د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). په عین حال کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه وړاندې کړو.
مایع بایوپسي (LB) یوه مفهوم ده چې په بایومیډیکل برخه کې په چټکۍ سره شهرت ترلاسه کوي. دا مفهوم په عمده توګه د حجروي DNA (ccfDNA) د دوراني ټوټو د کشف پر بنسټ والړ دی، کوم چې په عمده توګه په مختلفو نسجونو کې د حجرو له مړینې وروسته د کوچنیو ټوټو په توګه خوشې کیږي. د دې ټوټو یوه کوچنۍ برخه د بهرنیو (بهرني) نسجونو یا ژوندیو موجوداتو څخه سرچینه اخلي. په اوسني کار کې، موږ دا مفهوم په میوسلونو باندې پلي کړی، یو ساتونکی ډول چې د سمندري اوبو د لوړ فلټریشن ظرفیت لپاره پیژندل کیږي. موږ د میوسلونو وړتیا کاروو ترڅو د طبیعي فلټرونو په توګه عمل وکړي ترڅو د مختلفو سرچینو څخه د چاپیریال DNA ټوټې ونیسي ترڅو د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو د ژویو تنوع په اړه معلومات چمتو کړي. زموږ پایلې ښیې چې میوسل هیمولیمف د DNA ټوټې لري چې په اندازې کې خورا توپیر لري، له 1 څخه تر 5 kb پورې. د شاټګن ترتیب ښودلې چې د DNA ډیری ټوټې د بهرني مایکروبیل اصل څخه دي. د دوی په منځ کې، موږ د باکتریا، آرکیا او ویروسونو څخه د DNA ټوټې وموندلې، پشمول د ویروسونو چې د ساحلي سمندري ایکوسیستمونو کې موندل شوي مختلف کوربه اخته کوي. په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفهوم چې په میوو باندې پلي کیږي د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو کې د مایکروبیل تنوع په اړه د پوهې یوه بډایه مګر لا تر اوسه نه ده سپړل شوې سرچینه استازیتوب کوي.
د سمندري ایکوسیستمونو د ژویو تنوع باندې د اقلیم بدلون (CC) اغیز د څیړنې یوه ګړندۍ وده کونکې ساحه ده. نړیواله تودوخه نه یوازې د مهمو فزیولوژیکي فشارونو لامل کیږي، بلکې د سمندري ژوندیو موجوداتو د تودوخې ثبات ارتقايي حدود هم فشاروي، د یو شمیر ډولونو د استوګنې ځای اغیزمن کوي، دوی هڅوي چې د نورو مناسبو شرایطو لټون وکړي [1، 2]. د میټازوآنونو د ژویو تنوع اغیزمن کولو سربیره، CC د کوربه-مایکروبیل تعاملاتو نازک توازن ګډوډوي. دا مایکروبیل ډیسبیکټریوسیس د سمندري ایکوسیستمونو لپاره یو جدي ګواښ رامینځته کوي ځکه چې دا سمندري ژوندی موجودات د ساري ناروغیو لپاره ډیر حساس کوي [3، 4]. داسې انګیرل کیږي چې SS په ډله ایزو مړینو کې مهم رول لوبوي، کوم چې د نړیوال سمندري ایکوسیستمونو د مدیریت لپاره یوه جدي ستونزه ده [5، 6]. دا د ډیری سمندري ډولونو اقتصادي، ایکولوژیکي او تغذیې اغیزو ته په پام سره یوه مهمه مسله ده. دا په ځانګړي توګه د قطبي سیمو کې د ژوندیو دوه والو لپاره ریښتیا ده، چیرې چې د CK اغیزې ډیرې سمدستي او شدیدې دي [6، 7]. په حقیقت کې، دوه والو لکه میټیلس spp. په پراخه کچه د سمندري ایکوسیستمونو باندې د CC اغیزو څارلو لپاره کارول کیږي. د حیرانتیا خبره نده، د دوی روغتیا څارلو لپاره نسبتا لوی شمیر بایومارکرونه رامینځته شوي، ډیری وختونه د انزایمیک فعالیت یا حجروي دندو لکه د حجروي وړتیا او فاګوسیټیک فعالیت [8] پراساس د فعال بایومارکرونو سره د دوه پوړیز چلند څخه کار اخلي. پدې میتودونو کې د ځانګړو فشار شاخصونو غلظت اندازه کول هم شامل دي چې د سمندري اوبو د لوی مقدار جذبولو وروسته په نرم نسجونو کې راټولیږي. په هرصورت، د بایوالونو لوړ فلټریشن ظرفیت او نیم خلاص دوران سیسټم د مایع بایوپسي (LB) مفهوم په کارولو سره د نوي هیمولیمف بایومارکرونو رامینځته کولو فرصت چمتو کوي، د ناروغانو مدیریت لپاره یو ساده او لږترلږه برید کونکی چلند. د وینې نمونې [9، 10]. که څه هم د انسان LB کې د گردش مالیکولونو ډیری ډولونه موندل کیدی شي، دا مفهوم په عمده توګه په پلازما کې د خارجي حجروي DNA (ccfDNA) ټوټو د گردش کولو DNA ترتیب تحلیل پراساس دی. په حقیقت کې، د انسان په پلازما کې د دوراني DNA شتون د شلمې پیړۍ له نیمایي راهیسې پیژندل شوی [11]، مګر دا یوازې په وروستیو کلونو کې دی چې د لوړ-تروپټ ترتیب کولو میتودونو راتګ د ccfDNA پر بنسټ کلینیکي تشخیص ته لاره هواره کړې. د دې دوراني DNA ټوټو شتون د حجرو له مړینې وروسته د جینومیک DNA (هوا او مایټوکونډریال) غیر فعال خوشې کیدو له امله دی. په روغو اشخاصو کې، د ccfDNA غلظت معمولا ټیټ وي (<10 ng/mL) مګر په هغو ناروغانو کې چې د مختلفو رنځپوهنې سره مخ دي یا د فشار سره مخ دي، چې په پایله کې نسجونو ته زیان رسوي، 5-10 ځله زیات کیدی شي. په روغو اشخاصو کې، د ccfDNA غلظت معمولا ټیټ وي (<10 ng/mL) مګر په هغو ناروغانو کې چې د مختلفو رنځپوهنې سره مخ دي یا د فشار سره مخ دي، چې په پایله کې نسجونو ته زیان رسوي، 5-10 ځله زیات کیدی شي. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныйтойчнох подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. په روغو خلکو کې، د cccDNA غلظت معمولا ټیټ وي (<10 ng/mL)، مګر دا په هغو ناروغانو کې چې مختلف رنځپوهنې لري یا د فشار لاندې وي چې د نسجونو زیان لامل کیږي 5-10 ځله زیات کیدی شي.在健康个体中，ccfDNA د 浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂受受度通常较低）倍، 从而导致组织损伤.د ‏‎健康个体中，ccfdna 的浓度较低（（<10 ng/ml） 但 在各种病理或承受英叀或承受较中‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ增加 5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцизимостон патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. د ccfDNA غلظت معمولا په صحي اشخاصو کې ټیټ وي (<10 ng/ml)، مګر په هغو ناروغانو کې چې مختلف رنځپوهنې یا فشار لري 5-10 ځله زیات کیدی شي، چې په پایله کې نسجونو ته زیان رسوي.د ccfDNA ټوټو اندازه په پراخه کچه توپیر لري، مګر معمولا له 150 څخه تر 200 bp پورې وي. [12]. د ځان څخه اخیستل شوي ccfDNA تحلیل، یعنې د نورمال یا بدل شوي کوربه حجرو څخه ccfDNA، د اټومي او/یا مایټوکونډریال جینوم کې موجود جینیاتي او ایپی جینیټیک بدلونونو کشف کولو لپاره کارول کیدی شي، پدې توګه کلینیکانو سره د ځانګړي مالیکولر هدف لرونکي درملنې غوره کولو کې مرسته کوي [13]. په هرصورت، ccfDNA د امیندوارۍ پرمهال د جنین حجرو څخه یا د لیږد شوي ارګانونو څخه د بهرنیو سرچینو لکه ccfDNA څخه ترلاسه کیدی شي [14,15,16,17]. ccfDNA د انتاني اجنټ (بهرني) د نیوکلیک اسیدونو شتون کشف کولو لپاره د معلوماتو یوه مهمه سرچینه هم ده، کوم چې د وینې کلتورونو لخوا نه پیژندل شوي پراخه انتاناتو غیر انتفاعي کشف ته اجازه ورکوي، د اخته شوي نسج د برید کونکي بایپسي څخه مخنیوی کوي [18]. وروستیو مطالعاتو په حقیقت کې ښودلې چې د انسان وینه د معلوماتو بډایه سرچینه لري چې د ویروس او باکتریا رنځجنونو پیژندلو لپاره کارول کیدی شي، او دا چې د انسان پلازما کې موندل شوي شاوخوا 1٪ ccfDNA د بهرني اصل څخه دی [19]. دا مطالعات ښیي چې د یو ژوندی موجود د دوران مایکروبیوم حیاتي تنوع د ccfDNA تحلیل په کارولو سره ارزول کیدی شي. په هرصورت، تر دې وروستیو پورې، دا مفهوم په ځانګړي ډول په انسانانو کې او تر یوې اندازې پورې، په نورو فقاریه حیواناتو کې کارول کیده [20، 21].
په دې مقاله کې، موږ د LB پوټینشیل څخه کار اخلو ترڅو د Aulacomya atra د ccfDNA تحلیل وکړو، یو سویلي ډول چې معمولا په فرعي انټارکټیک کیرګولین ټاپوګانو کې موندل کیږي، د ټاپوګانو یوه ډله چې د لوی پلیټو په سر کې ده چې 35 ملیون کاله دمخه رامینځته شوې. د اورشیندی چاودنه. د ان ویټرو تجربوي سیسټم په کارولو سره، موږ وموندله چې د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټې په چټکۍ سره د میوسلونو لخوا اخیستل کیږي او د هیمولیمف برخې ته ننوځي. د شاټګن ترتیب ښودلې چې میوسل هیمولیمف ccfDNA د خپل او غیر ځان اصلي DNA ټوټې لري، پشمول د سمبیوټیک باکتریا او د سړې آتش فشاني سمندري ساحلي ایکوسیستمونو د بایومونو څخه د DNA ټوټې. هیمولیمف ccfDNA د مختلفو کوربه رینجونو سره د ویروسونو څخه اخیستل شوي ویروسي ترتیبونه هم لري. موږ د څو حجروي حیواناتو لکه هډوکي کب، سمندري انیمونونه، الګا او حشراتو څخه د DNA ټوټې هم وموندلې. په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفهوم په بریالیتوب سره د سمندري غیر فقاري حیواناتو لپاره پلي کیدی شي ترڅو په سمندري ایکوسیستمونو کې د بډایه جینومیک ذخیره تولید کړي.
لویان (۵۵-۷۰ ملي متره اوږد) میټیلس پلاټینسیس (ایم. پلاټینسیس) او اولاکومیا اټرا (اې. اټرا) د پورټ-او-فرانس د سمندري ډبرینو څنډو څخه راټول شوي وو (۰۴۹°۲۱.۲۳۵ سویل، ۰۷۰°۱۳.۴۹۰ ختیځ.). د کرګولین ټاپوګان د ۲۰۱۸ کال په دسمبر کې. نور بالغ نیلي اټرا (میټیلس سپپ.) د سوداګریز عرضه کوونکي (PEI Mussel King Inc.، Prince Edward Island، کاناډا) څخه ترلاسه شوي او د تودوخې کنټرول شوي (۴°C) هوا لرونکي ټانک کې ځای پر ځای شوي وو چې ۱۰-۲۰ لیتره ۳۲‰ مصنوعي مالګه لري. (مصنوعي سمندري مالګه ریف کرسټال، فوري سمندر، ورجینیا، امریکا). د هرې تجربې لپاره، د انفرادي شیلونو اوږدوالی او وزن اندازه شوی و.
د دې پروګرام لپاره د خلاص لاسرسي وړیا پروتوکول آنلاین شتون لري (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). په لنډه توګه، د LB هیمولیمف د تښتونکي عضلاتو څخه راټول شو لکه څنګه چې تشریح شوی [22]. هیمولیمف د 3 دقیقو لپاره د 1200 × g په سینټرفیوګیشن سره روښانه شو، سوپرنټینټ د کارولو پورې (-20 ° C) کنګل شو. د cfDNA د جلا کولو او پاکولو لپاره، نمونې (1.5-2.0 ml) د جوړونکي لارښوونو سره سم د NucleoSnap cfDNA کټ (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) په کارولو سره غوړ شوي او پروسس شوي. ccfDNA د نورو تحلیلونو پورې -80 ° C کې زیرمه شوی و. په ځینو تجربو کې، ccfDNA د QIAamp DNA څیړونکي کټ (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) په کارولو سره جلا او پاک شوی و. پاک شوی DNA د معیاري پیکو ګرین ازموینې په کارولو سره اندازه شوی و. د جلا شوي ccfDNA ټوټې ویش د کیپیلري الیکټروفوریسس لخوا د Agilent 2100 بایو انالیزر (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) په کارولو سره د لوړ حساسیت DNA کټ په کارولو سره تحلیل شو. دا ارزونه د جوړونکي لارښوونو سره سم د ccfDNA نمونې 1 µl په کارولو سره ترسره شوه.
د هیمولیمف ccfDNA ټوټو د ترتیب لپاره، جینوم کیوبیک (مونټریال، کیوبیک، کاناډا) د ایلومینا MiSeq PE75 کټ د ایلومینا DNA مکس کټ په کارولو سره د شاټګن کتابتونونه چمتو کړل. یو معیاري اډاپټر (BioO) کارول شوی و. د خامو معلوماتو فایلونه د NCBI سیکوینس ریډ آرشیف (SRR8924808 او SRR8924809) څخه شتون لري. د FastQC [23] په کارولو سره د لوستلو اساسي کیفیت ارزول شوی و. ټریموماتیک [24] د اډاپټرونو د کلپ کولو او د خراب کیفیت لوستلو لپاره کارول شوی. د شاټګن لوستل د جوړه شوي پایونو سره FLASH د 20 bp لږترلږه اوورلیپ سره اوږد واحد لوستلو کې یوځای شوي ترڅو د بې اتفاقۍ مخه ونیسي [25]. یوځای شوي لوستل د BLASTN سره د دوه اړخیز NCBI ټیکسونامي ډیټابیس (e ارزښت < 1e−3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي، او د ټیټ پیچلتیا ترتیبونو ماسک کول د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوي. یوځای شوي لوستل د BLASTN سره د دوه اړخیز NCBI ټیکسونامي ډیټابیس (e ارزښت < 1e−3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي، او د ټیټ پیچلتیا ترتیبونو ماسک کول د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوي. د Объединенные чтения были аннотированы 1e-3 и 90% гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. د NCBI بایوال ټیکسونامي ډیټابیس (e ارزښت < 1e-3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره د BLASTN سره د پول شوي لوستلو تشریح شوې، او د DUST [26] په کارولو سره د ټیټ پیچلتیا ترتیب ماسکینګ ترسره شو.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买, [ST用释合并的读买]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湔 2 [دوست 幔幰]进行 复杂度 序列 的. . . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчавлючать были (значение e <1e-3 и 90% гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности с использовательности. د NCBI بایوال ټیکسونومیک ډیټابیس (e ارزښت <1e-3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره د BLASTN سره د پول شوي لوستلو تشریح شوې، او د DUST [26] په کارولو سره د ټیټ پیچلتیا ترتیب ماسکینګ ترسره شو.لوستل په دوو ډلو ویشل شوي وو: د دوه اړخیزو ترتیبونو پورې اړوند (دلته د ځان لوستل ویل کیږي) او غیر اړونده (غیر ځان لوستل). دوه ډلې په جلا توګه د MEGAHIT په کارولو سره راټولې شوې ترڅو کانټیګونه رامینځته کړي [27]. په ورته وخت کې، د اجنبی مایکروبیوم لوستلو ټیکسونومیک ویش د Kraken2 [28] په کارولو سره طبقه بندي شو او په ګرافیکي ډول د Galaxy [29، 30] کې د کرونا پای چارټ لخوا ښودل شوی و. زموږ د لومړنیو تجربو څخه غوره کیلومتره د kmers-59 ټاکل شوي وو. بیا د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (د دوه اړخیز NCBI ډیټابیس، e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) سره د سمون له لارې ځان تړلي پیژندل شوي. بیا د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (د دوه اړخیز NCBI ډیټابیس، e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) سره د سمون له لارې ځان تړلي پیژندل شوي. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых , e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. بیا د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (NCBI بایوال ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره د مطابقت له لارې ځان-کنټیګونه وپیژندل شول.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% د ‏‎Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). بیا د BLASTN (NCBI بایوال ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره د مطابقت له لارې د وروستي تشریح لپاره ځان-کنټیګونه وپیژندل شول. په موازي ډول، د غیر ځان ګروپ کانټیګونه د BLASTN (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) سره تشریح شوي. په موازي ډول، د غیر ځان ګروپ کانټیګونه د BLASTN (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) سره تشریح شوي. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، значение e <1e-10%06могоим). په موازي ډول، د بهرنیو ګروپونو ترمنځ اړیکې د BLASTN (NT NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره تشریح شوي.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, جغرافیه 60٪). په موازي ډول، د غیر ځان ګروپ کنټیګونه د BLASTN (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره تشریح شوي. BLASTX د nr او RefSeq پروټین NCBI ډیټابیسونو (e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان تړلو ځایونو کې هم ترسره شو. BLASTX د nr او RefSeq پروټین NCBI ډیټابیسونو (e ارزښت < 1e−10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان تړلو ځایونو کې هم ترسره شو. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). BLASTX د nr او RefSeq NCBI پروټین ډیټابیسونو (e ارزښت < 1e-10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان تړلو ځایونو کې هم ترسره شو.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). BLASTX د nr او RefSeq NCBI پروټین ډیټابیسونو (e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان تړلو ځایونو کې هم ترسره شو.د غیر ځان-کنټیګونو BLASTN او BLASTX حوضونه وروستي کنټیګونه استازیتوب کوي (ضمیمه فایل وګورئ).
د PCR لپاره کارول شوي پرائمرونه په جدول S1 کې لیست شوي دي. د ټاک DNA پولیمیریز (بایو بیسیک کاناډا، مارخم، ON) د ccfDNA هدف جینونو د لوړولو لپاره کارول شوی و. لاندې د عکس العمل شرایط کارول شوي: د 3 دقیقو لپاره په 95 ° C کې ډینیټوریشن، د 1 دقیقې لپاره 95 ° C، د 1 دقیقې لپاره د انیلینګ تودوخه د 1 دقیقې لپاره تنظیم کړئ، د 72 ° C کې د 1 دقیقې لپاره اوږدوالی، 35 دورې، او په پای کې د 10 دقیقو دننه 72 ° C. . د PCR محصولات د الیکټروفوریسس لخوا په اګاروز جیلونو (1.5٪) کې جلا شوي چې SYBRTM خوندي DNA جیل سټین (انویټروجن، برلینګټن، ON، کاناډا) په 95 V کې لري.
د اوبو د څښلو لپاره د اوبو د څښلو لپاره (Mytilus spp.) د 500 ملی لیتر اکسیجن لرونکي سمندري اوبو (32 PSU) کې د 24 ساعتونو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې تطبیق شوي وو. د پلازمیډ DNA چې د انسان ګالیکټین-7 cDNA ترتیب (NCBI د لاسرسي شمیره L07769) کوډ کولو داخل لري د 190 μg/μl په وروستي غلظت کې په شیشي کې اضافه شو. د DNA اضافه کولو پرته د ورته شرایطو لاندې انکیوب شوي غوړ کنټرول وو. دریم کنټرول ټانک کې د غوړ پرته DNA شتون درلود. د سمندري اوبو کې د DNA کیفیت څارلو لپاره، د سمندري اوبو نمونې (20 μl؛ درې تکرارونه) په ټاکل شوي وخت کې له هر ټانک څخه اخیستل شوي. د پلازمیډ DNA تعقیب لپاره، د LB غوړ په ټاکل شوي وختونو کې راټول شوي او د qPCR او ddPCR لخوا تحلیل شوي. د سمندري اوبو د مالګې د لوړې کچې له امله، د ټولو PCR ازموینو دمخه د PCR کیفیت لرونکي اوبو (1:10) کې الیکوټونه حل شوي وو.
ډیجیټل څاڅکي PCR (ddPCR) د BioRad QX200 پروتوکول (میسیساګا، اونټاریو، کاناډا) په کارولو سره ترسره شو. د مطلوب تودوخې ټاکلو لپاره د تودوخې پروفایل وکاروئ (جدول S1). څاڅکي د QX200 څاڅکي جنراتور (BioRad) په کارولو سره تولید شوي. ddPCR په لاندې ډول ترسره شو: د 5 دقیقو لپاره 95 ° C، د 30 ثانیو لپاره د 95 ° C 50 دورې او د 1 دقیقو لپاره ورکړل شوی انیلینګ تودوخه او د 30 ثانیو لپاره 72 ° C، د 5 دقیقو لپاره 4 ° C او د 5 دقیقو دننه 90 ° C. د څاڅکو شمیر او مثبت عکس العملونه (د کاپيونو شمیر / µl) د QX200 څاڅکي لوستونکي (BioRad) په کارولو سره اندازه شوي. هغه نمونې چې له 10,000 څخه کم څاڅکي لري رد شوې. د نمونې کنټرول هرکله چې ddPCR چلول شوی و نه ترسره شو.
qPCR د روټر-جین® 3000 (کاربټ ریسرچ، سیډني، آسټرالیا) او LGALS7 ځانګړي پرائمرونو په کارولو سره ترسره شو. ټول مقداري PCRs د QuantiFast SYBR شنه PCR کټ (QIAGEN) په کارولو سره په 20 µl کې ترسره شول. qPCR د 95 درجو سانتي ګراد په 15 دقیقو کې د انکیوبیشن سره پیل شو، وروسته د 10 ثانیو لپاره په 95 درجو سانتي ګراد کې 40 دورې او د 60 درجو سانتي ګراد په 60 ثانیو کې د یوې معلوماتو راټولولو سره. د ویلې کولو منحني د 5 ثانیو لپاره په 95 درجو سانتي ګراد، د 60 ثانیو لپاره په 65 درجو سانتي ګراد، او د qPCR په پای کې په 97 درجو سانتي ګراد کې د پرله پسې اندازه کولو په کارولو سره رامینځته شوي. هر qPCR په درې ګوني ډول ترسره شو، پرته له کنټرول نمونو څخه.
څرنګه چې د غڼې غوښې د خپل لوړ فلټریشن نرخ لپاره پیژندل کیږي، موږ لومړی څیړنه وکړه چې ایا دوی کولی شي د سمندر په اوبو کې موجود د DNA ټوټې فلټر او وساتي. موږ دا هم لیوالتیا درلوده چې ایا دا ټوټې په خپل نیمه خلاص لیمفاټیک سیسټم کې راټولیږي. موږ دا مسله په تجربوي ډول د نیلي غڼې ټانکونو کې اضافه شوي د حل شوي DNA ټوټو برخلیک تعقیبولو سره حل کړه. د DNA ټوټو تعقیب اسانه کولو لپاره، موږ بهرني (نه ځان) پلازمیډ DNA کارولی چې د انسان ګالیکټین-7 جین لري. ddPCR د سمندر په اوبو او غڼې کې د پلازمیډ DNA ټوټې تعقیبوي. زموږ پایلې ښیې چې که چیرې د غڼې په نشتوالي کې د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټو مقدار د وخت په تیریدو سره (تر 7 ورځو پورې) نسبتا ثابت پاتې شي، نو د غڼې په شتون کې دا کچه تقریبا په بشپړ ډول د 8 ساعتونو دننه ورکه شوه (انځور 1a، b). د خارجي DNA ټوټې په اسانۍ سره د 15 دقیقو دننه د انټروالولر مایع او هیمولیمف کې کشف شوې (انځور 1c). دا ټوټې لاهم د افشا کیدو وروسته تر 4 ساعتونو پورې کشف کیدی شي. د DNA ټوټو په اړه د فلټر کولو دا فعالیت د باکتریا او الګیو د فلټر کولو فعالیت سره پرتله کیدونکی دی [31]. دا پایلې وړاندیز کوي چې mussels کولی شي په خپلو مایع برخو کې بهرني DNA فلټر او راټول کړي.
د سمندري اوبو کې د پلازمید DNA نسبي غلظت د (A) یا (B) په شتون کې د میوسلونو د ddPCR لخوا اندازه کیږي. په A کې، پایلې د فیصدو په توګه څرګندیږي، د بکسونو سرحدونه د 75 او 25 فیصدو استازیتوب کوي. فټ شوی لوګاریتمیک منحنی په سور رنګ کې ښودل شوی، او ساحه په خړ رنګ کې سیوري شوې د 95٪ باور وقفه استازیتوب کوي. په B کې، سره کرښه د اوسط استازیتوب کوي او نیلي کرښه د غلظت لپاره د 95٪ باور وقفه استازیتوب کوي. C د پلازمید DNA اضافه کولو وروسته په مختلفو وختونو کې د میوسلونو په هیمولیمف او والوولر مایع کې د پلازمید DNA راټولول. پایلې د مطلق کاپي کشف شوي/mL (±SE) په توګه وړاندې کیږي.
بیا، موږ د کیرګولین ټاپوګانو کې د میوسل بسترونو څخه راټول شوي میوسل کې د ccfDNA اصلیت وڅیړ، د ټاپوګانو یوه لرې پرتې ډله چې محدود انتروپجنیک نفوذ لري. د دې هدف لپاره، د میوسل هیمولیمفونو څخه cccDNA جلا او پاک شو د هغو میتودونو له لارې چې معمولا د انسانانو cccDNA پاکولو لپاره کارول کیږي [32، 33]. موږ وموندله چې په میوسل کې د هیمولیمف ccfDNA اوسط غلظت په هر ملی لیتر هیمولیمف حد کې دی (جدول S2، ضمیمه معلومات وګورئ). د غلظت دا حد د صحي خلکو په پرتله خورا لوی دی (په هر ملی لیتر کې ټیټ نانوګرام)، مګر په نادره مواردو کې، د سرطان ناروغانو کې، د ccfDNA کچه کولی شي په هر ملی لیتر کې څو مایکروګرامونو ته ورسیږي [34، 35]. د هیمولیمف ccfDNA د اندازې ویش تحلیل ښودلې چې دا ټوټې په اندازې کې خورا توپیر لري، له 1000 bp څخه تر 1000 bp پورې. تر 5000 bp پورې (انځور 2). ورته پایلې د سیلیکا پر بنسټ د QIAamp تفتیش کونکي کټ په کارولو سره ترلاسه شوې، یوه طریقه چې معمولا په عدلي ساینس کې کارول کیږي ترڅو د ټیټ غلظت DNA نمونو څخه جینومیک DNA په چټکۍ سره جلا او پاک کړي، په شمول د ccfDNA [36].
د عضلاتو د هیمولیمف د ccfDNA الیکټروفوریګرام استازی. د نیوکلیو سنپ پلازما کټ (پورته) او QIAamp DNA څیړونکي کټ سره استخراج شوی. د وایلن پلاټ چې په عضلاتو کې د هیمولیمف ccfDNA غلظت (±SE) ویش ښیې. تورې او سره کرښې په ترتیب سره د میډین او لومړۍ او دریمې ربعې استازیتوب کوي.
په انسانانو او پریمیټ کې د ccfDNA نږدې 1٪ بهرنۍ سرچینه لري [21، 37]. د بایوالونو نیمه خلاص دوران سیسټم، د مایکروبیل بډایه سمندري اوبو، او د میوسل ccfDNA د اندازې ویش ته په پام سره، موږ فرض کړه چې میوسل هیمولیمف ccfDNA ممکن د مایکروبیل DNA بډایه او متنوع حوض ولري. د دې فرضیې د ازموینې لپاره، موږ د کیرګلین ټاپوګانو څخه راټول شوي د اولاکومیا اټرا نمونو څخه هیمولیمف ccfDNA ترتیب کړ، چې له 10 ملیون څخه ډیر لوستل یې ترلاسه کړل، چې 97.6٪ یې د کیفیت کنټرول څخه تیر شو. بیا لوستل د BLASTN او NCBI بایوال ډیټابیسونو په کارولو سره د ځان او غیر ځان سرچینو سره سم طبقه بندي شوي (انځور S1، اضافي معلومات).
په انسانانو کې، دواړه اټومي او مایټوکونډریال DNA د وینې جریان ته خوشې کیدی شي [38]. په هرصورت، په دې څیړنه کې، د میوسلز اټومي جینومیک DNA په تفصیل سره تشریح کول ممکن نه وو، ځکه چې د A. atra جینوم ترتیب یا تشریح شوی نه دی. په هرصورت، موږ وکولی شو د بایوال کتابتون په کارولو سره زموږ د خپل اصلي ccfDNA ډیری ټوټې وپیژنو (انځور S2، اضافي معلومات). موږ د هغو A. atra جینونو د لارښود PCR امپلیفیکیشن له لارې چې ترتیب شوي وو (انځور 3) د خپل اصلي DNA ټوټو شتون هم تایید کړ. په ورته ډول، د دې په پام کې نیولو سره چې د A. atra مایټوکونډریال جینوم په عامه ډیټابیسونو کې شتون لري، یو څوک کولی شي د A. atra په هیمولیمف کې د مایټوکونډریال ccfDNA ټوټو شتون لپاره شواهد ومومي. د مایټوکونډریال DNA ټوټو شتون د PCR امپلیفیکیشن لخوا تایید شو (انځور 3).
د A. atra (سور نقطې - د سټاک شمیره: SRX5705969) او M. platensis (نیلي نقطې - د سټاک شمیره: SRX5705968) په هیمولیمف کې مختلف مایټوکونډریال جینونه شتون درلود چې د PCR لخوا تقویه شوي. انځور د بریټن او نورو، 2011 B څخه تطبیق شوی د A. atra څخه د هیمولیمف سوپرنټینټ تقویه کول د FTA کاغذ کې زیرمه شوي. د PCR مخلوط لرونکي PCR ټیوب ته مستقیم اضافه کولو لپاره د 3 ملي میتر پنچ وکاروئ.
په سمندري اوبو کې د مایکروبیل موادو د پراخوالي په پام کې نیولو سره، موږ په پیل کې د هیمولیمف کې د مایکروبیل DNA ترتیبونو ځانګړتیا باندې تمرکز وکړ. د دې کولو لپاره، موږ دوه مختلف ستراتیژیانې کاروو. لومړۍ ستراتیژۍ کې Kraken2 کارول شوی، د الګوریتم پر بنسټ د ترتیب طبقه بندي پروګرام چې کولی شي د مایکروبیل ترتیبونه د BLAST او نورو وسیلو سره پرتله کولو وړ دقت سره وپیژني [28]. له 6719 څخه ډیر لوستل د باکتریا اصلي کیدو لپاره ټاکل شوي، پداسې حال کې چې 124 او 64 په ترتیب سره د آرکیا او ویروسونو څخه وو (انځور 4). د باکتریا DNA ترټولو بډایه ټوټې Firmicutes (46٪)، Proteobacteria (27٪)، او Bacteroidetes (17٪) (انځور 4a) وې. دا ویش د سمندري نیلي میوسل مایکروبیوم [39، 40] د پخوانیو مطالعاتو سره مطابقت لري. ګاما پروټوباکټریا د پروټیوباکټیریا (44٪) اصلي ټولګی و، پشمول د ډیری Vibrionales (انځور 4b). د ddPCR میتود د A. atra hemolymph (انځور 4c) [41] په ccfDNA کې د Vibrio DNA ټوټو شتون تایید کړ. د ccfDNA د باکتریا اصليت په اړه د نورو معلوماتو ترلاسه کولو لپاره، یو اضافي چلند غوره شو (انځور S2، اضافي معلومات). په دې حالت کې، هغه لوستل چې سره یوځای شوي وو د جوړې-پای لوستلو په توګه راټول شوي وو او د BLASTN او د 1e−3 د e ارزښت او د 90٪ څخه ډیر هومولوژي سره د کټ آف په کارولو سره د ځان (دوه اړخیزو) یا غیر ځان اصلي په توګه طبقه بندي شوي وو. په دې حالت کې، هغه لوستل چې سره یوځای شوي وو د جوړې-پای لوستلو په توګه راټول شوي وو او د BLASTN او د 1e−3 د e ارزښت او د 90٪ څخه ډیر هومولوژي سره د کټ آف په کارولو سره د ځان (دوه اړخیزو) یا غیر ځان اصلي په توګه طبقه بندي شوي وو. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90٪. په دې حالت کې، متقابل لوستل د جوړه شوي پای لوستلو په توګه راټول شوي او د BLASTN او e ارزښت 1e-3 او کټ آف په کارولو سره د 90٪ څخه ډیر هومولوژي سره د اصلي (بایوالو) یا غیر اصلي په توګه طبقه بندي شوي.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用 的使用使用 blastn和和1> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身.. . . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы чтения моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90٪. په دې حالت کې، متقابل لوستل د جوړه شوي پای لوستلو په توګه راټول شوي او د e BLASTN او 1e-3 ارزښتونو او د هومولوژي حد > 90٪ په کارولو سره د خپل (دوه اړخیزو) یا غیر اصلي په توګه طبقه بندي شوي.څرنګه چې د A. atra جینوم لا تر اوسه ترتیب شوی نه دی، موږ د MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) اسمبلر د de novo اسمبلۍ ستراتیژي کارولې. ټولټال 147,188 کانټیګونه د اصلي انحصار (بایوالیو) په توګه پیژندل شوي دي. دا کانټیګونه بیا د BLASTN او BLASTX په کارولو سره د 1e-10 د e-ارزښتونو سره چاودیدلي. دې ستراتیژۍ موږ ته اجازه راکړه چې په A. atra ccfDNA کې موجود 482 غیر بایوالیو ټوټې وپیژنو. د دې DNA ټوټې نیمایي څخه ډیر (57٪) د باکتریا څخه ترلاسه شوي، په عمده توګه د ګیل سمبیونټونو څخه، په شمول د سلفوټروفیک سمبیونټونو، او د ګیل سمبیونټونو Solemya velum (انځور 5) څخه.
د ډول په کچه نسبي کثرت. B د دوه اصلي فایلا (فرمیکیوټس او پروټیوباکټیریا) مایکروبیل تنوع. د ddPCR C وایبریو spp استازیتوب پراخول. A. د 16S rRNA جین (نیلي) ټوټې په دریو اټرا هیمولیمفونو کې.
ټولټال ۴۸۲ راټول شوي کانټیګونه تحلیل شول. د میټاجینومیک کانټیګ تشریحاتو (پروکاریوټس او یوکاریوټس) د ټیکسونومیک ویش عمومي پروفایل. B د باکتریا د DNA ټوټو تفصيلي ویش چې د BLASTN او BLASTX لخوا پیژندل شوي.
د کریکن ۲ تحلیل دا هم وښودله چې د میوسل ccfDNA کې د لرغوني DNA ټوټې شاملې وې، په شمول د یوریارچایوټا (65٪)، کرینارچایوټا (24٪)، او تورمارچایوټا (11٪) د DNA ټوټې (انځور 6a). د یوریارچایوټا او کرینارچایوټا څخه اخیستل شوي د DNA ټوټو شتون، چې پخوا د کالیفورنیا میوسلونو په مایکروبیل ټولنه کې موندل شوي وو، باید د حیرانتیا خبره نه وي [42]. که څه هم یوریارچایوټا ډیری وختونه د سختو شرایطو سره تړاو لري، اوس دا پیژندل شوي چې یوریارچایوټا او کرینارچایوټا دواړه د سمندري کریوجینک چاپیریال کې ترټولو عام پروکاریوټونو څخه دي [43، 44]. په میوسلونو کې د میتانجینک مایکرو ارګانیزمونو شتون د حیرانتیا خبره نده، د کیرګولین پلیټیو [45] کې د لاندې لیکونو څخه د پراخه میتان لیکونو او د کیرګولین ټاپوګانو د ساحل څخه د احتمالي مایکروبیل میتان تولید په اړه وروستي راپورونو ته په پام سره [46].
زموږ پام بیا د DNA ویروسونو لوستلو ته واړاوه. زموږ د پوهې تر ټولو غوره، دا د میوسلونو د ویروس مینځپانګې لومړۍ غیر هدف مطالعه ده. لکه څنګه چې تمه کیده، موږ د باکتریوفیجونو (کاډوویرالز) د DNA ټوټې وموندلې (انځور 6b). په هرصورت، ترټولو عام ویروس DNA د نیوکلیوسایټو ویروسونو له یوې فایلم څخه راځي، چې د اټومي سایټوپلازمیک لوی DNA ویروس (NCLDV) په نوم هم پیژندل کیږي، کوم چې د هر ویروس ترټولو لوی جینوم لري. پدې فایلم کې، د DNA ډیری ترتیبونه د Mimimidoviridae (58٪) او Poxviridae (21٪) کورنۍ پورې اړه لري، چې طبیعي کوربه یې د فقاریه او ارتروپډونو په شمول دي، پداسې حال کې چې د دې DNA ترتیبونو یوه کوچنۍ برخه د پیژندل شوي ویروس الګی پورې اړه لري. سمندري یوکریوټیک الګی اخته کوي. دا ترتیبونه د پانډورا ویروس څخه هم ترلاسه شوي، د لوی ویروس چې د هر پیژندل شوي ویروس نسل ترټولو لوی جینوم اندازه لري. په زړه پورې خبره دا ده چې د ویروس سره د اخته کیدو لپاره پیژندل شوي کوربه لړۍ، لکه څنګه چې د هیمولیمف ccfDNA ترتیب لخوا ټاکل کیږي، نسبتا لویه وه (شکل S3، اضافي معلومات). پدې کې هغه ویروسونه شامل دي چې حشرات لکه باکولوویریډی او ایریدوویریډی اخته کوي، او همدارنګه هغه ویروسونه چې امیبا، الجي او فقاریه حیوانات اخته کوي. موږ د پیتوویرس سایبریکم جینوم سره سمون لرونکي ترتیبونه هم وموندل. پیټوویرسونه (چې د "زومبي ویروسونو" په نوم هم پیژندل کیږي) لومړی په سایبریا کې د 30,000 کلن پرمافروسټ څخه جلا شوي وو [47]. په دې توګه، زموږ پایلې د پخوانیو راپورونو سره مطابقت لري چې ښیې چې د دې ویروسونو ټول عصري ډولونه له منځه تللي ندي [48] او دا ویروسونه ممکن په لرې پرتو فرعي آرکټیک سمندري ایکوسیستمونو کې شتون ولري.
په پای کې، موږ ازموینه وکړه ترڅو وګورو چې ایا موږ کولی شو د نورو څو حجروي څارویو څخه د DNA ټوټې ومومو. د BLASTN او BLASTX لخوا د nt، nr او RefSeq کتابتونونو (جینومیک او پروټین) سره ټولټال 482 بهرني کانټیګونه پیژندل شوي. زموږ پایلې ښیې چې د څو حجروي څارویو د ccfDNA بهرني ټوټو په مینځ کې د هډوکو هډوکي DNA غالب دي (انځور 5). د حشراتو او نورو ډولونو څخه د DNA ټوټې هم موندل شوي. د DNA ټوټې نسبتا لویه برخه نه ده پیژندل شوې، احتمال لري د ځمکنیو ډولونو په پرتله په جینومیک ډیټابیس کې د سمندري ډولونو د لوی شمیر کم استازیتوب له امله [49].
په دې مقاله کې، موږ د LB مفهوم په میوو باندې تطبیق کوو، استدلال کوو چې د هیمولیمف ccfDNA شاټ ترتیب کولی شي د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو جوړښت په اړه بصیرت چمتو کړي. په ځانګړې توګه، موږ وموندله چې 1) میوو هیمولیمف نسبتا لوړ غلظت (مایکروګرام کچه) د نسبتا لوی (~ 1-5 kb) گردش کونکي DNA ټوټې لري؛ 2) دا DNA ټوټې دواړه خپلواک او غیر خپلواک دي 3) د دې DNA ټوټو بهرني سرچینو په مینځ کې، موږ باکتریا، لرغوني او ویروسي DNA، او همدارنګه د نورو څو حجروي څارویو DNA وموندل؛ 4) په هیمولیمف کې د دې بهرني ccfDNA ټوټو راټولول په چټکۍ سره پیښیږي او د میوو داخلي فلټر کولو فعالیت کې مرسته کوي. په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفهوم، چې تر دې دمه په عمده توګه د بایومیډیسن په برخه کې پلي شوی، د پوهې یوه بډایه مګر نا کشف شوې سرچینه کوډ کوي چې د سینټینیل ډولونو او د دوی چاپیریال ترمنځ د تعامل ښه پوهیدو لپاره کارول کیدی شي.
د پریمیټ سربیره، د ccfDNA جلاوالی په تی لرونکو حیواناتو کې راپور شوی، په شمول د موږکانو، سپیانو، پیشوګانو او اسونو [50، 51، 52]. په هرصورت، زموږ د پوهې له مخې، زموږ څیړنه لومړنۍ ده چې د سمندري ډولونو کې د خلاص گردش سیسټم سره د ccfDNA کشف او ترتیب راپور ورکوي. د میوزونو دا اناتوميکي ځانګړتیا او د فلټر کولو وړتیا ممکن لږترلږه په جزوي ډول د نورو ډولونو په پرتله د گردش کولو DNA ټوټو مختلف اندازې ځانګړتیاوې تشریح کړي. په انسانانو کې، په وینه کې گردش کونکي ډیری DNA ټوټې کوچنۍ ټوټې دي چې اندازه یې له 150 څخه تر 200 bp پورې ده. د اعظمي حد سره 167 bp [34، 53]. د DNA ټوټو یوه کوچنۍ مګر د پام وړ برخه د 300 او 500 bp په اندازه کې ده، او شاوخوا 5٪ یې د 900 bp څخه اوږده دي. [54]. د دې اندازې ویش دلیل دا دی چې په پلازما کې د ccfDNA اصلي سرچینه د حجرو د مړینې په پایله کې رامینځته کیږي، یا د حجرو د مړینې له امله یا په صحي اشخاصو کې د گردش هیماتوپویټیک حجرو د نیکروسس له امله یا د سرطان ناروغانو کې د تومور حجرو د اپوپټوسس له امله (د گردش تومور DNA په نوم پیژندل کیږي). ، ctDNA). د هیمولیمف ccfDNA د اندازې ویش چې موږ په عضلاتو کې وموندلو له 1000 څخه تر 5000 bp پورې و، دا وړاندیز کوي چې عضلات ccfDNA مختلف اصل لري. دا یو منطقي فرضیه ده، ځکه چې عضلات نیم خلاص عصبي سیسټم لري او په سمندري آبي چاپیریال کې ژوند کوي چې د مایکروبیل جینومیک DNA لوړ غلظت لري. په حقیقت کې، زموږ د لابراتوار تجربو چې exogenous DNA کاروي ښودلې چې عضلات په سمندري اوبو کې د DNA ټوټې راټولوي، لږترلږه د څو ساعتونو وروسته دوی د حجرو د جذب وروسته تخریب کیږي او/یا خوشې کیږي او/یا په مختلفو سازمانونو کې زیرمه کیږي. د حجرو نادریت ته په پام سره (دواړه پروکاریوټیک او یوکاریوټیک)، د انټرا والوولر برخو کارول به د ځان سرچینو او همدارنګه د بهرنیو سرچینو څخه د ccfDNA مقدار کم کړي. د دوه اړخیزه طبیعي معافیت اهمیت او د دوراني فاګوسایټونو لوی شمیر په پام کې نیولو سره، موږ نور هم فرض کړه چې حتی بهرني ccfDNA په دوراني فاګوسایټونو کې بډایه کیږي چې د مایکرو ارګانیزمونو او/یا حجروي کثافاتو په داخلیدو سره بهرني DNA راټولوي. په ګډه سره، زموږ پایلې ښیې چې دوه اړخیزه هیمولیمف ccfDNA د مالیکولي معلوماتو یو ځانګړی ذخیره ده او د ساتونکي ډول په توګه د دوی حیثیت پیاوړی کوي.
زموږ معلومات ښيي چې د باکتریا څخه اخیستل شوي هیمولیمف ccfDNA ټوټو ترتیب او تحلیل کولی شي د کوربه باکتریا فلورا او شاوخوا سمندري ایکوسیستم کې موجود باکتریا په اړه مهم معلومات چمتو کړي. د شاټ ترتیب تخنیکونو د کامنسل باکتریا A. atra gill ترتیبونه څرګند کړي چې که چیرې دودیز 16S rRNA پیژندنې میتودونه کارول شوي وای نو له لاسه ورکړل شوي وای، د یوې برخې له امله د حوالې کتابتون تعصب. په حقیقت کې، زموږ د LB معلوماتو کارول چې د M. platensis څخه په Kerguelen کې په ورته mussel طبقه کې راټول شوي و ښودله چې د ګیل سره تړلي باکتریا سمبیونټونه د دواړو mussel ډولونو لپاره ورته وو (انځور S4، ضمیمه معلومات). د دوو جینیاتي پلوه مختلف mussels دا ورته والی ممکن د Kerguelen په سړه، سلفر او آتش فشاني زیرمو کې د باکتریا ټولنو جوړښت منعکس کړي [55، 56، 57، 58]. د سلفر کمولو مایکرو ارګانیزمونو لوړه کچه په ښه توګه تشریح شوې کله چې د بایوټربیټ شوي ساحلي سیمو څخه mussels راټولول کیږي [59]، لکه د پورټ-او-فرانس ساحل. یو بل احتمال دا دی چې د commensal mussel نباتات ممکن د افقي لیږد لخوا اغیزمن شي [60، 61]. د سمندري چاپیریال، د سمندري پوړ سطحې، او په mussels کې د سمبیوټیک باکتریا ترکیب ترمنځ د اړیکو د ټاکلو لپاره ډیرو څیړنو ته اړتیا ده. دا مطالعات اوس مهال روان دي.
د هیمولیمف ccfDNA اوږدوالی او غلظت، د هغې د پاکولو اسانتیا، او د چټک شاټګن ترتیب ته اجازه ورکولو لپاره لوړ کیفیت د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو کې د ژویو تنوع ارزولو لپاره د میوسل ccfDNA کارولو ډیری ګټو څخه دي. دا طریقه په ځانګړي ډول په ورکړل شوي ایکوسیستم کې د ویروسي ټولنو (ویروومونو) ځانګړتیا لپاره اغیزمنه ده [62، 63]. د باکتریا، آرکیا، او یوکاریوټس برعکس، ویروسي جینومونه د 16S ترتیبونو په څیر فیلوجنیتیکي محافظت شوي جینونه نلري. زموږ پایلې ښیي چې د شاخص ډولونو لکه میوسلونو څخه مایع بایوپسي د نسبتا لوی شمیر ccfDNA ویروس ټوټو پیژندلو لپاره کارول کیدی شي چې کوربه اخته کوي چې معمولا د ساحلي سمندري ایکوسیستمونو کې ژوند کوي. پدې کې ویروسونه شامل دي چې د پروټوزووا، ارتروپډونو، حشراتو، نباتاتو او باکتریا ویروسونو (د مثال په توګه، باکتریوفیجونو) اخته کولو لپاره پیژندل شوي. ورته ویش وموندل شو کله چې موږ د نیلي میوسلونو (M. platensis) هیمولیمف ccfDNA ویروس معاینه کړ چې په کیرګولین کې په ورته میوسل طبقه کې راټول شوي (جدول S2، اضافي معلومات). د ccfDNA د شاټګن ترتیب په حقیقت کې د انسانانو یا نورو ډولونو د ویروس په مطالعه کې یو نوی چلند دی [21، 37، 64]. دا چلند په ځانګړي ډول د دوه ګوني DNA ویروسونو مطالعې لپاره ګټور دی، ځکه چې هیڅ یو جین د ټولو دوه ګوني DNA ویروسونو په مینځ کې خوندي نه دی، چې په بالټیمور کې د ویروسونو ترټولو متنوع او پراخه ټولګي استازیتوب کوي [65]. که څه هم ډیری دا ویروسونه غیر طبقه بندي پاتې دي او ممکن د ویروس نړۍ د یوې بشپړې نامعلومې برخې څخه ویروسونه پکې شامل وي [66]، موږ وموندله چې د میوسل A. atra او M. platensis ویروسونه او کوربه سلسلې د دوو ډولونو ترمنځ راځي. په ورته ډول (شکل S3 وګورئ، اضافي معلومات). دا ورته والی د حیرانتیا خبره نده، ځکه چې دا ممکن په چاپیریال کې د DNA د جذبولو کې د انتخاب نشتوالی منعکس کړي. د پاک شوي RNA په کارولو سره راتلونکي مطالعات اوس مهال د RNA ویروس ځانګړتیا لپاره اړین دي.
زموږ په څیړنه کې، موږ د کوارسکي او همکارانو [37] له کار څخه جوړ شوی یو ډیر سخت پایپ لاین وکاراوه، چا چې د اصلي ccfDNA د راټولولو دمخه او وروسته د راټول شوي لوستلو او کانټیګونو دوه مرحلې حذف کول کارولي، چې په پایله کې د غیر نقشه شوي لوستلو لوړه تناسب رامینځته شو. له همدې امله، موږ نشو کولی دا رد کړو چې د دې غیر نقشه شوي لوستلو څخه ځینې ممکن لاهم خپل اصل ولري، په عمده توګه ځکه چې موږ د دې میوسل ډولونو لپاره د حوالې جینوم نلرو. موږ دا پایپ لاین هم وکاراوه ځکه چې موږ د ځان او غیر ځان لوستلو ترمنځ د چیمیرا او د Illumina MiSeq PE75 لخوا رامینځته شوي لوستلو اوږدوالي په اړه اندیښمن وو. د ډیری نا چارټ شوي لوستلو لپاره بل دلیل دا دی چې ډیری سمندري میکروبونه، په ځانګړې توګه په لرې پرتو سیمو لکه Kerguelen کې، تشریح شوي ندي. موږ د Illumina MiSeq PE75 وکاراوه، فرض یې کړه چې د ccfDNA ټوټې اوږدوالی د انسان ccfDNA سره ورته دی. د راتلونکو مطالعاتو لپاره، زموږ د پایلو په پام کې نیولو سره چې ښیي چې هیمولیمف ccfDNA د انسانانو او/یا تی لرونکو حیواناتو په پرتله اوږده لوستل لري، موږ سپارښتنه کوو چې د ccfDNA د اوږدو ټوټو لپاره د ترتیب کولو پلیټ فارم وکاروئ. دا عمل به د ژور تحلیل لپاره د ډیرو نښو پیژندل خورا اسانه کړي. د اوسني شتون نه لرونکي بشپړ A. atra اټومي جینوم ترتیب ترلاسه کول به د ځان او غیر ځان سرچینو څخه د ccfDNA توپیر هم خورا اسانه کړي. دې ته په پام سره چې زموږ څیړنه د مایع بایوپسي مفکورې د میوو لپاره د پلي کولو امکان باندې تمرکز کړی، موږ هیله لرو چې لکه څنګه چې دا مفهوم په راتلونکي څیړنه کې کارول کیږي، نوي وسایل او پایپ لاینونه به رامینځته شي ترڅو د میوو د مایکروبیل تنوع مطالعه کولو لپاره د دې میتود ظرفیت زیات کړي. سمندري ایکوسیستم.
د غیر برید کونکي کلینیکي بایومارکر په توګه، د ccfDNA لوړ شوي انساني پلازما کچه د مختلفو ناروغیو، نسجونو زیان، او فشار شرایطو سره تړاو لري [67,68,69]. دا زیاتوالی د نسجونو زیان وروسته د خپل اصلي DNA ټوټو خوشې کیدو سره تړاو لري. موږ دا مسله د شدید تودوخې فشار په کارولو سره حل کړه، په کوم کې چې عضلات په لنډ ډول د 30 ° C تودوخې سره مخ شوي وو. موږ دا تحلیل په دریو خپلواکو تجربو کې د عضلاتو په دریو مختلفو ډولونو کې ترسره کړ. په هرصورت، موږ د شدید تودوخې فشار وروسته د ccfDNA په کچه کې هیڅ بدلون ونه موند (شکل S5 وګورئ، اضافي معلومات). دا کشف ممکن لږترلږه په جزوي ډول دا حقیقت تشریح کړي چې عضلات نیم خلاص دوران سیسټم لري او د دوی د لوړ فلټر کولو فعالیت له امله د بهرني DNA لوی مقدار راټولوي. له بلې خوا، عضلات، لکه د ډیری غیر فقاریه حیواناتو په څیر، ممکن د فشار له امله رامینځته شوي نسج زیان ته ډیر مقاومت ولري، په دې توګه د دوی په هیمولیمف کې د ccfDNA خوشې کول محدودوي [70, 71].
تر اوسه پورې، په آبي ایکوسیستمونو کې د ژویو تنوع د DNA تحلیل په عمده توګه د چاپیریال DNA (eDNA) میټابارکوډینګ باندې تمرکز کړی دی. په هرصورت، دا طریقه معمولا د ژویو تنوع تحلیل کې محدوده وي کله چې پرائمرونه کارول کیږي. د شاټګن ترتیب کارول د PCR محدودیتونه او د پرائمر سیټونو تعصبي انتخاب مخنیوی کوي. پدې توګه، په یوه معنی، زموږ طریقه د وروستي کارول شوي لوړ-تروپټ eDNA شاټګن ترتیب میتود ته نږدې ده، کوم چې د ټوټې شوي DNA مستقیم ترتیب کولو او نږدې ټول ژوندي موجوداتو تحلیل کولو توان لري [72، 73]. په هرصورت، یو شمیر بنسټیز مسلې شتون لري چې LB د معیاري eDNA میتودونو څخه توپیر کوي. البته، د eDNA او LB ترمنځ اصلي توپیر د طبیعي فلټر کوربه کارول دي. د eDNA مطالعې لپاره د طبیعي فلټر په توګه د سمندري ډولونو لکه سپنجونو او بایوالونو (Dresseina spp.) کارول راپور شوي [74، 75]. په هرصورت، د ډریسینا مطالعې د نسج بایوپسي کارولې چې له هغې څخه DNA استخراج شوی و. د LB څخه د ccfDNA تحلیل د نسج بایوپسي، ځانګړي او ځینې وختونه ګران تجهیزاتو او لوژستیک ته اړتیا نلري چې د eDNA یا نسج بایوپسي سره تړاو لري. په حقیقت کې، موږ پدې وروستیو کې راپور ورکړ چې د LB څخه ccfDNA د FTA ملاتړ سره ذخیره او تحلیل کیدی شي پرته له دې چې د سړې زنځیر ساتنه وشي، کوم چې په لرې پرتو سیمو کې د څیړنې لپاره یوه لویه ننګونه ده [76]. د مایع بایوپسي څخه د ccfDNA استخراج هم ساده دی او د شاټګن ترتیب او PCR تحلیل لپاره لوړ کیفیت DNA چمتو کوي. دا د eDNA تحلیل سره تړلي ځینې تخنیکي محدودیتونو ته په پام سره یوه لویه ګټه ده [77]. د نمونې اخیستلو میتود ساده کول او ټیټ لګښت هم په ځانګړي ډول د اوږدمهاله څارنې برنامو لپاره مناسب دی. د دوی د لوړ فلټر کولو وړتیا سربیره، د بایوالونو بله پیژندل شوې ځانګړتیا د دوی د بلغم کیمیاوي میوکوپولیساکرایډ ترکیب دی، کوم چې د ویروسونو جذب هڅوي [78، 79]. دا بایوالونه د ژوندیو تنوع او په ورکړل شوي آبي ایکوسیستم کې د اقلیم بدلون اغیزې مشخص کولو لپاره یو مثالی طبیعي فلټر جوړوي. که څه هم د کوربه څخه اخیستل شوي DNA ټوټو شتون د eDNA په پرتله د میتود محدودیت په توګه لیدل کیدی شي، د eDNA په پرتله د داسې اصلي ccfDNA درلودلو سره تړلی لګښت په ورته وخت کې د روغتیا مطالعاتو لپاره د شته معلوماتو پراخه مقدار لپاره د پوهیدو وړ دی. آفسټ کوربه. پدې کې د کوربه کوربه جینوم کې مدغم شوي ویروسي ترتیبونو شتون شامل دی. دا په ځانګړي ډول د عضلاتو لپاره مهم دی، په بایوالونو کې د افقي لیږد شوي لیوکیمیک ریټرو ویروسونو شتون ته په پام سره [80، 81]. د eDNA په پرتله د LB بله ګټه دا ده چې دا په هیمولیمف کې د وینې حجرو د گردش کولو فاګوسیټیک فعالیت څخه ګټه پورته کوي، کوم چې مایکرو ارګانیزمونه (او د دوی جینومونه) جذبوي. فاګوسیټوسس په بایوالونو کې د وینې حجرو اصلي دنده ده [82]. په پای کې، دا میتود د عضلاتو د لوړ فلټر کولو ظرفیت (اوسط 1.5 لیتره / ساعت د سمندري اوبو) او دوه ورځني گردش څخه ګټه پورته کوي، کوم چې د سمندري اوبو د مختلفو طبقو مخلوط زیاتوي، د هیټرولوګس eDNA نیولو ته اجازه ورکوي. [83، 84]. په دې توګه، د میوسل ccfDNA تحلیل د میوسل د تغذیې، اقتصادي او چاپیریالي اغیزو په پام کې نیولو سره یوه په زړه پورې لاره ده. د انسانانو څخه راټول شوي LB تحلیل ته ورته، دا طریقه د بهرني موادو په ځواب کې د کوربه DNA کې د جینیاتي او ایپی جینیټیک بدلونونو اندازه کولو امکان هم پرانیزي. د مثال په توګه، د دریم نسل ترتیب کولو ټیکنالوژۍ تصور کیدی شي ترڅو د نانوپور ترتیب په کارولو سره په اصلي ccfDNA کې د جینوم پراخه میتیلیشن تحلیل ترسره کړي. دا پروسه باید د دې حقیقت له مخې اسانه شي چې د میوسل ccfDNA ټوټو اوږدوالی په مثالي ډول د اوږد لوستلو ترتیب پلیټ فارمونو سره مطابقت لري چې د کیمیاوي بدلونونو اړتیا پرته د یو واحد ترتیب څخه د جینوم پراخه DNA میتیلیشن تحلیل ته اجازه ورکوي.85,86] دا یو په زړه پورې امکان دی، ځکه چې دا ښودل شوي چې د DNA میتیلیشن نمونې د چاپیریال فشار ته غبرګون منعکس کوي او د ډیری نسلونو لپاره دوام لري. له همدې امله، دا کولی شي د اقلیم بدلون یا ککړونکو سره د مخ کیدو وروسته د غبرګون اداره کولو اصلي میکانیزمونو کې ارزښتناکه بصیرت چمتو کړي [87]. په هرصورت، د LB کارول د محدودیتونو پرته ندي. بې له شکه، دا په ایکوسیستم کې د شاخص ډولونو شتون ته اړتیا لري. لکه څنګه چې پورته یادونه وشوه، د ورکړل شوي ایکوسیستم د حیاتي تنوع ارزولو لپاره د LB کارول هم یو سخت بایو انفارمیټکس پایپ لاین ته اړتیا لري چې د سرچینې څخه د DNA ټوټو شتون په پام کې نیسي. بله لویه ستونزه د سمندري ډولونو لپاره د حوالې جینومونو شتون دی. تمه کیږي چې د سمندري تی لرونکو جینومونو پروژه او پدې وروستیو کې رامینځته شوې Fish10k پروژه [88] په څیر نوښتونه به په راتلونکي کې دا ډول تحلیل اسانه کړي. د سمندري فلټر تغذیه کونکو ژوندی موجوداتو ته د LB مفهوم پلي کول د ترتیب ټیکنالوژۍ کې وروستي پرمختګونو سره هم مطابقت لري، دا د څو اوم بایو مارکرونو پراختیا لپاره مناسب کوي ترڅو د چاپیریال فشار په ځواب کې د سمندري استوګنځایونو روغتیا په اړه مهم معلومات چمتو کړي.
د جینوم ترتیب معلومات د NCBI ترتیب لوستلو آرشیف https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 کې د بایوپروجیکټس SRR8924808 لاندې زیرمه شوي دي.
بریرلي اېس، کینګزفورډ ایم جي د سمندري ژوند او ایکوسیستمونو په اړه د اقلیم بدلون اغیز. کول بیولوژي. ۲۰۰۹؛ ۱۹: P602–P614.
ګیسي ای، مانیا ای، مزاریس ای ډي، فراشیټي ایس، المپانیډو وی، بیویلاکوا ایس، او نور. د سمندري چاپیریال په اړه د اقلیم بدلون او نورو سیمه ایزو فشارونو ګډ اغیزې په پام کې ونیسئ. عمومي ساینسي چاپیریال. 2021;755:142564.
Carella F، Antuofermo E، Farina S، Salati F، Mandas D، Prado P، et al. ). د مارچ په لومړۍ نیټه ساینس. ۲۰۲۰؛ ۷:۴۸
سیرونټ ایل، نیکسترو سي آر، زردي جي آی، ګوبرویل ای. د تکراري تودوخې فشار شرایطو لاندې د تودوخې زغم کم شوی د نیلي میوسلونو د دوبي د لوړې مړینې تشریح کوي. ساینسي راپور 2019؛ 9:17498.
فی ایس بی، سیپیلسکي اې ایم، نوسل ایس، سروینټس-یوشیدا کې، هوان جي ایل، هوبر ای آر، او نور. د څارویو د مړینې په فریکونسۍ، لاملونو او حد کې وروستي بدلونونه. پروک نټل اکاډ ساینس امریکا. ۲۰۱۵؛ ۱۱۲: ۱۰۸۳-۸.
سکارپا ایف، سننا ډي، ایزینا I، موګیټي ډي، سیروتي ایف، حسیني ایس، او نور. ډیری غیر ډولونه - ځانګړي رنځجن ممکن د پینا نوبیلیس ډله ایز مړینې لامل شوي وي. ژوند. 2020؛ 10:238
براډلي ایم، کوټس ایس جي، جینکنز ای، اوهارا ټي ایم. د اقلیم بدلون احتمالي اغیزې په آرکټیک زونوټیک ناروغیو باندې. انټ جي سرکمپولر روغتیا. ۲۰۰۵؛ ۶۴:۴۶۸-۷۷.
بییر جي.، ګرین شمال لویدیځ، بروکس ایس.، الن آی جي، روس اې.، ګومیز ټي. او نور. نیلي میوسل (مایټیلس اډولیس سپپ.) د ساحلي ککړتیا څارنې کې د سیګنال ارګانیزم په توګه: یوه بیاکتنه. د مارچ چاپیریال ریس 2017؛ 130:338-65.
سیراویګنا جي، مارسوني ایس، سینا ایس، بارډیلي اې. د سرطان په درملنه کې د مایع بایوپسي ادغام. نیټ ریو کلین اونکول. ۲۰۱۷؛ ۱۴:۵۳۱-۴۸.
وان جي سي ايم، ماسي سي، ګارسیا-کورباچو جي، مولییر ایف، برینټون جي ډي، کالډاس سي، او نور. د مایع بایوپسي پختګي: د تومور ډي این اې ته اجازه ورکوي چې گردش وکړي. نیټ ریو سرطان. ۲۰۱۷؛ ۱۷:۲۲۳-۳۸.
منډیل پي.، میټیس پي. په انسان پلازما کې نیوکلیک اسیدونه. د سوک بایول فرعي شرکتونو د غونډې دقیقې. ۱۹۴۸؛ ۱۴۲:۲۴۱-۳.
برونخورسټ اې جي، انګیرر ډبلیو، هولډنریډر ایس. د سرطان درملنې لپاره د مالیکولي مارکر په توګه د حجرو څخه پاک ډي این اې لپاره نوی رول. د بایومولر تحلیل اندازه کول. ۲۰۱۹؛ ۱۷:۱۰۰۰۸۷.
ایګناټیډیس ایم، سلیج جی ډبلیو، جیفري ایس ایس مایع بایوپسي کلینیک ته ننوځي - د پلي کولو مسلې او راتلونکي ننګونې. نیټ ریو کلین اونکول. ۲۰۲۱؛ ۱۸:۲۹۷–۳۱۲.
لو وای ایم، کوربیټا این، چیمبرلین پی ایف، رای ډبلیو، سارجنټ ایل، ریډمن سي ډبلیو او نور. د جنین ډي این اې د مور په پلازما او سیرم کې شتون لري. لانسیټ. ۱۹۹۷؛ ۳۵۰:۴۸۵-۷.
مفارې ایم این، وانګ آر جي، شا جي ایم، سټیونسن ډي کې، کویک ایس آر د امیندوارۍ په جریان کې د میرمنو په وینه کې د بهر حجروي RNA گردش کولو په کارولو سره د امیندوارۍ او د هغې د پیچلتیاو مطالعه. ډوپیډیاټریکس. ۲۰۲۰؛ ۸:۶۰۵۲۱۹.
اولیریچ ایم، شیروډ کې، کیون پي، شوټز ای، بیک جي، سټیګباؤر جي، او نور. مایع بایپسي: د ډونر حجرو څخه پاک DNA د پښتورګو په ګرافټ کې د الوجینیک زخمونو کشفولو لپاره کارول کیږي. نیټ ریو نیفرول. ۲۰۲۱؛ ۱۷:۵۹۱-۶۰۳.
خوان ایف سي، لو وای ایم د زیږون دمخه تشخیص کې نوښتونه: د مور پلازما جینوم ترتیب. انا ایم ډي. ۲۰۱۶؛ ۶۷:۴۱۹-۳۲.
ګو ډبلیو، ډینګ ایکس، لی ایم، سوکو وای ډي، اریوالو ایس، سټرایک ډي، او نور. د اخته شوي بدني مایعاتو د راتلونکي نسل میټاجینومیک ترتیب سره د پیتوجن چټک کشف. نیټ میډیسن. ۲۰۲۱;۲۷:۱۱۵-۲۴.