გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
თხევადი ბიოფსია (LB) არის კონცეფცია, რომელიც სწრაფად იძენს პოპულარობას ბიომედიცინის სფეროში. კონცეფცია ძირითადად ეფუძნება მოცირკულირე უჯრედგარე დნმ-ის (ccfDNA) ფრაგმენტების აღმოჩენას, რომლებიც ძირითადად გამოიყოფა მცირე ფრაგმენტების სახით სხვადასხვა ქსოვილებში უჯრედის სიკვდილის შემდეგ. ამ ფრაგმენტების მცირე ნაწილი წარმოიქმნება უცხო (უცხო) ქსოვილებიდან ან ორგანიზმებიდან. მიმდინარე ნაშრომში ჩვენ გამოვიყენეთ ეს კონცეფცია მიდიებზე, რომლებიც ზღვის წყლის მაღალი ფილტრაციის უნარით ცნობილი მოდარაჯე სახეობაა. ჩვენ ვიყენებთ მიდიების უნარს, იმოქმედონ როგორც ბუნებრივი ფილტრები, რათა სხვადასხვა წყაროდან მიიღონ გარემოს დნმ-ის ფრაგმენტები, რათა მოგვაწოდოთ ინფორმაცია საზღვაო სანაპირო ეკოსისტემების ბიომრავალფეროვნების შესახებ. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ მიდიების ჰემოლიმფა შეიცავს დნმ-ის ფრაგმენტებს, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდება ზომით, 1-დან 5 კბ-მდე. შაშხანის სეკვენირებამ აჩვენა, რომ დნმ-ის ფრაგმენტების დიდი რაოდენობა უცხო მიკრობული წარმოშობისაა. მათ შორის აღმოვაჩინეთ ბაქტერიების, არქეების და ვირუსების დნმ-ის ფრაგმენტები, მათ შორის ვირუსები, რომლებიც ცნობილია, რომ აინფიცირებენ სხვადასხვა მასპინძლებს, რომლებიც ხშირად გვხვდება სანაპირო საზღვაო ეკოსისტემებში. დასკვნის სახით, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ მიდიებზე გამოყენებული LB კონცეფცია წარმოადგენს ზღვის სანაპირო ეკოსისტემებში მიკრობული მრავალფეროვნების შესახებ ცოდნის მდიდარ, მაგრამ ჯერ კიდევ შეუსწავლელ წყაროს.
კლიმატის ცვლილების (CC) გავლენა ზღვის ეკოსისტემების ბიომრავალფეროვნებაზე კვლევის სწრაფად მზარდი სფეროა. გლობალური დათბობა არა მხოლოდ მნიშვნელოვან ფიზიოლოგიურ სტრესებს იწვევს, არამედ ზღვის ორგანიზმების თერმული სტაბილურობის ევოლუციურ ზღვრებსაც არღვევს, რაც გავლენას ახდენს რიგი სახეობების ჰაბიტატზე და აიძულებს მათ უფრო ხელსაყრელი პირობების ძიებას [1, 2]. მეტაზოების ბიომრავალფეროვნებაზე ზემოქმედების გარდა, CC არღვევს მასპინძელ-მიკრობული ურთიერთქმედების დელიკატურ ბალანსს. ეს მიკრობული დისბაქტერიოზი სერიოზულ საფრთხეს უქმნის ზღვის ეკოსისტემებს, რადგან ის ზღვის ორგანიზმებს უფრო მგრძნობიარეს ხდის ინფექციური პათოგენების მიმართ [3, 4]. ითვლება, რომ SS მნიშვნელოვან როლს ასრულებს მასობრივ სიკვდილიანობაში, რაც სერიოზულ პრობლემას წარმოადგენს გლობალური საზღვაო ეკოსისტემების მართვისთვის [5, 6]. ეს მნიშვნელოვანი საკითხია მრავალი საზღვაო სახეობის ეკონომიკური, ეკოლოგიური და კვებითი ზემოქმედების გათვალისწინებით. ეს განსაკუთრებით ეხება პოლარულ რეგიონებში მცხოვრებ ორსაგდულოვან ფრინველებს, სადაც CK-ის ზემოქმედება უფრო მყისიერი და მძიმეა [6, 7]. სინამდვილეში, ორსაგდულოვანი ფრინველები, როგორიცაა Mytilus spp., ფართოდ გამოიყენება CC-ის საზღვაო ეკოსისტემებზე ზემოქმედების მონიტორინგისთვის. გასაკვირი არ არის, რომ მათი ჯანმრთელობის მონიტორინგისთვის შედარებით დიდი რაოდენობით ბიომარკერები შემუშავებულია, ხშირად ორდონიანი მიდგომის გამოყენებით, რომელიც მოიცავს ფუნქციურ ბიომარკერებს, რომლებიც დაფუძნებულია ფერმენტულ აქტივობაზე ან უჯრედულ ფუნქციებზე, როგორიცაა უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა და ფაგოციტური აქტივობა [8]. ეს მეთოდები ასევე მოიცავს სპეციფიკური წნევის ინდიკატორების კონცენტრაციის გაზომვას, რომლებიც გროვდება რბილ ქსოვილებში ზღვის წყლის დიდი რაოდენობით შეწოვის შემდეგ. თუმცა, ორსაგდულიანი ფრინველების მაღალი ფილტრაციის უნარი და ნახევრად ღია სისხლის მიმოქცევის სისტემა იძლევა შესაძლებლობას, შეიმუშაონ ახალი ჰემოლიმფის ბიომარკერები თხევადი ბიოფსიის (LB) კონცეფციის გამოყენებით, რომელიც პაციენტის მართვის მარტივი და მინიმალურად ინვაზიური მიდგომაა. სისხლის ნიმუშები [9, 10]. მიუხედავად იმისა, რომ ადამიანის LB-ში შეიძლება მოიძებნოს მოცირკულირე მოლეკულების რამდენიმე ტიპი, ეს კონცეფცია ძირითადად ეფუძნება პლაზმაში მოცირკულირე უჯრედგარე დნმ-ის (ccfDNA) ფრაგმენტების დნმ-ის სეკვენირების ანალიზს. სინამდვილეში, ადამიანის პლაზმაში მოცირკულირე დნმ-ის არსებობა ცნობილია მე-20 საუკუნის შუა პერიოდიდან [11], მაგრამ მხოლოდ ბოლო წლებში გახდა შესაძლებელი მაღალი გამტარუნარიანობის სეკვენირების მეთოდების გამოჩენა ccfDNA-ზე დაფუძნებული კლინიკური დიაგნოზის დასმა. ამ მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა ნაწილობრივ განპირობებულია უჯრედის სიკვდილის შემდეგ გენომური დნმ-ის (ბირთვული და მიტოქონდრიული) პასიური გამოთავისუფლებით. ჯანმრთელ პირებში ccfDNA-ს კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ პაციენტებში, რომლებიც განიცდიან სხვადასხვა პათოლოგიას ან ექვემდებარებიან სტრესს, რაც იწვევს ქსოვილების დაზიანებას. ჯანმრთელ პირებში ccfDNA-ს კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება გაიზარდოს 5-10-ჯერ პაციენტებში, რომლებიც განიცდიან სხვადასხვა პათოლოგიას ან ექვემდებარებიან სტრესს, რაც იწვევს ქსოვილების დაზიანებას. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ნგ/მლ), მაგრამ შეიძლება იყოს 5–10 განზავებულად განზრახული სტრესსუ, приводяврщденй.к. ჯანმრთელ ადამიანებში cccDNA-ს კონცენტრაცია ჩვეულებრივ დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ ის შეიძლება 5-10-ჯერ გაიზარდოს სხვადასხვა პათოლოგიის მქონე პაციენტებში ან სტრესის ქვეშ მყოფ პაციენტებში, რაც იწვევს ქსოვილების დაზიანებას.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ნგ/მლ） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 从而 组织。。。损伤ccfDNA კონცენტრაცია დაბალია (<10 ნგ/მლ) ძლიერ ადამიანებში, მაგრამ არ შეიძლება იყოს 5-10-ზე მეტი პაციენტთან ერთად სხვადასხვა პათოლოგიის ან სტრესის დროს. ჯანმრთელ პირებში ccfDNA-ს კონცენტრაცია, როგორც წესი, დაბალია (<10 ნგ/მლ), მაგრამ სხვადასხვა პათოლოგიის ან სტრესის მქონე პაციენტებში შეიძლება 5-10-ჯერ გაიზარდოს, რაც ქსოვილების დაზიანებას იწვევს.ccfDNA ფრაგმენტების ზომა ფართოდ მერყეობს, მაგრამ ჩვეულებრივ 150-დან 200 bp-მდე მერყეობს. [12] თვითწარმოებული ccfDNA-ს, ანუ ნორმალური ან ტრანსფორმირებული მასპინძელი უჯრედებიდან ccfDNA-ს ანალიზის გამოყენება შესაძლებელია ბირთვულ და/ან მიტოქონდრიულ გენომში არსებული გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ცვლილებების აღმოსაჩენად, რითაც კლინიცისტებს ეხმარება სპეციფიკური მოლეკულურად მიზნობრივი თერაპიების შერჩევაში [13]. თუმცა, ccfDNA-ს მიღება შესაძლებელია უცხო წყაროებიდან, როგორიცაა ccfDNA ნაყოფის უჯრედებიდან ორსულობის დროს ან გადანერგილი ორგანოებიდან [14,15,16,17]. ccfDNA ასევე წარმოადგენს ინფორმაციის მნიშვნელოვან წყაროს ინფექციური აგენტის (უცხო) ნუკლეინის მჟავების არსებობის აღმოსაჩენად, რაც საშუალებას იძლევა არაინვაზიური გზით გამოვლენილი იყოს სისხლის კულტურებით არიდენტიფიცირებული ფართოდ გავრცელებული ინფექციები, რაც თავიდან აიცილებს ინფიცირებული ქსოვილის ინვაზიურ ბიოფსიას [18]. ბოლოდროინდელმა კვლევებმა მართლაც აჩვენა, რომ ადამიანის სისხლი შეიცავს ინფორმაციის მდიდარ წყაროს, რომლის გამოყენებაც შესაძლებელია ვირუსული და ბაქტერიული პათოგენების იდენტიფიცირებისთვის და რომ ადამიანის პლაზმაში ნაპოვნი ccfDNA-ს დაახლოებით 1% უცხო წარმოშობისაა [19]. ეს კვლევები აჩვენებს, რომ ორგანიზმის მოცირკულირე მიკრობიომის ბიომრავალფეროვნების შეფასება შესაძლებელია ccfDNA ანალიზის გამოყენებით. თუმცა, ბოლო დრომდე ეს კონცეფცია მხოლოდ ადამიანებში და, ნაკლებად, სხვა ხერხემლიანებში გამოიყენებოდა [20, 21].
ამ ნაშრომში ჩვენ ვიყენებთ LB პოტენციალს Aulacomya atra-ს ccfDNA-ს გასაანალიზებლად, სამხრეთული სახეობისა, რომელიც ხშირად გვხვდება სუბანტარქტიკულ კერგუელენის კუნძულებზე, კუნძულების ჯგუფში, რომელიც დიდი პლატოს თავზე 35 მილიონი წლის წინ ჩამოყალიბდა. ვულკანური ამოფრქვევის დროს. ინ ვიტრო ექსპერიმენტული სისტემის გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ზღვის წყალში არსებული დნმ-ის ფრაგმენტები სწრაფად შეიწოვება მიდიების მიერ და შედის ჰემოლიმფის განყოფილებაში. შაშხანის სეკვენირებამ აჩვენა, რომ მიდიის ჰემოლიმფის ccfDNA შეიცავს საკუთარი და არათვით წარმოშობის დნმ-ის ფრაგმენტებს, მათ შორის სიმბიოზურ ბაქტერიებს და დნმ-ის ფრაგმენტებს ცივი ვულკანური საზღვაო სანაპირო ეკოსისტემებისთვის დამახასიათებელი ბიომებიდან. ჰემოლიმფის ccfDNA ასევე შეიცავს ვირუსულ თანმიმდევრობებს, რომლებიც მიღებულია სხვადასხვა მასპინძელი დიაპაზონის მქონე ვირუსებისგან. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ დნმ-ის ფრაგმენტები მრავალუჯრედიანი ცხოველებიდან, როგორიცაა ძვლოვანი თევზები, ზღვის ანემონები, წყალმცენარეები და მწერები. დასკვნის სახით, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ LB კონცეფციის წარმატებით გამოყენება შესაძლებელია ზღვის უხერხემლოებზე, რათა შეიქმნას მდიდარი გენომური რეპერტუარი ზღვის ეკოსისტემებში.
ზრდასრული (55-70 მმ სიგრძის) Mytilus platensis (M. platensis) და Aulacomya atra (A. atra) შეგროვდა პორტ-ო-ფრანსის (049°21.235 S, 070°13.490 E.) მოქცევითი კლდოვანი სანაპიროებიდან. კერგელენის კუნძულები 2018 წლის დეკემბერში. სხვა ზრდასრული ლურჯი მიდიები (Mytilus spp.) შეძენილი იქნა კომერციული მომწოდებლისგან (PEI Mussel King Inc., პრინც ედუარდის კუნძული, კანადა) და მოთავსდა ტემპერატურის კონტროლირებად (4°C) აერირებულ ავზში, რომელიც შეიცავდა 10–20 ლიტრ 32‰ ხელოვნურ მარილწყალს (ხელოვნური ზღვის მარილი Reef Crystal, Instant Ocean, ვირჯინია, აშშ). თითოეული ექსპერიმენტისთვის გაიზომა ცალკეული ნიჟარების სიგრძე და წონა.
ამ პროგრამის უფასო, ღია წვდომის პროტოკოლი ხელმისაწვდომია ონლაინ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). მოკლედ, LB ჰემოლიმფა შეგროვდა გამტაცებელი კუნთებიდან, როგორც აღწერილია [22]. ჰემოლიმფა გაიწმინდა ცენტრიფუგირებით 1200×g-ზე 3 წუთის განმავლობაში, ზედა ფენა გაიყინა (-20°C) გამოყენებამდე. cfDNA-ს იზოლირებისა და გაწმენდისთვის, ნიმუშები (1.5-2.0 მლ) გალღობეს და დამუშავდა NucleoSnap cfDNA ნაკრების (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. ccfDNA ინახებოდა -80°C-ზე შემდგომ ანალიზამდე. ზოგიერთ ექსპერიმენტში, ccfDNA იზოლირებული და გაწმენდილი იქნა QIAamp DNA Investigator Kit-ის (QIAGEN, ტორონტო, ონტარიო, კანადა) გამოყენებით. გაწმენდილი დნმ განისაზღვრა სტანდარტული PicoGreen ანალიზის გამოყენებით. იზოლირებული ccfDNA-ს ფრაგმენტების განაწილება გაანალიზდა კაპილარული ელექტროფორეზის მეთოდით Agilent 2100 ბიოანალიზატორის (Agilent Technologies Inc., სანტა კლარა, კალიფორნია) გამოყენებით, მაღალი მგრძნობელობის დნმ-ის ნაკრების გამოყენებით. ანალიზი ჩატარდა ccfDNA-ს ნიმუშის 1 µლ გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად.
ჰემოლიმფის ccfDNA ფრაგმენტების სეკვენირებისთვის, Génome Québec-მა (მონრეალი, კვებეკი, კანადა) მოამზადა თოფის ბიბლიოთეკები Illumina MiSeq PE75 ნაკრების Illumina DNA Mix ნაკრების გამოყენებით. გამოყენებული იქნა სტანდარტული ადაპტერი (BioO). ნედლი მონაცემების ფაილები ხელმისაწვდომია NCBI Sequence Read Archive-დან (SRR8924808 და SRR8924809). ძირითადი წაკითხვის ხარისხი შეფასდა FastQC-ის [23] გამოყენებით. ადაპტერების და დაბალი ხარისხის წაკითხვებისთვის გამოყენებული იქნა Trimmomatic [24]. დაწყვილებული ბოლოებით წაკითხვები FLASH-ით გაერთიანდა უფრო გრძელ ერთჯერად წაკითხვებში 20 bp მინიმალური გადაფარვით, შეუსაბამობების თავიდან ასაცილებლად [25]. შერწყმული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით ორსაგდულიანი NCBI ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−3 და 90% ჰომოლოგია), ხოლო დაბალი სირთულის თანმიმდევრობების შენიღბვა შესრულდა DUST-ის [26] გამოყენებით. შერწყმული წაკითხვები ანოტირებული იყო BLASTN-ით ორსაგდულიანი NCBI ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−3 და 90% ჰომოლოგია), ხოლო დაბალი სირთულის თანმიმდევრობების შენიღბვა შესრულდა DUST-ის [26] გამოყენებით. გამომცემელი აღწერა BLASTN დახმარება BLASTN-ის გამოყენებით было выполнено со использованием DUST [26]. გაერთიანებული წაკითხვები შენიშნული იქნა BLASTN-ით NCBI ორსაგდულიანი ტაქსონომიის მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e-3 და 90% ჰომოლოგია), ხოლო დაბალი სირთულის თანმიმდევრობის შენიღბვა ჩატარდა DUST-ის გამოყენებით [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数]进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ერთიანი ანოტირებით დახმარება BLASTN თაქსონიმის ბაზაზე დაფუძნებული NCBI (მნიშვნელოვნება e <1e-3 და 90% ზომიერი მეცნიერება), და было выполнено со использованием DUST [26]. გაერთიანებული წაკითხვები შენიშნული იქნა BLASTN-ით NCBI ორსაგდულიანი ტაქსონომიური მონაცემთა ბაზის გამოყენებით (e მნიშვნელობა <1e-3 და 90% ჰომოლოგია), ხოლო დაბალი სირთულის თანმიმდევრობის შენიღბვა ჩატარდა DUST-ის გამოყენებით [26].წაკითხვები დაიყო ორ ჯგუფად: ორსაგდულიანი თანმიმდევრობების მსგავს (აქ თვითწაკითხვები) და დაუკავშირებელი (არათვითწაკითხვები). ორი ჯგუფი ცალ-ცალკე შეიკრიბა MEGAHIT-ის გამოყენებით კონტიგების გენერირებისთვის [27]. ამასობაში, უცხო მიკრობიომის წაკითხვების ტაქსონომიური განაწილება კლასიფიცირებული იქნა Kraken2-ის [28] გამოყენებით და გრაფიკულად წარმოდგენილი იქნა Krona-ს წრიული დიაგრამით Galaxy-ზე [29, 30]. ჩვენი წინასწარი ექსპერიმენტებიდან ოპტიმალური კმერები განისაზღვრა, როგორც kmers-59. საბოლოო ანოტაციისთვის თვითკონტიგები იდენტიფიცირებული იქნა BLASTN-თან (ორსაგდულიანი NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) გასწორებით. საბოლოო ანოტაციისთვის თვითკონტიგები იდენტიფიცირებული იქნა BLASTN-თან (ორსაგდულიანი NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) გასწორებით. BLASTN-ის ფუნქციონირებადი დადასტურებული ფუნქციონირება (ბაზა დაწესებულებებში შექმნილია NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და მეცნიერება 60%) ცნობილობისთვის. თვითკონტიგები შემდეგ იდენტიფიცირებული იქნა BLASTN-თან (NCBI ორსაგდულიანი უჯრედების მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) შედარების გზით საბოლოო ანოტაციისთვის.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN-ის შეზღუდვისთვის დამახასიათებელი ანოტაციების შესახებ ინფორმაცია BLASTN-ის შესახებ (ბაზა NCBI დვუსშემქმნელი ბავშვებისთვის, მნიშვნელობა e <1e-10% და 6%). შემდეგ თვითკონტიგები იდენტიფიცირებული იქნა საბოლოო ანოტაციისთვის BLASTN-თან (NCBI ორსაგდულიანი უჯრედების მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) შესაბამისობის გზით. პარალელურად, არა-საკუთარი ჯგუფის კონტიგები BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) იქნა ანოტირებული. პარალელურად, არა-საკუთარი ჯგუფის კონტიგები BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია) იქნა ანოტირებული. პარალელურად чужеродные групповые контиги были аннотированы со помош BLASTN (ბაზა მონაცემები nt NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და გონოლოგია 60%). პარალელურად, უცხო ჯგუფის კონტიგები BLASTN-ით (NT NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) იქნა ანოტირებული.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 პარალელურად კონტიგი, არ არის относящиеся к општественный группе, были аннотированы со помош BLASTN (ძირითადად nt NCBI, მნიშვნელობა e <1e-10 და გომოლოგია 60%). პარალელურად, არა-თვითჯგუფური კონტიგები BLASTN-ით (nt NCBI მონაცემთა ბაზა, e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია) იქნა ანოტირებული. BLASTX ასევე ჩატარდა არა-თვით კონტიგებზე nr და RefSeq ცილის NCBI მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). BLASTX ასევე ჩატარდა არა-თვით კონტიგებზე nr და RefSeq ცილის NCBI მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e−10 და 60% ჰომოლოგია). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr და RefSeq NCBI (მნიშვნელობა e <1e-10 და გომოლოგია 60%). BLASTX ასევე ჩატარდა არა-თვითკონტიგებზე nr და RefSeq NCBI ცილის მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა < 1e-10 და 60% ჰომოლოგია).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr და RefSeq NCBI (მნიშვნელობა e <1e-10 და ზომიერება 60%). BLASTX ასევე ჩატარდა არა-თვითკონტიგებზე nr და RefSeq NCBI ცილის მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (e მნიშვნელობა <1e-10 და 60% ჰომოლოგია).არა-თვითკონტიგების BLASTN და BLASTX პულები წარმოადგენს საბოლოო კონტიგებს (იხილეთ დამატებითი ფაილი).
PCR-ისთვის გამოყენებული პრაიმერები ჩამოთვლილია ცხრილში S1. ccfDNA სამიზნე გენების ამპლიფიკაციისთვის გამოყენებული იქნა Taq დნმ პოლიმერაზა (Bio Basic Canada, Markham, ON). გამოყენებული იქნა შემდეგი რეაქციის პირობები: დენატურაცია 95°C-ზე 3 წუთის განმავლობაში, 95°C-ზე 1 წუთის განმავლობაში, გახურების ტემპერატურის დაყენება 1 წუთის განმავლობაში, დაგრძელება 72°C-ზე 1 წუთის განმავლობაში, 35 ციკლი და ბოლოს 72°C 10 წუთის განმავლობაში. . PCR პროდუქტები გამოიყო ელექტროფორეზით აგაროზის გელებში (1.5%), რომლებიც შეიცავდა SYBRTM Safe DNA Gel Stain-ს (Invitrogen, Burlington, ON, კანადა) 95 ვოლტზე.
მიდიები (Mytilus spp.) აკლიმატიზებული იქნა 500 მლ ჟანგბადიან ზღვის წყალში (32 PSU) 24 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. ფლაკონში დაემატა პლაზმიდური დნმ, რომელიც შეიცავდა ჩანართს, რომელიც აკოდირებდა ადამიანის გალექტინ-7 cDNA თანმიმდევრობას (NCBI-ის სააბონენტო ნომერი L07769), საბოლოო კონცენტრაციით 190 μg/μl. იმავე პირობებში დნმ-ის დამატების გარეშე ინკუბირებული მიდიები წარმოადგენდნენ საკონტროლო ჯგუფს. მესამე საკონტროლო ავზი შეიცავდა დნმ-ს მიდიების გარეშე. ზღვის წყალში დნმ-ის ხარისხის მონიტორინგისთვის, ზღვის წყლის ნიმუშები (20 μl; სამი გამეორება) აღებული იქნა თითოეული ავზიდან მითითებულ დროს. პლაზმიდური დნმ-ის მიკვლევადობის უზრუნველსაყოფად, LB მიდიები შეგროვდა მითითებულ დროს და გაანალიზდა qPCR და ddPCR მეთოდებით. ზღვის წყალში მარილის მაღალი შემცველობის გამო, ალიკვოტები განზავდა PCR ხარისხის წყალში (1:10) ყველა PCR ანალიზის ჩატარებამდე.
ციფრული წვეთოვანი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (ddPCR) ჩატარდა BioRad QX200 პროტოკოლის გამოყენებით (მისისოგა, ონტარიო, კანადა). ოპტიმალური ტემპერატურის დასადგენად გამოიყენეთ ტემპერატურული პროფილი (ცხრილი S1). წვეთები გენერირებული იქნა QX200 წვეთების გენერატორის (BioRad) გამოყენებით. ddPCR ჩატარდა შემდეგნაირად: 95°C 5 წუთის განმავლობაში, 95°C-ის 50 ციკლი 30 წამის განმავლობაში და მოცემული გახურების ტემპერატურა 1 წუთის განმავლობაში და 72°C 30 წამის განმავლობაში, 4°C 5 წუთის განმავლობაში და 90°C 5 წუთის განმავლობაში. წვეთების და დადებითი რეაქციების რაოდენობა (ასლების რაოდენობა/µl) გაიზომა QX200 წვეთების წამკითხველის (BioRad) გამოყენებით. 10,000-ზე ნაკლები წვეთიანი ნიმუშები უარყოფილი იქნა. ddPCR-ის ყოველი ჩატარებისას არ ტარდებოდა ნიმუშის კონტროლი.
qPCR ჩატარდა Rotor-Gene® 3000-ის (Corbett Research, სიდნეი, ავსტრალია) და LGALS7 სპეციფიკური პრაიმერების გამოყენებით. ყველა რაოდენობრივი PCR ჩატარდა 20 µლ-ში QuantiFast SYBR Green PCR Kit-ის (QIAGEN) გამოყენებით. qPCR დაიწყო 15 წუთიანი ინკუბაციით 95°C ტემპერატურაზე, რასაც მოჰყვა 40 ციკლი 95°C ტემპერატურაზე 10 წამის განმავლობაში და 60°C ტემპერატურაზე 60 წამის განმავლობაში, ერთი მონაცემთა შეგროვებით. დნობის მრუდები გენერირებული იქნა თანმიმდევრული გაზომვების გამოყენებით 95°C ტემპერატურაზე 5 წამის განმავლობაში, 65°C ტემპერატურაზე 60 წამის განმავლობაში და 97°C ტემპერატურაზე qPCR-ის ბოლოს. თითოეული qPCR ჩატარდა სამჯერ, გარდა საკონტროლო ნიმუშებისა.
ვინაიდან მიდიები ცნობილები არიან მაღალი ფილტრაციის სიჩქარით, თავდაპირველად გამოვიკვლიეთ, შეეძლოთ თუ არა მათ ზღვის წყალში არსებული დნმ-ის ფრაგმენტების ფილტრაცია და შენარჩუნება. ასევე დავინტერესდით, გროვდებოდა თუ არა ეს ფრაგმენტები მათ ნახევრად ღია ლიმფურ სისტემაში. ეს საკითხი ექსპერიმენტულად გადავწყვიტეთ ლურჯი მიდიების ავზებში დამატებული ხსნადი დნმ-ის ფრაგმენტების ბედის თვალყურის დევნებით. დნმ-ის ფრაგმენტების თვალყურის დევნების გასაადვილებლად, გამოვიყენეთ უცხო (არა თვით) პლაზმიდური დნმ, რომელიც შეიცავს ადამიანის გალექტინ-7 გენს. ddPCR აკონტროლებს პლაზმიდური დნმ-ის ფრაგმენტებს ზღვის წყალში და მიდიებში. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ თუ ზღვის წყალში დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა შედარებით მუდმივი რჩებოდა დროთა განმავლობაში (7 დღემდე) მიდიების არარსებობის შემთხვევაში, მაშინ მიდიების თანდასწრებით ეს დონე თითქმის მთლიანად გაქრა 8 საათის განმავლობაში (სურ. 1ა,ბ). ეგზოგენური დნმ-ის ფრაგმენტები ადვილად აღმოჩენილი იქნა 15 წუთის განმავლობაში ინტრავენტურ სითხესა და ჰემოლიმფაში ​​(სურ. 1გ). ამ ფრაგმენტების აღმოჩენა შესაძლებელი იყო კონტაქტიდან 4 საათამდე. დნმ-ის ფრაგმენტებთან მიმართებაში ეს ფილტრაციის აქტივობა შედარებადია ბაქტერიებისა და წყალმცენარეების ფილტრაციის აქტივობასთან [31]. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ მიდიებს შეუძლიათ უცხო დნმ-ის ფილტრაცია და დაგროვება თავიანთ სითხის განყოფილებებში.
პლაზმიდური დნმ-ის ფარდობითი კონცენტრაციები ზღვის წყალში მიდიების არსებობისას (A) ან არარსებობისას (B), გაზომილი ddPCR-ით. A-ში შედეგები გამოხატულია პროცენტულად, ჩარჩოების საზღვრები წარმოადგენს 75-ე და 25-ე პროცენტილებს. მორგებული ლოგარითმული მრუდი ნაჩვენებია წითლად, ხოლო ნაცრისფერით დაჩრდილული ფართობი წარმოადგენს 95%-იან სანდოობის ინტერვალს. B-ში წითელი ხაზი წარმოადგენს საშუალოს, ხოლო ლურჯი ხაზი წარმოადგენს კონცენტრაციის 95%-იან სანდოობის ინტერვალს. C პლაზმიდური დნმ-ის დაგროვება მიდიების ჰემოლიმფასა და სარქვლოვან სითხეში პლაზმიდური დნმ-ის დამატების შემდეგ სხვადასხვა დროს. შედეგები წარმოდგენილია როგორც აღმოჩენილი აბსოლუტური ასლები/მლ (±SE).
შემდეგ, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ccfDNA-ს წარმოშობა კერგუელენის კუნძულებზე მიდიების საწოლებიდან შეგროვებულ მიდიებში, კუნძულების შორეულ ჯგუფში, შეზღუდული ანთროპოგენური გავლენით. ამ მიზნით, მიდიების ჰემოლიმფებიდან cccDNA იზოლირებული და გაწმენდილი იქნა ადამიანის cccDNA-ს გასაწმენდად ხშირად გამოყენებული მეთოდებით [32, 33]. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ჰემოლიმფის ccfDNA-ს საშუალო კონცენტრაცია მიდიებში ჰემოლიმფის დაბალ მიკროგრამებშია მლ-ზე (იხილეთ ცხრილი S2, დამატებითი ინფორმაცია). კონცენტრაციების ეს დიაპაზონი გაცილებით დიდია, ვიდრე ჯანმრთელ ადამიანებში (დაბალი ნანოგრამი მილილიტრზე), მაგრამ იშვიათ შემთხვევებში, კიბოთი დაავადებულ პაციენტებში, ccfDNA-ს დონემ შეიძლება მიაღწიოს რამდენიმე მიკროგრამს მილილიტრზე [34, 35]. ჰემოლიმფის ccfDNA-ს ზომის განაწილების ანალიზმა აჩვენა, რომ ეს ფრაგმენტები მნიშვნელოვნად განსხვავდება ზომით, 1000 bp-დან 1000 bp-მდე და 5000 bp-მდე (სურ. 2). მსგავსი შედეგები მიღებულ იქნა სილიციუმის ბაზაზე დაფუძნებული QIAamp Investigator Kit-ის გამოყენებით, მეთოდი, რომელიც ფართოდ გამოიყენება სასამართლო მეცნიერებაში დაბალი კონცენტრაციის დნმ-ის ნიმუშებიდან, მათ შორის ccfDNA-დან, გენომური დნმ-ის სწრაფად იზოლირებისა და გაწმენდისთვის [36].
მიდიების ჰემოლიმფის წარმომადგენლობითი ccfDNA ელექტროფორეგრამა. ექსტრაგირებულია NucleoSnap Plasma Kit-ით (ზედა) და QIAamp DNA Investigator Kit-ით. B ვიოლინოს დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ჰემოლიმფის ccfDNA კონცენტრაციების (±SE) განაწილებას მიდიებში. შავი და წითელი ხაზები წარმოადგენს შესაბამისად მედიანას და პირველ და მესამე კვარტილებს.
ადამიანებსა და პრიმატებში ccfDNA-ს დაახლოებით 1%-ს უცხო წყარო აქვს [21, 37]. ორსაგდულიანი ფრინველების ნახევრად ღია ცირკულაციური სისტემის, მიკრობებით მდიდარი ზღვის წყლისა და მიდიების ccfDNA-ს ზომის განაწილების გათვალისწინებით, ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ მიდიების ჰემოლიმფის ccfDNA შეიძლება შეიცავდეს მიკრობული დნმ-ის მდიდარ და მრავალფეროვან ჯგუფს. ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად, ჩვენ გამოვყავით ჰემოლიმფის ccfDNA კერგუელენის კუნძულებიდან შეგროვებული Aulacomya atra-ს ნიმუშებიდან, რამაც 10 მილიონზე მეტი წაკითხვა მოგვცა, რომელთა 97.6%-მა გაიარა ხარისხის კონტროლი. შემდეგ ჩვენებები კლასიფიცირებული იქნა საკუთარი და არასაკუთარი წყაროების მიხედვით BLASTN და NCBI ორსაგდულიანი ფრინველების მონაცემთა ბაზების გამოყენებით (სურ. S1, დამატებითი ინფორმაცია).
ადამიანებში, როგორც ბირთვული, ასევე მიტოქონდრიული დნმ შეიძლება გამოთავისუფლდეს სისხლში [38]. თუმცა, ამ კვლევაში შეუძლებელი იყო მიდიების ბირთვული გენომური დნმ-ის დეტალურად აღწერა, იმის გათვალისწინებით, რომ A. atra-ს გენომი არ არის სეკვენირებული ან აღწერილი. თუმცა, ჩვენ შევძელით ჩვენი წარმოშობის ccfDNA ფრაგმენტების რაოდენობის იდენტიფიცირება ორსაგდულიანი ბიბლიოთეკის გამოყენებით (სურ. S2, დამატებითი ინფორმაცია). ჩვენ ასევე დავადასტურეთ ჩვენი წარმოშობის დნმ ფრაგმენტების არსებობა იმ A. atra გენების მიმართული PCR ამპლიფიკაციით, რომლებიც სეკვენირებული იყო (სურ. 3). ანალოგიურად, იმის გათვალისწინებით, რომ A. atra-ს მიტოქონდრიული გენომი ხელმისაწვდომია საჯარო მონაცემთა ბაზებში, შესაძლებელია A. atra-ს ჰემოლიმფაში ​​მიტოქონდრიული ccfDNA ფრაგმენტების არსებობის მტკიცებულების პოვნა. მიტოქონდრიული დნმ ფრაგმენტების არსებობა დადასტურდა PCR ამპლიფიკაციით (სურ. 3).
PCR-ით ამპლიფიცირებული A. atra-ს (წითელი წერტილები – სასაწყობო ნომერი: SRX5705969) და M. platensis-ის (ლურჯი წერტილები – სასაწყობო ნომერი: SRX5705968) ჰემოლიმფში სხვადასხვა მიტოქონდრიული გენი იყო. სურათი ადაპტირებულია ბრეტონის და სხვ., 2011 B-დან. A. atra-ს ჰემოლიმფის სუპერნატანტის ამპლიფიკაცია. შენახულია FTA ქაღალდზე. გამოიყენეთ 3 მმ-იანი სახვრეტი PCR ნარევის შემცველ PCR მილში პირდაპირ დასამატებლად.
ზღვის წყალში მიკრობული შემცველობის სიუხვის გათვალისწინებით, თავდაპირველად ჰემოლიმფაში ​​მიკრობული დნმ-ის თანმიმდევრობების დახასიათებაზე გავამახვილეთ ყურადღება. ამისათვის ორ განსხვავებულ სტრატეგიას ვიყენებთ. პირველ სტრატეგიაში გამოყენებული იყო Kraken2, ალგორითმზე დაფუძნებული თანმიმდევრობების კლასიფიკაციის პროგრამა, რომელსაც შეუძლია მიკრობული თანმიმდევრობების იდენტიფიცირება BLAST-თან და სხვა ინსტრუმენტებთან შედარებითი სიზუსტით [28]. 6719-ზე მეტი წაკითხვა ბაქტერიული წარმოშობის იყო, ხოლო 124 და 64 არქეებიდან და ვირუსებიდან, შესაბამისად (სურ. 4). ბაქტერიული დნმ-ის ყველაზე გავრცელებული ფრაგმენტები იყო Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) და Bacteroidetes (17%) (სურ. 4ა). ეს განაწილება შეესაბამება ზღვის ლურჯი მიდიის მიკრობიომის წინა კვლევებს [39, 40]. გამაპროტეობაქტერიები წარმოადგენდნენ Proteobacteria-ს ძირითად კლასს (44%), მათ შორის ბევრ Vibrionales-ს (სურ. 4ბ). ddPCR მეთოდმა დაადასტურა Vibrio დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა A. atra ჰემოლიმფის ccfდნმ-ში (სურ. 4გ) [41]. ccfDNA-ს ბაქტერიული წარმოშობის შესახებ მეტი ინფორმაციის მისაღებად, გამოყენებული იქნა დამატებითი მიდგომა (სურ. S2, დამატებითი ინფორმაცია). ამ შემთხვევაში, გადაფარვის მქონე წაკითხვები შეგროვდა, როგორც შეწყვილებული ბოლოების წაკითხვები და კლასიფიცირდა, როგორც საკუთარი (ორსაგდულიანი) ან არასაკუთარი წარმოშობის, BLASTN-ის, 1e−3 e მნიშვნელობისა და >90%-იანი ჰომოლოგიის მქონე ზღვრული მაჩვენებლის გამოყენებით. ამ შემთხვევაში, გადაფარვის მქონე წაკითხვები შეგროვდა, როგორც შეწყვილებული ბოლოების წაკითხვები და კლასიფიცირდა, როგორც საკუთარი (ორსაგდულიანი) ან არასაკუთარი წარმოშობის, BLASTN-ის, 1e−3 e მნიშვნელობისა და >90%-იანი ჰომოლოგიის მქონე ზღვრული მაჩვენებლის გამოყენებით. ამ კითხვის ნიშნის ქვეშ მყოფი კლასები და კლასსიფიციროვანები, როგორც საბაზრო გამოყენება (დასაქმებული моллюски) ან მსგავსება 1e-3 и отсечения со гомологией> 90%. ამ შემთხვევაში, გადაფარვის შედეგები შეგროვდა წყვილ-ბოლოიანი წაკითხვების სახით და კლასიფიცირდა, როგორც მშობლიური (ორსაგდულიანი) ან არაორიგინალი BLASTN-ის და 1e-3 e მნიშვნელობის და >90%-იანი ჰომოლოგიის მქონე ზღვრული მაჩვენებლების გამოყენებით.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皌e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。... In эtom sluchae perekrыvayuщиеся чтения были собраны како чтения со парными концами и классифицированы како საერთო (დასაქმებული моллюски) ან несобственные блющей по происхолждени. 1e-3 и порога хомологии> 90%. ამ შემთხვევაში, გადაფარვის შედეგები შეგროვდა, როგორც წყვილ-ბოლოიანი წაკითხვები და კლასიფიცირებული იქნა, როგორც საკუთარი (ორსაგდულიანი) ან არაორიგინალი, e BLASTN და 1e-3 მნიშვნელობების და >90%-იანი ჰომოლოგიის ზღურბლის გამოყენებით.ვინაიდან A. atra-ს გენომი ჯერ არ არის სეკვენირებული, ჩვენ გამოვიყენეთ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ასამბლერის de novo ასამბლეის სტრატეგია. სულ 147,188 კონტიგი იქნა იდენტიფიცირებული, როგორც წარმოშობის დამოკიდებული (ორსაგდულიანი). ეს კონტიგები შემდეგ აფეთქდა 1e-10 e-მნიშვნელობებით BLASTN-ისა და BLASTX-ის გამოყენებით. ამ სტრატეგიამ საშუალება მოგვცა, აგვერჩია A. atra ccfDNA-ში არსებული 482 არაორსაგდულიანი ფრაგმენტი. ამ დნმ-ის ფრაგმენტების ნახევარზე მეტი (57%) მიღებული იქნა ბაქტერიებისგან, ძირითადად ლაყუჩების სიმბიონტებისგან, მათ შორის სულფოტროფული სიმბიონტებისგან, და ლაყუჩების სიმბიონტ Solemya velum-ისგან (სურ. 5).
შედარებითი სიმრავლე ტიპის დონეზე. B ორი ძირითადი ფილას (Firmicutes და Proteobacteria) მიკრობული მრავალფეროვნება. ddPCR-ის წარმომადგენლობითი ამპლიფიკაცია C Vibrio spp. A. 16S rRNA გენის ფრაგმენტები (ლურჯი) სამ ატრა ჰემოლიმფში.
გაანალიზდა სულ 482 შეგროვებული კონტიგი. მეტაგენომიური კონტიგების ანოტაციების (პროკარიოტები და ეუკარიოტები) ტაქსონომიური განაწილების ზოგადი პროფილი. B BLASTN-ისა და BLASTX-ის მიერ იდენტიფიცირებული ბაქტერიული დნმ-ის ფრაგმენტების დეტალური განაწილება.
Kraken2 ანალიზმა ასევე აჩვენა, რომ მიდიების ccfDNA შეიცავდა არქეული დნმ-ის ფრაგმენტებს, მათ შორის Euryarchaeota-ს (65%), Crenarchaeota-ს (24%) და Thaurmarcheota-ს (11%) დნმ-ის ფრაგმენტებს (სურ. 6ა). Euryarchaeota-სა და Crenarchaeota-სგან მიღებული დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა, რომლებიც ადრე კალიფორნიული მიდიების მიკრობულ საზოგადოებაში იყო აღმოჩენილი, გასაკვირი არ უნდა იყოს [42]. მიუხედავად იმისა, რომ Euryarchaeota ხშირად ასოცირდება ექსტრემალურ პირობებთან, ახლა აღიარებულია, რომ როგორც Euryarchaeota, ასევე Crenarcheota ყველაზე გავრცელებულ პროკარიოტებს შორისაა ზღვის კრიოგენულ გარემოში [43, 44]. მიდიებში მეთანოგენური მიკროორგანიზმების არსებობა გასაკვირი არ არის, კერგელენის პლატოზე ფსკერიდან მეთანის ფართომასშტაბიანი გაჟონვის შესახებ ბოლოდროინდელი ცნობების გათვალისწინებით [45] და კერგელენის კუნძულების სანაპიროსთან დაფიქსირებული მიკრობული მეთანის შესაძლო წარმოების გათვალისწინებით [46].
შემდეგ ჩვენი ყურადღება დნმ ვირუსებიდან მიღებულ მონაცემებზე გადავიდა. ჩვენი ინფორმაციით, ეს არის მიდიებში ვირუსის შემცველობის პირველი არასამიზნე კვლევა. როგორც მოსალოდნელი იყო, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ბაქტერიოფაგების (Caudovirales) დნმ-ის ფრაგმენტები (სურ. 6ბ). თუმცა, ყველაზე გავრცელებული ვირუსული დნმ მოდის ნუკლეოციტოვირუსების ტიპიდან, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც ბირთვული ციტოპლაზმური დიდი დნმ ვირუსი (NCLDV), რომელსაც აქვს ნებისმიერი ვირუსის ყველაზე დიდი გენომი. ამ ტიპში დნმ-ის თანმიმდევრობების უმეტესობა მიეკუთვნება Mimimidoviridae (58%) და Poxviridae (21%) ოჯახებს, რომელთა ბუნებრივი მასპინძლები მოიცავს ხერხემლიანებს და ფეხსახსრიანებს, ხოლო ამ დნმ-ის თანმიმდევრობების მცირე ნაწილი ეკუთვნის ცნობილ ვირუსოლოგიურ წყალმცენარეებს. აინფიცირებს ზღვის ეუკარიოტულ წყალმცენარეებს. თანმიმდევრობები ასევე მიღებული იქნა პანდორას ვირუსიდან, გიგანტური ვირუსიდან, რომელსაც აქვს ყველაზე დიდი გენომის ზომა ვირუსულ გვარებს შორის. საინტერესოა, რომ ვირუსით ინფიცირებული მასპინძლების დიაპაზონი, როგორც ეს განისაზღვრება ჰემოლიმფის ccfDNA სეკვენირებით, შედარებით დიდი იყო (სურათი S3, დამატებითი ინფორმაცია). ის მოიცავს ვირუსებს, რომლებიც აინფიცირებენ მწერებს, როგორიცაა Baculoviridae და Iridoviridae, ასევე ვირუსებს, რომლებიც აინფიცირებენ ამებას, წყალმცენარეებს და ხერხემლიანებს. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ Pithovirus sibericum-ის გენომის შესაბამისი თანმიმდევრობები. პიტოვირუსები (ასევე ცნობილი როგორც „ზომბი ვირუსები“) პირველად იზოლირებული იქნა ციმბირის 30,000 წლის მარადმწვანე ტყიდან [47]. ამრიგად, ჩვენი შედეგები შეესაბამება წინა ანგარიშებს, რომლებიც აჩვენებს, რომ ამ ვირუსების ყველა თანამედროვე სახეობა არ არის გადაშენებული [48] და რომ ეს ვირუსები შეიძლება იმყოფებოდეს შორეულ სუბარქტიკულ საზღვაო ეკოსისტემებში.
და ბოლოს, ჩვენ გამოვცადეთ, შეგვეძლო თუ არა სხვა მრავალუჯრედიანი ცხოველების დნმ-ის ფრაგმენტების პოვნა. BLASTN-ისა და BLASTX-ის მეშვეობით nt, nr და RefSeq ბიბლიოთეკების (გენომიური და ცილოვანი) გამოყენებით სულ 482 უცხო კონტიგი იქნა იდენტიფიცირებული. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ მრავალუჯრედიანი ცხოველების ccfDNA-ს უცხო ფრაგმენტებს შორის ძვლოვანი ძვლების დნმ ჭარბობს (სურ. 5). ასევე აღმოჩენილია მწერების და სხვა სახეობების დნმ-ის ფრაგმენტები. დნმ-ის ფრაგმენტების შედარებით დიდი ნაწილი არ არის იდენტიფიცირებული, შესაძლოა, გენომურ მონაცემთა ბაზებში ზღვის სახეობების დიდი რაოდენობის არასაკმარისი წარმოდგენის გამო ხმელეთის სახეობებთან შედარებით [49].
ამ ნაშრომში ჩვენ LB კონცეფციას ვიყენებთ მიდიებზე და ვამტკიცებთ, რომ ჰემოლიმფის ccfDNA-ს სეკვენირებას შეუძლია ზღვის სანაპირო ეკოსისტემების შემადგენლობის შესახებ ინფორმაციის მოწოდება. კერძოდ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 1) მიდიის ჰემოლიმფა შეიცავს შედარებით დიდი (~1-5 კბ) ცირკულირებადი დნმ-ის ფრაგმენტების შედარებით მაღალ კონცენტრაციებს (მიკროგრამის დონეს); 2) ეს დნმ-ის ფრაგმენტები არის როგორც დამოუკიდებელი, ასევე არადამოუკიდებელი; 3) ამ დნმ-ის ფრაგმენტების უცხო წყაროებს შორის აღმოვაჩინეთ ბაქტერიული, არქეული და ვირუსული დნმ, ასევე სხვა მრავალუჯრედიანი ცხოველების დნმ; 4) ამ უცხო ccfDNA ფრაგმენტების დაგროვება ჰემოლიმფაში ​​სწრაფად ხდება და ხელს უწყობს მიდიების შიდა ფილტრაციის აქტივობას. დასკვნის სახით, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ LB კონცეფცია, რომელიც აქამდე ძირითადად ბიომედიცინის სფეროში გამოიყენებოდა, შეიცავს ცოდნის მდიდარ, მაგრამ შეუსწავლელ წყაროს, რომლის გამოყენებაც შესაძლებელია მოდარაჯე სახეობებსა და მათ გარემოს შორის ურთიერთქმედების უკეთ გასაგებად.
პრიმატების გარდა, ccfDNA-ს იზოლაცია დაფიქსირდა ძუძუმწოვრებში, მათ შორის თაგვებში, ძაღლებში, კატებსა და ცხენებში [50, 51, 52]. თუმცა, ჩვენი ინფორმაციით, ჩვენი კვლევა პირველია, რომელშიც აღწერილია ccfDNA-ს აღმოჩენა და სეკვენირება ღია ცირკულაციის სისტემის მქონე საზღვაო სახეობებში. მიდიების ეს ანატომიური თავისებურება და ფილტრაციის უნარი, სულ მცირე, ნაწილობრივ ხსნის სხვა სახეობებთან შედარებით მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების ზომის განსხვავებულ მახასიათებლებს. ადამიანებში, სისხლში მოცირკულირე დნმ-ის ფრაგმენტების უმეტესობა მცირე ფრაგმენტებია, რომელთა ზომა 150-დან 200 ფუნტ სთ-მდე მერყეობს, მაქსიმალური პიკით 167 ფუნტ სთ [34, 53]. დნმ-ის ფრაგმენტების მცირე, მაგრამ მნიშვნელოვანი ნაწილი 300-დან 500 ფუნტ სთ-მდე ზომისაა და დაახლოებით 5% 900 ფუნტ სთ-ზე გრძელია [54]. ამ ზომის განაწილების მიზეზი ის არის, რომ პლაზმაში ccfDNA-ს ძირითადი წყარო უჯრედების სიკვდილის შედეგად წარმოიქმნება, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს უჯრედების სიკვდილით, ჯანმრთელ პირებში მოცირკულირე ჰემატოპოეტური უჯრედების ნეკროზით, ან კიბოთი დაავადებულ პაციენტებში სიმსივნური უჯრედების აპოპტოზით (ცნობილია, როგორც მოცირკულირე სიმსივნური დნმ). მიდიებში აღმოჩენილი ჰემოლიმფის ccfDNA-ს ზომის განაწილება 1000-დან 5000 bp-მდე მერყეობდა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ მიდიების ccfDNA-ს განსხვავებული წარმოშობა აქვს. ეს ლოგიკური ჰიპოთეზაა, რადგან მიდიებს ნახევრად ღია სისხლძარღვოვანი სისტემა აქვთ და ცხოვრობენ საზღვაო წყლის გარემოში, რომელიც შეიცავს მიკრობული გენომური დნმ-ის მაღალ კონცენტრაციას. სინამდვილეში, ეგზოგენური დნმ-ის გამოყენებით ჩატარებულმა ჩვენმა ლაბორატორიულმა ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ მიდიები ზღვის წყალში დნმ-ის ფრაგმენტებს აგროვებენ, სულ მცირე რამდენიმე საათის შემდეგ ისინი იშლება უჯრედული შთანთქმის შემდეგ და/ან გამოიყოფა და/ან ინახება სხვადასხვა ორგანიზაციაში. უჯრედების (როგორც პროკარიოტული, ასევე ეუკარიოტული) იშვიათობის გათვალისწინებით, სარქვლშიდა კომპარტმენტების გამოყენება შეამცირებს ccfDNA-ს რაოდენობას, როგორც საკუთარი, ასევე უცხო წყაროებიდან. ორსაგდულიანი თანდაყოლილი იმუნიტეტის მნიშვნელობისა და მოცირკულირე ფაგოციტების დიდი რაოდენობის გათვალისწინებით, ჩვენ ასევე გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ უცხო ccfDNAც კი გამდიდრებულია მოცირკულირე ფაგოციტებით, რომლებიც უცხო დნმ-ს აგროვებენ მიკროორგანიზმების და/ან უჯრედული ნარჩენების მიღების შემდეგ. ჩვენი შედეგები ერთად აჩვენებს, რომ ორსაგდულიანი ჰემოლიმფის ccfDNA მოლეკულური ინფორმაციის უნიკალური საცავია და აძლიერებს მათ სტატუსს, როგორც მოდარაჯე სახეობის.
ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ ბაქტერიული წარმოშობის ჰემოლიმფის ccfDNA ფრაგმენტების სეკვენირება და ანალიზი შეიძლება უზრუნველყოფდეს ძირითად ინფორმაციას მასპინძელი ბაქტერიული ფლორისა და მიმდებარე საზღვაო ეკოსისტემაში არსებული ბაქტერიების შესახებ. სროლის სეკვენირების ტექნიკამ გამოავლინა კომენსალური ბაქტერიების A. atra ლაყუჩების თანმიმდევრობები, რომლებიც გამოტოვებული იქნებოდა, თუ გამოყენებული იქნებოდა 16S rRNA იდენტიფიკაციის ტრადიციული მეთოდები, ნაწილობრივ საცნობარო ბიბლიოთეკის მიკერძოების გამო. სინამდვილეში, კერგელენში იმავე მიდიების შრეში M. platensis-დან შეგროვებული LB მონაცემების ჩვენს მიერ გამოყენებამ აჩვენა, რომ ლაყუჩებთან ასოცირებული ბაქტერიული სიმბიონტების შემადგენლობა იდენტური იყო ორივე სახეობისთვის (სურ. S4, დამატებითი ინფორმაცია). ორი გენეტიკურად განსხვავებული მიდიის ეს მსგავსება შეიძლება ასახავდეს ბაქტერიული თემების შემადგენლობას კერგელენის ცივ, გოგირდოვან და ვულკანურ დანალექებში [55, 56, 57, 58]. გოგირდის შემამცირებელი მიკროორგანიზმების უფრო მაღალი დონე კარგად არის აღწერილი ბიოტურბირებული სანაპირო ზონებიდან მიდიების მოპოვებისას [59], როგორიცაა პორტ-ო-ფრანსის სანაპირო. კიდევ ერთი შესაძლებლობა ის არის, რომ კომენსალური მიდიების ფლორაზე შესაძლოა ჰორიზონტალური გადაცემა იყოს ზეგავლენის ქვეშ [60, 61]. საჭიროა მეტი კვლევა, რათა დადგინდეს საზღვაო გარემოს, ზღვის ფსკერის ზედაპირსა და მიდიებში სიმბიოზური ბაქტერიების შემადგენლობას შორის კორელაცია. ეს კვლევები ამჟამად მიმდინარეობს.
ჰემოლიმფის ccfDNA-ს სიგრძე და კონცენტრაცია, მისი გაწმენდის სიმარტივე და მაღალი ხარისხი, რომელიც საშუალებას იძლევა სწრაფი სეკვენირებისთვის, არის მიდიების ccfDNA-ს გამოყენების რამდენიმე უპირატესობა ზღვის სანაპირო ეკოსისტემებში ბიომრავალფეროვნების შესაფასებლად. ეს მიდგომა განსაკუთრებით ეფექტურია ვირუსული თემების (ვირომების) დასახასიათებლად მოცემულ ეკოსისტემაში [62, 63]. ბაქტერიების, არქეების და ეუკარიოტებისგან განსხვავებით, ვირუსული გენომები არ შეიცავს ფილოგენეტიკურად კონსერვირებულ გენებს, როგორიცაა 16S თანმიმდევრობები. ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ ინდიკატორული სახეობების, როგორიცაა მიდიები, თხევადი ბიოფსიები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ccfDNA ვირუსის ფრაგმენტების შედარებით დიდი რაოდენობის იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც ცნობილია, რომ აინფიცირებს მასპინძლებს, რომლებიც ჩვეულებრივ ბინადრობენ სანაპირო საზღვაო ეკოსისტემებში. ეს მოიცავს ვირუსებს, რომლებიც ცნობილია, რომ აინფიცირებს უმარტივესებს, ფეხსახსრიანებს, მწერებს, მცენარეებს და ბაქტერიულ ვირუსებს (მაგ., ბაქტერიოფაგებს). მსგავსი განაწილება აღმოჩნდა, როდესაც შევისწავლეთ ლურჯი მიდიების (M. platensis) ჰემოლიმფის ccfDNA ვირომი, რომელიც შეგროვდა კერგუელენში იმავე მიდიების ფენაში (ცხრილი S2, დამატებითი ინფორმაცია). ccfDNA-ს შატვისებური სეკვენირება მართლაც ახალი მიდგომაა, რომელიც იმპულსს იძენს ადამიანების ან სხვა სახეობების ვირომების შესწავლაში [21, 37, 64]. ეს მიდგომა განსაკუთრებით სასარგებლოა ორჯაჭვიანი დნმ-ის ვირუსების შესასწავლად, რადგან ყველა ორჯაჭვიან დნმ-ის ვირუსს შორის არც ერთი გენი არ არის შენარჩუნებული, რაც ბალტიმორში ვირუსების ყველაზე მრავალფეროვან და ფართო კლასს წარმოადგენს [65]. მიუხედავად იმისა, რომ ამ ვირუსების უმეტესობა კლასიფიცირებული არ არის და შეიძლება მოიცავდეს ვირუსებს ვირუსების სრულიად უცნობი ნაწილიდან [66], ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მიდიების A. atra-ს და M. platensis-ის ვირომები და მასპინძელი დიაპაზონები ამ ორ სახეობას შორის ხვდება. ანალოგიურად (იხილეთ სურათი S3, დამატებითი ინფორმაცია). ეს მსგავსება გასაკვირი არ არის, რადგან ეს შეიძლება ასახავდეს გარემოში არსებული დნმ-ის შთანთქმის სელექციურობის ნაკლებობას. ამჟამად საჭიროა გაწმენდილი რნმ-ის გამოყენებით სამომავლო კვლევები რნმ-ის ვირომის დასახასიათებლად.
ჩვენს კვლევაში გამოვიყენეთ კოვარსკის და მისი კოლეგების [37] ნაშრომებიდან ადაპტირებული ძალიან მკაცრი მილსადენი, რომლებმაც გამოიყენეს გაერთიანებული წაკითხვებისა და კონტიგების ორეტაპიანი წაშლა მშობლიური ccfDNA-ს აწყობამდე და მის შემდეგ, რაც გამოიწვია დაუმარკირებული წაკითხვების მაღალი წილი. ამიტომ, არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ, რომ ამ დაუმარკირებული წაკითხვების ზოგიერთს შეიძლება მაინც ჰქონდეს საკუთარი წარმოშობა, ძირითადად იმიტომ, რომ არ გვაქვს ამ მიდიის სახეობის საცნობარო გენომი. ჩვენ ასევე გამოვიყენეთ ეს მილსადენი, რადგან შეშფოთებული ვიყავით საკუთარ და არათვით წაკითხვებს შორის ქიმერებით და Illumina MiSeq PE75-ის მიერ გენერირებული წაკითხვის სიგრძეებით. დაუმარკირებული წაკითხვების უმეტესობის კიდევ ერთი მიზეზი ის არის, რომ ზღვის მიკრობების დიდი ნაწილი, განსაკუთრებით ისეთ შორეულ ადგილებში, როგორიცაა კერგუელენი, არ არის ანოტირებული. ჩვენ გამოვიყენეთ Illumina MiSeq PE75, იმის გათვალისწინებით, რომ ccfDNA ფრაგმენტების სიგრძე ადამიანის ccfDNA-ს მსგავსია. მომავალი კვლევებისთვის, ჩვენი შედეგების გათვალისწინებით, რომლებიც აჩვენებს, რომ ჰემოლიმფის ccfDNA-ს უფრო ხანგრძლივი წაკითხვა აქვს, ვიდრე ადამიანებსა და/ან ძუძუმწოვრებს, ჩვენ გირჩევთ გამოვიყენოთ სეკვენირების პლატფორმა, რომელიც უფრო შესაფერისია ccfDNA-ს უფრო გრძელი ფრაგმენტებისთვის. ეს პრაქტიკა გაცილებით გაამარტივებს უფრო ღრმა ანალიზისთვის მეტი ჩვენების იდენტიფიცირებას. ამჟამად მიუწვდომელი სრული A. atra-ს ბირთვული გენომის თანმიმდევრობის მოპოვება ასევე მნიშვნელოვნად შეუწყობს ხელს ccfDNA-ს საკუთარი და არასაკუთარი წყაროებისგან გარჩევას. იმის გათვალისწინებით, რომ ჩვენი კვლევა ფოკუსირებულია თხევადი ბიოფსიის კონცეფციის მიდიებზე გამოყენების შესაძლებლობაზე, ვიმედოვნებთ, რომ რადგან ეს კონცეფცია გამოიყენება მომავალ კვლევებში, შემუშავდება ახალი ინსტრუმენტები და მილსადენები, რათა გაიზარდოს ამ მეთოდის პოტენციალი მიდიების მიკრობული მრავალფეროვნების შესასწავლად. ზღვის ეკოსისტემა.
არაინვაზიური კლინიკური ბიომარკერის სახით, ადამიანის პლაზმაში ccfDNA-ს მომატებული დონე ასოცირდება სხვადასხვა დაავადებებთან, ქსოვილების დაზიანებასთან და სტრესულ პირობებთან [67,68,69]. ეს ზრდა დაკავშირებულია ქსოვილების დაზიანების შემდეგ საკუთარი წარმოშობის დნმ-ის ფრაგმენტების გამოთავისუფლებასთან. ჩვენ ეს საკითხი მწვავე სითბური სტრესის გამოყენებით განვიხილეთ, რომლის დროსაც მიდიები ხანმოკლედ იყვნენ 30°C ტემპერატურაზე. ეს ანალიზი სამ სხვადასხვა ტიპის მიდიაზე ჩავატარეთ სამ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში. თუმცა, მწვავე სითბური სტრესის შემდეგ ccfDNA-ს დონის რაიმე ცვლილება ვერ აღმოვაჩინეთ (იხილეთ სურათი S5, დამატებითი ინფორმაცია). ეს აღმოჩენა შესაძლოა ნაწილობრივ მაინც ხსნიდეს იმ ფაქტს, რომ მიდიებს აქვთ ნახევრად ღია სისხლის მიმოქცევის სისტემა და მათი მაღალი ფილტრაციის აქტივობის გამო დიდი რაოდენობით უცხო დნმ-ს აგროვებენ. მეორეს მხრივ, მიდიები, ბევრი უხერხემლო ცხოველის მსგავსად, შეიძლება უფრო მდგრადი იყვნენ სტრესით გამოწვეული ქსოვილების დაზიანების მიმართ, რითაც ზღუდავენ ccfDNA-ს გამოთავისუფლებას მათ ჰემოლიმფაში ​​[70, 71].
დღეისათვის, წყლის ეკოსისტემებში ბიომრავალფეროვნების დნმ-ის ანალიზი ძირითადად გარემოს დნმ-ის (eDNA) მეტაბარკოდირებაზე იყო ორიენტირებული. თუმცა, ეს მეთოდი, როგორც წესი, შეზღუდულია ბიომრავალფეროვნების ანალიზში, როდესაც პრაიმერები გამოიყენება. შატვის ტიპის სეკვენირების გამოყენება გვერდს უვლის PCR-ის შეზღუდვებს და პრაიმერების ნაკრებების მიკერძოებულ შერჩევას. ამრიგად, გარკვეული გაგებით, ჩვენი მეთოდი უფრო ახლოსაა ახლახან გამოყენებულ მაღალი გამტარუნარიანობის eDNA-ს შატვის ტიპის სეკვენირების მეთოდთან, რომელსაც შეუძლია ფრაგმენტირებული დნმ-ის პირდაპირი სეკვენირება და თითქმის ყველა ორგანიზმის ანალიზი [72, 73]. თუმცა, არსებობს მთელი რიგი ფუნდამენტური საკითხები, რომლებიც განასხვავებს LB-ს სტანდარტული eDNA მეთოდებისგან. რა თქმა უნდა, eDNA-სა და LB-ს შორის მთავარი განსხვავება ბუნებრივი ფილტრის მასპინძლების გამოყენებაა. აღწერილია ზღვის სახეობების, როგორიცაა ღრუბლები და ორსაგდულიანი ფრინველები (Dresseina spp.), გამოყენება, როგორც ბუნებრივი ფილტრი eDNA-ს შესასწავლად [74, 75]. თუმცა, დრეისენას კვლევაში გამოყენებული იყო ქსოვილის ბიოფსიები, საიდანაც დნმ იქნა ამოღებული. LB-დან ccfDNA-ს ანალიზი არ საჭიროებს ქსოვილის ბიოფსიას, სპეციალიზებულ და ზოგჯერ ძვირადღირებულ აღჭურვილობას და ლოგისტიკას, რომელიც დაკავშირებულია eDNA-სთან ან ქსოვილის ბიოფსიასთან. სინამდვილეში, ჩვენ ცოტა ხნის წინ გამოვაცხადეთ, რომ LB-დან ccfDNA-ს შენახვა და ანალიზი შესაძლებელია FTA მხარდაჭერით ცივი ჯაჭვის შენარჩუნების გარეშე, რაც დიდ გამოწვევას წარმოადგენს შორეულ რაიონებში კვლევისთვის [76]. ccfDNA-ს ექსტრაქცია თხევადი ბიოფსიებიდან ასევე მარტივია და უზრუნველყოფს მაღალი ხარისხის დნმ-ს სროლის სექვენირებისა და PCR ანალიზისთვის. ეს დიდი უპირატესობაა eDNA ანალიზთან დაკავშირებული ზოგიერთი ტექნიკური შეზღუდვის გათვალისწინებით [77]. შერჩევის მეთოდის სიმარტივე და დაბალი ღირებულება ასევე განსაკუთრებით შესაფერისია გრძელვადიანი მონიტორინგის პროგრამებისთვის. მათი მაღალი ფილტრაციის უნარის გარდა, ორსაგდულიანი ფრინველების კიდევ ერთი ცნობილი თვისებაა მათი ლორწოს ქიმიური მუკოპოლისაქარიდის შემადგენლობა, რაც ხელს უწყობს ვირუსების შეწოვას [78, 79]. ეს ორსაგდულიან ფრინველებს იდეალურ ბუნებრივ ფილტრად აქცევს ბიომრავალფეროვნების და კლიმატის ცვლილების გავლენის დასახასიათებლად მოცემულ წყლის ეკოსისტემაში. მიუხედავად იმისა, რომ მასპინძლისგან მიღებული დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობა შეიძლება ჩაითვალოს მეთოდის შეზღუდვად eDNA-სთან შედარებით, ასეთი ნატიური ccfDNA-ს ქონასთან შედარებით ღირებულება ერთდროულად გასაგებია ჯანმრთელობის კვლევებისთვის ხელმისაწვდომი ინფორმაციის უზარმაზარი რაოდენობის გამო. ოფსეტური მასპინძელი. ეს მოიცავს ვირუსული თანმიმდევრობების არსებობას, რომლებიც ინტეგრირებულია მასპინძელი მასპინძლის გენომში. ეს განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია მიდიებისთვის, ორსაგდულიან მიდიებში ჰორიზონტალურად გადამდები ლეიკემიური რეტროვირუსების არსებობის გათვალისწინებით [80, 81]. LB-ის კიდევ ერთი უპირატესობა eDNA-სთან შედარებით არის ის, რომ ის იყენებს ჰემოლიმფაში ​​მოცირკულირე სისხლის უჯრედების ფაგოციტურ აქტივობას, რომელიც შთანთქავს მიკროორგანიზმებს (და მათ გენომებს). ფაგოციტოზი არის სისხლის უჯრედების მთავარი ფუნქცია ორსაგდულიან მიდიებში [82]. და ბოლოს, მეთოდი იყენებს მიდიების მაღალ ფილტრაციის უნარს (ზღვის წყლის საშუალო 1.5 ლ/სთ) და ორდღიან ცირკულაციას, რაც ზრდის ზღვის წყლის სხვადასხვა ფენების შერევას, რაც საშუალებას იძლევა ჰეტეროლოგიური eDNA-ს დაჭერის. [83, 84]. ამგვარად, მიდიების ccfDNA ანალიზი საინტერესო გზაა მიდიების კვებითი, ეკონომიკური და გარემოზე ზემოქმედების გათვალისწინებით. ადამიანისგან შეგროვებული LB ანალიზის მსგავსად, ეს მეთოდი ასევე იძლევა მასპინძელი დნმ-ის გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ცვლილებების გაზომვის შესაძლებლობას ეგზოგენური ნივთიერებების საპასუხოდ. მაგალითად, მესამე თაობის სეკვენირების ტექნოლოგიების განხილვა შესაძლებელია ნანოფორების სეკვენირების გამოყენებით გენომის მასშტაბით მეთილირების ანალიზის ჩასატარებლად მშობლიურ ccfDNA-ში. ეს პროცესი უნდა გამარტივდეს იმით, რომ მიდიების ccfDNA ფრაგმენტების სიგრძე იდეალურად თავსებადია ხანგრძლივი წაკითხვის სეკვენირების პლატფორმებთან, რომლებიც საშუალებას იძლევა გენომის მასშტაბით დნმ-ის მეთილირების ანალიზის ჩატარება ერთი სეკვენირების ცდიდან ქიმიური ტრანსფორმაციების საჭიროების გარეშე.85,86] ეს საინტერესო შესაძლებლობაა, რადგან ნაჩვენებია, რომ დნმ-ის მეთილირების ნიმუშები ასახავს გარემო სტრესზე რეაქციას და ნარჩუნდება მრავალი თაობის განმავლობაში. ამიტომ, მას შეუძლია ღირებული ინფორმაცია მოგვაწოდოს კლიმატის ცვლილების ან დამაბინძურებლების ზემოქმედების შემდეგ რეაგირების ძირითადი მექანიზმების შესახებ [87]. თუმცა, LB-ის გამოყენება შეზღუდვების გარეშე არ არის. ცხადია, ეს მოითხოვს ეკოსისტემაში ინდიკატორი სახეობების არსებობას. როგორც ზემოთ აღინიშნა, მოცემული ეკოსისტემის ბიომრავალფეროვნების შესაფასებლად LB-ის გამოყენება ასევე მოითხოვს მკაცრ ბიოინფორმატიკულ არხებს, რომლებიც ითვალისწინებენ წყაროდან დნმ-ის ფრაგმენტების არსებობას. კიდევ ერთი მნიშვნელოვანი პრობლემაა ზღვის სახეობების საცნობარო გენომების ხელმისაწვდომობა. იმედია, რომ ისეთი ინიციატივები, როგორიცაა ზღვის ძუძუმწოვრების გენომების პროექტი და ახლახან შექმნილი Fish10k პროექტი [88], მომავალში ხელს შეუწყობს ასეთ ანალიზს. LB კონცეფციის გამოყენება ზღვის ფილტრ-მკვებავ ორგანიზმებზე ასევე თავსებადია სეკვენირების ტექნოლოგიის უახლეს მიღწევებთან, რაც მას კარგად შესაფერისს ხდის მრავალომიანი ბიომარკერების შემუშავებისთვის, რათა უზრუნველყონ მნიშვნელოვანი ინფორმაცია საზღვაო ჰაბიტატების ჯანმრთელობის შესახებ გარემოსდაცვითი სტრესის საპასუხოდ.
გენომის სეკვენირების მონაცემები განთავსებულია NCBI Sequence Read Archive-ში https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808, Bioprojects SRR8924808 კატეგორიის ქვეშ.
ბრაიერლი ა.ს., კინგსფორდი მ.ჯ. კლიმატის ცვლილების გავლენა ზღვის ბინადრებსა და ეკოსისტემებზე. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
გისი ე, მანეა ე, მაზარისი ად, ფრასკეტი ს, ალმპანიდუ ვ, ბევილაკუა ს და სხვ. გაითვალისწინეთ კლიმატის ცვლილებისა და სხვა ადგილობრივი სტრესორების კომბინირებული ზემოქმედება საზღვაო გარემოზე. ზოგადი სამეცნიერო გარემო. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, და სხვ. ). პირველი მარტის მეცნიერება. 2020; 7:48.
სერონტ ლ., ნიკასტრო კრ.რ., ზარდი გ.ი., გობერვილი ე. განმეორებითი სითბური სტრესის პირობებში სიცხისადმი შემცირებული ტოლერანტობა ხსნის ლურჯი მიდიების მაღალ ზაფხულის სიკვდილიანობას. სამეცნიერო ანგარიში 2019; 9:17498.
ფეი ს.ბ., სიეპიელსკი ა.მ., ნუსლე ს., სერვანტეს-იოშიდა კ., ჰვან ჯ.ლ., ჰუბერ ერ.რ. და სხვ. ცხოველთა სიკვდილიანობის სიხშირის, მიზეზებისა და მასშტაბის ბოლოდროინდელი ცვლილებები. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. მრავალმა არასპეციფიკურმა პათოგენმა შეიძლება გამოიწვიოს Pinna nobilis-ის მასობრივი სიკვდილიანობა. ცხოვრება. 2020; 10: 238.
ბრედლი მ., კოუტსი ს.ჯ., ჯენკინსი ე., ო'ჰარა ტ.მ. კლიმატის ცვლილების პოტენციური გავლენა არქტიკულ ზოონოზურ დაავადებებზე. საერთაშორისო ჟურნალი Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
ბეიერი ჯ., გრინი ნვ., ბრუკსი ს., ალან ი.ჯ., რუუსი ა., გომესი თ. და სხვ. ლურჯი მიდიები (Mytilus edulis spp.), როგორც სიგნალური ორგანიზმები სანაპირო ზოლის დაბინძურების მონიტორინგში: მიმოხილვა. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
სირავეგნია გ., მარსონი ს., სიენა ს., ბარდელი ა. თხევადი ბიოფსიის ინტეგრაცია კიბოს მკურნალობაში. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
ვან ჯ.ს.მ., მასი ს., გარსია-კორბაჩო ჯ., მულიერი ფ., ბრენტონი ჯ.დ., კალდასი ს. და სხვ. თხევადი ბიოფსიის მომწიფება: სიმსივნის დნმ-ის ცირკულაციის საშუალებას იძლევა. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
მანდელი პ., მეტაის პ. ნუკლეინის მჟავები ადამიანის პლაზმაში. Soc Biol-ის შვილობილი კომპანიების შეხვედრების ოქმები. 1948; 142:241-3.
ბრონკჰორსტი ა.ჯ., უნგერერი ვ., ჰოლდენრიდერი ს. უჯრედგარე დნმ-ის ახალი როლი, როგორც მოლეკულური მარკერი კიბოს მკურნალობისთვის. ბიომოლარული ანალიზის რაოდენობრივი განსაზღვრა. 2019;17:100087.
იგნატიადისი მ., სლეჯი გ.ვ., ჯეფრი ს.ს. თხევადი ბიოფსია კლინიკაში შემოდის - დანერგვის საკითხები და სამომავლო გამოწვევები. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
ლო ი.მ., კორბეტა ნ., ჩემბერლენი პ.ფ., რაი ვ., სარჯენტი ი.ლ., რედმენი ს.ვ. და სხვები. ნაყოფის დნმ დედის პლაზმასა და შრატშია. ლანცეტი. 1997; 350:485-7.
მუფარეი მ.ნ., ვონგი რ.ჯ., შოუ გ.მ., სტივენსონი დ.კ., კვეიკი ს.რ. ორსულობის მიმდინარეობისა და მისი გართულებების შესწავლა ორსულობის დროს ქალების სისხლში მოცირკულირე უჯრედგარე რნმ-ის გამოყენებით. დოპედიატრია. 2020;8:605219.
ოლერიხი მ., შერვუდი კ., კეოუნი პ., შუტცი ე., ბეკი ჯ., სტეგბაუერი ჯ. და სხვ. თხევადი ბიოფსია: დონორის უჯრედებისგან თავისუფალი დნმ გამოიყენება თირკმლის ტრანსპლანტატში ალოგენური დაზიანებების გამოსავლენად. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
ხუან ფ.კ., ლო ი.მ. პრენატალური დიაგნოსტიკის ინოვაციები: დედის პლაზმური გენომის სეკვენირება. ანა მ.დ. 2016;67:419-32.
გუ ვ., დენგ ს., ლი მ., სუკუ ი.დ., არევალო ს., სტრაიკე დ. და სხვ. ინფიცირებული სხეულის სითხეების ახალი თაობის მეტაგენომიკური სეკვენირების გამოყენებით პათოგენის სწრაფი აღმოჩენა. Nat Medicine. 2021;27:115-24.