Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Vedelbiopsia (LB) on kontseptsioon, mis biomeditsiini valdkonnas kiiresti populaarsust kogub. Kontseptsioon põhineb peamiselt ringleva rakuvälise DNA (ccfDNA) fragmentide tuvastamisel, mis vabanevad peamiselt väikeste fragmentidena pärast rakkude surma erinevates kudedes. Väike osa neist fragmentidest pärineb võõrastest kudedest või organismidest. Käesolevas töös oleme seda kontseptsiooni rakendanud rannakarpidele, mis on sentinell-liik, mis on tuntud oma kõrge merevee filtreerimisvõime poolest. Kasutame rannakarpide võimet toimida looduslike filtritena, et püüda keskkonna DNA fragmente erinevatest allikatest ja anda teavet rannikualade ökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse kohta. Meie tulemused näitavad, et rannakarpide hemolümf sisaldab DNA fragmente, mille suurus on väga erinev, 1 kuni 5 kb. Haavlipüssi sekveneerimine näitas, et suur hulk DNA fragmente on võõrast mikroobsest päritolust. Nende hulgas leidsime DNA fragmente bakteritelt, arhedelt ja viirustelt, sealhulgas viirustelt, mis teadaolevalt nakatavad mitmesuguseid rannikualade ökosüsteemides tavaliselt esinevaid peremeesorganisme. Kokkuvõtteks näitab meie uuring, et rannakarpide puhul rakendatud LB kontseptsioon kujutab endast rikkalikku, kuid seni uurimata teadmiste allikat mere ranniku ökosüsteemide mikroobide mitmekesisuse kohta.
Kliimamuutuste (KK) mõju mereökosüsteemide bioloogilisele mitmekesisusele on kiiresti kasvav uurimisvaldkond. Globaalne soojenemine mitte ainult ei põhjusta olulisi füsioloogilisi stressifaktoreid, vaid nihutab ka mereorganismide termilise stabiilsuse evolutsioonilisi piire, mõjutades paljude liikide elupaika, ajendades neid otsima soodsamaid tingimusi [1, 2]. Lisaks metazoanide bioloogilisele mitmekesisusele mõjutamisele häirib KK peremeesorganismi ja mikroobide vastastikmõju õrna tasakaalu. See mikroobne düsbakterioos kujutab endast tõsist ohtu mereökosüsteemidele, kuna see muudab mereorganismid nakkuslike patogeenide suhtes vastuvõtlikumaks [3, 4]. Arvatakse, et SS-il on oluline roll massilises surmajuhtumis, mis on tõsine probleem globaalsete mereökosüsteemide haldamisel [5, 6]. See on oluline küsimus, arvestades paljude mereliikide majanduslikku, ökoloogilist ja toitumisalast mõju. See kehtib eriti polaaraladel elavate karpide kohta, kus KK mõjud on vahetumad ja raskemad [6, 7]. Tegelikult kasutatakse karpe, näiteks Mytilus spp., laialdaselt KK mõju jälgimiseks mereökosüsteemidele. Pole üllatav, et nende tervise jälgimiseks on välja töötatud suhteliselt suur hulk biomarkereid, kasutades sageli kahetasandilist lähenemisviisi, mis hõlmab funktsionaalseid biomarkereid, mis põhinevad ensümaatilisel aktiivsusel või rakulistel funktsioonidel, nagu rakkude elujõulisus ja fagotsüütiline aktiivsus [8]. Need meetodid hõlmavad ka spetsiifiliste rõhuindikaatorite kontsentratsiooni mõõtmist, mis akumuleeruvad pehmetes kudedes pärast suure koguse merevee imendumist. Karpide kõrge filtreerimisvõime ja poolavatud vereringesüsteem pakuvad aga võimalust arendada uusi hemolümfi biomarkereid, kasutades vedelbiopsia (LB) kontseptsiooni, mis on lihtne ja minimaalselt invasiivne lähenemisviis patsiendi ravile. vereproovid [9, 10]. Kuigi inimese LB-s võib leida mitut tüüpi ringlevaid molekule, põhineb see kontseptsioon peamiselt plasmas ringlevate rakuvälise DNA (ccfDNA) fragmentide DNA sekveneerimise analüüsil. Tegelikult on ringleva DNA olemasolu inimese plasmas teada juba 20. sajandi keskpaigast [11], kuid alles viimastel aastatel on suure läbilaskevõimega sekveneerimismeetodite tulek viinud ccfDNA-l põhineva kliinilise diagnoosimiseni. Nende ringlevate DNA fragmentide olemasolu on osaliselt tingitud genoomse DNA (tuuma- ja mitokondriaalse) passiivsest vabanemisest pärast rakusurma. Tervetel inimestel on ccfDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/ml), kuid erinevate patoloogiate all kannatavatel või stressirohketel patsientidel võib see suureneda 5–10 korda, mille tulemuseks on koekahjustus. Tervetel inimestel on ccfDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/ml), kuid erinevate patoloogiate all kannatavatel või stressirohketel patsientidel võib see suureneda 5–10 korda, mille tulemuseks on koekahjustus. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разнрачы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Tervetel inimestel on cccDNA kontsentratsioon tavaliselt madal (<10 ng/ml), kuid see võib erinevate patoloogiatega patsientidel või stressi korral, mis viib koekahjustuseni, suureneda 5–10 korda.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍㼌从而寄致瀍ゼ绎而寄致瀍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 ng/ml)中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5.-10. прациенто различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA kontsentratsioon on tervetel inimestel tavaliselt madal (<10 ng/ml), kuid erinevate patoloogiate või stressiga patsientidel võib see suureneda 5–10 korda, mille tulemuseks on koekahjustus.ccfDNA fragmentide suurus varieerub suuresti, kuid jääb tavaliselt vahemikku 150 kuni 200 bp. [12]. Ise saadud ccfDNA, st normaalsetest või transformeeritud peremeesrakkudest pärineva ccfDNA analüüsi saab kasutada tuuma- ja/või mitokondriaalse genoomi geneetiliste ja epigeneetiliste muutuste tuvastamiseks, aidates seeläbi arstidel valida spetsiifilisi molekulaarselt suunatud ravimeetodeid [13]. CcfDNA-d saab aga saada ka võõrallikatest, näiteks loote rakkudest raseduse ajal või siirdatud organitest pärinevast ccfDNA-st [14,15,16,17]. ccfDNA on samuti oluline teabeallikas nakkustekitaja (võõra) nukleiinhapete olemasolu tuvastamiseks, mis võimaldab verekultuuridega tuvastamata laialt levinud nakkuste mitteinvasiivset tuvastamist, vältides nakatunud koe invasiivset biopsiat [18]. Hiljutised uuringud on tõepoolest näidanud, et inimveri sisaldab rikkalikku teabeallikat, mida saab kasutada viiruslike ja bakteriaalsete patogeenide tuvastamiseks, ning et umbes 1% inimese plasmas leiduvast ccfDNA-st on võõrpäritoluga [19]. Need uuringud näitavad, et organismi ringleva mikrobioomi bioloogilist mitmekesisust saab hinnata ccfDNA analüüsi abil. Kuid kuni viimase ajani kasutati seda kontseptsiooni ainult inimeste ja vähemal määral ka teiste selgroogsete puhul [20, 21].
Käesolevas artiklis kasutame LB-potentsiaali Aulacomya atra ccfDNA analüüsimiseks. See on lõunapoolne liik, mida leidub tavaliselt subantarktilistel Kergueleni saartel – saarestikul suurel platool, mis tekkis 35 miljonit aastat tagasi pärast vulkaanipurset. Kasutades in vitro eksperimentaalset süsteemi, leidsime, et rannakarbid omastavad merevees olevad DNA fragmendid kiiresti ja sisenevad hemolümfi. Haavlipüssi sekveneerimine on näidanud, et rannakarbi hemolümfi ccfDNA sisaldab nii omaenda kui ka mitte-oma päritolu DNA fragmente, sealhulgas sümbiootilisi baktereid ja DNA fragmente külmadele vulkaanilistele mereranniku ökosüsteemidele tüüpilistest bioomidest. Hemolümfi ccfDNA sisaldab ka viirusjärjestusi, mis pärinevad viirustest, millel on erinevad peremeesorganismid. Leidsime ka DNA fragmente mitmerakulistelt loomadelt, nagu luukalad, meriroosid, vetikad ja putukad. Kokkuvõtteks näitab meie uuring, et LB-kontseptsiooni saab edukalt rakendada mere selgrootute puhul, et luua mere ökosüsteemides rikkalik genoomne repertuaar.
Täiskasvanud (55–70 mm pikkused) sinikarbid (M. platensis) ja merikarbid (A. atra) koguti Port-au-France'i (049°21.235 S, 070°13.490 E) Kergueleni saarte kaljurannikult detsembris 2018. Teised täiskasvanud sinikarbid (Mytilus spp.) saadi kaubanduslikult tarnijalt (PEI Mussel King Inc., Prints Edwardi saar, Kanada) ja paigutati temperatuuriga kontrollitud (4 °C) aereeritud paaki, mis sisaldas 10–20 l 32‰ kunstlikku soolvett (kunstlik meresool Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Iga katse jaoks mõõdeti üksikute karpide pikkust ja kaalu.
Selle programmi tasuta avatud juurdepääsuga protokoll on veebis saadaval (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Lühidalt, LB hemolümf koguti abduktorlihastest, nagu kirjeldatud [22]. Hemolümf selitati tsentrifuugimisega kiirusel 1200×g 3 minutit, supernatant külmutati (-20°C) kuni kasutamiseni. cfDNA eraldamiseks ja puhastamiseks sulatati proovid (1,5–2,0 ml) ja töödeldi NucleoSnap cfDNA komplektiga (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) vastavalt tootja juhistele. ccfDNA-d säilitati temperatuuril -80°C kuni edasise analüüsini. Mõnes katses eraldati ja puhastati ccfDNA QIAamp DNA Investigator komplektiga (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Puhastatud DNA kvantifitseeriti standardse PicoGreen testi abil. Isoleeritud ccfDNA fragmentide jaotust analüüsiti kapillaarelektroforeesiga, kasutades Agilent 2100 bioanalüsaatorit (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ja kõrge tundlikkusega DNA komplekti. Analüüs viidi läbi 1 µl ccfDNA prooviga vastavalt tootja juhistele.
Hemolümfi ccfDNA fragmentide sekveneerimiseks valmistas Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) Illumina DNA Mix komplekti abil Illumina MiSeq PE75 komplekti kuuluvaid Illumina DNA Mix komplekte. Kasutati standardset adapterit (BioO). Toorandmete failid on saadaval NCBI Sequence Read Archive'ist (SRR8924808 ja SRR8924809). Lugemise põhikvaliteeti hinnati FastQC [23] abil. Trimmomatic [24] on kasutatud adapterite kärpimiseks ja halva kvaliteediga lugemiste jaoks. Paaritatud otstega haavlipüssi lugemised FLASH-liideti pikemateks üksikuteks lugemisteks minimaalse 20 bp kattuvusega, et vältida mittevastavusi [25]. Ühendatud lugemised annoteeriti BLASTN-iga, kasutades kahepoolmeliste NCBI taksonoomia andmebaasi (e-väärtus < 1e−3 ja 90% homoloogia), ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi DUST [26] abil. Ühendatud lugemised annoteeriti BLASTN-iga, kasutades kahepoolmeliste NCBI taksonoomia andmebaasi (e-väärtus < 1e−3 ja 90% homoloogia), ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi DUST [26] abil. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустусты NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнеонено с изовательностено TOLM [26]. Ühendatud näidud annoteeriti BLASTN-iga, kasutades NCBI kahepoolmeliste kahepoolmeliste taksonoomia andmebaasi (e-väärtus < 1e-3 ja 90% homoloogia), ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi DUST [26] abil.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数 [使类数据库)进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6 ]（进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базсты даннытворхчсты даннытвор моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ja 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выспологии использованием TOLM [26]. Ühendatud näidud annoteeriti BLASTN-iga, kasutades NCBI kahepoolmeliste taksonoomilist andmebaasi (e-väärtus <1e-3 ja 90% homoloogia), ning madala keerukusega järjestuste maskeerimine viidi läbi DUST [26] abil.Lugemised jagati kahte rühma: kahepoolmeliste järjestustega seotud (siin nimetatakse neid iselugemisteks) ja mitteseotud (mitte-iselugemised). Kaks rühma pandi eraldi kokku, kasutades MEGAHIT-i kontiigide genereerimiseks [27]. Samal ajal klassifitseeriti võõrmikrobioomi lugemiste taksonoomiline jaotus Kraken2 [28] abil ja esitati graafiliselt Krona sektordiagrammil Galaxy [29, 30] platvormil. Meie eelkatsete põhjal määrati optimaalseks kmer-väärtuseks kmer-59. Seejärel identifitseeriti enesekontrollid BLASTN-iga (kahepoolmeliste NCBI andmebaas, e-väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia) joondades lõpliku annotatsiooni saamiseks. Seejärel identifitseeriti enesekontrollid BLASTN-iga (kahepoolmeliste NCBI andmebaas, e-väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia) joondades lõpliku annotatsiooni saamiseks. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двустворюсмолчыNC значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Seejärel identifitseeriti isekontiigid, sobitades need BLASTN-iga (NCBI kahepoolmeliste rakkude andmebaas, e-väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia) lõpliku annotatsiooni saamiseks.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Seejärel identifitseeriti isekontiigid lõplikuks annotatsiooniks, sobitades need BLASTN-iga (NCBI kahepoolmeliste rakkude andmebaas, e-väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia). Paralleelselt annoteeriti mitte-iseseisvaid rühmade kontiive BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia). Paralleelselt annoteeriti mitte-iseseisvaid rühmade kontiive BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение-10 60%). Paralleelselt annoteeriti võõrrühmade kontiigid BLASTN-iga (NT NCBI andmebaas, e-väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннчхе <1e-10 ja гомология 60%). Paralleelselt annoteeriti mitte-ise grupi kontiigid BLASTN-iga (nt NCBI andmebaas, e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia). BLASTX viidi läbi ka mitte-iseseisvatel kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq valgu NCBI andmebaase (e väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia). BLASTX viidi läbi ka mitte-iseseisvatel kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq valgu NCBI andmebaase (e väärtus <1e−10 ja 60% homoloogia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr ja RefSeq NCBI (знаeч1e) гомология 60%). BLASTX viidi läbi ka mitte-iseenda kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq NCBI valgu andmebaase (e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 悌挧ﺐ 傌源 倧ﺐ还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 悌挧ﺐ 傌源 倧ﺐ BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значени-10 илгомо0 60%). BLASTX viidi läbi ka mitte-iseenda kontiigidel, kasutades nr ja RefSeq NCBI valgu andmebaase (e väärtus <1e-10 ja 60% homoloogia).Mitte-iseseisvate kontiigide BLASTN- ja BLASTX-kogumid esindavad lõplikke kontiive (vt lisafail).
PCR-i jaoks kasutatud praimerid on loetletud tabelis S1. ccfDNA sihtgeenide amplifitseerimiseks kasutati Taq DNA polümeraasi (Bio Basic Canada, Markham, ON). Kasutati järgmisi reaktsioonitingimusi: denatureerimine temperatuuril 95 °C 3 minutit, 95 °C 1 minut, seatud anniilimistemperatuur 1 minuti jooksul, elongatsioon temperatuuril 72 °C 1 minuti jooksul, 35 tsüklit ja lõpuks 72 °C 10 minuti jooksul. . PCR-produktid eraldati elektroforeesi teel agaroosgeelides (1,5%), mis sisaldasid SYBRTM Safe DNA geelvärvi (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pingel 95 V.
Rannakarpe (Mytilus spp.) aklimatiseeriti 24 tundi 500 ml hapnikuga rikastatud merevees (32 PSU) temperatuuril 4 °C. Viaali lisati plasmiid-DNA, mis sisaldas inimese galektiin-7 cDNA järjestust kodeerivat inserti (NCBI registreerimisnumber L07769), lõppkontsentratsiooniga 190 μg/μl. Kontrolliks olid samades tingimustes ilma DNA lisamiseta inkubeeritud rannakarbid. Kolmas kontrollpaak sisaldas DNA-d ilma rannakarpideta. DNA kvaliteedi jälgimiseks merevees võeti igast paagist näidatud ajal merevee proovid (20 μl; kolm kordust). Plasmiid-DNA jälgitavuse tagamiseks koguti LB-rannakarbid näidatud aegadel ja analüüsiti qPCR ja ddPCR abil. Merevee kõrge soolasisalduse tõttu lahjendati alikvoote enne kõiki PCR-analüüse PCR-kvaliteediga veega (1:10).
Digitaalne tilk-PCR (ddPCR) viidi läbi BioRad QX200 protokolli abil (Mississauga, Ontario, Kanada). Optimaalse temperatuuri määramiseks kasutage temperatuuriprofiili (tabel S1). Tilgad genereeriti QX200 tilgageneraatori (BioRad) abil. ddPCR viidi läbi järgmiselt: 95 °C 5 minutit, 50 tsüklit temperatuuril 95 °C 30 sekundit ja antud lõõmutamistemperatuuril 1 minuti jooksul ning 72 °C 30 sekundit, 4 °C 5 minutit ja 90 °C 5 minuti jooksul. Tilkade ja positiivsete reaktsioonide arv (koopiate arv/µl) mõõdeti QX200 tilgalugejaga (BioRad). Proovid, milles oli vähem kui 10 000 tilka, lükati tagasi. Mustrikontrolli ei teostatud iga kord, kui ddPCR käivitati.
qPCR viidi läbi Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austraalia) ja LGALS7 spetsiifiliste praimerite abil. Kõik kvantitatiivsed PCR-id viidi läbi 20 µl-s, kasutades QuantiFast SYBR Green PCR komplekti (QIAGEN). qPCR käivitati 15-minutilise inkubatsiooniga temperatuuril 95 °C, millele järgnes 40 tsüklit temperatuuril 95 °C 10 sekundi jooksul ja temperatuuril 60 °C 60 sekundi jooksul ühe andmekogumisega. Sulamiskõverad genereeriti järjestikuste mõõtmiste abil temperatuuril 95 °C 5 sekundi jooksul, temperatuuril 65 °C 60 sekundi jooksul ja temperatuuril 97 °C qPCR lõpus. Iga qPCR viidi läbi kolmes korduses, välja arvatud kontrollproovid.
Kuna rannakarbid on tuntud oma kõrge filtreerimiskiiruse poolest, uurisime kõigepealt, kas nad suudavad merevees esinevaid DNA fragmente filtreerida ja kinni hoida. Samuti olime huvitatud sellest, kas need fragmendid akumuleeruvad nende poolavatud lümfisüsteemis. Lahendasime selle probleemi eksperimentaalselt, jälgides sinikarpide akvaariumitesse lisatud lahustuvate DNA fragmentide saatust. DNA fragmentide jälgimise hõlbustamiseks kasutasime võõrast (mitte enda) plasmiid-DNA-d, mis sisaldas inimese galektiin-7 geeni. ddPCR jälgib plasmiid-DNA fragmente merevees ja rannakarpides. Meie tulemused näitavad, et kui karpide puudumisel jäi DNA fragmentide hulk merevees aja jooksul (kuni 7 päeva) suhteliselt konstantseks, siis karpide juuresolekul kadus see tase peaaegu täielikult 8 tunni jooksul (joonis 1a, b). Eksogeense DNA fragmente oli intravalvulaarses vedelikus ja hemolümfis kergesti tuvastatav 15 minuti jooksul (joonis 1c). Neid fragmente oli võimalik tuvastada veel kuni 4 tundi pärast kokkupuudet. See DNA fragmentide filtreerimisaktiivsus on võrreldav bakterite ja vetikate filtreerimisaktiivsusega [31]. Need tulemused viitavad sellele, et rannakarbid suudavad oma vedelikukambritesse filtreerida ja võõrast DNA-d koguda.
Plasmiidi DNA suhtelised kontsentratsioonid merevees karpide juuresolekul (A) või puudumisel (B), mõõdetuna ddPCR abil. Joonisel A on tulemused väljendatud protsentides, kusjuures kastide äärised tähistavad 75. ja 25. protsentiili. Sobitatud logaritmiline kõver on näidatud punasega ja halliga varjutatud ala tähistab 95% usaldusvahemikku. Joonisel B tähistab punane joon kontsentratsiooni keskmist ja sinine joon tähistab 95% usaldusvahemikku. C Plasmiidi DNA akumuleerumine karpide hemolümfis ja klapivedelikus erinevatel aegadel pärast plasmiidi DNA lisamist. Tulemused on esitatud tuvastatud absoluutkoopiate arvuna milliliitri kohta (±SE).
Järgmisena uurisime ccfDNA päritolu rannakarpides, mis on kogutud Kergueleni saarte rannakarpide kasvukohtadest. Kergueleni saared on eraldatud saarte rühmast, millel on piiratud inimtekkeline mõju. Sel eesmärgil eraldati rannakarpide hemolümfist pärit cccDNA ja puhastati see meetoditega, mida tavaliselt kasutatakse inimese cccDNA puhastamiseks [32, 33]. Leidsime, et hemolümfi ccfDNA keskmine kontsentratsioon rannakarpides on madalas mikrogrammides milliliitri kohta hemolümfis (vt tabel S2, lisateave). See kontsentratsioonide vahemik on palju suurem kui tervetel inimestel (madal nanogramm milliliitri kohta), kuid harvadel juhtudel, vähihaigetel, võib ccfDNA tase ulatuda mitme mikrogrammini milliliitri kohta [34, 35]. Hemolümfi ccfDNA suurusjaotuse analüüs näitas, et nende fragmentide suurus on väga erinev, ulatudes 1000 bp-st kuni 5000 bp-ni (joonis 2). Sarnaseid tulemusi saadi ka ränidioksiidil põhineva QIAamp Investigator Kiti abil, mis on kohtumeditsiinis laialdaselt kasutatav meetod genoomse DNA kiireks eraldamiseks ja puhastamiseks madala kontsentratsiooniga DNA proovidest, sealhulgas ccfDNA-st [36].
Rannakarpide hemolümfi representatiivne ccfDNA elektroforogramm. Ekstraheeritud NucleoSnap Plasma Kiti (üleval) ja QIAamp DNA Investigator Kiti abil. B Viiuli graafik, mis näitab hemolümfi ccfDNA kontsentratsioonide jaotust (±SE) rannakarpides. Mustad ja punased jooned tähistavad vastavalt mediaani ning esimest ja kolmandat kvartiili.
Ligikaudu 1% inimeste ja primaatide ccfDNA-st pärineb võõralt [21, 37]. Arvestades karpide poolavatud vereringesüsteemi, mikroobiderikast merevett ja rannakarpide ccfDNA suurusjaotust, püstitasime hüpoteesi, et rannakarpide hemolümfi ccfDNA võib sisaldada rikkalikku ja mitmekesist mikroobse DNA kogumit. Selle hüpoteesi kontrollimiseks sekveneerisime Kergueleni saartelt kogutud Aulacomya atra proovide hemolümfi ccfDNA-d, saades üle 10 miljoni järjestuse, millest 97,6% läbis kvaliteedikontrolli. Seejärel klassifitseeriti näidud vastavalt oma ja mitteoma allikatele, kasutades BLASTN ja NCBI karpide andmebaase (joonis S1, lisateave).
Inimestel võivad nii tuuma- kui ka mitokondriaalsed DNA-d vereringesse vabaneda [38]. Käesolevas uuringus ei olnud aga võimalik rannakarpide tuumagenoomset DNA-d detailselt kirjeldada, kuna A. atra genoomi pole sekveneeritud ega kirjeldatud. Siiski suutsime kahepoolmeliste teeki abil tuvastada mitmeid meie endi päritolu ccfDNA fragmente (joonis S2, lisateave). Samuti kinnitasime oma päritolu DNA fragmentide olemasolu nende A. atra geenide suunatud PCR amplifikatsiooni abil, mis sekveneeriti (joonis 3). Samamoodi, arvestades, et A. atra mitokondriaalne genoom on avalikes andmebaasides saadaval, võib leida tõendeid mitokondriaalsete ccfDNA fragmentide olemasolu kohta A. atra hemolümfis. Mitokondriaalsete DNA fragmentide olemasolu kinnitati PCR amplifikatsiooniga (joonis 3).
PCR-meetodil amplifitseeritud A. atra (punased täpid – laonumber: SRX5705969) ja M. platensis (sinised täpid – laonumber: SRX5705968) hemolümfis esinesid mitmesugused mitokondriaalsed geenid. Joonis on kohandatud Breton jt, 2011 allikast. B A. atra hemolümfi supernatandi amplifikatsioon. Säilitatud FTA paberil. PCR-segu sisaldavasse PCR-katsuti lisamiseks kasutage 3 mm augustajat.
Arvestades merevee rohket mikroobide sisaldust, keskendusime esialgu hemolümfi mikroobsete DNA järjestuste iseloomustamisele. Selleks kasutasime kahte erinevat strateegiat. Esimeses strateegias kasutati Kraken2, algoritmipõhist järjestuste klassifitseerimise programmi, mis suudab tuvastada mikroobseid järjestusi täpsusega, mis on võrreldav BLAST-i ja teiste tööriistadega [28]. Enam kui 6719 lugemist osutusid bakteriaalse päritoluga, samas kui 124 ja 64 pärinesid vastavalt arhedest ja viirustest (joonis 4). Kõige arvukamalt esinesid bakteriaalsed DNA fragmendid Firmicutes'ilt (46%), proteobakteritelt (27%) ja bakteroidetes'ilt (17%) (joonis 4a). See jaotus on kooskõlas varasemate mere sinikarbi mikrobioomi uuringutega [39, 40]. Gammaproteobakterid olid proteobakterite peamine klass (44%), sealhulgas paljud Vibrionales'id (joonis 4b). ddPCR meetod kinnitas Vibrio DNA fragmentide olemasolu A. atra hemolümfi ccfDNA-s (joonis 4c) [41]. CcfDNA bakteriaalse päritolu kohta lisateabe saamiseks kasutati täiendavat lähenemisviisi (joonis S2, lisateave). Sellisel juhul koondati kattuvad lugemised paarisotsaliste lugemistena ja klassifitseeriti BLASTN-i ja e-väärtuse 1e−3 ning piirväärtusega >90% homoloogiaga iseseisvateks (kahepoolmeliste) või mitte-iseenda päritoluga. Sellisel juhul koondati kattuvad lugemised paarisotsaliste lugemistena ja klassifitseeriti BLASTN-i ja e-väärtuse 1e−3 ning piirväärtusega >90% homoloogiaga iseseisvateks (kahepoolmeliste) või mitte-iseenda päritoluga. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиронваниц (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечечеюсесе homoloogiast > 90%. Sellisel juhul koguti kattuvad lugemised paarisotsaliste lugemistena ja klassifitseeriti natiivseteks (kahepoolmelisteks) või mitteoriginaalseteks, kasutades BLASTN-i ja e-väärtust 1e-3 ning piirväärtust >90% homoloogiaga.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e>90%和>90同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 璚1ne 用 使用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицавсткныныны (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 погаи homoloogia > 90%. Sel juhul koguti kattuvad lugemised paarisotsaliste lugemistena ja klassifitseeriti omadeks (kahepoolmelised) või mitteoriginaalseteks, kasutades e BLASTN ja 1e-3 väärtusi ning homoloogia läve >90%.Kuna A. atra genoomi pole veel sekveneeritud, kasutasime MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembleri de novo assamblee strateegiat. Kokku identifitseeriti 147 188 kontiiti päritolu poolest sõltuvateks (kahepoolmelisteks). Seejärel analüüsiti neid kontiike BLASTN ja BLASTX abil e-väärtustega 1e-10. See strateegia võimaldas meil tuvastada 482 mittekahepoolmeliste fragmenti A. atra ccfDNA-s. Enam kui pool (57%) neist DNA fragmentidest saadi bakteritelt, peamiselt lõpusesümbiontidelt, sealhulgas sulfotroofsetelt sümbiontidelt, ja lõpusesümbiontidelt Solemya velum (joonis 5).
Suhteline arvukus tüübi tasandil. B Kahe peamise hõimkonna (Firmicutes ja Proteobacteria) mikroobide mitmekesisus. ddPCR-i representatiivne amplifikatsioon C Vibrio spp. A. 16S rRNA geeni fragmendid (sinine) kolmes atra hemolümfis.
Kokku analüüsiti 482 kogutud kontiiti. Metagenoomsete kontiigide annotatsioonide taksonoomilise jaotuse üldprofiil (prokarüootid ja eukarüootid). B BLASTNi ja BLASTXi abil tuvastatud bakteriaalsete DNA fragmentide detailne jaotus.
Kraken2 analüüs näitas ka, et rannakarpide ccfDNA sisaldas arheaalseid DNA fragmente, sealhulgas Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ja Thaurmarcheota (11%) DNA fragmente (joonis 6a). Euryarchaeota ja Crenarchaeota DNA fragmentide olemasolu, mida varem leiti California rannakarpide mikroobikooslusest, ei tohiks olla üllatav [42]. Kuigi Euryarchaeota seostatakse sageli äärmuslike tingimustega, on nüüdseks teada, et nii Euryarchaeota kui ka Crenarcheota on mere krüogeenses keskkonnas kõige levinumad prokarüootid [43, 44]. Metanogeensete mikroorganismide esinemine rannakarpides ei ole üllatav, arvestades hiljutisi teateid ulatuslikest metaanileketest Kergueleni platoo põhjalekete kaudu [45] ja võimalikku mikroobse metaani tootmist Kergueleni saarte ranniku lähedal [46].
Seejärel pöördus meie tähelepanu DNA-viiruste näitude poole. Meie teada on see esimene rannakarpide viirussisalduse uuring, mis ei hõlma sihtmärki. Nagu oodatud, leidsime bakteriofaagide (Caudovirales) DNA fragmente (joonis 6b). Kõige levinum viiruslik DNA pärineb aga nukleotsütoviiruste hõimkonnast, mida tuntakse ka kui tuuma tsütoplasmaatilist suurt DNA-viirust (NCLDV), millel on kõigist viirustest suurim genoom. Selles hõimkonnas kuulub enamik DNA järjestusi perekondadesse Mimimidoviridae (58%) ja Poxviridae (21%), mille looduslike peremeeste hulka kuuluvad selgroogsed ja lülijalgsed, samas kui väike osa neist DNA järjestustest kuulub teadaolevatele viroloogilistele vetikatele. Nakatab mere eukarüootseid vetikaid. Järjestused saadi ka Pandora viirusest, hiiglaslikust viirusest, millel on kõigist teadaolevatest viirusperekondadest suurim genoomi suurus. Huvitaval kombel oli hemolümfi ccfDNA sekveneerimise abil määratud viirusega nakatunud peremeesorganismide hulk suhteliselt suur (joonis S3, lisateave). See hõlmab viiruseid, mis nakatavad putukaid nagu Baculoviridae ja Iridoviridae, samuti viiruseid, mis nakatavad amööbe, vetikaid ja selgroogseid. Leidsime ka Pithovirus sibericum genoomile vastavaid järjestusi. Pitoviirused (tuntud ka kui „zombiviirused“) eraldati esmakordselt 30 000 aasta vanusest igikeltsast Siberis [47]. Seega on meie tulemused kooskõlas varasemate aruannetega, mis näitavad, et mitte kõik nende viiruste tänapäevased liigid ei ole välja surnud [48] ja et need viirused võivad esineda kaugetes subarktilistes mereökosüsteemides.
Lõpuks testisime, kas suudame leida DNA fragmente ka teistelt hulkrakulistelt loomadelt. BLASTNi ja BLASTXi abil tuvastati kokku 482 võõrkontiiti nt, nr ja RefSeq teekide (genoomne ja valk) abil. Meie tulemused näitavad, et hulkrakuliste loomade ccfDNA võõrfragmentide hulgas domineerib luuluude DNA (joonis 5). Samuti on leitud putukate ja teiste liikide DNA fragmente. Suhteliselt suur osa DNA fragmentidest on tuvastamata, mis võib olla tingitud suure hulga mereliikide alaesindatusest genoomilistes andmebaasides võrreldes maismaaliikidega [49].
Käesolevas artiklis rakendame LB-kontseptsiooni rannakarpidele, väites, et hemolümfi ccfDNA plahvatasjärjestuse määramine võib anda ülevaate mere rannikualade ökosüsteemide koostisest. Täpsemalt leidsime, et 1) rannakarpide hemolümf sisaldab suhteliselt suurtes kontsentratsioonides (mikrogrammi tasemel) ringlevaid DNA fragmente; 2) need DNA fragmendid on nii sõltumatud kui ka mittesõltumatud; 3) Nende DNA fragmentide võõrallikate hulgast leidsime bakteriaalset, arheaalset ja viiruslikku DNA-d, samuti teiste hulkrakuliste loomade DNA-d; 4) Nende võõraste ccfDNA fragmentide akumuleerumine hemolümfis toimub kiiresti ja aitab kaasa rannakarpide sisemisele filtreerimisaktiivsusele. Kokkuvõtteks näitab meie uuring, et LB kontseptsioon, mida on seni rakendatud peamiselt biomeditsiini valdkonnas, kodeerib rikkalikku, kuid uurimata teadmiste allikat, mida saab kasutada sentinell-liikide ja nende keskkonna vastastikmõju paremaks mõistmiseks.
Lisaks primaatidele on ccfDNA eraldamist kirjeldatud ka imetajatel, sealhulgas hiirtel, koertel, kassidel ja hobustel [50, 51, 52]. Meie teada on see uuring aga esimene, mis kirjeldab ccfDNA tuvastamist ja sekveneerimist mereloomadel, kellel on avatud vereringesüsteem. See karpide anatoomiline omadus ja filtreerimisvõime võivad vähemalt osaliselt selgitada ringlevate DNA fragmentide erinevat suurust võrreldes teiste liikidega. Inimestel on enamik veres ringlevaid DNA fragmente väikesed fragmendid, mille suurus jääb vahemikku 150–200 bp, maksimaalse piigiga 167 bp [34, 53]. Väike, kuid oluline osa DNA fragmentidest on suurusega 300–500 bp ja umbes 5% on pikemad kui 900 bp [54]. Selle suurusjaotuse põhjuseks on see, et ccfDNA peamine allikas plasmas on rakkude surma tagajärjel, kas rakusurma või ringlevate hematopoeetiliste rakkude nekroosi tõttu tervetel inimestel või kasvajarakkude apoptoosi tõttu vähihaigetel (tuntud kui ringlev kasvaja DNA). , ctDNA). Rannakarpides leitud hemolümfi ccfDNA suurusjaotus oli vahemikus 1000 kuni 5000 bp, mis viitab sellele, et rannakarpide ccfDNA-l on erinev päritolu. See on loogiline hüpotees, kuna rannakarpidel on poolavatud veresoonte süsteem ja nad elavad mereveekeskkonnas, mis sisaldab suures kontsentratsioonis mikroobset genoomset DNA-d. Tegelikult on meie laborikatsed eksogeense DNA abil näidanud, et rannakarbid akumuleerivad DNA fragmente merevees, vähemalt mõne tunni pärast lagunevad need pärast raku omastamist ja/või vabanevad ja/või säilitatakse erinevates organisatsioonides. Arvestades rakkude (nii prokarüootsete kui ka eukarüootsete) haruldust, vähendab intravalvulaarsete sektsioonide kasutamine nii omaallikatest kui ka võõrallikatest pärineva ccfDNA hulka. Arvestades kahepoolmeliste kaasasündinud immuunsuse olulisust ja suurt hulka ringlevaid fagotsüütides, püstitasime lisaks hüpoteesi, et isegi võõras ccfDNA on rikastatud ringlevates fagotsüütides, mis akumuleerivad võõrast DNA-d mikroorganismide ja/või rakujäänuste allaneelamisel. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et kahepoolmeliste hemolümfi ccfDNA on ainulaadne molekulaarse teabe hoidla ja tugevdab nende staatust sentinell-liigina.
Meie andmed näitavad, et bakteritelt pärinevate hemolümfi ccfDNA fragmentide sekveneerimine ja analüüs võib anda olulist teavet peremeesorganismi bakteriaalse floora ja ümbritsevas mereökosüsteemis esinevate bakterite kohta. Sekveneerimistehnikad on paljastanud kommensaalse bakteri A. atra gill-järjestusi, mis oleksid tavapäraste 16S rRNA identifitseerimismeetodite kasutamisel kahe silma vahele jäänud, osaliselt võrdlusraamatukogu kallutatuse tõttu. Tegelikult näitas meie poolt Kergueleni samast rannakarbikihist M. platensis'est kogutud LB-andmete kasutamine, et lõpustega seotud bakteriaalsete sümbiontide koostis oli mõlema rannakarbiliigi puhul sama (joonis S4, lisateave). See kahe geneetiliselt erineva rannakarbi sarnasus võib peegeldada bakteriaalsete koosluste koostist Kergueleni külmades, väävlirikastes ja vulkaanilistes ladestustes [55, 56, 57, 58]. Väävlit redutseerivate mikroorganismide kõrgemat taset on hästi kirjeldatud rannakarpide korjamisel bioturbeeritud rannikualadelt [59], näiteks Port-au-France'i rannikult. Teine võimalus on, et kommensaalset rannakarpide floorat võib mõjutada horisontaalne ülekanne [60, 61]. Merekeskkonna, merepõhja pinna ja rannakarpide sümbiootiliste bakterite koostise vahelise seose kindlakstegemiseks on vaja rohkem uuringuid. Need uuringud on praegu käimas.
Hemolümfi ccfDNA pikkus ja kontsentratsioon, selle puhastamise lihtsus ja kõrge kvaliteet, mis võimaldab kiiret haavlipüss-sekveneerimist, on vaid mõned paljudest eelistest, mida pakub rannakarpide ccfDNA kasutamine mere rannikualade ökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse hindamiseks. See lähenemisviis on eriti efektiivne viiruskoosluste (viroomide) iseloomustamiseks antud ökosüsteemis [62, 63]. Erinevalt bakteritest, arhedest ja eukarüootidest ei sisalda viirusgenoomid fülogeneetiliselt konserveerunud geene, näiteks 16S-järjestusi. Meie tulemused näitavad, et indikaatorliikide, näiteks rannakarpide vedelbiopsiaid saab kasutada suhteliselt suure hulga ccfDNA viiruse fragmentide tuvastamiseks, mis teadaolevalt nakatavad rannikualade ökosüsteemides elavaid peremeesorganisme. See hõlmab viiruseid, mis teadaolevalt nakatavad algloomi, lülijalgseid, putukaid, taimi ja bakteriaalseid viiruseid (nt bakteriofaagid). Sarnane jaotus leiti ka siis, kui uurisime Kerguelenis samast rannakarpide kihist kogutud sinikarpide (M. platensis) hemolümfi ccfDNA viroomi (tabel S2, lisateave). ccfDNA haavlipüssi sekveneerimine on tõepoolest uus lähenemisviis, mis on inimeste või teiste liikide viroomi uurimisel hoogu kogumas [21, 37, 64]. See lähenemisviis on eriti kasulik kaheahelaliste DNA-viiruste uurimisel, kuna kõigi kaheahelaliste DNA-viiruste seas pole ükski geen konserveerunud, esindades Baltimore'i kõige mitmekesisemat ja laiemat viiruste klassi [65]. Kuigi enamik neist viirustest on endiselt klassifitseerimata ja võivad sisaldada viiruseid viirusmaailma täiesti tundmatust osast [66], leidsime, et rannakarpide A. atra ja M. platensis viroomid ja peremeesorganismide ulatus jäävad sarnaselt kahe liigi vahele (vt joonis S3, lisateave). See sarnasus ei ole üllatav, kuna see võib peegeldada selektiivsuse puudumist keskkonnas esineva DNA omastamisel. RNA viroomi iseloomustamiseks on praegu vaja edasisi uuringuid puhastatud RNA-ga.
Meie uuringus kasutasime väga ranget järjestust, mis on kohandatud Kowarski ja tema kolleegide [37] tööst, kus enne ja pärast natiivse ccfDNA kokkupanekut kasutati koondatud lugemiste ja kontiigide kaheastmelist deletsiooni, mille tulemuseks oli suur osa kaardistamata lugemistest. Seetõttu ei saa me välistada, et mõnel neist kaardistamata lugemistest võib siiski olla oma päritolu, peamiselt seetõttu, et meil puudub selle rannakarbiliigi referentsgenoom. Kasutasime seda järjestust ka seetõttu, et olime mures kimääride pärast oma ja mitte-oma lugemiste vahel ning Illumina MiSeq PE75 poolt genereeritud lugemispikkuste pärast. Teine põhjus enamiku kaardistamata lugemiste jaoks on see, et suurt osa meremikroobidest, eriti kaugetes piirkondades, näiteks Kerguelenis, pole annoteeritud. Kasutasime Illumina MiSeq PE75, eeldades, et ccfDNA fragmentide pikkus on sarnane inimese ccfDNA-ga. Tulevaste uuringute jaoks, arvestades meie tulemusi, mis näitavad, et hemolümfi ccfDNA-l on pikemad lugemised kui inimestel ja/või imetajatel, soovitame kasutada sekveneerimisplatvormi, mis sobib paremini pikemate ccfDNA fragmentide jaoks. See tava teeb sügavama analüüsi jaoks vajalike näidustuste tuvastamise palju lihtsamaks. Praegu kättesaamatu täieliku A. atra tuumagenoomi järjestuse hankimine hõlbustaks oluliselt ka ccfDNA eristamist enda ja mitte-enda allikatest. Arvestades, et meie uuringud on keskendunud vedelbiopsia kontseptsiooni rakendamise võimalusele rannakarpide puhul, loodame, et selle kontseptsiooni kasutamisel tulevastes uuringutes töötatakse välja uusi tööriistu ja uurimismeetodeid, et suurendada selle meetodi potentsiaali rannakarpide mikroobse mitmekesisuse uurimisel mereökosüsteemis.
Mitteinvasiivse kliinilise biomarkerina seostatakse ccfDNA kõrgenenud plasmataset inimesel mitmesuguste haiguste, koekahjustuste ja stressitingimustega [67,68,69]. See tõus on seotud DNA fragmentide vabanemisega pärast koekahjustust. Lahendasime seda probleemi ägeda kuumastressi abil, kus rannakarbid hoiti lühiajaliselt temperatuuril 30 °C. Viisime selle analüüsi läbi kolme erinevat tüüpi rannakarbiga kolmes sõltumatus katses. Siiski ei leidnud me ccfDNA tasemetes pärast ägedat kuumastressi mingeid muutusi (vt joonis S5, lisateave). See avastus võib vähemalt osaliselt selgitada asjaolu, et rannakarpidel on poolavatud vereringesüsteem ja nad akumuleerivad oma kõrge filtreerimisaktiivsuse tõttu suures koguses võõr-DNA-d. Teisest küljest võivad rannakarbid, nagu paljud selgrootud, olla stressist tingitud koekahjustuste suhtes vastupidavamad, piirates seeläbi ccfDNA vabanemist nende hemolümfis [70, 71].
Praeguseks on veeökosüsteemide bioloogilise mitmekesisuse DNA-analüüs keskendunud peamiselt keskkonna-DNA (eDNA) metabarkodeerimisele. See meetod on aga bioloogilise mitmekesisuse analüüsis tavaliselt piiratud, kui kasutatakse praimereid. Haavlipüssi sekveneerimise kasutamine aitab mööda hiilida PCR-i piirangutest ja praimerite komplektide kallutatud valikust. Seega on meie meetod teatud mõttes lähemal hiljuti kasutatud suure läbilaskevõimega eDNA haavlipüssi sekveneerimismeetodile, mis suudab fragmenteeritud DNA-d otse sekveneerida ja analüüsida peaaegu kõiki organisme [72, 73]. Siiski on mitmeid põhimõttelisi probleeme, mis eristavad LB-d standardsetest eDNA meetoditest. Loomulikult on eDNA ja LB peamine erinevus looduslike filterperemeeste kasutamine. On teatatud mereloomade, näiteks käsnade ja karploomade (Dresseina spp.), kasutamisest loodusliku filtrina eDNA uurimisel [74, 75]. Dreissena uuringus kasutati aga koebiopsiaid, millest DNA ekstraheeriti. LB-st saadud ccfDNA analüüs ei nõua koebiopsiat, spetsiaalseid ja mõnikord kalleid seadmeid ega eDNA või koebiopsiaga seotud logistikat. Tegelikult teatasime hiljuti, et LB-st pärinevat ccfDNA-d saab säilitada ja analüüsida FTA toel ilma külmaahelat säilitamata, mis on kaugemates piirkondades tehtavate uuringute jaoks suur väljakutse [76]. CcfDNA ekstraheerimine vedelbiopsiatest on samuti lihtne ja annab kvaliteetset DNA-d haavlipüssi sekveneerimiseks ja PCR-analüüsiks. See on suur eelis, arvestades mõningaid eDNA analüüsiga seotud tehnilisi piiranguid [77]. Proovivõtumeetodi lihtsus ja madal hind sobivad eriti hästi ka pikaajaliste seireprogrammide jaoks. Lisaks nende kõrgele filtreerimisvõimele on kahepoolmeliste teine ​​tuntud omadus nende lima keemiline mukopolüsahhariidide koostis, mis soodustab viiruste imendumist [78, 79]. See teeb kahepoolmelistest ideaalse loodusliku filtri bioloogilise mitmekesisuse ja kliimamuutuste mõju iseloomustamiseks antud veeökosüsteemis. Kuigi peremeesorganismi DNA fragmentide olemasolu võib pidada meetodi piiranguks võrreldes eDNA-ga, on sellise natiivse ccfDNA omamisega seotud kulud võrreldes eDNA-ga samaaegselt mõistetavad, arvestades terviseuuringute jaoks saadaolevat tohutut teavet. See hõlmab viirusjärjestuste olemasolu, mis on integreeritud peremeesorganismi genoomi. See on eriti oluline rannakarpide puhul, arvestades horisontaalselt levivate leukeemiliste retroviiruste esinemist karpides [80, 81]. Teine LB eelis eDNA ees on see, et see kasutab ära hemolümfis ringlevate vererakkude fagotsüütilist aktiivsust, mis haarab endasse mikroorganismid (ja nende genoomid). Fagotsütoos on karpide vererakkude peamine funktsioon [82]. Lõpuks kasutab meetod ära rannakarpide suurt filtreerimisvõimet (keskmiselt 1,5 l/h merevett) ja kahepäevast ringlust, mis suurendavad merevee erinevate kihtide segunemist, võimaldades heteroloogse eDNA püüdmist. [83, 84]. Seega on rannakarpide ccfDNA analüüs huvitav suund, arvestades rannakarpide toitumisalast, majanduslikku ja keskkonnamõju. Sarnaselt inimestelt kogutud LB analüüsiga avab see meetod ka võimaluse mõõta peremeesorganismi DNA geneetilisi ja epigeneetilisi muutusi vastusena eksogeensetele ainetele. Näiteks saab ette näha kolmanda põlvkonna sekveneerimistehnoloogiaid, et teostada genoomi hõlmavat metülatsioonianalüüsi natiivses ccfDNA-s nanopooride sekveneerimise abil. Seda protsessi peaks hõlbustama asjaolu, et rannakarpide ccfDNA fragmentide pikkus sobib ideaalis pika lugemisega sekveneerimisplatvormidega, mis võimaldavad genoomi hõlmavat DNA metülatsioonianalüüsi ühest sekveneerimistsüklist ilma keemiliste transformatsioonide vajaduseta.85,86] See on huvitav võimalus, kuna on näidatud, et DNA metülatsioonimustrid peegeldavad vastust keskkonnastressile ja püsivad paljude põlvkondade vältel. Seetõttu võib see anda väärtuslikku teavet kliimamuutuste või saasteainetega kokkupuutele reageerimise aluseks olevate mehhanismide kohta [87]. LB kasutamine pole aga ilma piiranguteta. On ilmselge, et see nõuab indikaatorliikide olemasolu ökosüsteemis. Nagu eespool mainitud, nõuab LB kasutamine antud ökosüsteemi bioloogilise mitmekesisuse hindamiseks ka ranget bioinformaatilist protsessi, mis võtab arvesse DNA fragmentide olemasolu allikast. Teine suur probleem on mereliikide referentsgenoomide kättesaadavus. Loodetakse, et sellised algatused nagu mereimetajate genoomide projekt ja hiljuti loodud Fish10k projekt [88] hõlbustavad sellist analüüsi tulevikus. LB-kontseptsiooni rakendamine mere filtreerivate organismide puhul on kooskõlas ka sekveneerimistehnoloogia uusimate edusammudega, mistõttu see sobib hästi mitmeoomiste biomarkerite väljatöötamiseks, et anda olulist teavet mereelupaikade tervise kohta vastusena keskkonnastressile.
Genoomi sekveneerimise andmed on deponeeritud NCBI järjestuste lugemise arhiivis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 kategooria Bioprojects SRR8924808 all.
Brierley AS, Kingsford MJ Kliimamuutuste mõju mereelustikule ja ökosüsteemidele. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S jt. Kaaluge kliimamuutuste ja muude kohalike stressitekitajate koosmõju merekeskkonnale. Üldine teaduslik keskkond. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P jt. ). Esimese märtsi teadus. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Korduva kuumastressi tingimustes vähenenud kuumataluvus selgitab sinikarpide suurt suvist suremust. Teaduslik aruanne 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER jt. Loomade surmajuhtumite sageduse, põhjuste ja ulatuse hiljutised muutused. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S jt. Pinna nobilise massilist suremust võisid põhjustada mitmed mitteliigispetsiifilised patogeenid. Elu. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Kliimamuutuste võimalik mõju Arktika zoonoossetele haigustele. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. jt. Sinised rannakarbid (Mytilus edulis spp.) signaalorganismidena rannikualade reostuse seires: ülevaade. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Vedelbiopsia integreerimine vähiravis. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C jt. Vedelbiopsia küpsemine: võimaldab kasvaja DNA-l ringluses olla. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleiinhapped inimese plasmas. Soc Biol tütarettevõtete koosolekute protokollid. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rakuvaba DNA uus roll molekulaarse markerina vähiravis. Biomolaarse analüüsi kvantifitseerimine. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vedelbiopsia jõuab kliinikusse – rakendusprobleemid ja tulevased väljakutsed. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ja teised. Loote DNA-d leidub ema plasmas ja seerumis. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Raseduse kulgu ja selle tüsistusi uuriv uuring, kasutades raseduse ajal naiste veres ringlevat rakuvälist RNA-d. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J jt. Vedelbiopsia: doonori rakkudevaba DNA-d kasutatakse neerusiirdamisel allogeensete kahjustuste tuvastamiseks. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM. Innovatsioonid sünnieelses diagnostikas: emaplasma genoomi sekveneerimine. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D jt. Kiire patogeenide tuvastamine nakatunud kehavedelike järgmise põlvkonna metagenoomse sekveneerimise abil. Nat Medicine. 2021;27:115-24.