Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). તે દરમિયાન, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સાઇટને સ્ટાઇલ અને JavaScript વિના રેન્ડર કરીશું.
લિક્વિડ બાયોપ્સી (LB) એ એક ખ્યાલ છે જે બાયોમેડિકલ ક્ષેત્રમાં ઝડપથી લોકપ્રિયતા મેળવી રહ્યો છે. આ ખ્યાલ મુખ્યત્વે ફરતા બાહ્યકોષીય DNA (ccfDNA) ના ટુકડાઓની શોધ પર આધારિત છે, જે મુખ્યત્વે વિવિધ પેશીઓમાં કોષ મૃત્યુ પછી નાના ટુકડાઓ તરીકે મુક્ત થાય છે. આ ટુકડાઓનો એક નાનો હિસ્સો વિદેશી (વિદેશી) પેશીઓ અથવા સજીવોમાંથી ઉદ્ભવે છે. વર્તમાન કાર્યમાં, અમે આ ખ્યાલને મસલ પર લાગુ કર્યો છે, જે તેમની ઉચ્ચ દરિયાઈ પાણી ગાળણ ક્ષમતા માટે જાણીતી સેન્ટિનલ પ્રજાતિ છે. અમે મસલની ક્ષમતાનો ઉપયોગ દરિયાઈ દરિયાકાંઠાના ઇકોસિસ્ટમ્સની જૈવવિવિધતા વિશે માહિતી પ્રદાન કરવા માટે વિવિધ સ્ત્રોતોમાંથી પર્યાવરણીય DNA ટુકડાઓ મેળવવા માટે કુદરતી ફિલ્ટર તરીકે કાર્ય કરવા માટે કરી રહ્યા છીએ. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે મસલ હેમોલિમ્ફમાં DNA ટુકડાઓ હોય છે જે કદમાં ખૂબ જ બદલાય છે, 1 થી 5 kb સુધી. શોટગન સિક્વન્સિંગ દર્શાવે છે કે મોટી સંખ્યામાં DNA ટુકડાઓ વિદેશી માઇક્રોબાયલ મૂળના છે. તેમાંથી, અમને બેક્ટેરિયા, આર્ચીઆ અને વાયરસના DNA ટુકડાઓ મળ્યા, જેમાં દરિયાકાંઠાના દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમ્સમાં સામાન્ય રીતે જોવા મળતા વિવિધ યજમાનોને ચેપ લગાડવા માટે જાણીતા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે. નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે છીપવાળી માછલીઓ પર લાગુ LB ની વિભાવના દરિયાઇ દરિયાકાંઠાના ઇકોસિસ્ટમમાં માઇક્રોબાયલ વિવિધતા વિશે જ્ઞાનનો સમૃદ્ધ પરંતુ હજુ સુધી અન્વેષિત સ્ત્રોત રજૂ કરે છે.
દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિની જૈવવિવિધતા પર આબોહવા પરિવર્તન (CC) ની અસર સંશોધનનો ઝડપથી વિકસતો ક્ષેત્ર છે. ગ્લોબલ વોર્મિંગ માત્ર મહત્વપૂર્ણ શારીરિક તાણનું કારણ નથી, પરંતુ દરિયાઈ જીવોની થર્મલ સ્થિરતાની ઉત્ક્રાંતિ મર્યાદાઓને પણ દબાણ કરે છે, જે સંખ્યાબંધ પ્રજાતિઓના નિવાસસ્થાનને અસર કરે છે, જે તેમને વધુ અનુકૂળ પરિસ્થિતિઓ શોધવા માટે પ્રેરે છે [1, 2]. મેટાઝોઆન્સની જૈવવિવિધતાને અસર કરવા ઉપરાંત, CC યજમાન-માઇક્રોબાયલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના નાજુક સંતુલનને વિક્ષેપિત કરે છે. આ માઇક્રોબાયલ ડિસબેક્ટેરિયોસિસ દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિ માટે ગંભીર ખતરો ઉભો કરે છે કારણ કે તે દરિયાઈ જીવોને ચેપી રોગકારક જીવો માટે વધુ સંવેદનશીલ બનાવે છે [3, 4]. એવું માનવામાં આવે છે કે SS સામૂહિક મૃત્યુમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, જે વૈશ્વિક દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિના સંચાલન માટે એક ગંભીર સમસ્યા છે [5, 6]. ઘણી દરિયાઈ પ્રજાતિઓના આર્થિક, ઇકોલોજીકલ અને પોષણ પ્રભાવોને જોતાં આ એક મહત્વપૂર્ણ મુદ્દો છે. આ ખાસ કરીને ધ્રુવીય પ્રદેશોમાં રહેતા બાયવાલ્વ માટે સાચું છે, જ્યાં CK ની અસરો વધુ તાત્કાલિક અને ગંભીર હોય છે [6, 7]. હકીકતમાં, માયટીલસ spp જેવા બાયવાલ્વ. દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમ પર CC ની અસરોનું નિરીક્ષણ કરવા માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે. આશ્ચર્યજનક વાત નથી કે, તેમના સ્વાસ્થ્યનું નિરીક્ષણ કરવા માટે પ્રમાણમાં મોટી સંખ્યામાં બાયોમાર્કર્સ વિકસાવવામાં આવ્યા છે, જે ઘણીવાર એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ અથવા કોષીય કાર્યક્ષમતા અને ફેગોસાયટીક પ્રવૃત્તિ [8] જેવા સેલ્યુલર કાર્યો પર આધારિત કાર્યાત્મક બાયોમાર્કર્સનો સમાવેશ કરતા બે-સ્તરીય અભિગમનો ઉપયોગ કરે છે. આ પદ્ધતિઓમાં દરિયાઈ પાણીના મોટા પ્રમાણમાં શોષણ પછી નરમ પેશીઓમાં એકઠા થતા ચોક્કસ દબાણ સૂચકાંકોની સાંદ્રતાનું માપન પણ શામેલ છે. જો કે, ઉચ્ચ ગાળણ ક્ષમતા અને બાયવાલ્વ્સની અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ તંત્ર પ્રવાહી બાયોપ્સી (LB) ની વિભાવનાનો ઉપયોગ કરીને નવા હેમોલિમ્ફ બાયોમાર્કર્સ વિકસાવવાની તક પૂરી પાડે છે, જે દર્દીના સંચાલન માટે એક સરળ અને ન્યૂનતમ આક્રમક અભિગમ છે. રક્ત નમૂનાઓ [9, 10]. જોકે માનવ LB માં અનેક પ્રકારના ફરતા અણુઓ મળી શકે છે, આ ખ્યાલ મુખ્યત્વે પ્લાઝ્મામાં ફરતા બાહ્યકોષીય DNA (ccfDNA) ટુકડાઓના DNA સિક્વન્સિંગ વિશ્લેષણ પર આધારિત છે. હકીકતમાં, માનવ પ્લાઝ્મામાં ફરતા ડીએનએની હાજરી 20મી સદીના મધ્યભાગથી જાણીતી છે [11], પરંતુ તાજેતરના વર્ષોમાં જ હાઇ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓના આગમનથી ccfDNA પર આધારિત ક્લિનિકલ નિદાન થયું છે. આ ફરતા ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરી આંશિક રીતે કોષ મૃત્યુ પછી જીનોમિક ડીએનએ (પરમાણુ અને માઇટોકોન્ડ્રિયલ) ના નિષ્ક્રિય પ્રકાશનને કારણે છે. સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં, ccfDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL) પરંતુ વિવિધ પેથોલોજીથી પીડાતા અથવા તણાવનો ભોગ બનેલા દર્દીઓમાં તે 5-10 ગણી વધી શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે. સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં, ccfDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL) પરંતુ વિવિધ પેથોલોજીથી પીડાતા અથવા તણાવનો ભોગ બનેલા દર્દીઓમાં તે 5-10 ગણી વધી શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныйтой больныйтох подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. સ્વસ્થ લોકોમાં, cccDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL), પરંતુ વિવિધ પેથોલોજી ધરાવતા દર્દીઓમાં અથવા તણાવ હેઠળ તે 5-10 ગણી વધી શકે છે જે પેશીઓને નુકસાન પહોંચાડે છે.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渞受5理或承受压度通常较低（倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 曭叀叀增加 5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцизинсент. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં ccfDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી (<10 ng/ml) હોય છે, પરંતુ વિવિધ પેથોલોજી અથવા તણાવ ધરાવતા દર્દીઓમાં તે 5-10 ગણી વધી શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે.ccfDNA ટુકડાઓનું કદ વ્યાપકપણે બદલાય છે, પરંતુ સામાન્ય રીતે 150 થી 200 bp સુધી હોય છે. [12]. સ્વ-ઉત્પન્ન ccfDNA, એટલે કે, સામાન્ય અથવા રૂપાંતરિત યજમાન કોષોમાંથી ccfDNA, નું વિશ્લેષણ, ન્યુક્લિયર અને/અથવા મિટોકોન્ડ્રીયલ જીનોમમાં હાજર આનુવંશિક અને એપિજેનેટિક ફેરફારો શોધવા માટે વાપરી શકાય છે, જેનાથી ક્લિનિશિયનોને ચોક્કસ પરમાણુ-લક્ષિત ઉપચાર પસંદ કરવામાં મદદ મળે છે [13]. જો કે, ccfDNA ગર્ભાવસ્થા દરમિયાન ગર્ભ કોષોમાંથી ccfDNA જેવા વિદેશી સ્ત્રોતોમાંથી અથવા ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરેલા અંગોમાંથી મેળવી શકાય છે [14,15,16,17]. ccfDNA એ ચેપી એજન્ટ (વિદેશી) ના ન્યુક્લિક એસિડની હાજરી શોધવા માટે માહિતીનો એક મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોત પણ છે, જે ચેપગ્રસ્ત પેશીઓના આક્રમક બાયોપ્સીને ટાળીને રક્ત સંસ્કૃતિઓ દ્વારા ઓળખાતા વ્યાપક ચેપનું બિન-આક્રમક શોધ કરવાની મંજૂરી આપે છે [18]. તાજેતરના અભ્યાસોએ ખરેખર દર્શાવ્યું છે કે માનવ રક્તમાં માહિતીનો સમૃદ્ધ સ્ત્રોત છે જેનો ઉપયોગ વાયરલ અને બેક્ટેરિયલ પેથોજેન્સને ઓળખવા માટે થઈ શકે છે, અને માનવ પ્લાઝ્મામાં જોવા મળતા લગભગ 1% ccfDNA વિદેશી મૂળના છે [19]. આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે સજીવના ફરતા માઇક્રોબાયોમની જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન ccfDNA વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે. જો કે, તાજેતરમાં સુધી, આ ખ્યાલનો ઉપયોગ ફક્ત માનવોમાં અને થોડા અંશે અન્ય કરોડઅસ્થિધારી પ્રાણીઓમાં થતો હતો [20, 21].
આ પેપરમાં, અમે ઓલાકોમ્યા એટ્રાના ccfDNA નું વિશ્લેષણ કરવા માટે LB સંભવિતતાનો ઉપયોગ કરીએ છીએ, જે દક્ષિણ પ્રજાતિ છે જે સામાન્ય રીતે સબઅન્ટાર્કટિક કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓમાં જોવા મળે છે, જે 35 મિલિયન વર્ષો પહેલા રચાયેલા મોટા ઉચ્ચપ્રદેશની ટોચ પર ટાપુઓનો સમૂહ છે. જ્વાળામુખી ફાટી નીકળવો. ઇન વિટ્રો પ્રાયોગિક પ્રણાલીનો ઉપયોગ કરીને, અમે શોધી કાઢ્યું કે દરિયાઈ પાણીમાં DNA ટુકડાઓ ઝડપથી મસલ દ્વારા શોષાય છે અને હેમોલિમ્ફ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં પ્રવેશ કરે છે. શોટગન સિક્વન્સિંગે દર્શાવ્યું છે કે મસલ હેમોલિમ્ફ ccfDNA માં તેના પોતાના અને બિન-સ્વ-મૂળના DNA ટુકડાઓ હોય છે, જેમાં સહજીવન બેક્ટેરિયા અને ઠંડા જ્વાળામુખી દરિયાઇ દરિયાઇ ઇકોસિસ્ટમના લાક્ષણિક બાયોમ્સમાંથી DNA ટુકડાઓનો સમાવેશ થાય છે. હેમોલિમ્ફ ccfDNA માં વિવિધ યજમાન શ્રેણીઓવાળા વાયરસમાંથી મેળવેલા વાયરલ સિક્વન્સ પણ હોય છે. અમને હાડકાની માછલી, દરિયાઈ એનિમોન્સ, શેવાળ અને જંતુઓ જેવા બહુકોષીય પ્રાણીઓમાંથી DNA ટુકડાઓ પણ મળ્યા. નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે LB ખ્યાલ દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં સમૃદ્ધ જીનોમિક ભંડાર ઉત્પન્ન કરવા માટે દરિયાઈ અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓ પર સફળતાપૂર્વક લાગુ કરી શકાય છે.
પુખ્ત (૫૫-૭૦ મીમી લાંબા) માયટીલસ પ્લેટેન્સિસ (એમ. પ્લેટેન્સિસ) અને ઓલાકોમ્યા એટ્રા (એ. એટ્રા) પોર્ટ-ઓ-ફ્રાન્સના આંતરભરતી ખડકાળ કિનારાઓ (૦૪૯°૨૧.૨૩૫ દક્ષિણ, ૦૭૦°૧૩.૪૯૦ પૂર્વ.) માંથી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. ડિસેમ્બર ૨૦૧૮માં કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ. અન્ય પુખ્ત વાદળી મસલ્સ (માયટીલસ એસપીપી.) એક વાણિજ્યિક સપ્લાયર (PEI મસલ્સ કિંગ ઇન્ક., પ્રિન્સ એડવર્ડ આઇલેન્ડ, કેનેડા) પાસેથી મેળવવામાં આવ્યા હતા અને તેમને ૧૦-૨૦ લિટર ૩૨‰ કૃત્રિમ ખારાશ ધરાવતા તાપમાન નિયંત્રિત (૪° સે) વાયુયુક્ત ટાંકીમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા. (કૃત્રિમ દરિયાઈ મીઠું રીફ ક્રિસ્ટલ, ઇન્સ્ટન્ટ ઓશન, વર્જિનિયા, યુએસએ). દરેક પ્રયોગ માટે, વ્યક્તિગત શેલની લંબાઈ અને વજન માપવામાં આવ્યું હતું.
આ પ્રોગ્રામ માટે એક મફત ઓપન એક્સેસ પ્રોટોકોલ ઓનલાઈન ઉપલબ્ધ છે (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). ટૂંકમાં, વર્ણવ્યા મુજબ [22], અપહરણકર્તા સ્નાયુઓમાંથી LB હેમોલિમ્ફ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. હેમોલિમ્ફને 1200×g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા 3 મિનિટ માટે સ્પષ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું, સુપરનેટન્ટને ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી (-20°C) થીજાવવામાં આવ્યું હતું. cfDNA ના અલગતા અને શુદ્ધિકરણ માટે, ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર NucleoSnap cfDNA કીટ (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓ (1.5-2.0 ml) પીગળવામાં આવ્યા હતા અને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. ccfDNA ને વધુ વિશ્લેષણ સુધી -80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. કેટલાક પ્રયોગોમાં, ccfDNA ને QIAamp DNA ઇન્વેસ્ટિગેટર કીટ (QIAGEN, ટોરોન્ટો, ઓન્ટારિયો, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરીને અલગ અને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું. શુદ્ધ DNA ને પ્રમાણભૂત PicoGreen પરખનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવ્યું હતું. એજિલેન્ટ 2100 બાયોએનાલિઝર (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ ઇન્ક., સાન્ટા ક્લેરા, CA) દ્વારા ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા DNA કીટનો ઉપયોગ કરીને કેશિકા ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દ્વારા અલગ કરાયેલા ccfDNA ના ટુકડા વિતરણનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર ccfDNA નમૂનાના 1 µl નો ઉપયોગ કરીને પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
હેમોલિમ્ફ ccfDNA ટુકડાઓના ક્રમ માટે, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) એ Illumina MiSeq PE75 કીટના Illumina DNA મિક્સ કીટનો ઉપયોગ કરીને શોટગન લાઇબ્રેરીઓ તૈયાર કરી. એક માનક એડેપ્ટર (BioO) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. NCBI સિક્વન્સ રીડ આર્કાઇવ (SRR8924808 અને SRR8924809) માંથી કાચી ડેટા ફાઇલો ઉપલબ્ધ છે. FastQC [23] નો ઉપયોગ કરીને મૂળભૂત વાંચન ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. ક્લિપિંગ એડેપ્ટરો અને નબળી ગુણવત્તાવાળા વાંચન માટે ટ્રિમોમેટિક [24] નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે. જોડીવાળા છેડાવાળા શોટગન રીડ્સને FLASH ને 20 bp ના ઓછામાં ઓછા ઓવરલેપ સાથે લાંબા સિંગલ રીડ્સમાં મર્જ કરવામાં આવ્યા હતા જેથી મેળ ન ખાય [25]. બાયવલ્વ NCBI વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e−3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે મર્જ કરેલા રીડ્સની ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી-જટિલતા સિક્વન્સનું માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. બાયવલ્વ NCBI વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e−3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે મર્જ કરેલા રીડ્સની ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી-જટિલતા સિક્વન્સનું માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатувых двустворчатюх 1e-3 અને 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. NCBI બાયવલ્વ વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e-3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે પૂલ્ડ રીડ્સની ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી જટિલતા ક્રમ માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买, [ST用释合并的读买]进行低复杂度序列的掩蔽.આ进行 复杂度 序列 的.. . .掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчать данных (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности с использовательности NCBI બાયવલ્વ ટેક્સોનોમિક ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય <1e-3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે પૂલ્ડ રીડ્સની ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી જટિલતા ક્રમ માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું.રીડ્સને બે જૂથોમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા: બાયવલ્વ સિક્વન્સ (અહીં સ્વ-રીડ્સ કહેવાય છે) અને અસંબંધિત (નોન-સેલ્ફ-રીડ્સ). કોન્ટિગ્સ [27] જનરેટ કરવા માટે MEGAHIT નો ઉપયોગ કરીને બે જૂથોને અલગથી એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા. દરમિયાન, એલિયન માઇક્રોબાયોમ રીડ્સના વર્ગીકરણ વિતરણને ક્રેકેન2 [28] નો ઉપયોગ કરીને વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યું હતું અને ગેલેક્સી [29, 30] પર ક્રોના પાઇ ચાર્ટ દ્વારા ગ્રાફિકલી રજૂ કરવામાં આવ્યું હતું. અમારા પ્રારંભિક પ્રયોગોમાંથી શ્રેષ્ઠ કિમીર્સ kmers-59 હોવાનું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (બાયવલ્વ NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે સંરેખણ દ્વારા સ્વ-સંકલન ઓળખવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (બાયવલ્વ NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે સંરેખણ દ્વારા સ્વ-સંકલન ઓળખવામાં આવ્યા હતા. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. ત્યારબાદ અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (NCBI બાયવલ્વ ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે મેચ કરીને સ્વ-કોન્ટિગ્સને ઓળખવામાં આવ્યા.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). ત્યારબાદ BLASTN (NCBI બાયવલ્વ ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે મેચ કરીને અંતિમ એનોટેશન માટે સ્વ-કોન્ટિગ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા. સમાંતર રીતે, નોનસેલ્ફ ગ્રુપ કોન્ટિગ્સને BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા. સમાંતર રીતે, નોનસેલ્ફ ગ્રુપ કોન્ટિગ્સને BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои ). સમાંતર રીતે, વિદેશી જૂથ કોન્ટિગ્સને BLASTN (NT NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, база данных nt NCBI, ગોમોલોજીયા 60%). સમાંતર રીતે, નોન-સેલ્ફ ગ્રુપ કોન્ટિગ્સને BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા. Nr અને RefSeq પ્રોટીન NCBI ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોનસેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ BLASTX હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. Nr અને RefSeq પ્રોટીન NCBI ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોનસેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ BLASTX હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). NR અને RefSeq NCBI પ્રોટીન ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય < 1e-10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોન-સેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ BLASTX કરવામાં આવ્યું હતું.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1m 60%). NR અને RefSeq NCBI પ્રોટીન ડેટાબેઝ (e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોન-સેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ BLASTX કરવામાં આવ્યું હતું.નોન-સેલ્ફ-કોન્ટિગ્સના BLASTN અને BLASTX પૂલ અંતિમ કોન્ટિગ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે (પૂરક ફાઇલ જુઓ).
પીસીઆર માટે ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાઇમર્સ કોષ્ટક S1 માં સૂચિબદ્ધ છે. ccfDNA લક્ષ્ય જનીનોને વિસ્તૃત કરવા માટે Taq DNA પોલિમરેઝ (બાયો બેઝિક કેનેડા, માર્ખામ, ON) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. નીચેની પ્રતિક્રિયા સ્થિતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો: 3 મિનિટ માટે 95°C પર ડિનેચરેશન, 1 મિનિટ માટે 95°C, 1 મિનિટ માટે સેટ એનિલિંગ તાપમાન, 1 મિનિટ માટે 72°C પર વિસ્તરણ, 35 ચક્ર, અને અંતે 10 મિનિટની અંદર 72°C. . પીસીઆર ઉત્પાદનોને 95 V પર SYBRTM સેફ ડીએનએ જેલ સ્ટેન (ઇન્વિટ્રોજન, બર્લિંગ્ટન, ON, કેનેડા) ધરાવતા એગારોઝ જેલ (1.5%) માં ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.
મસલ (માઇટિલસ spp.) ને 500 મિલી ઓક્સિજનયુક્ત દરિયાઈ પાણી (32 PSU) માં 4°C તાપમાને 24 કલાક માટે અનુકૂલિત કરવામાં આવ્યા હતા. માનવ ગેલેક્ટીન-7 cDNA સિક્વન્સ (NCBI એક્સેસિયન નંબર L07769) ને એન્કોડ કરતી ઇન્સર્ટ ધરાવતું પ્લાઝમિડ DNA 190 μg/μl ની અંતિમ સાંદ્રતા પર શીશીમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. DNA ઉમેર્યા વિના સમાન પરિસ્થિતિઓમાં ઉકાળવામાં આવેલા મસલ નિયંત્રણ હતા. ત્રીજા નિયંત્રણ ટાંકીમાં મસલ વિના DNA હતું. દરિયાઈ પાણીમાં DNA ની ગુણવત્તાનું નિરીક્ષણ કરવા માટે, દરેક ટાંકીમાંથી દર્શાવેલ સમયે દરિયાઈ પાણીના નમૂના (20 μl; ત્રણ પુનરાવર્તનો) લેવામાં આવ્યા હતા. પ્લાઝમિડ DNA ટ્રેસેબિલિટી માટે, LB મસલને દર્શાવેલ સમયે કાપવામાં આવ્યા હતા અને qPCR અને ddPCR દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. દરિયાઈ પાણીમાં મીઠાનું પ્રમાણ વધુ હોવાથી, બધા PCR પરીક્ષણો પહેલાં PCR ગુણવત્તાવાળા પાણીમાં (1:10) એલિક્વોટ્સને પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.
ડિજિટલ ડ્રોપલેટ PCR (ddPCR) BioRad QX200 પ્રોટોકોલ (મિસિસૌગા, ઓન્ટારિયો, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યો હતો. શ્રેષ્ઠ તાપમાન નક્કી કરવા માટે તાપમાન પ્રોફાઇલનો ઉપયોગ કરો (કોષ્ટક S1). QX200 ડ્રોપ જનરેટર (BioRad) નો ઉપયોગ કરીને ટીપાં ઉત્પન્ન કરવામાં આવ્યા હતા. ddPCR નીચે મુજબ હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું: 5 મિનિટ માટે 95°C, 30 સેકન્ડ માટે 95°C ના 50 ચક્ર અને 1 મિનિટ માટે આપેલ એનિલિંગ તાપમાન અને 30 સેકન્ડ માટે 72°C, 5 મિનિટ માટે 4°C અને 5 મિનિટની અંદર 90°C. QX200 ડ્રોપ રીડર (BioRad) નો ઉપયોગ કરીને ટીપાંની સંખ્યા અને હકારાત્મક પ્રતિક્રિયાઓ (કોપીઓની સંખ્યા/µl) માપવામાં આવી હતી. 10,000 થી ઓછા ટીપાંવાળા નમૂનાઓ નકારવામાં આવ્યા હતા. દર વખતે ddPCR ચલાવવામાં આવતા પેટર્ન નિયંત્રણ કરવામાં આવ્યું ન હતું.
qPCR રોટર-જીન® 3000 (કોર્બેટ રિસર્ચ, સિડની, ઓસ્ટ્રેલિયા) અને LGALS7 વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. બધા જથ્થાત્મક PCR ક્વોન્ટીફાસ્ટ SYBR ગ્રીન PCR કિટ (QIAGEN) નો ઉપયોગ કરીને 20 μl માં કરવામાં આવ્યા હતા. qPCR 95°C પર 15 મિનિટના ઇન્ક્યુબેશન સાથે શરૂ કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ 95°C પર 10 સેકન્ડ માટે 40 ચક્ર અને 60°C પર 60 સેકન્ડ માટે એક ડેટા સંગ્રહ સાથે. 5 સેકન્ડ માટે 95°C, 60 સેકન્ડ માટે 65°C અને qPCR ના અંતે 97°C પર ક્રમિક માપનો ઉપયોગ કરીને ગલન વળાંકો ઉત્પન્ન કરવામાં આવ્યા હતા. નિયંત્રણ નમૂનાઓ સિવાય, દરેક qPCR ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવ્યું હતું.
છીપવાળી માછલીઓ તેમના ઉચ્ચ ગાળણ દર માટે જાણીતી હોવાથી, અમે સૌપ્રથમ તપાસ કરી કે શું તેઓ દરિયાઈ પાણીમાં હાજર DNA ટુકડાઓને ફિલ્ટર કરી શકે છે અને જાળવી શકે છે. અમને એ પણ જાણવામાં રસ હતો કે શું આ ટુકડાઓ તેમના અર્ધ-ખુલ્લા લસિકા તંત્રમાં એકઠા થાય છે. અમે વાદળી છીપવાળી માછલીઓની ટાંકીઓમાં ઉમેરાયેલા દ્રાવ્ય DNA ટુકડાઓના ભાવિને શોધીને પ્રાયોગિક રીતે આ મુદ્દાને ઉકેલ્યો. DNA ટુકડાઓનું ટ્રેકિંગ સરળ બનાવવા માટે, અમે માનવ ગેલેક્ટીન-7 જનીન ધરાવતા વિદેશી (સ્વયં નહીં) પ્લાઝમિડ DNAનો ઉપયોગ કર્યો. ddPCR દરિયાઈ પાણી અને છીપવાળી માછલીઓમાં પ્લાઝમિડ DNA ટુકડાઓ શોધી કાઢે છે. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે જો છીપવાળી માછલીઓની ગેરહાજરીમાં દરિયાઈ પાણીમાં DNA ટુકડાઓનું પ્રમાણ સમય જતાં (7 દિવસ સુધી) પ્રમાણમાં સ્થિર રહે છે, તો છીપવાળી માછલીઓની હાજરીમાં આ સ્તર લગભગ 8 કલાકની અંદર સંપૂર્ણપણે અદૃશ્ય થઈ જાય છે (આકૃતિ 1a,b). ઇન્ટ્રાવાલ્વ્યુલર પ્રવાહી અને હેમોલિમ્ફ (આકૃતિ 1c) માં 15 મિનિટની અંદર બાહ્ય DNA ના ટુકડાઓ સરળતાથી શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા. આ ટુકડાઓ હજુ પણ સંપર્કમાં આવ્યા પછી 4 કલાક સુધી શોધી શકાય છે. ડીએનએ ટુકડાઓના સંદર્ભમાં આ ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિ બેક્ટેરિયા અને શેવાળની ​​ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિ સાથે તુલનાત્મક છે [31]. આ પરિણામો સૂચવે છે કે મસલ તેમના પ્રવાહી ભાગોમાં વિદેશી ડીએનએ ફિલ્ટર અને એકઠા કરી શકે છે.
ddPCR દ્વારા માપવામાં આવતા મસલ્સની હાજરી (A) અથવા ગેરહાજરી (B) માં દરિયાઈ પાણીમાં પ્લાઝમિડ DNA ની સાપેક્ષ સાંદ્રતા. A માં, પરિણામો ટકાવારી તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે, જેમાં બોક્સની કિનારીઓ 75મા અને 25મા પર્સેન્ટાઇલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. ફીટ કરેલ લોગરીધમિક વળાંક લાલ રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યો છે, અને ગ્રે રંગમાં છાંયો થયેલ વિસ્તાર 95% વિશ્વાસ અંતરાલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. B માં, લાલ રેખા સરેરાશનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે અને વાદળી રેખા સાંદ્રતા માટે 95% વિશ્વાસ અંતરાલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. C પ્લાઝમિડ DNA ઉમેર્યા પછી અલગ અલગ સમયે મસલ્સના હેમોલિમ્ફ અને વાલ્વ્યુલર પ્રવાહીમાં પ્લાઝમિડ DNA નું સંચય. પરિણામો શોધાયેલ સંપૂર્ણ નકલો/mL (±SE) તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે.
આગળ, અમે કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ પરના મસલ બેડમાંથી એકત્રિત કરાયેલા મસલ્સમાં ccfDNA ની ઉત્પત્તિની તપાસ કરી, જે મર્યાદિત માનવજાત પ્રભાવ ધરાવતા ટાપુઓના દૂરના જૂથ છે. આ હેતુ માટે, મસલ ​​હેમોલિમ્ફ્સમાંથી cccDNA ને અલગ કરીને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું અને સામાન્ય રીતે માનવ cccDNA ને શુદ્ધ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિઓ દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું [32, 33]. અમને જાણવા મળ્યું કે મસલમાં સરેરાશ હેમોલિમ્ફ ccfDNA સાંદ્રતા ઓછી માઇક્રોગ્રામ પ્રતિ મિલી હેમોલિમ્ફ શ્રેણીમાં હોય છે (કોષ્ટક S2, પૂરક માહિતી જુઓ). આ સાંદ્રતાની શ્રેણી સ્વસ્થ લોકો કરતા ઘણી મોટી છે (ઓછી નેનોગ્રામ પ્રતિ મિલીલીટર), પરંતુ દુર્લભ કિસ્સાઓમાં, કેન્સરના દર્દીઓમાં, ccfDNA નું સ્તર ઘણા માઇક્રોગ્રામ પ્રતિ મિલીલીટર સુધી પહોંચી શકે છે [34, 35]. હેમોલિમ્ફ ccfDNA ના કદ વિતરણના વિશ્લેષણમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે આ ટુકડાઓ કદમાં મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે, જે 1000 bp થી 1000 bp સુધી છે. 5000 bp સુધી (આકૃતિ 2). સિલિકા-આધારિત QIAamp ઇન્વેસ્ટિગેટર કિટનો ઉપયોગ કરીને સમાન પરિણામો મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે સામાન્ય રીતે ફોરેન્સિક વિજ્ઞાનમાં ccfDNA [36] સહિત ઓછી સાંદ્રતાવાળા DNA નમૂનાઓમાંથી જીનોમિક DNA ને ઝડપથી અલગ કરવા અને શુદ્ધ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે.
મસલ હેમોલિમ્ફનું પ્રતિનિધિત્વ કરતું ccfDNA ઇલેક્ટ્રોફોરેગ્રામ. ન્યુક્લિયોસ્નેપ પ્લાઝ્મા કીટ (ટોચ) અને QIAamp DNA ઇન્વેસ્ટિગેટર કીટ સાથે કાઢવામાં આવ્યું. B વાયોલિન પ્લોટ મસલમાં હેમોલિમ્ફ ccfDNA સાંદ્રતા (±SE) નું વિતરણ દર્શાવે છે. કાળી અને લાલ રેખાઓ અનુક્રમે મધ્યક અને પ્રથમ અને ત્રીજા ચતુર્થાંશનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
મનુષ્યો અને પ્રાઈમેટ્સમાં લગભગ 1% ccfDNA વિદેશી સ્ત્રોત ધરાવે છે [21, 37]. બાયવાલ્વ્સની અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ તંત્ર, માઇક્રોબાયલ-સમૃદ્ધ દરિયાઈ પાણી અને મસલ ccfDNA ના કદ વિતરણને ધ્યાનમાં રાખીને, અમે અનુમાન કર્યું કે મસલ હેમોલિમ્ફ ccfDNA માં માઇક્રોબાયલ DNA નો સમૃદ્ધ અને વૈવિધ્યસભર પૂલ હોઈ શકે છે. આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે, અમે કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓમાંથી એકત્રિત કરાયેલા ઓલાકોમ્યા એટ્રા નમૂનાઓમાંથી હેમોલિમ્ફ ccfDNA ને ક્રમબદ્ધ કર્યું, જેમાં 10 મિલિયનથી વધુ વાંચન મળ્યું, જેમાંથી 97.6% ગુણવત્તા નિયંત્રણમાંથી પસાર થયા. ત્યારબાદ BLASTN અને NCBI બાયવાલ્વ ડેટાબેઝ (આકૃતિ S1, પૂરક માહિતી) નો ઉપયોગ કરીને વાંચનને સ્વ અને બિન-સ્વ સ્ત્રોતો અનુસાર વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યું.
મનુષ્યોમાં, ન્યુક્લિયર અને મિટોકોન્ડ્રીયલ બંને ડીએનએ લોહીના પ્રવાહમાં મુક્ત થઈ શકે છે [38]. જોકે, હાલના અભ્યાસમાં, મસલ્સના ન્યુક્લિયર જીનોમિક ડીએનએનું વિગતવાર વર્ણન કરવું શક્ય નહોતું, કારણ કે એ. એટ્રા જીનોમનું ક્રમ અથવા વર્ણન કરવામાં આવ્યું નથી. જો કે, અમે બાયવલ્વ લાઇબ્રેરી (આકૃતિ S2, પૂરક માહિતી) નો ઉપયોગ કરીને આપણા પોતાના મૂળના સંખ્યાબંધ ccfDNA ટુકડાઓ ઓળખવામાં સક્ષમ હતા. અમે એ. એટ્રા જનીનોના નિર્દેશિત PCR એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા આપણા પોતાના મૂળના DNA ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ પણ કરી હતી જે ક્રમમાં હતા (આકૃતિ 3). તેવી જ રીતે, A. એટ્રાનો મિટોકોન્ડ્રીયલ જીનોમ જાહેર ડેટાબેઝમાં ઉપલબ્ધ હોવાથી, A. એટ્રાના હેમોલિમ્ફમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ccfDNA ટુકડાઓની હાજરી માટે પુરાવા શોધી શકાય છે. પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ DNA ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી (આકૃતિ 3).
A. atra (લાલ બિંદુઓ - સ્ટોક નંબર: SRX5705969) અને M. platensis (વાદળી બિંદુઓ - સ્ટોક નંબર: SRX5705968) ના હેમોલિમ્ફમાં વિવિધ મિટોકોન્ડ્રીયલ જનીનો હાજર હતા જે PCR દ્વારા વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા. બ્રેટોન એટ અલ., 2011 B માંથી અનુકૂલિત આકૃતિ A. atra માંથી હેમોલિમ્ફ સુપરનેટન્ટનું એમ્પ્લીફિકેશન FTA કાગળ પર સંગ્રહિત. PCR મિશ્રણ ધરાવતી PCR ટ્યુબમાં સીધા ઉમેરવા માટે 3 mm પંચનો ઉપયોગ કરો.
દરિયાઈ પાણીમાં વિપુલ પ્રમાણમાં માઇક્રોબાયલ સામગ્રીને જોતાં, અમે શરૂઆતમાં હેમોલિમ્ફમાં માઇક્રોબાયલ ડીએનએ સિક્વન્સના લાક્ષણિકતા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું. આ કરવા માટે, અમે બે અલગ અલગ વ્યૂહરચનાઓનો ઉપયોગ કરીએ છીએ. પ્રથમ વ્યૂહરચનામાં ક્રેકેન2 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જે એક અલ્ગોરિધમ-આધારિત સિક્વન્સ વર્ગીકરણ કાર્યક્રમ છે જે BLAST અને અન્ય સાધનો [28] ની તુલનામાં ચોકસાઈ સાથે માઇક્રોબાયલ સિક્વન્સ ઓળખી શકે છે. 6719 થી વધુ રીડ્સ બેક્ટેરિયલ મૂળના હોવાનું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે 124 અને 64 અનુક્રમે આર્ચીઆ અને વાયરસના હતા (આકૃતિ 4). સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં બેક્ટેરિયલ ડીએનએ ટુકડાઓ ફર્મિક્યુટ્સ (46%), પ્રોટીઓબેક્ટેરિયા (27%), અને બેક્ટેરોઇડેટ્સ (17%) (આકૃતિ 4a) હતા. આ વિતરણ દરિયાઈ વાદળી મસલ માઇક્રોબાયોમ [39, 40] ના અગાઉના અભ્યાસો સાથે સુસંગત છે. ગેમાપ્રોટીઓબેક્ટેરિયા પ્રોટીઓબેક્ટેરિયા (44%) નો મુખ્ય વર્ગ હતો, જેમાં ઘણા વિબ્રિઓનાલ્સ (આકૃતિ 4b)નો સમાવેશ થાય છે. ddPCR પદ્ધતિએ A. atra hemolymph (આકૃતિ 4c) [41] ના ccfDNA માં Vibrio DNA ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ કરી. ccfDNA ના બેક્ટેરિયલ મૂળ વિશે વધુ માહિતી મેળવવા માટે, એક વધારાનો અભિગમ અપનાવવામાં આવ્યો (આકૃતિ S2, પૂરક માહિતી). આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપ થયેલા રીડ્સને જોડી-અંત રીડ્સ તરીકે એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e−3 ના e મૂલ્ય અને >90% હોમોલોજી સાથે કટઓફનો ઉપયોગ કરીને સ્વ (દ્વિભાજક) અથવા બિન-સ્વ મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપ થયેલા રીડ્સને જોડી-અંત રીડ્સ તરીકે એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e−3 ના e મૂલ્ય અને >90% હોમોલોજી સાથે કટઓફનો ઉપયોગ કરીને સ્વ (દ્વિભાજક) અથવા બિન-સ્વ મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપિંગ રીડ્સને જોડી-સમાપ્ત રીડ્સ તરીકે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e-3 ના e મૂલ્ય અને 90% થી વધુ હોમોલોજી સાથે કટઓફનો ઉપયોગ કરીને મૂળ (બાયવલ્વ) અથવા બિન-મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 બ્લાસ્ટ 和 和1> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપિંગ રીડ્સને જોડી-સમાપ્ત રીડ્સ તરીકે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને e BLASTN અને 1e-3 મૂલ્યો અને હોમોલોજી થ્રેશોલ્ડ >90% નો ઉપયોગ કરીને પોતાના (બાયવલ્વ્સ) અથવા બિન-મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા.A. atra જીનોમ હજુ સુધી સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યો ન હોવાથી, અમે MEGAHIT નેક્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ (NGS) એસેમ્બલરની ડી નોવો એસેમ્બલી સ્ટ્રેટેજીનો ઉપયોગ કર્યો. કુલ 147,188 કોન્ટિગ્સને મૂળના આશ્રિત (બાયવલ્વ) તરીકે ઓળખવામાં આવ્યા છે. ત્યારબાદ BLASTN અને BLASTX નો ઉપયોગ કરીને 1e-10 ના e-મૂલ્યો સાથે આ કોન્ટિગ્સને વિસ્ફોટ કરવામાં આવ્યા હતા. આ વ્યૂહરચનાથી અમને A. atra ccfDNA માં હાજર 482 નોન-બાયવલ્વ ટુકડાઓ ઓળખવાની મંજૂરી મળી. આ DNA ટુકડાઓમાંથી અડધાથી વધુ (57%) બેક્ટેરિયામાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા, મુખ્યત્વે ગિલ સિમ્બિઓન્ટ્સમાંથી, જેમાં સલ્ફોટ્રોફિક સિમ્બિઓન્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે, અને ગિલ સિમ્બિઓન્ટ્સ સોલેમ્યા વેલમ (આકૃતિ 5) માંથી.
પ્રકાર સ્તરે સાપેક્ષ વિપુલતા. B બે મુખ્ય ફાયલા (ફર્મિક્યુટ્સ અને પ્રોટીઓબેક્ટેરિયા) ની સૂક્ષ્મજીવ વિવિધતા. ddPCR C વિબ્રિઓ spp નું પ્રતિનિધિત્વ પ્રવર્ધન. A. ત્રણ એટ્રા હેમોલિમ્ફમાં 16S rRNA જનીન (વાદળી) ના ટુકડાઓ.
કુલ 482 એકત્રિત કોન્ટિગ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. મેટાજેનોમિક કોન્ટિગ એનોટેશન (પ્રોકેરીયોટ્સ અને યુકેરીયોટ્સ) ના વર્ગીકરણ વિતરણની સામાન્ય પ્રોફાઇલ. B BLASTN અને BLASTX દ્વારા ઓળખાતા બેક્ટેરિયલ DNA ટુકડાઓનું વિગતવાર વિતરણ.
Kraken2 વિશ્લેષણમાં એ પણ દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે મસલ ccfDNA માં આર્કિયલ DNA ટુકડાઓ હતા, જેમાં Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) અને Thaurmarcheota (11%) ના DNA ટુકડાઓ શામેલ હતા (આકૃતિ 6a). કેલિફોર્નિયાના મસલ્સના માઇક્રોબાયલ સમુદાયમાં અગાઉ જોવા મળતા Euryarchaeota અને Crenarchaeota માંથી મેળવેલા DNA ટુકડાઓની હાજરી આશ્ચર્યજનક ન હોવી જોઈએ [42]. જોકે Euryarchaeota ઘણીવાર આત્યંતિક પરિસ્થિતિઓ સાથે સંકળાયેલું છે, હવે તે માન્યતા પ્રાપ્ત થઈ છે કે Euryarchaeota અને Crenarchaeota બંને દરિયાઈ ક્રાયોજેનિક વાતાવરણમાં સૌથી સામાન્ય પ્રોકેરીયોટ્સમાંના છે [43, 44]. કેર્ગ્યુલેન પ્લેટુ [45] પર તળિયાના લીકમાંથી વ્યાપક મિથેન લીક થવાના અને કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓના કિનારે જોવા મળતા સંભવિત માઇક્રોબાયલ મિથેન ઉત્પાદનના તાજેતરના અહેવાલોને ધ્યાનમાં રાખીને, મસલમાં મેથેનોજેનિક સુક્ષ્મસજીવોની હાજરી આશ્ચર્યજનક નથી [46].
ત્યારબાદ અમારું ધ્યાન ડીએનએ વાયરસના વાંચન તરફ ગયું. અમારી શ્રેષ્ઠ જાણકારી મુજબ, આ મસલ્સના વાયરસ સામગ્રીનો પ્રથમ ઓફ-ટાર્ગેટ અભ્યાસ છે. અપેક્ષા મુજબ, અમને બેક્ટેરિયોફેજ (કૌડોવિરાલ્સ) ના ડીએનએ ટુકડાઓ મળ્યા (આકૃતિ 6b). જોકે, સૌથી સામાન્ય વાયરલ ડીએનએ ન્યુક્લિયોસાયટોવાયરસના એક જૂથમાંથી આવે છે, જેને ન્યુક્લિયર સાયટોપ્લાઝમિક લાર્જ ડીએનએ વાયરસ (NCLDV) તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, જે કોઈપણ વાયરસનો સૌથી મોટો જીનોમ ધરાવે છે. આ જૂથમાં, મોટાભાગના ડીએનએ સિક્વન્સ મીમિમિડોવિરિડે (58%) અને પોક્સવિરિડે (21%) પરિવારોના છે, જેમના કુદરતી યજમાનોમાં કરોડઅસ્થિધારી પ્રાણીઓ અને આર્થ્રોપોડ્સનો સમાવેશ થાય છે, જ્યારે આ ડીએનએ સિક્વન્સનો એક નાનો હિસ્સો જાણીતા વાઇરોલોજિકલ શેવાળનો છે. દરિયાઈ યુકેરીયોટિક શેવાળને ચેપ લગાડે છે. આ જૂથો પેન્ડોરા વાયરસમાંથી પણ મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે કોઈપણ જાણીતા વાયરલ જાતિના સૌથી મોટા જીનોમ કદ ધરાવતો વિશાળ વાયરસ છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, હેમોલિમ્ફ ccfDNA સિક્વન્સિંગ દ્વારા નક્કી કરાયેલ વાયરસથી ચેપગ્રસ્ત હોવાનું જાણવા મળતા યજમાનોની શ્રેણી પ્રમાણમાં મોટી હતી (આકૃતિ S3, પૂરક માહિતી). તેમાં બેક્યુલોવિરિડે અને ઇરિડોવિરિડે જેવા જંતુઓને ચેપ લગાડતા વાયરસ તેમજ અમીબા, શેવાળ અને કરોડઅસ્થિધારી પ્રાણીઓને ચેપ લગાડતા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે. અમને પિથોવાયરસ સાઇબેરીકમ જીનોમ સાથે મેળ ખાતા સિક્વન્સ પણ મળ્યા. પિટોવાયરસ (જેને "ઝોમ્બી વાયરસ" તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) સૌપ્રથમ સાઇબિરીયામાં 30,000 વર્ષ જૂના પર્માફ્રોસ્ટમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા [47]. આમ, અમારા પરિણામો અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે જે દર્શાવે છે કે આ વાયરસની બધી આધુનિક પ્રજાતિઓ લુપ્ત થઈ નથી [48] અને આ વાયરસ દૂરના સબઆર્કટિક દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં હાજર હોઈ શકે છે.
છેલ્લે, અમે અન્ય બહુકોષીય પ્રાણીઓના DNA ટુકડાઓ શોધી શકીએ છીએ કે કેમ તે જોવા માટે પરીક્ષણ કર્યું. BLASTN અને BLASTX દ્વારા nt, nr અને RefSeq લાઇબ્રેરીઓ (જીનોમિક અને પ્રોટીન) સાથે કુલ 482 વિદેશી કોન્ટિગ ઓળખાયા. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે બહુકોષીય પ્રાણીઓના ccfDNA ના વિદેશી ટુકડાઓમાં હાડકાના હાડકાના DNA પ્રબળ છે (આકૃતિ 5). જંતુઓ અને અન્ય પ્રજાતિઓના DNA ટુકડાઓ પણ મળી આવ્યા છે. DNA ટુકડાઓનો પ્રમાણમાં મોટો ભાગ ઓળખવામાં આવ્યો નથી, સંભવતઃ પાર્થિવ પ્રજાતિઓની તુલનામાં જીનોમિક ડેટાબેઝમાં મોટી સંખ્યામાં દરિયાઈ પ્રજાતિઓના ઓછા પ્રતિનિધિત્વને કારણે [49].
આ પેપરમાં, અમે મસલ પર LB ખ્યાલ લાગુ કરીએ છીએ, એવી દલીલ કરીએ છીએ કે હેમોલિમ્ફ ccfDNA શોટ સિક્વન્સિંગ દરિયાઇ દરિયાકાંઠાના ઇકોસિસ્ટમ્સની રચનામાં સમજ આપી શકે છે. ખાસ કરીને, અમે જોયું કે 1) મસલ હેમોલિમ્ફમાં પ્રમાણમાં મોટા (~1-5 kb) ફરતા DNA ટુકડાઓની પ્રમાણમાં ઊંચી સાંદ્રતા (માઇક્રોગ્રામ સ્તર) હોય છે; 2) આ DNA ટુકડાઓ સ્વતંત્ર અને બિન-સ્વતંત્ર બંને છે 3) આ DNA ટુકડાઓના વિદેશી સ્ત્રોતોમાં, અમને બેક્ટેરિયલ, આર્કિયલ અને વાયરલ DNA, તેમજ અન્ય બહુકોષીય પ્રાણીઓના DNA મળ્યા; 4) હેમોલિમ્ફમાં આ વિદેશી ccfDNA ટુકડાઓનું સંચય ઝડપથી થાય છે અને મસલની આંતરિક ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિમાં ફાળો આપે છે. નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે LB ની વિભાવના, જે અત્યાર સુધી મુખ્યત્વે બાયોમેડિસિનના ક્ષેત્રમાં લાગુ કરવામાં આવી છે, તે જ્ઞાનના સમૃદ્ધ પરંતુ અન્વેષિત સ્ત્રોતને એન્કોડ કરે છે જેનો ઉપયોગ સેન્ટિનલ પ્રજાતિઓ અને તેમના પર્યાવરણ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે થઈ શકે છે.
પ્રાઈમેટ્સ ઉપરાંત, ઉંદર, કૂતરા, બિલાડી અને ઘોડા સહિત સસ્તન પ્રાણીઓમાં ccfDNA અલગતા નોંધાઈ છે [50, 51, 52]. જો કે, અમારા જ્ઞાન મુજબ, અમારો અભ્યાસ ખુલ્લા પરિભ્રમણ પ્રણાલી ધરાવતી દરિયાઈ પ્રજાતિઓમાં ccfDNA ની શોધ અને ક્રમની જાણ કરનારો પહેલો અભ્યાસ છે. છીપવાળી માછલીઓની આ શરીરરચનાત્મક વિશેષતા અને ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા, ઓછામાં ઓછા આંશિક રીતે, અન્ય પ્રજાતિઓની તુલનામાં ફરતા DNA ટુકડાઓના વિવિધ કદના લક્ષણો સમજાવી શકે છે. મનુષ્યોમાં, લોહીમાં ફરતા મોટાભાગના DNA ટુકડાઓ 150 થી 200 bp સુધીના કદના નાના ટુકડાઓ છે. મહત્તમ ટોચ 167 bp [34, 53] સાથે. DNA ટુકડાઓનો એક નાનો પણ નોંધપાત્ર ભાગ 300 થી 500 bp કદમાં હોય છે, અને લગભગ 5% 900 bp કરતા લાંબા હોય છે. [54]. આ કદ વિતરણનું કારણ એ છે કે પ્લાઝ્મામાં ccfDNA નો મુખ્ય સ્ત્રોત કોષ મૃત્યુના પરિણામે થાય છે, કાં તો કોષ મૃત્યુને કારણે અથવા સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં ફરતા હેમેટોપોએટીક કોષોના નેક્રોસિસને કારણે અથવા કેન્સરના દર્દીઓમાં ગાંઠ કોષોના એપોપ્ટોસિસને કારણે (જેને ફરતા ગાંઠ DNA તરીકે ઓળખવામાં આવે છે). , ctDNA). છીપવાળી માછલીઓમાં અમને મળેલા હેમોલિમ્ફ ccfDNA નું કદ વિતરણ 1000 થી 5000 bp સુધીનું હતું, જે સૂચવે છે કે છીપવાળી માછલીઓમાં ccfDNA નું મૂળ અલગ છે. આ એક તાર્કિક પૂર્વધારણા છે, કારણ કે છીપવાળી માછલીઓમાં અર્ધ-ખુલ્લી વેસ્ક્યુલર સિસ્ટમ હોય છે અને તે માઇક્રોબાયલ જીનોમિક DNA ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા ધરાવતા દરિયાઈ જળચર વાતાવરણમાં રહે છે. હકીકતમાં, બાહ્ય DNA નો ઉપયોગ કરતા અમારા પ્રયોગશાળા પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું છે કે છીપવાળી માછલીઓ દરિયાઈ પાણીમાં DNA ટુકડાઓ એકઠા કરે છે, ઓછામાં ઓછા થોડા કલાકો પછી તેઓ સેલ્યુલર શોષણ પછી અને/અથવા મુક્ત થયા પછી અને/અથવા વિવિધ સંગઠનોમાં સંગ્રહિત થયા પછી ડિગ્રેડ થાય છે. કોષો (પ્રોકેરીયોટિક અને યુકેરીયોટિક બંને) ની દુર્લભતાને ધ્યાનમાં રાખીને, ઇન્ટ્રાવાલ્વ્યુલર કમ્પાર્ટમેન્ટનો ઉપયોગ સ્વ-સ્ત્રોતો તેમજ વિદેશી સ્ત્રોતોમાંથી ccfDNA ની માત્રા ઘટાડશે. બાયવલ્વ જન્મજાત રોગપ્રતિકારક શક્તિ અને મોટી સંખ્યામાં ફરતા ફેગોસાઇટ્સના મહત્વને ધ્યાનમાં લેતા, અમે આગળ અનુમાન લગાવ્યું કે વિદેશી ccfDNA પણ ફરતા ફેગોસાઇટ્સમાં સમૃદ્ધ થાય છે જે સુક્ષ્મસજીવો અને/અથવા સેલ્યુલર કચરાના ઇન્જેશન પર વિદેશી DNA એકઠા કરે છે. એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે બાયવલ્વ હેમોલિમ્ફ ccfDNA એ પરમાણુ માહિતીનો એક અનોખો ભંડાર છે અને સેન્ટિનલ પ્રજાતિ તરીકે તેમની સ્થિતિને મજબૂત બનાવે છે.
અમારા ડેટા સૂચવે છે કે બેક્ટેરિયાથી મેળવેલા હેમોલિમ્ફ ccfDNA ટુકડાઓનું સિક્વન્સિંગ અને વિશ્લેષણ યજમાન બેક્ટેરિયલ ફ્લોરા અને આસપાસના દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં હાજર બેક્ટેરિયા વિશે મુખ્ય માહિતી પ્રદાન કરી શકે છે. શોટ સિક્વન્સિંગ તકનીકોએ કોમેન્સલ બેક્ટેરિયા A. એટ્રા ગિલના સિક્વન્સ જાહેર કર્યા છે જે જો પરંપરાગત 16S rRNA ઓળખ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હોત તો ચૂકી ગયા હોત, જે અંશતઃ સંદર્ભ પુસ્તકાલય પૂર્વગ્રહને કારણે હતું. હકીકતમાં, કેર્ગ્યુલેન ખાતે સમાન મસલ સ્તરમાં M. પ્લેટેન્સિસમાંથી એકત્રિત કરવામાં આવેલા LB ડેટાનો ઉપયોગ દર્શાવે છે કે ગિલ-સંકળાયેલ બેક્ટેરિયલ સિમ્બિઓન્ટ્સની રચના બંને મસલ પ્રજાતિઓ માટે સમાન હતી (આકૃતિ S4, પૂરક માહિતી). બે આનુવંશિક રીતે અલગ મસલની આ સમાનતા કેર્ગ્યુલેનના ઠંડા, સલ્ફર અને જ્વાળામુખીના ભંડારમાં બેક્ટેરિયલ સમુદાયોની રચનાને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે [55, 56, 57, 58]. બાયોટર્બેટેડ દરિયાકાંઠાના વિસ્તારો [59], જેમ કે પોર્ટ-ઓ-ફ્રાન્સના દરિયાકાંઠામાંથી મસલ લણણી કરતી વખતે સલ્ફર-ઘટાડતા સુક્ષ્મસજીવોના ઉચ્ચ સ્તરનું સારી રીતે વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે. બીજી શક્યતા એ છે કે કોમેન્સલ મસલ ફ્લોરા આડી ટ્રાન્સમિશન [60, 61] દ્વારા પ્રભાવિત થઈ શકે છે. દરિયાઈ પર્યાવરણ, દરિયાઈ સપાટી અને મસલ્સમાં સહજીવન બેક્ટેરિયાની રચના વચ્ચેના સંબંધને નક્કી કરવા માટે વધુ સંશોધનની જરૂર છે. આ અભ્યાસો હાલમાં ચાલુ છે.
દરિયાઈ દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે મસલ ccfDNA નો ઉપયોગ કરવાના ઘણા ફાયદાઓમાં હેમોલિમ્ફ ccfDNA ની લંબાઈ અને સાંદ્રતા, તેની શુદ્ધિકરણની સરળતા અને ઝડપી શોટગન સિક્વન્સિંગને મંજૂરી આપવા માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તા એ છે. આ અભિગમ આપેલ ઇકોસિસ્ટમમાં વાયરલ સમુદાયો (વાયરોમ્સ) ને લાક્ષણિકતા આપવા માટે ખાસ કરીને અસરકારક છે [62, 63]. બેક્ટેરિયા, આર્ચીઆ અને યુકેરીયોટ્સથી વિપરીત, વાયરલ જીનોમમાં 16S સિક્વન્સ જેવા ફાયલોજેનેટિકલી સંરક્ષિત જનીનો હોતા નથી. અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે મસલ જેવી સૂચક પ્રજાતિઓમાંથી પ્રવાહી બાયોપ્સીનો ઉપયોગ દરિયાકાંઠાના દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં રહેતા યજમાનોને ચેપ લગાડવા માટે જાણીતા પ્રમાણમાં મોટી સંખ્યામાં ccfDNA વાયરસ ટુકડાઓને ઓળખવા માટે થઈ શકે છે. આમાં પ્રોટોઝોઆ, આર્થ્રોપોડ્સ, જંતુઓ, છોડ અને બેક્ટેરિયલ વાયરસ (દા.ત., બેક્ટેરિયોફેજ) ને ચેપ લગાડવા માટે જાણીતા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે અમે કેર્ગ્યુલેન (કોષ્ટક S2, પૂરક માહિતી) ખાતે સમાન મસલ સ્તરમાં એકત્રિત વાદળી મસલ (એમ. પ્લેટેન્સિસ) ના હેમોલિમ્ફ ccfDNA વાયરસની તપાસ કરી ત્યારે સમાન વિતરણ જોવા મળ્યું (કોષ્ટક S2, પૂરક માહિતી). ccfDNA નું શોટગન સિક્વન્સિંગ ખરેખર એક નવો અભિગમ છે જે માનવીઓ અથવા અન્ય પ્રજાતિઓના વિરોમના અભ્યાસમાં ગતિ પકડી રહ્યો છે [21, 37, 64]. આ અભિગમ ખાસ કરીને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA વાયરસના અભ્યાસ માટે ઉપયોગી છે, કારણ કે બાલ્ટીમોરમાં વાયરસના સૌથી વૈવિધ્યસભર અને વ્યાપક વર્ગનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા બધા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA વાયરસમાં કોઈ એક જનીન સાચવવામાં આવતું નથી [65]. જોકે આમાંના મોટાભાગના વાયરસ અવર્ગીકૃત રહે છે અને તેમાં વાયરલ વિશ્વના સંપૂર્ણપણે અજાણ્યા ભાગના વાયરસ શામેલ હોઈ શકે છે [66], અમે જોયું કે મસલ A. atra અને M. platensis ના વિરોમ્સ અને યજમાન શ્રેણીઓ બે પ્રજાતિઓ વચ્ચે આવે છે. એ જ રીતે (આકૃતિ S3, વધારાની માહિતી જુઓ). આ સમાનતા આશ્ચર્યજનક નથી, કારણ કે તે પર્યાવરણમાં હાજર DNA ના શોષણમાં પસંદગીના અભાવને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે. RNA વિરોમને લાક્ષણિકતા આપવા માટે શુદ્ધ RNA નો ઉપયોગ કરીને ભવિષ્યના અભ્યાસોની હાલમાં જરૂર છે.
અમારા અભ્યાસમાં, અમે કોવાર્સ્કી અને તેમના સાથીદારો [37] ના કાર્યમાંથી અપનાવવામાં આવેલી ખૂબ જ સખત પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કર્યો, જેમણે મૂળ ccfDNA ના એસેમ્બલી પહેલા અને પછી પૂલ્ડ રીડ્સ અને કોન્ટિગ્સના બે-પગલાં કાઢી નાખવાનો ઉપયોગ કર્યો, જેના પરિણામે અનમેપ્ડ રીડ્સનું પ્રમાણ ઊંચું થયું. તેથી, અમે નકારી શકતા નથી કે આ અનમેપ્ડ રીડ્સમાંથી કેટલાક હજુ પણ તેમના પોતાના મૂળ હોઈ શકે છે, મુખ્યત્વે કારણ કે અમારી પાસે આ મસલ પ્રજાતિ માટે સંદર્ભ જીનોમ નથી. અમે આ પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ પણ કર્યો કારણ કે અમે સ્વ અને બિન-સ્વ-રીડ્સ વચ્ચેના કાઇમરા અને ઇલુમિના MiSeq PE75 દ્વારા ઉત્પન્ન થતી રીડ લંબાઈ વિશે ચિંતિત હતા. મોટાભાગના અનચાર્ટેડ રીડિંગ્સનું બીજું કારણ એ છે કે મોટાભાગના દરિયાઈ સૂક્ષ્મજીવાણુઓ, ખાસ કરીને કેર્ગ્યુલેન જેવા દૂરના વિસ્તારોમાં, ટીકા કરવામાં આવી નથી. અમે ઇલુમિના MiSeq PE75 નો ઉપયોગ કર્યો, એમ ધારીને કે ccfDNA ટુકડાની લંબાઈ માનવ ccfDNA જેવી જ છે. ભવિષ્યના અભ્યાસો માટે, અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે હેમોલિમ્ફ ccfDNA માનવો અને/અથવા સસ્તન પ્રાણીઓ કરતાં વધુ લાંબો વાંચન ધરાવે છે, અમે લાંબા ccfDNA ટુકડાઓ માટે વધુ યોગ્ય સિક્વન્સિંગ પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરીએ છીએ. આ પ્રથા ઊંડા વિશ્લેષણ માટે વધુ સંકેતો ઓળખવાનું ખૂબ સરળ બનાવશે. હાલમાં અનુપલબ્ધ સંપૂર્ણ A. atra ન્યુક્લિયર જીનોમ સિક્વન્સ મેળવવાથી સ્વ અને બિન-સ્વ સ્ત્રોતોમાંથી ccfDNA ના ભેદભાવને પણ મોટા પ્રમાણમાં સરળ બનાવશે. અમારા સંશોધને પ્રવાહી બાયોપ્સીની વિભાવનાને મસલ પર લાગુ કરવાની શક્યતા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે તે જોતાં, અમે આશા રાખીએ છીએ કે ભવિષ્યના સંશોધનમાં આ ખ્યાલનો ઉપયોગ કરવામાં આવશે, મસલની માઇક્રોબાયલ વિવિધતાનો અભ્યાસ કરવા માટે આ પદ્ધતિની સંભાવના વધારવા માટે નવા સાધનો અને પાઇપલાઇન્સ વિકસાવવામાં આવશે. દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમ.
બિન-આક્રમક ક્લિનિકલ બાયોમાર્કર તરીકે, ccfDNA ના વધેલા માનવ પ્લાઝ્મા સ્તરો વિવિધ રોગો, પેશીઓને નુકસાન અને તાણની સ્થિતિઓ સાથે સંકળાયેલા છે [67,68,69]. આ વધારો પેશીઓને નુકસાન પછી તેના પોતાના મૂળના DNA ટુકડાઓના પ્રકાશન સાથે સંકળાયેલ છે. અમે તીવ્ર ગરમીના તાણનો ઉપયોગ કરીને આ મુદ્દાને સંબોધિત કર્યો, જેમાં છીપવાળી માછલીઓને થોડા સમય માટે 30 °C તાપમાનના સંપર્કમાં લાવવામાં આવ્યા હતા. અમે ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં ત્રણ અલગ અલગ પ્રકારના છીપવાળી માછલીઓ પર આ વિશ્લેષણ કર્યું. જો કે, તીવ્ર ગરમીના તાણ પછી અમને ccfDNA સ્તરમાં કોઈ ફેરફાર જોવા મળ્યો નથી (આકૃતિ S5, વધારાની માહિતી જુઓ). આ શોધ ઓછામાં ઓછા આંશિક રીતે, એ હકીકતને સમજાવી શકે છે કે છીપવાળી માછલીઓમાં અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ તંત્ર હોય છે અને તેમની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિને કારણે મોટી માત્રામાં વિદેશી DNA એકઠા કરે છે. બીજી બાજુ, ઘણા અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓની જેમ, છીપવાળી માછલીઓ તાણ-પ્રેરિત પેશીઓના નુકસાન માટે વધુ પ્રતિરોધક હોઈ શકે છે, જેનાથી તેમના હેમોલિમ્ફમાં ccfDNA ના પ્રકાશનને મર્યાદિત કરવામાં આવે છે [70, 71].
આજ સુધી, જળચર ઇકોસિસ્ટમ્સમાં જૈવવિવિધતાના DNA વિશ્લેષણ મુખ્યત્વે પર્યાવરણીય DNA (eDNA) મેટાબારકોડિંગ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે. જો કે, જ્યારે પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે ત્યારે જૈવવિવિધતા વિશ્લેષણમાં આ પદ્ધતિ સામાન્ય રીતે મર્યાદિત હોય છે. શોટગન સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ PCR ની મર્યાદાઓ અને પ્રાઇમર સેટની પક્ષપાતી પસંદગીને ટાળે છે. આમ, એક અર્થમાં, અમારી પદ્ધતિ તાજેતરમાં ઉપયોગમાં લેવાતી હાઇ-થ્રુપુટ eDNA શોટગન સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિની નજીક છે, જે ખંડિત DNA ને સીધી રીતે ક્રમ આપવા અને લગભગ તમામ સજીવોનું વિશ્લેષણ કરવા સક્ષમ છે [72, 73]. જો કે, ઘણા મૂળભૂત મુદ્દાઓ છે જે LB ને પ્રમાણભૂત eDNA પદ્ધતિઓથી અલગ પાડે છે. અલબત્ત, eDNA અને LB વચ્ચેનો મુખ્ય તફાવત કુદરતી ફિલ્ટર હોસ્ટનો ઉપયોગ છે. eDNA નો અભ્યાસ કરવા માટે કુદરતી ફિલ્ટર તરીકે સ્પોન્જ અને બાયવાલ્વ્સ (ડ્રેસીના spp.) જેવી દરિયાઈ પ્રજાતિઓનો ઉપયોગ નોંધવામાં આવ્યો છે [74, 75]. જો કે, ડ્રેઇસેનાના અભ્યાસમાં ટીશ્યુ બાયોપ્સીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો જેમાંથી DNA કાઢવામાં આવ્યો હતો. LB માંથી ccfDNA ના વિશ્લેષણ માટે eDNA અથવા ટીશ્યુ બાયોપ્સી સાથે સંકળાયેલ ટીશ્યુ બાયોપ્સી, વિશિષ્ટ અને ક્યારેક ખર્ચાળ સાધનો અને લોજિસ્ટિક્સની જરૂર નથી. હકીકતમાં, અમે તાજેતરમાં અહેવાલ આપ્યો છે કે LB માંથી ccfDNA ને FTA સપોર્ટ સાથે સંગ્રહિત અને વિશ્લેષણ કરી શકાય છે, કોલ્ડ ચેઇન જાળવી રાખ્યા વિના, જે દૂરના વિસ્તારોમાં સંશોધન માટે એક મોટો પડકાર છે [76]. પ્રવાહી બાયોપ્સીમાંથી ccfDNA નું નિષ્કર્ષણ પણ સરળ છે અને શોટગન સિક્વન્સિંગ અને PCR વિશ્લેષણ માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા DNA પ્રદાન કરે છે. eDNA વિશ્લેષણ સાથે સંકળાયેલી કેટલીક તકનીકી મર્યાદાઓને ધ્યાનમાં રાખીને આ એક મોટો ફાયદો છે [77]. નમૂના પદ્ધતિની સરળતા અને ઓછી કિંમત લાંબા ગાળાના દેખરેખ કાર્યક્રમો માટે પણ ખાસ કરીને યોગ્ય છે. તેમની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા ઉપરાંત, બાયવાલ્વ્સનું બીજું જાણીતું લક્ષણ તેમના લાળની રાસાયણિક મ્યુકોપોલિસેકરાઇડ રચના છે, જે વાયરસના શોષણને પ્રોત્સાહન આપે છે [78, 79]. આ બાયવાલ્વ્સને આપેલ જળચર ઇકોસિસ્ટમમાં જૈવવિવિધતા અને આબોહવા પરિવર્તનની અસરને દર્શાવવા માટે એક આદર્શ કુદરતી ફિલ્ટર બનાવે છે. જોકે યજમાન-વ્યુત્પન્ન DNA ટુકડાઓની હાજરી eDNA ની તુલનામાં પદ્ધતિની મર્યાદા તરીકે જોઈ શકાય છે, eDNA ની તુલનામાં આવા મૂળ ccfDNA રાખવા સાથે સંકળાયેલ ખર્ચ એક સાથે સમજી શકાય છે કારણ કે આરોગ્ય અભ્યાસ માટે ઉપલબ્ધ વિશાળ માહિતીનો જથ્થો છે. ઓફસેટ હોસ્ટ. આમાં યજમાન હોસ્ટના જીનોમમાં સંકલિત વાયરલ સિક્વન્સની હાજરી શામેલ છે. બાયવાલ્વ્સમાં આડા ટ્રાન્સમિટેડ લ્યુકેમિક રેટ્રોવાયરસની હાજરીને ધ્યાનમાં રાખીને, મસલ ​​માટે આ ખાસ કરીને મહત્વપૂર્ણ છે [80, 81]. eDNA કરતાં LB નો બીજો ફાયદો એ છે કે તે હેમોલિમ્ફમાં ફરતા રક્ત કોષોની ફેગોસાયટીક પ્રવૃત્તિનો ઉપયોગ કરે છે, જે સુક્ષ્મસજીવો (અને તેમના જીનોમ) ને ઘેરી લે છે. બાયવાલ્વમાં રક્ત કોષોનું મુખ્ય કાર્ય ફેગોસાયટોસિસ છે [82]. છેલ્લે, પદ્ધતિ મસલની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા (સરેરાશ 1.5 l/h દરિયાઈ પાણી) અને બે-દિવસીય પરિભ્રમણનો લાભ લે છે, જે દરિયાઈ પાણીના વિવિધ સ્તરોના મિશ્રણમાં વધારો કરે છે, જે હેટરોલોગસ eDNA ને કેપ્ચર કરવાની મંજૂરી આપે છે. [83, 84]. આમ, મસલ ​​ccfDNA વિશ્લેષણ એ એક રસપ્રદ માર્ગ છે જે છીપવાળી માછલીઓના પોષક, આર્થિક અને પર્યાવરણીય પ્રભાવોને ધ્યાનમાં રાખીને બનાવવામાં આવે છે. માનવીઓ પાસેથી એકત્રિત કરવામાં આવેલા LB ના વિશ્લેષણની જેમ, આ પદ્ધતિ બાહ્ય પદાર્થોના પ્રતિભાવમાં યજમાન DNA માં આનુવંશિક અને એપિજેનેટિક ફેરફારોને માપવાની શક્યતા પણ ખોલે છે. ઉદાહરણ તરીકે, નેનોપોર સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને મૂળ ccfDNA માં જીનોમ-વ્યાપી મેથિલેશન વિશ્લેષણ કરવા માટે ત્રીજી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકોની કલ્પના કરી શકાય છે. આ પ્રક્રિયાને એ હકીકત દ્વારા સરળ બનાવવી જોઈએ કે મસલ ccfDNA ટુકડાઓની લંબાઈ લાંબા-વાંચિત સિક્વન્સિંગ પ્લેટફોર્મ સાથે આદર્શ રીતે સુસંગત છે જે રાસાયણિક પરિવર્તનની જરૂરિયાત વિના એક જ સિક્વન્સિંગમાંથી જીનોમ-વ્યાપી DNA મેથિલેશન વિશ્લેષણ ચલાવવાની મંજૂરી આપે છે.85,86] આ એક રસપ્રદ શક્યતા છે, કારણ કે એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે DNA મેથિલેશન પેટર્ન પર્યાવરણીય તાણના પ્રતિભાવને પ્રતિબિંબિત કરે છે અને ઘણી પેઢીઓ સુધી ચાલુ રહે છે. તેથી, તે આબોહવા પરિવર્તન અથવા પ્રદૂષકોના સંપર્કમાં આવ્યા પછી પ્રતિભાવને સંચાલિત કરતી અંતર્ગત પદ્ધતિઓમાં મૂલ્યવાન સમજ પ્રદાન કરી શકે છે [87]. જો કે, LB નો ઉપયોગ મર્યાદાઓ વિના નથી. કહેવાની જરૂર નથી, આ માટે ઇકોસિસ્ટમમાં સૂચક પ્રજાતિઓની હાજરી જરૂરી છે. ઉપર જણાવ્યા મુજબ, આપેલ ઇકોસિસ્ટમની જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે LB નો ઉપયોગ કરવા માટે એક સખત બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇનની પણ જરૂર પડે છે જે સ્ત્રોતમાંથી DNA ટુકડાઓની હાજરીને ધ્યાનમાં લે છે. બીજી મોટી સમસ્યા દરિયાઈ પ્રજાતિઓ માટે સંદર્ભ જીનોમની ઉપલબ્ધતા છે. એવી આશા છે કે મરીન મેમલ જીનોમ્સ પ્રોજેક્ટ અને તાજેતરમાં સ્થાપિત Fish10k પ્રોજેક્ટ [88] જેવી પહેલ ભવિષ્યમાં આવા વિશ્લેષણને સરળ બનાવશે. દરિયાઈ ફિલ્ટર-ફીડિંગ સજીવોમાં LB ખ્યાલનો ઉપયોગ સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજીમાં નવીનતમ પ્રગતિ સાથે પણ સુસંગત છે, જે પર્યાવરણીય તાણના પ્રતિભાવમાં દરિયાઈ નિવાસસ્થાનોના સ્વાસ્થ્ય વિશે મહત્વપૂર્ણ માહિતી પ્રદાન કરવા માટે મલ્ટિ-ઓહ્મ બાયોમાર્કર્સના વિકાસ માટે તેને યોગ્ય બનાવે છે.
જીનોમ સિક્વન્સિંગ ડેટા NCBI સિક્વન્સ રીડ આર્કાઇવ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 માં બાયોપ્રોજેક્ટ્સ SRR8924808 હેઠળ જમા કરવામાં આવ્યો છે.
બ્રિઅરલી એએસ, કિંગ્સફોર્ડ એમજે દરિયાઈ જીવન અને ઇકોસિસ્ટમ પર આબોહવા પરિવર્તનની અસર. કોલ બાયોલોજી. 2009; 19: P602–P614.
ગિસી ઇ, માનેઆ ઇ, મઝારિસ એડી, ફ્રેશેટ્ટી એસ, આલ્મ્પાનીડોઉ વી, બેવિલાક્વા એસ, વગેરે. દરિયાઇ પર્યાવરણ પર આબોહવા પરિવર્તન અને અન્ય સ્થાનિક તાણના સંયુક્ત પ્રભાવોને ધ્યાનમાં લો. સામાન્ય વૈજ્ઞાનિક પર્યાવરણ. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). પ્રથમ માર્ચનું વિજ્ઞાન. 2020; 7:48.
સેરોન્ટ એલ, નિકાસ્ટ્રો સીઆર, ઝાર્ડી જીઆઈ, ગોબરવિલે ઇ. પુનરાવર્તિત ગરમીના તણાવની સ્થિતિમાં ગરમી સહનશીલતામાં ઘટાડો વાદળી મસલ્સના ઉનાળાના ઉચ્ચ મૃત્યુદરને સમજાવે છે. વૈજ્ઞાનિક અહેવાલ 2019; 9:17498.
ફે એસબી, સીપીએલસ્કી એએમ, નુસ્લે એસ, સર્વાન્ટેસ-યોશિદા કે, હવાન જેએલ, હ્યુબર ઇઆર, વગેરે. પ્રાણીઓના મૃત્યુની આવર્તન, કારણો અને હદમાં તાજેતરના ફેરફારો. પ્રોક નેટ્લ એકેડ સાયન્સ યુએસએ. 2015;112:1083-8.
સ્કાર્પા એફ, સન્ના ડી, અઝેના I, મુગેટી ડી, સેરુટી એફ, હોસેની એસ, એટ અલ. બહુવિધ બિન-જાતિ-વિશિષ્ટ પેથોજેન્સ પિન્ના નોબિલિસના સામૂહિક મૃત્યુનું કારણ બની શકે છે. જીવન. 2020; 10:238.
બ્રેડલી એમ, કાઉટ્સ એસજે, જેનકિન્સ ઇ, ઓ'હારા ટીએમ. આર્કટિક ઝૂનોટિક રોગો પર આબોહવા પરિવર્તનની સંભવિત અસર. ઇન્ટ જે સર્કમ્પોલર હેલ્થ. 2005; 64:468–77.
બેયર જે., ગ્રીન એનડબ્લ્યુ, બ્રુક્સ એસ., એલન આઈજે, રુસ એ., ગોમેઝ ટી. વગેરે. દરિયાકાંઠાના પ્રદૂષણ દેખરેખમાં સિગ્નલ સજીવ તરીકે વાદળી મસલ્સ (માયટીલસ એડ્યુલિસ એસપીપી.): એક સમીક્ષા. માર્ચ એન્વાયરન રેસ 2017; 130:338-65.
સિરાવેગ્ના જી, માર્સોની એસ, સિએના એસ, બાર્ડેલી એ. કેન્સર સારવારમાં પ્રવાહી બાયોપ્સીનું એકીકરણ. નેટ રેવ ક્લીન ઓન્કોલ. 2017; 14:531–48.
વાન જેસીએમ, મેસી સી, ​​ગાર્સિયા-કોર્બાચો જે, મૌલીયર એફ, બ્રેન્ટન જેડી, કેલ્ડાસ સી, વગેરે. લિક્વિડ બાયોપ્સી પરિપક્વતા: ગાંઠ ડીએનએને પરિભ્રમણ કરવાની મંજૂરી આપે છે. નેટ રેવ કેન્સર. 2017;17:223–38.
મેન્ડેલ પી., મેટાઈસ પી. માનવ પ્લાઝ્મામાં ન્યુક્લિક એસિડ્સ. સોક બાયોલ પેટાકંપનીઓની મીટિંગ મિનિટ્સ. 1948; 142:241-3.
બ્રોન્કોર્સ્ટ એજે, ઉંગેરર ડબલ્યુ, હોલ્ડનરીડર એસ. કેન્સરની સારવાર માટે મોલેક્યુલર માર્કર તરીકે કોષ-મુક્ત ડીએનએ માટે એક નવી ભૂમિકા. બાયોમોલર વિશ્લેષણનું પ્રમાણીકરણ. 2019;17:100087.
ઇગ્નાટીઆડિસ એમ., સ્લેજ જીડબ્લ્યુ, જેફરી એસએસ લિક્વિડ બાયોપ્સી ક્લિનિકમાં પ્રવેશ કરે છે - અમલીકરણના મુદ્દાઓ અને ભવિષ્યના પડકારો. નેટ રેવ ક્લિન ઓન્કોલ. 2021; 18:297–312.
લો વાયએમ, કોર્બેટા એન., ચેમ્બરલેન પીએફ, રાય ડબલ્યુ., સાર્જન્ટ આઈએલ, રેડમેન સીડબ્લ્યુ અને અન્ય. ગર્ભ ડીએનએ માતાના પ્લાઝ્મા અને સીરમમાં હાજર હોય છે. લેન્સેટ. 1997; 350:485-7.
મુફારે એમએન, વોંગ આરજે, શો જીએમ, સ્ટીવનસન ડીકે, ક્વેક એસઆર ગર્ભાવસ્થા દરમિયાન સ્ત્રીઓના લોહીમાં ફરતા બાહ્યકોષીય આરએનએનો ઉપયોગ કરીને ગર્ભાવસ્થાના કોર્સ અને તેની ગૂંચવણોનો અભ્યાસ. ડોપીડિયાટ્રિક્સ. 2020;8:605219.
ઓલેરિચ એમ, શેરવુડ કે, કેઓન પી, શુટ્ઝ ઇ, બેક જે, સ્ટેગબાઉર જે, વગેરે. લિક્વિડ બાયોપ્સી: કિડની ગ્રાફ્ટમાં એલોજેનિક જખમ શોધવા માટે ડોનર સેલ-ફ્રી ડીએનએનો ઉપયોગ થાય છે. નેટ રેવ નેફ્રોલ. 2021; 17:591–603.
જુઆન એફસી, લો વાયએમ પ્રિનેટલ ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં નવીનતાઓ: માતૃત્વ પ્લાઝ્મા જીનોમ સિક્વન્સિંગ. અન્ના એમડી. 2016;67:419-32.
ગુ ડબલ્યુ, ડેંગ એક્સ, લી એમ, સુકુ વાયડી, અરેવાલો એસ, સ્ટ્રાઇક ડી, વગેરે. ચેપગ્રસ્ત શારીરિક પ્રવાહીના આગામી પેઢીના મેટાજેનોમિક સિક્વન્સિંગ સાથે ઝડપી રોગકારક શોધ. નેટ મેડિસિન. 2021;27:115-24.