Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රව්සර් අනුවාදයේ සීමිත CSS සහාය ඇත. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රීය කරන්න). මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි වෙබ් අඩවිය විලාස සහ JavaScript නොමැතිව විදැහුම් කරන්නෙමු.
ද්‍රව ජෛව වෛද්‍ය ක්ෂේත්‍රයේ වේගයෙන් ජනප්‍රිය වෙමින් පවතින සංකල්පයකි. මෙම සංකල්පය ප්‍රධාන වශයෙන් පදනම් වී ඇත්තේ විවිධ පටක වල සෛල මිය යාමෙන් පසු කුඩා කොටස් ලෙස මුදා හරින සංසරණ බාහිර සෛලීය DNA (ccfDNA) කොටස් හඳුනා ගැනීම මත ය. මෙම කොටස් වලින් කුඩා ප්‍රමාණයක් විදේශීය (විදේශීය) පටක හෝ ජීවීන්ගෙන් ආරම්භ වේ. වත්මන් කාර්යයේදී, අපි මෙම සංකල්පය ඉහළ මුහුදු ජල පෙරීමේ ධාරිතාව සඳහා ප්‍රසිද්ධ සෙන්ටිනල් විශේෂයක් වන මස්සල් සඳහා යොදාගෙන ඇත. සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය පිළිබඳ තොරතුරු සැපයීම සඳහා විවිධ ප්‍රභවයන්ගෙන් පාරිසරික DNA කොටස් ග්‍රහණය කර ගැනීම සඳහා ස්වාභාවික පෙරහන් ලෙස ක්‍රියා කිරීමට අපි මස්සල් වල හැකියාව භාවිතා කරමු. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මස්සල් හිමොලිම්ෆ් හි 1 සිට 5 kb දක්වා ප්‍රමාණයෙන් බෙහෙවින් වෙනස් වන DNA කොටස් අඩංගු බවයි. ෂොට්ගන් අනුපිළිවෙලින් පෙන්නුම් කළේ DNA කොටස් විශාල සංඛ්‍යාවක් විදේශීය ක්ෂුද්‍රජීවී සම්භවයක් ඇති බවයි. ඒවා අතර, වෙරළබඩ සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල බහුලව දක්නට ලැබෙන විවිධ ධාරකයන්ට ආසාදනය කරන වෛරස් ඇතුළුව, බැක්ටීරියා, ආකියා සහ වෛරස් වලින් DNA කොටස් අපට හමු විය. අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ මට්ටි සඳහා යොදන ලද LB සංකල්පය සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය පිළිබඳ පොහොසත් නමුත් තවමත් ගවේෂණය කර නොමැති දැනුමේ මූලාශ්‍රයක් නියෝජනය කරන බවයි.
දේශගුණික විපර්යාස (CC) සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වයට ඇති කරන බලපෑම වේගයෙන් වර්ධනය වන පර්යේෂණ ක්ෂේත්‍රයකි. ගෝලීය උණුසුම වැදගත් භෞතික විද්‍යාත්මක ආතතීන් ඇති කරනවා පමණක් නොව, සමුද්‍ර ජීවීන්ගේ තාප ස්ථායිතාවයේ පරිණාමීය සීමාවන් තල්ලු කරයි, විශේෂ ගණනාවක වාසස්ථානවලට බලපායි, වඩාත් හිතකර තත්වයන් සෙවීමට ඔවුන් පොළඹවයි [1, 2]. මෙටාසෝවාවන්ගේ ජෛව විවිධත්වයට බලපානවාට අමතරව, CC ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී අන්තර්ක්‍රියා වල සියුම් සමතුලිතතාවයට බාධා කරයි. මෙම ක්ෂුද්‍රජීවී ඩිස්බැක්ටීරියෝසිස් සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවලට බරපතල තර්ජනයක් එල්ල කරයි, මන්ද එය සමුද්‍ර ජීවීන් බෝවන රෝග කාරක වලට වඩාත් ගොදුරු වේ [3, 4]. ගෝලීය සමුද්‍ර පරිසර පද්ධති කළමනාකරණය සඳහා බරපතල ගැටළුවක් වන මහා මරණ සඳහා SS වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව විශ්වාස කෙරේ [5, 6]. බොහෝ සාගර විශේෂවල ආර්ථික, පාරිසරික සහ පෝෂණ බලපෑම් සැලකිල්ලට ගෙන මෙය වැදගත් ගැටළුවකි. CK හි බලපෑම් වඩාත් ක්ෂණික සහ දරුණු වන ධ්‍රැවීය ප්‍රදේශවල ජීවත් වන ද්වි කපාට සඳහා මෙය විශේෂයෙන් සත්‍ය වේ [6, 7]. ඇත්ත වශයෙන්ම, මයිටිලස් වැනි ද්වි කපාට. සාගර පරිසර පද්ධති කෙරෙහි CC වල බලපෑම් නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ. පුදුමයට කරුණක් නොවේ, ඔවුන්ගේ සෞඛ්‍යය නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා සාපේක්ෂව විශාල ජෛව සලකුණු සංඛ්‍යාවක් සංවර්ධනය කර ඇති අතර, බොහෝ විට එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් හෝ සෛල ශක්‍යතාව සහ ෆාගෝසයිටික් ක්‍රියාකාරකම් වැනි සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් මත පදනම් වූ ක්‍රියාකාරී ජෛව සලකුණු ඇතුළත් ද්වි-ස්ථර ප්‍රවේශයක් භාවිතා කරයි [8]. මුහුදු ජලය විශාල ප්‍රමාණයක් අවශෝෂණය කිරීමෙන් පසු මෘදු පටක වල එකතු වන නිශ්චිත පීඩන දර්ශකවල සාන්ද්‍රණය මැනීම ද මෙම ක්‍රමවලට ඇතුළත් වේ. කෙසේ වෙතත්, බිවල්ව් වල ඉහළ පෙරීමේ ධාරිතාව සහ අර්ධ-විවෘත සංසරණ පද්ධතිය, රෝගියා කළමනාකරණය සඳහා සරල සහ අවම ආක්‍රමණශීලී ප්‍රවේශයක් වන ද්‍රව බයොප්සි (LB) සංකල්පය භාවිතා කරමින් නව හිමොලිම්ෆ් ජෛව සලකුණු සංවර්ධනය කිරීමට අවස්ථාවක් සපයයි. රුධිර සාම්පල [9, 10]. මිනිස් LB හි සංසරණ අණු වර්ග කිහිපයක් සොයාගත හැකි වුවද, මෙම සංකල්පය ප්‍රධාන වශයෙන් ප්ලාස්මාවේ සංසරණය වන බාහිර සෛලීය DNA (ccfDNA) කොටස්වල DNA අනුක්‍රමික විශ්ලේෂණය මත පදනම් වේ. ඇත්ත වශයෙන්ම, මිනිස් ප්ලාස්මාවේ සංසරණ DNA පවතින බව 20 වන සියවසේ මැද භාගයේ සිට දැනගෙන ඇත [11], නමුත් මෑත වසරවලදී පමණක් ඉහළ ප්‍රතිදාන අනුක්‍රමික ක්‍රමවල පැමිණීම ccfDNA මත පදනම් වූ සායනික රෝග විනිශ්චයකට හේතු වී ඇත. මෙම සංසරණ DNA කොටස් තිබීම සෛල මරණයෙන් පසු ජෙනෝමික් DNA (න්‍යෂ්ටික සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල්) නිෂ්ක්‍රීයව මුදා හැරීමට හේතු වේ. නිරෝගී පුද්ගලයින් තුළ, ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩුය (<10 ng/mL) නමුත් විවිධ ව්‍යාධි වලින් පෙළෙන හෝ ආතතියට ලක්වන රෝගීන් තුළ එය 5-10 ගුණයකින් වැඩි විය හැකි අතර එමඟින් පටක හානි සිදු වේ. නිරෝගී පුද්ගලයින් තුළ, ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩුය (<10 ng/mL) නමුත් විවිධ ව්‍යාධි වලින් පෙළෙන හෝ ආතතියට ලක්වන රෝගීන් තුළ එය 5-10 ගුණයකින් වැඩි විය හැකි අතර එමඟින් පටක හානි සිදු වේ. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 в 5-10 различной патологией или подвергающихся стресу, приводящему к повреждению тканей. නිරෝගී පුද්ගලයින් තුළ, cccDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩුය (<10 ng/mL), නමුත් විවිධ ව්‍යාධි ඇති රෝගීන් හෝ පටක හානිවලට තුඩු දෙන ආතතිය යටතේ සිටින රෝගීන් තුළ එය 5-10 ගුණයකින් වැඩි විය හැක.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （<10 ng/ml中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 දක්වා различными патологиями или stressom, что приводит к повреждению тканей. නිරෝගී පුද්ගලයින් තුළ ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩු (<10 ng/ml) වන නමුත් විවිධ ව්‍යාධි හෝ ආතතියෙන් පෙළෙන රෝගීන් තුළ එය 5-10 ගුණයකින් වැඩි විය හැකි අතර එමඟින් පටක හානි සිදු වේ.ccfDNA කොටස්වල ප්‍රමාණය පුළුල් ලෙස වෙනස් වේ, නමුත් සාමාන්‍යයෙන් 150 සිට 200 bp දක්වා පරාසයක පවතී. [12]. ස්වයං-ව්‍යුත්පන්න ccfDNA විශ්ලේෂණය, එනම්, සාමාන්‍ය හෝ පරිවර්තනය කරන ලද ධාරක සෛල වලින් ccfDNA, න්‍යෂ්ටික සහ/හෝ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෙනෝමයේ පවතින ජානමය සහ එපිජෙනටික් වෙනස්කම් හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි අතර, එමඟින් නිශ්චිත අණුක ඉලක්ක කරගත් ප්‍රතිකාර තෝරා ගැනීමට වෛද්‍යවරුන්ට උපකාරී වේ [13]. කෙසේ වෙතත්, ගර්භණී සමයේදී භ්‍රෑණ සෛල වලින් හෝ බද්ධ කළ අවයව වලින් ccfDNA වැනි විදේශීය ප්‍රභවයන්ගෙන් ccfDNA ලබා ගත හැකිය [14,15,16,17]. ආසාදිත කාරකයක (විදේශීය) න්‍යෂ්ටික අම්ල පැවතීම හඳුනා ගැනීම සඳහා ccfDNA ද වැදගත් තොරතුරු මූලාශ්‍රයකි, එමඟින් රුධිර සංස්කෘතීන් මගින් හඳුනා නොගත් පුළුල් ආසාදන ආක්‍රමණශීලී නොවන ලෙස හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසයි, ආසාදිත පටක වල ආක්‍රමණශීලී ජෛව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාවලිය වළක්වා ගනී [18]. මෑත කාලීන අධ්‍යයනයන් ඇත්ත වශයෙන්ම පෙන්වා දී ඇත්තේ මිනිස් රුධිරයේ වෛරස් සහ බැක්ටීරියා රෝග කාරක හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි පොහොසත් තොරතුරු මූලාශ්‍රයක් අඩංගු වන අතර මිනිස් ප්ලාස්මාවේ ඇති ccfDNA වලින් 1% ක් පමණ විදේශීය සම්භවයක් ඇති බවයි [19]. මෙම අධ්‍යයනයන් මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ ජීවියෙකුගේ සංසරණය වන ක්ෂුද්‍රජීවයේ ජෛව විවිධත්වය ccfDNA විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් තක්සේරු කළ හැකි බවයි. කෙසේ වෙතත්, මෑතක් වන තුරුම, මෙම සංකල්පය මිනිසුන් තුළ පමණක් භාවිතා කරන ලද අතර, අඩු ප්‍රමාණයකට, අනෙකුත් පෘෂ්ඨවංශීන් තුළ [20, 21].
වර්තමාන පත්‍රිකාවේ, අපි LB විභවය භාවිතා කර වසර මිලියන 35 කට පෙර නිර්මාණය වූ විශාල සානුවක මුදුනේ පිහිටි දූපත් සමූහයක් වන උපඇන්ටාක්ටික් කර්ගුලෙන් දූපත් වල බහුලව දක්නට ලැබෙන දකුණු විශේෂයක් වන ඕලකොමියා ඇට්‍රාගේ ccfDNA විශ්ලේෂණය කරමු. ගිනිකඳු පිපිරීම. අභ්‍යන්තර පර්යේෂණාත්මක පද්ධතියක් භාවිතා කරමින්, මුහුදු ජලයේ ඇති DNA කොටස් ඉක්මනින් මට්ටි විසින් අවශෝෂණය කර හීමොලිම්ප් මැදිරියට ඇතුළු වන බව අපට පෙනී ගියේය. ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය මගින් මට්ටි හිමොලිම්ප් ccfDNA හි තමන්ගේම සහ ස්වයං සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් අඩංගු වන අතර, සහජීවන බැක්ටීරියා සහ සීතල ගිනිකඳු සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල සාමාන්‍ය ජෛව වලින් ලබාගත් DNA කොටස් ද ඇතුළත් වේ. හීමොලිම්ප් ccfDNA හි විවිධ ධාරක පරාසයන් සහිත වෛරස් වලින් ලබාගත් වෛරස් අනුපිළිවෙලවල් ද අඩංගු වේ. අස්ථි මාළු, මුහුදු ඇනිමෝන, ඇල්ගී සහ කෘමීන් වැනි බහු සෛලීය සතුන්ගෙන් DNA කොටස් ද අපට හමු විය. අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ LB සංකල්පය සාගර අපෘෂ්ඨවංශීන්ට සාර්ථකව යෙදිය හැකි බවත්, සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල පොහොසත් ජානමය පරාසයක් ජනනය කළ හැකි බවත්ය.
වැඩිහිටි (55-70 මි.මී. දිග) මයිටිලස් ප්ලැටෙන්සිස් (එම්. ප්ලැටෙන්සිස්) සහ අවුලකොම්යා ඇට්‍රා (ඒ. ඇට්‍රා) පෝර්ට්-ඕ-ප්‍රංශයේ අන්තර් උදම් පාෂාණ වෙරළ තීරයෙන් (049°21.235 දකුණු, 070°13.490 නැගෙනහිර) එකතු කරන ලදී. 2018 දෙසැම්බර් මාසයේදී කර්ගුලන් දූපත්. අනෙකුත් වැඩිහිටි නිල් මට්ටි (මයිටිලස් විශේෂ) වාණිජ සැපයුම්කරුවෙකුගෙන් (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ලබා ගන්නා ලද අතර 32‰ කෘතිම අති ක්ෂාර 10-20 L අඩංගු උෂ්ණත්ව පාලිත (4°C) වාතනය කළ ටැංකියක තැන්පත් කරන ලදී. (කෘතිම මුහුදු ලුණු රීෆ් ක්‍රිස්ටල්, ක්ෂණික සාගරය, වර්ජිනියා, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය). එක් එක් අත්හදා බැලීම සඳහා, තනි කවචවල දිග සහ බර මනිනු ලැබීය.
මෙම වැඩසටහන සඳහා නොමිලේ විවෘත ප්‍රවේශ ප්‍රොටෝකෝලයක් මාර්ගගතව ඇත (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). කෙටියෙන් කිවහොත්, විස්තර කර ඇති පරිදි LB හිමොලිම්ෆ් පැහැරගැනීමේ මාංශ පේශි වලින් එකතු කරන ලදී [22]. හිමොලිම්ෆ් මිනිත්තු 3 ක් සඳහා 1200×g දී කේන්ද්‍රාපසාරීකරණය මගින් පැහැදිලි කරන ලදී, භාවිතය තෙක් සුපිරි ද්‍රව්‍යය (-20°C) ශීත කරන ලදී. cfDNA හුදකලා කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීම සඳහා, නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සාම්පල (1.5-2.0 ml) නියුක්ලියෝස්නැප් cfDNA කට්ටලය (මැචෙරි-නාගල්, බෙත්ලෙහෙන්, PA) භාවිතයෙන් දියකර සකස් කරන ලදී. වැඩිදුර විශ්ලේෂණය තෙක් ccfDNA -80°C දී ගබඩා කරන ලදී. සමහර අත්හදා බැලීම් වලදී, QIAamp DNA විමර්ශක කට්ටලය (QIAGEN, ටොරොන්ටෝ, ඔන්ටාරියෝ, කැනඩාව) භාවිතයෙන් ccfDNA හුදකලා කර පිරිසිදු කරන ලදී. සම්මත PicoGreen විශ්ලේෂණයක් භාවිතයෙන් පිරිසිදු කරන ලද DNA ප්‍රමාණනය කරන ලදී. හුදකලා වූ ccfDNA හි කොටස් ව්‍යාප්තිය, අධි සංවේදීතා DNA කට්ටලයක් භාවිතයෙන් Agilent 2100 ජෛව විශ්ලේෂකයක් (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) භාවිතයෙන් කේශනාලිකා විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ccfDNA සාම්පලයෙන් 1 µl භාවිතා කරමින් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
හිමොලිම්ෆ් ccfDNA කොටස් අනුපිළිවෙලට සකස් කිරීම සඳහා, ජෙනෝම් ක්විබෙක් (මොන්ට්‍රියල්, ක්විබෙක්, කැනඩාව) ඉලුමිනා MiSeq PE75 කට්ටලයේ ඉලුමිනා DNA මිශ්‍ර කට්ටලය භාවිතයෙන් ෂොට්ගන් පුස්තකාල සකස් කළේය. සම්මත ඇඩැප්ටරයක් ​​(BioO) භාවිතා කරන ලදී. අමු දත්ත ගොනු NCBI අනුක්‍රමික කියවීමේ ලේඛනාගාරයෙන් (SRR8924808 සහ SRR8924809) ලබා ගත හැකිය. FastQC [23] භාවිතයෙන් මූලික කියවීමේ ගුණාත්මකභාවය තක්සේරු කරන ලදී. ඇඩැප්ටර සහ දුර්වල ගුණාත්මක කියවීම් සඳහා ට්‍රිමෝමැටික් [24] ක්ලිපින් කිරීම සඳහා භාවිතා කර ඇත. යුගල කළ කෙළවර සහිත ෂොට්ගන් කියවීම් FLASH දිගු තනි කියවීම් වලට ඒකාබද්ධ කරන ලද අතර නොගැලපීම් වළක්වා ගැනීම සඳහා අවම වශයෙන් 20 bp අතිච්ඡාදනය වේ [25]. ඒකාබද්ධ කියවීම් ද්වි කපාට NCBI වර්ගීකරණය දත්ත සමුදායක් (e අගය < 1e−3 සහ 90% සමජාතීයතාව) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ විවරණය කරන ලද අතර, අඩු සංකීර්ණතා අනුපිළිවෙලවල් ආවරණය කිරීම DUST භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී [26]. ඒකාබද්ධ කියවීම් ද්වි කපාට NCBI වර්ගීකරණය දත්ත සමුදායක් (e අගය < 1e−3 සහ 90% සමජාතීයතාව) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ විවරණය කරන ලද අතර, අඩු සංකීර්ණතා අනුපිළිවෙලවල් ආවරණය කිරීම DUST භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී [26]. Объединные чтенные були аннотированы с помощью BLASTN සහ ISPOLYSOVANIEM bazy dannыh taksonomies моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложноблестей использованием DUST [26]. NCBI ද්වි කපාට වර්ගීකරණ දත්ත සමුදාය (e අගය < 1e-3 සහ 90% සමජාතීයතාව) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ සංචිත කියවීම් විවරණය කරන ලද අතර, DUST භාවිතයෙන් අඩු සංකීර්ණතා අනුක්‍රමික ආවරණ සිදු කරන ලදී [26].ඔබ NCBI进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 සහ 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 佻湨 ，6进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединные чтенные були аннотированы с помощю BLASTN s ISPOLUSOVANIEM ටක්සොනොමිචෙස්කොයි ඩී.එස්. NCBI использованием DUST [26]. NCBI ද්වි කපාට වර්ගීකරණ දත්ත සමුදාය (e අගය <1e-3 සහ 90% සමජාතීයතාව) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ සංචිත කියවීම් විවරණය කරන ලද අතර, DUST භාවිතයෙන් අඩු සංකීර්ණතා අනුක්‍රමික ආවරණ සිදු කරන ලදී [26].කියවීම් කණ්ඩායම් දෙකකට බෙදා ඇත: ද්වි කපාට අනුපිළිවෙලට අදාළ (මෙහි ස්වයං-කියවීම් ලෙස හැඳින්වේ) සහ අසම්බන්ධ (ස්වයං-කියවීම් නොවන). කොන්ටිග් ජනනය කිරීම සඳහා MEGAHIT භාවිතයෙන් කණ්ඩායම් දෙකක් වෙන වෙනම එකලස් කරන ලදී [27]. මේ අතර, පිටසක්වල ක්ෂුද්‍ර ජීවී කියවීම්වල වර්ගීකරණ ව්‍යාප්තිය Kraken2 [28] භාවිතයෙන් වර්ගීකරණය කරන ලද අතර Galaxy [29, 30] හි ක්‍රෝනා පයි ප්‍රස්ථාරයක් මගින් චිත්‍රකව නිරූපණය කරන ලදී. අපගේ මූලික අත්හදා බැලීම් වලින් ප්‍රශස්ත kmers kmers-59 ලෙස තීරණය කරන ලදී. අවසාන විවරණයක් සඳහා BLASTN (bivalve NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ පෙළගැස්වීමෙන් ස්වයං කොන්ටිග් හඳුනා ගන්නා ලදී. අවසාන විවරණයක් සඳහා BLASTN (bivalve NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ පෙළගැස්වීමෙන් ස්වයං කොන්ටිග් හඳුනා ගන්නා ලදී. Затем собственные контиги били идентифицированы путем сопоставления с BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. අවසාන විවරණය සඳහා BLASTN (NCBI ද්වි කපාට දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ ගැලපීමෙන් ස්වයං-සම්බන්ධක හඳුනා ගන්නා ලදී.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной анотации путем сопоставление данных NCBI для двустворчатых молллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). ඉන්පසු BLASTN (NCBI bivalve දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% homology) හා සැසඳීමෙන් අවසාන විවරණය සඳහා ස්වයං-සම්බන්ධක හඳුනා ගන්නා ලදී. සමාන්තරව, ස්වයං නොවන කණ්ඩායම් කොන්ටිග් BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ සටහන් කරන ලදී. සමාන්තරව, ස්වයං නොවන කණ්ඩායම් කොන්ටිග් BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ සටහන් කරන ලදී. Параллельно чужеродные груповые kontigi были аннотированы с помощью BLASTN (බේස ඩැන්නිච් nt NCBI, 101 60%). සමාන්තරව, විදේශීය කණ්ඩායම් කොන්ටිග් BLASTN (NT NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ සටහන් කරන ලදී.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной grouppe, бли аннотированы с помосульно контиги, бесплатно значение e <1e-10 и гомология 60%). සමාන්තරව, ස්වයං-නොවන කණ්ඩායම් කොන්ටිග් BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% සමජාතීයතාව) සමඟ සටහන් කරන ලදී. nr සහ RefSeq ප්‍රෝටීන් NCBI දත්ත සමුදායන් (e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) භාවිතා කරමින් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග් මත BLASTX ද සිදු කරන ලදී. nr සහ RefSeq ප්‍රෝටීන් NCBI දත්ත සමුදායන් (e අගය < 1e−10 සහ 60% සමජාතීයතාව) භාවිතා කරමින් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග් මත BLASTX ද සිදු කරන ලදී. BLASTX TAKZE был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq10 и гомология 60%). nr සහ RefSeq NCBI ප්‍රෝටීන් දත්ත සමුදායන් (e අගය < 1e-10 සහ 60% සමජාතීයතාව) භාවිතා කරමින් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග් මත BLASTX සිදු කරන ලදී.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI BLASTX tакже выполняли на несамостоятельных с использованием баз данных белка nr සහ RefSeq NCBI (1CENACBI 60%). nr සහ RefSeq NCBI ප්‍රෝටීන් දත්ත සමුදායන් (e අගය <1e-10 සහ 60% සමජාතීයතාව) භාවිතා කරමින් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග් මත BLASTX ද සිදු කරන ලදී.ස්වයං-සම්බන්ධ නොවන BLASTN සහ BLASTX තටාක අවසාන සන්ධාන නියෝජනය කරයි (අතිරේක ගොනුව බලන්න).
PCR සඳහා භාවිතා කරන ලද ප්‍රයිමර් S1 වගුවේ ලැයිස්තුගත කර ඇත. ccfDNA ඉලක්ක ජාන විස්තාරණය කිරීම සඳහා Taq DNA පොලිමරේස් (Bio Basic Canada, Markham, ON) භාවිතා කරන ලදී. පහත ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි භාවිතා කරන ලදී: මිනිත්තු 3 ක් සඳහා 95°C දී denaturation, මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 95°C, මිනිත්තු 1 ක් සඳහා annealing උෂ්ණත්වය, මිනිත්තු 1 ක් සඳහා 72°C දී දිගු කිරීම, චක්‍ර 35 ක් සහ අවසානයේ මිනිත්තු 10 ක් ඇතුළත 72°C. . PCR නිෂ්පාදන 95 V දී SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) අඩංගු ඇගරෝස් ජෙල් (1.5%) තුළ ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් මගින් වෙන් කරන ලදී.
මස්සල් (Mytilus spp.) ඔක්සිජන් සහිත මුහුදු ජලය මිලි ලීටර් 500 (32 PSU) තුළ පැය 24ක් 4°C දී හුරු කරන ලදී. මිනිස් ගැලක්ටින්-7 cDNA අනුක්‍රමය (NCBI ප්‍රවේශ අංකය L07769) කේතනය කරන ඇතුළු කිරීමක් අඩංගු ප්ලාස්මිඩ් DNA 190 μg/μl අවසාන සාන්ද්‍රණයකින් කුප්පියට එකතු කරන ලදී. DNA එකතු කිරීමකින් තොරව එකම තත්වයන් යටතේ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද මස්සල් පාලනය විය. තුන්වන පාලන ටැංකියේ මස්සල් නොමැතිව DNA අඩංගු විය. මුහුදු ජලයේ DNA වල ගුණාත්මකභාවය නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා, සඳහන් කළ වේලාවට එක් එක් ටැංකියෙන් මුහුදු ජල සාම්පල (20 μl; පුනරාවර්තන තුනක්) ලබා ගන්නා ලදී. ප්ලාස්මිඩ් DNA සොයා ගැනීමේ හැකියාව සඳහා, LB ​​මස්සල් සඳහන් කළ වේලාවන්හිදී අස්වනු නෙළන ලද අතර qPCR සහ ddPCR මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. මුහුදු ජලයේ ඉහළ ලුණු අන්තර්ගතය නිසා, සියලුම PCR පරීක්ෂණවලට පෙර ඇල්කොහොල් PCR ගුණාත්මක ජලයේ (1:10) තනුක කරන ලදී.
ඩිජිටල් බිංදු PCR (ddPCR) BioRad QX200 ප්‍රොටෝකෝලය (මිසිසෝගා, ඔන්ටාරියෝ, කැනඩාව) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. ප්‍රශස්ත උෂ්ණත්වය තීරණය කිරීම සඳහා උෂ්ණත්ව පැතිකඩ භාවිතා කරන්න (වගුව S1). QX200 බිංදු උත්පාදක යන්ත්‍රයක් (BioRad) භාවිතයෙන් බිංදු ජනනය කරන ලදී. ddPCR පහත පරිදි සිදු කරන ලදී: මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 95°C, තත්පර 30 ක් සඳහා 95°C චක්‍ර 50 ක් සහ මිනිත්තු 1 ක් සඳහා ලබා දී ඇති ඇනීලිං උෂ්ණත්වය සහ තත්පර 30 ක් සඳහා 72°C, මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 4°C සහ මිනිත්තු 5 ක් ඇතුළත 90°C. බිංදු ගණන සහ ධනාත්මක ප්‍රතික්‍රියා (පිටපත් ගණන/µl) QX200 බිංදු කියවනය (BioRad) භාවිතයෙන් මනිනු ලැබීය. බිංදු 10,000 ට අඩු සාම්පල ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී. ddPCR ක්‍රියාත්මක කරන සෑම අවස්ථාවකම රටා පාලනය සිදු නොකළේය.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (කෝබට් පර්යේෂණ, සිඩ්නි, ඕස්ට්‍රේලියාව) සහ LGALS7 විශේෂිත ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. සියලුම ප්‍රමාණාත්මක PCR 20 µl හි QuantiFast SYBR හරිත PCR කට්ටලය (QIAGEN) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. qPCR 95°C දී මිනිත්තු 15 ක පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමකින් ආරම්භ කරන ලද අතර ඉන් පසුව තත්පර 10 ක් සඳහා 95°C දී චක්‍ර 40 ක් සහ තත්පර 60 ක් සඳහා 60°C දී එක් දත්ත එකතුවක් සමඟ ආරම්භ කරන ලදී. තත්පර 5 ක් සඳහා 95°C, තත්පර 60 ක් සඳහා 65°C සහ qPCR අවසානයේ 97°C දී අනුක්‍රමික මිනුම් භාවිතා කරමින් ද්‍රවාංක වක්‍ර ජනනය කරන ලදී. පාලන සාම්පල හැර, සෑම qPCR එකක්ම ත්‍රිත්ව වලින් සිදු කරන ලදී.
මට්ටි ඔවුන්ගේ ඉහළ පෙරීමේ අනුපාතය සඳහා ප්‍රසිද්ධ බැවින්, අපි මුලින්ම මුහුදු ජලයේ ඇති DNA කොටස් පෙරීමට සහ රඳවා ගැනීමට හැකිද යන්න සොයා බැලුවෙමු. මෙම කොටස් ඒවායේ අර්ධ-විවෘත වසා පද්ධතියේ එකතු වේද යන්න පිළිබඳවද අපි උනන්දු විය. නිල් මට්ටි ටැංකිවලට එකතු කරන ලද ද්‍රාව්‍ය DNA කොටස්වල ඉරණම සොයා ගැනීමෙන් අපි මෙම ගැටළුව පර්යේෂණාත්මකව විසඳා ගත්තෙමු. DNA කොටස් නිරීක්ෂණය කිරීම පහසු කිරීම සඳහා, අපි මිනිස් ගැලෙක්ටින්-7 ජානය අඩංගු විදේශීය (ස්වයං නොවේ) ප්ලාස්මිඩ් DNA භාවිතා කළෙමු. ddPCR මුහුදු ජලයේ සහ මට්ටි වල ප්ලාස්මිඩ් DNA කොටස් සොයා ගනී. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මට්ටි නොමැති විට (දින 7 දක්වා) මුහුදු ජලයේ ඇති DNA කොටස් ප්‍රමාණය සාපේක්ෂව නියතව පැවතුනේ නම්, මට්ටි ඉදිරියේ මෙම මට්ටම පැය 8 ක් ඇතුළත සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ අතුරුදහන් වූ බවයි (රූපය 1a,b). බාහිර DNA කොටස් අභ්‍යන්තර කපාට තරලය සහ හිමොලිම්ප් (රූපය 1c) තුළ මිනිත්තු 15 ක් ඇතුළත පහසුවෙන් අනාවරණය විය. නිරාවරණයෙන් පැය 4 ක් දක්වා මෙම කොටස් තවමත් අනාවරණය කර ගත හැකිය. DNA කොටස් සම්බන්ධයෙන් මෙම පෙරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වය බැක්ටීරියා සහ ඇල්ගී වල පෙරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වයට සමාන වේ [31]. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මට්ටි වලට ඔවුන්ගේ තරල මැදිරි තුළ විදේශීය DNA පෙරීමට සහ රැස් කිරීමට හැකි බවයි.
මට්ටි ඉදිරියේ (A) හෝ නොමැති විට (B) මුහුදු ජලයේ ප්ලාස්මිඩ් DNA වල සාපේක්ෂ සාන්ද්‍රණය, ddPCR මගින් මට්ටි. A හි, ප්‍රතිඵල ප්‍රතිශත ලෙස ප්‍රකාශ කර ඇති අතර, කොටු වල මායිම් 75 වන සහ 25 වන ප්‍රතිශත නියෝජනය කරයි. සවි කර ඇති ලඝුගණක වක්‍රය රතු පැහැයෙන් දක්වා ඇති අතර, අළු පැහැයෙන් සෙවන ලද ප්‍රදේශය 95% විශ්වාසනීය පරතරය නියෝජනය කරයි. B හි, රතු රේඛාව මධ්‍යන්‍යය නියෝජනය කරන අතර නිල් රේඛාව සාන්ද්‍රණය සඳහා 95% විශ්වාසනීය පරතරය නියෝජනය කරයි. C ප්ලාස්මිඩ් DNA එකතු කිරීමෙන් පසු විවිධ කාලවලදී මට්ටි වල හිමොලිම්ප් සහ කපාට තරලයේ ප්ලාස්මිඩ් DNA සමුච්චය වීම. ප්‍රතිඵල අනාවරණය කරගත් නිරපේක්ෂ පිටපත්/mL (±SE) ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.
ඊළඟට, සීමිත මානව විද්‍යාත්මක බලපෑමක් ඇති දුරස්ථ දූපත් සමූහයක් වන කර්ගුලෙන් දූපත් වල මසල් ඇඳන්ගෙන් එකතු කරන ලද මසල් වල ccfDNA සම්භවය අපි විමර්ශනය කළෙමු. මෙම අරමුණ සඳහා, මසල් හිමොලිම්ෆ් වලින් cccDNA හුදකලා කර මිනිස් cccDNA පිරිසිදු කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වන ක්‍රම මගින් පවිත්‍ර කරන ලදී [32, 33]. මසල් වල සාමාන්‍ය හිමොලිම්ෆ් ccfDNA සාන්ද්‍රණය මිලි ලීටරයකට අඩු මයික්‍රොග්‍රෑම් හීමොලිම්ෆ් පරාසයක පවතින බව අපට පෙනී ගියේය (වගුව S2, අතිරේක තොරතුරු බලන්න). මෙම සාන්ද්‍රණ පරාසය නිරෝගී පුද්ගලයින්ට වඩා බෙහෙවින් විශාලය (මිලිලීටරයකට අඩු නැනෝග්‍රෑම්), නමුත් දුර්ලභ අවස්ථාවන්හිදී, පිළිකා රෝගීන් තුළ, ccfDNA මට්ටම මිලිලීටරයකට මයික්‍රොග්‍රෑම් කිහිපයක් කරා ළඟා විය හැකිය [34, 35]. හිමොලිම්ෆ් ccfDNA හි ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ මෙම කොටස් ප්‍රමාණයෙන් බොහෝ සෙයින් වෙනස් වන බවයි, 1000 bp සිට 1000 bp දක්වා. 5000 bp දක්වා (රූපය 2). ccfDNA [36] ඇතුළු අඩු සාන්ද්‍රණයකින් යුත් DNA සාම්පල වලින් ජෙනෝමික් DNA ඉක්මනින් හුදකලා කර පිරිසිදු කිරීම සඳහා අධිකරණ වෛද්‍ය විද්‍යාවේ බහුලව භාවිතා වන ක්‍රමයක් වන සිලිකා මත පදනම් වූ QIAamp විමර්ශක කට්ටලය භාවිතයෙන් සමාන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී.
මසල් හිමොලිම්ෆ් හි නියෝජිත ccfDNA විද්‍යුත් විච්ඡේදක සටහන. නියුක්ලියෝස්නැප් ප්ලාස්මා කට්ටලය (ඉහළ) සහ QIAamp DNA විමර්ශක කට්ටලය සමඟ උපුටා ගන්නා ලදී. B මසල් වල හිමොලිම්ෆ් ccfDNA සාන්ද්‍රණයන් (±SE) ව්‍යාප්තිය පෙන්වන වයලීන සටහන. කළු සහ රතු රේඛා පිළිවෙලින් මධ්‍යන්‍ය සහ පළමු සහ තුන්වන කාර්තු නියෝජනය කරයි.
මිනිසුන් සහ ප්‍රයිමේටාවන් තුළ ccfDNA වලින් ආසන්න වශයෙන් 1% ක් විදේශීය ප්‍රභවයක් ඇත [21, 37]. ද්වි කපාටවල අර්ධ-විවෘත සංසරණ පද්ධතිය, ක්ෂුද්‍රජීවීන්ගෙන් පොහොසත් මුහුදු ජලය සහ මුසල් ccfDNA හි ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය සැලකිල්ලට ගෙන, මුසල් හිමොලිම්ප් ccfDNA හි පොහොසත් සහ විවිධාකාර ක්ෂුද්‍රජීවී DNA සංචිතයක් අඩංගු විය හැකි බව අපි උපකල්පනය කළෙමු. මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි Kerguelen දූපත් වලින් එකතු කරන ලද Aulacomya atra සාම්පල වලින් hemolymph ccfDNA අනුපිළිවෙලට සකස් කළ අතර, කියවීම් මිලියන 10 කට වඩා ලබා දුන් අතර, එයින් 97.6% ක් තත්ත්ව පාලනය සමත් විය. පසුව කියවීම් BLASTN සහ NCBI ද්වි කපාට දත්ත සමුදායන් භාවිතයෙන් ස්වයං සහ ස්වයං නොවන ප්‍රභවයන්ට අනුව වර්ගීකරණය කරන ලදී (රූපය S1, අතිරේක තොරතුරු).
මිනිසුන් තුළ, න්‍යෂ්ටික සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA දෙකම රුධිරයට මුදා හැරිය හැක [38]. කෙසේ වෙතත්, වර්තමාන අධ්‍යයනයේ දී, A. atra ජෙනෝමය අනුක්‍රමණය කර හෝ විස්තර කර නොමැති බැවින්, මස්සල් වල න්‍යෂ්ටික ජෙනෝමික් DNA විස්තරාත්මකව විස්තර කිරීමට නොහැකි විය. කෙසේ වෙතත්, ද්වි කපාට පුස්තකාලය භාවිතයෙන් අපගේම සම්භවයක් ඇති ccfDNA කොටස් ගණනාවක් හඳුනා ගැනීමට අපට හැකි විය (රූපය S2, අතිරේක තොරතුරු). අනුක්‍රමණය කරන ලද එම A. atra ජානවල සෘජු PCR විස්තාරණය මගින් අපගේම සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් ඇති බව අපි තහවුරු කළෙමු (රූපය 3). ඒ හා සමානව, A. atra හි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෙනෝමය පොදු දත්ත සමුදායන්හි ඇති බැවින්, A. atra හි හීමොලිම්ෆ් හි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ccfDNA කොටස් ඇති බවට සාක්ෂි සොයාගත හැකිය. මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA කොටස් ඇති බව PCR විස්තාරණය මගින් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 3).
PCR මගින් විස්තාරණය කරන ලද A. atra (රතු තිත් - තොග අංකය: SRX5705969) සහ M. platensis (නිල් තිත් - තොග අංකය: SRX5705968) හි හිමොලිම්ප් වල විවිධ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාන තිබුණි. බ්‍රෙටන් සහ වෙනත් අයගෙන් අනුවර්තනය කරන ලද රූපය, 2011 B A. atra වෙතින් හිමොලිම්ප් සුපර්නැටන්ට් විස්තාරණය FTA කඩදාසි මත ගබඩා කර ඇත. PCR මිශ්‍රණය අඩංගු PCR නළයට කෙලින්ම එකතු කිරීමට 3 mm පන්ච් එකක් භාවිතා කරන්න.
මුහුදු ජලයේ බහුල ක්ෂුද්‍රජීවී අන්තර්ගතය සැලකිල්ලට ගෙන, අපි මුලින් අවධානය යොමු කළේ හිමොලිම්ෆ් හි ක්ෂුද්‍රජීවී DNA අනුපිළිවෙලෙහි ලක්ෂණ හඳුනා ගැනීම කෙරෙහි ය. මෙය සිදු කිරීම සඳහා, අපි වෙනස් උපාය මාර්ග දෙකක් භාවිතා කරමු. පළමු උපාය මාර්ගය භාවිතා කළේ BLAST සහ අනෙකුත් මෙවලම් වලට සමාන නිරවද්‍යතාවයකින් ක්ෂුද්‍රජීවී අනුපිළිවෙල හඳුනාගත හැකි ඇල්ගොරිතම මත පදනම් වූ අනුක්‍රමික වර්ගීකරණ වැඩසටහනක් වන Kraken2 ය [28]. කියවීම් 6719 කට වඩා බැක්ටීරියා සම්භවයක් ඇති බව තීරණය කරන ලද අතර, කියවීම් 124 සහ 64 පිළිවෙලින් ආර්කියා සහ වෛරස් වලින් විය (රූපය 4). වඩාත් බහුල බැක්ටීරියා DNA කොටස් වූයේ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) සහ Bacteroidetes (17%) (රූපය 4a). මෙම ව්‍යාප්තිය සමුද්‍ර නිල් මසල් ක්ෂුද්‍රජීවය පිළිබඳ පෙර අධ්‍යයනයන්ට අනුකූල වේ [39, 40]. ගැමාප්‍රෝටියෝබැක්ටීරියා යනු ප්‍රෝටියෝබැක්ටීරියා (44%) හි ප්‍රධාන පන්තියයි, බොහෝ Vibrionales (රූපය 4b) ඇතුළුව. ddPCR ක්‍රමය මගින් A. atra hemolymph හි ccfDNA හි Vibrio DNA කොටස් පවතින බව තහවුරු කරන ලදී (රූපය 4c) [41]. ccfDNA හි බැක්ටීරියා සම්භවය පිළිබඳ වැඩිදුර තොරතුරු ලබා ගැනීම සඳහා, අතිරේක ප්‍රවේශයක් ගන්නා ලදී (රූපය S2, අතිරේක තොරතුරු). මෙම අවස්ථාවේදී, අතිච්ඡාදනය වූ කියවීම් යුගල-අන්ත කියවීම් ලෙස එකලස් කරන ලද අතර BLASTN සහ 1e−3 ක e අගයක් සහ >90% සමජාතීයතාවයක් සහිත කඩඉමක් භාවිතයෙන් ස්වයං (ද්වි කපාට) හෝ ස්වයං නොවන සම්භවයක් ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී. මෙම අවස්ථාවේදී, අතිච්ඡාදනය වූ කියවීම් යුගල-අන්ත කියවීම් ලෙස එකලස් කරන ලද අතර BLASTN සහ 1e−3 ක e අගයක් සහ >90% සමජාතීයතාවයක් සහිත කඩඉමක් භාවිතයෙන් ස්වයං (ද්වි කපාට) හෝ ස්වයං නොවන සම්භවයක් ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී. В В В том случае перекрываюющеся били собраны как чтения с parnыmy cornsami и били классии собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значение 3 с гомологией> 90%. මෙම අවස්ථාවේදී, අතිච්ඡාදනය වන කියවීම් යුගල-අවසන් කියවීම් ලෙස එකතු කරන ලද අතර BLASTN සහ e අගය 1e-3 සහ >90% සමජාතීයතාවය සහිත කඩඉම භාවිතා කරමින් ස්වදේශීය (ද්වි කපාට) හෝ මුල් නොවන ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e> 90%值和同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 璌 的-31和> 90% 同源性 的 分类 自身 В В В В том случае перекрывающиеся били собраны как чтения с parnыmy konchamis и класифицы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по по по происхождению с использованием использования порога гомологии> 90%. මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අතිච්ඡාදනය වන කියවීම් යුගල-අවසන් කියවීම් ලෙස එකතු කර e BLASTN සහ 1e-3 අගයන් සහ සමජාතීය සීමාව > 90% භාවිතා කරමින් තමන්ගේම (ද්වි කපාට) හෝ මුල් නොවන ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී.A. atra ජෙනෝමය තවමත් අනුපිළිවෙලට සකස් කර නොමැති බැවින්, අපි MEGAHIT ඊළඟ පරම්පරාවේ අනුක්‍රමික (NGS) එකලස් කරන්නාගේ නව එකලස් කිරීමේ උපාය මාර්ගය භාවිතා කළෙමු. සම්භවය මත යැපෙන (ද්වි කපාට) කොන්ටිග් 147,188 ක් හඳුනාගෙන ඇත. මෙම කොන්ටිග් පසුව BLASTN සහ BLASTX භාවිතයෙන් 1e-10 e-අගය සමඟ පුපුරවා හරින ලදී. මෙම උපාය මාර්ගය A. atra ccfDNA හි ඇති ද්වි කපාට නොවන කොටස් 482 ක් හඳුනා ගැනීමට අපට ඉඩ ලබා දුන්නේය. මෙම DNA කොටස් වලින් අඩකට වඩා (57%) බැක්ටීරියා වලින් ලබා ගන්නා ලදී, ප්‍රධාන වශයෙන් සල්ෆොට්‍රොෆික් සංකේත ඇතුළු ගිල් සංකේත වලින් සහ ගිල් සංකේත Solemya velum (රූපය 5).
වර්ග මට්ටමින් සාපේක්ෂ බහුලත්වය. B ප්‍රධාන ෆයිලා දෙකක (ෆර්මිකියුට්ස් සහ ප්‍රෝටියෝබැක්ටීරියා) ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය. ddPCR හි නියෝජිත විස්තාරණය C Vibrio spp. A. ඇට්‍රා හීමොලිම්ෆ් තුනක 16S rRNA ජානයේ (නිල්) කොටස්.
එකතු කරන ලද කොන්ටිග් 482 ක් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. මෙටාජෙනොමික් කොන්ටිග් විවරණවල (ප්‍රොකැරියෝට සහ යුකැරියෝට) වර්ගීකරණ ව්‍යාප්තියේ සාමාන්‍ය පැතිකඩ. B BLASTN සහ BLASTX මගින් හඳුනාගත් බැක්ටීරියා DNA කොටස්වල සවිස්තරාත්මක ව්‍යාප්තිය.
Kraken2 විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ mussel ccfDNA හි Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) සහ Thaurmarcheota (11%) ඇතුළු පුරාවිද්‍යාත්මක DNA කොටස් අඩංගු බවයි (රූපය 6a). කැලිෆෝනියානු mussel වල ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රජාවෙන් කලින් හමු වූ Euryarchaeota සහ Crenarchaeota වලින් ලබාගත් DNA කොටස් තිබීම පුදුමයට කරුණක් නොවිය යුතුය [42]. Euryarchaeota බොහෝ විට ආන්තික තත්වයන් සමඟ සම්බන්ධ වුවද, Euryarchaeota සහ Crenarcheota යන දෙකම සමුද්‍ර ක්‍රයොජනික් පරිසරයේ වඩාත් සුලභ ප්‍රොකැරියෝට් අතර බව දැන් හඳුනාගෙන ඇත [43, 44]. Kerguelen සානුවේ [45] පතුලේ කාන්දුවීම් වලින් පුළුල් මීතේන් කාන්දුවීම් සහ Kerguelen දූපත් වල වෙරළට ඔබ්බෙන් නිරීක්ෂණය වූ ක්ෂුද්‍රජීවී මීතේන් නිෂ්පාදනය පිළිබඳ මෑත කාලීන වාර්තා අනුව, mussel වල මෙතනොජනික් ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් සිටීම පුදුමයක් නොවේ [46].
ඉන්පසු අපගේ අවධානය DNA වෛරස් වලින් කියවීම් වෙත යොමු විය. අපගේ දැනුමේ උපරිමයට අනුව, මෙය මට්ටි වල වෛරස් අන්තර්ගතය පිළිබඳ පළමු ඉලක්කයෙන් බැහැර අධ්‍යයනයයි. අපේක්ෂා කළ පරිදි, අපට බැක්ටීරියාභක්ෂක (Caudovirales) වල DNA කොටස් හමු විය (රූපය 6b). කෙසේ වෙතත්, වඩාත් සුලභ වෛරස් DNA පැමිණෙන්නේ ඕනෑම වෛරසයක විශාලතම ජෙනෝමය ඇති නියුක්ලියෝසයිටෝ වයිරස (NCLDV) ලෙසද හැඳින්වෙන නියුක්ලියෝසයිටෝ වයිරස කුලයකිනි. මෙම කාණ්ඩය තුළ, බොහෝ DNA අනුපිළිවෙල මිමිමිඩොවිරිඩේ (58%) සහ පොක්ස්විරිඩේ (21%) පවුල්වලට අයත් වන අතර, ඒවායේ ස්වාභාවික ධාරකයන්ට පෘෂ්ඨවංශීන් සහ ආත්‍රපෝඩාවන් ඇතුළත් වන අතර, මෙම DNA අනුපිළිවෙලින් කුඩා ප්‍රමාණයක් දන්නා වෛරස් විද්‍යාත්මක ඇල්ගී වලට අයත් වේ. සමුද්‍ර යුකැරියෝටික් ඇල්ගී ආසාදනය කරයි. අනුපිළිවෙලවල් පැන්ඩෝරා වෛරසයෙන් ද ලබා ගන්නා ලදී, එය දන්නා ඕනෑම වෛරස් පරම්පරාවක විශාලතම ජෙනෝම ප්‍රමාණය සහිත යෝධ වෛරසයකි. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, හීමොලිම්ෆ් ccfDNA අනුක්‍රමණය මගින් තීරණය කරන ලද පරිදි වෛරසයෙන් ආසාදනය වී ඇති බව දන්නා ධාරක පරාසය සාපේක්ෂව විශාල විය (රූපය S3, අතිරේක තොරතුරු). එයට බැකුලෝවිරිඩේ සහ ඉරිඩෝවිරිඩේ වැනි කෘමීන් ආසාදනය කරන වෛරස් මෙන්ම ඇමීබා, ඇල්ගී සහ පෘෂ්ඨවංශීන් ආසාදනය කරන වෛරස් ද ඇතුළත් වේ. පිටෝ වයිරස් සයිබීරිකම් ජෙනෝමයට ගැලපෙන අනුපිළිවෙලවල් ද අපට හමු විය. පිටෝ වයිරස් ("සොම්බි වෛරස්" ලෙසද හැඳින්වේ) මුලින්ම සයිබීරියාවේ අවුරුදු 30,000 ක් පැරණි නිත්‍ය හිම වලින් හුදකලා කරන ලදී [47]. මේ අනුව, මෙම වෛරස් වල සියලුම නවීන විශේෂ වඳ වී ගොස් නැති බවත් [48] මෙම වෛරස් දුරස්ථ උප ආක්ටික් සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල පැවතිය හැකි බවත් පෙන්වන පෙර වාර්තා සමඟ අපගේ ප්‍රතිඵල අනුකූල වේ.
අවසාන වශයෙන්, අනෙකුත් බහු සෛලීය සතුන්ගෙන් DNA කොටස් සොයා ගත හැකිදැයි බැලීමට අපි පරීක්ෂා කළෙමු. nt, nr සහ RefSeq පුස්තකාල (ජානමය සහ ප්‍රෝටීන්) සමඟ BLASTN සහ BLASTX විසින් විදේශීය කොන්ටිග් 482 ක් හඳුනාගෙන ඇත. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ බහු සෛලීය සතුන්ගේ ccfDNA හි විදේශීය කොටස් අතර අස්ථි අස්ථිවල DNA ප්‍රමුඛ වන බවයි (රූපය 5). කෘමීන්ගෙන් සහ අනෙකුත් විශේෂවලින් ලබාගත් DNA කොටස් ද සොයාගෙන ඇත. භූමිෂ්ඨ විශේෂ හා සසඳන විට ජානමය දත්ත සමුදායන්හි සාගර විශේෂ විශාල සංඛ්‍යාවක් අඩුවෙන් නියෝජනය වීම නිසා විය හැකිය [49].
වර්තමාන පත්‍රිකාවේ, අපි LB සංකල්පය මට්ටි සඳහා යොදන අතර, hemolymph ccfDNA වෙඩි තැබීමේ අනුක්‍රමණය සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල සංයුතිය පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා දිය හැකි බවට තර්ක කරමු. විශේෂයෙන්, අපි සොයා ගත්තේ 1) mussel hemolymph හි සාපේක්ෂව විශාල (~1-5 kb) සංසරණය වන DNA කොටස්වල සාපේක්ෂව ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් (ක්ෂුද්‍ර ග්‍රෑම් මට්ටම්) අඩංගු වන බවයි; 2) මෙම DNA කොටස් ස්වාධීන සහ ස්වාධීන නොවන දෙකම වේ 3) මෙම DNA කොටස්වල විදේශීය ප්‍රභවයන් අතර, අපට බැක්ටීරියා, පුරාවිද්‍යා සහ වෛරස් DNA මෙන්ම අනෙකුත් බහු සෛලීය සතුන්ගේ DNA හමු විය; 4) hemolymph හි මෙම විදේශීය ccfDNA කොටස් සමුච්චය වීම වේගයෙන් සිදුවන අතර මට්ටි වල අභ්‍යන්තර පෙරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වයට දායක වේ. අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ මෙතෙක් ප්‍රධාන වශයෙන් ජෛව වෛද්‍ය ක්ෂේත්‍රයේ යෙදී ඇති LB සංකල්පය, සෙන්ටිනල් විශේෂ සහ ඒවායේ පරිසරය අතර අන්තර්ක්‍රියා වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා භාවිතා කළ හැකි පොහොසත් නමුත් ගවේෂණය නොකළ දැනුමේ මූලාශ්‍රයක් සංකේතනය කරන බවයි.
ප්‍රයිමේට් සතුන්ට අමතරව, මීයන්, බල්ලන්, බළලුන් සහ අශ්වයන් ඇතුළු ක්ෂීරපායින් තුළ ccfDNA හුදකලාව වාර්තා වී ඇත [50, 51, 52]. කෙසේ වෙතත්, අපගේ දැනුමට අනුව, විවෘත සංසරණ පද්ධතියක් සහිත සමුද්‍ර විශේෂවල ccfDNA හඳුනා ගැනීම සහ අනුක්‍රමණය කිරීම වාර්තා කළ පළමු අධ්‍යයනය අපගේ අධ්‍යයනයයි. මට්ටි වල මෙම ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක ලක්ෂණය සහ පෙරීමේ හැකියාව, අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන්, අනෙකුත් විශේෂ හා සසඳන විට සංසරණය වන DNA කොටස්වල විවිධ ප්‍රමාණයේ ලක්ෂණ පැහැදිලි කළ හැකිය. මිනිසුන් තුළ, රුධිරයේ සංසරණය වන බොහෝ DNA කොටස් 150 සිට 200 bp දක්වා ප්‍රමාණයේ කුඩා කොටස් වේ. උපරිම උපරිමය 167 bp [34, 53]. DNA කොටස් වලින් කුඩා නමුත් සැලකිය යුතු කොටසක් ප්‍රමාණයෙන් 300 ත් 500 bp ත් අතර වන අතර 5% ක් පමණ 900 bp ට වඩා දිගු වේ. [54]. මෙම ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තියට හේතුව නම්, ප්ලාස්මාවේ ccfDNA හි ප්‍රධාන ප්‍රභවය සෛල මරණයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සිදුවන අතර, එය සෛල මරණය නිසා හෝ නිරෝගී පුද්ගලයින්ගේ සංසරණය වන රක්තපාත සෛලවල නෙරෝසිස් නිසා හෝ පිළිකා රෝගීන්ගේ පිළිකා සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස් නිසා (සංසරණ පිළිකා DNA ලෙස හැඳින්වේ) වීමයි. , ctDNA). අපි මට්ටි වල සොයාගත් හීමොලිම්ප් ccfDNA හි ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය 1000 සිට 5000 bp දක්වා වූ අතර, එයින් ඇඟවෙන්නේ මට්ටි ccfDNA වෙනස් සම්භවයක් ඇති බවයි. මෙය තාර්කික උපකල්පනයකි, මන්ද මට්ටි අර්ධ-විවෘත සනාල පද්ධතියක් ඇති අතර ක්ෂුද්‍රජීවී ජානමය DNA ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් අඩංගු සාගර ජලජ පරිසරවල ජීවත් වේ. ඇත්ත වශයෙන්ම, බාහිර DNA භාවිතා කරන අපගේ රසායනාගාර අත්හදා බැලීම්වලින් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ මට්ටි මුහුදු ජලයේ DNA කොටස් රැස් කරන බවයි, අවම වශයෙන් පැය කිහිපයකට පසු ඒවා සෛලීය අවශෝෂණයෙන් සහ/හෝ මුදා හැරීමෙන් සහ/හෝ විවිධ සංවිධානවල ගබඩා කිරීමෙන් පසු දිරාපත් වේ. සෛලවල දුර්ලභත්වය (ප්‍රොකැරියෝටික් සහ යුකැරියෝටික් යන දෙකම) සැලකිල්ලට ගෙන, අභ්‍යන්තර කපාට මැදිරි භාවිතය ස්වයං ප්‍රභවයන්ගෙන් මෙන්ම විදේශීය ප්‍රභවයන්ගෙන් ccfDNA ප්‍රමාණය අඩු කරනු ඇත. ද්වි කපාට සහජ ප්‍රතිශක්තියේ වැදගත්කම සහ සංසරණය වන ෆාගෝසයිට් විශාල සංඛ්‍යාව සැලකිල්ලට ගනිමින්, ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් සහ/හෝ සෛලීය සුන්බුන් ශරීරගත කිරීමේදී විදේශීය DNA රැස් කරන සංසරණ ෆාගෝසයිට් වලින් විදේශීය ccfDNA පවා පොහොසත් වන බව අපි තවදුරටත් උපකල්පනය කළෙමු. එකට ගත් කල, අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ද්වි කපාට හීමොලිම්ෆ් ccfDNA යනු අණුක තොරතුරු වල අද්විතීය ගබඩාවක් වන අතර සෙන්ටිනල් විශේෂයක් ලෙස ඔවුන්ගේ තත්ත්වය ශක්තිමත් කරන බවයි.
අපගේ දත්තවලින් පෙනී යන්නේ බැක්ටීරියා වලින් ලබාගත් හිමොලිම්ෆ් ccfDNA කොටස් අනුපිළිවෙලට සකස් කිරීම සහ විශ්ලේෂණය කිරීම මගින් ධාරක බැක්ටීරියා ශාක හා අවට සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතියේ ඇති බැක්ටීරියා පිළිබඳ ප්‍රධාන තොරතුරු සැපයිය හැකි බවයි. ෂොට් අනුපිළිවෙල ශිල්පීය ක්‍රම මගින් සාම්ප්‍රදායික 16S rRNA හඳුනාගැනීමේ ක්‍රම භාවිතා කර ඇත්නම් මඟ හැරෙන ආරම්භක බැක්ටීරියා A. atra gill හි අනුපිළිවෙල හෙළි කර ඇති අතර, එය යොමු පුස්තකාල නැඹුරුවක් හේතුවෙන් අර්ධ වශයෙන් සිදු විය. ඇත්ත වශයෙන්ම, Kerguelen හි එකම mussel ස්ථරයේ M. platensis වෙතින් එකතු කරන ලද LB දත්ත භාවිතා කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ gill-ආශ්‍රිත බැක්ටීරියා සහජීවනයන්ගේ සංයුතිය mussel විශේෂ දෙකටම සමාන බවයි (රූපය S4, අතිරේක තොරතුරු). ජානමය වශයෙන් වෙනස් mussel දෙකක මෙම සමානතාවය Kerguelen හි සීතල, සල්ෆර් සහ ගිනිකඳු තැන්පතු වල බැක්ටීරියා ප්‍රජාවන්ගේ සංයුතිය පිළිබිඹු කළ හැකිය [55, 56, 57, 58]. පෝර්ට්-ඕ-ප්‍රංශ වෙරළ තීරය වැනි ජෛව ටර්බේටඩ් වෙරළබඩ ප්‍රදේශවලින් [59] මට්ටි අස්වැන්න නෙළන විට සල්ෆර් අඩු කරන ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගේ ඉහළ මට්ටම් හොඳින් විස්තර කර ඇත. තවත් හැකියාවක් නම්, ආරම්භක මට්ටි වෘක්ෂලතාදිය තිරස් සම්ප්‍රේෂණයෙන් බලපෑමට ලක් විය හැකි බවයි [60, 61]. සමුද්‍ර පරිසරය, මුහුදු පත්ලේ මතුපිට සහ මට්ටි වල සහජීවන බැක්ටීරියා සංයුතිය අතර සහසම්බන්ධය තීරණය කිරීම සඳහා තවත් පර්යේෂණ අවශ්‍ය වේ. මෙම අධ්‍යයනයන් දැනට සිදුවෙමින් පවතී.
හිමොලිම්ෆ් ccfDNA වල දිග සහ සාන්ද්‍රණය, එහි පිරිසිදු කිරීමේ පහසුව සහ වේගවත් ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණයට ඉඩ සලසන උසස් තත්ත්වය, සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා මුසල් ccfDNA භාවිතා කිරීමේ බොහෝ වාසි වලින් කිහිපයකි. මෙම ප්‍රවේශය විශේෂයෙන් ඵලදායී වන්නේ දී ඇති පරිසර පද්ධතියක වෛරස් ප්‍රජාවන් (වෛරස්) සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ය [62, 63]. බැක්ටීරියා, ආර්කියා සහ යුකැරියෝට් මෙන් නොව, වෛරස් ජෙනෝමවල 16S අනුපිළිවෙල වැනි ෆයිලොජෙනටික් ලෙස සංරක්ෂණය කරන ලද ජාන අඩංගු නොවේ. අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මසල් වැනි දර්ශක විශේෂවලින් ලැබෙන ද්‍රව ජෛව පරීක්ෂණ මගින් සාමාන්‍යයෙන් වෙරළබඩ සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල වාසය කරන ධාරකයන්ට ආසාදනය කරන බව දන්නා ccfDNA වෛරස් කොටස් සාපේක්ෂව විශාල සංඛ්‍යාවක් හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි බවයි. මෙයට ප්‍රොටෝසෝවා, ආත්‍රපෝඩාවන්, කෘමීන්, ශාක සහ බැක්ටීරියා වෛරස් (උදා: බැක්ටීරියාභක්ෂක) ආසාදනය කරන බව දන්නා වෛරස් ඇතුළත් වේ. කර්ගුලන්හි එකම මුසල් ස්ථරයේ එකතු කරන ලද නිල් මසල් (M. ප්ලැටෙන්සිස්) හි හිමොලිම්ෆ් ccfDNA වයිරසය පරීක්ෂා කළ විට සමාන ව්‍යාප්තියක් සොයා ගන්නා ලදී (වගුව S2, අතිරේක තොරතුරු). ccfDNA හි ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය ඇත්ත වශයෙන්ම මිනිසුන්ගේ හෝ වෙනත් විශේෂවල වයිරෝමය අධ්‍යයනයේ දී ගම්‍යතාව ලබා ගන්නා නව ප්‍රවේශයකි [21, 37, 64]. ද්විත්ව කෙඳි සහිත DNA වෛරස් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා මෙම ප්‍රවේශය විශේෂයෙන් ප්‍රයෝජනවත් වේ, මන්ද බැල්ටිමෝර් හි වඩාත්ම විවිධාකාර සහ පුළුල් වෛරස් පන්තිය නියෝජනය කරන සියලුම ද්විත්ව කෙඳි සහිත DNA වෛරස් අතර තනි ජානයක් සංරක්ෂණය කර නොමැති බැවිනි [65]. මෙම වෛරස් බොහොමයක් වර්ගීකරණය කර නොමැති අතර වෛරස් ලෝකයේ සම්පූර්ණයෙන්ම නොදන්නා කොටසකින් වෛරස් ඇතුළත් විය හැකි වුවද [66], A. atra සහ M. platensis හි වයිරෝම සහ ධාරක පරාසයන් විශේෂ දෙක අතර වැටෙන බව අපට පෙනී ගියේය. ඒ හා සමානව (රූපය S3 බලන්න, අමතර තොරතුරු). මෙම සමානකම පුදුමයක් නොවේ, මන්ද එය පරිසරයේ පවතින DNA අවශෝෂණය කිරීමේ තේරීමේ ඌනතාවයක් පිළිබිඹු කළ හැකිය. RNA වයිරෝමය සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා පිරිසිදු RNA භාවිතා කරන අනාගත අධ්‍යයනයන් දැනට අවශ්‍ය වේ.
අපගේ අධ්‍යයනයේ දී, අපි කොවාර්ස්කි සහ සගයන්ගේ [37] කෘතිවලින් අනුවර්තනය කරන ලද ඉතා දැඩි නල මාර්ගයක් භාවිතා කළෙමු, ඔවුන් දේශීය ccfDNA එකලස් කිරීමට පෙර සහ පසු සංචිත කියවීම් සහ කොන්ටිග්ස් පියවර දෙකකින් මකා දැමීමක් භාවිතා කළ අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සිතියම්ගත නොකළ කියවීම් ඉහළ ප්‍රතිශතයක් ඇති විය. එමනිසා, මෙම සිතියම්ගත නොකළ කියවීම් සමහරක් තවමත් තමන්ගේම සම්භවයක් තිබිය හැකි බව අපට බැහැර කළ නොහැක, ප්‍රධාන වශයෙන් අපට මෙම මස්සල් විශේෂය සඳහා යොමු ජෙනෝමයක් නොමැති බැවිනි. ස්වයං සහ ස්වයං නොවන කියවීම් අතර චයිමේරා සහ ඉලුමිනා මයිසෙක් PE75 මගින් ජනනය කරන ලද කියවීමේ දිග ගැන අපි සැලකිලිමත් වූ නිසා අපි මෙම නල මාර්ගය ද භාවිතා කළෙමු. බොහෝ දුරට සලකුණු නොකළ කියවීම් සඳහා තවත් හේතුවක් වන්නේ සාගර ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්, විශේෂයෙන් කර්ගුලන් වැනි දුරස්ථ ප්‍රදේශවල, සටහන් කර නොමැති වීමයි. ccfDNA කොටස් දිග මිනිස් ccfDNA ට සමාන යැයි උපකල්පනය කරමින් අපි ඉලුමිනා මයිසෙක් PE75 භාවිතා කළෙමු. අනාගත අධ්‍යයනයන් සඳහා, හීමොලිම්ෆ් ccfDNA මිනිසුන්ට සහ/හෝ ක්ෂීරපායින්ට වඩා දිගු කියවීම් ඇති බව පෙන්වන අපගේ ප්‍රතිඵල අනුව, දිගු ccfDNA කොටස් සඳහා වඩාත් සුදුසු අනුක්‍රමික වේදිකාවක් භාවිතා කිරීම අපි නිර්දේශ කරමු. මෙම පරිචය ගැඹුරු විශ්ලේෂණය සඳහා තවත් ඇඟවීම් හඳුනා ගැනීම බෙහෙවින් පහසු කරනු ඇත. දැනට නොමැති සම්පූර්ණ A. atra න්‍යෂ්ටික ජෙනෝම අනුපිළිවෙල ලබා ගැනීම ස්වයං සහ ස්වයං නොවන ප්‍රභවයන්ගෙන් ccfDNA වෙනස් කොට සැලකීමට ද බෙහෙවින් පහසුකම් සපයයි. අපගේ පර්යේෂණය ද්‍රව ජෛව විද්‍යාත්මක සංකල්පය මට්ටි සඳහා යෙදීමේ හැකියාව කෙරෙහි අවධානය යොමු කර ඇති බැවින්, මෙම සංකල්පය අනාගත පර්යේෂණවලදී භාවිතා කරන බැවින්, මට්ටි වල ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා මෙම ක්‍රමයේ විභවය වැඩි කිරීම සඳහා නව මෙවලම් සහ නල මාර්ග සංවර්ධනය කරනු ඇතැයි අපි බලාපොරොත්තු වෙමු. සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිය.
ආක්‍රමණශීලී නොවන සායනික ජෛව මාර්කර් එකක් ලෙස, මිනිස් ප්ලාස්මාවේ ccfDNA මට්ටම් ඉහළ යාම විවිධ රෝග, පටක හානි සහ ආතති තත්වයන් සමඟ සම්බන්ධ වේ [67,68,69]. මෙම වැඩිවීම පටක හානිවලින් පසු තමන්ගේම සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් මුදා හැරීම සමඟ සම්බන්ධ වේ. අපි මෙම ගැටළුව ආමන්ත්‍රණය කළේ උග්‍ර තාප ආතතිය භාවිතා කරමිනි, එහිදී මට්ටි 30 °C උෂ්ණත්වයකට කෙටියෙන් නිරාවරණය විය. ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකදී විවිධ වර්ගයේ මට්ටි තුනක් පිළිබඳව අපි මෙම විශ්ලේෂණය සිදු කළෙමු. කෙසේ වෙතත්, උග්‍ර තාප ආතතියෙන් පසු ccfDNA මට්ටම්වල කිසිදු වෙනසක් අපට හමු නොවීය (රූපය S5, අමතර තොරතුරු බලන්න). මෙම සොයාගැනීම අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන් මට්ටිවලට අර්ධ-විවෘත සංසරණ පද්ධතියක් ඇති බවත් ඒවායේ ඉහළ පෙරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වය හේතුවෙන් විදේශීය DNA විශාල ප්‍රමාණයක් රැස් කරන බවත් පැහැදිලි කළ හැකිය. අනෙක් අතට, බොහෝ අපෘෂ්ඨවංශීන් මෙන් මට්ටි, ආතතියෙන් ඇතිවන පටක හානිවලට වඩා ප්‍රතිරෝධී විය හැකි අතර, එමඟින් ඔවුන්ගේ හීමොලිම්ප් හි ccfDNA මුදා හැරීම සීමා කරයි [70, 71].
අද වන විට, ජලජ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය පිළිබඳ DNA විශ්ලේෂණය ප්‍රධාන වශයෙන් අවධානය යොමු කර ඇත්තේ පාරිසරික DNA (eDNA) මෙටාබාර්කෝඩින් කෙරෙහි ය. කෙසේ වෙතත්, ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන විට ජෛව විවිධත්ව විශ්ලේෂණයේදී මෙම ක්‍රමය සාමාන්‍යයෙන් සීමිත වේ. ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය භාවිතා කිරීම PCR හි සීමාවන් සහ ප්‍රයිමර් කට්ටලවල පක්ෂග්‍රාහී තේරීම මඟ හරියි. මේ අනුව, එක් අර්ථයකින්, අපගේ ක්‍රමය මෑතකදී භාවිතා කරන ලද ඉහළ-ප්‍රතිදාන eDNA ෂොට්ගන් අනුක්‍රමික ක්‍රමයට සමීප වන අතර, එය කැබලි කරන ලද DNA සෘජුවම අනුක්‍රමණය කිරීමට සහ සියලුම ජීවීන් පාහේ විශ්ලේෂණය කිරීමට සමත් වේ [72, 73]. කෙසේ වෙතත්, LB සම්මත eDNA ක්‍රමවලින් වෙන්කර හඳුනා ගන්නා මූලික ගැටළු ගණනාවක් තිබේ. ඇත්ත වශයෙන්ම, eDNA සහ LB අතර ප්‍රධාන වෙනස වන්නේ ස්වාභාවික පෙරහන් ධාරක භාවිතයයි. eDNA අධ්‍යයනය සඳහා ස්වාභාවික පෙරහනක් ලෙස ස්පොන්ජ් සහ බිවල්ව් (Dresseina spp.) වැනි සාගර විශේෂ භාවිතා කිරීම වාර්තා වී ඇත [74, 75]. කෙසේ වෙතත්, ඩ්‍රීසේනාගේ අධ්‍යයනයේදී DNA නිස්සාරණය කරන ලද පටක ජෛව පරීක්ෂණ භාවිතා කරන ලදී. LB වලින් ccfDNA විශ්ලේෂණය සඳහා පටක ජෛව පරීක්ෂණ, විශේෂිත සහ සමහර විට මිල අධික උපකරණ සහ eDNA හෝ පටක ජෛව පරීක්ෂණ සමඟ සම්බන්ධ සැපයුම් අවශ්‍ය නොවේ. ඇත්ත වශයෙන්ම, දුරස්ථ ප්‍රදේශවල පර්යේෂණ සඳහා ප්‍රධාන අභියෝගයක් වන සීතල දාමයක් පවත්වා නොගෙන FTA සහාය ඇතිව LB වලින් ccfDNA ගබඩා කර විශ්ලේෂණය කළ හැකි බව අපි මෑතකදී වාර්තා කළෙමු [76]. ද්‍රව ජෛව පරීක්ෂණ වලින් ccfDNA නිස්සාරණය ද සරල වන අතර ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය සහ PCR විශ්ලේෂණය සඳහා උසස් තත්ත්වයේ DNA සපයයි. eDNA විශ්ලේෂණයට සම්බන්ධ සමහර තාක්ෂණික සීමාවන් සැලකිල්ලට ගෙන මෙය විශාල වාසියකි [77]. සාම්පල ලබා ගැනීමේ ක්‍රමයේ සරල බව සහ අඩු පිරිවැය දිගු කාලීන අධීක්ෂණ වැඩසටහන් සඳහා ද විශේෂයෙන් සුදුසු වේ. ඒවායේ ඉහළ පෙරහන් කිරීමේ හැකියාවට අමතරව, ද්වි කපාටවල තවත් ප්‍රසිද්ධ ලක්ෂණයක් වන්නේ වෛරස් අවශෝෂණය ප්‍රවර්ධනය කරන ඒවායේ ශ්ලේෂ්මලයේ රසායනික මුකොපොලිසැකරයිඩ සංයුතියයි [78, 79]. මෙය ද්වි කපාටයන් ලබා දී ඇති ජලජ පරිසර පද්ධතියක ජෛව විවිධත්වය සහ දේශගුණික විපර්යාසවල බලපෑම සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා කදිම ස්වාභාවික පෙරහනක් බවට පත් කරයි. ධාරකයෙන් ලබාගත් DNA කොටස් තිබීම eDNA හා සසඳන විට ක්‍රමයේ සීමාවක් ලෙස දැකිය හැකි වුවද, eDNA හා සසඳන විට එවැනි දේශීය ccfDNA එකක් තිබීම හා සම්බන්ධ පිරිවැය සෞඛ්‍ය අධ්‍යයනයන් සඳහා ලබා ගත හැකි අතිවිශාල තොරතුරු ප්‍රමාණයක් සඳහා එකවර තේරුම් ගත හැකිය. ඕෆ්සෙට් ධාරකය. මෙයට ධාරක ධාරකයේ ජෙනෝමය තුළට ඒකාබද්ධ කරන ලද වෛරස් අනුපිළිවෙලවල් තිබීම ඇතුළත් වේ. ද්වි කපාට වල තිරස් අතට සම්ප්‍රේෂණය වන ලියුකේමික් රෙට්‍රොවයිරස තිබීම නිසා මෙය මට්ටි සඳහා විශේෂයෙන් වැදගත් වේ [80, 81]. eDNA වලට වඩා LB හි තවත් වාසියක් නම්, එය ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් (සහ ඒවායේ ජෙනෝම) ගිල ගන්නා හිමොලිම්ප් හි රුධිර සෛල සංසරණය කිරීමේ ෆාගෝසයිටික් ක්‍රියාකාරිත්වය සූරාකෑමයි. ද්වි කපාට වල රුධිර සෛලවල ප්‍රධාන කාර්යය වන්නේ ෆාගෝසයිටෝසිස් ය [82]. අවසාන වශයෙන්, මෙම ක්‍රමය මට්ටි වල ඉහළ පෙරීමේ ධාරිතාවයෙන් (සාමාන්‍යයෙන් මුහුදු ජලය l/h 1.5) සහ දින දෙකක සංසරණයෙන් ප්‍රයෝජන ගන්නා අතර එමඟින් මුහුදු ජලයේ විවිධ ස්ථර මිශ්‍ර වීම වැඩි කරයි, විෂමජාතීය eDNA අල්ලා ගැනීමට ඉඩ සලසයි. [83, 84]. මේ අනුව, මස්සල් ccfDNA විශ්ලේෂණය යනු මට්ටි වල පෝෂණ, ආර්ථික සහ පාරිසරික බලපෑම් සැලකිල්ලට ගෙන සිත්ගන්නා මාර්ගයකි. මිනිසුන්ගෙන් එකතු කරන ලද LB විශ්ලේෂණයට සමානව, මෙම ක්‍රමය බාහිර ද්‍රව්‍යවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ධාරක DNA වල ජානමය සහ එපිජෙනටික් වෙනස්කම් මැනීමේ හැකියාව ද විවෘත කරයි. නිදසුනක් ලෙස, නැනෝපෝර අනුක්‍රමණය භාවිතයෙන් ස්වදේශීය ccfDNA හි ජෙනෝමය-පුළුල් මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණය සිදු කිරීම සඳහා තුන්වන පරම්පරාවේ අනුක්‍රමික තාක්ෂණයන් අපේක්ෂා කළ හැකිය. රසායනික පරිවර්තනයන් අවශ්‍යතාවයකින් තොරව තනි අනුක්‍රමික ධාවනයකින් ජෙනෝමය-පුළුල් DNA මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණයට ඉඩ සලසන දිගු-කියවන අනුක්‍රමික වේදිකා සමඟ මස්සල් ccfDNA කොටස්වල දිග ඉතා මැනවින් අනුකූල වන බැවින් මෙම ක්‍රියාවලිය පහසු කළ යුතුය. 85,86] මෙය සිත්ගන්නාසුලු හැකියාවක් වන අතර, DNA මෙතිලේෂන් රටා පාරිසරික ආතතියට ප්‍රතිචාරයක් පිළිබිඹු කරන බවත් පරම්පරා ගණනාවක් පුරා පවතින බවත් පෙන්වා දී ඇත. එබැවින්, දේශගුණික විපර්යාස හෝ දූෂකවලට නිරාවරණය වීමෙන් පසු ප්‍රතිචාරය පාලනය කරන යටින් පවතින යාන්ත්‍රණයන් පිළිබඳ වටිනා අවබෝධයක් ලබා දිය හැකිය [87]. කෙසේ වෙතත්, LB භාවිතය සීමාවන් නොමැතිව නොවේ. පරිසර පද්ධතියේ දර්ශක විශේෂ පැවතීම අවශ්‍ය බව පැවසීම අවශ්‍ය නොවේ. ඉහත සඳහන් කළ පරිදි, දී ඇති පරිසර පද්ධතියක ජෛව විවිධත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා LB භාවිතා කිරීම සඳහා ප්‍රභවයෙන් DNA කොටස් තිබීම සැලකිල්ලට ගන්නා දැඩි ජෛව තොරතුරු නල මාර්ගයක් ද අවශ්‍ය වේ. තවත් ප්‍රධාන ගැටළුවක් වන්නේ සමුද්‍ර විශේෂ සඳහා යොමු ජෙනෝම ලබා ගැනීමයි. සමුද්‍ර ක්ෂීරපායී ජෙනෝම ව්‍යාපෘතිය සහ මෑතකදී ස්ථාපිත කරන ලද Fish10k ව්‍යාපෘතිය [88] වැනි මුලපිරීම් අනාගතයේදී එවැනි විශ්ලේෂණයකට පහසුකම් සපයනු ඇතැයි අපේක්ෂා කෙරේ. සමුද්‍ර පෙරහන්-පෝෂණ ජීවීන් සඳහා LB සංකල්පය යෙදීම අනුක්‍රමික තාක්ෂණයේ නවතම දියුණුව සමඟ ද අනුකූල වන අතර, පාරිසරික ආතතියට ප්‍රතිචාර වශයෙන් සමුද්‍ර වාසස්ථානවල සෞඛ්‍යය පිළිබඳ වැදගත් තොරතුරු සැපයීම සඳහා බහු-ඕම් ජෛව සලකුණු සංවර්ධනය සඳහා එය හොඳින් ගැලපේ.
ජෙනෝම අනුක්‍රමික දත්ත NCBI අනුක්‍රමික කියවීමේ ලේඛනාගාරයේ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ජෛව ව්‍යාපෘති SRR8924808 යටතේ තැන්පත් කර ඇත.
බ්‍රයර්ලි ඒඑස්, කිංග්ස්ෆර්ඩ් එම්ජේ දේශගුණික විපර්යාස නිසා සාගර ජීවීන්ට සහ පරිසර පද්ධතිවලට ඇති වන බලපෑම. කෝල් ජීව විද්‍යාව. 2009; 19: පී 602–පී 614.
ගිසි ඊ, මැනියා ඊ, මැසාරිස් ඒඩී, ෆ්‍රාෂෙට්ටි එස්, ඇල්ම්පනිඩෝ වී, බෙවිලැක්වා එස්, සහ තවත් අය. දේශගුණික විපර්යාස සහ අනෙකුත් දේශීය ආතතීන් සමුද්‍ර පරිසරයට ඇති කරන ඒකාබද්ධ බලපෑම් සලකා බලන්න. සාමාන්‍ය විද්‍යාත්මක පරිසරය. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ) මාර්තු පළමුවැනිදා විද්‍යාව. 2020;7:48.
සෙරොන්ට් එල්, නිකාස්ට්‍රෝ සීආර්, සර්ඩි ජීඅයි, ගොබර්විල් ඊ. පුනරාවර්තන තාප පීඩන තත්වයන් යටතේ අඩු තාප ඉවසීම නිල් මට්ටි වල ගිම්හාන මරණ අනුපාතය ඉහළ යාමට හේතු වේ. විද්‍යාත්මක වාර්තාව 2019; 9:17498.
ෆෙයි එස්බී, සීපියෙල්ස්කි ඒඑම්, නුසල් එස්, සර්වන්ටෙස්-යෝෂිඩා කේ, හ්වාන් ජේඑල්, හියුබර් ඊආර්, ආදිය. සත්ව මරණවල සංඛ්‍යාතය, හේතු සහ ප්‍රමාණයෙහි මෑත කාලීන වෙනස්කම්. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. පින්න නොබිලිස්ගේ සමූහ මරණයට හේතු වී ඇත්තේ විශේෂ නොවන විශේෂිත රෝග කාරක කිහිපයක් විය හැක. ජීවිතය. 2020;10:238.
බ්‍රැඩ්ලි එම්, කෝට්ස් එස්ජේ, ජෙන්කින්ස් ඊ, ඔහාරා ටීඑම්. ආක්ටික් සත්ව විද්‍යාත්මක රෝග කෙරෙහි දේශගුණික විපර්යාසවල විභව බලපෑම. ඉන්ට් ජේ සර්කම්පෝලර් සෞඛ්‍යය. 2005; 64:468–77.
බෙයර් ජේ., ග්‍රීන් එන්ඩබ්ලිව්, බෲක්ස් එස්., ඇලන් අයිජේ, රූස් ඒ., ගෝමස් ටී. සහ තවත් අය. වෙරළබඩ දූෂණ නිරීක්ෂණයේ සංඥා ජීවීන් ලෙස නිල් මස්කෙල් (මයිටිලස් එඩුලිස් එස්පීපී): සමාලෝචනයක්. මාර්තු පරිසරය පිළිබඳ වාර්තා 2017; 130:338-65.
සිරවෙග්නා ජී, මාර්සෝනි එස්, සියෙනා එස්, බාර්ඩෙලි ඒ. පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා ද්‍රව ජෛව පරීක්ෂණ ඒකාබද්ධ කිරීම. නැට් රෙව් ක්ලීන් ඔන්කොල්. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. ද්‍රව ජෛව පරිණතභාවය: පිළිකා DNA සංසරණය වීමට ඉඩ සලසයි. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
මැන්ඩෙල් පී., මෙටෙයිස් පී. මිනිස් ප්ලාස්මාවේ න්‍යෂ්ටික අම්ල. සොක් බයෝල් අනුබද්ධිත ආයතනවල රැස්වීම් වාර්තා. 1948; 142:241-3.
බ්‍රොන්ක්හෝස්ට් ඒජේ, උන්ගෙරර් ඩබ්ලිව්, හෝල්ඩෙන්රීඩර් එස්. පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා අණුක සලකුණක් ලෙස සෛල-නිදහස් DNA සඳහා නව කාර්යභාරයක්. ජෛව මවුලික විශ්ලේෂණයේ ප්‍රමාණනය. 2019; 17: 100087.
ඉග්නේෂියාඩිස් එම්., ස්ලෙජ් ජීඩබ්ලිව්, ජෙෆ්රි එස්එස් ද්‍රව ජෛව පරීක්ෂණ සායනයට ඇතුළු වේ - ක්‍රියාත්මක කිරීමේ ගැටළු සහ අනාගත අභියෝග. නේට් රෙව් ක්ලින් ඔන්කොල්. 2021; 18:297–312.
ලෝ වයිඑම්, කෝබෙටා එන්., චේම්බර්ලයින් පීඑෆ්, රායි ඩබ්ලිව්., සාජන්ට් අයිඑල්, රෙඩ්මන් සීඩබ්ලිව් සහ තවත් අය. භ්‍රෑණ ඩීඑන්ඒ මාතෘ ප්ලාස්මා සහ සෙරුමය තුළ පවතී. ලැන්සෙට්. 1997; 350:485-7.
මුෆරේ එම්එන්, වොන්ග් ආර්ජේ, ෂෝ ජීඑම්, ස්ටීවන්සන් ඩීකේ, ක්වේක් එස්ආර් ගර්භණී සමයේදී කාන්තාවන්ගේ රුධිරයේ සංසරණය වන බාහිර සෛලීය ආර්එන්ඒ භාවිතා කරමින් ගර්භණීභාවයේ ගමන් මග සහ එහි සංකූලතා අධ්‍යයනය කිරීම. ඩොපීඩියාට්‍රික්ස්. 2020;8:605219.
ඔලෙරිච් එම්, ෂර්වුඩ් කේ, කියවුන් පී, ෂූට්ස් ඊ, බෙක් ජේ, ස්ටෙග්බවර් ජේ, සහ තවත් අය. ද්‍රව ජෛව පරීක්ෂණය: වකුගඩු බද්ධ කිරීමකදී ඇලෝජෙනික් තුවාල හඳුනා ගැනීම සඳහා දායක සෛල-නිදහස් DNA භාවිතා කරයි. නැට් රෙව් නෙෆ්‍රෝල්. 2021; 17:591–603.
ජුවාන් එෆ්සී, ලෝ වයිඑම් පූර්ව ප්‍රසව රෝග විනිශ්චය පිළිබඳ නවෝත්පාදන: මාතෘ ප්ලාස්මා ජෙනෝම අනුපිළිවෙල. ඇනා එම්ඩී. 2016; 67: 419-32.
ගු ඩබ්ලිව්, ඩෙන්ග් එක්ස්, ලී එම්, සුකු වයිඩී, අරේවාලෝ එස්, ස්ට්‍රයික් ඩී, ආදිය. ආසාදිත ශරීර තරලවල ඊළඟ පරම්පරාවේ මෙටාජෙනොමික් අනුපිළිවෙල සමඟ වේගවත් රෝග කාරක හඳුනාගැනීම. නැට් මෙඩිසින්. 2021;27:115-24.