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액체생검(LB)은 생물의학 분야에서 빠르게 인기를 얻고 있는 개념입니다. 이 개념은 주로 다양한 조직에서 세포 사멸 후 작은 조각으로 방출되는 순환 세포외 DNA(ccfDNA) 조각을 검출하는 데 기반합니다. 이러한 조각 중 일부는 외부 조직이나 생물체에서 유래합니다. 본 연구에서는 이 개념을 높은 해수 여과 능력으로 알려진 파수꾼 종인 홍합에 적용했습니다. 홍합이 자연 필터 역할을 하는 능력을 활용하여 다양한 출처에서 환경 DNA 조각을 포집하여 해양 연안 생태계의 생물다양성에 대한 정보를 제공합니다. 연구 결과, 홍합 혈림프에는 1kb에서 5kb까지 크기가 매우 다양한 DNA 조각이 포함되어 있음을 보여주었습니다. 샷건 시퀀싱 결과, 많은 DNA 조각이 외부 미생물 유래임을 확인했습니다. 그중에서도 박테리아, 고균, 바이러스의 DNA 조각이 발견되었으며, 여기에는 연안 해양 생태계에서 흔히 발견되는 다양한 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 바이러스도 포함됩니다. 결론적으로, 본 연구는 홍합에 적용된 LB 개념이 해양 연안 생태계의 미생물 다양성에 대한 풍부하지만 아직 탐구되지 않은 지식의 원천임을 보여줍니다.
기후 변화(CC)가 해양 생태계의 생물 다양성에 미치는 영향은 빠르게 성장하는 연구 분야입니다. 지구 온난화는 중요한 생리적 스트레스를 유발할 뿐만 아니라 해양 생물의 열 안정성의 진화적 한계를 밀어붙여 여러 종의 서식지에 영향을 미치고 더 유리한 조건을 찾도록 유도합니다[1, 2]. CC는 후생동물의 생물 다양성에 영향을 미치는 것 외에도 숙주-미생물 상호작용의 섬세한 균형을 파괴합니다. 이러한 미생물 불균형은 해양 생물을 감염성 병원체에 더 취약하게 만들어 해양 생태계에 심각한 위협을 가합니다[3, 4]. SS는 대량 사망에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지며, 이는 전 세계 해양 생태계 관리에 심각한 문제입니다[5, 6]. 이는 많은 해양 종의 경제적, 생태적, 영양적 영향을 감안할 때 중요한 문제입니다. 특히 CK의 영향이 더 즉각적이고 심각한 극지방에 서식하는 이매패류의 경우 더욱 그렇습니다[6, 7]. 실제로 Mytilus spp.와 같은 이매패류는 해양 생태계에 대한 CC의 영향을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 놀랍지 않게도, 효소 활성이나 세포 생존력 및 식세포 활동과 같은 세포 기능에 기반한 기능적 바이오마커를 포함하는 2단계 접근법을 사용하여 이매패류의 건강을 모니터링하기 위해 비교적 많은 수의 바이오마커가 개발되었습니다[8]. 이러한 방법에는 대량의 해수 흡수 후 연조직에 축적되는 특정 압력 지표의 농도 측정도 포함됩니다. 그러나 이매패류의 높은 여과 용량과 반개방 순환계는 환자 관리에 대한 간단하고 최소 침습적 접근법인 액체 생검(LB) 개념을 사용하여 새로운 혈림프 바이오마커를 개발할 수 있는 기회를 제공합니다. 혈액 샘플[9, 10]. 인간 LB에서 여러 유형의 순환 분자가 발견될 수 있지만, 이 개념은 주로 혈장 내 순환 세포외 DNA(ccfDNA) 단편의 DNA 시퀀싱 분석에 기반합니다. 실제로 인간 혈장에서 순환 DNA의 존재는 20세기 중반부터 알려져 왔지만[11], 고처리량 시퀀싱 방법의 등장으로 ccfDNA를 기반으로 한 임상 진단이 가능해진 것은 최근의 일입니다. 이러한 순환 DNA 단편의 존재는 세포 사멸 후 핵 및 미토콘드리아 게놈 DNA가 수동적으로 방출되기 때문입니다. 건강한 사람의 경우 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮습니다(<10 ng/mL). 하지만 다양한 병리를 앓거나 스트레스를 받는 환자의 경우 5~10배까지 증가하여 조직 손상이 발생할 수 있습니다. 건강한 사람의 경우 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮습니다(<10 ng/mL). 하지만 다양한 병리를 앓거나 스트레스를 받는 환자의 경우 5~10배까지 증가하여 조직 손상이 발생할 수 있습니다. У здоровых лудей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией 및 подвергавичся стрессу, приводяЂему к повреждениу тканей. 건강한 사람의 경우 cccDNA 농도는 일반적으로 낮습니다(<10 ng/mL). 하지만 다양한 병리를 앓거나 조직 손상으로 이어지는 스트레스를 받는 환자의 경우 5~10배까지 증가할 수 있습니다.에서 ccfDNA의 속도는 일반적으로 10ng/mL 미만이며, 但患有各种病理或承受压력적患者中可增加5-10倍，从而导致组织损伤。健康 个体 中 , ccfdna 的 浓titude 较 低 （(<10 ng/ml) 但 各 种 病理 或 承受 压력 患者 中 可 增加 5-10 倍 ，从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых лудей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждениу тканей. 건강한 사람의 경우 ccfDNA 농도는 일반적으로 낮습니다(<10 ng/ml). 하지만 다양한 병리나 스트레스를 받는 환자의 경우 5~10배까지 증가할 수 있으며, 조직 손상이 발생할 수 있습니다.ccfDNA 단편의 크기는 매우 다양하지만 일반적으로 150~200bp 범위입니다.[12] 자가 유래 ccfDNA, 즉 정상 또는 형질 전환된 숙주 세포의 ccfDNA를 분석하면 핵 및/또는 미토콘드리아 유전체에 존재하는 유전적 및 후성유전적 변화를 감지하여 임상의가 특정 분자 표적 치료법을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다.[13] 그러나 ccfDNA는 임신 중 태아 세포나 이식된 장기의 ccfDNA와 같은 이물질 공급원에서 얻을 수도 있습니다.[14,15,16,17]. ccfDNA는 또한 감염원(이물질)의 핵산 존재를 감지하기 위한 중요한 정보원이며, 혈액 배양으로 확인되지 않는 광범위한 감염을 비침습적으로 감지하여 감염된 조직의 침습적 생검을 피할 수 있습니다.[18] 최근 연구에 따르면 인간 혈액에는 바이러스 및 박테리아 병원균을 식별하는 데 사용할 수 있는 풍부한 정보가 포함되어 있으며, 인간 혈장에서 발견되는 ccfDNA의 약 1%가 외래 유래라는 사실이 밝혀졌습니다[19]. 이러한 연구들은 ccfDNA 분석을 통해 생물체 내 순환 미생물군집의 생물다양성을 평가할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 최근까지 이 개념은 인간에게만 사용되었으며, 다른 척추동물에서는 그보다 덜 사용되었습니다[20, 21].
본 논문에서는 LB 퍼텐셜을 이용하여 3,500만 년 전에 형성된 거대한 고원 위에 있는 섬들인 아남극 케르겔렌 제도에서 흔히 발견되는 남방종인 아울라코미아 아트라(Aulacomya atra)의 ccfDNA를 분석합니다. 화산 폭발. 시험관 내 실험 시스템을 사용하여 해수에 있는 DNA 조각이 홍합에 의해 빠르게 흡수되어 혈림프 구획으로 유입되는 것을 발견했습니다. 샷건 시퀀싱을 통해 홍합 혈림프 ccfDNA는 공생 박테리아와 차가운 화산 해양 연안 생태계의 전형적인 생물군에서 유래한 DNA 조각을 포함하여 자체 유래 및 비자기 유래 DNA 조각을 포함하고 있음을 보여주었습니다. 혈림프 ccfDNA는 또한 다양한 숙주 범위를 가진 바이러스에서 유래한 바이러스 서열을 포함합니다. 또한 경골어류, 말미잘, 조류, 곤충과 같은 다세포 동물의 DNA 조각도 발견했습니다. 결론적으로, 본 연구는 LB 개념이 해양 무척추동물에 성공적으로 적용되어 해양 생태계에서 풍부한 게놈 레퍼토리를 생성할 수 있음을 보여줍니다.
성체(길이 55~70mm)인 Mytilus platensis(M. platensis)와 Aulacomya atra(A. atra)를 포르토프랑스(남위 049°21.235, 동경 070°13.490)의 조간대 바위 해안에서 채집했습니다. 2018년 12월 케르겔렌 섬에서 채집했습니다. 다른 성체 푸른 홍합(Mytilus spp.)은 상업용 공급업체(PEI Mussel King Inc., 프린스 에드워드 아일랜드, 캐나다)에서 구입하여 32‰ 인공 소금물(인공 해염 Reef Crystal, Instant Ocean, 버지니아, 미국) 10~20L가 담긴 온도 조절식(4°C) 통기 탱크에 넣었습니다. 각 실험에서 개별 껍질의 길이와 무게를 측정했습니다.
이 프로그램에 대한 무료 오픈 액세스 프로토콜은 온라인에서 제공됩니다(https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). 간략하게 설명하면, LB 혈림프는 [22]에 설명된 대로 외전근에서 수집되었습니다. 혈림프는 1200×g에서 3분간 원심분리하여 정제되었고, 상층액은 사용하기 전까지 냉동(-20°C)되었습니다. cfDNA의 분리 및 정제를 위해 샘플(1.5-2.0 ml)을 해동하고 제조업체의 지침에 따라 NucleoSnap cfDNA 키트(Macherey-Nagel, Bethlehen, PA)를 사용하여 처리했습니다. ccfDNA는 추가 분석까지 -80°C에 보관했습니다. 일부 실험에서는 QIAamp DNA Investigator Kit(QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada)를 사용하여 ccfDNA를 분리하고 정제했습니다. 정제된 DNA는 표준 PicoGreen 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 분리된 ccfDNA의 단편 분포는 Agilent 2100 바이오분석기(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)와 고감도 DNA 키트를 사용하여 모세관 전기영동으로 분석했습니다. 분석은 제조사의 지침에 따라 1 µl의 ccfDNA 샘플을 사용하여 수행했습니다.
혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱을 위해, Génome Québec(캐나다 퀘벡주 몬트리올)은 Illumina MiSeq PE75 키트의 Illumina DNA Mix 키트를 사용하여 샷건 라이브러리를 준비했습니다. 표준 어댑터(BioO)를 사용했습니다. 원시 데이터 파일은 NCBI Sequence Read Archive(SRR8924808 및 SRR8924809)에서 사용할 수 있습니다. 기본 판독 품질은 FastQC[23]를 사용하여 평가했습니다. 클리핑 어댑터 및 품질이 낮은 판독에는 Trimmomatic[24]을 사용했습니다. 쌍을 이루는 말단을 가진 샷건 판독은 불일치를 방지하기 위해 최소 20bp의 중복을 갖는 더 긴 단일 판독으로 FLASH 병합했습니다[25]. 병합된 읽기는 이매패 NCBI 분류 데이터베이스(e 값 < 1e−3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석이 달렸고, 낮은 복잡도 시퀀스의 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다. 병합된 읽기는 이매패 NCBI 분류 데이터베이스(e 값 < 1e−3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석이 달렸고, 낮은 복잡도 시퀀스의 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다. Объединенные чтения были аннотированы с помочиваны БLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллусков NCBI(значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием 먼지 [26]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류 데이터베이스(e 값 < 1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석이 달렸고, 낮은 복잡도의 시퀀스 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다.使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 와90% 同源性) 用BLASTN 注释合并的读数 ，并使用 DUST [26] 이 여행은 최고의 즐거움을 선사합니다.使用 双 壳类 ncbi 分类 （(<1e-3 and 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 먼지 [26] 进行 复杂島 序列 的。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помочатых BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллусков NCBI(значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием 먼지 [26]. 풀링된 읽기는 NCBI 이매패류 분류 데이터베이스(e 값 <1e-3 및 90% 상동성)를 사용하여 BLASTN으로 주석이 달렸고, 낮은 복잡도의 시퀀스 마스킹은 DUST[26]를 사용하여 수행되었습니다.리드는 이매패류 서열과 관련된 리드(본 연구에서는 자체 리드라고 함)와 관련 없는 리드(비자체 리드)의 두 그룹으로 나뉘었습니다. 두 그룹은 MEGAHIT을 사용하여 별도로 조립하여 콘티그를 생성했습니다[27]. 한편, 외래 미생물군집 리드의 분류학적 분포는 Kraken2[28]를 사용하여 분류하고 Galaxy[29, 30]에서 크로나 파이 차트로 그래픽으로 표현했습니다. 예비 실험에서 최적의 kmers는 kmers-59로 결정되었습니다. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(이매패 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 정렬하여 자체 콘티그를 식별했습니다. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(이매패 NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)을 사용하여 정렬하여 자체 콘티그를 식별했습니다. BLASTN(NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. 그런 다음 최종 주석을 위해 BLASTN(NCBI 이매패 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과 일치시켜 자체 콘티그를 식별했습니다.BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 and60% 同源性)对齐来识别自身叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 이 문서는 BLASTN에 대한 정보를 제공합니다. для двустворчатых моллусков, значение e <1e-10 и гомология 60%). 그런 다음 자체 콘티그를 BLASTN(NCBI 이매패 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)과 일치시켜 최종 주석을 위해 식별했습니다. 동시에 비자체 그룹 콘티그는 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)으로 주석이 달렸습니다. 동시에 비자체 그룹 콘티그는 BLASTN(nt NCBI 데이터베이스, e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)으로 주석이 달렸습니다. Pараллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помочеваны с помочьù BLASTN(база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология) 60%). 동시에, 외국 그룹 콘티그는 BLASTN(NT NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성)으로 주석이 달렸습니다.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释不自身组중叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释不自身组중叠群。 Pараллельно Контиги, не относячеся к собственной группе, были аннотированы с помочене BLASTN(база данных nt NCBI, значение e <1e-10 및 гомология 60%). 동시에 비자체 그룹 콘티그는 BLASTN으로 주석이 달렸습니다(nt NCBI 데이터베이스, e 값 <1e-10 및 60% 상동성). BLASTX는 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스(e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자가 콘티그에 대해서도 수행되었습니다. BLASTX는 nr 및 RefSeq 단백질 NCBI 데이터베이스(e 값 < 1e−10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자가 콘티그에 대해서도 수행되었습니다. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI(значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX는 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스(e 값 < 1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자가 콘티그에 대해서도 수행되었습니다.还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对不自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 and60% 同源性).还使用nr 와RefSeq 蛋白NCBI 数据库对不自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 and60% 同源性). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI(значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX는 nr 및 RefSeq NCBI 단백질 데이터베이스(e 값 <1e-10 및 60% 상동성)를 사용하여 비자가 콘티그에 대해서도 수행되었습니다.비자체 콘티그의 BLASTN 및 BLASTX 풀은 최종 콘티그를 나타냅니다(보충 파일 참조).
PCR에 사용된 프라이머는 표 S1에 나열되어 있습니다. Taq DNA polymerase(Bio Basic Canada, Markham, ON)를 사용하여 ccfDNA 표적 유전자를 증폭했습니다. 반응 조건은 다음과 같습니다. 95°C에서 3분 변성, 95°C에서 1분, 어닐링 온도에서 1분, 72°C에서 1분 신장, 35회 반복, 마지막으로 72°C에서 10분 이내에 수행했습니다. PCR 산물은 SYBRTM Safe DNA Gel Stain(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)을 첨가한 아가로스 겔(1.5%)에서 95V로 전기영동하여 분리했습니다.
홍합(Mytilus spp.)을 500 ml의 산소화된 해수(32 PSU)에 4°C에서 24시간 동안 순화시켰다. 인간 갈렉틴-7 cDNA 서열(NCBI 접근 번호 L07769)을 암호화하는 삽입물을 포함하는 플라스미드 DNA를 최종 농도 190 μg/μl가 되도록 바이알에 첨가했다. DNA를 첨가하지 않고 동일한 조건에서 배양한 홍합을 대조군으로 사용했다. 세 번째 대조군 탱크에는 홍합이 없는 DNA가 들어 있었다. 해수 내 DNA의 품질을 모니터링하기 위해, 지정된 시간에 각 탱크에서 해수 시료(20 μl, 3회 반복)를 채취했다. 플라스미드 DNA 추적을 위해, 지정된 시간에 LB 홍합을 수확하여 qPCR 및 ddPCR로 분석했다. 해수의 높은 염 함량으로 인해, 모든 PCR 분석 전에 분취량을 PCR 품질 물(1:10)에 희석했다.
디지털 드롭릿 PCR(ddPCR)은 BioRad QX200 프로토콜(캐나다 온타리오주 미시소거)을 사용하여 수행했습니다. 온도 프로파일을 사용하여 최적 온도를 결정했습니다(표 S1). 드롭은 QX200 드롭 제너레이터(BioRad)를 사용하여 생성했습니다. ddPCR은 다음과 같이 수행했습니다. 95°C에서 5분, 95°C에서 30초, 주어진 어닐링 온도에서 1분, 72°C에서 30초, 4°C에서 5분, 90°C에서 5분 동안의 50회 사이클. 드롭 수와 양성 반응(복제 수/µl)은 QX200 드롭 리더(BioRad)를 사용하여 측정했습니다. 드롭릿이 10,000개 미만인 샘플은 제외했습니다. 패턴 제어는 ddPCR을 실행할 때마다 수행하지 않았습니다.
qPCR은 Rotor-Gene® 3000(Corbett Research, Sydney, Australia)과 LGALS7 특이 프라이머를 사용하여 수행했습니다. 모든 정량 PCR은 QuantiFast SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)을 사용하여 20 µl에서 수행했습니다. qPCR은 95°C에서 15분간 배양한 후, 95°C에서 10초, 60°C에서 60초 동안 40회 반복하고, 한 번의 데이터 수집을 수행했습니다. 용융 곡선은 qPCR 종료 시 95°C에서 5초, 65°C에서 60초, 그리고 97°C에서 연속 측정하여 생성했습니다. 대조군을 제외한 모든 qPCR은 3회 반복 수행했습니다.
홍합은 높은 여과율로 알려져 있기 때문에, 저희는 홍합이 해수에 존재하는 DNA 단편을 여과하고 보유할 수 있는지 먼저 조사했습니다. 또한 이러한 단편이 홍합의 반개방 림프계에 축적되는지 여부에도 관심이 있었습니다. 저희는 푸른 홍합 탱크에 첨가된 가용성 DNA 단편의 이동 경로를 추적하여 이 문제를 실험적으로 해결했습니다. DNA 단편 추적을 용이하게 하기 위해 인간 갈렉틴-7 유전자를 포함하는 외래(자가가 아닌) 플라스미드 DNA를 사용했습니다. ddPCR은 해수와 홍합에서 플라스미드 DNA 단편을 추적합니다. 저희의 결과는 홍합이 없는 경우 해수 내 DNA 단편의 양이 시간 경과에 따라(최대 7일) 비교적 일정하게 유지되었지만, 홍합이 있는 경우 이 수준이 8시간 이내에 거의 완전히 사라짐을 보여줍니다(그림 1a, b). 외래 DNA 단편은 판막 내액과 혈림프에서 15분 이내에 쉽게 검출되었습니다(그림 1c). 이러한 단편은 노출 후 최대 4시간까지 검출될 수 있었습니다. DNA 단편에 대한 이러한 여과 활성은 박테리아 및 조류의 여과 활성과 유사합니다[31]. 이러한 결과는 홍합이 유체 구획에서 이물질 DNA를 여과하고 축적할 수 있음을 시사합니다.
홍합이 있을 때(A) 또는 없을 때(B) 해수 내 플라스미드 DNA의 상대 농도를 ddPCR로 측정한 결과입니다. A에서는 결과를 백분율로 표시했으며, 상자의 경계는 75번째 백분위수와 25번째 백분위수를 나타냅니다. 적합된 대수 곡선은 빨간색으로 표시되었고, 회색 음영 영역은 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. B에서는 빨간색 선은 평균을, 파란색 선은 농도의 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. C는 플라스미드 DNA를 첨가한 후 여러 시점에서 홍합의 혈림프액과 판막액에 축적된 플라스미드 DNA의 양을 보여줍니다. 결과는 절대 검출량/mL(±SE)으로 나타냅니다.
다음으로, 우리는 인위적인 영향이 제한적인 외딴 섬들인 케르겔렌 섬의 홍합밭에서 수집한 홍합에서 ccfDNA의 기원을 조사했습니다. 이를 위해 홍합 혈림프에서 cccDNA를 분리하고 일반적으로 인간 cccDNA를 정제하는 데 사용되는 방법으로 정제했습니다[32, 33]. 우리는 홍합의 평균 혈림프 ccfDNA 농도가 혈림프 ml당 낮은 마이크로그램 범위에 있음을 발견했습니다(표 S2, 보충 정보 참조). 이 농도 범위는 건강한 사람(밀리리터당 낮은 나노그램)보다 훨씬 높지만 드물게 암 환자의 경우 ccfDNA 수준이 밀리리터당 수 마이크로그램에 도달할 수 있습니다[34, 35]. 혈림프 ccfDNA의 크기 분포를 분석한 결과 이러한 단편의 크기가 1000bp에서 1000bp, 최대 5000bp까지 매우 다양하다는 것을 보여주었습니다(그림 2). ccfDNA를 포함한 저농도 DNA 샘플에서 게놈 DNA를 빠르게 분리하고 정제하기 위해 법의학에서 일반적으로 사용되는 방법인 실리카 기반 QIAamp Investigator Kit를 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다[36].
홍합 혈림프의 대표적인 ccfDNA 전기영동도. NucleoSnap Plasma Kit(위)와 QIAamp DNA Investigator Kit로 추출함. B. 홍합의 혈림프 ccfDNA 농도 분포(±SE)를 보여주는 바이올린 플롯. 검은색 선과 빨간색 선은 각각 중앙값과 1사분위수, 3사분위수를 나타냄.
인간과 영장류의 ccfDNA 중 약 1%는 외래 유래입니다[21, 37]. 이매패류의 반개방 순환계, 미생물이 풍부한 해수, 그리고 홍합 ccfDNA의 크기 분포를 고려할 때, 홍합 혈림프 ccfDNA에는 풍부하고 다양한 미생물 DNA 풀이 포함되어 있을 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 검증하기 위해, 케르겔렌 섬에서 채취한 Aulacomya atra 샘플의 혈림프 ccfDNA를 시퀀싱하여 1,000만 개 이상의 리드를 얻었으며, 이 중 97.6%가 품질 관리를 통과했습니다. 이후, BLASTN 및 NCBI 이매패류 데이터베이스를 사용하여 자가 및 비자가 유래된 리드를 분류했습니다(그림 S1, 보충 정보).
인간의 경우 핵 DNA와 미토콘드리아 DNA가 모두 혈류로 방출될 수 있습니다[38]. 그러나 본 연구에서는 A. atra 유전체가 시퀀싱되거나 설명되지 않았기 때문에 홍합의 핵 유전체 DNA를 자세히 설명할 수 없었습니다. 그러나 우리는 이매패 라이브러리를 사용하여 우리 자신의 기원의 여러 ccfDNA 단편을 식별할 수 있었습니다(그림 S2, 보충 정보). 또한 시퀀싱된 A. atra 유전자의 지시된 PCR 증폭을 통해 우리 자신의 기원 DNA 단편의 존재를 확인했습니다(그림 3). 마찬가지로 A. atra의 미토콘드리아 유전체가 공공 데이터베이스에서 사용 가능하다는 점을 감안할 때 A. atra의 혈림프에서 미토콘드리아 ccfDNA 단편의 존재에 대한 증거를 찾을 수 있습니다. 미토콘드리아 DNA 단편의 존재는 PCR 증폭을 통해 확인되었습니다(그림 3).
다양한 미토콘드리아 유전자가 PCR로 증폭된 A. atra(빨간색 점 - 스톡 번호: SRX5705969)와 M. platensis(파란색 점 - 스톡 번호: SRX5705968)의 혈림프에서 발견되었습니다. 그림은 Breton et al., 2011 B에서 발췌했습니다. A. atra의 혈림프 상층액 증폭. FTA 종이에 보관. 3mm 펀치를 사용하여 PCR 혼합물이 담긴 PCR 튜브에 직접 첨가합니다.
해수에 풍부한 미생물 함량이 있다는 점을 고려하여, 우리는 처음에 혈림프에서 미생물 DNA 서열의 특성화에 초점을 맞췄습니다. 이를 위해 두 가지 다른 전략을 사용했습니다. 첫 번째 전략은 BLAST 및 기타 도구와 비교할 수 있는 정확도로 미생물 서열을 식별할 수 있는 알고리즘 기반 서열 분류 프로그램인 Kraken2를 사용했습니다[28]. 6719개 이상의 판독이 박테리아 유래로 결정되었고, 124개와 64개가 각각 고균과 바이러스에서 유래되었습니다(그림 4). 가장 풍부한 박테리아 DNA 단편은 Firmicutes(46%), Proteobacteria(27%), Bacteroidetes(17%)였습니다(그림 4a). 이 분포는 해양 청홍합 미생물군집에 대한 이전 연구[39, 40]와 일치합니다. Gammaproteobacteria는 많은 Vibrionales를 포함하여 Proteobacteria의 주요 클래스(44%)였습니다(그림 4b). ddPCR 방법을 통해 A. atra 혈림프의 ccfDNA에서 Vibrio DNA 단편의 존재가 확인되었습니다(그림 4c) [41]. ccfDNA의 박테리아 기원에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 추가적인 접근법이 사용되었습니다(그림 S2, 보충 정보). 이 경우, 중복된 읽기는 쌍방향 읽기로 조립되었고 BLASTN과 1e−3의 e 값과 90% 이상 상동성을 갖는 임계값을 사용하여 자기 기원(이매패류) 또는 비자기 기원으로 분류되었습니다. 이 경우, 중복된 읽기는 쌍방향 읽기로 조립되었고 BLASTN과 1e−3의 e 값과 90% 이상 상동성을 갖는 임계값을 사용하여 자기 기원(이매패류) 또는 비자기 기원으로 분류되었습니다. В этом случае перекрываучиеся чтения были собраны как чтения с parными konцами 및 были классифицированы как собственные (двустворчатые молуски) или чужие по происхожденик с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. 이 경우 중복되는 판독은 쌍방향 판독으로 수집되었고 BLASTN과 1e-3의 e 값과 90% 이상의 상동성을 갖는 임계값을 사용하여 기본(이매패류) 또는 비원본으로 분류되었습니다.에서 这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用 BLASTN 과 1e-3 적 e 值화>90%同源性截止值分类为自身(双壳类)或不自身来源.에서 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 과 1e-3 적 值 와> 90% 유사성 적 공유自身 （双 壳类） 不 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывавававаны как собственные (двустворчатые моллуски) или несобственные по происхожденик с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. 이 경우, 중복되는 판독은 쌍방향 판독으로 수집되었고 e BLASTN 및 1e-3 값과 상동성 임계값 >90%를 사용하여 자체(이매패류) 또는 비원본으로 분류되었습니다.A. atra 유전체는 아직 시퀀싱되지 않았기 때문에, MEGAHIT 차세대 시퀀싱(NGS) 어셈블러의 de novo 어셈블리 전략을 사용했습니다. 총 147,188개의 콘티그가 기원에 따라 종속적인 이매패류(bivalves)로 확인되었습니다. 이 콘티그들은 BLASTN과 BLASTX를 사용하여 1e-10의 e-값으로 분해되었습니다. 이 전략을 통해 A. atra ccfDNA에서 482개의 비이매패류 단편을 확인할 수 있었습니다. 이 DNA 단편의 절반 이상(57%)은 박테리아, 주로 아황산영양 공생체를 포함한 아가미 공생체와 아가미 공생체인 솔레미아 벨룸(Solemya velum)에서 추출되었습니다(그림 5).
유형 수준에서의 상대적 풍부도. B 두 주요 문(피르미쿠테스와 프로테오박테리아)의 미생물 다양성. ddPCR의 대표적 증폭. C 비브리오 속. A. 세 개의 무균 혈림프에서 16S rRNA 유전자 단편(파란색).
수집된 총 482개의 콘티그를 분석했습니다. 메타게놈 콘티그 어노테이션(원핵생물 및 진핵생물)의 분류학적 분포에 대한 일반적인 개요. B BLASTN 및 BLASTX로 동정된 박테리아 DNA 단편의 상세 분포.
Kraken2 분석은 또한 홍합 ccfDNA에 Euryarchaeota(65%), Crenarchaeota(24%), Thaurmarcheota(11%)의 DNA 조각을 포함한 고균 DNA 조각이 포함되어 있음을 보여주었습니다(그림 6a). 이전에 캘리포니아 홍합의 미생물 군집에서 발견된 Euryarchaeota와 Crenarchaeota에서 유래한 DNA 조각의 존재는 놀라운 일이 아닙니다[42]. Euryarchaeota는 종종 극한 조건과 관련이 있지만 이제는 Euryarchaeota와 Crenarcheota가 모두 해양 극저온 환경에서 가장 흔한 원핵생물에 속한다는 것이 알려졌습니다[43, 44]. 최근 케르겔렌 고원의 바닥 누출로 인한 광범위한 메탄 누출[45]과 케르겔렌 섬 해안에서 관찰된 미생물 메탄 생성[46]에 대한 보고가 있는 것을 감안할 때 홍합에 메탄 생성 미생물이 존재한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.
그 후 우리의 관심은 DNA 바이러스의 판독으로 옮겨갔습니다. 우리가 아는 한, 이것은 홍합의 바이러스 함량에 대한 최초의 오프타겟 연구입니다. 예상대로 박테리오파지(Caudovirales)의 DNA 단편을 발견했습니다(그림 6b). 그러나 가장 흔한 바이러스 DNA는 핵세포질 대형 DNA 바이러스(NCLDV)로도 알려진 핵세포바이러스 문에서 유래하며, 모든 바이러스 중 가장 큰 게놈을 가지고 있습니다. 이 문 내에서 대부분의 DNA 서열은 자연 숙주에 척추동물과 절지동물이 포함되는 Mimimidoviridae(58%)와 Poxviridae(21%) 과에 속하지만, 이 DNA 서열 중 일부는 알려진 바이러스성 조류에 속합니다. 해양 진핵 조류를 감염시킵니다. 이 서열은 알려진 바이러스 속 중 가장 큰 게놈 크기를 가진 거대 바이러스인 판도라 바이러스에서도 얻었습니다. 흥미롭게도, 혈림프 ccfDNA 시퀀싱으로 확인된 바이러스에 감염된 것으로 알려진 숙주의 범위는 비교적 컸습니다(그림 S3, 보충 정보). 여기에는 바큘로바이러스과(Baculoviridae) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)와 같은 곤충을 감염시키는 바이러스와 아메바, 조류 및 척추동물을 감염시키는 바이러스가 포함됩니다. 또한 Pithovirus sibericum 게놈과 일치하는 서열을 발견했습니다. 피토바이러스(좀비 바이러스라고도 함)는 시베리아의 3만 년 된 영구 동토층에서 처음 분리되었습니다[47]. 따라서 저희의 결과는 이러한 바이러스의 모든 현대 종이 멸종된 것은 아니며[48] 이러한 바이러스가 먼 아북극 해양 생태계에 존재할 수 있음을 보여주는 이전 보고와 일치합니다.
마지막으로, 다른 다세포 동물의 DNA 단편을 찾을 수 있는지 시험했습니다. 총 482개의 외래 콘티그가 nt, nr 및 RefSeq 라이브러리(게놈 및 단백질)를 사용하여 BLASTN 및 BLASTX를 통해 식별되었습니다. 결과에 따르면 다세포 동물의 ccfDNA 외래 단편 중에서 뼈 DNA가 우세합니다(그림 5). 곤충 및 기타 종의 DNA 단편도 발견되었습니다. DNA 단편의 비교적 많은 부분이 식별되지 않았는데, 이는 육상 종에 비해 게놈 데이터베이스에서 많은 수의 해양 종이 과소 표현되어 있기 때문일 수 있습니다[49].
본 논문에서는 LB 개념을 홍합에 적용하여 혈림프 ccfDNA 샷 시퀀싱이 해양 연안 생태계 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다고 주장합니다. 특히, 1) 홍합 혈림프에는 비교적 큰(~1-5 kb) 순환 DNA 단편이 비교적 높은 농도(마이크로그램 수준)로 포함되어 있다는 점, 2) 이러한 DNA 단편은 독립적이면서도 비독립적이라는 점, 3) 이러한 DNA 단편의 외래 출처 중에서 박테리아, 고균, 바이러스 DNA와 다른 다세포 동물의 DNA가 발견되었다는 점, 4) 혈림프에서 이러한 외래 ccfDNA 단편의 축적은 빠르게 발생하며 홍합의 내부 여과 활동에 기여한다는 점을 발견했습니다. 결론적으로, 본 연구는 지금까지 주로 생의학 분야에 적용되어 온 LB 개념이 감시종과 환경 간의 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 사용될 수 있는 풍부하지만 탐구되지 않은 지식의 원천을 담고 있음을 보여줍니다.
영어: 영장류 외에도 쥐, 개, 고양이, 말을 포함한 포유류에서 ccfDNA 분리가 보고되었습니다[50, 51, 52]. 그러나 우리가 아는 한, 우리 연구는 개방 순환 시스템을 가진 해양 종에서 ccfDNA의 검출 및 시퀀싱을 보고한 최초의 연구입니다. 홍합의 이러한 해부학적 특징과 여과 능력은 적어도 부분적으로 다른 종과 비교하여 순환 DNA 단편의 크기 특성이 다른 이유를 설명할 수 있습니다. 인간의 경우 혈액을 순환하는 대부분의 DNA 단편은 크기가 150~200bp인 작은 단편이며 최대 피크는 167bp입니다[34, 53]. DNA 단편 중 작지만 중요한 부분은 크기가 300~500bp이고 약 5%는 900bp보다 깁니다.[54]. 이러한 크기 분포의 이유는 혈장에서 ccfDNA의 주요 공급원이 세포 사멸의 결과로 발생하기 때문입니다. 즉, 건강한 개체에서는 세포 사멸이나 순환 조혈 세포의 괴사로 인해, 암 환자에서는 종양 세포의 세포 사멸(순환 종양 DNA, ctDNA라고 함)로 인해 발생합니다. 홍합에서 발견한 혈림프 ccfDNA의 크기 분포는 1000~5000bp로, 홍합 ccfDNA의 기원이 다를 수 있음을 시사합니다. 홍합은 반개방형 혈관계를 가지고 있으며 미생물 유전체 DNA가 고농도로 함유된 해양 수생 환경에 서식하기 때문에 이는 논리적인 가설입니다. 실제로 외인성 DNA를 사용한 실험실 실험에서 홍합은 해수에 DNA 단편을 축적하며, 적어도 몇 시간 후에는 세포 흡수 후 분해되거나 다양한 조직에 방출 및/또는 저장된다는 사실이 밝혀졌습니다. 세포(원핵생물과 진핵생물 모두)의 희소성을 고려할 때, 판막 내 구획을 사용하면 자가 유래뿐만 아니라 외래 유래에서 유래하는 ccfDNA의 양도 감소할 것입니다. 이매패류의 선천 면역의 중요성과 순환 식세포의 수가 많다는 점을 고려하여, 미생물 및/또는 세포 파편을 섭취하면 외래 DNA를 축적하는 순환 식세포에도 외래 ccfDNA가 풍부하게 존재한다는 가설을 세웠습니다. 종합적으로, 본 연구 결과는 이매패류 혈림프의 ccfDNA가 분자 정보의 고유한 저장소임을 보여주며, 이매패류가 파수꾼 종으로서의 지위를 강화해 줍니다.
본 연구의 데이터는 박테리아 유래 혈림프 ccfDNA 단편의 시퀀싱 및 분석을 통해 숙주 박테리아 군집과 주변 해양 생태계에 존재하는 박테리아에 대한 핵심 정보를 제공할 수 있음을 시사한다. 샷 시퀀싱 기법을 통해 기존의 16S rRNA 동정법을 사용했다면 참조 라이브러리 편향으로 인해 놓쳤을 공생 박테리아인 A. atra gill의 서열이 밝혀졌다. 실제로, 케르겔렌의 동일한 홍합층에서 M. platensis로부터 수집한 LB 데이터를 사용한 결과, 두 홍합 종 모두 아가미 관련 공생 박테리아의 구성이 동일함을 보여주었다(그림 S4, 보충 정보). 유전적으로 다른 두 홍합의 이러한 유사성은 케르겔렌의 차갑고 유황이 함유된 화산 퇴적층의 박테리아 군집 구성을 반영할 수 있다[55, 56, 57, 58]. 포르토프랑스 해안과 같이 생물교란이 일어나는 해안 지역에서 홍합을 채취할 때 황 환원 미생물의 수치가 더 높다는 사실이 잘 알려져 있습니다[59]. 또 다른 가능성은 공생 홍합 군집이 수평 전파의 영향을 받을 수 있다는 것입니다[60, 61]. 해양 환경, 해저 표면, 그리고 홍합의 공생 박테리아 구성 간의 상관관계를 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 이러한 연구는 현재 진행 중입니다.
혈림프 ccfDNA의 길이와 농도, 정제의 용이성, 그리고 신속한 샷건 시퀀싱을 가능하게 하는 고품질은 해양 연안 생태계의 생물다양성을 평가하기 위해 홍합 ccfDNA를 사용하는 많은 장점 중 일부입니다. 이 접근법은 주어진 생태계에서 바이러스 군집(바이롬)을 특성화하는 데 특히 효과적입니다[62, 63]. 박테리아, 고균, 진핵생물과 달리 바이러스 유전체에는 16S 서열과 같은 계통발생학적으로 보존된 유전자가 없습니다. 본 연구 결과는 홍합과 같은 지표종의 액체 생검을 사용하여 연안 해양 생태계에 일반적으로 서식하는 숙주를 감염시키는 것으로 알려진 비교적 많은 수의 ccfDNA 바이러스 단편을 식별할 수 있음을 시사합니다. 여기에는 원생동물, 절지동물, 곤충, 식물 및 박테리아 바이러스(예: 박테리오파지)를 감염시키는 것으로 알려진 바이러스가 포함됩니다. 영어: 우리가 케르겔렌의 같은 홍합층에서 수집한 푸른 홍합(M. platensis)의 혈림프 ccfDNA 바이롬을 조사했을 때 유사한 분포가 발견되었습니다(표 S2, 보충 정보). ccfDNA의 샷건 시퀀싱은 실제로 인간이나 다른 종의 바이롬 연구에서 추진력을 얻고 있는 새로운 접근법입니다[21, 37, 64]. 이 접근법은 볼티모어에서 가장 다양하고 광범위한 바이러스 종류를 나타내는 모든 이중 가닥 DNA 바이러스에서 단일 유전자가 보존되지 않기 때문에 이중 가닥 DNA 바이러스를 연구하는 데 특히 유용합니다[65]. 이러한 바이러스의 대부분은 분류되지 않았고 바이러스 세계의 완전히 알려지지 않은 부분의 바이러스를 포함할 수 있지만[66], 홍합 A. atra와 M. platensis의 바이롬과 숙주 범위가 두 종 사이에 있음을 발견했습니다. 유사합니다(그림 S3, 추가 정보 참조). 이러한 유사성은 환경에 존재하는 DNA 흡수에 대한 선택성이 부족함을 반영할 수 있으므로 놀라운 일이 아닙니다. 현재 RNA 바이롬을 특성화하기 위해 정제된 RNA를 사용한 향후 연구가 필요합니다.
우리 연구에서 우리는 Kowarski와 동료들의 작업[37]에서 가져온 매우 엄격한 파이프라인을 사용했는데, 이들은 네이티브 ccfDNA를 조립하기 전과 후에 풀링된 리드와 콘티그를 두 단계로 삭제하여 매핑되지 않은 리드의 비율이 높았습니다. 따라서 이러한 매핑되지 않은 리드 중 일부가 여전히 자체 기원을 가질 가능성을 배제할 수 없습니다. 그 이유는 주로 이 홍합 종에 대한 참조 유전체가 없기 때문입니다. 또한 우리는 자기 리드와 비자기 리드 사이의 키메라와 Illumina MiSeq PE75에서 생성된 리드 길이에 대해 우려했기 때문에 이 파이프라인을 사용했습니다. 대부분의 미기록 판독의 또 다른 이유는 특히 케르겔렌과 같은 외딴 지역의 많은 해양 미생물이 주석 처리되지 않았기 때문입니다. 우리는 ccfDNA 단편 길이가 인간 ccfDNA와 비슷하다고 가정하고 Illumina MiSeq PE75를 사용했습니다. 향후 연구를 위해, 혈림프 ccfDNA가 인간 및/또는 포유류보다 더 긴 리드를 갖는다는 연구 결과를 바탕으로, 더 긴 ccfDNA 단편에 더 적합한 시퀀싱 플랫폼을 사용할 것을 권장합니다. 이러한 방법을 사용하면 심층 분석을 위한 더 많은 지표를 훨씬 쉽게 식별할 수 있습니다. 현재 이용 가능한 완전한 A. atra 핵 유전체 서열을 확보하면 자가 및 비자가 유래한 ccfDNA를 구별하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 본 연구는 액체 생검 개념을 홍합에 적용할 가능성에 중점을 두었으므로, 향후 연구에서 이 개념을 활용함으로써 홍합의 미생물 다양성 연구에 있어 이 방법의 잠재력을 높일 수 있는 새로운 도구와 파이프라인이 개발되기를 기대합니다.
비침습적 임상 바이오마커로서, 인간 혈장 내 ccfDNA 수치의 상승은 다양한 질병, 조직 손상 및 스트레스 조건과 관련이 있습니다[67,68,69]. 이러한 증가는 조직 손상 후 자체 유래의 DNA 단편 방출과 관련이 있습니다. 우리는 홍합을 30°C의 온도에 잠깐 노출시키는 급성 열 스트레스를 사용하여 이 문제를 다루었습니다. 우리는 세 가지 독립적인 실험에서 세 가지 유형의 홍합에 대해 이 분석을 수행했습니다. 그러나 급성 열 스트레스 후 ccfDNA 수치에 변화가 없다는 것을 발견했습니다(그림 S5 참조, 추가 정보). 이 발견은 홍합이 반개방 순환계를 가지고 있고 높은 여과 활동으로 인해 많은 양의 이물질 DNA를 축적한다는 사실을 적어도 부분적으로 설명할 수 있습니다. 반면에 많은 무척추동물과 마찬가지로 홍합은 스트레스로 인한 조직 손상에 더 강할 수 있으며, 따라서 혈림프에서 ccfDNA 방출을 제한할 수 있습니다[70, 71].
지금까지 수생 생태계의 생물다양성에 대한 DNA 분석은 주로 환경 DNA(eDNA) 메타바코딩에 초점을 맞춰 왔습니다. 그러나 이 방법은 프라이머를 사용할 경우 생물다양성 분석에 일반적으로 제한적입니다. 샷건 시퀀싱을 사용하면 PCR의 한계와 프라이머 세트의 편향된 선택을 피할 수 있습니다. 따라서 어떤 의미에서 우리의 방법은 최근에 사용되는 고처리량 eDNA 샷건 시퀀싱 방법에 더 가깝습니다. 이 방법은 단편화된 DNA를 직접 시퀀싱하고 거의 모든 생물체를 분석할 수 있습니다[72, 73]. 그러나 LB를 표준 eDNA 방법과 구별하는 몇 가지 근본적인 문제가 있습니다. 물론 eDNA와 LB의 주요 차이점은 자연 필터 숙주를 사용한다는 것입니다. 해면과 이매패류(Dresseina spp.)와 같은 해양 종을 eDNA 연구를 위한 자연 필터로 사용한 것이 보고되었습니다[74, 75]. 그러나 Dreissena의 연구는 DNA를 추출한 조직 생검을 사용했습니다. LB에서 ccfDNA를 분석하는 데는 조직 생검, 특수하고 때로는 값비싼 장비, eDNA 또는 조직 생검과 관련된 물류가 필요하지 않습니다. 사실, 우리는 최근 LB에서 얻은 ccfDNA를 콜드 체인을 유지하지 않고 FTA 지원으로 저장하고 분석할 수 있다고 보고했는데, 이는 원격 지역에서 연구하는 데 있어 주요 과제입니다[76]. 액체 생검에서 ccfDNA를 추출하는 것도 간단하며 샷건 시퀀싱 및 PCR 분석을 위한 고품질 DNA를 제공합니다. 이는 eDNA 분석과 관련된 몇 가지 기술적 한계를 감안할 때 큰 장점입니다[77]. 샘플링 방법의 단순성과 낮은 비용은 장기 모니터링 프로그램에도 특히 적합합니다. 높은 여과 능력 외에도 이매패의 또 다른 잘 알려진 특징은 점액의 화학적 점액다당류 구성으로, 바이러스 흡수를 촉진합니다[78, 79]. 이로 인해 이매패는 주어진 수생 생태계에서 생물다양성과 기후 변화의 영향을 특성화하기 위한 이상적인 자연 필터가 됩니다. 숙주 유래 DNA 단편의 존재는 eDNA에 비해 방법의 한계로 볼 수 있지만, 건강 연구에 사용 가능한 방대한 양의 정보를 고려하면 eDNA에 비해 이러한 기본 ccfDNA를 갖는 데 드는 비용을 동시에 이해할 수 있습니다.상쇄 숙주.여기에는 숙주 숙주의 유전체에 통합된 바이러스 서열의 존재가 포함됩니다.이는 이매패류에 수평 전파되는 백혈병 레트로바이러스가 존재한다는 점을 감안할 때 홍합에 특히 중요합니다[80, 81].eDNA에 비해 LB의 또 다른 장점은 미생물(및 그 유전체)을 삼키는 혈림프에서 순환하는 혈액 세포의 식세포 활동을 이용한다는 것입니다.식세포작용은 이매패류에서 혈액 세포의 주요 기능입니다[82].마지막으로, 이 방법은 홍합의 높은 여과 용량(평균 1.5 l/h의 해수)과 2일 순환을 활용하여 해수의 다른 층의 혼합을 증가시켜 이종 eDNA를 포획할 수 있습니다. [83, 84] 따라서 홍합의 영양학적, 경제적, 환경적 영향을 고려할 때 홍합 ccfDNA 분석은 흥미로운 연구 분야입니다. 인간에게서 채취한 LB 분석과 유사하게, 이 방법은 외인성 물질에 대한 반응으로 숙주 DNA의 유전적 및 후성유전적 변화를 측정할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 예를 들어, 3세대 시퀀싱 기술은 나노포어 시퀀싱을 사용하여 천연 ccfDNA에서 전체 유전체 메틸화 분석을 수행하는 것을 고려할 수 있습니다. 이 과정은 홍합 ccfDNA 단편의 길이가 화학적 변환 없이 단일 시퀀싱 실행으로 전체 유전체 DNA 메틸화 분석을 가능하게 하는 롱리드 시퀀싱 플랫폼과 이상적으로 호환된다는 사실에 의해 촉진될 것입니다.85,86] DNA 메틸화 패턴이 환경 스트레스에 대한 반응을 반영하고 여러 세대에 걸쳐 지속된다는 것이 밝혀졌기 때문에 이는 흥미로운 가능성입니다. 따라서 기후 변화나 오염 물질 노출 후 반응을 조절하는 기저 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다[87]. 그러나 LB의 사용에는 한계가 있습니다. 말할 것도 없이, 이를 위해서는 생태계에 지표 종이 존재해야 합니다. 위에서 언급했듯이, LB를 사용하여 주어진 생태계의 생물다양성을 평가하려면 출처의 DNA 조각의 존재를 고려하는 엄격한 생물정보학 파이프라인도 필요합니다. 또 다른 주요 문제는 해양 종에 대한 참조 유전체의 가용성입니다. 해양 포유류 유전체 프로젝트와 최근에 시작된 Fish10k 프로젝트[88]와 같은 이니셔티브가 앞으로 이러한 분석을 용이하게 할 것으로 기대됩니다. LB 개념을 해양 여과 섭식 생물에 적용하는 것은 최신 시퀀싱 기술의 발전과도 호환되므로 환경 스트레스에 대한 반응으로 해양 서식지의 건강에 대한 중요한 정보를 제공하는 다중 옴 바이오마커 개발에 매우 ​​적합합니다.
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