Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among i-render ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang liquid biopsy (LB) usa ka konsepto nga paspas nga nagkapopular sa natad sa biomedical. Ang konsepto gibase sa pag-ila sa mga tipik sa naglibot nga extracellular DNA (ccfDNA), nga kasagaran gipagawas isip gagmay nga mga tipik human sa pagkamatay sa selula sa lainlaing mga tisyu. Gamay nga bahin niini nga mga tipik naggikan sa langyaw (langyaw) nga mga tisyu o organismo. Sa kasamtangang trabaho, among gigamit kini nga konsepto sa mga tahong, usa ka sentinel species nga nailhan tungod sa ilang taas nga kapasidad sa pagsala sa tubig sa dagat. Gigamit namo ang abilidad sa mga tahong nga molihok isip natural nga mga filter aron makuha ang mga tipik sa DNA sa kalikopan gikan sa lainlaing mga gigikanan aron makahatag impormasyon bahin sa biodiversity sa mga ekosistema sa baybayon sa dagat. Ang among mga resulta nagpakita nga ang hemolymph sa tahong adunay mga tipik sa DNA nga lainlain ang gidak-on, gikan sa 1 hangtod 5 kb. Ang shotgun sequencing nagpakita nga daghang gidaghanon sa mga tipik sa DNA ang gikan sa langyaw nga microbial. Lakip niini, nakit-an namo ang mga tipik sa DNA gikan sa bakterya, archaea, ug mga virus, lakip ang mga virus nga nahibal-an nga maka-impeksyon sa lainlaing mga host nga kasagarang makita sa mga ekosistema sa dagat sa baybayon. Sa konklusyon, ang among pagtuon nagpakita nga ang konsepto sa LB nga gigamit sa mga tahong nagrepresentar sa usa ka dato apan wala pa masusi nga tinubdan sa kahibalo bahin sa pagkalainlain sa mikrobyo sa mga ekosistema sa baybayon sa dagat.
Ang epekto sa pagbag-o sa klima (CC) sa biodiversity sa mga ekosistema sa dagat usa ka paspas nga nagtubo nga natad sa panukiduki. Ang pag-init sa kalibutan dili lamang hinungdan sa hinungdanon nga mga stress sa pisyolohikal, apan nagduso usab sa mga limitasyon sa ebolusyon sa thermal stability sa mga organismo sa dagat, nga nakaapekto sa puy-anan sa daghang mga espisye, nga nag-aghat kanila sa pagpangita alang sa mas paborableng mga kondisyon [1, 2]. Gawas pa sa pag-apekto sa biodiversity sa mga metazoan, ang CC nakabalda sa delikado nga balanse sa interaksyon sa host-microbial. Kini nga microbial dysbacteriosis naghulga sa mga ekosistema sa dagat tungod kay kini naghimo sa mga organismo sa dagat nga mas dali nga mataptan sa mga makatakod nga pathogen [3, 4]. Gituohan nga ang SS adunay hinungdanon nga papel sa daghang kamatayon, nga usa ka seryoso nga problema alang sa pagdumala sa mga ekosistema sa dagat sa kalibutan [5, 6]. Kini usa ka hinungdanon nga isyu tungod sa mga epekto sa ekonomiya, ekolohiya ug nutrisyon sa daghang mga espisye sa dagat. Kini labi ka tinuod alang sa mga bivalve nga nagpuyo sa mga rehiyon sa polar, diin ang mga epekto sa CK mas dali ug grabe [6, 7]. Sa tinuud, ang mga bivalve sama sa Mytilus spp. kaylap nga gigamit aron mabantayan ang mga epekto sa CC sa mga ekosistema sa dagat. Dili ikatingala, daghang mga biomarker ang naugmad aron mabantayan ang ilang kahimsog, kasagaran gamit ang duha ka tier nga pamaagi nga naglambigit sa mga functional biomarker base sa enzymatic activity o cellular functions sama sa cell viability ug phagocytic activity [8]. Kini nga mga pamaagi naglakip usab sa pagsukod sa konsentrasyon sa mga specific pressure indicator nga natipon sa humok nga mga tisyu pagkahuman sa pagsuhop sa daghang tubig sa dagat. Bisan pa, ang taas nga kapasidad sa pagsala ug semi-open circulatory system sa mga bivalve naghatag usa ka oportunidad sa pagpalambo sa bag-ong mga hemolymph biomarker gamit ang konsepto sa liquid biopsy (LB), usa ka yano ug minimally invasive nga pamaagi sa pagdumala sa pasyente. mga sample sa dugo [9, 10]. Bisan kung daghang mga klase sa circulating molecules ang makit-an sa human LB, kini nga konsepto panguna nga gibase sa DNA sequencing analysis sa circulating extracellular DNA (ccfDNA) fragments sa plasma. Sa tinuud, ang presensya sa circulating DNA sa human plasma nahibal-an sukad sa tunga-tunga sa ika-20 nga siglo [11], apan sa bag-ohay nga mga tuig lamang nga ang pag-abot sa high-throughput sequencing methods misangpot sa clinical diagnosis base sa ccfDNA. Ang presensya niining mga naglibot nga tipik sa DNA tungod sa pasibo nga pagpagawas sa genomic DNA (nuclear ug mitochondrial) human sa kamatayon sa selula. Sa himsog nga mga indibidwal, ang konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL) apan mahimong madugangan sa 5-10 ka pilo sa mga pasyente nga nag-antos sa lainlaing mga patolohiya o na-stress, nga moresulta sa kadaot sa tisyu. Sa himsog nga mga indibidwal, ang konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL) apan mahimong madugangan sa 5-10 ka pilo sa mga pasyente nga nag-antos sa lainlaing mga patolohiya o na-stress, nga moresulta sa kadaot sa tisyu. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухльоч патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sa himsog nga mga tawo, ang konsentrasyon sa cccDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL), apan mahimo kini nga motaas og 5-10 ka pilo sa mga pasyente nga adunay lainlaing mga patolohiya o ubos sa stress nga mosangpot sa kadaot sa tisyu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损中。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 或 受 承受可 增加 5-10 ， 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у млица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ang konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/ml) sa himsog nga mga indibidwal, apan mahimong madugangan og 5-10 ka pilo sa mga pasyente nga adunay lainlaing mga patolohiya o stress, nga moresulta sa kadaot sa tisyu.Ang gidak-on sa mga tipik sa ccfDNA managlahi, apan kasagaran gikan sa 150 ngadto sa 200 bp. [12]. Ang pag-analisar sa self-derived ccfDNA, ie, ccfDNA gikan sa normal o transformed host cells, magamit aron mahibal-an ang mga pagbag-o sa genetic ug epigenetic nga anaa sa nuclear ug/o mitochondrial genome, sa ingon makatabang sa mga clinician sa pagpili sa piho nga mga terapiya nga gitarget sa molekula [13]. Bisan pa, ang ccfDNA makuha gikan sa langyaw nga mga tinubdan sama sa ccfDNA gikan sa mga fetal cells atol sa pagmabdos o gikan sa mga transplanted organ [14,15,16,17]. Ang ccfDNA usa usab ka importante nga tinubdan sa impormasyon alang sa pag-ila sa presensya sa mga nucleic acid sa usa ka makatakod nga ahente (langyaw), nga nagtugot sa dili-invasive nga pag-ila sa kaylap nga mga impeksyon nga wala mailhi sa mga kultura sa dugo, nga naglikay sa invasive biopsy sa nataptan nga tisyu [18]. Ang bag-o nga mga pagtuon nagpakita nga ang dugo sa tawo adunay daghang tinubdan sa impormasyon nga magamit aron mailhan ang mga viral ug bacterial pathogens, ug nga mga 1% sa ccfDNA nga makita sa plasma sa tawo gikan sa langyaw nga gigikanan [19]. Kini nga mga pagtuon nagpakita nga ang biodiversity sa naglibot nga microbiome sa usa ka organismo mahimong masusi gamit ang ccfDNA analysis. Bisan pa, hangtod bag-o lang, kini nga konsepto gigamit lamang sa mga tawo ug, sa gamay nga sukod, sa ubang mga vertebrate [20, 21].
Sa kasamtangang papel, among gigamit ang potensyal sa LB aron analisahon ang ccfDNA sa Aulacomya atra, usa ka habagatang espisye nga kasagarang makita sa subantarctic Kerguelen Islands, usa ka grupo sa mga isla sa ibabaw sa usa ka dako nga plateau nga naporma 35 milyon ka tuig ang milabay. pagbuto sa bulkan. Gamit ang usa ka in vitro experimental system, among nakita nga ang mga tipik sa DNA sa tubig sa dagat dali nga gikuha sa mga tahong ug misulod sa hemolymph compartment. Ang shotgun sequencing nagpakita nga ang mussel hemolymph ccfDNA adunay mga tipik sa DNA nga kaugalingon ug dili-kaugalingon nga gigikanan, lakip ang symbiotic bacteria ug mga tipik sa DNA gikan sa mga biome nga tipikal sa bugnaw nga volcanic marine coastal ecosystem. Ang Hemolymph ccfDNA adunay usab mga viral sequence nga nakuha gikan sa mga virus nga adunay lainlaing mga host ranges. Nakakita usab kami og mga tipik sa DNA gikan sa mga multicellular nga hayop sama sa bony fish, sea anemones, algae ug mga insekto. Sa konklusyon, ang among pagtuon nagpakita nga ang konsepto sa LB malampuson nga magamit sa mga marine invertebrates aron makamugna og usa ka dato nga genomic repertoire sa mga marine ecosystem.
Ang mga hamtong nga tahong (55-70 mm ang gitas-on) nga Mytilus platensis (M. platensis) ug Aulacomya atra (A. atra) gikolekta gikan sa intertidal nga batoon nga baybayon sa Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Kerguelen Islands niadtong Disyembre 2018. Ang ubang mga hamtong nga blue mussel (Mytilus spp.) nakuha gikan sa usa ka komersyal nga supplier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ug gibutang sa usa ka kontrolado nga temperatura (4°C) nga aerated tank nga adunay 10–20 L nga 32‰ nga artipisyal nga brine. (artipisyal nga asin sa dagat nga Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Alang sa matag eksperimento, gisukod ang gitas-on ug gibug-aton sa indibidwal nga mga kabhang.
Usa ka libre nga open access protocol para niini nga programa ang anaa online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Sa laktod nga pagkasulti, ang LB hemolymph gikolekta gikan sa mga kaunuran sa abductor sama sa gihulagway [22]. Ang hemolymph giklaro pinaagi sa centrifugation sa 1200×g sulod sa 3 ka minuto, ang supernatant gi-freeze (-20°C) hangtod gamiton. Alang sa pag-isolate ug pagputli sa cfDNA, ang mga sample (1.5-2.0 ml) gi-thawn ug giproseso gamit ang NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sumala sa mga instruksyon sa tiggama. Ang ccfDNA gitipigan sa -80°C hangtod sa dugang nga pag-analisar. Sa pipila ka mga eksperimento, ang ccfDNA gi-isolate ug giputli gamit ang QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Ang giputli nga DNA gi-quantify gamit ang standard nga PicoGreen assay. Ang distribusyon sa tipik sa nahimulag nga ccfDNA gisusi pinaagi sa capillary electrophoresis gamit ang Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gamit ang High Sensitivity DNA Kit. Ang assay gihimo gamit ang 1 µl sa ccfDNA sample sumala sa mga instruksyon sa tiggama.
Para sa pag-sequence sa mga fragment sa hemolymph ccfDNA, ang Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) nag-andam og mga shotgun libraries gamit ang Illumina DNA Mix kit sa Illumina MiSeq PE75 kit. Usa ka standard adapter (BioO) ang gigamit. Ang mga raw data file anaa sa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ug SRR8924809). Ang basic reading quality gisusi gamit ang FastQC [23]. Ang Trimmomatic [24] gigamit para sa mga clipping adapter ug mga read nga dili maayo ang kalidad. Ang mga shotgun read nga adunay paired ends gi-FLASH merge ngadto sa mas taas nga single reads nga adunay minimum nga overlap nga 20 bp aron malikayan ang mga mismatch [25]. Ang gihiusang mga nabasa gi-annotate gamit ang BLASTN gamit ang bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 ug 90% homology), ug ang pag-mask sa mga low-complexity sequence gihimo gamit ang DUST [26]. Ang gihiusang mga nabasa gi-annotate gamit ang BLASTN gamit ang bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 ug 90% homology), ug ang pag-mask sa mga low-complexity sequence gihimo gamit ang DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчозозналюмч < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Ang mga pooled reads gi-annotate gamit ang BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomy database (e value < 1e-3 ug 90% homology), ug ang low complexity sequence masking gihimo gamit ang DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，并使，用年进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 6用 读数 ，进行 复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствослюмча (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с исполнено с использом. Ang mga pooled reads gi-annotate gamit ang BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 ug 90% homology), ug ang low complexity sequence masking gihimo gamit ang DUST [26].Ang mga read gibahin sa duha ka grupo: may kalabutan sa mga sequence sa bivalve (gitawag dinhi nga self-reads) ug walay kalabutan (non-self-reads). Duha ka grupo ang gilain nga gi-assemble gamit ang MEGAHIT aron makamugna og mga contig [27]. Samtang, ang taxonomic distribution sa alien microbiome reads giklasipikar gamit ang Kraken2 [28] ug girepresentahan sa grapiko sa usa ka Krona pie chart sa Galaxy [29, 30]. Ang optimal kmers natino nga kmers-59 gikan sa among pasiunang mga eksperimento. Ang mga self contigs giila dayon pinaagi sa pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 ug 60% homology) para sa katapusang anotasyon. Ang mga self contigs giila dayon pinaagi sa pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 ug 60% homology) para sa katapusang anotasyon. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Ang mga self-contigs giila pinaagi sa pagpares niini sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ug 60% homology) para sa katapusang anotasyon.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал да NCBIн двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ang mga self-contig gi-ila dayon alang sa katapusang anotasyon pinaagi sa pagpares batok sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ug 60% homology). Sa susama, ang mga nonself group contigs gi-annotate gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 ug 60% homology). Sa susama, ang mga nonself group contigs gi-annotate gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 ug 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 м. Sa susama, ang mga langyaw nga grupo nga contigs gi-annotate gamit ang BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 ug 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных nt nt гомология 60%). Sa susama, ang mga non-self group contigs gi-annotate gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ug 60% homology). Ang BLASTX gihimo usab sa mga nonself contigs gamit ang nr ug RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ug 60% homology). Ang BLASTX gihimo usab sa mga nonself contigs gamit ang nr ug RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ug 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение лио <1e%)-10 e <1e. Ang BLASTX gihimo usab sa mga non-self contigs gamit ang nr ug RefSeq NCBI protein databases (e value < 1e-10 ug 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 % . Ang BLASTX gihimo usab sa mga non-self contigs gamit ang nr ug RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 ug 60% homology).Ang BLASTN ug BLASTX pools sa mga non-self-contigs nagrepresentar sa final contigs (tan-awa ang Supplementary file).
Ang mga primer nga gigamit para sa PCR gilista sa Table S1. Ang Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) gigamit aron mapadako ang mga target gene sa ccfDNA. Ang mosunod nga mga kondisyon sa reaksyon gigamit: denaturation sa 95°C sulod sa 3 ka minuto, 95°C sulod sa 1 ka minuto, set annealing temperature sulod sa 1 ka minuto, elongation sa 72°C sulod sa 1 ka minuto, 35 ka cycle, ug sa katapusan 72°C sulod sa 10 ka minuto. . Ang mga produkto sa PCR gibulag pinaagi sa electrophoresis sa agarose gels (1.5%) nga adunay sulod nga SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) sa 95 V.
Ang mga tahong (Mytilus spp.) gi-acclimatize sa 500 ml nga oxygenated seawater (32 PSU) sulod sa 24 oras sa 4°C. Ang plasmid DNA nga adunay insert nga nag-encode sa human galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) gidugang sa vial sa katapusang konsentrasyon nga 190 μg/μl. Ang mga tahong nga gi-incubate ubos sa parehas nga mga kondisyon nga wala gidugang ang DNA mao ang kontrol. Ang ikatulo nga control tank adunay DNA nga walay tahong. Aron mabantayan ang kalidad sa DNA sa tubig sa dagat, ang mga sample sa tubig sa dagat (20 μl; tulo ka pagbalik-balik) gikuha gikan sa matag tangke sa gitakdang oras. Para sa plasmid DNA traceability, ang mga LB mussel gi-harvest sa gitakdang oras ug gi-analisa pinaagi sa qPCR ug ddPCR. Tungod sa taas nga lebel sa asin sa tubig sa dagat, ang mga aliquot gi-dilute sa tubig nga kalidad sa PCR (1:10) sa wala pa ang tanang PCR assays.
Ang digital droplet PCR (ddPCR) gihimo gamit ang BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada). Gamita ang temperature profile aron mahibal-an ang labing maayong temperatura (Table S1). Ang mga tulo gihimo gamit ang QX200 drop generator (BioRad). Ang ddPCR gihimo sama sa mosunod: 95°C sulod sa 5 ka minuto, 50 ka siklo sa 95°C sulod sa 30 segundos ug usa ka gihatag nga annealing temperature sulod sa 1 ka minuto ug 72°C sulod sa 30 segundos, 4°C sulod sa 5 ka minuto ug 90°C sulod sa 5 ka minuto. Ang gidaghanon sa mga tulo ug positibo nga mga reaksyon (gidaghanon sa mga kopya/µl) gisukod gamit ang QX200 drop reader (BioRad). Ang mga sample nga adunay ubos sa 10,000 ka tulo gisalikway. Ang pattern control wala gihimo matag higayon nga gipadagan ang ddPCR.
Ang qPCR gihimo gamit ang Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) ug mga primer nga espesipiko sa LGALS7. Ang tanang quantitative PCR gihimo sa 20 µl gamit ang QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Ang qPCR gisugdan sa 15 minutos nga incubation sa 95°C gisundan sa 40 ka siklo sa 95°C sulod sa 10 segundos ug sa 60°C sulod sa 60 segundos nga adunay usa ka pagkolekta sa datos. Ang mga melting curve gihimo gamit ang sunod-sunod nga mga sukod sa 95°C sulod sa 5 segundos, 65°C sulod sa 60 segundos, ug 97°C sa katapusan sa qPCR. Ang matag qPCR gihimo sa triplicate, gawas sa mga control sample.
Tungod kay ang mga tahong nailhan sa ilang taas nga filtration rate, among gisusi una kung mahimo ba nila nga masala ug mapadayon ang mga tipik sa DNA nga anaa sa tubig sa dagat. Interesado usab kami kung kini nga mga tipik magtapok sa ilang semi-open lymphatic system. Gisulbad namo kini nga isyu pinaagi sa eksperimento pinaagi sa pagsubay sa kapalaran sa mga tipik sa soluble DNA nga gidugang sa mga tangke sa asul nga tahong. Aron mapadali ang pagsubay sa mga tipik sa DNA, gigamit namo ang langyaw (dili kaugalingon) nga plasmid DNA nga adunay human galectin-7 gene. Ang ddPCR nagsubay sa mga tipik sa plasmid DNA sa tubig sa dagat ug mga tahong. Ang among mga resulta nagpakita nga kung ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA sa tubig sa dagat nagpabilin nga medyo makanunayon sa paglabay sa panahon (hangtod sa 7 ka adlaw) kung wala ang mga tahong, nan sa presensya sa mga tahong kini nga lebel hapit hingpit nga nawala sulod sa 8 ka oras (Fig. 1a,b). Ang mga tipik sa exogenous DNA dali nga nakit-an sulod sa 15 minuto sa intravalvular fluid ug hemolymph (Fig. 1c). Kini nga mga tipik makit-an gihapon hangtod sa 4 ka oras pagkahuman sa pagkaladlad. Kini nga kalihokan sa pagsala kalabot sa mga tipik sa DNA ikatandi sa kalihokan sa pagsala sa bakterya ug lumot [31]. Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mga tahong makasala ug makatipon og langyaw nga DNA sa ilang mga pluwido.
Ang relatibong konsentrasyon sa plasmid DNA sa tubig sa dagat sa presensya (A) o kawala (B) sa mga tahong, gisukod pinaagi sa ddPCR. Sa A, ang mga resulta gipahayag isip mga porsyento, diin ang mga utlanan sa mga kahon nagrepresentar sa ika-75 ug ika-25 nga porsyento. Ang gipahaom nga logarithmic curve gipakita sa pula, ug ang lugar nga gi-shade sa abohon nagrepresentar sa 95% nga confidence interval. Sa B, ang pula nga linya nagrepresentar sa mean ug ang asul nga linya nagrepresentar sa 95% nga confidence interval para sa konsentrasyon. C Akumulasyon sa plasmid DNA sa hemolymph ug valvular fluid sa mga tahong sa lain-laing mga oras human sa pagdugang sa plasmid DNA. Ang mga resulta gipresentar isip absolute copies nga nakita/mL (±SE).
Sunod, among gisusi ang gigikanan sa ccfDNA sa mga tahong nga gikolekta gikan sa mga higdaanan sa tahong sa Kerguelen Islands, usa ka hilit nga grupo sa mga isla nga adunay limitado nga impluwensya sa tawo. Alang niini nga katuyoan, ang cccDNA gikan sa mga hemolymph sa tahong gi-isolate ug giputli pinaagi sa mga pamaagi nga kasagarang gigamit sa pagputli sa cccDNA sa tawo [32, 33]. Among nakita nga ang aberids nga konsentrasyon sa hemolymph ccfDNA sa mga tahong anaa sa ubos nga micrograms kada ml nga hemolymph range (tan-awa ang Table S2, Supplementary Information). Kini nga range sa konsentrasyon mas dako kay sa himsog nga mga tawo (ubos nga nanograms kada milliliter), apan sa talagsaon nga mga kaso, sa mga pasyente sa kanser, ang lebel sa ccfDNA mahimong moabot sa daghang micrograms kada milliliter [34, 35]. Ang pag-analisar sa distribusyon sa gidak-on sa hemolymph ccfDNA nagpakita nga kini nga mga tipik managlahi kaayo sa gidak-on, gikan sa 1000 bp hangtod sa 1000 bp. hangtod sa 5000 bp (Fig. 2). Parehas nga mga resulta ang nakuha gamit ang silica-based QIAamp Investigator Kit, usa ka pamaagi nga kasagarang gigamit sa forensic science aron paspas nga ihimulag ug limpyohan ang genomic DNA gikan sa mga sample sa DNA nga ubos ang konsentrasyon, lakip ang ccfDNA [36].
Representatibong ccfDNA electrophoregram sa hemolymph sa tahong. Gikuha gamit ang NucleoSnap Plasma Kit (ibabaw) ug QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin plot nga nagpakita sa distribusyon sa hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) sa mga tahong. Ang itom ug pula nga linya nagrepresentar sa median ug ang una ug ikatulo nga quartile, matag usa.
Gibana-bana nga 1% sa ccfDNA sa mga tawo ug mga primate adunay langyaw nga tinubdan [21, 37]. Tungod sa semi-open circulatory system sa mga bivalve, microbial-rich seawater, ug ang size distribution sa mussel ccfDNA, among gi-hypothesize nga ang mussel hemolymph ccfDNA mahimong adunay daghang microbial DNA. Aron masulayan kini nga hypothesis, among gi-sequence ang hemolymph ccfDNA gikan sa mga sample sa Aulacomya atra nga nakolekta gikan sa Kerguelen Islands, nga nakahatag og kapin sa 10 milyon nga reads, 97.6% niini nakapasar sa quality control. Ang mga readings gi-classify dayon sumala sa self ug non-self sources gamit ang BLASTN ug NCBI bivalve databases (Fig. S1, Supplementary Information).
Sa mga tawo, ang nuclear ug mitochondrial DNA parehong mahimong ipagawas ngadto sa agos sa dugo [38]. Apan, sa kasamtangang pagtuon, dili posible nga ihulagway sa detalye ang nuclear genomic DNA sa mga tahong, tungod kay ang A. atra genome wala pa ma-sequence o mahulagway. Apan, nakaila kami og daghang ccfDNA fragments nga among gigikanan gamit ang bivalve library (Fig. S2, Supplementary Information). Gikumpirma usab namo ang presensya sa mga DNA fragments nga among gigikanan pinaagi sa directed PCR amplification sa mga A. atra genes nga gi-sequence (Fig. 3). Sa susama, tungod kay ang mitochondrial genome sa A. atra anaa sa mga pampublikong database, makakita og ebidensya alang sa presensya sa mitochondrial ccfDNA fragments sa hemolymph sa A. atra. Ang presensya sa mitochondrial DNA fragments gikumpirma pinaagi sa PCR amplification (Fig. 3).
Nagkalain-laing mitochondrial genes ang anaa sa hemolymph sa A. atra (pula nga mga tuldok – stock number: SRX5705969) ug M. platensis (asul nga mga tuldok – stock number: SRX5705968) nga gi-amplify pinaagi sa PCR. Ang hulagway gikuha gikan sa Breton et al., 2011 B Amplipikasyon sa hemolymph supernatant gikan sa A. atra Gitipigan sa FTA nga papel. Gamita ang 3 mm nga punch aron idugang direkta sa PCR tube nga adunay sulod nga PCR mix.
Tungod sa daghang microbial content sa tubig sa dagat, una namong gipunting ang pag-ila sa mga microbial DNA sequences sa hemolymph. Aron mahimo kini, migamit kami og duha ka lain-laing estratehiya. Ang unang estratehiya migamit sa Kraken2, usa ka algorithm-based sequence classification program nga makaila sa mga microbial sequences nga adunay katukma nga ikatandi sa BLAST ug uban pang mga himan [28]. Kapin sa 6719 ka mga pagbasa ang natino nga gikan sa bakterya, samtang 124 ug 64 gikan sa archaea ug mga virus, matag usa (Fig. 4). Ang labing daghang bacterial DNA fragments mao ang Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ug Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Kini nga distribusyon nahiuyon sa nangaging mga pagtuon sa marine blue mussel microbiome [39, 40]. Ang Gammaproteobacteria mao ang pangunang klase sa Proteobacteria (44%), lakip ang daghang Vibrionales (Fig. 4b). Ang pamaagi sa ddPCR nagpamatuod sa presensya sa mga tipik sa Vibrio DNA sa ccfDNA sa A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41]. Aron makakuha og dugang nga impormasyon bahin sa gigikanan sa bakterya sa ccfDNA, usa ka dugang nga pamaagi ang gihimo (Fig. S2, Supplementary Information). Sa kini nga kaso, ang mga nabasa nga nagsapaw gi-assemble isip paired-end reads ug giklasipikar nga of self (bivalves) o nonself origin gamit ang BLASTN ug usa ka e value nga 1e−3 ug usa ka cutoff nga adunay >90% homology. Sa kini nga kaso, ang mga nabasa nga nagsapaw gi-assemble isip paired-end reads ug giklasipikar nga of self (bivalves) o nonself origin gamit ang BLASTN ug usa ka e value nga 1e−3 ug usa ka cutoff nga adunay >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы какдрусныество моллюски) o чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Sa kini nga kaso, ang nagsapaw-sapaw nga mga read gikolekta isip paired-ended reads ug giklasipikar nga native (bivalve) o non-original gamit ang BLASTN ug e value nga 1e-3 ug cutoff nga adunay >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 会和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 和 和 3 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствоствены моллюски) o несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Sa kini nga kaso, ang nagsapaw-sapaw nga mga pagbasa gikolekta isip paired-ended nga mga pagbasa ug giklasipikar nga own (bivalves) o non-original gamit ang e BLASTN ug 1e-3 nga mga kantidad ug usa ka homology threshold nga >90%.Tungod kay ang genome sa A. atra wala pa ma-sequence, among gigamit ang de novo assembly strategy sa MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler. Usa ka total nga 147,188 ka contigs ang nailhan nga dependent (bivalves) of origin. Kini nga mga contigs gipabuto dayon gamit ang e-values ​​​​nga 1e-10 gamit ang BLASTN ug BLASTX. Kini nga estratehiya nagtugot kanamo sa pag-ila sa 482 ka non-bivalve fragments nga anaa sa A. atra ccfDNA. Kapin sa katunga (57%) niini nga mga DNA fragments nakuha gikan sa bacteria, kasagaran gikan sa gill symbionts, lakip ang sulfotrophic symbionts, ug gikan sa gill symbionts nga Solemya velum (Fig. 5).
Relatibong kadagaya sa lebel sa tipo. B Pagkalainlain sa mikrobyo sa duha ka pangunang phyla (Firmicutes ug Proteobacteria). Representatibong amplipikasyon sa ddPCR C Vibrio spp. A. Mga tipik sa 16S rRNA gene (asul) sa tulo ka atra hemolymphs.
Usa ka kinatibuk-an nga 482 ka nakolekta nga mga contig ang gisusi. Kinatibuk-ang profile sa taxonomic distribution sa metagenomic contig annotation (prokaryotes ug eukaryotes). B Detalyadong distribusyon sa mga tipik sa bacterial DNA nga giila sa BLASTN ug BLASTX.
Ang pagtuki sa Kraken2 nagpakita usab nga ang mussel ccfDNA adunay mga archaeal DNA fragments, lakip ang mga DNA fragments sa Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ug Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Ang presensya sa mga DNA fragments nga nakuha gikan sa Euryarchaeota ug Crenarchaeota, nga kaniadto nakit-an sa microbial community sa mga Californian mussels, dili angay ikatingala [42]. Bisan tuod ang Euryarchaeota kanunay nga nalangkit sa grabeng mga kondisyon, karon giila nga ang Euryarchaeota ug Crenarcheota lakip sa labing komon nga mga prokaryote sa marine cryogenic environment [43, 44]. Ang presensya sa methanogenic microorganisms sa mga mussels dili ikatingala, tungod sa bag-o nga mga report sa daghang methane leaks gikan sa mga leaks sa ilawom sa Kerguelen Plateau [45] ug posible nga microbial methane production nga naobserbahan sa baybayon sa Kerguelen Islands [46].
Ang among atensyon unya nabalhin ngadto sa mga pagbasa gikan sa mga virus sa DNA. Sa among nahibaloan, kini ang unang off-target nga pagtuon sa sulod sa virus sa mga tahong. Sama sa gilauman, nakakita kami og mga tipik sa DNA sa mga bacteriophage (Caudovirales) (Fig. 6b). Bisan pa, ang labing komon nga viral DNA gikan sa usa ka phylum sa mga nucleocytovirus, nailhan usab nga nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), nga adunay pinakadako nga genome sa bisan unsang virus. Sulod niini nga phylum, kadaghanan sa mga sequence sa DNA nahisakop sa mga pamilya nga Mimimidoviridae (58%) ug Poxviridae (21%), kansang natural nga mga host naglakip sa mga vertebrate ug arthropod, samtang ang gamay nga proporsyon niini nga mga sequence sa DNA nahisakop sa nailhan nga virological algae. Nag-impeksyon sa marine eukaryotic algae. Ang mga sequence nakuha usab gikan sa Pandora virus, ang higanteng virus nga adunay pinakadako nga gidak-on sa genome sa bisan unsang nailhan nga viral genera. Makapainteres, ang range sa mga host nga nahibal-an nga nataptan sa virus, sumala sa gitino sa hemolymph ccfDNA sequencing, medyo dako (Figure S3, Supplementary Information). Apil niini ang mga virus nga motakod sa mga insekto sama sa Baculoviridae ug Iridoviridae, ingon man mga virus nga motakod sa amoeba, algae ug vertebrates. Nakakita usab kami og mga sequence nga mohaom sa genome sa Pithovirus sibericum. Ang mga Pitovirus (nailhan usab nga "zombie viruses") unang nahimulag gikan sa 30,000 ka tuig nga permafrost sa Siberia [47]. Busa, ang among mga resulta nahiuyon sa nangaging mga report nga nagpakita nga dili tanan nga modernong espisye niining mga virus napuo na [48] ug nga kini nga mga virus mahimong anaa sa hilit nga subarctic marine ecosystems.
Sa katapusan, among gisulayan aron makita kung makakita ba mi og mga tipik sa DNA gikan sa ubang mga multicellular nga hayop. Usa ka total nga 482 ka langyaw nga contig ang giila sa BLASTN ug BLASTX gamit ang nt, nr ug RefSeq libraries (genomic ug protein). Ang among mga resulta nagpakita nga taliwala sa mga langyaw nga tipik sa ccfDNA sa multicellular nga mga hayop, ang DNA sa mga bukog nga bukog ang nag-una (Fig. 5). Nakit-an usab ang mga tipik sa DNA gikan sa mga insekto ug uban pang mga espisye. Usa ka medyo dako nga bahin sa mga tipik sa DNA ang wala mailhi, posible tungod sa kakulang sa representasyon sa daghang mga espisye sa dagat sa mga genomic database kung itandi sa mga espisye sa yuta [49].
Sa karon nga papel, among gigamit ang konsepto sa LB sa mga tahong, nga nangatarungan nga ang hemolymph ccfDNA shot sequencing makahatag og panabut sa komposisyon sa mga ekosistema sa baybayon sa dagat. Sa partikular, among nakita nga 1) ang hemolymph sa tahong adunay medyo taas nga konsentrasyon (mga lebel sa microgram) sa medyo dako (~1-5 kb) nga naglibot nga mga tipik sa DNA; 2) kini nga mga tipik sa DNA parehong independente ug dili independente 3) Lakip sa mga langyaw nga gigikanan niini nga mga tipik sa DNA, among nakit-an ang bacterial, archaeal ug viral DNA, ingon man ang DNA sa ubang multicellular nga mga hayop; 4) Ang akumulasyon niining mga langyaw nga tipik sa ccfDNA sa hemolymph nahitabo dayon ug nakatampo sa internal nga kalihokan sa pagsala sa mga tahong. Sa konklusyon, ang among pagtuon nagpakita nga ang konsepto sa LB, nga hangtod karon gigamit labi na sa natad sa biomedicine, nag-encode sa usa ka dato apan wala pa masusi nga gigikanan sa kahibalo nga magamit aron mas masabtan ang interaksyon tali sa mga espisye sa sentinel ug sa ilang palibot.
Gawas sa mga primate, ang ccfDNA isolation gitaho sa mga mammal, lakip ang mga ilaga, iro, iring, ug kabayo [50, 51, 52]. Bisan pa, sa among nahibal-an, ang among pagtuon mao ang una nga nagtaho sa pag-ila ug pag-sequence sa ccfDNA sa mga marine species nga adunay open circulation system. Kini nga anatomical feature ug filtering ability sa mga tahong mahimong, labing menos sa bahin, makapasabut sa lain-laing mga kinaiya sa gidak-on sa naglibot nga mga tipik sa DNA kon itandi sa ubang mga espisye. Sa mga tawo, kadaghanan sa mga tipik sa DNA nga naglibot sa dugo gagmay nga mga tipik nga gikan sa 150 hangtod 200 bp. nga adunay maximum peak nga 167 bp [34, 53]. Usa ka gamay apan hinungdanon nga bahin sa mga tipik sa DNA ang tali sa 300 ug 500 bp ang gidak-on, ug mga 5% ang mas taas kaysa 900 bp. [54]. Ang hinungdan niining distribusyon sa gidak-on kay ang pangunang tinubdan sa ccfDNA sa plasma mahitabo isip resulta sa kamatayon sa selula, tungod man sa kamatayon sa selula o tungod sa nekrosis sa naglibot nga mga hematopoietic cells sa himsog nga mga indibidwal o tungod sa apoptosis sa mga tumor cells sa mga pasyente sa kanser (nailhan nga circulating tumor DNA). , ctDNA). Ang distribusyon sa gidak-on sa hemolymph ccfDNA nga among nakit-an sa mga tahong gikan sa 1000 hangtod 5000 bp, nga nagsugyot nga ang tahong ccfDNA adunay lahi nga gigikanan. Kini usa ka lohikal nga pangagpas, tungod kay ang mga tahong adunay semi-open vascular system ug nagpuyo sa mga palibot sa tubig sa dagat nga adunay taas nga konsentrasyon sa microbial genomic DNA. Sa tinuud, ang among mga eksperimento sa laboratoryo nga naggamit sa exogenous DNA nagpakita nga ang mga tahong nagtipon sa mga tipik sa DNA sa tubig sa dagat, labing menos pagkahuman sa pipila ka oras kini madaot pagkahuman sa pag-uptake sa selula ug/o gipagawas ug/o gitipigan sa lainlaing mga organisasyon. Tungod sa talagsaon nga mga selula (parehong prokaryotic ug eukaryotic), ang paggamit sa intravalvular compartments makapakunhod sa gidaghanon sa ccfDNA gikan sa kaugalingon nga mga tinubdan ingon man gikan sa langyaw nga mga tinubdan. Tungod sa kahinungdanon sa kinaiyanhong resistensya sa bivalve ug sa daghang gidaghanon sa naglibot nga mga phagocyte, among gi-hypothesize nga bisan ang langyaw nga ccfDNA daghan sa naglibot nga mga phagocyte nga nagtigom og langyaw nga DNA sa dihang makakaon og mga mikroorganismo ug/o mga cellular debris. Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang among mga resulta nagpakita nga ang bivalve hemolymph ccfDNA usa ka talagsaon nga tipiganan sa impormasyon sa molekula ug nagpalig-on sa ilang kahimtang isip usa ka sentinel species.
Ang among datos nagpakita nga ang sequencing ug pag-analisa sa mga tipik sa hemolymph ccfDNA nga gikan sa bakterya makahatag og importanteng impormasyon bahin sa host bacterial flora ug sa bakterya nga anaa sa palibot nga marine ecosystem. Ang mga teknik sa shot sequencing nagpadayag sa mga sequence sa commensal bacteria nga A. atra gill nga unta wala mamatikdi kon gigamit ang conventional 16S rRNA identification methods, tungod sa usa ka reference library bias. Sa tinuod lang, ang among paggamit sa LB data nga nakolekta gikan sa M. platensis sa samang mussel layer sa Kerguelen nagpakita nga ang komposisyon sa gill-associated bacterial symbionts parehas para sa duha ka klase sa mussel (Fig. S4, Supplementary Information). Kini nga pagkaparehas sa duha ka genetically different mussels mahimong magpakita sa komposisyon sa bacterial community sa bugnaw, sulfurous, ug volcanic deposits sa Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Ang mas taas nga lebel sa sulfur-reducing microorganisms maayo nga gihulagway sa pag-ani sa mga mussel gikan sa bioturbated coastal areas [59], sama sa baybayon sa Port-au-France. Laing posibilidad mao nga ang commensal mussel flora mahimong maapektuhan sa horizontal transmission [60, 61]. Kinahanglan ang dugang nga panukiduki aron mahibal-an ang korelasyon tali sa palibot sa dagat, salog sa dagat, ug ang komposisyon sa symbiotic bacteria sa mga tahong. Kini nga mga pagtuon nagpadayon pa karon.
Ang gitas-on ug konsentrasyon sa hemolymph ccfDNA, ang kadali sa pagputli niini, ug ang taas nga kalidad aron tugotan ang paspas nga shotgun sequencing mao ang pipila sa daghang mga bentaha sa paggamit sa mussel ccfDNA aron masusi ang biodiversity sa mga ekosistema sa baybayon sa dagat. Kini nga pamaagi labi ka epektibo alang sa pag-ila sa mga komunidad sa viral (virome) sa usa ka gihatag nga ekosistema [62, 63]. Dili sama sa bakterya, archaea, ug eukaryote, ang mga viral genome wala’y sulod nga mga gene nga gikonserba sa phylogenetically sama sa 16S sequences. Ang among mga resulta nagpakita nga ang mga likido nga biopsies gikan sa mga espisye sa indikasyon sama sa mga tahong mahimong magamit aron mailhan ang medyo daghang gidaghanon sa mga tipik sa virus sa ccfDNA nga nahibal-an nga maka-impeksyon sa mga host nga kasagarang nagpuyo sa mga ekosistema sa dagat sa baybayon. Naglakip kini sa mga virus nga nahibal-an nga maka-impeksyon sa protozoa, arthropod, insekto, tanom, ug mga virus sa bakterya (pananglitan, bacteriophage). Usa ka parehas nga distribusyon ang nakit-an sa dihang among gisusi ang hemolymph ccfDNA virome sa mga blue mussel (M. platensis) nga nakolekta sa parehas nga layer sa tahong sa Kerguelen (Table S2, Supplementary Information). Ang shotgun sequencing sa ccfDNA usa gyud ka bag-ong pamaagi nga nagkakusog sa pagtuon sa virome sa mga tawo o uban pang mga espisye [21, 37, 64]. Kini nga pamaagi labi ka mapuslanon alang sa pagtuon sa mga double-stranded DNA virus, tungod kay walay usa ka gene nga napreserbar taliwala sa tanan nga double-stranded DNA virus, nga nagrepresentar sa labing lainlain ug halapad nga klase sa mga virus sa Baltimore [65]. Bisan kung kadaghanan niini nga mga virus nagpabilin nga wala ma-classify ug mahimong maglakip sa mga virus gikan sa usa ka hingpit nga wala mailhi nga bahin sa kalibutan sa virus [66], among nakita nga ang mga virome ug host ranges sa mga tahong nga A. atra ug M. platensis nahulog taliwala sa duha ka espisye. parehas (tan-awa ang figure S3, dugang nga impormasyon). Kini nga pagkaparehas dili ikatingala, tungod kay kini mahimong magpakita sa kakulang sa selectivity sa pagsuhop sa DNA nga naa sa palibot. Ang umaabot nga mga pagtuon gamit ang purified RNA gikinahanglan karon aron mailhan ang RNA virome.
Sa among pagtuon, migamit kami og estrikto kaayo nga pipeline nga gi-adapt gikan sa trabaho ni Kowarski ug mga kauban [37], kinsa migamit og duha ka lakang nga pagtangtang sa pooled reads ug contigs sa wala pa ug pagkahuman sa pag-assemble sa lumad nga ccfDNA, nga miresulta sa taas nga proporsyon sa wala ma-map nga mga reads. Busa, dili namo masalikway nga ang pipila niining wala ma-map nga mga reads mahimong adunay kaugalingon nga gigikanan, labi na tungod kay wala kami'y reference genome alang niining klase sa tahong. Gigamit usab namo kini nga pipeline tungod kay nabalaka kami bahin sa mga chimera tali sa self ug non-self reads ug ang mga gitas-on sa read nga namugna sa Illumina MiSeq PE75. Laing rason sa kadaghanan sa wala ma-chart nga mga reading mao nga kadaghanan sa mga marine microbes, labi na sa mga hilit nga lugar sama sa Kerguelen, wala pa ma-annotate. Gigamit namo ang Illumina MiSeq PE75, nga nagtuo nga ang gitas-on sa ccfDNA fragment parehas sa human ccfDNA. Alang sa umaabot nga mga pagtuon, tungod sa among mga resulta nga nagpakita nga ang hemolymph ccfDNA adunay mas taas nga mga reads kaysa sa mga tawo ug/o mga mammal, among girekomenda ang paggamit og sequencing platform nga mas angay alang sa mas taas nga mga ccfDNA fragment. Kini nga praktis makapahimo niini nga mas sayon ​​sa pag-ila sa dugang mga indikasyon alang sa mas lawom nga pag-analisar. Ang pagkuha sa kasamtangang dili magamit nga kompleto nga A. atra nuclear genome sequence makatabang usab sa pag-ila sa ccfDNA gikan sa kaugalingon ug dili-kaugalingon nga mga tinubdan. Tungod kay ang among panukiduki naka-focus sa posibilidad sa pag-apply sa konsepto sa liquid biopsy sa mga tahong, nanghinaut kami nga samtang kini nga konsepto gamiton sa umaabot nga panukiduki, ang mga bag-ong himan ug mga pipeline mapalambo aron madugangan ang potensyal niini nga pamaagi sa pagtuon sa microbial diversity sa mga tahong sa marine ecosystem.
Isip usa ka dili-invasive nga klinikal nga biomarker, ang taas nga lebel sa ccfDNA sa plasma sa tawo nalangkit sa lainlaing mga sakit, kadaot sa tisyu, ug mga kondisyon sa stress [67,68,69]. Kini nga pagtaas nalangkit sa pagpagawas sa mga tipik sa DNA nga gikan sa kaugalingon niini pagkahuman sa kadaot sa tisyu. Gitubag namo kini nga isyu gamit ang acute heat stress, diin ang mga tahong mubo nga naladlad sa temperatura nga 30 °C. Gihimo namo kini nga pag-analisa sa tulo ka lainlaing mga klase sa tahong sa tulo ka independente nga mga eksperimento. Bisan pa, wala kami nakakita og bisan unsang pagbag-o sa lebel sa ccfDNA pagkahuman sa acute heat stress (tan-awa ang Figure S5, dugang nga impormasyon). Kini nga nadiskobrehan mahimong magpatin-aw, labing menos sa bahin, sa kamatuoran nga ang mga tahong adunay semi-open circulatory system ug nagtipon og daghang kantidad sa langyaw nga DNA tungod sa ilang taas nga kalihokan sa pagsala. Sa laing bahin, ang mga tahong, sama sa daghang mga invertebrate, mahimong mas makasugakod sa kadaot sa tisyu nga gipahinabo sa stress, sa ingon naglimite sa pagpagawas sa ccfDNA sa ilang hemolymph [70, 71].
Hangtod karon, ang pag-analisa sa DNA sa biodiversity sa mga ekosistema sa tubig nag-una nga naka-focus sa environmental DNA (eDNA) metabarcoding. Bisan pa, kini nga pamaagi kasagaran limitado sa pag-analisa sa biodiversity kung gigamit ang mga primer. Ang paggamit sa shotgun sequencing naglikay sa mga limitasyon sa PCR ug sa biased nga pagpili sa mga primer sets. Busa, sa usa ka bahin, ang among pamaagi mas duol sa bag-o lang gigamit nga high-throughput eDNA Shotgun sequencing method, nga makahimo sa direktang pag-sequence sa fragmented DNA ug pag-analisa sa halos tanan nga mga organismo [72, 73]. Bisan pa, adunay daghang mga sukaranan nga isyu nga nagpalahi sa LB gikan sa standard nga mga pamaagi sa eDNA. Siyempre, ang panguna nga kalainan tali sa eDNA ug LB mao ang paggamit sa natural nga filter hosts. Ang paggamit sa mga espisye sa dagat sama sa mga espongha ug bivalve (Dresseina spp.) isip natural nga filter alang sa pagtuon sa eDNA gitaho [74, 75]. Bisan pa, ang pagtuon ni Dreissena migamit og tissue biopsies diin gikuha ang DNA. Ang pag-analisa sa ccfDNA gikan sa LB wala magkinahanglan og tissue biopsy, espesyalisado ug usahay mahal nga kagamitan ug logistik nga nalangkit sa eDNA o tissue biopsy. Sa tinuod lang, bag-o lang namong gitaho nga ang ccfDNA gikan sa LB mahimong tipigan ug analisahon gamit ang suporta sa FTA nga wala magmintinar og cold chain, nga usa ka dakong hagit alang sa panukiduki sa mga hilit nga lugar [76]. Ang pagkuha sa ccfDNA gikan sa likido nga mga biopsies yano ra usab ug naghatag og taas nga kalidad nga DNA alang sa shotgun sequencing ug PCR analysis. Kini usa ka dako nga bentaha tungod sa pipila ka mga teknikal nga limitasyon nga nalangkit sa eDNA analysis [77]. Ang kayano ug ubos nga gasto sa pamaagi sa sampling labi usab nga angay alang sa mga programa sa pagmonitor sa dugay nga panahon. Gawas pa sa ilang taas nga abilidad sa pagsala, ang laing nailhan nga bahin sa mga bivalve mao ang kemikal nga mucopolysaccharide nga komposisyon sa ilang mucus, nga nagpasiugda sa pagsuhop sa mga virus [78, 79]. Kini naghimo sa mga bivalve nga usa ka sulundon nga natural nga filter alang sa pag-ila sa biodiversity ug ang epekto sa pagbag-o sa klima sa usa ka gihatag nga aquatic ecosystem. Bisan kung ang presensya sa mga tipik sa DNA nga nakuha sa host mahimong makita nga usa ka limitasyon sa pamaagi kung itandi sa eDNA, ang gasto nga nalangkit sa pagbaton sa ingon nga lumad nga ccfDNA kung itandi sa eDNA masabtan usab alang sa daghang impormasyon nga magamit alang sa mga pagtuon sa kahimsog. offset host. Apil niini ang presensya sa mga viral sequence nga gisagol sa genome sa host host. Kini labi ka importante alang sa mga tahong, tungod sa presensya sa horizontally transmitted leukemic retroviruses sa mga bivalve [80, 81]. Laing bentaha sa LB kaysa eDNA mao nga kini naggamit sa phagocytic activity sa naglibot nga mga selula sa dugo sa hemolymph, nga naglamoy sa mga mikroorganismo (ug sa ilang mga genome). Ang phagocytosis mao ang pangunang gimbuhaton sa mga selula sa dugo sa mga bivalve [82]. Sa katapusan, ang pamaagi nagpahimulos sa taas nga kapasidad sa pagsala sa mga tahong (aberids nga 1.5 l/h sa tubig sa dagat) ug duha ka adlaw nga sirkulasyon, nga nagdugang sa pagsagol sa lainlaing mga lut-od sa tubig sa dagat, nga nagtugot sa pagkuha sa heterologous eDNA. [83, 84]. Busa, ang pag-analisa sa tahong ccfDNA usa ka makapaikag nga paagi tungod sa mga epekto sa nutrisyon, ekonomiya, ug kalikopan sa mga tahong. Parehas sa pag-analisa sa LB nga nakolekta gikan sa mga tawo, kini nga pamaagi nagbukas usab sa posibilidad sa pagsukod sa mga pagbag-o sa genetic ug epigenetic sa host DNA isip tubag sa mga exogenous nga substansiya. Pananglitan, ang mga teknolohiya sa sequencing sa ikatulong henerasyon mahimong mahunahunaan aron makahimo og genome-wide methylation analysis sa lumad nga ccfDNA gamit ang nanopore sequencing. Kini nga proseso kinahanglan nga mapadali sa kamatuoran nga ang gitas-on sa mga tipik sa mussel ccfDNA sulundon nga nahiuyon sa mga long-read sequencing platform nga nagtugot sa genome-wide DNA methylation analysis gikan sa usa ka single sequencing run nga wala kinahanglana ang mga pagbag-o sa kemikal.85,86] Kini usa ka makapaikag nga posibilidad, tungod kay gipakita nga ang mga sumbanan sa DNA methylation nagpakita sa usa ka tubag sa stress sa kalikopan ug magpadayon sa daghang mga henerasyon. Busa, makahatag kini og bililhong panabut sa nagpahiping mga mekanismo nga nagdumala sa tubag pagkahuman sa pagkaladlad sa pagbag-o sa klima o mga pollutant [87]. Bisan pa, ang paggamit sa LB dili walay mga limitasyon. Dili na kinahanglan isulti, kini nanginahanglan sa presensya sa mga espisye sa indikasyon sa ekosistema. Sama sa nahisgutan sa ibabaw, ang paggamit sa LB aron masusi ang biodiversity sa usa ka gihatag nga ekosistema nanginahanglan usab usa ka estrikto nga pipeline sa bioinformatics nga gikonsiderar ang presensya sa mga tipik sa DNA gikan sa gigikanan. Ang laing dakong problema mao ang pagkaanaa sa mga reference genome alang sa mga espisye sa dagat. Gilauman nga ang mga inisyatibo sama sa Marine Mammal Genomes Project ug ang bag-o lang natukod nga Fish10k project [88] makapadali sa ingon nga pag-analisar sa umaabot. Ang paggamit sa konsepto sa LB sa mga organismo nga nag-filter sa dagat nahiuyon usab sa pinakabag-o nga mga pag-uswag sa teknolohiya sa sequencing, nga naghimo niini nga angay alang sa pagpalambo sa mga multi-ohm biomarker aron makahatag hinungdanon nga impormasyon bahin sa kahimsog sa mga puy-anan sa dagat agig tubag sa stress sa kalikopan.
Ang datos sa genome sequencing nadeposito na sa NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ubos sa Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Epekto sa pagbag-o sa klima sa kinabuhi sa dagat ug mga ekosistema. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Hunahunaa ang hiniusa nga mga epekto sa pagbag-o sa klima ug uban pang lokal nga mga stressor sa palibot sa dagat. kinatibuk-ang siyentipikong palibot. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Siyensiya sa una sa Marso. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ang pagkunhod sa pag-antos sa kainit ubos sa balik-balik nga mga kondisyon sa stress sa kainit nagpatin-aw sa taas nga pagkamatay sa mga blue mussel sa ting-init. Scientific report 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ug uban pa. Bag-o nga mga pagbag-o sa kasubsob, mga hinungdan ug gilapdon sa pagkamatay sa mga hayop. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, ug uban pa. Daghang dili espesipiko nga mga pathogen ang mahimong hinungdan sa daghang pagkamatay sa Pinna nobilis. Kinabuhi. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensyal nga epekto sa pagbag-o sa klima sa mga sakit nga zoonotic sa Arctic. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mga asul nga tahong (Mytilus edulis spp.) isip mga organismo sa signal sa pagmonitor sa polusyon sa baybayon: usa ka pagrepaso. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Paghiusa sa liquid biopsy sa pagtambal sa kanser. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Pagkahinog sa likidong biopsy: Nagtugot sa DNA sa tumor nga mosirkular. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Mga nucleic acid sa plasma sa tawo. Mga minuto sa miting sa mga subsidiary sa Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Usa ka bag-ong papel para sa cell-free DNA isip molecular marker para sa pagtambal sa kanser. Kwantipikasyon sa biomolar analysis. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Misulod sa klinika ang liquid biopsy – mga isyu sa implementasyon ug mga hagit sa umaabot. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ug uban pa. Ang fetal DNA anaa sa plasma ug serum sa inahan. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Pagtuon sa dagan sa pagmabdos ug sa mga komplikasyon niini gamit ang naglibot nga extracellular RNA sa dugo sa mga babaye atol sa pagmabdos. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Liquid biopsy: ang donor cell-free DNA gigamit aron makamatikod sa allogeneic lesions sa usa ka kidney graft. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Mga Kabag-ohan sa mga diagnostic sa pagmabdos: maternal plasma genome sequencing. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Paspas nga pag-ila sa pathogen gamit ang sunod nga henerasyon nga metagenomic sequencing sa mga nataptan nga pluwido sa lawas. Nat Medicine. 2021;27:115-24.