ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
การตรวจชิ้นเนื้อเหลว (Liquid biopsy หรือ LB) เป็นแนวคิดที่กำลังได้รับความนิยมอย่างรวดเร็วในวงการชีวการแพทย์ แนวคิดนี้อาศัยการตรวจจับชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่ไหลเวียนอยู่นอกเซลล์ (Circulating extracellular DNA หรือ ccfDNA) ซึ่งส่วนใหญ่จะถูกปล่อยออกมาเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ หลังจากการตายของเซลล์ในเนื้อเยื่อต่างๆ ชิ้นส่วนเหล่านี้ส่วนน้อยมาจากเนื้อเยื่อหรือสิ่งมีชีวิตต่างถิ่น ในงานวิจัยนี้ เราได้ประยุกต์ใช้แนวคิดนี้กับหอยแมลงภู่ ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่รู้จักกันดีในด้านความสามารถในการกรองน้ำทะเลสูง เราใช้ความสามารถของหอยแมลงภู่ในการทำหน้าที่เป็นตัวกรองตามธรรมชาติเพื่อดักจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากสิ่งแวดล้อมจากแหล่งต่างๆ เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศชายฝั่งทะเล ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าฮีโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดแตกต่างกันมาก ตั้งแต่ 1 ถึง 5 กิโลเบส (kb) การจัดลำดับดีเอ็นเอแบบช็อตกัน (Shotgun sequencing) แสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำนวนมากมีต้นกำเนิดจากจุลินทรีย์ต่างถิ่น ในจำนวนนั้น เราพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากแบคทีเรีย อาร์เคีย และไวรัส รวมถึงไวรัสที่ทราบกันว่าสามารถติดเชื้อในโฮสต์หลากหลายชนิดที่พบได้ทั่วไปในระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่ง โดยสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิดของ LB ที่นำมาใช้กับหอยแมลงภู่เป็นแหล่งความรู้ที่อุดมสมบูรณ์แต่ยังไม่ได้รับการสำรวจอย่างเต็มที่เกี่ยวกับความหลากหลายทางชีวภาพของจุลินทรีย์ในระบบนิเวศทางทะเลชายฝั่ง
ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศ (CC) ต่อความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศทางทะเลเป็นหัวข้อการวิจัยที่กำลังเติบโตอย่างรวดเร็ว ภาวะโลกร้อนไม่เพียงแต่ก่อให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาที่สำคัญเท่านั้น แต่ยังผลักดันขีดจำกัดวิวัฒนาการของความเสถียรทางความร้อนของสิ่งมีชีวิตในทะเล ส่งผลกระทบต่อถิ่นที่อยู่ของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด กระตุ้นให้พวกมันต้องค้นหาสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมกว่า [1, 2] นอกจากจะส่งผลกระทบต่อความหลากหลายทางชีวภาพของสัตว์หลายเซลล์แล้ว การเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศยังรบกวนความสมดุลที่ละเอียดอ่อนของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และจุลินทรีย์ ภาวะจุลินทรีย์เสียสมดุลนี้เป็นภัยคุกคามร้ายแรงต่อระบบนิเวศทางทะเล เนื่องจากทำให้สิ่งมีชีวิตในทะเลมีความอ่อนแอต่อเชื้อโรคมากขึ้น [3, 4] เชื่อกันว่าภาวะจุลินทรีย์เสียสมดุลมีบทบาทสำคัญในการตายหมู่ ซึ่งเป็นปัญหาที่ร้ายแรงสำหรับการจัดการระบบนิเวศทางทะเลทั่วโลก [5, 6] นี่เป็นประเด็นสำคัญเมื่อพิจารณาถึงผลกระทบทางเศรษฐกิจ นิเวศวิทยา และโภชนาการของสิ่งมีชีวิตในทะเลหลายชนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับหอยสองฝาที่อาศัยอยู่ในเขตขั้วโลก ซึ่งผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศนั้นรุนแรงและเกิดขึ้นทันทีมากกว่า [6, 7] ในความเป็นจริง หอยสองฝา เช่น Mytilus spp. ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจสอบผลกระทบของ CC ต่อระบบนิเวศทางทะเล ไม่น่าแปลกใจที่ได้มีการพัฒนาไบโอมาร์กเกอร์จำนวนมากเพื่อตรวจสอบสุขภาพของพวกมัน โดยมักใช้แนวทางสองระดับที่เกี่ยวข้องกับไบโอมาร์กเกอร์เชิงฟังก์ชันโดยอิงจากกิจกรรมของเอนไซม์หรือหน้าที่ของเซลล์ เช่น ความมีชีวิตของเซลล์และกิจกรรมการกลืนกิน [8] วิธีการเหล่านี้ยังรวมถึงการวัดความเข้มข้นของตัวบ่งชี้ความดันเฉพาะที่สะสมอยู่ในเนื้อเยื่ออ่อนหลังจากดูดซับน้ำทะเลจำนวนมาก อย่างไรก็ตาม ความสามารถในการกรองสูงและระบบไหลเวียนโลหิตแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝาเปิดโอกาสให้พัฒนาไบโอมาร์กเกอร์ฮีโมลิมฟ์ใหม่โดยใช้แนวคิดของการตรวจชิ้นเนื้อเหลว (LB) ซึ่งเป็นแนวทางที่ง่ายและรุกรานน้อยที่สุดในการจัดการผู้ป่วย ตัวอย่างเลือด [9, 10] แม้ว่าจะพบโมเลกุลหมุนเวียนหลายประเภทใน LB ของมนุษย์ แต่แนวคิดนี้ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอของชิ้นส่วนดีเอ็นเอภายนอกเซลล์ที่หมุนเวียน (ccfDNA) ในพลาสมา ในความเป็นจริง การมีอยู่ของ DNA ที่หมุนเวียนอยู่ในพลาสมาของมนุษย์เป็นที่ทราบกันมาตั้งแต่กลางศตวรรษที่ 20 [11] แต่เพิ่งในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาที่การเกิดขึ้นของวิธีการจัดลำดับแบบความเร็วสูงได้นำไปสู่การวินิจฉัยทางคลินิกโดยอาศัย ccfDNA การมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่หมุนเวียนเหล่านี้เป็นผลมาจากการปล่อย DNA จีโนม (นิวเคลียร์และไมโทคอนเดรีย) ออกมาโดยไม่ตั้งใจหลังจากเซลล์ตาย ในบุคคลที่มีสุขภาพดี ความเข้มข้นของ ccfDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่เป็นโรคต่างๆ หรืออยู่ในภาวะเครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหาย ในบุคคลที่มีสุขภาพดี ความเข้มข้นของ ccfDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่เป็นโรคต่างๆ หรืออยู่ในภาวะเครียด ซึ่งส่งผลให้เนื้อเยื่อเสียหาย У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ในคนที่มีสุขภาพดี ความเข้มข้นของ cccDNA โดยปกติจะต่ำ (<10 ng/mL) แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีพยาธิสภาพต่างๆ หรืออยู่ภายใต้ความเครียดที่นำไปสู่ความเสียหายของเนื้อเยื่อ在健康个体中，ccfDNA ของ浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10倍，从而导致组织损伤。อยู่ที่ 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可 增加 5-10倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. โดยปกติแล้วความเข้มข้นของ ccfDNA จะต่ำ (<10 ng/ml) ในบุคคลที่มีสุขภาพดี แต่สามารถเพิ่มขึ้นได้ 5-10 เท่าในผู้ป่วยที่มีพยาธิสภาพต่างๆ หรือความเครียด ซึ่งส่งผลให้เกิดความเสียหายต่อเนื้อเยื่อขนาดของชิ้นส่วน ccfDNA มีความหลากหลายมาก แต่โดยทั่วไปจะมีขนาดตั้งแต่ 150 ถึง 200 bp [12] การวิเคราะห์ ccfDNA ที่ได้มาจากเซลล์เจ้าบ้านปกติหรือเซลล์เจ้าบ้านที่เปลี่ยนแปลงไป สามารถนำมาใช้ตรวจจับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ที่มีอยู่ในจีโนมนิวเคลียร์และ/หรือไมโทคอนเดรีย ซึ่งจะช่วยให้แพทย์สามารถเลือกการบำบัดที่มุ่งเป้าไปที่โมเลกุลเฉพาะได้ [13] อย่างไรก็ตาม ccfDNA สามารถได้มาจากแหล่งภายนอก เช่น ccfDNA จากเซลล์ทารกในครรภ์ระหว่างตั้งครรภ์หรือจากอวัยวะที่ปลูกถ่าย [14,15,16,17] ccfDNA ยังเป็นแหล่งข้อมูลที่สำคัญสำหรับการตรวจหาการมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกของเชื้อโรค (ภายนอก) ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจจับการติดเชื้อที่แพร่หลายซึ่งไม่สามารถระบุได้จากการเพาะเชื้อในเลือดได้โดยไม่ต้องทำการตรวจชิ้นเนื้อแบบรุกรานจากเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ [18] การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าเลือดของมนุษย์มีแหล่งข้อมูลมากมายที่สามารถใช้ระบุเชื้อไวรัสและแบคทีเรียก่อโรคได้ และประมาณ 1% ของ ccfDNA ที่พบในพลาสมาของมนุษย์มีต้นกำเนิดจากภายนอก [19] การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความหลากหลายทางชีวภาพของไมโครไบโอมที่หมุนเวียนในร่างกายสามารถประเมินได้โดยใช้การวิเคราะห์ ccfDNA อย่างไรก็ตาม จนกระทั่งเมื่อไม่นานมานี้ แนวคิดนี้ถูกนำมาใช้เฉพาะในมนุษย์ และในระดับที่น้อยกว่าในสัตว์มีกระดูกสันหลังชนิดอื่น [20, 21]
ในงานวิจัยนี้ เราใช้ศักยภาพของ LB ในการวิเคราะห์ ccfDNA ของหอยแมลงภู่ Aulacomya atra ซึ่งเป็นสายพันธุ์ทางใต้ที่พบได้ทั่วไปในหมู่เกาะเคอร์เกเลนในเขตย่อยแอนตาร์กติก ซึ่งเป็นกลุ่มเกาะบนที่ราบสูงขนาดใหญ่ที่ก่อตัวขึ้นจากการระเบิดของภูเขาไฟเมื่อ 35 ล้านปีก่อน โดยใช้ระบบทดลองในหลอดทดลอง เราพบว่าชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเลถูกดูดซึมเข้าสู่หอยแมลงภู่ได้อย่างรวดเร็วและเข้าไปในช่องฮีโมลิมฟ์ การจัดลำดับแบบช็อตกันแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วน DNA ทั้งจากแหล่งกำเนิดของตัวเองและจากแหล่งกำเนิดอื่น รวมถึงแบคทีเรียที่อยู่ร่วมกันและชิ้นส่วน DNA จากระบบนิเวศทั่วไปของระบบนิเวศชายฝั่งทะเลภูเขาไฟเย็น นอกจากนี้ ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์ยังประกอบด้วยลำดับไวรัสที่ได้มาจากไวรัสที่มีช่วงโฮสต์ต่างกัน เรายังพบชิ้นส่วน DNA จากสัตว์หลายเซลล์ เช่น ปลาที่มีกระดูกแข็ง ดอกไม้ทะเล สาหร่าย และแมลงด้วย โดยสรุป งานวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่าแนวคิด LB สามารถนำไปประยุกต์ใช้กับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเลได้อย่างประสบความสำเร็จ เพื่อสร้างคลังข้อมูลทางพันธุกรรมที่หลากหลายในระบบนิเวศทางทะเล
หอยแมลงภู่สีน้ำเงินโตเต็มวัย (ยาว 55-70 มม.) Mytilus platensis (M. platensis) และ Aulacomya atra (A. atra) ถูกเก็บรวบรวมจากชายฝั่งหินระหว่างน้ำขึ้นน้ำลงของเมืองปอร์โต-ฟรองซ์ (049°21.235 S, 070°13.490 E) หมู่เกาะเคอร์เกเลน ในเดือนธันวาคม 2018 ส่วนหอยแมลงภู่สีน้ำเงินโตเต็มวัยชนิดอื่นๆ (Mytilus spp.) ได้มาจากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์ (PEI Mussel King Inc., เกาะพรินซ์เอ็ดเวิร์ด ประเทศแคนาดา) และนำไปเลี้ยงในถังที่มีการควบคุมอุณหภูมิ (4°C) และมีการเติมอากาศ โดยบรรจุน้ำเกลือเทียม 32‰ ปริมาตร 10-20 ลิตร (เกลือทะเลเทียม Reef Crystal, Instant Ocean, เวอร์จิเนีย สหรัฐอเมริกา) สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง จะทำการวัดความยาวและน้ำหนักของเปลือกหอยแต่ละตัว
โปรโตคอลการเข้าถึงแบบเปิดฟรีสำหรับโปรแกรมนี้มีให้บริการทางออนไลน์ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1) โดยสรุปคือ เก็บฮีโมลิมฟ์ LB จากกล้ามเนื้อ abductor ตามที่อธิบายไว้ [22] ฮีโมลิมฟ์ถูกทำให้ใสโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 1200×g เป็นเวลา 3 นาที สารละลายส่วนบนถูกแช่แข็ง (-20°C) จนกว่าจะใช้งาน สำหรับการแยกและทำให้บริสุทธิ์ของ cfDNA ตัวอย่าง (1.5-2.0 มล.) ถูกละลายและประมวลผลโดยใช้ชุด NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ccfDNA ถูกเก็บไว้ที่ -80°C จนกว่าจะมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม ในบางการทดลอง ccfDNA ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุด QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) ปริมาณ DNA ที่บริสุทธิ์แล้วถูกวัดโดยใช้การทดสอบ PicoGreen มาตรฐาน การกระจายตัวของชิ้นส่วน ccfDNA ที่แยกได้ถูกวิเคราะห์โดยวิธีอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบเส้นเลือดฝอยโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) โดยใช้ชุดตรวจ DNA ความไวสูง การทดสอบดำเนินการโดยใช้ตัวอย่าง ccfDNA 1 µl ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
สำหรับการจัดลำดับชิ้นส่วน ccfDNA ของฮีโมลิมฟ์ Génome Québec (มอนทรีออล ควิเบก แคนาดา) ได้เตรียมไลบรารีช็อตกันโดยใช้ชุด Illumina DNA Mix ของชุด Illumina MiSeq PE75 ใช้อะแดปเตอร์มาตรฐาน (BioO) ไฟล์ข้อมูลดิบมีอยู่ใน NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 และ SRR8924809) คุณภาพการอ่านขั้นพื้นฐานได้รับการประเมินโดยใช้ FastQC [23] Trimmomatic [24] ถูกใช้สำหรับการตัดอะแดปเตอร์และการอ่านที่มีคุณภาพต่ำ การอ่านช็อตกันที่มีปลายคู่ได้รับการผสาน FLASH เข้ากับการอ่านเดี่ยวที่ยาวขึ้นโดยมีการทับซ้อนขั้นต่ำ 20 bp เพื่อหลีกเลี่ยงความไม่ตรงกัน [25] อ่านที่รวมกันได้รับการระบุคำอธิบายประกอบโดยใช้ BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธาน NCBI ของหอยสองฝา (ค่า e < 1e−3 และความเหมือนกัน 90%) และการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำทำได้โดยใช้ DUST [26] อ่านที่รวมกันได้รับการระบุคำอธิบายประกอบโดยใช้ BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธาน NCBI ของหอยสองฝา (ค่า e < 1e−3 และความเหมือนกัน 90%) และการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำทำได้โดยใช้ DUST [26] Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ฝุ่น [26]. อ่านรวมได้รับการระบุคำอธิบายประกอบโดยใช้ BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานหอยสองฝาของ NCBI (ค่า e < 1e-3 และความเหมือนกัน 90%) และทำการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำโดยใช้ DUST [26]使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 ฝุ่น [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ฝุ่น [26]. อ่านรวมได้รับการระบุคำอธิบายประกอบโดยใช้ BLASTN โดยใช้ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานหอยสองฝาของ NCBI (ค่า e <1e-3 และความเหมือนกัน 90%) และทำการปิดบังลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำโดยใช้ DUST [26]อ่านข้อมูลถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: กลุ่มที่เกี่ยวข้องกับลำดับของหอยสองฝา (ในที่นี้เรียกว่าการอ่านด้วยตนเอง) และกลุ่มที่ไม่เกี่ยวข้อง (การอ่านที่ไม่ใช่ด้วยตนเอง) ทั้งสองกลุ่มถูกประกอบแยกกันโดยใช้ MEGAHIT เพื่อสร้างคอนติ๊ก [27] ในขณะเดียวกัน การกระจายทางอนุกรมวิธานของการอ่านไมโครไบโอมต่างถิ่นถูกจำแนกโดยใช้ Kraken2 [28] และแสดงผลในรูปแบบแผนภูมิวงกลม Krona บน Galaxy [29, 30] kmers ที่เหมาะสมที่สุดถูกกำหนดให้เป็น kmers-59 จากการทดลองเบื้องต้นของเรา จากนั้นจึงระบุคอนติ๊กของตัวเองโดยการจัดเรียงลำดับด้วย BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝาของ NCBI ค่า e < 1e−10 และความเหมือน 60%) เพื่อทำการระบุคำอธิบายขั้นสุดท้าย จากนั้นจึงระบุคอนติ๊กของตัวเองโดยการจัดเรียงลำดับด้วย BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝาของ NCBI ค่า e < 1e−10 และความเหมือน 60%) เพื่อทำการระบุคำอธิบายขั้นสุดท้าย Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. จากนั้นจึงระบุคอนติ๊กของตัวเองโดยการจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝาของ NCBI ค่า e <1e-10 และความเหมือน 60%) เพื่อการระบุคำอธิบายขั้นสุดท้าย然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI) для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). จากนั้นจึงระบุคอนติ๊กของตัวเองเพื่อทำการระบุคำอธิบายขั้นสุดท้ายโดยการจับคู่กับ BLASTN (ฐานข้อมูลหอยสองฝาของ NCBI ค่า e <1e-10 และความเหมือน 60%) ในขณะเดียวกัน คอนติ๊กของกลุ่มที่ไม่ใช่ตนเองได้รับการระบุด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI ค่า e < 1e−10 และความเหมือนกัน 60%) ในขณะเดียวกัน คอนติ๊กของกลุ่มที่ไม่ใช่ตนเองได้รับการระบุด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI ค่า e < 1e−10 และความเหมือนกัน 60%) Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). ในขณะเดียวกัน คอนติ๊กของกลุ่มต่างประเทศได้รับการระบุด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล NT NCBI ค่า e <1e-10 และความเหมือนกัน 60%)平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение อี <1e-10 и гомология 60%). ในขณะเดียวกัน คอนติ๊กกลุ่มที่ไม่ใช่กลุ่มเดียวกันได้รับการระบุด้วย BLASTN (ฐานข้อมูล nt NCBI ค่า e <1e-10 และความเหมือนกัน 60%) นอกจากนี้ ยังได้ทำการ BLASTX กับคอนติ๊กที่ไม่ใช่ของตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq ของ NCBI (ค่า e < 1e−10 และความเหมือนกัน 60%) นอกจากนี้ ยังได้ทำการ BLASTX กับคอนติ๊กที่ไม่ใช่ของตัวเองโดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq ของ NCBI (ค่า e < 1e−10 และความเหมือนกัน 60%) BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). นอกจากนี้ ยังได้ทำการ BLASTX กับคอนติ๊กที่ไม่ใช่ของตัวเอง โดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq ของ NCBI (ค่า e < 1e-10 และความเหมือนกัน 60%)还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). นอกจากนี้ ยังได้ทำการ BLASTX กับคอนติ๊กที่ไม่ใช่ของตัวเอง โดยใช้ฐานข้อมูลโปรตีน nr และ RefSeq ของ NCBI (ค่า e <1e-10 และความเหมือน 60%)กลุ่ม BLASTN และ BLASTX ของคอนติ๊กที่ไม่ใช่ของตัวเองแสดงถึงคอนติ๊กสุดท้าย (ดูไฟล์เพิ่มเติม)
ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR แสดงอยู่ในตาราง S1 ใช้เอนไซม์ Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ในการเพิ่มปริมาณยีนเป้าหมาย ccfDNA ใช้เงื่อนไขปฏิกิริยาดังต่อไปนี้: การแยกสาย DNA ที่ 95°C เป็นเวลา 3 นาที, 95°C เป็นเวลา 1 นาที, ตั้งค่าอุณหภูมิการจับคู่ (annealing) เป็นเวลา 1 นาที, การยืดสาย DNA ที่ 72°C เป็นเวลา 1 นาที, ทำซ้ำ 35 รอบ และสุดท้ายที่ 72°C ภายใน 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกโดยการอิเล็กโทรโฟเรซิสในเจลอะกาโรส (1.5%) ที่มี SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ที่ 95 V
หอยแมลงภู่ (Mytilus spp.) ถูกปรับสภาพในน้ำทะเลที่มีออกซิเจน 500 มล. (32 PSU) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C ดีเอ็นเอพลาสมิดที่มีส่วนแทรกที่เข้ารหัสลำดับ cDNA ของกาแลคติน-7 ของมนุษย์ (หมายเลขการเข้าถึง NCBI L07769) ถูกเติมลงในหลอดทดลองในความเข้มข้นสุดท้าย 190 μg/μl หอยแมลงภู่ที่บ่มภายใต้สภาวะเดียวกันโดยไม่เติมดีเอ็นเอเป็นกลุ่มควบคุม ถังควบคุมที่สามมีดีเอ็นเอโดยไม่มีหอยแมลงภู่ เพื่อตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอในน้ำทะเล ตัวอย่างน้ำทะเล (20 μl; ทำซ้ำ 3 ครั้ง) ถูกเก็บจากแต่ละถังในเวลาที่กำหนด สำหรับการตรวจสอบย้อนกลับของดีเอ็นเอพลาสมิด หอยแมลงภู่ LB ถูกเก็บเกี่ยวในเวลาที่กำหนดและวิเคราะห์โดย qPCR และ ddPCR เนื่องจากน้ำทะเลมีปริมาณเกลือสูง ตัวอย่างจึงถูกเจือจางในน้ำคุณภาพสำหรับ PCR (1:10) ก่อนการทดสอบ PCR ทุกครั้ง
การทำ Digital droplet PCR (ddPCR) ดำเนินการโดยใช้โปรโตคอล BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada) ใช้โปรไฟล์อุณหภูมิเพื่อกำหนดอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุด (ตาราง S1) สร้างหยดโดยใช้เครื่องสร้างหยด QX200 (BioRad) ดำเนินการ ddPCR ดังนี้: 95°C เป็นเวลา 5 นาที, 50 รอบของ 95°C เป็นเวลา 30 วินาที และอุณหภูมิการจับคู่ที่กำหนดเป็นเวลา 1 นาที และ 72°C เป็นเวลา 30 วินาที, 4°C เป็นเวลา 5 นาที และ 90°C ภายใน 5 นาที จำนวนหยดและปฏิกิริยาที่เป็นบวก (จำนวนสำเนา/µl) ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านหยด QX200 (BioRad) ตัวอย่างที่มีหยดน้อยกว่า 10,000 หยดจะถูกปฏิเสธ การควบคุมรูปแบบไม่ได้ดำเนินการทุกครั้งที่ทำ ddPCR
ทำการวิเคราะห์ qPCR โดยใช้เครื่อง Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) และไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ LGALS7 การวิเคราะห์ qPCR ทุกครั้งทำในปริมาตร 20 µl โดยใช้ชุดตรวจ QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) เริ่ม qPCR ด้วยการบ่มที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 นาที ตามด้วย 40 รอบ ที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 10 วินาที และ 60°C เป็นเวลา 60 วินาที พร้อมเก็บข้อมูลหนึ่งครั้ง สร้างกราฟการหลอมเหลวโดยใช้การวัดต่อเนื่องที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5 วินาที, 65°C เป็นเวลา 60 วินาที และ 97°C ในตอนท้ายของ qPCR ทำการวิเคราะห์ qPCR แต่ละครั้งซ้ำ 3 ครั้ง ยกเว้นตัวอย่างควบคุม
เนื่องจากหอยแมลงภู่ขึ้นชื่อเรื่องอัตราการกรองสูง เราจึงทำการตรวจสอบก่อนว่าพวกมันสามารถกรองและกักเก็บชิ้นส่วน DNA ที่มีอยู่ในน้ำทะเลได้หรือไม่ นอกจากนี้เรายังสนใจว่าชิ้นส่วนเหล่านี้จะสะสมอยู่ในระบบน้ำเหลืองแบบกึ่งเปิดของพวกมันหรือไม่ เราได้แก้ไขปัญหานี้โดยการทดลองติดตามชะตากรรมของชิ้นส่วน DNA ที่ละลายได้ซึ่งเติมลงในถังเลี้ยงหอยแมลงภู่ เพื่อให้ง่ายต่อการติดตามชิ้นส่วน DNA เราใช้พลาสมิด DNA จากภายนอก (ไม่ใช่ของตัวเอง) ที่มีจีน galectin-7 ของมนุษย์ ddPCR ติดตามชิ้นส่วนพลาสมิด DNA ในน้ำทะเลและหอยแมลงภู่ ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า หากปริมาณชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเลคงที่ค่อนข้างคงที่ตลอดเวลา (นานถึง 7 วัน) ในกรณีที่ไม่มีหอยแมลงภู่ แต่ในกรณีที่มีหอยแมลงภู่ ระดับนี้จะหายไปเกือบหมดภายใน 8 ชั่วโมง (รูปที่ 1a,b) สามารถตรวจพบชิ้นส่วน DNA จากภายนอกได้อย่างง่ายดายภายใน 15 นาทีในของเหลวภายในลิ้นและฮีโมลิมฟ์ (รูปที่ 1c) ชิ้นส่วนเหล่านี้ยังคงสามารถตรวจพบได้นานถึง 4 ชั่วโมงหลังจากการสัมผัส กิจกรรมการกรองในส่วนที่เกี่ยวกับชิ้นส่วน DNA นี้เทียบได้กับกิจกรรมการกรองของแบคทีเรียและสาหร่าย [31] ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สามารถกรองและสะสม DNA จากภายนอกในช่องของเหลวของพวกมันได้
ความเข้มข้นสัมพัทธ์ของดีเอ็นเอพลาสมิดในน้ำทะเลในสภาวะที่มี (A) หรือไม่มี (B) หอยแมลงภู่ วัดโดยวิธี ddPCR ในภาพ A ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ โดยขอบของกล่องแสดงถึงเปอร์เซ็นไทล์ที่ 75 และ 25 เส้นโค้งลอการิทึมที่ปรับให้เหมาะสมแสดงด้วยสีแดง และพื้นที่แรเงาสีเทาแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% ในภาพ B เส้นสีแดงแสดงค่าเฉลี่ย และเส้นสีน้ำเงินแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% สำหรับความเข้มข้น ภาพ C การสะสมของดีเอ็นเอพลาสมิดในน้ำเหลืองและน้ำในวาล์วของหอยแมลงภู่ในช่วงเวลาต่างๆ หลังจากการเติมดีเอ็นเอพลาสมิด ผลลัพธ์แสดงเป็นจำนวนสำเนาสัมบูรณ์ที่ตรวจพบ/มิลลิลิตร (±SE)
ต่อไป เราได้ตรวจสอบที่มาของ ccfDNA ในหอยแมลงภู่ที่เก็บรวบรวมจากแหล่งหอยแมลงภู่บนหมู่เกาะเคอร์เกเลน ซึ่งเป็นกลุ่มเกาะที่ห่างไกลและมีอิทธิพลจากมนุษย์น้อย เพื่อจุดประสงค์นี้ เราได้แยกและทำให้บริสุทธิ์ cccDNA จากฮีโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่โดยใช้วิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการทำให้บริสุทธิ์ cccDNA ของมนุษย์ [32, 33] เราพบว่าความเข้มข้นเฉลี่ยของ ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่นั้นอยู่ในช่วงไมโครกรัมต่ำต่อมิลลิลิตรของฮีโมลิมฟ์ (ดูตาราง S2 ข้อมูลเพิ่มเติม) ช่วงความเข้มข้นนี้สูงกว่าในคนที่มีสุขภาพดีมาก (นาโนกรัมต่ำต่อมิลลิลิตร) แต่ในบางกรณีที่หายาก ในผู้ป่วยมะเร็ง ระดับของ ccfDNA อาจสูงถึงหลายไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร [34, 35] การวิเคราะห์การกระจายขนาดของ ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์แสดงให้เห็นว่าชิ้นส่วนเหล่านี้มีขนาดแตกต่างกันอย่างมาก โดยมีขนาดตั้งแต่ 1000 bp ถึง 1000 bp มากถึง 5000 bp (รูปที่ 2) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันนี้ได้จากการใช้ชุด QIAamp Investigator Kit ที่ใช้ซิลิกาเป็นฐาน ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไปในนิติวิทยาศาสตร์เพื่อแยกและทำให้บริสุทธิ์ DNA จีโนมจากตัวอย่าง DNA ที่มีความเข้มข้นต่ำอย่างรวดเร็ว รวมถึง ccfDNA [36]
ภาพอิเล็กโทรโฟเรแกรมแสดงการแยก ccfDNA จากน้ำเหลืองของหอยแมลงภู่ สกัดด้วยชุดอุปกรณ์ NucleoSnap Plasma Kit (ด้านบน) และ QIAamp DNA Investigator Kit (ด้านล่าง) แผนภาพไวโอลินแสดงการกระจายตัวของความเข้มข้นของ ccfDNA ในน้ำเหลืองของหอยแมลงภู่ (±SE) เส้นสีดำและสีแดงแสดงค่ามัธยฐาน ควาร์ไทล์ที่หนึ่งและสาม ตามลำดับ
ประมาณ 1% ของ ccfDNA ในมนุษย์และไพรเมตมีแหล่งที่มาจากภายนอก [21, 37] เนื่องจากระบบไหลเวียนโลหิตแบบกึ่งเปิดของหอยสองฝา น้ำทะเลที่อุดมไปด้วยจุลินทรีย์ และการกระจายขนาดของ ccfDNA ของหอยแมลงภู่ เราจึงตั้งสมมติฐานว่า ccfDNA ในน้ำเหลืองของหอยแมลงภู่อาจมี DNA ของจุลินทรีย์ที่หลากหลายและอุดมสมบูรณ์ เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราจึงทำการลำดับเบส ccfDNA ในน้ำเหลืองจากตัวอย่าง Aulacomya atra ที่เก็บรวบรวมจากหมู่เกาะเคอร์เกเลน ได้ผลลัพธ์มากกว่า 10 ล้านลำดับเบส โดย 97.6% ผ่านการตรวจสอบคุณภาพ จากนั้นจึงทำการจำแนกลำดับเบสตามแหล่งที่มาของตนเองและแหล่งที่มาจากภายนอกโดยใช้ฐานข้อมูล BLASTN และ NCBI สำหรับหอยสองฝา (รูปที่ S1 ข้อมูลเพิ่มเติม)
ในมนุษย์ DNA ทั้งนิวเคลียร์และไมโทคอนเดรียสามารถถูกปล่อยเข้าสู่กระแสเลือดได้ [38] อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาปัจจุบันนี้ ไม่สามารถอธิบายรายละเอียดเกี่ยวกับ DNA จีโนมนิวเคลียร์ของหอยแมลงภู่ได้ เนื่องจากจีโนมของ A. atra ยังไม่ได้รับการจัดลำดับหรืออธิบายไว้ แต่เราสามารถระบุชิ้นส่วน ccfDNA จำนวนหนึ่งที่มีต้นกำเนิดของเราเองได้โดยใช้ไลบรารีของหอยสองฝา (รูปที่ S2 ข้อมูลเพิ่มเติม) เรายังยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่มีต้นกำเนิดของเราเองโดยการขยายสัญญาณ PCR ของยีน A. atra ที่ได้รับการจัดลำดับแล้ว (รูปที่ 3) ในทำนองเดียวกัน เนื่องจากจีโนมไมโทคอนเดรียของ A. atra มีอยู่ในฐานข้อมูลสาธารณะ จึงสามารถพบหลักฐานการมีอยู่ของชิ้นส่วน ccfDNA ไมโทคอนเดรียในฮีโมลิมฟ์ของ A. atra การมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ไมโทคอนเดรียได้รับการยืนยันโดยการขยายสัญญาณ PCR (รูปที่ 3)
พบยีนไมโทคอนเดรียหลายชนิดในน้ำเหลืองของ A. atra (จุดสีแดง – หมายเลขสต็อก: SRX5705969) และ M. platensis (จุดสีน้ำเงิน – หมายเลขสต็อก: SRX5705968) ที่ขยายด้วยวิธี PCR ภาพดัดแปลงจาก Breton et al., 2011 B การขยายสารละลายน้ำเหลืองจาก A. atra เก็บรักษาบนกระดาษ FTA ใช้ที่เจาะกระดาษขนาด 3 มม. เจาะใส่ลงในหลอด PCR ที่มีส่วนผสมของ PCR โดยตรง
เนื่องจากมีจุลินทรีย์จำนวนมากในน้ำทะเล เราจึงมุ่งเน้นไปที่การจำแนกลักษณะของลำดับดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ในฮีโมลิมฟ์เป็นหลัก ในการทำเช่นนี้ เราใช้กลยุทธ์ที่แตกต่างกันสองวิธี วิธีแรกใช้ Kraken2 ซึ่งเป็นโปรแกรมจำแนกลำดับตามอัลกอริทึมที่สามารถระบุลำดับจุลินทรีย์ด้วยความแม่นยำเทียบเท่ากับ BLAST และเครื่องมืออื่นๆ [28] พบว่ามีลำดับมากกว่า 6719 ลำดับที่มาจากแบคทีเรีย ในขณะที่ 124 และ 64 ลำดับมาจากอาร์เคียและไวรัส ตามลำดับ (รูปที่ 4) ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่พบมากที่สุดคือ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) และ Bacteroidetes (17%) (รูปที่ 4a) การกระจายตัวนี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับไมโครไบโอมของหอยแมลงภู่สีน้ำเงินในทะเล [39, 40] Gammaproteobacteria เป็นคลาสหลักของ Proteobacteria (44%) รวมถึง Vibrionales จำนวนมาก (รูปที่ 4b) วิธี ddPCR ยืนยันการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ของ Vibrio ใน ccfDNA ของฮีโมลิมฟ์ของ A. atra (รูปที่ 4c) [41] เพื่อให้ได้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับต้นกำเนิดของแบคทีเรียของ ccfDNA จึงได้ใช้วิธีการเพิ่มเติม (รูปที่ S2 ข้อมูลเพิ่มเติม) ในกรณีนี้ ข้อมูลการอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกนำมาประกอบกันเป็นข้อมูลการอ่านแบบคู่ปลาย และถูกจำแนกว่าเป็นข้อมูลที่มาจากแหล่งกำเนิดเดียวกัน (หอยสองฝา) หรือจากแหล่งกำเนิดอื่น โดยใช้ BLASTN และค่า e เท่ากับ 1e−3 และเกณฑ์การตัดที่ความเหมือนกันมากกว่า 90% ในกรณีนี้ ข้อมูลการอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกนำมาประกอบกันเป็นข้อมูลการอ่านแบบคู่ปลาย และถูกจำแนกว่าเป็นข้อมูลที่มาจากแหล่งกำเนิดเดียวกัน (หอยสองฝา) หรือจากแหล่งกำเนิดอื่น โดยใช้ BLASTN และค่า e เท่ากับ 1e−3 และเกณฑ์การตัดที่ความเหมือนกันมากกว่า 90% В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как. собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. ในกรณีนี้ ข้อมูลการอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกรวบรวมเป็นข้อมูลการอ่านแบบคู่ปลาย และถูกจำแนกเป็นข้อมูลดั้งเดิม (หอยสองฝา) หรือข้อมูลที่ไม่ใช่ของดั้งเดิม โดยใช้ BLASTN และค่า e ที่ 1e-3 และค่าตัดที่ความเหมือนกันมากกว่า 90%在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。อยู่ที่ 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные. (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. ในกรณีนี้ ข้อมูลการอ่านที่ทับซ้อนกันจะถูกรวบรวมเป็นข้อมูลการอ่านแบบคู่ปลาย และจำแนกเป็นข้อมูลดั้งเดิม (หอยสองฝา) หรือข้อมูลที่ไม่ใช่ของดั้งเดิม โดยใช้ BLASTN และค่า 1e-3 ​​และเกณฑ์ความเหมือน >90%เนื่องจากจีโนมของ A. atra ยังไม่ได้รับการจัดลำดับ เราจึงใช้กลยุทธ์การประกอบจีโนมแบบ de novo ของโปรแกรมประกอบจีโนม MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) โดยระบุคอนติ๊กทั้งหมด 147,188 ชิ้นว่ามีต้นกำเนิดจากหอยสองฝา จากนั้นจึงทำการขยายคอนติ๊กเหล่านี้ด้วยค่า e-value 1e-10 โดยใช้ BLASTN และ BLASTX กลยุทธ์นี้ทำให้เราสามารถระบุชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ไม่ใช่หอยสองฝาได้ 482 ชิ้นใน ccfDNA ของ A. atra มากกว่าครึ่งหนึ่ง (57%) ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้ได้มาจากแบคทีเรีย โดยส่วนใหญ่มาจากแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกับเหงือก รวมถึงแบคทีเรียที่ใช้ซัลเฟตเป็นแหล่งพลังงาน และจากแบคทีเรีย Solemya velum ที่อาศัยอยู่ร่วมกับเหงือก (รูปที่ 5)
ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ในระดับชนิด B ความหลากหลายทางจุลชีววิทยาของสองไฟลัมหลัก (Firmicutes และ Proteobacteria) การขยายสัญญาณตัวแทนของ ddPCR C Vibrio spp. A ชิ้นส่วนของยีน 16S rRNA (สีน้ำเงิน) ในฮีโมลิมฟ์ของปลาอะทราสามตัว
มีการวิเคราะห์คอนติ๊กที่รวบรวมได้ทั้งหมด 482 รายการ ภาพรวมทั่วไปของการกระจายทางอนุกรมวิธานของคำอธิบายประกอบคอนติ๊กเมตาจีโนมิก (โปรคาริโอตและยูคาริโอต) B การกระจายโดยละเอียดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่ระบุโดย BLASTN และ BLASTX
การวิเคราะห์ Kraken2 ยังแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีชิ้นส่วน DNA ของอาร์เคีย รวมถึงชิ้นส่วน DNA ของ Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) และ Thaurmarcheota (11%) (รูปที่ 6a) การมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่ได้มาจาก Euryarchaeota และ Crenarchaeota ซึ่งเคยพบในชุมชนจุลินทรีย์ของหอยแมลงภู่แคลิฟอร์เนียมาก่อนนั้น ไม่ควรเป็นเรื่องน่าประหลาดใจ [42] แม้ว่า Euryarchaeota มักจะเกี่ยวข้องกับสภาวะที่รุนแรง แต่ปัจจุบันเป็นที่ยอมรับแล้วว่าทั้ง Euryarchaeota และ Crenarcheota เป็นโปรคาริโอตที่พบได้บ่อยที่สุดในสภาพแวดล้อมทางทะเลที่มีอุณหภูมิต่ำ [43, 44] การมีอยู่ของจุลินทรีย์ที่สร้างมีเทนในหอยแมลงภู่ไม่ใช่เรื่องน่าประหลาดใจ เมื่อพิจารณาจากรายงานล่าสุดเกี่ยวกับการรั่วไหลของมีเทนอย่างกว้างขวางจากรอยรั่วที่ก้นทะเลบนที่ราบสูงเคอร์เกเลน [45] และความเป็นไปได้ของการผลิตมีเทนจากจุลินทรีย์ที่สังเกตได้นอกชายฝั่งของหมู่เกาะเคอร์เกเลน [46]
จากนั้นเราจึงหันมาสนใจการอ่านลำดับดีเอ็นเอของไวรัส เท่าที่เราทราบ นี่เป็นการศึกษาแบบไม่ตรงเป้าหมายครั้งแรกเกี่ยวกับปริมาณไวรัสในหอยแมลงภู่ ดังที่คาดไว้ เราพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอของแบคทีริโอเฟจ (Caudovirales) (รูปที่ 6b) อย่างไรก็ตาม ดีเอ็นเอของไวรัสที่พบมากที่สุดมาจากไฟลัมของนิวคลีโอไซโตไวรัส หรือที่รู้จักกันในชื่อไวรัสดีเอ็นเอขนาดใหญ่ในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม (NCLDV) ซึ่งมีจีโนมใหญ่ที่สุดในบรรดาไวรัสทั้งหมด ภายในไฟลัมนี้ ลำดับดีเอ็นเอส่วนใหญ่เป็นของวงศ์ Mimimidoviridae (58%) และ Poxviridae (21%) ซึ่งมีโฮสต์ตามธรรมชาติเป็นสัตว์มีกระดูกสันหลังและสัตว์ขาปล้อง ในขณะที่ลำดับดีเอ็นเอส่วนน้อยเป็นของสาหร่ายที่ติดเชื้อไวรัส ซึ่งติดเชื้อในสาหร่ายยูคาริโอตในทะเล นอกจากนี้ยังได้ลำดับจากไวรัสแพนโดรา ซึ่งเป็นไวรัสยักษ์ที่มีขนาดจีโนมใหญ่ที่สุดในบรรดาสกุลไวรัสที่รู้จักทั้งหมด ที่น่าสนใจคือ ช่วงของโฮสต์ที่ทราบว่าติดเชื้อไวรัส ซึ่งกำหนดโดยการจัดลำดับ ccfDNA ของฮีโมลิมฟ์นั้นค่อนข้างกว้าง (รูปที่ S3 ข้อมูลเพิ่มเติม) ซึ่งรวมถึงไวรัสที่ติดเชื้อในแมลง เช่น Baculoviridae และ Iridoviridae รวมถึงไวรัสที่ติดเชื้อในอะมีบา สาหร่าย และสัตว์มีกระดูกสันหลัง เรายังพบลำดับที่ตรงกับจีโนมของ Pithovirus sibericum ด้วย ไวรัสพิโทไวรัส (หรือที่รู้จักกันในชื่อ “ไวรัสซอมบี้”) ถูกแยกได้ครั้งแรกจากดินเยือกแข็งอายุ 30,000 ปีในไซบีเรีย [47] ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่าไม่ใช่ทุกสายพันธุ์ของไวรัสเหล่านี้ที่สูญพันธุ์ไปแล้ว [48] และไวรัสเหล่านี้อาจมีอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลกึ่งอาร์กติกที่ห่างไกล
สุดท้าย เราได้ทดสอบเพื่อดูว่าเราสามารถค้นหาชิ้นส่วน DNA จากสัตว์หลายเซลล์ชนิดอื่นได้หรือไม่ มีการระบุคอนติ๊กต่างประเทศทั้งหมด 482 รายการโดยใช้ BLASTN และ BLASTX กับไลบรารี nt, nr และ RefSeq (จีโนมและโปรตีน) ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าในบรรดาชิ้นส่วนต่างประเทศของ ccfDNA ของสัตว์หลายเซลล์นั้น DNA จากกระดูกมีจำนวนมากที่สุด (รูปที่ 5) นอกจากนี้ยังพบชิ้นส่วน DNA จากแมลงและสายพันธุ์อื่นๆ อีกด้วย ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่ยังไม่ได้รับการระบุ อาจเป็นเพราะจำนวนสายพันธุ์ทางทะเลจำนวนมากในฐานข้อมูลจีโนมมีน้อยกว่าเมื่อเทียบกับสายพันธุ์บนบก [49]
ในงานวิจัยนี้ เราได้ประยุกต์ใช้แนวคิด LB กับหอยแมลงภู่ โดยให้เหตุผลว่า การจัดลำดับดีเอ็นเออิสระในฮีโมลิมฟ์ (ccfDNA shot sequencing) สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับองค์ประกอบของระบบนิเวศชายฝั่งทะเลได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราพบว่า 1) ฮีโมลิมฟ์ของหอยแมลงภู่มีดีเอ็นเอชิ้นส่วนหมุนเวียนขนาดใหญ่ (~1-5 กิโลเบส) ในความเข้มข้นค่อนข้างสูง (ระดับไมโครกรัม) 2) ดีเอ็นเอชิ้นส่วนเหล่านี้มีทั้งแบบอิสระและไม่อิสระ 3) ในบรรดาแหล่งที่มาของดีเอ็นเอชิ้นส่วนเหล่านี้ เราพบดีเอ็นเอของแบคทีเรีย อาร์เคีย และไวรัส รวมถึงดีเอ็นเอของสัตว์หลายเซลล์อื่นๆ 4) การสะสมของดีเอ็นเอชิ้นส่วนอิสระเหล่านี้ในฮีโมลิมฟ์เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและมีส่วนช่วยในกิจกรรมการกรองภายในของหอยแมลงภู่ โดยสรุป งานวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่า แนวคิด LB ซึ่งส่วนใหญ่ถูกนำไปใช้ในด้านชีวการแพทย์นั้น เป็นแหล่งความรู้ที่อุดมสมบูรณ์แต่ยังไม่ได้รับการสำรวจ ซึ่งสามารถนำมาใช้เพื่อทำความเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างสิ่งมีชีวิตที่เป็นตัวบ่งชี้และสิ่งแวดล้อมได้ดียิ่งขึ้น
นอกจากไพรเมตแล้ว ยังมีรายงานการแยก ccfDNA ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ได้แก่ หนู สุนัข แมว และม้า [50, 51, 52] อย่างไรก็ตาม เท่าที่เรารู้ การศึกษาของเราเป็นครั้งแรกที่รายงานการตรวจจับและลำดับของ ccfDNA ในสัตว์ทะเลที่มีระบบไหลเวียนแบบเปิด ลักษณะทางกายวิภาคและความสามารถในการกรองของหอยแมลงภู่อาจอธิบายลักษณะขนาดที่แตกต่างกันของชิ้นส่วน DNA ที่ไหลเวียนเมื่อเทียบกับสายพันธุ์อื่นได้ ในมนุษย์ ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่ที่ไหลเวียนในเลือดเป็นชิ้นส่วนขนาดเล็กที่มีขนาดตั้งแต่ 150 ถึง 200 bp โดยมีขนาดสูงสุดที่ 167 bp [34, 53] ชิ้นส่วน DNA ส่วนน้อยแต่สำคัญมีขนาดระหว่าง 300 ถึง 500 bp และประมาณ 5% มีความยาวมากกว่า 900 bp [54] เหตุผลของการกระจายขนาดนี้คือ แหล่งที่มาหลักของ ccfDNA ในพลาสมาเกิดขึ้นจากการตายของเซลล์ ไม่ว่าจะเป็นการตายของเซลล์หรือภาวะเนื้อตายของเซลล์เม็ดเลือดที่ไหลเวียนในบุคคลที่มีสุขภาพดี หรือภาวะอะพอพโทซิสของเซลล์มะเร็งในผู้ป่วยมะเร็ง (เรียกว่า DNA ของเนื้องอกที่ไหลเวียน หรือ ctDNA) การกระจายขนาดของ ccfDNA ในน้ำเหลืองที่เราพบในหอยแมลงภู่มีช่วงตั้งแต่ 1,000 ถึง 5,000 bp ซึ่งบ่งชี้ว่า ccfDNA ของหอยแมลงภู่มีแหล่งกำเนิดที่แตกต่างกัน นี่เป็นสมมติฐานที่สมเหตุสมผล เนื่องจากหอยแมลงภู่มีระบบหลอดเลือดแบบกึ่งเปิดและอาศัยอยู่ในสภาพแวดล้อมทางน้ำในทะเลที่มีความเข้มข้นสูงของ DNA จีโนมของจุลินทรีย์ อันที่จริง การทดลองในห้องปฏิบัติการของเราโดยใช้ DNA จากภายนอกแสดงให้เห็นว่าหอยแมลงภู่สะสมชิ้นส่วน DNA ในน้ำทะเล อย่างน้อยหลังจากนั้นไม่กี่ชั่วโมง ชิ้นส่วนเหล่านั้นจะถูกย่อยสลายหลังจากการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ และ/หรือถูกปล่อยออกมา และ/หรือถูกเก็บไว้ในโครงสร้างต่างๆ เนื่องจากเซลล์ (ทั้งโปรคาริโอตและยูคาริโอต) มีจำนวนน้อย การใช้ช่องว่างภายในลิ้นจะช่วยลดปริมาณ ccfDNA จากแหล่งภายในและจากแหล่งภายนอก เมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของหอยสองฝาและจำนวนฟาโกไซต์ที่ไหลเวียนอยู่เป็นจำนวนมาก เราจึงตั้งสมมติฐานเพิ่มเติมว่า แม้แต่ ccfDNA จากแหล่งภายนอกก็อาจถูกสะสมอยู่ในฟาโกไซต์ที่ไหลเวียนอยู่ ซึ่งจะสะสม DNA จากแหล่งภายนอกเมื่อกลืนกินจุลินทรีย์และ/หรือเศษเซลล์ โดยสรุป ผลการวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่า ccfDNA ในน้ำเหลืองของหอยสองฝาเป็นแหล่งเก็บข้อมูลโมเลกุลที่ไม่เหมือนใคร และตอกย้ำสถานะของพวกมันในฐานะสิ่งมีชีวิตที่เป็นตัวชี้วัดสำคัญ
ข้อมูลของเราบ่งชี้ว่าการจัดลำดับและการวิเคราะห์ชิ้นส่วน ccfDNA ของฮีโมลิมฟ์ที่ได้จากแบคทีเรียสามารถให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับจุลินทรีย์แบคทีเรียในโฮสต์และแบคทีเรียที่มีอยู่ในระบบนิเวศทางทะเลโดยรอบ เทคนิคการจัดลำดับแบบช็อตได้เปิดเผยลำดับของแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกันในเหงือกของ A. atra ซึ่งอาจพลาดไปหากใช้วิธีการระบุ 16S rRNA แบบดั้งเดิม ส่วนหนึ่งเนื่องมาจากอคติของไลบรารีอ้างอิง อันที่จริง การใช้ข้อมูล LB ที่เก็บรวบรวมจาก M. platensis ในชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่ Kerguelen แสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบของแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกับเหงือกนั้นเหมือนกันสำหรับหอยแมลงภู่ทั้งสองชนิด (รูปที่ S4 ข้อมูลเพิ่มเติม) ความคล้ายคลึงกันของหอยแมลงภู่สองชนิดที่แตกต่างกันทางพันธุกรรมนี้อาจสะท้อนถึงองค์ประกอบของชุมชนแบคทีเรียในตะกอนที่เย็น มีกำมะถัน และเป็นหินภูเขาไฟของ Kerguelen [55, 56, 57, 58] มีการอธิบายอย่างละเอียดถึงระดับของจุลินทรีย์ลดซัลเฟอร์ที่สูงขึ้นเมื่อเก็บเกี่ยวหอยแมลงภู่จากพื้นที่ชายฝั่งที่มีการกวนทางชีวภาพ [59] เช่น ชายฝั่งของปอร์โตฟรองซ์ อีกความเป็นไปได้หนึ่งคือจุลินทรีย์ที่อาศัยอยู่ร่วมกับหอยแมลงภู่อาจได้รับผลกระทบจากการส่งผ่านในแนวนอน [60, 61] จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างสภาพแวดล้อมทางทะเล พื้นผิวของพื้นทะเล และองค์ประกอบของแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกับหอยแมลงภู่ การศึกษาเหล่านี้กำลังดำเนินการอยู่
ความยาวและความเข้มข้นของ ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์ ความง่ายในการทำให้บริสุทธิ์ และคุณภาพสูงที่ช่วยให้การจัดลำดับแบบช็อตกันอย่างรวดเร็ว เป็นข้อดีหลายประการของการใช้ ccfDNA จากหอยแมลงภู่ในการประเมินความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศชายฝั่งทะเล วิธีนี้มีประสิทธิภาพเป็นพิเศษสำหรับการจำแนกลักษณะของชุมชนไวรัส (ไวโรม) ในระบบนิเวศที่กำหนด [62, 63] แตกต่างจากแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต จีโนมของไวรัสไม่มีจีนที่อนุรักษ์ทางวิวัฒนาการ เช่น ลำดับ 16S ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าตัวอย่างของเหลวจากสิ่งมีชีวิตที่เป็นตัวบ่งชี้ เช่น หอยแมลงภู่ สามารถใช้เพื่อระบุชิ้นส่วนไวรัส ccfDNA จำนวนมากที่ทราบกันว่าติดเชื้อในโฮสต์ที่อาศัยอยู่ในระบบนิเวศชายฝั่งทะเล ซึ่งรวมถึงไวรัสที่ทราบกันว่าติดเชื้อในโปรโตซัว อาร์โทรพอด แมลง พืช และไวรัสแบคทีเรีย (เช่น แบคทีริโอเฟจ) พบการกระจายตัวที่คล้ายคลึงกันเมื่อเราตรวจสอบไวรัส ccfDNA ในน้ำเหลืองของหอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (M. platensis) ที่เก็บรวบรวมจากชั้นหอยแมลงภู่เดียวกันที่เกาะเคอร์เกอเลน (ตาราง S2 ข้อมูลเพิ่มเติม) การจัดลำดับแบบช็อตกันของ ccfDNA เป็นแนวทางใหม่ที่กำลังได้รับความนิยมในการศึกษาไวรัสของมนุษย์หรือสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น [21, 37, 64] แนวทางนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาไวรัสดีเอ็นเอสองสาย เนื่องจากไม่มีจีนเดียวที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในไวรัสดีเอ็นเอสองสายทั้งหมด ซึ่งเป็นตัวแทนของไวรัสที่มีความหลากหลายและกว้างขวางที่สุดในบัลติมอร์ [65] แม้ว่าไวรัสส่วนใหญ่เหล่านี้ยังไม่ได้รับการจำแนกประเภทและอาจรวมถึงไวรัสจากส่วนที่ไม่รู้จักของโลกไวรัส [66] เราพบว่าไวรัสและช่วงโฮสต์ของหอยแมลงภู่ A. atra และ M. platensis อยู่ระหว่างสองสายพันธุ์ในลักษณะที่คล้ายคลึงกัน (ดูรูป S3 ข้อมูลเพิ่มเติม) ความคล้ายคลึงกันนี้ไม่น่าแปลกใจ เนื่องจากอาจสะท้อนให้เห็นถึงการขาดความจำเพาะในการดูดซับดีเอ็นเอที่มีอยู่ในสิ่งแวดล้อม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมโดยใช้อาร์เอ็นเอที่บริสุทธิ์เพื่อระบุลักษณะของไวรัสอาร์เอ็นเอในอนาคต
ในการศึกษาของเรา เราใช้ไปป์ไลน์ที่เข้มงวดมากซึ่งดัดแปลงมาจากงานของ Kowarski และเพื่อนร่วมงาน [37] ซึ่งใช้การลบอ่านและคอนติ๊กที่รวมกันสองขั้นตอนก่อนและหลังการประกอบ ccfDNA ดั้งเดิม ส่งผลให้มีสัดส่วนของอ่านที่ไม่สามารถจับคู่ได้สูง ดังนั้น เราจึงไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ที่อ่านที่ไม่สามารถจับคู่ได้เหล่านี้บางส่วนอาจยังมีต้นกำเนิดของตัวเองได้ เนื่องจากเราไม่มีจีโนมอ้างอิงสำหรับหอยแมลงภู่ชนิดนี้ เรายังใช้ไปป์ไลน์นี้เพราะเรากังวลเกี่ยวกับไคเมอราส์ระหว่างอ่านของตัวเองและอ่านที่ไม่ใช่ของตัวเอง และความยาวของอ่านที่สร้างโดย Illumina MiSeq PE75 อีกเหตุผลหนึ่งสำหรับการอ่านที่ไม่สามารถจับคู่ได้ส่วนใหญ่คือจุลินทรีย์ในทะเลจำนวนมาก โดยเฉพาะในพื้นที่ห่างไกลเช่น Kerguelen ยังไม่ได้รับการระบุ เราใช้ Illumina MiSeq PE75 โดยสมมติว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA คล้ายกับ ccfDNA ของมนุษย์ สำหรับการศึกษาในอนาคต จากผลการวิจัยของเราที่แสดงให้เห็นว่า ccfDNA ในน้ำเหลืองของหอยมีขนาดลำดับเบสยาวกว่าในมนุษย์และ/หรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เราขอแนะนำให้ใช้แพลตฟอร์มการจัดลำดับเบสที่เหมาะสมกับชิ้นส่วน ccfDNA ที่ยาวกว่า วิธีนี้จะช่วยให้ระบุสิ่งบ่งชี้สำหรับการวิเคราะห์เชิงลึกได้ง่ายขึ้น การได้รับลำดับจีโนมของนิวเคลียสของ A. atra ที่สมบูรณ์ ซึ่งปัจจุบันยังไม่มีอยู่ จะช่วยอำนวยความสะดวกในการแยกแยะ ccfDNA จากแหล่งที่มาของตัวเองและแหล่งอื่น ๆ ได้มากขึ้น เนื่องจากการวิจัยของเรามุ่งเน้นไปที่ความเป็นไปได้ในการประยุกต์ใช้แนวคิดการตรวจชิ้นเนื้อเหลวกับหอยแมลงภู่ เราหวังว่าเมื่อมีการนำแนวคิดนี้ไปใช้ในการวิจัยในอนาคต จะมีการพัฒนาเครื่องมือและกระบวนการใหม่ ๆ เพื่อเพิ่มศักยภาพของวิธีการนี้ในการศึกษาความหลากหลายทางจุลชีววิทยาของระบบนิเวศทางทะเลของหอยแมลงภู่
ระดับ ccfDNA ในพลาสมาของมนุษย์ที่สูงขึ้น ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางคลินิกที่ไม่รุกราน มีความสัมพันธ์กับโรคต่างๆ ความเสียหายของเนื้อเยื่อ และสภาวะความเครียด [67,68,69] การเพิ่มขึ้นนี้เกี่ยวข้องกับการปล่อยชิ้นส่วน DNA ที่มีต้นกำเนิดมาจากตัวมันเองหลังจากความเสียหายของเนื้อเยื่อ เราได้ศึกษาปัญหานี้โดยใช้ความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน โดยให้หอยแมลงภู่สัมผัสกับอุณหภูมิ 30 °C ในระยะเวลาสั้นๆ เราทำการวิเคราะห์นี้กับหอยแมลงภู่สามชนิดที่แตกต่างกันในการทดลองอิสระสามครั้ง อย่างไรก็ตาม เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในระดับ ccfDNA หลังจากความเครียดจากความร้อนเฉียบพลัน (ดูรูป S5 ข้อมูลเพิ่มเติม) การค้นพบนี้อาจอธิบายได้บางส่วนถึงข้อเท็จจริงที่ว่าหอยแมลงภู่มีระบบไหลเวียนโลหิตแบบกึ่งเปิดและสะสม DNA จากภายนอกจำนวนมากเนื่องจากกิจกรรมการกรองที่สูง ในทางกลับกัน หอยแมลงภู่ เช่นเดียวกับสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายชนิด อาจมีความต้านทานต่อความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากความเครียดได้มากกว่า จึงจำกัดการปล่อย ccfDNA ในฮีโมลิมฟ์ของพวกมัน [70, 71]
จนถึงปัจจุบัน การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของความหลากหลายทางชีวภาพในระบบนิเวศทางน้ำส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่เมตาบาร์โค้ดดิ้งดีเอ็นเอสิ่งแวดล้อม (eDNA) อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มักมีข้อจำกัดในการวิเคราะห์ความหลากหลายทางชีวภาพเมื่อใช้ไพรเมอร์ การใช้การจัดลำดับแบบช็อตกันช่วยหลีกเลี่ยงข้อจำกัดของ PCR และการเลือกชุดไพรเมอร์ที่มีอคติ ดังนั้น ในแง่หนึ่ง วิธีของเราจึงใกล้เคียงกับวิธีการจัดลำดับ eDNA แบบช็อตกันที่มีปริมาณงานสูงที่ใช้กันในปัจจุบัน ซึ่งสามารถจัดลำดับดีเอ็นเอที่แตกหักได้โดยตรงและวิเคราะห์สิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมด [72, 73] อย่างไรก็ตาม มีประเด็นพื้นฐานหลายประการที่ทำให้ LB แตกต่างจากวิธีการ eDNA มาตรฐาน แน่นอนว่าความแตกต่างหลักระหว่าง eDNA และ LB คือการใช้โฮสต์ตัวกรองตามธรรมชาติ มีรายงานการใช้สิ่งมีชีวิตในทะเล เช่น ฟองน้ำและหอยสองฝา (Dresseina spp.) เป็นตัวกรองตามธรรมชาติสำหรับการศึกษา eDNA [74, 75] อย่างไรก็ตาม การศึกษาของ Dreissena ใช้ชิ้นเนื้อที่สกัดดีเอ็นเอออกมา การวิเคราะห์ ccfDNA จาก LB ไม่จำเป็นต้องใช้การตรวจชิ้นเนื้อ อุปกรณ์เฉพาะทาง และบางครั้งก็มีราคาแพง รวมถึงโลจิสติกส์ที่เกี่ยวข้องกับ eDNA หรือการตรวจชิ้นเนื้อ อันที่จริง เราได้รายงานเมื่อเร็วๆ นี้ว่า ccfDNA จาก LB สามารถจัดเก็บและวิเคราะห์ได้โดยใช้ FTA โดยไม่ต้องรักษาห่วงโซ่ความเย็น ซึ่งเป็นความท้าทายที่สำคัญสำหรับการวิจัยในพื้นที่ห่างไกล [76] การสกัด ccfDNA จากตัวอย่างของเหลวก็ทำได้ง่ายและให้ DNA คุณภาพสูงสำหรับการจัดลำดับแบบช็อตกันและการวิเคราะห์ PCR นี่เป็นข้อได้เปรียบอย่างมากเมื่อพิจารณาถึงข้อจำกัดทางเทคนิคบางประการที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ eDNA [77] ความเรียบง่ายและต้นทุนต่ำของวิธีการเก็บตัวอย่างยังเหมาะอย่างยิ่งสำหรับโปรแกรมการติดตามระยะยาว นอกจากความสามารถในการกรองสูงแล้ว คุณสมบัติที่รู้จักกันดีอีกประการหนึ่งของหอยสองฝาคือองค์ประกอบทางเคมีของมิวโคโพลีแซคคาไรด์ในเมือก ซึ่งส่งเสริมการดูดซับไวรัส [78, 79] ทำให้หอยสองฝาเป็นตัวกรองธรรมชาติที่เหมาะสำหรับการกำหนดลักษณะความหลากหลายทางชีวภาพและผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศในระบบนิเวศทางน้ำที่กำหนด แม้ว่าการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA ที่ได้มาจากโฮสต์อาจถูกมองว่าเป็นข้อจำกัดของวิธีการเมื่อเทียบกับ eDNA แต่ต้นทุนที่เกี่ยวข้องกับการมี ccfDNA ดั้งเดิมดังกล่าวเมื่อเทียบกับ eDNA นั้นก็เข้าใจได้ในเวลาเดียวกัน เนื่องจากมีข้อมูลจำนวนมหาศาลสำหรับการศึกษาด้านสุขภาพ ซึ่งรวมถึงการมีลำดับไวรัสที่รวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ สิ่งนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับหอยแมลงภู่ เนื่องจากมีเรโทรไวรัสลูคีเมียที่ถ่ายทอดในแนวนอนในหอยสองฝา [80, 81] ข้อดีอีกประการหนึ่งของ LB เหนือ eDNA คือการใช้ประโยชน์จากกิจกรรมฟาโกไซติกของเซลล์เม็ดเลือดที่ไหลเวียนในฮีโมลิมฟ์ ซึ่งจะกลืนกินจุลินทรีย์ (และจีโนมของพวกมัน) ฟาโกไซโตซิสเป็นหน้าที่หลักของเซลล์เม็ดเลือดในหอยสองฝา [82] สุดท้ายนี้ วิธีการนี้ใช้ประโยชน์จากความสามารถในการกรองสูงของหอยแมลงภู่ (เฉลี่ย 1.5 ลิตร/ชั่วโมงของน้ำทะเล) และการหมุนเวียนสองวัน ซึ่งเพิ่มการผสมของชั้นน้ำทะเลที่แตกต่างกัน ทำให้สามารถจับ eDNA ที่แตกต่างกันได้ [83, 84] ดังนั้น การวิเคราะห์ ccfDNA ของหอยแมลงภู่จึงเป็นแนวทางที่น่าสนใจเมื่อพิจารณาถึงผลกระทบทางโภชนาการ เศรษฐกิจ และสิ่งแวดล้อมของหอยแมลงภู่ เช่นเดียวกับการวิเคราะห์ LB ที่เก็บจากมนุษย์ วิธีนี้ยังเปิดโอกาสในการวัดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ใน DNA ของโฮสต์เพื่อตอบสนองต่อสารภายนอก ตัวอย่างเช่น เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นที่สามสามารถนำมาใช้ในการวิเคราะห์เมทิลเลชั่นทั่วทั้งจีโนมใน ccfDNA ดั้งเดิมโดยใช้การจัดลำดับนาโนพอเร กระบวนการนี้ควรได้รับการอำนวยความสะดวกโดยข้อเท็จจริงที่ว่าความยาวของชิ้นส่วน ccfDNA ของหอยแมลงภู่เข้ากันได้ดีกับแพลตฟอร์มการจัดลำดับแบบอ่านยาว ซึ่งช่วยให้สามารถวิเคราะห์การเมทิลเลชั่นของ DNA ทั่วทั้งจีโนมจากการจัดลำดับเพียงครั้งเดียวโดยไม่จำเป็นต้องมีการแปลงทางเคมี [85,86] นี่เป็นความเป็นไปได้ที่น่าสนใจ เนื่องจากมีการแสดงให้เห็นแล้วว่ารูปแบบการเมทิลเลชั่นของ DNA สะท้อนถึงการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมและคงอยู่ได้หลายชั่วอายุคน ดังนั้นจึงสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าเกี่ยวกับกลไกพื้นฐานที่ควบคุมการตอบสนองหลังจากการสัมผัสกับการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศหรือมลพิษ [87] อย่างไรก็ตาม การใช้ LB ก็มีข้อจำกัดเช่นกัน แน่นอนว่าสิ่งนี้ต้องการการมีอยู่ของสายพันธุ์ตัวบ่งชี้ในระบบนิเวศ ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น การใช้ LB เพื่อประเมินความหลากหลายทางชีวภาพของระบบนิเวศที่กำหนด ยังต้องการไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศที่เข้มงวดซึ่งคำนึงถึงการมีอยู่ของชิ้นส่วน DNA จากแหล่งที่มา ปัญหาสำคัญอีกประการหนึ่งคือความพร้อมของจีโนมอ้างอิงสำหรับสายพันธุ์ทางทะเล หวังว่าโครงการริเริ่มต่างๆ เช่น โครงการจีโนมสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในทะเล และโครงการ Fish10k ที่เพิ่งจัดตั้งขึ้น [88] จะช่วยอำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ดังกล่าวในอนาคต การประยุกต์ใช้แนวคิด LB กับสิ่งมีชีวิตในทะเลที่กินอาหารแบบกรองยังเข้ากันได้กับความก้าวหน้าล่าสุดในเทคโนโลยีการจัดลำดับ ทำให้เหมาะสำหรับการพัฒนาไบโอมาร์กเกอร์หลายโอห์มเพื่อให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับสุขภาพของแหล่งที่อยู่อาศัยในทะเลในการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม
ข้อมูลลำดับจีโนมได้ถูกฝากไว้ใน NCBI Sequence Read Archive ที่ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ภายใต้โครงการชีวภาพ SRR8924808
Brierley AS, Kingsford MJ ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศต่อสิ่งมีชีวิตและระบบนิเวศทางทะเล Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S และคณะ พิจารณาผลกระทบร่วมกันของการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศและปัจจัยกดดันในท้องถิ่นอื่นๆ ต่อสิ่งแวดล้อมทางทะเล สิ่งแวดล้อมทางวิทยาศาสตร์ทั่วไป 2021;755:142564
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, และคณะ ). ศาสตร์แห่งวันที่ 1 มีนาคม 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ความทนทานต่อความร้อนที่ลดลงภายใต้สภาวะความเครียดจากความร้อนซ้ำๆ อธิบายถึงอัตราการตายสูงของหอยแมลงภู่สีน้ำเงินในช่วงฤดูร้อน รายงานทางวิทยาศาสตร์ 2019; 9:17498
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER และคณะ การเปลี่ยนแปลงล่าสุดในความถี่ สาเหตุ และขอบเขตของการตายของสัตว์ Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, และคณะ เชื้อโรคที่ไม่เฉพาะเจาะจงหลายชนิดอาจทำให้ Pinna nobilis เสียชีวิตจำนวนมาก ชีวิต. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. ผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศต่อโรคติดต่อจากสัตว์สู่คนในแถบอาร์กติก Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. และคณะ หอยแมลงภู่สีน้ำเงิน (Mytilus edulis spp.) เป็นสิ่งมีชีวิตบ่งชี้ในการตรวจสอบมลพิษชายฝั่ง: บทวิจารณ์ Mar Environ Res 2017; 130:338-65
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. การบูรณาการการตรวจชิ้นเนื้อเหลวในการรักษาโรคมะเร็ง Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C และคณะ การเจริญเติบโตของตัวอย่างชีวภาพเหลว: ช่วยให้ดีเอ็นเอของเนื้องอกไหลเวียนได้ Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. กรดนิวคลีอิกในพลาสมาของมนุษย์ รายงานการประชุมของสาขา Soc Biol 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. บทบาทใหม่ของดีเอ็นเออิสระในเซลล์ในฐานะเครื่องหมายโมเลกุลสำหรับการรักษามะเร็ง การหาปริมาณการวิเคราะห์ไบโอโมลาร์ 2019;17:100087
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS การตรวจชิ้นเนื้อเหลวเข้าสู่คลินิก – ปัญหาในการนำไปใช้และความท้าทายในอนาคต Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW และคณะ ดีเอ็นเอของทารกในครรภ์มีอยู่ในพลาสมาและซีรั่มของมารดา Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR การศึกษาเกี่ยวกับขั้นตอนการตั้งครรภ์และภาวะแทรกซ้อนโดยใช้ RNA นอกเซลล์ที่หมุนเวียนในเลือดของสตรีระหว่างตั้งครรภ์ Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J และคณะ การตรวจชิ้นเนื้อเหลว: ดีเอ็นเออิสระจากเซลล์ผู้บริจาคใช้ในการตรวจหาความผิดปกติของเนื้อเยื่อต่างชนิดในไตที่ปลูกถ่าย Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM นวัตกรรมในการวินิจฉัยก่อนคลอด: การจัดลำดับจีโนมพลาสมาของมารดา Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D และคณะ การตรวจจับเชื้อก่อโรคอย่างรวดเร็วด้วยการจัดลำดับจีโนมแบบเมตาจีโนมิกส์รุ่นใหม่ของของเหลวในร่างกายที่ติดเชื้อ Nat Medicine. 2021;27:115-24.