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액체생검(Liquid biopsy, LB)은 생의학 분야에서 빠르게 주목받고 있는 개념입니다. 이 개념은 주로 다양한 조직에서 세포 사멸 후 작은 조각으로 방출되는 순환 세포외 DNA(ccfDNA) 조각을 검출하는 데 기반을 두고 있습니다. 이러한 조각 중 일부는 외부 조직이나 유기체에서 유래합니다. 본 연구에서는 해수 여과 능력이 뛰어난 지표종인 홍합에 이 개념을 적용했습니다. 홍합의 천연 필터 역할을 이용하여 다양한 출처의 환경 DNA 조각을 포획함으로써 연안 해양 생태계의 생물 다양성에 대한 정보를 얻고자 했습니다. 연구 결과, 홍합 혈림프에는 1~5kb에 이르는 다양한 크기의 DNA 조각이 포함되어 있음을 확인했습니다. 샷건 시퀀싱 분석 결과, 상당수의 DNA 조각이 외부 미생물에서 유래한 것으로 나타났습니다. 여기에는 박테리아, 고세균, 바이러스의 DNA 조각이 포함되었으며, 특히 연안 해양 생태계에서 흔히 발견되는 다양한 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 바이러스의 DNA 조각도 검출되었습니다. 결론적으로, 본 연구는 홍합에 적용된 LB 개념이 해양 연안 생태계의 미생물 다양성에 대한 풍부하지만 아직 탐구되지 않은 지식의 원천을 나타낸다는 것을 보여줍니다.
기후 변화(CC)가 해양 생태계의 생물 다양성에 미치는 영향은 연구가 빠르게 증가하는 분야입니다. 지구 온난화는 중요한 생리적 스트레스를 유발할 뿐만 아니라 해양 생물의 열 안정성의 진화적 한계를 넘어서게 하여 수많은 종의 서식지에 영향을 미치고, 더 유리한 환경을 찾아 이동하게 만듭니다[1, 2]. 기후 변화는 다세포 동물의 생물 다양성에 영향을 미치는 것 외에도 숙주-미생물 상호작용의 미묘한 균형을 깨뜨립니다. 이러한 미생물 불균형은 해양 생물을 감염성 병원균에 더욱 취약하게 만들어 해양 생태계에 심각한 위협을 가합니다[3, 4]. 이러한 불균형은 대량 폐사의 주요 원인으로 여겨지며, 이는 전 세계 해양 생태계 관리에 심각한 문제로 작용합니다[5, 6]. 이는 많은 해양 생물의 경제적, 생태적, 영양적 측면에 영향을 미치기 때문에 더욱 중요한 문제입니다. 특히 극지방에 서식하는 이매패류의 경우, 기후 변화의 영향이 더욱 즉각적이고 심각하게 나타납니다[6, 7]. 실제로 Mytilus spp.와 같은 이매패류는 해양 생태계에 대한 CC의 영향을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 따라서 이들의 건강을 모니터링하기 위해 비교적 많은 바이오마커가 개발되었으며, 종종 효소 활성 또는 세포 생존력 및 식세포 활동과 같은 세포 기능을 기반으로 하는 기능적 바이오마커를 포함하는 2단계 접근 방식을 사용합니다[8]. 이러한 방법에는 또한 다량의 해수를 흡수한 후 연조직에 축적되는 특정 압력 지표의 농도 측정이 포함됩니다. 그러나 이매패류의 높은 여과 능력과 반개방형 순환계는 환자 관리에 있어 간단하고 최소 침습적인 접근 방식인 액체 생검(LB) 개념을 사용하여 새로운 혈림프 바이오마커를 개발할 수 있는 기회를 제공합니다[9, 10]. 인간 LB에서는 여러 유형의 순환 분자를 찾을 수 있지만, 이 개념은 주로 혈장 내 순환 세포외 DNA(ccfDNA) 조각의 DNA 시퀀싱 분석을 기반으로 합니다. 실제로, 인간 혈장 내 순환 DNA의 존재는 20세기 중반부터 알려져 왔지만[11], 고처리량 시퀀싱 방법의 등장으로 ccfDNA를 기반으로 한 임상 진단이 가능해진 것은 최근의 일입니다. 이러한 순환 DNA 조각의 존재는 부분적으로 세포 사멸 후 게놈 DNA(핵 및 미토콘드리아)의 수동적 방출 때문입니다. 건강한 사람의 경우 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL), 다양한 질병을 앓거나 스트레스를 받아 조직 손상을 입은 환자에서는 5~10배 증가할 수 있습니다. 건강한 사람의 경우 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL), 다양한 질병을 앓거나 스트레스를 받아 조직 손상을 입은 환자에서는 5~10배 증가할 수 있습니다. У здоровых лудей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией 및 подвергавичся стрессу, приводяЂему к повреждениу тканей. 건강한 사람의 경우 cccDNA 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/mL), 다양한 질병을 앓거나 조직 손상을 유발하는 스트레스를 받는 환자에서는 5~10배 증가할 수 있습니다.에서 ccfDNA의 속도는 일반적으로 10ng/mL 미만이며, 但患有各种病理或承受压력적患者中可增加5-10倍，从而导致组织损伤。健康 个体 中 , ccfdna 的 浓titude 较 低 （(<10 ng/ml) 但 各 种 病理 或 承受 压력 患者 中 可 增加 5-10 倍 ，从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых лудей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждениу тканей. 건강한 사람의 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮지만(<10 ng/ml), 다양한 질병이나 스트레스를 겪는 환자에서는 5~10배 증가하여 조직 손상을 초래할 수 있습니다.ccfDNA 단편의 크기는 매우 다양하지만 일반적으로 150~200bp 범위에 있습니다[12]. 자가 유래 ccfDNA, 즉 정상 또는 형질전환된 숙주 세포에서 유래한 ccfDNA를 분석하면 핵 및/또는 미토콘드리아 게놈에 존재하는 유전적 및 후성유전적 변화를 감지할 수 있으므로 임상의가 특정 분자 표적 치료법을 선택하는 데 도움이 됩니다[13]. 그러나 ccfDNA는 임신 중 태아 세포 또는 이식 장기와 같은 외부 출처에서도 얻을 수 있습니다[14,15,16,17]. 또한 ccfDNA는 감염성 병원체(외부)의 핵산 존재를 감지하는 중요한 정보원이기도 하며, 혈액 배양으로는 확인되지 않는 광범위한 감염을 비침습적으로 감지하여 감염 조직의 침습적인 생검을 피할 수 있게 해줍니다[18]. 최근 연구에 따르면 인체 혈액에는 바이러스 및 세균 병원체를 식별하는 데 사용할 수 있는 풍부한 정보가 포함되어 있으며, 인체 혈장에서 발견되는 ccfDNA의 약 1%가 외부 유래인 것으로 나타났습니다[19]. 이러한 연구는 ccfDNA 분석을 통해 유기체의 순환 미생물군집의 생물다양성을 평가할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 최근까지 이 개념은 인간에게만, 그리고 다른 척추동물에는 그보다 덜 사용되었습니다[20, 21].
본 논문에서는 LB 기법을 이용하여 아남극 케르겔렌 제도(약 3500만 년 전 화산 폭발로 형성된 거대한 고원 위에 자리한 섬들)에 흔히 서식하는 남극종인 Aulacomya atra의 ccfDNA를 분석하였다. 시험관 내 실험 시스템을 통해 해수 속 DNA 조각들이 홍합에 빠르게 흡수되어 혈림프 내로 이동하는 것을 확인하였다. 샷건 시퀀싱 분석 결과, 홍합 혈림프의 ccfDNA에는 홍합 자체 유래 DNA 조각뿐만 아니라 공생 박테리아 및 차가운 화산성 해양 연안 생태계의 전형적인 생물군계에서 유래한 DNA 조각을 포함한 비자체 유래 DNA 조각들이 존재함을 확인하였다. 또한, 혈림프 ccfDNA에는 숙주 범위가 다양한 바이러스에서 유래한 바이러스 서열도 포함되어 있었다. 더 나아가, 경골어류, 말미잘, 해조류, 곤충과 같은 다세포 동물의 DNA 조각도 발견되었다. 결론적으로, 본 연구는 LB 개념이 해양 무척추동물에 성공적으로 적용되어 해양 생태계의 풍부한 유전체 레퍼토리를 생성할 수 있음을 보여준다.
2018년 12월, 프랑스 포르토프랑스(049°21.235 S, 070°13.490 E) 케르겔렌 제도의 조간대 암초 해안에서 성체(길이 55-70 mm) 홍합(Mytilus platensis, M. platensis)과 아울라코미야 아트라(Aulacomya atra, A. atra)를 채집하였다. 다른 성체 홍합(Mytilus spp.)은 상업 공급업체(PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada)에서 구입하여 32‰ 인공 염수(Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) 10-20 L가 담긴 온도 조절(4°C) 및 통기 수조에 넣었다. 각 실험에서 개별 홍합 껍데기의 길이와 무게를 측정하였다.
이 프로그램에 대한 무료 공개 액세스 프로토콜은 온라인(https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)에서 확인할 수 있습니다. 간단히 설명하면, LB 혈림프는 [22]에 설명된 대로 외전근에서 채취했습니다. 혈림프는 1200×g에서 3분간 원심분리하여 투명화하고, 상층액은 사용 전까지 -20°C에서 냉동 보관했습니다. cfDNA의 분리 및 정제를 위해 샘플(1.5-2.0 ml)을 해동하고 제조사의 지침에 따라 NucleoSnap cfDNA 키트(Macherey-Nagel, Bethlehen, PA)를 사용하여 처리했습니다. ccfDNA는 추가 분석 전까지 -80°C에서 보관했습니다. 일부 실험에서는 QIAamp DNA Investigator 키트(QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada)를 사용하여 ccfDNA를 분리 및 정제했습니다. 정제된 DNA는 표준 PicoGreen 분석법을 사용하여 정량했습니다. 분리된 ccfDNA의 단편 분포는 고감도 DNA 키트를 사용하여 Agilent 2100 바이오애널라이저(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)로 모세관 전기영동을 통해 분석하였다. 분석은 제조사의 지침에 따라 1 µl의 ccfDNA 샘플을 사용하여 수행하였다.
혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱을 위해 Génome Québec(캐나다 퀘벡주 몬트리올)은 Illumina MiSeq PE75 키트의 Illumina DNA Mix 키트를 사용하여 샷건 라이브러리를 제작했습니다. 표준 어댑터(BioO)가 사용되었습니다. 원시 데이터 파일은 NCBI Sequence Read Archive(SRR8924808 및 SRR8924809)에서 확인할 수 있습니다. 기본 판독 품질은 FastQC[23]를 사용하여 평가했습니다. Trimmomatic[24]은 어댑터와 품질이 낮은 판독값을 잘라내는 데 사용되었습니다. 쌍을 이루는 끝부분을 가진 샷건 판독값은 불일치를 방지하기 위해 최소 20bp의 중복을 갖도록 FLASH 병합하여 더 긴 단일 판독값으로 만들었습니다[25]. 병합된 읽기는 이매패 NCBI 분류 데이터베이스(e 값 < 1e−3 및 90% 동질성)를 사용하여 BLASTN으로 주석 처리되었으며 DUST[26]를 사용하여 저복잡성 시퀀스의 마스킹이 수행되었습니다. 병합된 읽기는 이매패 NCBI 분류 데이터베이스(e 값 < 1e−3 및 90% 동질성)를 사용하여 BLASTN으로 주석 처리되었으며 DUST[26]를 사용하여 저복잡성 시퀀스의 마스킹이 수행되었습니다. Объединенные чтения были аннотированы с помочиваны БLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллусков NCBI(значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием 먼지 [26]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류 데이터베이스(e 값 < 1e-3 및 90% 동질성)를 사용하여 BLASTN으로 주석 처리되었고 DUST[26]를 사용하여 낮은 복잡성 시퀀스 마스킹이 수행되었습니다.使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 와90% 同源性) 用BLASTN 注释合并的读数 ，并使用 DUST [26] 이 여행은 최고의 즐거움을 선사합니다.使用 双 壳类 ncbi 分类 （(<1e-3 and 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 먼지 [26] 进行 复杂島 序列 的。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помочатых BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллусков NCBI(значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием 먼지 [26]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류학 데이터베이스(e 값 <1e-3 및 90% 동질성)를 사용하여 BLASTN으로 주석 처리되었으며 DUST[26]를 사용하여 낮은 복잡성 시퀀스 마스킹이 수행되었습니다.리드는 이매패류 서열과 관련된 리드(여기서는 셀프 리드라고 함)와 관련이 없는 리드(비셀프 리드)의 두 그룹으로 나뉘었습니다. 두 그룹은 MEGAHIT을 사용하여 각각 어셈블하여 컨티그를 생성했습니다[27]. 한편, 외래 미생물군 리드의 분류학적 분포는 Kraken2[28]를 사용하여 분류하고 Galaxy[29, 30]의 Krona 파이 차트로 시각적으로 표현했습니다. 최적의 kmers는 예비 실험을 통해 kmers-59로 결정되었습니다. 그런 다음 BLASTN(이매패류 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 정렬함으로써 자체 컨티그를 식별하고 최종 주석을 달았습니다. 그런 다음 BLASTN(이매패류 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 정렬함으로써 자체 컨티그를 식별하고 최종 주석을 달았습니다. BLASTN(NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(NCBI 이매패류 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과 비교하여 자체 컨티그를 식별했습니다.BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 and60% 同源性)对齐来识别自身叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 이 문서는 BLASTN에 대한 정보를 제공합니다. для двустворчатых моллусков, значение e <1e-10 и гомология 60%). 그런 다음 BLASTN(NCBI 이매패류 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과 비교하여 최종 주석을 위해 자체 컨티그를 식별했습니다. 이와 동시에, 비자기 그룹 컨티그는 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 주석 처리되었습니다. 이와 동시에, 비자기 그룹 컨티그는 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 주석 처리되었습니다. Pараллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помочеваны с помочьù BLASTN(база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология) 60%). 이와 동시에, 외래 그룹 컨티그는 BLASTN(NT NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)을 사용하여 주석 처리되었습니다.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释不自身组중叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释不自身组중叠群。 Pараллельно Контиги, не относячеся к собственной группе, были аннотированы с помочене BLASTN(база данных nt NCBI, значение e <1e-10 및 гомология 60%). 이와 동시에, 비자기 그룹 컨티그는 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)을 사용하여 주석 처리되었습니다. 또한 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스를 사용하여 비자가 컨티그에 대해 BLASTX를 수행했습니다(e 값 < 1e−10 및 60% 상동성). 또한 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스를 사용하여 비자가 컨티그에 대해 BLASTX를 수행했습니다(e 값 < 1e−10 및 60% 상동성). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI(значение e <1e-10 и 60%). 또한 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스를 사용하여 비자가 컨티그에 대해 BLASTX를 수행했습니다(e 값 < 1e-10 및 60% 상동성).还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对不自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 and60% 同源性).还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对不自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 and60% 同源性). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI(значение e <1e-10 и 60%). 또한 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스를 사용하여 비자가 컨티그에 대해 BLASTX를 수행했습니다(e 값 <1e-10 및 60% 상동성).비자기 컨티그의 BLASTN 및 BLASTX 풀은 최종 컨티그를 나타냅니다(보충 자료 참조).
PCR에 사용된 프라이머는 표 S1에 나열되어 있습니다. Taq DNA 중합효소(Bio Basic Canada, Markham, ON)를 사용하여 ccfDNA 표적 유전자를 증폭했습니다. 반응 조건은 다음과 같습니다: 95°C에서 3분간 변성, 95°C에서 1분간 유지, 72°C에서 1분간 어닐링, 35회 반복, 마지막으로 72°C에서 10분간 유지. PCR 산물은 SYBR™ Safe DNA Gel Stain(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)이 포함된 1.5% 아가로스 겔에서 95V로 전기영동하여 분리했습니다.
홍합(Mytilus spp.)을 4°C에서 24시간 동안 산소가 공급된 해수(32 PSU) 500 ml에 순응시켰습니다. 사람 갈렉틴-7 cDNA 서열(NCBI 접근 번호 L07769)을 암호화하는 삽입물을 포함하는 플라스미드 DNA를 최종 농도 190 μg/μl로 바이알에 첨가했습니다. DNA를 첨가하지 않고 동일한 조건에서 배양한 홍합을 대조군으로 사용했습니다. 세 번째 대조군 수조에는 홍합 없이 DNA만 넣었습니다. 해수 내 DNA 품질을 모니터링하기 위해 지정된 시간에 각 수조에서 해수 샘플(20 μl, 3회 반복)을 채취했습니다. 플라스미드 DNA 추적성을 위해 지정된 시간에 LB 홍합을 수확하여 qPCR 및 ddPCR 분석을 수행했습니다. 해수의 높은 염분 함량으로 인해 모든 PCR 분석 전에 시료를 PCR용 증류수로 1:10 희석했습니다.
BioRad QX200 프로토콜(캐나다 온타리오주 미시소거)을 사용하여 디지털 드롭릿 PCR(ddPCR)을 수행했습니다. 최적 온도는 온도 프로파일을 사용하여 결정했습니다(표 S1). QX200 드롭 생성기(BioRad)를 사용하여 드롭을 생성했습니다. ddPCR은 다음과 같이 진행했습니다: 95°C에서 5분, 95°C에서 30초 및 특정 어닐링 온도에서 1분, 72°C에서 30초, 4°C에서 5분, 90°C에서 5분 동안 50주기. 드롭 수와 양성 반응 수(copys/µl)는 QX200 드롭 리더(BioRad)를 사용하여 측정했습니다. 드롭 수가 10,000개 미만인 샘플은 제외했습니다. ddPCR을 실행할 때마다 패턴 대조를 수행하지는 않았습니다.
qPCR은 Rotor-Gene® 3000(Corbett Research, Sydney, Australia)과 LGALS7 특이적 프라이머를 사용하여 수행되었습니다. 모든 정량적 PCR은 QuantiFast SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)를 사용하여 20 µl 용량으로 진행되었습니다. qPCR은 95°C에서 15분간 배양한 후, 95°C에서 10초, 60°C에서 60초 동안 40주기 반복하고, 각 주기마다 데이터를 한 번씩 수집했습니다. 용융 곡선은 95°C에서 5초, 65°C에서 60초, 그리고 qPCR 종료 시 97°C에서 연속적으로 측정하여 얻었습니다. 대조군 샘플을 제외한 모든 qPCR은 3회 반복하여 수행했습니다.
홍합은 여과율이 높은 것으로 알려져 있기 때문에, 먼저 홍합이 해수에 존재하는 DNA 조각을 여과하고 보유할 수 있는지 조사했습니다. 또한 이러한 DNA 조각이 홍합의 반개방형 림프계에 축적되는지 여부에도 관심을 가졌습니다. 우리는 홍합 수조에 용해성 DNA 조각을 첨가하고 그 이동 경로를 추적하는 실험을 통해 이 문제를 해결했습니다. DNA 조각의 추적을 용이하게 하기 위해, 우리는 인간 갈렉틴-7 유전자를 포함하는 외래(자가가 아닌) 플라스미드 DNA를 사용했습니다. ddPCR을 이용하여 해수와 홍합 내 플라스미드 DNA 조각을 추적했습니다. 실험 결과, 홍합이 없는 조건에서는 해수 내 DNA 조각의 양이 시간 경과에 따라 (최대 7일) 비교적 일정하게 유지되었지만, 홍합이 있는 조건에서는 8시간 이내에 거의 완전히 사라지는 것을 확인했습니다(그림 1a,b). 외래 DNA 조각은 15분 이내에 홍합 판막 내액과 혈림프에서 쉽게 검출되었으며(그림 1c), 노출 후 최대 4시간까지 검출되었습니다. DNA 조각에 대한 이러한 여과 활동은 박테리아와 조류의 여과 활동과 유사합니다[31]. 이러한 결과는 홍합이 유체 구획에서 외래 DNA를 여과하고 축적할 수 있음을 시사합니다.
홍합이 있는 경우(A)와 없는 경우(B) 해수에서 플라스미드 DNA의 상대적 농도를 ddPCR로 측정하였다. A에서 결과는 백분율로 표시하였으며, 상자의 테두리는 75번째 백분위수와 25번째 백분위수를 나타낸다. 적합된 로그 곡선은 빨간색으로 표시하였고, 회색 음영 영역은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. B에서 빨간색 선은 평균값을, 파란색 선은 농도에 대한 95% 신뢰 구간을 나타낸다. C 플라스미드 DNA 첨가 후 시간에 따른 홍합의 혈림프와 판막액 내 플라스미드 DNA 축적량을 나타낸다. 결과는 검출된 절대 복제본 수/mL(±표준오차)로 표시하였다.
다음으로, 인위적인 영향이 제한적인 외딴 섬 무리인 케르겔렌 제도의 홍합 서식지에서 채집한 홍합에서 ccfDNA의 기원을 조사했습니다. 이를 위해 홍합 혈림프에서 cccDNA를 분리하고 사람 cccDNA 정제에 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 정제했습니다[32, 33]. 홍합 혈림프의 평균 ccfDNA 농도는 혈림프 1ml당 수 마이크로그램(μg/ml) 범위인 것으로 나타났습니다(표 S2, 보충 정보 참조). 이 농도 범위는 건강한 사람(수 나노그램/ml)보다 훨씬 높지만, 드물게 암 환자의 경우 ccfDNA 수치가 수 마이크로그램/ml에 달할 수 있습니다[34, 35]. 혈림프 ccfDNA의 크기 분포를 분석한 결과, 이 단편들은 1000bp에서 최대 5000bp까지 매우 다양한 크기를 보였습니다(그림 2). 법의학에서 일반적으로 사용되는 방법인 실리카 기반 QIAamp Investigator Kit를 사용하여 유사한 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 ccfDNA를 포함한 저농도 DNA 샘플에서 게놈 DNA를 신속하게 분리 및 정제하는 데 사용됩니다[36].
홍합 혈림프의 ccfDNA 전기영동 결과 대표 그림. NucleoSnap Plasma Kit(상단)와 QIAamp DNA Investigator Kit를 사용하여 추출하였다. B. 홍합 혈림프 내 ccfDNA 농도 분포(±표준오차)를 나타내는 바이올린 플롯. 검은색 선은 중앙값을, 빨간색 선은 제1사분위수와 제3사분위수를 나타낸다.
인간과 영장류의 ccfDNA 중 약 1%는 외부에서 유래한 것으로 알려져 있다[21, 37]. 이매패류의 반개방형 순환계, 미생물이 풍부한 해수, 그리고 홍합 ccfDNA의 크기 분포를 고려하여, 우리는 홍합 혈림프 ccfDNA에 풍부하고 다양한 미생물 DNA가 존재할 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설을 검증하기 위해 케르겔렌 제도에서 채집한 Aulacomya atra 홍합의 혈림프 ccfDNA를 시퀀싱하여 1천만 개 이상의 리드를 얻었고, 그중 97.6%가 품질 관리를 통과했다. BLASTN과 NCBI 이매패류 데이터베이스를 이용하여 리드를 자체 유래와 비자체 유래로 분류하였다(그림 S1, 보충 정보).
인간의 경우 핵 DNA와 미토콘드리아 DNA 모두 혈류로 방출될 수 있습니다[38]. 그러나 본 연구에서는 A. atra의 게놈이 시퀀싱되거나 분석되지 않았기 때문에 홍합의 핵 게놈 DNA를 자세히 기술하는 것은 불가능했습니다. 하지만 우리는 이매패류 라이브러리를 사용하여 자체적으로 개발한 여러 ccfDNA 단편을 확인할 수 있었습니다(그림 S2, 보충 정보). 또한 시퀀싱된 A. atra 유전자를 대상으로 직접 PCR 증폭을 수행하여 자체 개발한 DNA 단편의 존재를 확인했습니다(그림 3). 마찬가지로 A. atra의 미토콘드리아 게놈이 공개 데이터베이스에 존재하므로 A. atra의 혈림프에서 미토콘드리아 ccfDNA 단편의 존재를 확인할 수 있습니다. 미토콘드리아 DNA 단편의 존재는 PCR 증폭을 통해 확인되었습니다(그림 3).
PCR을 통해 증폭된 A. atra(빨간색 점 – 재고 번호: SRX5705969)와 M. platensis(파란색 점 – 재고 번호: SRX5705968)의 혈림프에서 다양한 미토콘드리아 유전자가 존재함을 확인하였다. 그림은 Breton et al., 2011에서 발췌하였다. B. A. atra 혈림프 상층액의 증폭. FTA 종이에 보관하였다. 3mm 펀치를 사용하여 PCR 혼합물이 들어 있는 PCR 튜브에 직접 첨가하였다.
해수에는 미생물이 풍부하게 존재하기 때문에, 우리는 먼저 혈림프 내 미생물 DNA 서열의 특성 분석에 집중했습니다. 이를 위해 두 가지 전략을 사용했습니다. 첫 번째 전략은 BLAST 및 기타 도구와 유사한 정확도로 미생물 서열을 식별할 수 있는 알고리즘 기반 서열 분류 프로그램인 Kraken2를 사용했습니다[28]. 6719개 이상의 서열이 세균 유래로, 124개는 고세균 유래로, 64개는 바이러스 유래로 확인되었습니다(그림 4). 가장 풍부한 세균 DNA 단편은 Firmicutes(46%), Proteobacteria(27%), Bacteroidetes(17%)였습니다(그림 4a). 이러한 분포는 홍합 미생물군에 대한 이전 연구 결과와 일치합니다[39, 40]. Proteobacteria의 주요 분류군은 Gammaproteobacteria(44%)였으며, 여기에는 많은 Vibrionales가 포함되었습니다(그림 4b). ddPCR 방법은 A. atra 혈림프의 ccfDNA에서 Vibrio DNA 단편의 존재를 확인했습니다(그림 4c)[41]. ccfDNA의 세균 기원에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 추가적인 접근 방식을 취했습니다(그림 S2, 보충 정보). 이 경우, 겹치는 리드는 페어드 엔드 리드로 어셈블되었으며, BLASTN과 1e−3의 e 값, 그리고 90% 이상의 상동성을 기준으로 자체(이매패류) 또는 비자체 유래로 분류되었습니다. 이 경우, 겹치는 리드는 페어드 엔드 리드로 어셈블되었으며, BLASTN과 1e−3의 e 값, 그리고 90% 이상의 상동성을 기준으로 자체(이매패류) 또는 비자체 유래로 분류되었습니다. В этом случае перекрываучиеся чтения были собраны как чтения с parными konцами 및 были классифицированы как собственные (двустворчатые молуски) или чужие по происхожденик с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. 이 경우, 중복되는 리드는 쌍을 이루는 리드로 수집되었으며, BLASTN과 1e-3의 e 값, 그리고 90% 이상의 상동성을 기준으로 토착(이매패류) 또는 비토착으로 분류되었습니다.에서 这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用 BLASTN 과 1e-3 적 e 值화>90%同源性截止值分类为自身(双壳类)或不自身来源.에서 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 과 1e-3 적 值 와> 90% 유사성 적 공유自身 （双 壳类） 不 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывавававаны как собственные (двустворчатые моллуски) или несобственные по происхожденик с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. 이 경우, 중복되는 리드는 쌍을 이루는 리드로 수집되었으며 eBLASTN과 1e-3 값, 그리고 90% 이상의 상동성 임계값을 사용하여 자체 리드(이매패류) 또는 비원본 리드로 분류되었습니다.A. atra 게놈은 아직 시퀀싱되지 않았기 때문에 MEGAHIT 차세대 시퀀싱(NGS) 어셈블러의 de novo 어셈블리 전략을 사용했습니다. 총 147,188개의 컨티그가 이매패류 유래로 확인되었습니다. 이 컨티그들은 BLASTN과 BLASTX를 사용하여 1e-10의 e-값으로 확장되었습니다. 이 전략을 통해 A. atra ccfDNA에 존재하는 482개의 비이매패류 유래 단편을 식별할 수 있었습니다. 이 DNA 단편의 절반 이상(57%)은 박테리아, 주로 아가미 공생균(황영양성 공생균 포함) 및 아가미 공생균인 Solemya velum에서 유래한 것이었습니다(그림 5).
유형 수준에서의 상대적 풍부도. B 두 주요 문(Firmicutes 및 Proteobacteria)의 미생물 다양성. ddPCR의 대표적인 증폭 결과 C Vibrio spp. A. 세 개의 아트라 혈림프에서 16S rRNA 유전자 단편(파란색).
수집된 총 482개의 컨티그를 분석했습니다. 메타게놈 컨티그 주석의 분류학적 분포에 대한 일반적인 프로필(원핵생물 및 진핵생물). B BLASTN 및 BLASTX로 식별된 박테리아 DNA 단편의 상세 분포.
Kraken2 분석 결과, 홍합 ccfDNA에는 Euryarchaeota(65%), Crenarchaeota(24%), Thaurmarcheota(11%)를 포함한 고세균 DNA 조각이 포함되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 6a). 캘리포니아 홍합의 미생물 군집에서 이전에 발견된 바 있는 Euryarchaeota와 Crenarchaeota 유래 DNA 조각의 존재는 놀라운 일이 아닙니다[42]. Euryarchaeota는 극한 환경과 관련이 있는 것으로 알려져 있지만, 현재는 Euryarchaeota와 Crenarchaeota 모두 해양 극저온 환경에서 가장 흔한 원핵생물 중 하나로 인식되고 있습니다[43, 44]. 케르겔렌 고원의 해저 누출로 인한 광범위한 메탄 누출[45]과 케르겔렌 제도 연안에서 관찰된 미생물에 의한 메탄 생성 가능성[46]을 고려할 때, 홍합에서 메탄 생성 미생물이 발견된 것은 놀라운 일이 아닙니다.
그 후 우리는 DNA 바이러스 분석에 집중했습니다. 우리가 아는 한, 이는 홍합의 바이러스 함량을 분석한 최초의 비표적 연구입니다. 예상대로 박테리오파지(Caudovirales)의 DNA 단편이 발견되었습니다(그림 6b). 그러나 가장 흔한 바이러스 DNA는 핵세포질 대형 DNA 바이러스(NCLDV)라고도 알려진 핵세포바이러스문에 속하며, 이는 모든 바이러스 중에서 가장 큰 게놈을 가지고 있습니다. 이 문 내에서 대부분의 DNA 서열은 척추동물과 절지동물을 자연 숙주로 하는 Mimimidoviridae(58%)와 Poxviridae(21%) 계열에 속하며, 이 DNA 서열 중 일부는 해양 진핵 조류를 감염시키는 것으로 알려진 조류 바이러스에 속합니다. 또한, 알려진 모든 바이러스 속 중에서 가장 큰 게놈 크기를 가진 거대 바이러스인 판도라 바이러스의 서열도 얻었습니다. 흥미롭게도, 혈림프 ccfDNA 시퀀싱을 통해 확인된 바이러스 감염 숙주의 범위는 비교적 넓었습니다(그림 S3, 보충 정보). 여기에는 바쿨로바이러스과(Baculoviridae)와 이리도바이러스과(Iridoviridae)와 같은 곤충을 감염시키는 바이러스뿐만 아니라 아메바, 조류 및 척추동물을 감염시키는 바이러스도 포함됩니다. 또한 Pithovirus sibericum 게놈과 일치하는 시퀀스도 발견했습니다. 피토바이러스(일명 "좀비 바이러스")는 시베리아의 3만 년 된 영구 동토층에서 처음 분리되었습니다[47]. 따라서 우리의 결과는 이러한 바이러스의 모든 현대 종이 멸종된 것은 아니며[48] 이러한 바이러스가 외딴 아한대 해양 생태계에 존재할 수 있다는 이전 보고와 일치합니다.
마지막으로, 다른 다세포 동물의 DNA 조각을 찾을 수 있는지 확인하기 위해 테스트를 수행했습니다. nt, nr 및 RefSeq 라이브러리(게놈 및 단백질)를 사용하여 BLASTN 및 BLASTX를 통해 총 482개의 외래 컨티그가 확인되었습니다. 결과는 다세포 동물의 ccfDNA 외래 조각 중 뼈의 DNA가 가장 많이 포함되어 있음을 보여줍니다(그림 5). 곤충 및 기타 종의 DNA 조각도 발견되었습니다. 상대적으로 많은 DNA 조각이 확인되지 않았는데, 이는 육상 종에 비해 게놈 데이터베이스에서 해양 종의 수가 적기 때문일 가능성이 있습니다[49].
본 논문에서는 LB 개념을 홍합에 적용하여 혈림프 ccfDNA 샷 시퀀싱이 해양 연안 생태계의 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 주장합니다. 구체적으로, 우리는 다음과 같은 사실을 발견했습니다. 1) 홍합 혈림프에는 비교적 큰 크기(약 1-5kb)의 순환 DNA 단편이 비교적 높은 농도(마이크로그램 수준)로 존재합니다. 2) 이러한 DNA 단편은 독립적 및 비독립적입니다. 3) 이러한 DNA 단편의 외부 기원에는 박테리아, 고세균, 바이러스 DNA뿐만 아니라 다른 다세포 동물의 DNA도 포함됩니다. 4) 이러한 외부 ccfDNA 단편은 혈림프에 빠르게 축적되며 홍합의 내부 여과 활동에 기여합니다. 결론적으로, 본 연구는 지금까지 주로 생의학 분야에 적용되어 온 LB 개념이 지표종과 환경 간의 상호작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있는 풍부하지만 아직 탐구되지 않은 지식의 원천을 내포하고 있음을 보여줍니다.
영장류 외에도 쥐, 개, 고양이, 말 등 포유류에서도 ccfDNA 분리가 보고되었습니다[50, 51, 52]. 그러나 본 연구는 개방형 순환계를 가진 해양 생물에서 ccfDNA를 검출하고 염기서열을 분석한 최초의 연구입니다. 홍합의 이러한 해부학적 특징과 여과 능력은 다른 종과 비교하여 순환 DNA 단편의 크기 특성이 다른 이유를 부분적으로 설명할 수 있습니다. 인간의 경우 혈액 내 순환하는 대부분의 DNA 단편은 150~200bp 크기의 작은 단편이며, 최대 크기는 167bp입니다[34, 53]. 300~500bp 크기의 DNA 단편은 적지만 중요한 부분을 차지하며, 약 5%는 900bp보다 깁니다[54]. 이러한 크기 분포의 이유는 혈장 내 ccfDNA의 주요 공급원이 세포 사멸, 즉 건강한 사람의 경우 순환 조혈 세포의 사멸 또는 괴사, 암 환자의 경우 종양 세포의 세포 사멸(순환 종양 DNA, ctDNA)로 인해 발생하기 때문입니다. 우리가 홍합에서 발견한 혈림프 ccfDNA의 크기 분포는 1000~5000 bp 범위였으며, 이는 홍합 ccfDNA의 기원이 다를 수 있음을 시사합니다. 홍합은 반개방형 혈관계를 가지고 있으며 미생물 유전체 DNA 농도가 높은 해양 환경에 서식하기 때문에 이는 타당한 가설입니다. 실제로, 외래 DNA를 사용한 우리 연구실 실험에서는 홍합이 해수에 DNA 조각을 축적하며, 세포 흡수 후 최소 몇 시간 후에 분해되거나 방출되거나 다양한 조직에 저장되는 것을 보여주었습니다. 세포(원핵세포와 진핵세포 모두)의 희소성을 고려할 때, 판막 내 구획을 이용하면 자가 유래뿐 아니라 외부 유래의 ccfDNA 양을 줄일 수 있습니다. 이매패류의 선천성 면역의 중요성과 순환하는 식세포의 수가 많다는 점을 감안하여, 우리는 외부 유래 ccfDNA조차도 미생물 및/또는 세포 파편을 섭취하여 외부 DNA를 축적하는 순환하는 식세포에 풍부하게 존재할 것이라는 가설을 세웠습니다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 이매패류 혈림프 ccfDNA가 분자 정보를 담고 있는 독특한 저장소이며, 이매패류가 지표종으로서의 지위를 더욱 공고히 한다는 것을 보여줍니다.
우리의 데이터는 박테리아 유래 혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱 및 분석이 숙주 박테리아 군집과 주변 해양 생태계에 존재하는 박테리아에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 샷 시퀀싱 기법을 통해 기존의 16S rRNA 식별 방법을 사용했을 경우 참조 라이브러리 편향으로 인해 놓쳤을 A. atra 아가미 공생 박테리아의 서열을 밝혀냈습니다. 실제로, 케르겔렌의 동일한 홍합층에서 M. platensis로부터 수집한 LB 데이터를 사용한 결과, 아가미 관련 박테리아 공생체의 구성이 두 홍합 종 모두에서 동일하다는 것을 보여주었습니다(그림 S4, 보충 정보). 유전적으로 다른 두 홍합의 이러한 유사성은 케르겔렌의 차갑고 유황이 많으며 화산 활동이 활발한 퇴적물에 서식하는 박테리아 군집의 구성을 반영하는 것일 수 있습니다[55, 56, 57, 58]. 생물교란이 일어난 연안 지역[59], 예를 들어 포르토프랑스 해안에서 홍합을 채취할 경우 황 환원 미생물의 수준이 더 높다는 것이 잘 알려져 있습니다. 또 다른 가능성은 홍합 공생 미생물총이 수평적 전파에 의해 영향을 받을 수 있다는 것입니다[60, 61]. 해양 환경, 해저 표면, 그리고 홍합 내 공생 박테리아 구성 간의 상관관계를 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하며, 현재 이러한 연구가 진행 중입니다.
홍합 혈림프 ccfDNA의 길이와 농도, 손쉬운 정제, 그리고 신속한 샷건 시퀀싱을 가능하게 하는 높은 품질은 해양 연안 생태계의 생물 다양성을 평가하는 데 있어 홍합 ccfDNA를 사용하는 데 있어 여러 장점 중 일부입니다. 이 접근법은 특히 특정 생태계의 바이러스 군집(바이롬)을 특성화하는 데 효과적입니다[62, 63]. 박테리아, 고세균, 진핵생물과는 달리 바이러스 게놈에는 16S 서열과 같은 계통발생학적으로 보존된 유전자가 포함되어 있지 않습니다. 우리의 결과는 홍합과 같은 지표 종의 액체 생검을 사용하여 연안 해양 생태계에 서식하는 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 비교적 많은 수의 ccfDNA 바이러스 조각을 식별할 수 있음을 보여줍니다. 여기에는 원생동물, 절지동물, 곤충, 식물을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스와 박테리아 바이러스(예: 박테리오파지)가 포함됩니다. 케르겔렌의 동일한 홍합 군락에서 채집한 푸른 홍합(M. platensis)의 혈림프 ccfDNA 바이러스군을 조사했을 때도 유사한 분포가 관찰되었습니다(표 S2, 보충 정보). ccfDNA의 샷건 시퀀싱은 인간이나 다른 종의 바이러스군 연구에서 점차 주목받고 있는 새로운 접근 방식입니다[21, 37, 64]. 이 접근 방식은 특히 이중 가닥 DNA 바이러스 연구에 유용한데, 모든 이중 가닥 DNA 바이러스에서 공통적으로 보존되는 유전자가 없기 때문입니다. 이중 가닥 DNA 바이러스는 볼티모어에서 가장 다양하고 광범위한 바이러스 부류를 대표합니다[65]. 이러한 바이러스의 대부분은 아직 분류되지 않았으며, 바이러스 세계의 완전히 알려지지 않은 부분에서 유래한 바이러스도 포함될 수 있지만[66], 우리는 홍합 A. atra와 M. platensis의 바이러스군과 숙주 범위가 두 종의 중간 형태임을 발견했습니다(그림 S3, 추가 정보 참조). 이러한 유사성은 환경에 존재하는 DNA를 선택적으로 흡수하지 않는다는 점을 반영하는 것이므로 놀라운 일이 아닙니다. 정제된 RNA를 이용한 추가 연구를 통해 RNA 바이러스군을 규명할 필요가 있다.
본 연구에서는 Kowarski와 동료들의 연구[37]에서 사용된 파이프라인을 엄격하게 적용했습니다. 이 파이프라인은 네이티브 ccfDNA 조립 전후에 풀링된 리드와 컨티그를 2단계로 삭제하는 방식을 사용했는데, 이로 인해 매핑되지 않은 리드의 비율이 높았습니다. 따라서, 특히 이 홍합 종에 대한 참조 게놈이 없기 때문에 매핑되지 않은 리드 중 일부가 여전히 고유한 기원을 가질 가능성을 배제할 수 없습니다. 또한, Illumina MiSeq PE75에서 생성되는 리드 길이와 자체 리드와 비자체 리드 간의 키메라 문제를 고려하여 이 파이프라인을 사용했습니다. 매핑되지 않은 리드가 많은 또 다른 이유는 케르겔렌 섬과 같은 외딴 지역의 해양 미생물 대부분이 아직 주석 처리되지 않았기 때문입니다. 우리는 Illumina MiSeq PE75를 사용하면서 ccfDNA 단편 길이가 인간 ccfDNA와 유사하다고 가정했습니다. 본 연구 결과에서 혈림프 ccfDNA가 인간 및/또는 포유류보다 더 긴 염기서열을 나타낸다는 점을 고려하여, 향후 연구에서는 더 긴 ccfDNA 단편에 적합한 시퀀싱 플랫폼을 사용할 것을 권장합니다. 이를 통해 심층 분석이 필요한 부분을 더 쉽게 식별할 수 있을 것입니다. 현재 확보되지 않은 A. atra의 완전한 핵 게놈 염기서열을 얻는 것 또한 ccfDNA를 자가 유래와 비자가 유래로 구분하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 본 연구는 홍합에 액체 생검 개념을 적용할 가능성에 초점을 맞추었으므로, 향후 연구에서 이 개념이 활용됨에 따라 홍합 해양 생태계의 미생물 다양성 연구에 이 방법을 더욱 효과적으로 활용할 수 있는 새로운 도구와 파이프라인이 개발되기를 기대합니다.
비침습적 임상 바이오마커로서, 사람 혈장 내 ccfDNA 수치 증가는 다양한 질병, 조직 손상 및 스트레스 조건과 관련이 있습니다[67,68,69]. 이러한 증가는 조직 손상 후 자체 유래 DNA 조각이 방출되는 것과 관련이 있습니다. 우리는 홍합을 30°C의 온도에 단시간 노출시키는 급성 열 스트레스를 이용하여 이 문제를 조사했습니다. 세 가지 다른 종류의 홍합을 대상으로 세 번의 독립적인 실험을 수행했습니다. 그러나 급성 열 스트레스 후 ccfDNA 수치의 변화는 발견되지 않았습니다(그림 S5 참조, 추가 정보). 이러한 결과는 홍합이 반개방형 순환계를 가지고 있으며 높은 여과 활동으로 인해 많은 양의 외래 DNA를 축적한다는 사실을 부분적으로 설명할 수 있습니다. 반면에, 많은 무척추동물과 마찬가지로 홍합은 스트레스로 인한 조직 손상에 더 강하여 혈림프 내 ccfDNA 방출을 제한할 수 있습니다[70, 71].
지금까지 수생 생태계의 생물 다양성에 대한 DNA 분석은 주로 환경 DNA(eDNA) 메타바코딩에 집중되어 왔습니다. 그러나 이 방법은 프라이머를 사용할 때 생물 다양성 분석에 한계가 있는 경우가 많습니다. 샷건 시퀀싱을 사용하면 PCR의 한계와 프라이머 세트 선택의 편향을 극복할 수 있습니다. 따라서, 본 연구 방법은 최근 단편화된 DNA를 직접 시퀀싱하고 거의 모든 유기체를 분석할 수 있는 고처리량 eDNA 샷건 시퀀싱 방법과 유사합니다[72, 73]. 하지만 LB 방법은 표준 eDNA 방법과 몇 가지 근본적인 차이점이 있습니다. 물론 eDNA와 LB의 가장 큰 차이점은 자연 여과 숙주를 사용한다는 점입니다. 해면이나 이매패류(Dresselina spp.)와 같은 해양 생물을 eDNA 연구를 위한 자연 여과 숙주로 사용하는 연구가 보고되었습니다[74, 75]. 그러나 Dresselina의 연구는 조직 생검에서 DNA를 추출하는 방식을 사용했습니다. LB에서 추출한 ccfDNA 분석은 조직 생검, 특수하고 때로는 고가의 장비, 그리고 eDNA 또는 조직 생검과 관련된 물류 문제를 필요로 하지 않습니다. 실제로, 우리는 최근 LB에서 추출한 ccfDNA를 냉장 보관 없이 FTA 지원을 통해 저장 및 분석할 수 있다고 보고했는데, 이는 외딴 지역에서의 연구에 있어 주요 과제입니다[76]. 액체 생검에서 ccfDNA를 추출하는 것 또한 간단하며, 샷건 시퀀싱 및 PCR 분석에 적합한 고품질 DNA를 제공합니다. 이는 eDNA 분석과 관련된 몇 가지 기술적 한계를 고려할 때 큰 장점입니다[77]. 샘플링 방법의 단순성과 저비용은 장기 모니터링 프로그램에 특히 적합합니다. 이매패류는 높은 여과 능력 외에도 점액의 화학적 뮤코다당류 구성으로 바이러스 흡수를 촉진하는 것으로 잘 알려져 있습니다[78, 79]. 이러한 특성으로 인해 이매패류는 특정 수생 생태계의 생물 다양성과 기후 변화의 영향을 규명하는 데 이상적인 천연 필터 역할을 합니다. 숙주 유래 DNA 단편의 존재는 eDNA에 비해 이 방법의 한계로 볼 수 있지만, eDNA에 비해 이러한 천연 ccfDNA를 얻는 데 드는 비용은 건강 연구에 활용 가능한 방대한 정보를 고려할 때 충분히 이해할 수 있습니다. 숙주 유래 DNA 단편의 존재는 바이러스 서열이 숙주 게놈에 통합된 경우를 포함합니다. 이는 특히 홍합의 경우, 이매패류에서 수평적으로 전파되는 백혈병 레트로바이러스가 존재한다는 점을 고려할 때 매우 중요합니다[80, 81]. eDNA에 비해 LB의 또 다른 장점은 혈림프 내 순환 혈액 세포의 식세포 작용을 이용하여 미생물(및 그 게놈)을 포식한다는 것입니다. 식세포 작용은 이매패류 혈액 세포의 주요 기능입니다[82]. 마지막으로, 이 방법은 홍합의 높은 여과 능력(평균 1.5L/h의 해수)과 2일간의 순환을 활용하여 해수의 여러 층을 혼합함으로써 이종 eDNA를 포획할 수 있습니다. [83, 84]. 따라서 홍합의 영양학적, 경제적, 환경적 영향을 고려할 때 홍합 ccfDNA 분석은 흥미로운 연구 분야입니다. 인간에서 채취한 LB 분석과 유사하게, 이 방법은 외부 물질에 대한 숙주 DNA의 유전적 및 후성유전적 변화를 측정할 가능성을 열어줍니다. 예를 들어, 3세대 시퀀싱 기술을 이용하여 나노포어 시퀀싱을 통해 천연 ccfDNA의 게놈 전체 메틸화 분석을 수행할 수 있습니다. 홍합 ccfDNA 단편의 길이가 장서열 시퀀싱 플랫폼과 이상적으로 호환되어 화학적 변환 없이 단일 시퀀싱 실행으로 게놈 전체 DNA 메틸화 분석이 가능하다는 점에서 이 과정은 더욱 용이해질 것입니다. [85, 86] DNA 메틸화 패턴은 환경 스트레스에 대한 반응을 반영하고 여러 세대에 걸쳐 지속되는 것으로 나타났기 때문에, 이는 기후 변화나 오염 물질 노출 후 반응을 조절하는 근본적인 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. [87] 그러나 LB 사용에는 한계가 있습니다. 말할 필요도 없이, 이는 생태계에 지표종이 존재해야 함을 의미합니다. 앞서 언급했듯이, 특정 생태계의 생물다양성을 평가하기 위해 LB를 사용하는 것 또한 원천 DNA 조각의 존재를 고려하는 엄격한 생물정보학 파이프라인을 필요로 합니다. 또 다른 주요 문제는 해양 종의 참조 게놈 확보의 어려움입니다. 해양 포유류 게놈 프로젝트(Marine Mammal Genomes Project)와 최근 설립된 Fish10k 프로젝트[88]와 같은 이니셔티브들이 향후 이러한 분석을 용이하게 할 것으로 기대됩니다. 해양 여과 섭식 생물에 LB 개념을 적용하는 것은 최신 시퀀싱 기술의 발전과도 부합하므로, 환경 스트레스에 대한 해양 서식지의 건강 상태에 대한 중요한 정보를 제공하는 다중 옴 바이오마커 개발에 매우 ​​적합합니다.
게놈 시퀀싱 데이터는 NCBI 시퀀스 판독 아카이브(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808)의 생물 프로젝트 SRR8924808에 등록되었습니다.
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