BLASTN <1e-10 እና гомология 60%)። በተመሳሳይ ጊዜ፣ ራሳቸውን ያልቻሉ የቡድን ተያያዥ ጉዳዮች በBLASTN (nt NCBI የውሂብ ጎታ፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ተብራርተዋል። BLASTX እንዲሁ በ nr እና RefSeq ፕሮቲን NCBI የውሂብ ጎታዎች (e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በራስ-ሰር ባልሆኑ ግንኙነቶች ላይ ተካሂዷል። BLASTX እንዲሁ በ nr እና RefSeq ፕሮቲን NCBI የውሂብ ጎታዎች (e value < 1e−10 እና 60% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በራስ-ሰር ባልሆኑ ግንኙነቶች ላይ ተካሂዷል። BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигахс использованием баз данных белка nr እና RefSeq NCBI0 гомология 60%). BLASTX እንዲሁ በ nr እና RefSeq NCBI የፕሮቲን ዳታቤዞች (e value < 1e-10 እና 60% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በራስ-ሰር ባልሆኑ ኮንቲግስ ​​ላይ ተካሂዷል።还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧 BLASTX скачать видео - гомология 60%). BLASTX እንዲሁ በ nr እና RefSeq NCBI የፕሮቲን ዳታቤዞች (e value <1e-10 እና 60% ተመሳሳይነት) በመጠቀም በራስ-ሰር ባልሆኑ ኮንቲግስ ​​ላይ ተካሂዷል።የBLASTN እና የBLASTX ኳሶች ራሳቸውን የማይገፉ ጉንጮች የመጨረሻዎቹን ጉንጮች ይወክላሉ (ተጨማሪውን ፋይል ይመልከቱ)።
ለPCR ጥቅም ላይ የዋሉት ፕሪመሮች በሰንጠረዥ S1 ውስጥ ተዘርዝረዋል። ታክ ዲኤንኤ ፖሊመሬዝ (ባዮ ቤዚክ ካናዳ፣ ማርክሃም፣ ኦን) የccfDNA ኢላማ ጂኖችን ለማጉላት ጥቅም ላይ ውሏል። የሚከተሉት የምላሽ ሁኔታዎች ጥቅም ላይ ውለዋል፡ በ95°ሴ ለ3 ደቂቃዎች ዲናቱሬሽን፣ በ95°ሴ ለ1 ደቂቃ፣ በ1 ደቂቃ ውስጥ 95°ሴ የሙቀት መጠንን አዘጋጅ፣ በ72°ሴ ለ1 ደቂቃ ማራዘም፣ በ35 ዑደቶች እና በመጨረሻም በ10 ደቂቃዎች ውስጥ 72°ሴ። የPCR ምርቶች በ95 ቮልት SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen፣ Burlington፣ ON፣ ካናዳ) በያዙት በአጋሮዝ ጄሎች (1.5%) በኤሌክትሮፎረሲስ ተለያይተዋል።
ሙሰልስ (ማይቲለስ ስፕ.) በ500 ሚሊ ሊትር ኦክስጅን ያለው የባህር ውሃ (32 PSU) ለ24 ሰዓታት በ4°ሴ ውስጥ ተቀላቅለዋል። የሰው ጋሌክትን-7 cDNA ቅደም ተከተል (NCBI accession number L07769) የሚያስገባ ማስገቢያ የያዘው የፕላዝሚድ ዲ ኤን ኤ በመጨረሻው ክምችት 190 μg/μl ወደ ጠርሙሱ ተጨምሯል። ዲ ኤን ኤ ሳይጨመር በተመሳሳይ ሁኔታ ውስጥ የተተከሉ ሙሰልስ መቆጣጠሪያው ነበሩ። ሦስተኛው የመቆጣጠሪያ ታንክ ሙሰልስ የሌለው ዲ ኤን ኤ ይዟል። በባህር ውሃ ውስጥ ያለውን የዲ ኤን ኤ ጥራት ለመከታተል፣ የባህር ውሃ ናሙናዎች (20 μl፤ ሶስት ድግግሞሽ) ከእያንዳንዱ ታንክ በተጠቀሰው ጊዜ ተወስደዋል። ለፕላዝሚድ ዲ ኤን ኤ መከታተያ፣ የLB ሙሰልስ በተጠቀሱት ጊዜያት ተሰብስቦ በ qPCR እና ddPCR ተተነተነ። በባህር ውሃ ውስጥ ባለው ከፍተኛ የጨው ይዘት ምክንያት፣ ሁሉም የ PCR ምርመራዎች ከመደረጉ በፊት አልኮቶች በ PCR ጥራት ውሃ (1:10) ተቀልጠዋል።
ዲጂታል ጠብታ PCR (ddPCR) የተከናወነው በባዮራድ QX200 ፕሮቶኮል (ሚሲሳጉዋ፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) በመጠቀም ነው። የሙቀት መጠኑን በተሻለ ሁኔታ ለማወቅ የሙቀት መጠኑን ይጠቀሙ (ሠንጠረዥ S1)። ጠብታዎቹ የተፈጠሩት በQX200 ጠብታ ጀነሬተር (ባዮራድ) በመጠቀም ነው። ddPCR እንደሚከተለው ተካሂዷል፡- ለ5 ደቂቃ 95°ሴ፣ ለ30 ሰከንድ 50 ዑደቶች 95°ሴ እና ለ1 ደቂቃ 72°ሴ እና ለ30 ሰከንድ 72°ሴ፣ ለ5 ደቂቃ 4°ሴ እና ለ5 ደቂቃ 90°ሴ። የጠብታዎች ብዛት እና የአዎንታዊ ምላሾች (የቅጂዎች ብዛት/µl) በQX200 ጠብታ አንባቢ (ባዮራድ) በመጠቀም ተለክተዋል። ከ10,000 በታች ጠብታዎች ያላቸው ናሙናዎች ውድቅ ተደርገዋል። ddPCR በሚሰራበት ጊዜ ሁሉ የንድፍ ቁጥጥር አልተከናወነም።
qPCR የተከናወነው በRotor-Gene® 3000 (Corbet Research፣ ሲድኒ፣ አውስትራሊያ) እና በLGALS7 ልዩ ፕሪመሮች በመጠቀም ነው። ሁሉም የቁጥር PCRዎች በ20 µl በQuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) በመጠቀም ተከናውነዋል። qPCR የተጀመረው በ95°ሴ ለ15 ደቂቃ ኢንኩቤሽን ከዚያም በ95°ሴ ለ10 ሰከንዶች በ40 ዑደቶች እና በአንድ የውሂብ ስብስብ በ60°ሴ ለ60 ሰከንዶች ነው። የመቅለጥ ኩርባዎች የተፈጠሩት በተከታታይ መለኪያዎችን በመጠቀም በ95°ሴ ለ5 ሰከንዶች፣ በ65°ሴ ለ60 ሰከንዶች በ65°ሴ እና በqPCR መጨረሻ በ97°ሴ ነው። እያንዳንዱ qPCR ከሶስትዮሽ መለኪያዎች በስተቀር ከቁጥጥር ናሙናዎች በስተቀር ተከናውኗል።
ሙሰልስ በከፍተኛ የማጣሪያ ፍጥነታቸው የሚታወቁ በመሆናቸው፣ በመጀመሪያ በባህር ውሃ ውስጥ የሚገኙትን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ማጣራት እና ማቆየት ይችሉ እንደሆነ መርምረናል። እነዚህ ቁርጥራጮች በከፊል ክፍት በሆነው የሊምፋቲክ ሲስተም ውስጥ ይከማቹ እንደሆነ ለማወቅ ፍላጎት ነበረን። ይህንን ጉዳይ በሙከራ ፈትነን በሰማያዊ ሙሰል ታንኮች ውስጥ የተጨመሩትን የሚሟሟ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች እጣ ፈንታ በመከታተል ፈትነናል። የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን መከታተል ለማመቻቸት፣ የሰውን ጋሌክትን-7 ጂን የያዘ የውጭ (የራሱን ያልሆነ) የፕላዝሚድ ዲኤንኤ ተጠቅመናል። ddPCR በባህር ውሃ እና ሙሰልስ ውስጥ የፕላዝሚድ ዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ይከታተላል። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት በባህር ውሃ ውስጥ ያለው የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መጠን ሙሰልስ በሌለበት ጊዜ (እስከ 7 ቀናት) በአንጻራዊ ሁኔታ ቋሚ ሆኖ ከቀጠለ፣ ሙሰልስ ባለበት ጊዜ ይህ ደረጃ በ8 ሰዓታት ውስጥ ሙሉ በሙሉ ከሞላ ጎደል ጠፍቶ ነበር (ምስል 1a፣ለ)። የውጭ ዲኤንኤ ቁርጥራጮች በቫልቭል ፈሳሽ እና በሂሞሊምፍ ውስጥ በ15 ደቂቃ ውስጥ በቀላሉ ተገኝተዋል (ምስል 1ሐ)። እነዚህ ቁርጥራጮች ከተጋለጡ በኋላ እስከ 4 ሰዓታት ድረስ ሊገኙ ይችላሉ። ይህ ከዲኤንኤ ቁርጥራጮች ጋር በተያያዘ የማጣሪያ እንቅስቃሴ ከባክቴሪያ እና አልጌ የማጣሪያ እንቅስቃሴ ጋር ሊወዳደር ይችላል [31]። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት ሙሰልስ በፈሳሽ ክፍሎቻቸው ውስጥ የውጭ ዲ ኤን ኤ ማጣራት እና ማከማቸት ይችላል።
በባህር ውሃ ውስጥ የፕላዝሚድ ዲኤንኤ አንጻራዊ ክምችት በ ddPCR የሚለካው በባህር ውሃ ውስጥ የፕላዝሚድ ዲኤንኤ አንጻራዊ ክምችት (A) ወይም በሌለበት (B)፣ በ ddPCR ይለካል። በ A ውስጥ ውጤቶቹ እንደ መቶኛ ይገለፃሉ፣ የሳጥኖቹ ድንበሮች 75ኛ እና 25ኛ ፐርሰንታይሎችን ይወክላሉ። የተገጠመው ሎጋሪዝማዊ ኩርባ በቀይ ይታያል፣ እና በግራጫ የተሸፈነው ቦታ የ95% የመተማመን ክፍተትን ይወክላል። በ B ውስጥ፣ ቀይ መስመሩ አማካኝን ይወክላል እና ሰማያዊ መስመሩ ለማጎሪያው የ95% የመተማመን ክፍተትን ይወክላል። C የፕላዝሚድ ዲኤንኤ ከተጨመረ በኋላ በተለያዩ ጊዜያት በሙሰልስ ሄሞሊምፍ እና ቫልቭላር ፈሳሽ ውስጥ የፕላዝሚድ ዲኤንኤ ክምችት። ውጤቶቹ እንደ ፍፁም ቅጂዎች ተገኝተዋል/mL (±SE)።
ቀጥሎም፣ በከርጌለን ደሴቶች ላይ ከሚገኙት የሙሰል አልጋዎች የተሰበሰቡ ሙሰል ውስጥ የ ccfDNA አመጣጥን መርምረናል፤ እነዚህም ውስን የሰው ልጅ ተጽእኖ ያላቸው ሩቅ የደሴቶች ቡድን ናቸው። ለዚህ ዓላማ፣ ከሙሰል ሄሞሊምፍ የሚገኘው cccDNA የሰውን cccDNA ለማጽዳት በተለምዶ በሚጠቀሙባቸው ዘዴዎች ተለይቶ ተጠርጓል [32፣ 33]። በሙሰል ውስጥ ያለው አማካይ የሂሞሊፍ ccfDNA ክምችት በml ሄሞሊምፍ ክልል ውስጥ መሆኑን ደርሰንበታል (ሠንጠረዥ S2፣ ተጨማሪ መረጃ ይመልከቱ)። ይህ የክምችት ክልል ከጤናማ ሰዎች በጣም ትልቅ ነው (ዝቅተኛ ናኖግራም በአንድ ሚሊሊተር)፣ ነገር ግን አልፎ አልፎ፣ በካንሰር በሽተኞች ላይ፣ የ ccfDNA መጠን በአንድ ሚሊሊተር በርካታ ማይክሮግራም ሊደርስ ይችላል [34፣ 35]። የሂሞሊፍ ccfDNA መጠን ስርጭት ትንተና እንደሚያሳየው እነዚህ ቁርጥራጮች በመጠን ከ1000 bp እስከ 1000 bp. እስከ 5000 bp (ምስል 2) ድረስ ይለያያሉ። ተመሳሳይ ውጤቶች የተገኙት በሲሊካ ላይ የተመሠረተውን QIAamp Investigator Kit በመጠቀም ሲሆን ይህም በፎረንሲክ ሳይንስ ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው ዘዴ ሲሆን ይህም ccfDNA ን ጨምሮ ዝቅተኛ ክምችት ካለው የዲኤንኤ ናሙናዎች ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ በፍጥነት ለመለየት እና ለማጽዳት ነው [36]።
የሙሰል ሄሞሊምፍ ተወካይ የ ccfDNA ኤሌክትሮፎሬግራም። ከኒውክሊዮስናፕ ፕላዝማ ኪት (ከላይ) እና ከQIAamp የዲኤንኤ መርማሪ ኪት ጋር የተወሰደ። በሙሰል ውስጥ የሂሞሊምፍ ccfDNA ክምችት (±SE) ስርጭትን የሚያሳይ የቢ ቫዮሊን ሴራ። ጥቁር እና ቀይ መስመሮች መካከለኛ እና የመጀመሪያ እና ሶስተኛውን ኳርትቲልስ በቅደም ተከተል ይወክላሉ።
በሰውና በፕሪሚቶች ውስጥ በግምት 1% የሚሆነው የ ccfDNA የውጭ ምንጭ አለው [21፣ 37]። የቢቫልቭስ ከፊል ክፍት የደም ዝውውር ስርዓት፣ በማይክሮባላዊ የበለፀገ የባህር ውሃ እና የ mussel ccfDNA መጠን ስርጭትን ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የ mussel hemolymph ccfDNA የበለፀገ እና የተለያየ የማይክሮባላዊ ዲኤንኤ ክምችት ሊይዝ እንደሚችል ገምተናል። ይህንን መላምት ለመፈተሽ፣ ከከርጉለን ደሴቶች የተሰበሰቡትን የ oulacomya atra ናሙናዎችን በቅደም ተከተል አስቀምጠናል፣ ከ10 ሚሊዮን በላይ ንባቦችን አስገኝቷል፣ ከእነዚህም ውስጥ 97.6% የሚሆኑት የጥራት ቁጥጥርን አልፈዋል። ከዚያም ንባቦቹ በ BLASTN እና NCBI bivalve ዳታቤዞች (ምስል S1፣ ተጨማሪ መረጃ) በመጠቀም በራስ እና በራስ ባልሆኑ ምንጮች መሠረት ተመድበዋል።
በሰዎች ውስጥ፣ የኑክሌርም ሆነ የማይቶኮንድሪያል ዲኤንኤ ወደ ደም ስር ሊለቀቅ ይችላል [38]። ሆኖም፣ በዚህ ጥናት፣ የኤ. አትራ ጂኖም ቅደም ተከተል ወይም መግለጫ ስላልተደረገ፣ የሙሰልስን የኑክሌር ጂኖሚክ ዲኤንኤ በዝርዝር መግለጽ አልተቻለም። ሆኖም፣ የቢቫልቭ ቤተ-መጽሐፍትን በመጠቀም የራሳችንን መነሻ የሆኑ በርካታ የccfDNA ቁርጥራጮችን መለየት ችለናል (ምስል S2፣ ተጨማሪ መረጃ)። እንዲሁም በቅደም ተከተል የተቀመጡትን የኤ. አትራ ጂኖች በPCR ማጉላት የራሳችንን መነሻ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን አረጋግጠናል (ምስል 3)። በተመሳሳይ፣ የኤ. አትራ ሚቶኮንድሪያል ጂኖም በሕዝብ የውሂብ ጎታዎች ውስጥ ስለሚገኝ፣ በኤ. አትራ ሂሞሊምፍ ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ሲሲኤፍዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን የሚያሳይ ማስረጃ ማግኘት ይቻላል። የማይቶኮንድሪያል ዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖር በPCR ማጉላት ተረጋግጧል (ምስል 3)።
በ PCR በተጨመረው የኤ. አትራ (ቀይ ነጠብጣቦች - የአክሲዮን ቁጥር፡ SRX5705969) እና ኤም. ፕላቴንሲስ (ሰማያዊ ነጠብጣቦች - የአክሲዮን ቁጥር፡ SRX5705968) ሄሞሊምፍ ውስጥ የተለያዩ ሚቶኮንድሪያል ጂኖች ተገኝተዋል። ምስል ከ Breton et al., 2011 B የሄሞሊምፍ ሱፐርናታንት ማጉላት ከኤ. አትራ በFTA ወረቀት ላይ ተከማችቷል። የPCR ድብልቅን ወደያዘው የPCR ቱቦ በቀጥታ ለመጨመር 3 ሚሜ የሆነ ጡጫ ይጠቀሙ።
በባህር ውሃ ውስጥ ያለውን የተትረፈረፈ የማይክሮባላዊ ይዘት ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ መጀመሪያ ላይ በሂሞሊምፍ ውስጥ የማይክሮባላዊ ዲኤንኤ ቅደም ተከተሎችን በመለየት ላይ አተኩረናል። ይህንን ለማድረግ ሁለት የተለያዩ ስልቶችን እንጠቀማለን። የመጀመሪያው ስትራቴጂ ከBLAST እና ከሌሎች መሳሪያዎች ጋር በሚመሳሰል ትክክለኛነት የማይክሮባላዊ ቅደም ተከተሎችን መለየት የሚችል ክራከን2 የተባለውን በአልጎሪዝም ላይ የተመሠረተ የቅደም ተከተል ምደባ ፕሮግራም ተጠቅሟል [28]። ከ6719 በላይ ንባቦች የባክቴሪያ መነሻ እንደሆኑ ተወስኗል፣ 124 እና 64 ደግሞ ከአርኬያ እና ከቫይረሶች የተገኙ ናቸው (ምስል 4)። በጣም በብዛት የሚገኙት የባክቴሪያ ዲኤንኤ ቁርጥራጮች ፈርሚኩቴስ (46%)፣ ፕሮቲዮባክቴሪያ (27%) እና ባክቴሮይድቴስ (17%) ነበሩ (ምስል 4ሀ)። ይህ ስርጭት ከቀደምት የባህር ሰማያዊ ሙሰል ማይክሮባዮም ጥናቶች ጋር የሚጣጣም ነው [39፣ 40]። ጋማፕሮቴኦባክቴሪያዎች የፕሮቲዮባክቴሪያ ዋና ክፍል (44%) ነበሩ፣ ብዙ ቪብሪዮናሌስን ጨምሮ (ምስል 4ለ)። የዲዲፒሲአር ዘዴ በኤ. አትራ ሄሞሊምፍ (ccfDNA) ccfDNA ውስጥ የቪብሪዮ ​​ዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን አረጋግጧል (ምስል 4ሐ) [41]። ስለ ccfDNA የባክቴሪያ አመጣጥ ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት፣ ተጨማሪ አቀራረብ ተወስዷል (ምስል S2፣ ተጨማሪ መረጃ)። በዚህ ሁኔታ፣ የተደራረቡ ንባቦች እንደ ጥንድ-ጫፍ ንባቦች ተሰብስበዋል እና በBLASTN እና 1e−3 የሆነ የኢ እሴት እና ከ90% ተመሳሳይነት ጋር የተቆራረጠ የሴፍ (የራስ-አልባ) ወይም የራስ-አልባ አመጣጥ ተብለው ተመድበዋል። በዚህ ሁኔታ፣ የተደራረቡ ንባቦች እንደ ጥንድ-ጫፍ ንባቦች ተሰብስበዋል እና በBLASTN እና 1e−3 የሆነ የኢ እሴት እና ከ90% ተመሳሳይነት ጋር የተቆራረጠ የሴፍ (የራስ-አልባ) ወይም የራስ-አልባ አመጣጥ ተብለው ተመድበዋል። В этом слайче прекрывиеся чтеኒያ ቢሊ ሶብራንይ ካንቺ ቺቺንያ (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсогомой. በዚህ ሁኔታ፣ ተደራራቢ ንባቦች እንደ ጥንድ-ጫፍ ንባቦች የተሰበሰቡ ሲሆን በBLASTN እና በ1e-3 የኢ እሴት እና በ>90% ተመሳሳይነት በመጠቀም እንደ ተወላጅ (ቢቫልቭ) ወይም ኦሪጅናል ያልሆነ ተመድበዋል።在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 Facebook 上。 如要連結 使用 使用 使用 blastn 倌用 Blann 倌% 1e同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 В этом слайче прекрывиеся чтыnya byly ሶብራንይ ካንቺ ቼይንስ (двустворчатые моллюски) ወይም 1e-3% 9. በዚህ ሁኔታ፣ ተደራራቢ ንባቦች እንደ ጥንድ-ጫፍ ንባቦች ተሰብስበው በ e BLASTN እና 1e-3 እሴቶች ​​እና ከ90% በላይ በሆነ ተመሳሳይነት ገደብ በመጠቀም እንደ የራስ (ቢቫልቭስ) ወይም ኦሪጅናል ያልሆነ ተመድበዋል።የኤ. አትራ ጂኖም እስካሁን ቅደም ተከተል ስላልተሰጠ፣ የሜጋሂት ቀጣይ ትውልድ ቅደም ተከተል (NGS) አሰባሳቢ የዴ ኖቮ አሰባሳቢ ስትራቴጂን ተጠቅመናል። በአጠቃላይ 147,188 ኮንቲጎች የመነሻ ጥገኛ (ቢቫልቭስ) እንደሆኑ ተለይተዋል። ከዚያም እነዚህ ኮንቲጎች በBLASTN እና BLASTX በመጠቀም በ1e-10 ኢ-እሴሎች ተፈነዱ። ይህ ስትራቴጂ በኤ. አትራ ccfDNA ውስጥ የሚገኙ 482 ባይቫልቭ ያልሆኑ ቁርጥራጮችን ለመለየት አስችሎናል። ከእነዚህ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ውስጥ ከግማሽ በላይ (57%) የሚሆኑት የተገኙት ከባክቴሪያ ሲሆን በዋናነት ከጂል ሲምቢዮንትስ፣ ሰልፎትሮፊክ ሲምቢዮንትስን ጨምሮ፣ እና ከጂል ሲምቢዮንትስ ሶሌሚያ ቬለም (ምስል 5) ነው።
በዓይነት ደረጃ አንጻራዊ ብዛት። ለ የሁለት ዋና ዋና ፊላዎች (ፈርሚኩቴስ እና ፕሮቲኦባክቴሪያ) የማይክሮቢያል ልዩነት። የ ddPCR C Vibrio spp. ተወካይ ማጉላት። A. በሦስት የአትራ ሂሞሊምፍ ውስጥ የ16S rRNA ጂን (ሰማያዊ) ቁርጥራጮች።
በአጠቃላይ 482 የተሰበሰቡ ኮንቲጎች ተተነተኑ። የሜታጀኖሚክ ኮንቲግ ማብራሪያዎች (ፕሮካርዮትስ እና ዩካርዮትስ) የታክሶኖሚክ ስርጭት አጠቃላይ መገለጫ። ለ በBLASTN እና BLASTX የተለዩ የባክቴሪያ ዲኤንኤ ቁርጥራጮች ዝርዝር ስርጭት።
የክራከን2 ትንተና እንደሚያሳየው የሙሰል ሲሲኤፍዲኤንኤ የአርኬያል ዲኤንኤ ቁርጥራጮችን እንደያዘ አሳይቷል፣ ይህም የዩርቻኦታ (65%)፣ የክሬናርቻኦታ (24%) እና የታውርማርቻኦታ (11%) የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን (ምስል 6a) ያካትታል። ቀደም ሲል በካሊፎርኒያ ሙሰልስ ማይክሮባላዊ ማህበረሰብ ውስጥ ከሚገኙት ከዩርቻኦታ እና ከክሬናርቻኦታ የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸው አስገራሚ መሆን የለበትም [42]። ምንም እንኳን ዩርቻኦታ ብዙውን ጊዜ ከከባድ ሁኔታዎች ጋር የተቆራኘ ቢሆንም፣ ሁለቱም ዩርቻኦታ እና ክሬናርቻኦታ በባህር ክሪዮጀኒክ አካባቢ ውስጥ በጣም የተለመዱ ፕሮካርዮቶች መካከል እንደሆኑ አሁን ተረጋግጧል [43፣ 44]። በቅርብ ጊዜ በከርጌለን ፕላቱ ላይ ካለው የታችኛው ፍሳሽ ሰፊ የሜቴን መፍሰስ እና በከርጌለን ደሴቶች የባህር ዳርቻ ላይ ሊታዩ የሚችሉ ማይክሮባላዊ ሚቴን ማምረት ሪፖርቶችን ከግምት ውስጥ በማስገባት በሙሰልስ ውስጥ የሜታኖጂኒክ ረቂቅ ተሕዋስያን መኖር አያስደንቅም [45]።
ከዚያም ትኩረታችን ከዲኤንኤ ቫይረሶች ወደተወሰዱ ንባቦች ተዛወረ። እስከምናውቀው ድረስ፣ ይህ የሙሰልስ የቫይረስ ይዘት የመጀመሪያ ኢላማ የሌለው ጥናት ነው። እንደተጠበቀው፣ የባክቴሪዮፋጅስ (ካውዶቫይሬልስ) የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን አግኝተናል (ምስል 6ለ)። ሆኖም፣ በጣም የተለመደው የቫይረስ ዲኤንኤ የሚመጣው ከኑክሊዮሳይቶቫይረሶች ፊለም ሲሆን፣ የኑክሌር ሳይቶፕላዝም ትልቅ ዲኤንኤ ቫይረስ (NCLDV) በመባልም ይታወቃል፣ እሱም ከማንኛውም ቫይረስ ትልቁ ጂኖም አለው። በዚህ ፊለም ውስጥ፣ አብዛኛዎቹ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎች የሚሚሚዶቪሪዳ (58%) እና ፖክስቪሪዳኢ (21%) ቤተሰቦች ሲሆኑ፣ ተፈጥሯዊ አስተናጋጆቻቸው የጀርባ አጥንት እና የአርትሮፖዶችን ያካትታሉ፣ ከእነዚህ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎች ውስጥ አነስተኛ ድርሻ የሚታወቁ የቫይሮሎጂ አልጌዎች ናቸው። የባህር ኢኩሪዮቲክ አልጌዎችን ያጠቃል። ቅደም ተከተሎቹ የተገኙት ከማንኛውም የቫይረስ ዝርያ ትልቁን የጂኖም መጠን ካለው ግዙፍ ቫይረስ፣ ከፓንዶራ ቫይረስ ነው። የሚገርመው ነገር፣ በሄሞሊምፍ ccfDNA ቅደም ተከተል እንደተወሰነው በቫይረሱ ​​እንደተያዙ የሚታወቁት የአስተናጋጆች ክልል በአንጻራዊ ሁኔታ ትልቅ ነበር (ምስል S3፣ ተጨማሪ መረጃ)። እንደ ባኩሎቪሪዳ እና ኢሪዶቪሪዳ ያሉ ነፍሳትን የሚያጠቁ ቫይረሶችን እንዲሁም አሞኢባ፣ አልጌ እና አከርካሪዎችን የሚያጠቁ ቫይረሶችን ያካትታል። እንዲሁም ከፒቶቫይረስ ሲቤሪኩም ጂኖም ጋር የሚዛመዱ ቅደም ተከተሎችን አግኝተናል። ፒቶቫይረሶች (“ዞምቢ ቫይረሶች” በመባልም ይታወቃሉ) ለመጀመሪያ ጊዜ በሳይቤሪያ ከ30,000 ዓመት ዕድሜ ካለው ፐርማፍሮስት ተለይተዋል [47]። ስለዚህ፣ ውጤቶቻችን ቀደም ሲል ከተዘገቡት ሪፖርቶች ጋር የሚጣጣሙ ናቸው፣ እነዚህ ቫይረሶች ሁሉም ዘመናዊ ዝርያዎች አልጠፉም [48] እና እነዚህ ቫይረሶች በርቀት በሚገኙ የባህር ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ ሊኖሩ ይችላሉ።
በመጨረሻም፣ ከሌሎች ባለብዙ ሴሉላር እንስሳት የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ማግኘት እንችል እንደሆነ ለማየት ሞክረናል። በBLASTN እና BLASTX በ nt፣ nr እና RefSeq ቤተ-መጻሕፍት (ጂኖሚክ እና ፕሮቲን) በድምሩ 482 የውጭ ኮንቲግሶች ተለይተዋል። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት ባለብዙ ሴሉላር እንስሳት የ ccfDNA የውጭ ቁርጥራጮች መካከል የአጥንት አጥንቶች ዲኤንኤ በብዛት ይገኛሉ (ምስል 5)። ከነፍሳት እና ከሌሎች ዝርያዎች የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችም ተገኝተዋል። በአንጻራዊ ሁኔታ ሲታይ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች አልታወቁም፣ ምናልባትም ከምድራዊ ዝርያዎች ጋር ሲነጻጸር በጂኖሚክ የውሂብ ጎታዎች ውስጥ ብዙ የባህር ዝርያዎች በቂ ውክልና ባለመኖራቸው ምክንያት ሊሆን ይችላል [49]።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ የኤልቢ ፅንሰ-ሀሳብን ለሙሰልስ እንተገብራለን፣ የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍዲኤንኤ ሾት ሴኩዌንሲንግ የባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮችን ስብጥር ግንዛቤ ሊሰጥ እንደሚችል በመግለጽ። በተለይም፣ 1) የሙሰል ሄሞሊምፍ በአንጻራዊ ሁኔታ ከፍተኛ (~1-5 ኪ.ባ.) የሚዘዋወሩ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን በአንጻራዊ ሁኔታ ከፍተኛ ክምችት (ማይክሮግራም ደረጃዎች) ይይዛል፤ 2) እነዚህ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ገለልተኛ እና ገለልተኛ ያልሆኑ ናቸው 3) ከእነዚህ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች የውጭ ምንጮች መካከል፣ የባክቴሪያ፣ የአርኬያል እና የቫይረስ ዲኤንኤ እንዲሁም የሌሎች ባለብዙ ሴል እንስሳት ዲኤንኤ አግኝተናል፤ 4) የእነዚህ የውጭ ሲሲኤፍዲኤንኤ ቁርጥራጮች በሂሞሊምፍ ውስጥ መከማቸት በፍጥነት የሚከሰት እና ለሙሰልስ ውስጣዊ የማጣሪያ እንቅስቃሴ አስተዋጽኦ ያደርጋል። በማጠቃለያ፣ ጥናታችን እስካሁን ድረስ በዋናነት በባዮሜዲስን መስክ የተተገበረው የኤልቢ ፅንሰ-ሀሳብ የሴንቲነል ዝርያዎችን እና አካባቢያቸውን መስተጋብር በተሻለ ሁኔታ ለመረዳት ሊያገለግል የሚችል የበለፀገ ግን ያልተመረመረ የእውቀት ምንጭን እንደሚያመለክት ያሳያል።
ከፕሪሜቶች በተጨማሪ፣ የ ccfDNA ማግለል በአጥቢ እንስሳት ላይ ሪፖርት ተደርጓል፣ አይጦች፣ ውሾች፣ ድመቶች እና ፈረሶች [50፣ 51፣ 52]። ሆኖም፣ እስከምናውቀው ድረስ፣ ጥናታችን በባህር ዝርያዎች ውስጥ በክፍት የደም ዝውውር ስርዓት ውስጥ የ ccfDNA መገኘት እና ቅደም ተከተል ሪፖርት ያደረገው የመጀመሪያው ነው። ይህ የአናቶሚካል ባህሪ እና የሙሰል የማጣራት ችሎታ፣ ቢያንስ በከፊል፣ ከሌሎች ዝርያዎች ጋር ሲነጻጸር የሚዘዋወሩ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን የተለያዩ የመጠን ባህሪያትን ሊያብራራ ይችላል። በሰዎች ውስጥ፣ በደም ውስጥ የሚዘዋወሩት አብዛኛዎቹ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ከ150 እስከ 200 bp የሚደርሱ ትናንሽ ቁርጥራጮች ሲሆኑ ከፍተኛው 167 bp ጫፍ [34፣ 53] ነው። ትንሽ ግን ጉልህ የሆነ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መጠን ከ300 እስከ 500 bp ሲሆን፣ ወደ 5% የሚሆኑት ደግሞ ከ900 bp ይረዝማሉ። [54]። የዚህ የመጠን ስርጭት ምክንያት በፕላዝማ ውስጥ ያለው የ ccfDNA ዋና ምንጭ የሚከሰተው በሴል ሞት ምክንያት ነው፣ ወይ በሴል ሞት ምክንያት ወይም በጤናማ ግለሰቦች ላይ በሚዘዋወሩ የሂማቶፖይቲክ ሴሎች ኒክሮሲስ ወይም በካንሰር በሽተኞች ላይ በሚዘዋወሩ የቲሞር ሴሎች አፖፕቶሲስ ምክንያት (የሚዘዋወሩ የቲሞር ዲኤንኤ በመባል የሚታወቀው)። በሙሰልስ ውስጥ ያገኘነው የሂሞሊምፍ ccfDNA መጠን ስርጭት ከ1000 እስከ 5000 ቢፒ ይደርሳል፣ ይህም የ mussel ccfDNA የተለየ መነሻ እንዳለው ይጠቁማል። ይህ ምክንያታዊ መላምት ነው፣ ምክንያቱም ሙሰልስ ከፊል ክፍት የሆነ የደም ሥር ስርዓት ስላላቸው እና ከፍተኛ የማይክሮባላዊ ጂኖሚክ ዲኤንኤ ክምችት ባላቸው የባህር ውሃ አካባቢዎች ስለሚኖሩ። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ ውጫዊ ዲኤንኤ በመጠቀም የላብራቶሪ ሙከራዎቻችን እንደሚያሳዩት ሙሰልስ በባህር ውሃ ውስጥ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ያከማቻል፣ ቢያንስ ከጥቂት ሰዓታት በኋላ ሴሉላር ከተወሰደ እና/ወይም ከተለቀቁ እና/ወይም በተለያዩ ድርጅቶች ውስጥ ከተከማቹ በኋላ ይበላሻሉ። የሴሎች ብርቅነት (ፕሮካርዮቲክ እና ዩካሪዮቲክ) ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የውስጥ ቫልቭ ክፍሎች አጠቃቀም የ ccfDNA መጠንን ከራስ ምንጮችም ሆነ ከውጭ ምንጮች ይቀንሳል። የቢቫልቭ ተፈጥሯዊ የበሽታ መከላከያ አስፈላጊነትን እና ብዙ የሚዘዋወሩ ፋጎሳይቶችን አስፈላጊነት ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የውጭ ሲሲኤፍዲኤንኤ እንኳን ረቂቅ ተሕዋስያን እና/ወይም የሴሉላር ፍርስራሾችን ሲመገቡ የውጭ ዲኤንኤ በሚያከማቹ በሚዘዋወሩ ፋጎሳይቶች የበለፀገ መሆኑን በተጨማሪ ገምተናል። አንድ ላይ ሲጠቃለል፣ ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት ቢቫልቭ ሂሞሊምፍ ሲሲኤፍዲኤንኤ የሞለኪውላር መረጃ ልዩ ማከማቻ እና እንደ ሴንቲነል ዝርያ ያላቸውን ሁኔታ ያጠናክራል።
መረጃዎቻችን እንደሚያሳዩት በባክቴሪያ የተገኙ የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍዲኤንኤ ቁርጥራጮች ቅደም ተከተል እና ትንተና ስለ አስተናጋጁ የባክቴሪያ እፅዋት እና በዙሪያው ባለው የባህር ሥነ-ምህዳር ውስጥ ስለሚገኙት ባክቴሪያዎች ቁልፍ መረጃ ሊሰጡ ይችላሉ። የተኩስ ቅደም ተከተል ቴክኒኮች የተለመዱ የ16S rRNA መለያ ዘዴዎች ጥቅም ላይ ቢውሉ ኖሮ የማይታለፉ የኮሜንሳል ባክቴሪያ ኤ. አትራ ጊል ቅደም ተከተሎችን አሳይተዋል፣ ይህም በከፊል በማጣቀሻ ቤተ-መጽሐፍት አድልዎ ምክንያት ነው። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ በኬርጌለን በተመሳሳይ የሙሰል ሽፋን ውስጥ ከኤም. ፕላቴንሲስ የተሰበሰበው የLB መረጃ አጠቃቀማችን ከጊል ጋር የተያያዙ የባክቴሪያ ሲምቢዮንትስ ስብጥር ለሁለቱም የሙሰል ዝርያዎች ተመሳሳይ መሆኑን አሳይቷል (ምስል S4፣ ተጨማሪ መረጃ)። ይህ የሁለት በጄኔቲክ የተለያዩ ሙሰልስ ተመሳሳይነት በኬርጌለን ቀዝቃዛ፣ ሰልፈር እና የእሳተ ገሞራ ክምችት ውስጥ የባክቴሪያ ማህበረሰቦችን ስብጥር ሊያንፀባርቅ ይችላል [55፣ 56፣ 57፣ 58]። እንደ ፖርት-ኦ-ፈረንሳይ የባህር ዳርቻ ካሉ ባዮተርቡብ የባህር ዳርቻ አካባቢዎች ሙስልቶችን ሲሰበስቡ ከፍተኛ የሰልፈር-መቀነስ ረቂቅ ተሕዋስያን ደረጃዎች በሚገባ ተገልጸዋል። ሌላው አማራጭ የኮመንሳል ሙሰል ፍሎራ በአግድም ስርጭት ሊጎዳ ይችላል [60፣ 61]። በባህር አካባቢ፣ በባህር ወለል ወለል እና በሙሰል ውስጥ ባሉ የሲምባዮቲክ ባክቴሪያ ስብጥር መካከል ያለውን ትስስር ለማወቅ ተጨማሪ ምርምር ያስፈልጋል። እነዚህ ጥናቶች በአሁኑ ጊዜ በመካሄድ ላይ ናቸው።
የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍዲኤንኤ ርዝመት እና ክምችት፣ የማጽዳት ቀላልነቱ እና ፈጣን የሻምበል ቅደም ተከተል እንዲኖር የሚያስችል ከፍተኛ ጥራት ያለው መሆኑ በባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ ያለውን የብዝሃ ሕይወት ለመገምገም የሙሰል ሲሲኤፍዲኤንኤን መጠቀም ከሚያስገኛቸው በርካታ ጥቅሞች መካከል ጥቂቶቹ ናቸው። ይህ አካሄድ በተለይ በተወሰነ ሥነ-ምህዳር ውስጥ የቫይረስ ማህበረሰቦችን (ቫይሮሞችን) ለመለየት ውጤታማ ነው [62፣ 63]። ከባክቴሪያ፣ አርኬያ እና ዩካርዮትስ በተለየ መልኩ የቫይረስ ጂኖሞች እንደ 16S ቅደም ተከተሎች ያሉ ፊሎጄኔቲክ የተጠበቁ ጂኖችን አልያዙም። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት እንደ ሙሰል ካሉ አመላካች ዝርያዎች የሚመነጩ ፈሳሽ ባዮፕሲዎች በተለምዶ በባህር ዳርቻ የባህር ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ የሚኖሩ አስተናጋጆችን እንደሚያጠቁ የሚታወቁ በአንጻራዊ ሁኔታ ከፍተኛ ቁጥር ያላቸውን የ ccfDNA ቫይረስ ቁርጥራጮችን ለመለየት ሊያገለግሉ ይችላሉ። ይህም ፕሮቶዞአ፣ አርትሮፖድስ፣ ነፍሳት፣ ተክሎች እና የባክቴሪያ ቫይረሶችን (ለምሳሌ፣ ባክቴሪዮፋጅስ) እንደሚይዙ የሚታወቁ ቫይረሶችን ያጠቃልላል። በከርጉሌን በተመሳሳይ የሙሰል ሽፋን ውስጥ የተሰበሰቡትን የሰማያዊ ሙሰል (ኤም. ፕላቴንሲስ) ሄሞሊምፍ ccfDNA ቫይሮምን ስንመረምር ተመሳሳይ ስርጭት ተገኝቷል (ሠንጠረዥ S2፣ ተጨማሪ መረጃ)። የccfDNA ሾትጉንግ ቅደም ተከተል በእርግጥ በሰዎች ወይም በሌሎች ዝርያዎች ቫይሮም ጥናት ውስጥ እየጨመረ የሚሄድ አዲስ አቀራረብ ነው [21፣ 37፣ 64]። ይህ አካሄድ በተለይ ድርብ-ክር የሆኑ የዲኤንኤ ቫይረሶችን ለማጥናት ጠቃሚ ነው፣ ምክንያቱም በባልቲሞር ውስጥ በጣም የተለያዩ እና ሰፊ የሆኑ የቫይረሶችን ክፍል የሚወክል አንድም ጂን የለም። ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ እነዚህ ቫይረሶች ያልተመደቡ ሆነው የሚቀሩ እና ሙሉ በሙሉ ከማይታወቅ የቫይረስ ዓለም ክፍል የመጡ ቫይረሶችን ሊያካትቱ ቢችሉም [66]፣ የሙሰል ኤ. አትራ እና ኤም. ፕላቴንሲስ ቫይሮሞች እና የአስተናጋጅ ክልሎች በሁለቱ ዝርያዎች መካከል እንደሚወድቁ ደርሰንበታል። በተመሳሳይ (ምስል S3፣ ተጨማሪ መረጃ ይመልከቱ)። ይህ ተመሳሳይነት የሚያስደንቅ አይደለም፣ ምክንያቱም በአካባቢው ውስጥ ያለውን ዲኤንኤ በመምጠጥ ረገድ የመምረጥ እጥረትን ሊያንፀባርቅ ይችላል። የRNA ቫይረስን ለመለየት በአሁኑ ጊዜ የተጣራ አር ኤን ኤ በመጠቀም የወደፊት ጥናቶች ያስፈልጋሉ።
በጥናታችን ውስጥ፣ ከኮዋርስኪ እና ከባልደረቦቻችን [37] ሥራ የተወሰደ በጣም ጥብቅ የሆነ የቧንቧ መስመር ተጠቅመናል፣ እነሱም የአካባቢው ccfDNA ከመሰብሰባቸው በፊት እና በኋላ የተዋሃዱ ንባቦችን እና ኮንቲጎችን ሁለት ደረጃ መሰረዝ ተጠቅመዋል፣ ይህም ከፍተኛ መጠን ያለው ያልተቀረጹ ንባቦችን አስከትሏል። ስለዚህ፣ ከእነዚህ ያልተቀረጹ ንባቦች መካከል አንዳንዶቹ የራሳቸው መነሻ ሊኖራቸው እንደሚችል ማስወገድ አንችልም፣ በዋነኝነት ለዚህ የሙሰል ዝርያ የማጣቀሻ ጂኖም ስለሌለን። ይህንን የቧንቧ መስመር ተጠቅመን በራስ እና በራስ ባልሆኑ ንባቦች እና በኢሉሚና ሚሴክ PE75 የሚመነጩት የንባብ ርዝመቶች መካከል ስላለው ቺሜራ ስጋት ስለነበረን ይህንን የቧንቧ መስመር ተጠቅመናል። ለአብዛኛዎቹ ያልተቀረጹ ንባቦች ምክንያት አብዛኛው የባህር ማይክሮቦች፣ በተለይም እንደ ኬርጌለን ባሉ ሩቅ አካባቢዎች፣ አልተገለጹም የሚለው ነው። ኢሉሚና ሚሴክ PE75ን ተጠቅመናል፣ የccfDNA ቁራጭ ርዝመቶች ከሰው ccfDNA ጋር ተመሳሳይ እንደሆኑ አድርገን እንገምታለን። ለወደፊት ጥናቶች፣ የሂሞሊምፍ ccfDNA ከሰዎች እና/ወይም ከአጥቢ ​​እንስሳት የበለጠ ረዘም ያለ ንባቦች እንዳሉት የሚያሳዩ ውጤቶቻችንን ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ ለረጅም ጊዜ የccfDNA ቁርጥራጮች የበለጠ ተስማሚ የሆነ የቅደም ተከተል መድረክ እንዲጠቀሙ እንመክራለን። ይህ ልምምድ ለበለጠ ጥልቅ ትንተና ተጨማሪ አመላካቾችን ለመለየት በጣም ቀላል ያደርገዋል። በአሁኑ ጊዜ የማይገኘውን የተሟላ የኤ. አትራ ኒውክሊየር ጂኖም ቅደም ተከተል ማግኘት የ ccfDNAን ከራስ እና ከራስ ካልሆኑ ምንጮች ለይቶ ማግለልን በእጅጉ ያመቻቻል። ጥናታችን የፈሳሽ ባዮፕሲ ጽንሰ-ሀሳብን በሙሰል ላይ የመተግበር እድል ላይ ያተኮረ በመሆኑ፣ ይህ ጽንሰ-ሀሳብ ወደፊት በሚደረጉ ጥናቶች ውስጥ ጥቅም ላይ ስለሚውል፣ ይህ ዘዴ የሙሰልስን የማይክሮባላዊ ልዩነት ለማጥናት ያለውን አቅም ለማሳደግ አዳዲስ መሳሪያዎች እና የቧንቧ መስመሮች እንደሚዘጋጁ ተስፋ እናደርጋለን። የባህር ሥነ-ምህዳር።
እንደ ወራሪ ያልሆነ ክሊኒካዊ ባዮማርከር፣ የሰው ልጅ የፕላዝማ መጠን መጨመር ከተለያዩ በሽታዎች፣ ከቲሹ ጉዳት እና ከጭንቀት ሁኔታዎች ጋር የተቆራኘ ነው [67,68,69]። ይህ ጭማሪ ከቲሹ ጉዳት በኋላ የራሱ የሆነ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ከመልቀቃቸው ጋር የተያያዘ ነው። ይህንን ጉዳይ አጣዳፊ የሙቀት ጭንቀትን በመጠቀም ተወያይተናል፣ በዚህ ውስጥ ሙሰል ለአጭር ጊዜ ለ30°ሴ የሙቀት መጠን ተጋልጠዋል። ይህንን ትንተና በሦስት ገለልተኛ ሙከራዎች በሦስት የተለያዩ የሙሰል ዓይነቶች ላይ አድርገናል። ሆኖም፣ ከከባድ የሙቀት ጭንቀት በኋላ በ ccfDNA ደረጃዎች ላይ ምንም ለውጥ አላገኘንም (ምስል S5፣ ተጨማሪ መረጃ ይመልከቱ)። ይህ ግኝት ቢያንስ በከፊል፣ ሙሰል በከፊል ክፍት የሆነ የደም ዝውውር ስርዓት እንዳላቸው እና በከፍተኛ የማጣሪያ እንቅስቃሴያቸው ምክንያት ከፍተኛ መጠን ያለው የውጭ ዲኤንኤ እንደሚከማች ሊያብራራ ይችላል። በሌላ በኩል፣ ሙሰል፣ ልክ እንደ ብዙ ኢንቬርቴብሬትስ፣ ለጭንቀት ምክንያት ለሚመጣ የቲሹ ጉዳት የበለጠ የመቋቋም ችሎታ ሊኖራቸው ይችላል፣ በዚህም በሂሞሊምፍ ውስጥ የ ccfDNA መልቀቅን ይገድባል [70፣ 71]።
እስካሁን ድረስ፣ በውሃ ውስጥ ባሉ ሥነ-ምህዳሮች ውስጥ የብዝሃ ሕይወት ዲኤንኤ ትንተና በዋናነት በአካባቢ ዲኤንኤ (eDNA) ሜታባርኮዲንግ ላይ ያተኮረ ነው። ሆኖም፣ ይህ ዘዴ ብዙውን ጊዜ ፕሪመሮች ጥቅም ላይ ሲውሉ በብዝሃ ሕይወት ትንተና ውስጥ የተገደበ ነው። የሻንጋይ ቅደም ተከተል አጠቃቀም የPCR ገደቦችን እና የፕሪመር ስብስቦችን አድሏዊ ምርጫን ያልፋል። ስለዚህ፣ በአንድ መልኩ፣ ዘዴያችን በቅርብ ጊዜ ጥቅም ላይ ከዋለው ከፍተኛ-ፍጥነት eDNA Shotgun ቅደም ተከተል ዘዴ ጋር ቅርብ ነው፣ ይህም የተከፋፈለ ዲኤንኤ በቀጥታ ቅደም ተከተል ማድረግ እና ሁሉንም ማለት ይቻላል ህዋሳት መተንተን የሚችል ነው [72፣ 73]። ሆኖም፣ LBን ከመደበኛ eDNA ዘዴዎች የሚለዩ በርካታ መሠረታዊ ጉዳዮች አሉ። እርግጥ ነው፣ በ eDNA እና LB መካከል ያለው ዋና ልዩነት የተፈጥሮ ማጣሪያ አስተናጋጆችን መጠቀም ነው። እንደ ስፖንጅ እና ቢቫልቭስ (ድሬሴና ስፕ.) ያሉ የባህር ዝርያዎችን እንደ eDNA ለማጥናት እንደ ተፈጥሯዊ ማጣሪያ መጠቀም [74፣ 75] ተዘግቧል። ሆኖም፣ የድሬሴና ጥናት ዲኤንኤ የተወጣባቸውን የቲሹ ባዮፕሲዎችን ተጠቅሟል። ከኤልቢ የ ccfDNA ትንተና የቲሹ ባዮፕሲ፣ ከ eDNA ወይም ከቲሹ ባዮፕሲ ጋር የተያያዙ ልዩ እና አንዳንድ ጊዜ ውድ የሆኑ መሳሪያዎች እና ሎጂስቲክስ አያስፈልገውም። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ በቅርብ ጊዜ ከኤልቢ የ ccfDNA ቀዝቃዛ ሰንሰለት ሳይጠብቅ በኤፍቲኤ ድጋፍ ሊከማች እና ሊተነተን እንደሚችል ሪፖርት አድርገናል፣ ይህም በሩቅ አካባቢዎች ለሚደረጉ ጥናቶች ትልቅ ፈተና ነው [76]። የ ccfDNA ከፈሳሽ ባዮፕሲዎች ማውጣትም ቀላል እና ለሾትገን ቅደም ተከተል እና ለ PCR ትንተና ከፍተኛ ጥራት ያለው ዲኤንኤ ይሰጣል። ይህ ከ eDNA ትንተና ጋር የተያያዙ አንዳንድ ቴክኒካዊ ገደቦችን ከግምት ውስጥ በማስገባት ትልቅ ጥቅም ነው [77]። የናሙና ዘዴው ቀላልነት እና ዝቅተኛ ዋጋ በተለይ ለረጅም ጊዜ የክትትል ፕሮግራሞች ተስማሚ ነው። ከከፍተኛ የማጣሪያ ችሎታቸው በተጨማሪ፣ የቢቫልቭስ ሌላው የታወቀ ባህሪ የንፋሳቸው ኬሚካል mucopolysaccharide ስብጥር ሲሆን ይህም የቫይረሶችን መምጠጥ ያበረታታል [78፣ 79]። ይህ ቢልቫልቭስን ባዮሎጂያዊ ልዩነትን እና የአየር ንብረት ለውጥን በአንድ የተወሰነ የውሃ ሥነ-ምህዳር ውስጥ ያለውን ተጽዕኖ ለመለየት ተስማሚ የተፈጥሮ ማጣሪያ ያደርገዋል። ምንም እንኳን ከኤዲኤንኤ ጋር ሲነጻጸር የአስተናጋጁ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖር ዘዴው ውስንነት ተደርጎ ሊወሰድ ቢችልም፣ ከኤዲኤንኤ ጋር ሲነጻጸር እንዲህ ያለ ተወላጅ ccfDNA ከኤዲኤንኤ ጋር ሲነጻጸር ያለው ወጪ ለጤና ጥናቶች ሰፊ መረጃ በአንድ ጊዜ ለመረዳት የሚቻል ነው። offset host። ይህ በአስተናጋጅ አስተናጋጅ ጂኖም ውስጥ የተዋሃዱ የቫይረስ ቅደም ተከተሎችን መኖርን ያካትታል። ይህ በተለይ ለሙሰልስ አስፈላጊ ነው፣ በቢቫልቭስ ውስጥ በአግድም የሚተላለፉ ሉኪሚክ ሬትሮቫይረሶች መኖርን ከግምት ውስጥ በማስገባት [80፣ 81]። ከኤዲኤንኤ በላይ ያለው ሌላው የLB ጥቅም በሂሞሊምፍ ውስጥ የሚዘዋወሩ የደም ሴሎችን ፋጎሳይቲክ እንቅስቃሴ መጠቀሚያ መሆኑ ነው፣ ይህም ረቂቅ ተሕዋስያንን (እና ጂኖሞቻቸውን) ይይዛል። ፋጎሳይቶሲስ በቢቫልቭስ ውስጥ የደም ሴሎች ዋና ተግባር ነው [82]። በመጨረሻም፣ ዘዴው የሙሰልስ ከፍተኛ የማጣሪያ አቅም (አማካይ 1.5 ሊትር/ሰዓት የባህር ውሃ) እና የሁለት ቀን የደም ዝውውርን ይጠቀማል፣ ይህም የተለያዩ የባህር ውሃ ንብርብሮችን መቀላቀልን ይጨምራል፣ ይህም ሄትሮሎጎስ ኢዲኤንኤ እንዲይዝ ያስችላል። [83፣ 84]። ስለዚህ፣ የሙሰል ሲሲኤፍዲኤንኤ ትንተና የሙሰልን የአመጋገብ፣ የኢኮኖሚ እና የአካባቢ ተፅእኖ ከግምት ውስጥ በማስገባት አስደሳች መንገድ ነው። ልክ ከሰዎች የተሰበሰበውን የLB ትንተና፣ ይህ ዘዴ በአስተናጋጅ ዲኤንኤ ውስጥ ለውጫዊ ንጥረ ነገሮች ምላሽ ለመስጠት የጄኔቲክ እና የኤፒጄኔቲክ ለውጦችን የመለካት እድልን ይከፍታል። ለምሳሌ፣ የሶስተኛ ትውልድ ቅደም ተከተል ቴክኖሎጂዎች በናኖፖሬ ቅደም ተከተል በመጠቀም በአካባቢያዊ ccfDNA ውስጥ ጂኖም-አቀፍ የሜቲሌሽን ትንተና ለማከናወን ሊታሰብ ይችላል። ይህ ሂደት የሙሰል ሲሲኤፍዲኤንኤ ቁርጥራጮች ርዝመት ከረጅም ጊዜ ከተነበቡ የቅደም ተከተል መድረኮች ጋር በጥሩ ሁኔታ ተኳሃኝ በመሆኑ ማመቻቸት አለበት፣ ይህም የኬሚካል ለውጦች ሳያስፈልጉ ጂኖም-አቀፍ የዲኤንኤ ሜቲሌሽን ትንተና ያስችላል።85,86] ይህ አስደሳች ዕድል ነው፣ ምክንያቱም የዲኤንኤ ሜቲሌሽን ቅጦች ለአካባቢያዊ ውጥረት ምላሽን የሚያንፀባርቁ እና ለብዙ ትውልዶች እንደሚቀጥሉ ታይቷል። ስለዚህ፣ ለአየር ንብረት ለውጥ ወይም ለብክለት ከተጋለጡ በኋላ ምላሽን የሚቆጣጠሩትን መሰረታዊ ዘዴዎች ጠቃሚ ግንዛቤ ሊሰጥ ይችላል [87]። ሆኖም፣ የLB አጠቃቀም ያለ ገደብ አይደለም። ይህ በሥነ-ምህዳር ውስጥ የአመላካች ዝርያዎች መኖርን ይጠይቃል ማለቱ አስፈላጊ አይደለም። ከላይ እንደተጠቀሰው፣ የአንድ የተወሰነ ሥነ-ምህዳር ብዝሃነትን ለመገምገም LB መጠቀም ከምንጩ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን ግምት ውስጥ የሚያስገባ ጥብቅ የባዮኢንፎርማቲክስ ቧንቧን ይጠይቃል። ሌላው ዋና ችግር ለባህር ዝርያዎች የማጣቀሻ ጂኖሞች መገኘት ነው። እንደ የባህር አጥቢ እንስሳት ጂኖምስ ፕሮጀክት እና በቅርቡ የተቋቋመው የFish10k ፕሮጀክት [88] ያሉ ተነሳሽነቶች ለወደፊቱ እንዲህ ዓይነቱን ትንተና ያመቻቻሉ ተብሎ ተስፋ ይደረጋል። የLB ጽንሰ-ሀሳብን በባህር ማጣሪያ-መመገብ ፍጥረታት ላይ መተግበርም ከቅደም ተከተል ቴክኖሎጂ የቅርብ ጊዜ እድገቶች ጋር ተኳሃኝ ነው፣ ይህም ለአካባቢ ውጥረት ምላሽ የባህር መኖሪያዎችን ጤና በተመለከተ አስፈላጊ መረጃዎችን ለማቅረብ ለብዙ-ኦህም ባዮማርከሮች ልማት ተስማሚ ያደርገዋል።
የጂኖም ቅደም ተከተል መረጃ በ NCBI ቅደም ተከተል ውስጥ ተቀምጧል መዝገብ ቤት ያንብቡ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 በባዮፕሮጀክቶች SRR8924808 ስር።
ብሪየርሊ ኤኤስ፣ ኪንግስፎርድ ኤምጄ የአየር ንብረት ለውጥ በባህር ህይወት እና ስነ-ምህዳሮች ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ። ኮል ባዮሎጂ። 2009፤ 19፡ P602–P614።
ጂሲ ኢ፣ ማኔአ ኢ፣ ማዛሪስ ኤዲ፣ ፍራሼቲ ኤስ፣ አልፓኒዱ ቪ፣ ቤቪላክኳ ኤስ፣ እና ሌሎችም። የአየር ንብረት ለውጥ እና ሌሎች የአካባቢ አስጨናቂ ሁኔታዎች በባህር አካባቢ ላይ የሚያስከትሉትን የተጣመረ ተጽእኖ ግምት ውስጥ ያስገቡ። አጠቃላይ ሳይንሳዊ አካባቢ። 2021፤755:142564።
ካሬላ ኤፍ፣ አንቱኦፈርሞ ኢ፣ ፋሪና ኤስ፣ ሳላቲ ኤፍ፣ ማንዳስ ዲ፣ ፕራዶ ፒ፣ እና ሌሎችም። ). የመጋቢት መጀመሪያ ሳይንስ. 2020፤7፡48።
ሴሮንት ኤል፣ ኒካስትሮ ሲአር፣ ዛርዲ ጂአይ፣ ጎበርቪል ኢ። በተደጋጋሚ የሙቀት ውጥረት ሁኔታዎች ውስጥ የሙቀት መቋቋም መቀነስ የሰማያዊ ሙሰል ከፍተኛ የበጋ ሞትን ያብራራል። ሳይንሳዊ ሪፖርት 2019፤ 9:17498።
ፌይ ኤስቢ፣ ሲፒየልስኪ ኤኤም፣ ኑስል ኤስ፣ ሰርቫንቴስ-ዮሺዳ ኬ፣ ህዋን ጄኤል፣ ሁበር ኢአር፣ ወዘተ. በእንስሳት ሞት ድግግሞሽ፣ መንስኤዎች እና መጠን ላይ የቅርብ ጊዜ ለውጦች። ፕሮክ ናትል አካድ ሳይንስ ዩኤስኤ። 2015፤112:1083-8።
Scarpa F፣ Sanna D፣ Azzena I፣ Mughetti D፣ Cerruti F፣ Hosseini S፣ et al. ብዙ ዓይነት ያልሆኑ ልዩ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን የፒና ኖቢሊስን የጅምላ ሞት አስከትለዋል። ህይወት። 2020፤10፡238።
ብራድሌይ ኤም፣ ኩትስ ኤስጄ፣ ጄንኪንስ ኢ፣ ኦሃራ ™። የአየር ንብረት ለውጥ በአርክቲክ ዞኖቲክ በሽታዎች ላይ ሊያስከትል የሚችለው ተጽዕኖ። ኢንት ጄ ሰርኩምፖላር ጤና። 2005፤ 64:468–77።
ቤየር ጄ.፣ ግሪን ሰሜን ምዕራብ፣ ብሩክስ ኤስ.፣ አለን አይጄ፣ ሩስ ኤ.፣ ጎሜዝ ቲ. እና ሌሎችም። ሰማያዊ ሙሰልስ (ማይቲለስ ኤዱሊስ ስፕ.) በባህር ዳርቻ ብክለት ክትትል ውስጥ እንደ ምልክት ህዋሳት፡ ግምገማ። ማር ኤንቪሮን ሬስ 2017፤ 130፡338-65።
ሲራቬኛ ጂ፣ ማርሶኒ ኤስ፣ ሲዬና ኤስ፣ ባርዴሊ ኤ። በካንሰር ህክምና ውስጥ የፈሳሽ ባዮፕሲ ውህደት። ናት ሬቭ ክሊን ኦንኮል። 2017፤ 14:531–48።
ዋን ጄሲኤም፣ ማሳሲ ሲ፣ ጋርሲያ-ኮርባቾ ጄ፣ ሞውሊየር ኤፍ፣ ብሬንተን ጄዲ፣ ካልዳስ ሲ፣ ወዘተ. ፈሳሽ ባዮፕሲ ብስለት፡ የቲዩመር ዲኤንኤ እንዲዘዋወር ያስችላል። ናት ሬቭ ካንሰር። 2017፤17፡223–38።
ማንዴል ፒ.፣ ሜታይስ ፒ. በሰው ፕላዝማ ውስጥ ያሉ ኑክሊክ አሲዶች። የሶክ ባዮል ቅርንጫፎች ስብሰባ ቃለ ጉባኤዎች። 1948፤ 142:241-3።
ብሮንኮርስት ኤጄ፣ ኡንገር ደብሊው፣ ሆልደንሪደር ኤስ. ለካንሰር ሕክምና እንደ ሞለኪውላር ማርከር ለሴል-ነጻ ዲኤንኤ አዲስ ሚና። የባዮሞላር ትንተና መጠን። 2019፤17:100087።
ኢግናቲያዲስ ኤም.፣ ስሌጅ ጂደብሊው፣ ጄፍሪ ኤስ ኤስ ሊኩዊድ ባዮፕሲ ወደ ክሊኒኩ ገባ - የትግበራ ጉዳዮች እና የወደፊት ተግዳሮቶች። ናት ሬቭ ክሊን ኦንኮል። 2021፤ 18:297–312።
ሎ ዋይኤም፣ ኮርቤታ ኤን.፣ ቻምበርሊን ፒኤፍ፣ ራይ ደብሊው.፣ ሳርጀንት ኢኤል፣ ሬድማን ሲደብሊው እና ሌሎችም። የፅንስ ዲ ኤን ኤ በእናቶች ፕላዝማ እና ሴረም ውስጥ ይገኛል። ላንሴት። 1997፤ 350:485-7።
ሙፋሬይ ኤምኤን፣ ዎንግ አርጄ፣ ሻው ጂኤም፣ ስቲቨንሰን ዲኬ፣ ኩዌክ ኤስአር በእርግዝና ወቅት በሴቶች ደም ውስጥ በሚዘዋወረው ከሴሎች ውጭ የሆነ አር ኤን ኤ በመጠቀም የእርግዝና ሂደት እና ውስብስብ ችግሮች ጥናት። ዶፔዲያትሪክስ። 2020፤8:605219።
ኦሌሪች ኤም፣ ሸርዉድ ኬ፣ ኪውን ፒ፣ ሽትዝ ኢ፣ ቤክ ጄ፣ ስቴግባወር ጄ፣ ወዘተ. ፈሳሽ ባዮፕሲ፡- ለጋሽ ሴል-ነጻ ዲኤንኤ በኩላሊት ሽረት ውስጥ አሎጅኒክ ቁስሎችን ለመለየት ይጠቅማል። ናት ሬቭ ኔፍሮል። 2021፤ 17:591–603።
ጁዋን ኤፍሲ፣ ሎ ዋይኤም በቅድመ ወሊድ ምርመራ ውስጥ ፈጠራዎች፡ የእናቶች የፕላዝማ ጂኖም ቅደም ተከተል። አና ኤምዲ። 2016፤ 67:419-32።
ጉ ደብሊው፣ ዴንግ ኤክስ፣ ሊ ኤም፣ ሱኩ ዋይዲ፣ አሬቫሎ ኤስ፣ ስትራይክ ዲ፣ እና ሌሎችም። በበሽታው የተያዙ የሰውነት ፈሳሾችን በሚቀጥለው ትውልድ ሜታጂኖሚክ ቅደም ተከተል በመጠቀም ፈጣን የበሽታ አምጪ ተህዋሲያን መለየት። ናት ሜዲስን። 2021፤27:115-24።