Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Sinh thiết dịch thể (Liquid biopsy - LB) là một khái niệm đang nhanh chóng trở nên phổ biến trong lĩnh vực y sinh học. Khái niệm này chủ yếu dựa trên việc phát hiện các mảnh DNA ngoại bào lưu hành (ccfDNA), chủ yếu được giải phóng dưới dạng các mảnh nhỏ sau khi tế bào chết trong các mô khác nhau. Một phần nhỏ các mảnh này có nguồn gốc từ các mô hoặc sinh vật ngoại lai. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã áp dụng khái niệm này cho loài trai, một loài chỉ thị nổi tiếng với khả năng lọc nước biển cao. Chúng tôi sử dụng khả năng của trai hoạt động như những bộ lọc tự nhiên để thu giữ các mảnh DNA môi trường từ nhiều nguồn khác nhau nhằm cung cấp thông tin về đa dạng sinh học của hệ sinh thái ven biển. Kết quả của chúng tôi cho thấy dịch máu của trai chứa các mảnh DNA có kích thước rất khác nhau, từ 1 đến 5 kb. Giải trình tự shotgun cho thấy một số lượng lớn các mảnh DNA có nguồn gốc vi sinh vật ngoại lai. Trong số đó, chúng tôi tìm thấy các mảnh DNA từ vi khuẩn, vi sinh vật cổ và virus, bao gồm cả các virus được biết là lây nhiễm nhiều vật chủ thường thấy trong hệ sinh thái biển ven bờ. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB được áp dụng cho trai là một nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá về sự đa dạng vi sinh vật trong hệ sinh thái ven biển.
Tác động của biến đổi khí hậu (CC) đến đa dạng sinh học của hệ sinh thái biển là một lĩnh vực nghiên cứu đang phát triển nhanh chóng. Sự nóng lên toàn cầu không chỉ gây ra những căng thẳng sinh lý quan trọng mà còn đẩy giới hạn tiến hóa về khả năng chịu nhiệt của các sinh vật biển, ảnh hưởng đến môi trường sống của một số loài, khiến chúng phải tìm kiếm những điều kiện thuận lợi hơn [1, 2]. Ngoài việc ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của động vật đa bào, CC còn phá vỡ sự cân bằng mong manh của tương tác giữa vật chủ và vi sinh vật. Sự mất cân bằng vi sinh vật này gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với hệ sinh thái biển vì nó làm cho các sinh vật biển dễ bị nhiễm các mầm bệnh truyền nhiễm hơn [3, 4]. Người ta tin rằng SS đóng vai trò quan trọng trong các vụ chết hàng loạt, đây là một vấn đề nghiêm trọng đối với việc quản lý hệ sinh thái biển toàn cầu [5, 6]. Đây là một vấn đề quan trọng do những tác động về kinh tế, sinh thái và dinh dưỡng đối với nhiều loài sinh vật biển. Điều này đặc biệt đúng đối với các loài thân mềm hai mảnh vỏ sống ở vùng cực, nơi tác động của CK diễn ra tức thì và nghiêm trọng hơn [6, 7]. Trên thực tế, các loài thân mềm hai mảnh vỏ như Mytilus spp. được sử dụng rộng rãi để theo dõi tác động của CC đối với hệ sinh thái biển. Không có gì đáng ngạc nhiên, một số lượng tương đối lớn các dấu ấn sinh học đã được phát triển để theo dõi sức khỏe của chúng, thường sử dụng phương pháp hai cấp độ liên quan đến các dấu ấn sinh học chức năng dựa trên hoạt động enzym hoặc chức năng tế bào như khả năng sống của tế bào và hoạt động thực bào [8]. Các phương pháp này cũng bao gồm việc đo nồng độ các chỉ số áp suất cụ thể tích tụ trong mô mềm sau khi hấp thụ một lượng lớn nước biển. Tuy nhiên, khả năng lọc cao và hệ tuần hoàn bán mở của động vật thân mềm hai mảnh vỏ mang lại cơ hội để phát triển các dấu ấn sinh học huyết tương mới bằng cách sử dụng khái niệm sinh thiết lỏng (LB), một phương pháp đơn giản và ít xâm lấn để quản lý bệnh nhân. mẫu máu [9, 10]. Mặc dù có thể tìm thấy một số loại phân tử lưu hành trong LB của con người, nhưng khái niệm này chủ yếu dựa trên phân tích trình tự DNA của các mảnh DNA ngoại bào lưu hành (ccfDNA) trong huyết tương. Trên thực tế, sự hiện diện của DNA lưu hành trong huyết tương người đã được biết đến từ giữa thế kỷ 20 [11], nhưng chỉ trong những năm gần đây, sự ra đời của các phương pháp giải trình tự thông lượng cao mới dẫn đến chẩn đoán lâm sàng dựa trên ccfDNA. Sự hiện diện của các đoạn DNA lưu hành này một phần là do sự giải phóng thụ động DNA bộ gen (nhân và ty thể) sau khi tế bào chết. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), không cần phải trả thêm tiền vào khoảng 5–10 tháng больных с различной патологией hoặc ли bạn có thể làm điều đó bằng cách sử dụng nó. Ở người khỏe mạnh, nồng độ cccDNA thường thấp (<10 ng/mL), nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc khi bị căng thẳng dẫn đến tổn thương mô.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL).在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 phútКонцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены vào ngày 5-10 tháng 7 пациентов с различными патологиями hoặc или không, bạn có thể làm điều đó. Nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/ml) ở người khỏe mạnh, nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô.Kích thước của các đoạn ccfDNA rất khác nhau, nhưng thường nằm trong khoảng từ 150 đến 200 bp. [12]. Phân tích ccfDNA tự thân, tức là ccfDNA từ các tế bào chủ bình thường hoặc biến đổi, có thể được sử dụng để phát hiện các thay đổi di truyền và biểu sinh có trong bộ gen nhân và/hoặc ty thể, từ đó giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn các liệu pháp nhắm mục tiêu phân tử cụ thể [13]. Tuy nhiên, ccfDNA có thể được lấy từ các nguồn ngoại lai như ccfDNA từ tế bào thai nhi trong thời kỳ mang thai hoặc từ các cơ quan được cấy ghép [14,15,16,17]. ccfDNA cũng là một nguồn thông tin quan trọng để phát hiện sự hiện diện của axit nucleic của tác nhân gây bệnh truyền nhiễm (ngoại lai), cho phép phát hiện không xâm lấn các bệnh nhiễm trùng lan rộng không được xác định bằng cấy máu, tránh sinh thiết xâm lấn mô bị nhiễm bệnh [18]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng máu người chứa một nguồn thông tin phong phú có thể được sử dụng để xác định các tác nhân gây bệnh virus và vi khuẩn, và khoảng 1% ccfDNA được tìm thấy trong huyết tương người có nguồn gốc ngoại lai [19]. Những nghiên cứu này chứng minh rằng tính đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật lưu thông trong cơ thể có thể được đánh giá bằng phân tích ccfDNA. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khái niệm này chỉ được sử dụng riêng ở người và ở mức độ ít hơn ở các động vật có xương sống khác [20, 21].
Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng tiềm năng LB để phân tích ccfDNA của Aulacomya atra, một loài trai thường được tìm thấy ở quần đảo Kerguelen cận Nam Cực, một nhóm đảo nằm trên một cao nguyên rộng lớn được hình thành cách đây 35 triệu năm do phun trào núi lửa. Sử dụng hệ thống thí nghiệm trong ống nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các đoạn DNA trong nước biển nhanh chóng được trai hấp thụ và đi vào khoang dịch máu. Giải trình tự shotgun cho thấy ccfDNA trong dịch máu của trai chứa các đoạn DNA có nguồn gốc từ chính nó và từ bên ngoài, bao gồm vi khuẩn cộng sinh và các đoạn DNA từ các quần xã sinh vật điển hình của hệ sinh thái ven biển núi lửa lạnh. ccfDNA trong dịch máu cũng chứa các trình tự virus có nguồn gốc từ các virus có phạm vi vật chủ khác nhau. Chúng tôi cũng tìm thấy các đoạn DNA từ các động vật đa bào như cá xương, hải quỳ, tảo và côn trùng. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB có thể được áp dụng thành công cho động vật không xương sống biển để tạo ra một kho tàng gen phong phú trong hệ sinh thái biển.
Các cá thể trai xanh trưởng thành (dài 55-70 mm) thuộc loài Mytilus platensis (M. platensis) và Aulacomya atra (A. atra) được thu thập từ các bờ đá vùng triều của Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E), quần đảo Kerguelen vào tháng 12 năm 2018. Các cá thể trai xanh trưởng thành khác (Mytilus spp.) được lấy từ một nhà cung cấp thương mại (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) và được đặt trong bể sục khí có kiểm soát nhiệt độ (4°C) chứa 10–20 L nước muối nhân tạo 32‰ (muối biển nhân tạo Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Đối với mỗi thí nghiệm, chiều dài và trọng lượng của từng vỏ trai được đo.
Một giao thức truy cập mở miễn phí cho chương trình này có sẵn trực tuyến (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Tóm lại, dịch máu LB được thu thập từ các cơ khép như đã mô tả [22]. Dịch máu được làm trong bằng cách ly tâm ở 1200×g trong 3 phút, dịch nổi được đông lạnh (-20°C) cho đến khi sử dụng. Để phân lập và tinh chế cfDNA, các mẫu (1,5-2,0 ml) được rã đông và xử lý bằng bộ kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. ccfDNA được bảo quản ở -80°C cho đến khi phân tích tiếp theo. Trong một số thí nghiệm, ccfDNA được phân lập và tinh chế bằng bộ kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). DNA tinh chế được định lượng bằng xét nghiệm PicoGreen tiêu chuẩn. Sự phân bố các đoạn ADN tự do (ccfDNA) được phân lập đã được phân tích bằng phương pháp điện di mao dẫn sử dụng máy phân tích sinh học Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) với bộ kit ADN độ nhạy cao. Thí nghiệm được thực hiện với 1 µl mẫu ccfDNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để giải trình tự các đoạn ccfDNA huyết tương, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) đã chuẩn bị các thư viện shotgun bằng cách sử dụng bộ kit Illumina DNA Mix của bộ kit Illumina MiSeq PE75. Một adapter tiêu chuẩn (BioO) đã được sử dụng. Các tệp dữ liệu thô có sẵn từ Kho lưu trữ trình tự đọc NCBI (SRR8924808 và SRR8924809). Chất lượng đọc cơ bản được đánh giá bằng FastQC [23]. Trimmomatic [24] đã được sử dụng để cắt bỏ adapter và các bản đọc chất lượng kém. Các bản đọc shotgun với các đầu ghép đôi được FLASH hợp nhất thành các bản đọc đơn dài hơn với độ chồng chéo tối thiểu là 20 bp để tránh sai lệch [25]. Các đoạn đọc được hợp nhất được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại NCBI của động vật hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và độ tương đồng 90%), và việc che giấu các trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26]. Các đoạn đọc được hợp nhất được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại NCBI của động vật hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và độ tương đồng 90%), và việc che giấu các trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% độ ồn), một khả năng giúp loại bỏ bụi bẩn khỏi bụi [26]. Các đoạn đọc gộp được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại động vật thân mềm hai mảnh vỏ của NCBI (giá trị e < 1e-3 và độ tương đồng 90%), và việc che giấu trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数,并使用BỤI [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 bụi [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 và 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием BỤI [26]. Các đoạn đọc gộp được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại động vật thân mềm hai mảnh vỏ của NCBI (giá trị e <1e-3 và độ tương đồng 90%), và việc che giấu trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].Các đoạn đọc được chia thành hai nhóm: liên quan đến trình tự động vật thân mềm hai mảnh vỏ (ở đây được gọi là đoạn đọc tự thân) và không liên quan (đoạn đọc không tự thân). Hai nhóm được lắp ráp riêng biệt bằng MEGAHIT để tạo ra các contig [27]. Trong khi đó, sự phân bố phân loại của các đoạn đọc hệ vi sinh vật ngoại lai được phân loại bằng Kraken2 [28] và được biểu diễn bằng đồ thị hình tròn Krona trên Galaxy [29, 30]. Số kmer tối ưu được xác định là kmer-59 từ các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi. Sau đó, các đoạn contig tự thân được xác định bằng cách đối chiếu với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI về động vật thân mềm hai mảnh vỏ, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%) để chú thích cuối cùng. Sau đó, các đoạn contig tự thân được xác định bằng cách đối chiếu với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI về động vật thân mềm hai mảnh vỏ, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%) để chú thích cuối cùng. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и tỷ lệ 60%) là một khoản tiền lớn. Sau đó, các đoạn contig tự thân được xác định bằng cách đối chiếu với BLASTN (cơ sở dữ liệu động vật thân mềm hai mảnh vỏ của NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%) để chú thích cuối cùng.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60%同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Bạn có thể sử dụng các công cụ hỗ trợ để đạt được lợi ích kinh tế cao nhất với BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 và гомология 60%). Sau đó, các đoạn contig tự thân được xác định để chú thích cuối cùng bằng cách đối chiếu với BLASTN (cơ sở dữ liệu động vật thân mềm hai mảnh vỏ của NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%). Song song đó, các đoạn contig không thuộc nhóm tự thân được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). Song song đó, các đoạn contig không thuộc nhóm tự thân được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Song song đó, các đoạn trình tự của nhóm ngoại lai được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu NT NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%).平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。 Bạn không cần phải lo lắng về điều đó, bạn không cần phải làm gì với nó, bạn có thể làm điều đó bằng cách sử dụng BLASTN (база) данных nt NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Song song đó, các đoạn contig không thuộc nhóm tự thân được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đoạn contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq của NCBI (giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đoạn contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq của NCBI (giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). BLASTX là một trong những người cung cấp dịch vụ quản lý tài khoản cho các nhà cung cấp dịch vụ tài chính và RefSeq NCBI (значение e <1e-10 và гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đoạn contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq của NCBI (giá trị e < 1e-10 và độ tương đồng 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX là một trong những công cụ giúp bạn quản lý các khoản nợ của mình bằng cách sử dụng các tài khoản của bạn và RefSeq NCBI (значение e <1e-10 và гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đoạn contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq NCBI (giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%).Các nhóm BLASTN và BLASTX gồm các contig không phải là contig tự thân đại diện cho các contig cuối cùng (xem Tệp bổ sung).
Các mồi được sử dụng cho PCR được liệt kê trong Bảng S1. Enzyme Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) được sử dụng để khuếch đại các gen đích ccfDNA. Các điều kiện phản ứng sau đây đã được sử dụng: biến tính ở 95°C trong 3 phút, 95°C trong 1 phút, nhiệt độ bắt cặp cố định trong 1 phút, kéo dài ở 72°C trong 1 phút, 35 chu kỳ, và cuối cùng là 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được tách bằng điện di trên gel agarose (1,5%) chứa thuốc nhuộm gel DNA an toàn SYBR™ (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ở 95 V.
Ngao (Mytilus spp.) được thích nghi trong 500 ml nước biển có oxy (32 PSU) trong 24 giờ ở 4°C. DNA plasmid chứa đoạn mã hóa trình tự cDNA galectin-7 của người (số hiệu truy cập NCBI L07769) được thêm vào lọ với nồng độ cuối cùng là 190 μg/μl. Ngao được ủ trong cùng điều kiện mà không thêm DNA được dùng làm nhóm đối chứng. Bể đối chứng thứ ba chứa DNA mà không có ngao. Để theo dõi chất lượng DNA trong nước biển, các mẫu nước biển (20 μl; ba lần lặp lại) được lấy từ mỗi bể vào thời điểm đã chỉ định. Để truy xuất nguồn gốc DNA plasmid, ngao LB được thu hoạch vào các thời điểm đã chỉ định và phân tích bằng qPCR và ddPCR. Do hàm lượng muối cao trong nước biển, các mẫu được pha loãng trong nước đạt tiêu chuẩn PCR (tỷ lệ 1:10) trước khi thực hiện tất cả các xét nghiệm PCR.
PCR giọt kỹ thuật số (ddPCR) được thực hiện bằng cách sử dụng giao thức BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Sử dụng biểu đồ nhiệt độ để xác định nhiệt độ tối ưu (Bảng S1). Các giọt được tạo ra bằng máy tạo giọt QX200 (BioRad). Quá trình ddPCR được thực hiện như sau: 95°C trong 5 phút, 50 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây và nhiệt độ ủ nhất định trong 1 phút, sau đó là 72°C trong 30 giây, 4°C trong 5 phút và 90°C trong vòng 5 phút. Số lượng giọt và phản ứng dương tính (số bản sao/µl) được đo bằng máy đọc giọt QX200 (BioRad). Các mẫu có ít hơn 10.000 giọt bị loại bỏ. Việc kiểm soát mẫu không được thực hiện mỗi khi chạy ddPCR.
Phương pháp qPCR được thực hiện bằng máy Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Úc) và các mồi đặc hiệu cho LGALS7. Tất cả các phản ứng PCR định lượng đều được thực hiện trong 20 µl bằng bộ kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). Phản ứng qPCR bắt đầu bằng quá trình ủ 15 phút ở 95°C, tiếp theo là 40 chu kỳ ở 95°C trong 10 giây và ở 60°C trong 60 giây với một lần thu thập dữ liệu. Đường cong nóng chảy được tạo ra bằng cách đo liên tiếp ở 95°C trong 5 giây, 65°C trong 60 giây và 97°C ở cuối phản ứng qPCR. Mỗi phản ứng qPCR được thực hiện ba lần, ngoại trừ các mẫu đối chứng.
Vì trai được biết đến với tốc độ lọc cao, trước tiên chúng tôi đã điều tra xem liệu chúng có thể lọc và giữ lại các mảnh DNA có trong nước biển hay không. Chúng tôi cũng quan tâm đến việc liệu các mảnh này có tích tụ trong hệ thống bạch huyết bán mở của chúng hay không. Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng thực nghiệm bằng cách theo dõi số phận của các mảnh DNA hòa tan được thêm vào bể trai xanh. Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc theo dõi các mảnh DNA, chúng tôi đã sử dụng DNA plasmid ngoại lai (không phải tự thân) chứa gen galectin-7 của người. ddPCR theo dõi các mảnh DNA plasmid trong nước biển và trai. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng nếu lượng mảnh DNA trong nước biển vẫn tương đối ổn định theo thời gian (lên đến 7 ngày) khi không có trai, thì khi có trai, mức độ này gần như biến mất hoàn toàn trong vòng 8 giờ (Hình 1a,b). Các mảnh DNA ngoại lai dễ dàng được phát hiện trong vòng 15 phút trong dịch nội van và huyết tương (Hình 1c). Các mảnh này vẫn có thể được phát hiện đến 4 giờ sau khi tiếp xúc. Hoạt động lọc đối với các mảnh DNA này tương đương với hoạt động lọc của vi khuẩn và tảo [31]. Những kết quả này cho thấy trai có thể lọc và tích lũy DNA ngoại lai trong các khoang chứa dịch của chúng.
Nồng độ tương đối của DNA plasmid trong nước biển khi có (A) hoặc không có (B) trai, được đo bằng ddPCR. Trong A, kết quả được biểu thị bằng phần trăm, với các đường viền của ô vuông đại diện cho phân vị thứ 75 và thứ 25. Đường cong logarit được vẽ màu đỏ, và vùng được tô bóng màu xám biểu thị khoảng tin cậy 95%. Trong B, đường màu đỏ biểu thị giá trị trung bình và đường màu xanh biểu thị khoảng tin cậy 95% cho nồng độ. C Sự tích lũy DNA plasmid trong dịch máu và dịch van của trai ở các thời điểm khác nhau sau khi thêm DNA plasmid. Kết quả được trình bày dưới dạng số bản sao tuyệt đối được phát hiện/mL (±SE).
Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra nguồn gốc của ccfDNA trong trai thu thập từ các bãi trai trên quần đảo Kerguelen, một nhóm đảo xa xôi với ảnh hưởng của con người rất hạn chế. Để phục vụ mục đích này, ccfDNA từ dịch máu của trai đã được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp thường được sử dụng để tinh chế ccfDNA của người [32, 33]. Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ccfDNA trung bình trong dịch máu của trai nằm trong phạm vi microgam thấp trên ml dịch máu (xem Bảng S2, Thông tin bổ sung). Phạm vi nồng độ này lớn hơn nhiều so với ở người khỏe mạnh (vài nanogam thấp trên mililit), nhưng trong những trường hợp hiếm hoi, ở bệnh nhân ung thư, mức độ ccfDNA có thể đạt tới vài microgam trên mililit [34, 35]. Phân tích sự phân bố kích thước của ccfDNA trong dịch máu cho thấy các đoạn này có kích thước rất khác nhau, từ 1000 bp đến 5000 bp (Hình 2). Kết quả tương tự đã được thu được bằng cách sử dụng Bộ điều tra QIAamp dựa trên silica, một phương pháp thường được sử dụng trong khoa học pháp y để nhanh chóng phân lập và tinh chế DNA bộ gen từ các mẫu DNA có nồng độ thấp, bao gồm cả ccfDNA [36].
Hình ảnh điện di ccfDNA tiêu biểu của dịch máu trai. Được chiết xuất bằng bộ kit NucleoSnap Plasma (trên) và bộ kit QIAamp DNA Investigator (dưới). B. Biểu đồ violin thể hiện sự phân bố nồng độ ccfDNA trong dịch máu trai (±SE). Các đường màu đen và đỏ lần lượt biểu thị giá trị trung vị và tứ phân vị thứ nhất và thứ ba.
Khoảng 1% ccfDNA ở người và động vật linh trưởng có nguồn gốc ngoại lai [21, 37]. Với hệ tuần hoàn bán mở của động vật thân mềm hai mảnh vỏ, nước biển giàu vi sinh vật và sự phân bố kích thước của ccfDNA trai, chúng tôi giả thuyết rằng ccfDNA trong dịch máu của trai có thể chứa một nguồn DNA vi sinh vật phong phú và đa dạng. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã giải trình tự ccfDNA trong dịch máu của các mẫu Aulacomya atra thu thập được từ quần đảo Kerguelen, thu được hơn 10 triệu lượt đọc, trong đó 97,6% vượt qua kiểm soát chất lượng. Sau đó, các lượt đọc được phân loại theo nguồn gốc tự thân và không tự thân bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu BLASTN và NCBI về động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Hình S1, Thông tin bổ sung).
Ở người, cả DNA nhân và DNA ty thể đều có thể được giải phóng vào máu [38]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu hiện tại, không thể mô tả chi tiết DNA bộ gen nhân của trai, vì bộ gen của A. atra chưa được giải trình tự hoặc mô tả. Tuy nhiên, chúng tôi đã có thể xác định một số đoạn ccfDNA có nguồn gốc riêng của chúng tôi bằng cách sử dụng thư viện động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Hình S2, Thông tin bổ sung). Chúng tôi cũng đã xác nhận sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc riêng của chúng tôi bằng cách khuếch đại PCR có định hướng các gen A. atra đã được giải trình tự (Hình 3). Tương tự, vì bộ gen ty thể của A. atra có sẵn trong các cơ sở dữ liệu công cộng, người ta có thể tìm thấy bằng chứng về sự hiện diện của các đoạn ccfDNA ty thể trong dịch máu của A. atra. Sự hiện diện của các đoạn DNA ty thể đã được xác nhận bằng cách khuếch đại PCR (Hình 3).
Nhiều gen ty thể khác nhau đã được tìm thấy trong dịch máu của A. atra (chấm đỏ – mã số: SRX5705969) và M. platensis (chấm xanh – mã số: SRX5705968) được khuếch đại bằng PCR. Hình ảnh được điều chỉnh từ Breton et al., 2011 B Khuếch đại dịch máu từ A. atra. Được bảo quản trên giấy FTA. Sử dụng dụng cụ đục lỗ 3 mm để thêm trực tiếp vào ống PCR chứa hỗn hợp PCR.
Với hàm lượng vi sinh vật phong phú trong nước biển, ban đầu chúng tôi tập trung vào việc xác định đặc điểm của trình tự DNA vi sinh vật trong huyết tương. Để làm điều này, chúng tôi sử dụng hai chiến lược khác nhau. Chiến lược đầu tiên sử dụng Kraken2, một chương trình phân loại trình tự dựa trên thuật toán có thể xác định trình tự vi sinh vật với độ chính xác tương đương với BLAST và các công cụ khác [28]. Hơn 6719 trình tự được xác định là có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong khi 124 và 64 trình tự lần lượt là từ vi khuẩn cổ và vi rút (Hình 4). Các đoạn DNA vi khuẩn phong phú nhất là Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) và Bacteroidetes (17%) (Hình 4a). Sự phân bố này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hệ vi sinh vật của trai xanh biển [39, 40]. Gammaproteobacteria là lớp chính của Proteobacteria (44%), bao gồm nhiều Vibrionales (Hình 4b). Phương pháp ddPCR đã xác nhận sự hiện diện của các đoạn DNA Vibrio trong ccfDNA của dịch máu A. atra (Hình 4c) [41]. Để có thêm thông tin về nguồn gốc vi khuẩn của ccfDNA, một phương pháp bổ sung đã được thực hiện (Hình S2, Thông tin bổ sung). Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng chéo được ghép lại thành các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là có nguồn gốc tự thân (động vật thân mềm hai mảnh vỏ) hoặc không phải tự thân bằng cách sử dụng BLASTN với giá trị e là 1e−3 và ngưỡng cắt với độ tương đồng >90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng chéo được ghép lại thành các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là có nguồn gốc tự thân (động vật thân mềm hai mảnh vỏ) hoặc không phải tự thân bằng cách sử dụng BLASTN với giá trị e là 1e−3 và ngưỡng cắt với độ tương đồng >90%. Bạn có thể dễ dàng tìm được một người có thể kiếm được nhiều tiền hơn và có thể kiếm được nhiều tiền hơn классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) hoặc чужие по происхождению с использованием BLASTN và значения e 1e-3 và отсечения с гомологией> 90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng chéo được thu thập dưới dạng các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là bản địa (động vật thân mềm hai mảnh vỏ) hoặc không phải bản địa bằng cách sử dụng BLASTN với giá trị e là 1e-3 và ngưỡng tương đồng >90%.90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% Bạn có thể có được một khoản tiền lớn để có được một khoản tiền lớn và một khoản tiền nhất định và một khoản tiền lớn как собственные (двустворчатые моллюски) hoặc несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng chéo được thu thập dưới dạng các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là đoạn đọc gốc (động vật thân mềm hai mảnh vỏ) hoặc không phải gốc bằng cách sử dụng giá trị eBLASTN và 1e-3 cùng ngưỡng tương đồng >90%.Vì bộ gen của A. atra chưa được giải trình tự, chúng tôi đã sử dụng chiến lược lắp ráp de novo của trình lắp ráp giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) MEGAHIT. Tổng cộng 147.188 contig đã được xác định là có nguồn gốc phụ thuộc (động vật thân mềm hai mảnh vỏ). Sau đó, các contig này được phân tích mở rộng với giá trị e là 1e-10 bằng cách sử dụng BLASTN và BLASTX. Chiến lược này cho phép chúng tôi xác định được 482 đoạn không phải động vật thân mềm hai mảnh vỏ có trong ccfDNA của A. atra. Hơn một nửa (57%) số đoạn DNA này thu được từ vi khuẩn, chủ yếu là từ các vi khuẩn cộng sinh ở mang, bao gồm cả vi khuẩn cộng sinh ưa lưu huỳnh, và từ vi khuẩn cộng sinh ở mang Solemya velum (Hình 5).
Độ phong phú tương đối ở cấp độ loại. B. Đa dạng vi sinh vật của hai ngành chính (Firmicutes và Proteobacteria). Hình ảnh khuếch đại đại diện của ddPCR C. Vibrio spp. A. Các đoạn gen 16S rRNA (màu xanh) trong ba mẫu dịch máu của chuột atra.
Tổng cộng 482 đoạn contig thu thập được đã được phân tích. Hồ sơ tổng quát về phân bố phân loại của các chú thích contig metagenomic (sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực). B Phân bố chi tiết các đoạn DNA vi khuẩn được xác định bằng BLASTN và BLASTX.
Phân tích Kraken2 cũng cho thấy ccfDNA của trai chứa các đoạn DNA của vi khuẩn cổ, bao gồm các đoạn DNA của Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) và Thaurmarcheota (11%) (Hình 6a). Sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ Euryarchaeota và Crenarchaeota, trước đây được tìm thấy trong cộng đồng vi sinh vật của trai California, không có gì đáng ngạc nhiên [42]. Mặc dù Euryarchaeota thường liên quan đến các điều kiện khắc nghiệt, nhưng hiện nay người ta nhận thấy rằng cả Euryarchaeota và Crenarcheota đều nằm trong số các sinh vật nhân sơ phổ biến nhất trong môi trường biển lạnh giá [43, 44]. Sự hiện diện của vi sinh vật sinh khí metan trong trai không có gì đáng ngạc nhiên, xét đến các báo cáo gần đây về rò rỉ khí metan trên diện rộng từ các lỗ rò rỉ dưới đáy biển trên Cao nguyên Kerguelen [45] và khả năng sản xuất khí metan của vi sinh vật được quan sát thấy ngoài khơi quần đảo Kerguelen [46].
Sau đó, sự chú ý của chúng tôi chuyển sang các trình tự DNA của virus. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là nghiên cứu ngoài mục tiêu đầu tiên về hàm lượng virus trong trai. Đúng như dự đoán, chúng tôi đã tìm thấy các đoạn DNA của thực khuẩn thể (Caudovirales) (Hình 6b). Tuy nhiên, DNA virus phổ biến nhất đến từ một ngành của nucleocytovirus, còn được gọi là virus DNA lớn trong nhân và tế bào chất (NCLDV), có bộ gen lớn nhất trong số tất cả các virus. Trong ngành này, hầu hết các trình tự DNA thuộc về các họ Mimimidoviridae (58%) và Poxviridae (21%), có vật chủ tự nhiên bao gồm động vật có xương sống và động vật chân đốt, trong khi một phần nhỏ các trình tự DNA này thuộc về các loài tảo gây bệnh đã biết. Virus này lây nhiễm tảo biển nhân chuẩn. Các trình tự cũng được thu thập từ virus Pandora, virus khổng lồ có kích thước bộ gen lớn nhất trong số tất cả các chi virus đã biết. Điều thú vị là, phạm vi vật chủ được biết là bị nhiễm virus, được xác định bằng phương pháp giải trình tự ccfDNA trong dịch máu, tương đối rộng (Hình S3, Thông tin bổ sung). Nó bao gồm các loại virus lây nhiễm côn trùng như Baculoviridae và Iridoviridae, cũng như các loại virus lây nhiễm amip, tảo và động vật có xương sống. Chúng tôi cũng tìm thấy các trình tự phù hợp với bộ gen của Pithovirus sibericum. Pitovirus (còn được gọi là “virus zombie”) lần đầu tiên được phân lập từ lớp băng vĩnh cửu 30.000 năm tuổi ở Siberia [47]. Do đó, kết quả của chúng tôi phù hợp với các báo cáo trước đây cho thấy không phải tất cả các loài virus hiện đại này đều đã tuyệt chủng [48] và những virus này có thể tồn tại trong các hệ sinh thái biển cận Bắc Cực xa xôi.
Cuối cùng, chúng tôi đã thử nghiệm để xem liệu có thể tìm thấy các đoạn DNA từ các động vật đa bào khác hay không. Tổng cộng 482 đoạn contig ngoại lai đã được xác định bằng BLASTN và BLASTX với các thư viện nt, nr và RefSeq (bộ gen và protein). Kết quả của chúng tôi cho thấy trong số các đoạn ngoại lai của ccfDNA của động vật đa bào, DNA của xương chiếm ưu thế (Hình 5). Các đoạn DNA từ côn trùng và các loài khác cũng đã được tìm thấy. Một phần tương đối lớn các đoạn DNA chưa được xác định, có thể là do sự thiếu đại diện của một số lượng lớn các loài sinh vật biển trong cơ sở dữ liệu bộ gen so với các loài trên cạn [49].
Trong bài báo này, chúng tôi áp dụng khái niệm LB vào loài trai, lập luận rằng việc giải trình tự ccfDNA trong dịch máu có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về thành phần của hệ sinh thái biển ven bờ. Cụ thể, chúng tôi nhận thấy rằng: 1) dịch máu của trai chứa nồng độ tương đối cao (mức microgam) các đoạn DNA lưu thông có kích thước tương đối lớn (~1-5 kb); 2) các đoạn DNA này vừa độc lập vừa không độc lập; 3) Trong số các nguồn ngoại lai của các đoạn DNA này, chúng tôi tìm thấy DNA của vi khuẩn, vi sinh vật cổ và virus, cũng như DNA của các động vật đa bào khác; 4) Sự tích lũy các đoạn ccfDNA ngoại lai này trong dịch máu diễn ra nhanh chóng và góp phần vào hoạt động lọc nội bộ của trai. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB, cho đến nay chủ yếu được áp dụng trong lĩnh vực y sinh học, mã hóa một nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá, có thể được sử dụng để hiểu rõ hơn về sự tương tác giữa các loài chỉ thị và môi trường của chúng.
Ngoài các loài linh trưởng, việc phân lập ccfDNA đã được báo cáo ở các loài động vật có vú, bao gồm chuột, chó, mèo và ngựa [50, 51, 52]. Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên báo cáo về việc phát hiện và giải trình tự ccfDNA ở các loài sinh vật biển có hệ tuần hoàn mở. Đặc điểm giải phẫu này và khả năng lọc của trai có thể, ít nhất một phần, giải thích các đặc điểm kích thước khác nhau của các đoạn DNA lưu thông so với các loài khác. Ở người, hầu hết các đoạn DNA lưu thông trong máu là các đoạn nhỏ có kích thước từ 150 đến 200 bp, với đỉnh tối đa là 167 bp [34, 53]. Một phần nhỏ nhưng đáng kể các đoạn DNA có kích thước từ 300 đến 500 bp, và khoảng 5% dài hơn 900 bp [54]. Lý do cho sự phân bố kích thước này là nguồn chính của ccfDNA trong huyết tương xuất hiện do sự chết tế bào, hoặc do chết tế bào hoặc do hoại tử các tế bào tạo máu lưu thông ở những người khỏe mạnh hoặc do apoptosis của các tế bào khối u ở bệnh nhân ung thư (được gọi là DNA khối u lưu thông, ctDNA). Sự phân bố kích thước của ccfDNA trong dịch máu mà chúng tôi tìm thấy ở trai dao động từ 1000 đến 5000 bp, cho thấy ccfDNA của trai có nguồn gốc khác. Đây là một giả thuyết hợp lý, vì trai có hệ thống mạch bán mở và sống trong môi trường nước biển chứa nồng độ cao DNA bộ gen vi khuẩn. Trên thực tế, các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm của chúng tôi sử dụng DNA ngoại sinh đã chỉ ra rằng trai tích lũy các mảnh DNA trong nước biển, ít nhất sau vài giờ chúng bị phân hủy sau khi tế bào hấp thụ và/hoặc được giải phóng và/hoặc lưu trữ trong các tổ chức khác nhau. Do sự khan hiếm của các tế bào (cả tế bào nhân sơ và nhân thực), việc sử dụng các ngăn bên trong van sẽ làm giảm lượng ccfDNA từ nguồn nội sinh cũng như từ nguồn ngoại lai. Xem xét tầm quan trọng của hệ miễn dịch bẩm sinh ở động vật thân mềm hai mảnh vỏ và số lượng lớn các tế bào thực bào lưu thông, chúng tôi tiếp tục đưa ra giả thuyết rằng ngay cả ccfDNA ngoại lai cũng được làm giàu trong các tế bào thực bào lưu thông, những tế bào này tích lũy DNA ngoại lai khi nuốt phải vi sinh vật và/hoặc mảnh vụn tế bào. Tóm lại, kết quả của chúng tôi cho thấy ccfDNA trong dịch máu của động vật thân mềm hai mảnh vỏ là một kho lưu trữ thông tin phân tử độc đáo và củng cố vị thế của chúng như một loài chỉ thị.
Dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng việc giải trình tự và phân tích các đoạn ccfDNA huyết tương có nguồn gốc từ vi khuẩn có thể cung cấp thông tin quan trọng về hệ vi khuẩn của vật chủ và vi khuẩn hiện diện trong hệ sinh thái biển xung quanh. Các kỹ thuật giải trình tự ngẫu nhiên đã tiết lộ các trình tự của vi khuẩn cộng sinh A. atra mang mà sẽ bị bỏ sót nếu sử dụng các phương pháp nhận dạng 16S rRNA thông thường, một phần do sự thiên lệch của thư viện tham chiếu. Trên thực tế, việc chúng tôi sử dụng dữ liệu LB thu thập từ M. platensis trong cùng một lớp trai ở Kerguelen cho thấy thành phần của các vi khuẩn cộng sinh liên quan đến mang là giống nhau đối với cả hai loài trai (Hình S4, Thông tin bổ sung). Sự tương đồng này của hai loài trai khác nhau về mặt di truyền có thể phản ánh thành phần của cộng đồng vi khuẩn trong các trầm tích lạnh, chứa lưu huỳnh và núi lửa của Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Mức độ cao hơn của vi sinh vật khử lưu huỳnh đã được mô tả rõ ràng khi thu hoạch trai từ các khu vực ven biển bị xáo trộn sinh học [59], chẳng hạn như bờ biển Port-au-France. Một khả năng khác là hệ vi sinh vật cộng sinh của trai có thể bị ảnh hưởng bởi sự truyền ngang [60, 61]. Cần nghiên cứu thêm để xác định mối tương quan giữa môi trường biển, bề mặt đáy biển và thành phần vi khuẩn cộng sinh trong trai. Những nghiên cứu này hiện đang được tiến hành.
Chiều dài và nồng độ ccfDNA trong dịch máu, khả năng tinh chế dễ dàng và chất lượng cao cho phép giải trình tự shotgun nhanh chóng là một số trong nhiều ưu điểm của việc sử dụng ccfDNA của trai để đánh giá đa dạng sinh học trong hệ sinh thái ven biển. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả để mô tả các cộng đồng virus (virome) trong một hệ sinh thái nhất định [62, 63]. Không giống như vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn, bộ gen virus không chứa các gen được bảo tồn về mặt phát sinh chủng loại như trình tự 16S. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sinh thiết dịch từ các loài chỉ thị như trai có thể được sử dụng để xác định số lượng tương đối lớn các mảnh virus ccfDNA được biết là lây nhiễm các vật chủ thường sinh sống trong hệ sinh thái biển ven biển. Điều này bao gồm các virus được biết là lây nhiễm động vật nguyên sinh, động vật chân đốt, côn trùng, thực vật và virus vi khuẩn (ví dụ: thực khuẩn thể). Một sự phân bố tương tự đã được tìm thấy khi chúng tôi kiểm tra virome ccfDNA trong dịch máu của trai xanh (M. platensis) được thu thập trong cùng một lớp trai tại Kerguelen (Bảng S2, Thông tin bổ sung). Giải trình tự shotgun của ccfDNA thực sự là một phương pháp mới đang được chú trọng trong nghiên cứu về hệ vi rút của con người hoặc các loài khác [21, 37, 64]. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho việc nghiên cứu các vi rút DNA mạch đôi, vì không có gen nào được bảo tồn giữa tất cả các vi rút DNA mạch đôi, đại diện cho lớp vi rút đa dạng và rộng nhất ở Baltimore [65]. Mặc dù hầu hết các vi rút này vẫn chưa được phân loại và có thể bao gồm các vi rút từ một phần hoàn toàn chưa được biết đến của thế giới vi rút [66], chúng tôi nhận thấy rằng hệ vi rút và phạm vi vật chủ của trai A. atra và M. platensis nằm giữa hai loài này một cách tương tự (xem hình S3, thông tin bổ sung). Sự tương đồng này không đáng ngạc nhiên, vì nó có thể phản ánh sự thiếu chọn lọc trong việc hấp thụ DNA có trong môi trường. Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng RNA tinh khiết hiện đang cần thiết để đặc trưng hóa hệ vi rút RNA.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã sử dụng một quy trình rất nghiêm ngặt được điều chỉnh từ công trình của Kowarski và các đồng nghiệp [37], những người đã sử dụng quy trình xóa hai bước các đoạn đọc và contig được gộp lại trước và sau khi lắp ráp ccfDNA bản địa, dẫn đến tỷ lệ đoạn đọc không được ánh xạ cao. Do đó, chúng tôi không thể loại trừ khả năng một số đoạn đọc không được ánh xạ này vẫn có nguồn gốc riêng của chúng, chủ yếu là vì chúng tôi không có bộ gen tham chiếu cho loài trai này. Chúng tôi cũng sử dụng quy trình này vì chúng tôi lo ngại về sự lai ghép giữa các đoạn đọc tự thân và không tự thân cũng như độ dài đoạn đọc được tạo ra bởi Illumina MiSeq PE75. Một lý do khác cho phần lớn các đoạn đọc chưa được lập bản đồ là do phần lớn các vi sinh vật biển, đặc biệt là ở các khu vực xa xôi như Kerguelen, chưa được chú thích. Chúng tôi đã sử dụng Illumina MiSeq PE75, giả định độ dài đoạn ccfDNA tương tự như ccfDNA của con người. Đối với các nghiên cứu trong tương lai, dựa trên kết quả của chúng tôi cho thấy ccfDNA trong dịch máu có độ dài đọc dài hơn so với con người và/hoặc động vật có vú, chúng tôi khuyến nghị sử dụng nền tảng giải trình tự phù hợp hơn cho các đoạn ccfDNA dài hơn. Cách làm này sẽ giúp dễ dàng hơn trong việc xác định thêm các dấu hiệu để phân tích sâu hơn. Việc thu được trình tự bộ gen nhân hoàn chỉnh của A. atra hiện chưa có sẵn cũng sẽ tạo điều kiện thuận lợi hơn rất nhiều cho việc phân biệt ccfDNA từ nguồn tự thân và nguồn không tự thân. Vì nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào khả năng áp dụng khái niệm sinh thiết lỏng cho trai, chúng tôi hy vọng rằng khi khái niệm này được sử dụng trong các nghiên cứu tương lai, các công cụ và quy trình mới sẽ được phát triển để tăng tiềm năng của phương pháp này trong việc nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật của trai trong hệ sinh thái biển.
Là một dấu ấn sinh học lâm sàng không xâm lấn, nồng độ ccfDNA trong huyết tương người tăng cao có liên quan đến nhiều bệnh, tổn thương mô và tình trạng căng thẳng [67,68,69]. Sự gia tăng này liên quan đến việc giải phóng các đoạn DNA có nguồn gốc từ chính nó sau khi mô bị tổn thương. Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng stress nhiệt cấp tính, trong đó trai được tiếp xúc ngắn với nhiệt độ 30 °C. Chúng tôi đã thực hiện phân tích này trên ba loại trai khác nhau trong ba thí nghiệm độc lập. Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy bất kỳ sự thay đổi nào về mức độ ccfDNA sau stress nhiệt cấp tính (xem Hình S5, thông tin bổ sung). Phát hiện này có thể giải thích, ít nhất một phần, thực tế là trai có hệ tuần hoàn bán mở và tích lũy một lượng lớn DNA ngoại lai do hoạt động lọc cao của chúng. Mặt khác, trai, giống như nhiều động vật không xương sống khác, có thể có khả năng chống chịu tốt hơn với tổn thương mô do stress gây ra, do đó hạn chế việc giải phóng ccfDNA trong dịch máu của chúng [70, 71].
Cho đến nay, phân tích DNA về đa dạng sinh học trong hệ sinh thái thủy sinh chủ yếu tập trung vào giải trình tự DNA môi trường (eDNA). Tuy nhiên, phương pháp này thường bị hạn chế trong phân tích đa dạng sinh học khi sử dụng mồi. Việc sử dụng giải trình tự shotgun khắc phục được những hạn chế của PCR và việc lựa chọn bộ mồi thiên lệch. Do đó, theo một nghĩa nào đó, phương pháp của chúng tôi gần giống với phương pháp giải trình tự eDNA Shotgun thông lượng cao được sử dụng gần đây, có khả năng giải trình tự trực tiếp DNA bị phân mảnh và phân tích hầu hết các sinh vật [72, 73]. Tuy nhiên, có một số vấn đề cơ bản phân biệt LB với các phương pháp eDNA tiêu chuẩn. Tất nhiên, sự khác biệt chính giữa eDNA và LB là việc sử dụng vật chủ lọc tự nhiên. Việc sử dụng các loài sinh vật biển như bọt biển và động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Dresseina spp.) làm vật lọc tự nhiên để nghiên cứu eDNA đã được báo cáo [74, 75]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Dreissena đã sử dụng sinh thiết mô từ đó DNA được chiết xuất. Phân tích ccfDNA từ LB không yêu cầu sinh thiết mô, thiết bị chuyên dụng và đôi khi đắt tiền cũng như hậu cần liên quan đến eDNA hoặc sinh thiết mô. Trên thực tế, gần đây chúng tôi đã báo cáo rằng ccfDNA từ LB có thể được lưu trữ và phân tích với sự hỗ trợ của FTA mà không cần duy trì chuỗi lạnh, đây là một thách thức lớn đối với nghiên cứu ở các khu vực xa xôi [76]. Việc chiết xuất ccfDNA từ sinh thiết lỏng cũng đơn giản và cung cấp DNA chất lượng cao cho phân tích giải trình tự shotgun và PCR. Đây là một lợi thế lớn khi xét đến một số hạn chế kỹ thuật liên quan đến phân tích eDNA [77]. Sự đơn giản và chi phí thấp của phương pháp lấy mẫu cũng đặc biệt phù hợp cho các chương trình giám sát dài hạn. Ngoài khả năng lọc cao, một đặc điểm nổi tiếng khác của động vật thân mềm hai mảnh vỏ là thành phần mucopolysaccharide hóa học của chất nhầy, giúp thúc đẩy sự hấp thụ virus [78, 79]. Điều này làm cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ trở thành một bộ lọc tự nhiên lý tưởng để đặc trưng hóa đa dạng sinh học và tác động của biến đổi khí hậu trong một hệ sinh thái thủy sinh nhất định. Mặc dù sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ vật chủ có thể được coi là một hạn chế của phương pháp so với eDNA, nhưng chi phí liên quan đến việc có ccfDNA bản địa như vậy so với eDNA cũng dễ hiểu đối với lượng thông tin khổng lồ có sẵn cho các nghiên cứu sức khỏe. Điều này bao gồm sự hiện diện của các trình tự virus được tích hợp vào bộ gen của vật chủ. Điều này đặc biệt quan trọng đối với trai, do sự hiện diện của retrovirus gây bệnh bạch cầu lây truyền theo chiều ngang ở động vật thân mềm hai mảnh vỏ [80, 81]. Một ưu điểm khác của LB so với eDNA là nó khai thác hoạt động thực bào của các tế bào máu lưu thông trong dịch máu, nuốt chửng các vi sinh vật (và bộ gen của chúng). Thực bào là chức năng chính của các tế bào máu ở động vật thân mềm hai mảnh vỏ [82]. Cuối cùng, phương pháp này tận dụng khả năng lọc cao của trai (trung bình 1,5 l/h nước biển) và sự tuần hoàn hai ngày, làm tăng sự trộn lẫn của các lớp nước biển khác nhau, cho phép thu giữ eDNA dị loại [83, 84]. Do đó, phân tích ccfDNA của trai là một hướng đi thú vị do tác động về dinh dưỡng, kinh tế và môi trường của trai. Tương tự như phân tích LB thu thập từ con người, phương pháp này cũng mở ra khả năng đo lường những thay đổi di truyền và biểu sinh trong DNA của vật chủ để đáp ứng với các chất ngoại sinh. Ví dụ, các công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba có thể được hình dung để thực hiện phân tích methylation trên toàn bộ hệ gen trong ccfDNA tự nhiên bằng cách sử dụng giải trình tự nanopore. Quá trình này sẽ được tạo điều kiện thuận lợi bởi thực tế là chiều dài của các đoạn ccfDNA của trai lý tưởng tương thích với các nền tảng giải trình tự đọc dài cho phép phân tích methylation DNA trên toàn bộ hệ gen từ một lần chạy giải trình tự duy nhất mà không cần chuyển đổi hóa học.85,86] Đây là một khả năng thú vị, vì người ta đã chứng minh rằng các mô hình methylation DNA phản ánh phản ứng với căng thẳng môi trường và tồn tại qua nhiều thế hệ. Do đó, nó có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc có giá trị về các cơ chế cơ bản chi phối phản ứng sau khi tiếp xúc với biến đổi khí hậu hoặc chất gây ô nhiễm [87]. Tuy nhiên, việc sử dụng LB không phải là không có hạn chế. Không cần phải nói, điều này đòi hỏi sự hiện diện của các loài chỉ thị trong hệ sinh thái. Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng LB để đánh giá đa dạng sinh học của một hệ sinh thái nhất định cũng đòi hỏi một quy trình tin sinh học nghiêm ngặt có tính đến sự hiện diện của các đoạn DNA từ nguồn. Một vấn đề lớn khác là sự sẵn có của bộ gen tham chiếu cho các loài sinh vật biển. Người ta hy vọng rằng các sáng kiến ​​như Dự án Bộ gen Động vật có vú biển và dự án Fish10k mới thành lập [88] sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích như vậy trong tương lai. Việc áp dụng khái niệm LB cho các sinh vật ăn lọc ở biển cũng tương thích với những tiến bộ mới nhất trong công nghệ giải trình tự, khiến nó rất phù hợp cho việc phát triển các dấu ấn sinh học đa ohm để cung cấp thông tin quan trọng về sức khỏe của môi trường sống biển khi đối mặt với căng thẳng môi trường.
Dữ liệu giải trình tự bộ gen đã được lưu trữ trong Kho lưu trữ trình tự đọc NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 thuộc Dự án sinh học SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ. Tác động của biến đổi khí hậu đến đời sống sinh vật biển và hệ sinh thái. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Xem xét tác động tổng hợp của biến đổi khí hậu và các yếu tố gây căng thẳng cục bộ khác đối với môi trường biển. Môi trường khoa học tổng quát. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, và cộng sự. ). Khoa học của ngày đầu tiên của tháng ba. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Khả năng chịu nhiệt giảm dưới điều kiện căng thẳng nhiệt lặp đi lặp lại giải thích tỷ lệ tử vong cao của trai xanh vào mùa hè. Báo cáo khoa học 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Những thay đổi gần đây về tần suất, nguyên nhân và mức độ tử vong của động vật. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, và những người khác. Nhiều mầm bệnh không đặc hiệu cho loài có thể gây chết hàng loạt loài Pinna nobilis. Mạng sống. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Tác động tiềm tàng của biến đổi khí hậu đối với các bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người ở Bắc Cực. Tạp chí sức khỏe vùng cực quốc tế. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. và cộng sự. Trai xanh (Mytilus edulis spp.) như sinh vật báo hiệu trong giám sát ô nhiễm ven biển: một bài đánh giá. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Tích hợp sinh thiết dịch thể trong điều trị ung thư. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Sự trưởng thành của sinh thiết dịch thể: Cho phép DNA khối u lưu thông. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Axit nucleic trong huyết tương người. Biên bản cuộc họp của các chi nhánh Hiệp hội Sinh học. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Vai trò mới của DNA tự do trong tế bào như một dấu ấn phân tử cho điều trị ung thư. Định lượng phân tích sinh học. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. Sinh thiết dịch thể được đưa vào thực tiễn lâm sàng – các vấn đề triển khai và thách thức trong tương lai. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW và cộng sự. DNA thai nhi có trong huyết tương và huyết thanh của mẹ. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Nghiên cứu về diễn biến thai kỳ và các biến chứng của nó bằng cách sử dụng RNA ngoại bào lưu hành trong máu của phụ nữ mang thai. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Sinh thiết dịch thể: DNA tự do của tế bào người hiến được sử dụng để phát hiện các tổn thương dị loại trong ghép thận. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM. Những đổi mới trong chẩn đoán trước sinh: giải trình tự bộ gen huyết tương mẹ. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Phát hiện mầm bệnh nhanh chóng bằng phương pháp giải trình tự metagenomic thế hệ mới của dịch cơ thể bị nhiễm bệnh. Nat Medicine. 2021;27:115-24.