Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Биопсияи моеъ (БМ) консепсияест, ки дар соҳаи биотиббӣ босуръат маъруфият пайдо мекунад. Ин консепсия асосан ба ошкор кардани пораҳои ДНК-и берунҳуҷайравии гардишкунанда (ccfDNA) асос ёфтааст, ки асосан пас аз марги ҳуҷайраҳо дар бофтаҳои гуногун ҳамчун пораҳои хурд ҷудо мешаванд. Қисми ками ин пораҳо аз бофтаҳо ё организмҳои бегона (бегона) сарчашма мегиранд. Дар кори ҷорӣ, мо ин консепсияро ба мидияҳо, як навъи посбон, ки бо қобилияти баланди филтратсияи оби баҳрӣ маъруф аст, татбиқ кардем. Мо қобилияти мидияҳоро барои амал кардан ҳамчун филтрҳои табиӣ барои гирифтани пораҳои ДНК-и муҳити зист аз манбаъҳои гуногун барои пешниҳоди маълумот дар бораи гуногунии биологии экосистемаҳои соҳилии баҳрӣ истифода мебарем. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки гемолимфаи мидия пораҳои ДНК-ро дар бар мегирад, ки аз 1 то 5 кб андозаашон хеле фарқ мекунанд. Пайдарпайии туфанг нишон дод, ки шумораи зиёди пораҳои ДНК аз пайдоиши микробҳои хориҷӣ мебошанд. Дар байни онҳо, мо пораҳои ДНК-ро аз бактерияҳо, археяҳо ва вирусҳо, аз ҷумла вирусҳоеро пайдо кардем, ки маълум аст, ки ба як қатор мизбонҳо, ки одатан дар экосистемаҳои соҳилии баҳрӣ мавҷуданд, сироят мекунанд. Хулоса, таҳқиқоти мо нишон медиҳад, ки мафҳуми LB, ки ба мидияҳо татбиқ мешавад, як манбаи ғанӣ, вале ҳанӯз омӯхтанашудаи дониш дар бораи гуногунии микробҳо дар экосистемаҳои соҳилии баҳрӣ мебошад.
Таъсири тағйирёбии иқлим (ТИ) ба гуногунии биологии экосистемаҳои баҳрӣ як соҳаи босуръат рушдёбандаи таҳқиқот аст. Гармшавии глобалӣ на танҳо боиси стрессҳои муҳими физиологӣ мегардад, балки маҳдудиятҳои эволютсионии устувории гармии организмҳои баҳриро низ тела медиҳад ва ба муҳити зисти як қатор намудҳо таъсир мерасонад ва онҳоро водор мекунад, ки шароити мусоидтарро ҷустуҷӯ кунанд [1, 2]. Илова бар таъсир расонидан ба гуногунии биологии метазоанҳо, ТИ тавозуни нозуки таъсири мутақобилаи мизбон-микробҳоро халалдор мекунад. Ин дисбактериози микробӣ барои экосистемаҳои баҳрӣ таҳдиди ҷиддӣ эҷод мекунад, зеро он организмҳои баҳриро ба патогенҳои сироятӣ осебпазиртар мекунад [3, 4]. Боварӣ дорад, ки ТИ дар марги оммавӣ нақши муҳим дорад, ки ин мушкили ҷиддӣ барои идоракунии экосистемаҳои баҳрии ҷаҳонӣ аст [5, 6]. Ин як масъалаи муҳим аст, бо назардошти таъсири иқтисодӣ, экологӣ ва ғизоии бисёр намудҳои баҳрӣ. Ин махсусан барои думолбачаҳо, ки дар минтақаҳои қутбӣ зиндагӣ мекунанд, дуруст аст, ки дар он ҷо таъсири ТИ фаврӣ ва шадидтар аст [6, 7]. Дар асл, думолбачаҳо ба монанди Mytilus spp. барои назорат кардани таъсири ТИ ба экосистемаҳои баҳрӣ васеъ истифода мешаванд. Тааҷҷубовар нест, ки шумораи нисбатан зиёди биомаркерҳо барои назорати саломатии онҳо таҳия шудаанд, ки аксар вақт аз равиши дусатҳа истифода мебаранд, ки биомаркерҳои функсионалиро дар бар мегирад, ки ба фаъолияти ферментативӣ ё вазифаҳои ҳуҷайравӣ, ба монанди қобилияти зинда мондани ҳуҷайра ва фаъолияти фагоситӣ асос ёфтаанд [8]. Ин усулҳо инчунин андозагирии консентратсияи нишондиҳандаҳои фишори мушаххасро дар бар мегиранд, ки пас аз ҷабби миқдори зиёди оби баҳр дар бофтаҳои нарм ҷамъ мешаванд. Бо вуҷуди ин, иқтидори баланди филтратсия ва системаи нимкушодаи гардиши хуни думолбаҳо имконият медиҳанд, ки биомаркерҳои нави гемолимфаро бо истифода аз консепсияи биопсияи моеъ (БМ), як равиши оддӣ ва каминвазивӣ барои идоракунии беморон таҳия кунанд. намунаҳои хун [9, 10]. Гарчанде ки дар БМ инсон якчанд намуди молекулаҳои гардишкунандаро пайдо кардан мумкин аст, ин консепсия асосан ба таҳлили пайдарпайии ДНК-и пораҳои ДНК-и берунҳуҷайравии гардишкунанда (ccfDNA) дар плазма асос ёфтааст. Дар асл, мавҷудияти ДНК-и гардишкунанда дар плазмаи инсон аз миёнаҳои асри 20 маълум буд [11], аммо танҳо дар солҳои охир пайдоиши усулҳои пайдарпайии баландсифат боиси ташхиси клиникӣ дар асоси ccfDNA шудааст. Мавҷудияти ин пораҳои ДНК-и гардишкунанда қисман аз раҳошавии ғайрифаъоли ДНК-и геномӣ (ҳастаӣ ва митохондриявӣ) пас аз марги ҳуҷайра вобаста аст. Дар афроди солим, консентратсияи ccfDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё таҳти стресс қарордошта, он метавонад 5-10 маротиба зиёд шавад, ки боиси осеби бофтаҳо мегардад. Дар афроди солим, консентратсияи ccfDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё таҳти стресс қарордошта, он метавонад 5-10 маротиба зиёд шавад, ки боиси осеби бофтаҳо мегардад. У здоровых одамон концентрация вккДНК дар норме низкая (<10 нг/мл), аммо метавонад дар 5-10 раз дар патологии гуногун ё зери фишори равонӣ, фишори равонӣ ва повреждению тканей. Дар одамони солим, консентратсияи cccDNA одатан паст аст (<10 нг/мл), аммо он метавонад дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё зери стрессе, ки ба осеби бофтаҳо оварда мерасонад, 5-10 маротиба афзоиш ёбад.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致绤绤绤在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 戗中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍损伤Консентратсияи ccfDNA дар байни одамон (<10 нг/мл) кам аст, аммо метавонад дар 5-10 раз дар беморони гирифтори бемориҳои гуногун ё фишори равонӣ, ки боиси пайдоиши тканей мегардад, афзояд. Консентратсияи ccfDNA одатан дар афроди солим паст аст (<10 нг/мл), аммо дар беморони гирифтори патологияҳои гуногун ё стресс метавонад 5-10 маротиба зиёд шавад, ки боиси осеби бофтаҳо мегардад.Андозаи пораҳои ccfDNA хеле гуногун аст, аммо одатан аз 150 то 200 bp аст. [12]. Таҳлили ccfDNA-и худсохт, яъне ccfDNA аз ҳуҷайраҳои мизбони муқаррарӣ ё табдилёфта, метавонад барои муайян кардани тағйироти генетикӣ ва эпигенетикӣ, ки дар геноми ҳастаӣ ва/ё митохондрия мавҷуданд, истифода шавад ва бо ин ба табибон дар интихоби терапияҳои мушаххаси молекулавӣ-мақсаднок кӯмак кунад [13]. Аммо, ccfDNA-ро аз манбаъҳои хориҷӣ, ба монанди ccfDNA аз ҳуҷайраҳои ҷанинӣ ҳангоми ҳомиладорӣ ё аз узвҳои трансплантатсияшуда ба даст овардан мумкин аст [14,15,16,17]. ccfDNA инчунин як манбаи муҳими иттилоот барои муайян кардани мавҷудияти кислотаҳои нуклеинии агенти сироятӣ (бегона) мебошад, ки имкон медиҳад сироятҳои паҳншударо, ки бо фарҳангҳои хун муайян карда нашудаанд, ғайриинвазивӣ муайян карда шавад ва аз биопсияи инвазивии бофтаи сироятшуда пешгирӣ карда шавад [18]. Тадқиқотҳои ахир нишон доданд, ки хуни инсон дорои манбаи бойи иттилоот аст, ки метавонад барои муайян кардани патогенҳои вирусӣ ва бактериявӣ истифода шавад ва тақрибан 1% ccfDNA, ки дар плазмаи инсон мавҷуд аст, аз пайдоиши хориҷӣ мебошад [19]. Ин таҳқиқот нишон медиҳанд, ки гуногунии биологии микробиомаи гардиши организмро бо истифода аз таҳлили ccfDNA арзёбӣ кардан мумкин аст. Аммо, то ба наздикӣ, ин мафҳум танҳо дар одамон ва то андозае камтар дар дигар сутунмӯҳраҳо истифода мешуд [20, 21].
Дар мақолаи мазкур, мо аз потенсиали LB барои таҳлили ccfDNA-и Аулакомия атра, як навъи ҷанубӣ, ки маъмулан дар ҷазираҳои Кергелени зериантарктикӣ, як гурӯҳи ҷазираҳо дар болои як платои калон, ки 35 миллион сол пеш ташкил ёфтаанд, пайдо мешавад, истифода мебарем. оташфишонии вулқонӣ. Бо истифода аз системаи таҷрибавии in vitro, мо муайян кардем, ки пораҳои ДНК дар оби баҳр зуд аз ҷониби мидияҳо гирифта мешаванд ва ба қисмати гемолимфа ворид мешаванд. Пайдарпайии туфанг нишон дод, ки ccfDNA-и гемолимфаи мидия пораҳои ДНК-и пайдоиши худ ва ғайрихудӣ, аз ҷумла бактерияҳои симбиотикӣ ва пораҳои ДНК аз биомҳоеро дар бар мегирад, ки ба экосистемаҳои соҳилии баҳрии вулқонии хунук хосанд. ccfDNA-и гемолимфа инчунин пайдарпайии вирусиро дар бар мегирад, ки аз вирусҳо бо диапазонҳои гуногуни мизбон гирифта шудаанд. Мо инчунин пораҳои ДНК-ро аз ҳайвоноти бисёрҳуҷайраӣ, ба монанди моҳии устухонӣ, анемонҳои баҳрӣ, обсабзҳо ва ҳашарот пайдо кардем. Хулоса, таҳқиқоти мо нишон медиҳад, ки консепсияи LB метавонад ба бесутунмӯҳраҳои баҳрӣ бомуваффақият татбиқ карда шавад, то репертуари бойи геномӣ дар экосистемаҳои баҳрӣ ба вуҷуд ояд.
Мидияҳои болиғ (дарозии 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) ва Aulacomya atra (A. atra) аз соҳилҳои санглохи байниқабатии Порт-о-Франс (049°21.235 ҷанубӣ, 070°13.490 шарқӣ) дар моҳи декабри соли 2018 ҷамъоварӣ карда шуданд. Мидияҳои кабуди болиғи дигар (Mytilus spp.) аз як таъминкунандаи тиҷоратӣ (PEI Mussel King Inc., ҷазираи Принс Эдвард, Канада) гирифта шуда, дар зарфи ҳаводори бо ҳарорати назоратшаванда (4°C), ки дорои 10-20 литр оби сунъии 32‰ (намаки сунъии баҳрӣ Reef Crystal, Instant Ocean, Вирҷиния, ИМА) буд, ҷойгир карда шуданд. Барои ҳар як таҷриба, дарозӣ ва вазни садафҳои алоҳида чен карда шуданд.
Протоколи дастрасии озод барои ин барнома онлайн дастрас аст (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Хулоса, гемолимфаи LB аз мушакҳои абдуктор, тавре ки тавсиф шудааст [22], ҷамъоварӣ карда шуд. Гемолимфа бо роҳи сентрифугакунӣ дар 1200×g барои 3 дақиқа равшан карда шуд, қабати болоии он (-20°C) то истифода ях карда шуд. Барои ҷудо кардан ва тоза кардани cfDNA, намунаҳо (1.5-2.0 мл) об карда шуданд ва бо истифода аз маҷмӯаи NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда коркард карда шуданд. ccfDNA то таҳлили минбаъда дар -80°C нигоҳ дошта шуд. Дар баъзе таҷрибаҳо, ccfDNA бо истифода аз маҷмӯаи QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) ҷудо ва тоза карда шуд. ДНК-и тозашуда бо истифода аз санҷиши стандартии PicoGreen миқдор карда шуд. Тақсимоти пораҳои ccfDNA-и ҷудошуда тавассути электрофорези капиллярӣ бо истифода аз биоанализатори Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния) бо истифода аз маҷмӯаи ДНК-и ҳассосияти баланд таҳлил карда шуд. Санҷиш бо истифода аз 1 µl намунаи ccfDNA мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд.
Барои пайдарпайии пораҳои гемолимфаи ccfDNA, Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) китобхонаҳои тирандозиро бо истифода аз маҷмӯаи Illumina DNA Mix-и маҷмӯаи Illumina MiSeq PE75 омода кард. Адаптери стандартӣ (BioO) истифода шуд. Файлҳои маълумоти хом аз бойгонии хондани пайдарпайии NCBI (SRR8924808 ва SRR8924809) дастрасанд. Сифати асосии хониш бо истифода аз FastQC [23] арзёбӣ карда шуд. Trimmomatic [24] барои адаптерҳои буридан ва хондани пастсифат истифода шудааст. Хониши тирандозӣ бо нӯгҳои ҷуфтшуда FLASH ба хондани дарозтари ягона бо ҳампӯшии ҳадди ақали 20 bp муттаҳид карда шуд, то аз номувофиқатӣ пешгирӣ карда шавад [25]. Хонишҳои якҷояшуда бо истифода аз пойгоҳи додаҳои таксономияи дуқабата NCBI (арзиши e < 1e−3 ва 90% гомология) бо BLASTN шарҳ дода шуданд ва ниқобкунии пайдарпайиҳои мураккаби паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд. Хонишҳои якҷояшуда бо истифода аз пойгоҳи додаҳои таксономияи дуқабата NCBI (арзиши e < 1e−3 ва 90% гомология) бо BLASTN шарҳ дода шуданд ва ниқобкунии пайдарпайиҳои мураккаби паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд. Объединенные чтения бо аннотировани с помощью BLASTN бо истифодабарии базаи данных таксономии дуворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 ва 90% гомологии), як маскирование пас аз иҷрои вазифаҳои зарурӣ истифода мешавад. [26]. Хонишҳои якҷояшуда бо истифода аз пойгоҳи додаҳои таксономияи дуқабата NCBI (арзиши e < 1e-3 ва 90% гомология) бо BLASTN шарҳ дода шуданд ва ниқобкунии пайдарпайии мураккабии паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读）2ST进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 唨 唶6进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотировани с помощью BLASTN бо истифода аз таксономической базы данных дуворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ва 90% гомологии), як маскирование пас аз анҷоми корҳои ислоҳӣ. [26]. Хонишҳои якҷояшуда бо истифода аз пойгоҳи додаҳои таксономии дуқабата NCBI (арзиши e <1e-3 ва 90% гомология) бо BLASTN шарҳ дода шуданд ва ниқобкунии пайдарпайии мураккабии паст бо истифода аз DUST [26] анҷом дода шуд.Хонданҳо ба ду гурӯҳ тақсим карда шуданд: бо пайдарпайиҳои дуқабата алоқаманд (дар ин ҷо хондани худӣ номида мешавад) ва алоқаманд набуда (хонданҳои ғайрихудӣ). Ду гурӯҳ алоҳида бо истифода аз MEGAHIT барои тавлиди контигҳо ҷамъ карда шуданд [27]. Дар ҳамин ҳол, тақсимоти таксономии хондани микробиомаҳои бегона бо истифода аз Kraken2 [28] тасниф карда шуд ва ба таври графикӣ бо диаграммаи доиравии Krona дар Galaxy нишон дода шуд [29, 30]. Аз рӯи таҷрибаҳои пешакии мо муайян карда шуд, ки кмерҳои оптималӣ кмерҳо-59 мебошанд. Сипас, ҳампайвандҳои худӣ бо роҳи мувофиқ кардан бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои дуқабата NCBI, арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд. Сипас, ҳампайвандҳои худӣ бо роҳи мувофиқ кардан бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои дуқабата NCBI, арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд. Затем собственные контиги бо идентификатсияи путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%) барои окончательной аннотации. Сипас, худпайвандҳо бо роҳи муқоиса бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои дуқабата NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) барои шарҳи ниҳоӣ муайян карда шуданд.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем бо идентификатсияи собственные контиги барои окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI барои двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Сипас, худпайвандҳо барои шарҳи ниҳоӣ бо муқоиса бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои дуқабата NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) муайян карда шуданд. Дар баробари ин, пайвастагиҳои гурӯҳи худӣ бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои nt NCBI, арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) қайд карда шуданд. Дар баробари ин, пайвастагиҳои гурӯҳи худӣ бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои nt NCBI, арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) қайд карда шуданд. Параллельно чужеродные групповые контиги бо аннотировани с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Дар баробари ин, пайвастагиҳои гурӯҳҳои хориҷӣ бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои NT NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) қайд карда шуданд.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотировани с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ва гомология 60%). Дар баробари ин, пайвастагиҳои ғайрихудӣ бо BLASTN (пойгоҳи додаҳои nt NCBI, арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) қайд карда шуданд. BLASTX инчунин дар контигҳои худӣ бо истифода аз пойгоҳҳои додаҳои NCBI сафедаи nr ва RefSeq (арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) гузаронида шуд. BLASTX инчунин дар контигҳои худӣ бо истифода аз пойгоҳҳои додаҳои NCBI сафедаи nr ва RefSeq (арзиши e < 1e−10 ва 60% гомология) гузаронида шуд. BLASTX инчунин бо истифода аз несамостоятельных контигахҳо бо истифода аз баз данных белка nr ва RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ва гомология 60%). BLASTX инчунин дар контигҳои ғайрихудӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои сафедаҳои nr ва RefSeq NCBI (арзиши e < 1e-10 ва 60% гомология) анҷом дода шуд.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 BLASTX инчунин бо истифода аз несамостоятельных контигахҳо бо истифода аз баз данных белка nr ва RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ва гомология 60%). BLASTX инчунин дар контигҳои ғайрихудӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои сафедаҳои nr ва RefSeq NCBI (арзиши e <1e-10 ва 60% гомология) анҷом дода шуд.Ҳавзҳои BLASTN ва BLASTX-и контигҳои ғайрихудӣ контигҳои ниҳоиро нишон медиҳанд (нигаред ба файли иловагӣ).
Праймерҳои истифодашуда барои PCR дар Ҷадвали S1 номбар шудаанд. Полимеразаи ДНК-и Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) барои тақвияти генҳои мақсадноки ccfDNA истифода шуд. Шартҳои зерини реаксия истифода шуданд: денатуратсия дар 95°C барои 3 дақиқа, 95°C барои 1 дақиқа, ҳарорати муқарраршудаи гармкунӣ барои 1 дақиқа, дарозкунӣ дар 72°C барои 1 дақиқа, 35 давра ва дар ниҳоят 72°C дар давоми 10 дақиқа. . Маҳсулоти PCR бо истифода аз электрофорез дар гелҳои агароз (1,5%), ки дорои SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Берлингтон, ON, Канада) дар 95 В буданд, ҷудо карда шуданд.
Мидияҳо (Mytilus spp.) дар 500 мл оби баҳрии оксигендор (32 PSU) ба муддати 24 соат дар ҳарорати 4°C мутобиқ карда шуданд. ДНК-и плазмидӣ, ки дорои варақаи рамзгузории пайдарпайии кДНК-и галектин-7-и инсонӣ (рақами вуруди NCBI L07769) буд, бо консентратсияи ниҳоии 190 мкг/мкл ба шиша илова карда шуд. Мидияҳое, ки дар ҳамон шароит бе илова кардани ДНК инкубатсия карда шуда буданд, назорати назоратӣ буданд. Зарфи сеюми назорати ДНК-ро бе мидияҳо дар бар мегирифт. Барои назорати сифати ДНК дар оби баҳр, намунаҳои оби баҳрӣ (20 мкл; се такрор) аз ҳар як зарф дар вақти муайяншуда гирифта шуданд. Барои пайгирии ДНК-и плазмидӣ, мидияҳои LB дар вақтҳои муайяншуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо истифода аз qPCR ва ddPCR таҳлил карда шуданд. Аз сабаби миқдори зиёди намак дар оби баҳр, пеш аз ҳама санҷишҳои PCR, аликвотҳо дар оби босифати PCR (1:10) ҳал карда шуданд.
PCR-и қатрагии рақамӣ (ddPCR) бо истифода аз протоколи BioRad QX200 (Миссиссога, Онтарио, Канада) анҷом дода шуд. Барои муайян кардани ҳарорати оптималӣ аз профили ҳарорат истифода баред (Ҷадвали S1). Қатраҳо бо истифода аз генератори қатрагии QX200 (BioRad) тавлид карда шуданд. ddPCR чунин анҷом дода шуд: 95°C барои 5 дақиқа, 50 давраи 95°C барои 30 сония ва ҳарорати муайяни гармкунӣ барои 1 дақиқа ва 72°C барои 30 сония, 4°C барои 5 дақиқа ва 90°C дар давоми 5 дақиқа. Шумораи қатраҳо ва аксуламалҳои мусбат (шумораи нусхаҳо/µl) бо истифода аз хонандаи қатрагии QX200 (BioRad) чен карда шуданд. Намунаҳое, ки камтар аз 10,000 қатра доштанд, рад карда шуданд. Назорати намуна ҳар дафъае, ки ddPCR иҷро мешуд, анҷом дода намешуд.
qPCR бо истифода аз праймерҳои махсуси Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) ва LGALS7 анҷом дода шуд. Ҳамаи PCR-ҳои миқдорӣ дар 20 µl бо истифода аз маҷмӯаи PCR Green QuantiFast SYBR (QIAGEN) анҷом дода шуданд. qPCR бо инкубатсияи 15 дақиқа дар 95°C оғоз ёфт ва баъдан 40 давра дар 95°C барои 10 сония ва дар 60°C барои 60 сония бо як ҷамъоварии маълумот анҷом дода шуд. Хатҳои обшавӣ бо истифода аз андозагириҳои пайдарпай дар 95°C барои 5 сония, 65°C барои 60 сония ва 97°C дар охири qPCR тавлид карда шуданд. Ҳар як qPCR се маротиба анҷом дода шуд, ба истиснои намунаҳои назоратӣ.
Азбаски мидияҳо бо суръати баланди филтратсияи худ маълуманд, мо аввал таҳқиқ кардем, ки оё онҳо метавонанд пораҳои ДНК-ро, ки дар оби баҳр мавҷуданд, филтр кунанд ва нигоҳ доранд. Мо инчунин ба он таваҷҷӯҳ доштем, ки оё ин пораҳо дар системаи лимфавии нимкушодаи худ ҷамъ мешаванд. Мо ин масъаларо бо пайгирии тақдири пораҳои ҳалшавандаи ДНК, ки ба зарфҳои мидияҳои кабуд илова карда мешаванд, ба таври таҷрибавӣ ҳал кардем. Барои осон кардани пайгирии пораҳои ДНК, мо ДНК-и плазмидии бегона (на худӣ)-ро, ки гени галектин-7-и инсонро дар бар мегирифт, истифода бурдем. ddPCR пораҳои ДНК-и плазмидиро дар оби баҳр ва мидияҳо пайгирӣ мекунад. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки агар миқдори пораҳои ДНК дар оби баҳр дар вақти набудани мидияҳо бо мурури замон (то 7 рӯз) нисбатан доимӣ боқӣ монад, пас дар ҳузури мидияҳо ин сатҳ қариб дар давоми 8 соат пурра нопадид шуд (Расми 1a,b). Пораҳои ДНК-и экзогенӣ дар давоми 15 дақиқа дар моеъи дохили клапанӣ ва гемолимфа ба осонӣ муайян карда шуданд (Расми 1c). Ин пораҳо то 4 соат пас аз таъсир муайян карда мешуданд. Ин фаъолияти филтркунӣ нисбат ба пораҳои ДНК бо фаъолияти филтркунии бактерияҳо ва обсабзҳо қобили муқоиса аст [31]. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки мидияҳо метавонанд ДНК-и бегонаро дар қисмҳои моеъи худ филтр кунанд ва ҷамъ кунанд.
Консентратсияи нисбии ДНК-и плазмидӣ дар оби баҳр ҳангоми ҳузури (A) ё набудани (B) мидияҳо, ки бо истифода аз ddPCR чен карда мешаванд. Дар A, натиҷаҳо ҳамчун фоиз ифода карда мешаванд, ки сарҳадҳои қуттиҳо 75-ум ва 25-ум процентилҳоро нишон медиҳанд. Каҷхати логарифмии мувофиқ бо ранги сурх нишон дода шудааст ва масоҳати бо ранги хокистарӣ рангшуда фосилаи эътимоди 95% -ро нишон медиҳад. Дар B, хати сурх миёна ва хати кабуд фосилаи эътимоди 95% -ро барои консентратсия нишон медиҳад. C Ҷамъшавии ДНК-и плазмидӣ дар моеъи гемолимфа ва клапанҳои мидияҳо дар вақтҳои гуногун пас аз илова кардани ДНК-и плазмидӣ. Натиҷаҳо ҳамчун нусхаҳои мутлақи ошкоршуда/мл (±SE) пешниҳод карда мешаванд.
Сипас, мо пайдоиши ccfDNA-ро дар мидияҳое, ки аз катҳои мидияҳо дар ҷазираҳои Кергелен, як гурӯҳи дурдасти ҷазираҳо бо таъсири маҳдуди антропогенӣ ҷамъоварӣ шудаанд, таҳқиқ кардем. Барои ин мақсад, cccDNA аз гемолимфаҳои мидия бо усулҳое, ки маъмулан барои тоза кардани cccDNA-и инсон истифода мешаванд, ҷудо ва тоза карда шуд [32, 33]. Мо муайян кардем, ки консентратсияи миёнаи ccfDNA-и гемолимфа дар мидияҳо дар диапазони микрограммҳои паст дар як мл гемолимфа мебошанд (нигаред ба Ҷадвали S2, Маълумоти иловагӣ). Ин диапазони консентратсияҳо нисбат ба одамони солим хеле калонтар аст (нанограммҳои паст дар як миллилитр), аммо дар ҳолатҳои нодир, дар беморони саратон, сатҳи ccfDNA метавонад ба якчанд микрограмм дар як миллилитр расад [34, 35]. Таҳлили тақсимоти андозаи ccfDNA-и гемолимфа нишон дод, ки ин пораҳо аз ҷиҳати андоза хеле фарқ мекунанд, аз 1000 bp то 1000 bp то 5000 bp (Расми 2). Натиҷаҳои монанд бо истифода аз маҷмӯаи QIAamp Investigator дар асоси кремний ба даст оварда шуданд, усуле, ки маъмулан дар илми криминалистӣ барои ҷудо кардан ва тоза кардани ДНК-и геномӣ аз намунаҳои ДНК-и пастконсентратсия, аз ҷумла ccfDNA [36], зуд истифода мешавад.
Электрофореграммаи намояндагии ccfDNA-и гемолимфаи мидия. Бо истифода аз маҷмӯаи плазмавии NucleoSnap (боло) ва маҷмӯаи QIAamp DNA Investigator Kit истихроҷ карда шудааст. Нақшаи B скрипка, ки тақсимоти консентратсияи ccfDNA-и гемолимфаро (±SE) дар мидияҳо нишон медиҳад. Хатҳои сиёҳ ва сурх мутаносибан медиана ва квартилҳои якум ва сеюмро нишон медиҳанд.
Тақрибан 1% ccfDNA дар одамон ва приматҳо манбаи хориҷӣ дорад [21, 37]. Бо назардошти системаи нимкушодаи гардиши хуни думолбачаҳо, оби баҳрии бой аз микробҳо ва тақсимоти андозаи ccfDNA мидия, мо фарзия кардем, ки ccfDNA гемолимфаи мидия метавонад дорои ҳавзи бой ва гуногуни ДНК-и микробӣ бошад. Барои санҷидани ин фарзия, мо ccfDNA-и гемолимфаро аз намунаҳои Аулакомя атра, ки аз ҷазираҳои Кергелен ҷамъоварӣ шудаанд, пайдарпайӣ кардем ва беш аз 10 миллион хонишро ба даст овардем, ки 97,6% аз онҳо аз назорати сифат гузаштанд. Сипас хонишҳо мувофиқи манбаъҳои худӣ ва ғайрихудӣ бо истифода аз пойгоҳи додаҳои думолбачаи BLASTN ва NCBI тасниф карда шуданд (Расми S1, Маълумоти иловагӣ).
Дар одамон, ҳам ДНК-и ҳастаӣ ва ҳам ДНК-и митохондрия метавонад ба ҷараёни хун ворид шавад [38]. Аммо, дар таҳқиқоти мазкур, тавсифи муфассали ДНК-и геномии ҳастаии мидияҳо имконнопазир буд, зеро геноми A. atra секвенсия ё тавсиф нашудааст. Аммо, мо тавонистем як қатор пораҳои ccfDNA-и пайдоиши худро бо истифода аз китобхонаи дуқабата муайян кунем (Расми S2, Маълумоти иловагӣ). Мо инчунин мавҷудияти пораҳои ДНК-и пайдоиши худро бо роҳи амплификацияи самтноки PCR-и он генҳои A. atra, ки секвенсия шудаанд, тасдиқ кардем (Расми 3). Ба ҳамин монанд, бо назардошти он, ки геноми митохондрияи A. atra дар пойгоҳҳои додаҳои оммавӣ дастрас аст, далелҳоеро дар бораи мавҷудияти пораҳои ccfDNA-и митохондрия дар гемолимфаи A. atra пайдо кардан мумкин аст. Мавҷудияти пораҳои ДНК-и митохондрия бо амплификацияи PCR тасдиқ карда шуд (Расми 3).
Дар гемолимфаи A. atra (нуқтаҳои сурх - рақами захиравӣ: SRX5705969) ва M. platensis (нуқтаҳои кабуд - рақами захиравӣ: SRX5705968), ки бо PCR тақвият дода шудааст, генҳои гуногуни митохондрия мавҷуданд. Расм аз Breton et al., 2011 B Амплификацияи супернатант гемолимфа аз A. atra Дар коғази FTA нигоҳ дошта мешавад. Барои илова кардан мустақиман ба найчаи PCR, ки омехтаи PCR-ро дар бар мегирад, аз сӯрохи 3 мм истифода баред.
Бо назардошти миқдори зиёди микробҳо дар оби баҳр, мо дар аввал ба тавсифи пайдарпайии ДНК-и микробҳо дар гемолимфа тамаркуз кардем. Барои ин, мо аз ду стратегияи гуногун истифода мебарем. Стратегияи аввал Kraken2-ро истифода бурд, ки барномаи таснифоти пайдарпайии бар асоси алгоритм асосёфта мебошад, ки метавонад пайдарпайии микробҳоро бо дақиқии қобили муқоиса бо BLAST ва дигар асбобҳо муайян кунад [28]. Зиёда аз 6719 хониш пайдоиши бактериявӣ муайян карда шуданд, дар ҳоле ки мутаносибан 124 ва 64 аз архей ва вирусҳо буданд (Расми 4). Пораҳои ДНК-и бактериявии аз ҳама фаровон Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) ва Bacteroidetes (17%) буданд (Расми 4a). Ин тақсимот бо таҳқиқоти қаблии микробиомаи кабуди баҳрӣ мувофиқ аст [39, 40]. Гаммапротеобактерияҳо синфи асосии Proteobacteria (44%), аз ҷумла бисёр Vibrionales буданд (Расми 4b). Усули ddPCR мавҷудияти пораҳои ДНК-и Вибриоро дар ccfDNA-и гемолимфаи A. atra тасдиқ кард (Расми 4c) [41]. Барои ба даст овардани маълумоти бештар дар бораи пайдоиши бактериявии ccfDNA, як равиши иловагӣ истифода шуд (Расми S2, Маълумоти иловагӣ). Дар ин ҳолат, хонданҳое, ки бо ҳам печидаанд, ҳамчун хондани ҷуфт-нӯг ҷамъ карда шуданд ва бо истифода аз BLASTN ва арзиши e-и 1e−3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун пайдоиши худӣ (дуқабат) ё ғайрихудӣ тасниф карда шуданд. Дар ин ҳолат, хонданҳое, ки бо ҳам печидаанд, ҳамчун хондани ҷуфт-нӯг ҷамъ карда шуданд ва бо истифода аз BLASTN ва арзиши e-и 1e−3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун пайдоиши худӣ (дуқабат) ё ғайрихудӣ тасниф карда шуданд. В этом случае перекрывающиеся чтения бо собраны как чтения с парными концами ва бо классифицировани как собственные (двустворчатые моллюски) ё чужие по происхождению бо истифода аз BLASTN ва значения аз 190%. Дар ин ҳолат, хонданиҳои ҳампӯш ҳамчун хонданиҳои ҷуфтшуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо истифода аз арзиши BLASTN ва e-и 1e-3 ва буриш бо >90% гомология ҳамчун аслӣ (дуқабат) ё ғайриаслӣ тасниф карда шуданд.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 的 用 嚄 甌值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения бо собрани как чтения с парными концами ва классифицировани как собственные (двустворчатые моллюски) ё несобственные по происхождению бо истифодабарии значений e BLASTN логи и по-19e. Дар ин ҳолат, хонданиҳои такроршаванда ҳамчун хонданиҳои ҷуфтшуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо истифода аз арзишҳои e BLASTN ва 1e-3 ва остонаи гомологӣ >90% ҳамчун худӣ (дуқабат) ё ғайриаслӣ тасниф карда шуданд.Азбаски геноми A. atra ҳанӯз секвенсия нашудааст, мо стратегияи васлкунии de novo-и ассемблери MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-ро истифода бурдем. Дар маҷмӯъ 147,188 контиг ҳамчун вобаста (дуқабат)-и пайдоиш муайян карда шуданд. Сипас ин контигҳо бо истифода аз BLASTN ва BLASTX бо арзишҳои e-1e-10 тарконида шуданд. Ин стратегия ба мо имкон дод, ки 482 порчаи ғайридуқабатаро, ки дар A. atra ccfDNA мавҷуданд, муайян кунем. Зиёда аз нисфи (57%) ин порчаҳои ДНК аз бактерияҳо, асосан аз симбионтҳои гилл, аз ҷумла симбионтҳои сулфотрофӣ ва аз симбионтҳои гилл Solemya velum гирифта шудаанд (Расми 5).
Фаровонии нисбӣ дар сатҳи намуд. B Гуногунии микробӣ аз ду филаи асосӣ (Firmicutes ва Proteobacteria). Афзоиши намояндагии ddPCR C Vibrio spp. A. Қисмҳои гени 16S rRNA (кабуд) дар се гемолимфаи атра.
Дар маҷмӯъ 482 контигҳои ҷамъовардашуда таҳлил карда шуданд. Профили умумии тақсимоти таксономии аннотатсияҳои контиги метагеномӣ (прокариотҳо ва эукариотҳо). B Тақсимоти муфассали пораҳои ДНК-и бактериявӣ, ки тавассути BLASTN ва BLASTX муайян карда шудаанд.
Таҳлили Kraken2 инчунин нишон дод, ки ДНК-и мидияҳои ccf пораҳои ДНК-и археалӣ, аз ҷумла пораҳои ДНК-и Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) ва Thaurmarcheota (11%)-ро дар бар мегирад (Расми 6a). Мавҷудияти пораҳои ДНК, ки аз Euryarchaeota ва Crenarchaeota гирифта шудаанд ва қаблан дар ҷомеаи микробҳои мидияҳои Калифорния пайдо шудаанд, набояд ҳайратовар бошад [42]. Гарчанде ки Euryarchaeota аксар вақт бо шароити шадид алоқаманд аст, ҳоло маълум аст, ки ҳам Euryarchaeota ва ҳам Crenarcheota аз ҷумлаи маъмултарин прокариотҳо дар муҳити криогении баҳрӣ мебошанд [43, 44]. Бо назардошти гузоришҳои ахир дар бораи ихроҷи васеи метан аз ихроҷи қаърии платои Кергелен [45] ва эҳтимолияти истеҳсоли метани микробӣ дар наздикии соҳили ҷазираҳои Кергелен [46], мавҷудияти микроорганизмҳои метаногенӣ дар мидияҳо ҳайратовар нест.
Сипас таваҷҷӯҳи мо ба хондани вирусҳои ДНК равона шуд. То ҷое ки мо медонем, ин аввалин таҳқиқоти берун аз ҳадафи таркиби вирус дар мидияҳо мебошад. Тавре ки интизор мерафт, мо пораҳои ДНК-и бактериофагҳоро (Caudovirales) ёфтем (Расми 6б). Аммо, маъмултарин ДНК-и вирусӣ аз як филуми нуклеоцитовирусҳо, ки бо номи вируси ДНК-и калони ситоплазмаи ҳастаӣ (NCLDV) низ маълум аст, ки бузургтарин геноми ҳама гуна вирусро дорад, гирифта шудааст. Дар дохили ин филум, аксари пайдарпайиҳои ДНК ба оилаҳои Mimimidoviridae (58%) ва Poxviridae (21%) тааллуқ доранд, ки мизбонони табиии онҳо сутунмӯҳраҳо ва буғумподро дар бар мегиранд, дар ҳоле ки қисми ками ин пайдарпайиҳои ДНК ба обсабзҳои маъруфи вирусологӣ тааллуқ доранд. Обсабзҳои эукариотикии баҳриро сироят мекунад. Пайдарпайиҳо инчунин аз вируси Пандора, вируси азим бо бузургтарин андозаи геном аз ҳама гуна ҷинсҳои маълуми вирусӣ гирифта шудаанд. Ҷолиб он аст, ки доираи мизбонҳое, ки бо вирус сироят ёфтаанд, ки тавассути пайдарпайии гемолимфа ccfDNA муайян карда мешавад, нисбатан калон буд (Расми S3, Маълумоти иловагӣ). Он вирусҳоеро дар бар мегирад, ки ҳашаротҳоро ба монанди Baculoviridae ва Iridoviridae сироят мекунанд, инчунин вирусҳоеро, ки амеба, обсабзҳо ва сутунмӯҳраҳоро сироят мекунанд. Мо инчунин пайдарпайиҳоеро пайдо кардем, ки ба геноми Pithovirus sibericum мувофиқат мекунанд. Питовирусҳо (инчунин бо номи "вирусҳои зомби" маълуманд) бори аввал аз яхбандии 30,000-сола дар Сибир ҷудо карда шуданд [47]. Ҳамин тариқ, натиҷаҳои мо бо гузоришҳои қаблӣ мувофиқанд, ки нишон медиҳанд, ки на ҳама намудҳои муосири ин вирусҳо нобуд шудаанд [48] ва ин вирусҳо метавонанд дар экосистемаҳои дурдасти баҳрии субарктикӣ мавҷуд бошанд.
Ниҳоят, мо озмоиш кардем, то бубинем, ки оё мо метавонем пораҳои ДНК-ро аз дигар ҳайвоноти бисёрҳуҷайраӣ пайдо кунем. Дар маҷмӯъ 482 контиги хориҷӣ тавассути BLASTN ва BLASTX бо китобхонаҳои nt, nr ва RefSeq (геномӣ ва сафеда) муайян карда шуданд. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки дар байни пораҳои хориҷии ccfDNA-и ҳайвоноти бисёрҳуҷайраӣ ДНК-и устухонҳо бартарӣ дорад (Расми 5). Порчаҳои ДНК аз ҳашарот ва дигар намудҳо низ пайдо шудаанд. Қисми нисбатан зиёди пораҳои ДНК муайян карда нашудаанд, ки эҳтимолан аз сабаби намояндагии нокифояи шумораи зиёди намудҳои баҳрӣ дар пойгоҳҳои додаҳои геномӣ дар муқоиса бо намудҳои хушкӣ [49].
Дар мақолаи мазкур, мо мафҳуми LB-ро ба мидияҳо татбиқ мекунем ва изҳор медорем, ки пайдарпайии зарбаҳои гемолимфаи ccfDNA метавонад ба таркиби экосистемаҳои соҳилии баҳрӣ фаҳмиш диҳад. Аз ҷумла, мо муайян кардем, ки 1) гемолимфаи мидия дорои консентратсияи нисбатан баланди (сатҳи микрограмм) пораҳои нисбатан калони ДНК-и гардишкунанда (~1-5 кб) мебошад; 2) ин пораҳои ДНК ҳам мустақил ва ҳам ғайримустақил мебошанд; 3) Дар байни манбаъҳои хориҷии ин пораҳои ДНК, мо ДНК-и бактериявӣ, археалӣ ва вирусӣ, инчунин ДНК-и дигар ҳайвоноти бисёрҳуҷайравиро пайдо кардем; 4) Ҷамъшавии ин пораҳои ccfDNA-и хориҷӣ дар гемолимфа босуръат рух медиҳад ва ба фаъолияти филтркунии дохилии мидияҳо мусоидат мекунад. Хулоса, таҳқиқоти мо нишон медиҳад, ки мафҳуми LB, ки то ҳол асосан дар соҳаи биотиб истифода мешавад, як манбаи бой, вале ноомӯхтаи донишро рамзгузорӣ мекунад, ки метавонад барои беҳтар фаҳмидани таъсири мутақобилаи байни намудҳои посбон ва муҳити онҳо истифода шавад.
Илова бар приматҳо, ҷудошавии ccfDNA дар ширхӯрон, аз ҷумла мушҳо, сагҳо, гурбаҳо ва аспҳо гузориш шудааст [50, 51, 52]. Аммо, то ҷое ки мо медонем, таҳқиқоти мо аввалин таҳқиқотест, ки ошкор ва пайдарпайии ccfDNA-ро дар намудҳои баҳрӣ бо системаи гардиши кушод гузориш медиҳад. Ин хусусияти анатомӣ ва қобилияти филтркунии мидияҳо метавонад ҳадди аққал қисман хусусиятҳои андозаи гуногуни пораҳои ДНК-и гардишкунандаро дар муқоиса бо дигар намудҳо шарҳ диҳад. Дар одамон, аксари пораҳои ДНК, ки дар хун гардиш мекунанд, пораҳои хурде мебошанд, ки андозаашон аз 150 то 200 bp бо қуллаи максималии 167 bp мебошанд [34, 53]. Қисми хурд, вале назарраси пораҳои ДНК аз 300 то 500 bp мебошанд ва тақрибан 5% аз 900 bp дарозтаранд [54]. Сабаби ин тақсимоти андоза дар он аст, ки манбаи асосии ccfDNA дар плазма дар натиҷаи марги ҳуҷайраҳо, ё аз сабаби марги ҳуҷайраҳо ё аз сабаби некрозии ҳуҷайраҳои гардиши хун дар одамони солим ё аз сабаби апоптози ҳуҷайраҳои варам дар беморони саратон (бо номи ДНК-и варами гардишкунанда маълум аст) ба вуҷуд меояд. , ctDNA). Тақсимоти андозаи ccfDNA-и гемолимфа, ки мо дар мидияҳо ёфтем, аз 1000 то 5000 bp буд, ки нишон медиҳад, ки ccfDNA-и мидия пайдоиши дигар дорад. Ин як фарзияи мантиқӣ аст, зеро мидияҳо системаи рагҳои нимкушода доранд ва дар муҳитҳои обии баҳрӣ, ки дорои консентратсияи баланди ДНК-и геномии микробӣ мебошанд, зиндагӣ мекунанд. Дар асл, таҷрибаҳои лаборатории мо бо истифода аз ДНК-и экзогенӣ нишон доданд, ки мидияҳо пораҳои ДНК-ро дар оби баҳр ҷамъ мекунанд, ҳадди аққал пас аз чанд соат онҳо пас аз азхудкунии ҳуҷайраҳо вайрон мешаванд ва/ё озод карда мешаванд ва/ё дар ташкилотҳои гуногун нигоҳ дошта мешаванд. Бо назардошти камёб будани ҳуҷайраҳо (ҳам прокариотӣ ва ҳам эукариотӣ), истифодаи қисмҳои дохили клапан миқдори ccfDNA-ро аз манбаъҳои худӣ ва инчунин аз манбаъҳои хориҷӣ кам мекунад. Бо назардошти аҳамияти масунияти модарзодии дуқабата ва шумораи зиёди фагоситҳои гардишкунанда, мо фарзияеро пешниҳод кардем, ки ҳатто ccfDNA-и хориҷӣ бо фагоситҳои гардишкунанда ғанӣ мегардад, ки ҳангоми фурӯ бурдани микроорганизмҳо ва/ё партовҳои ҳуҷайравӣ ДНК-и хориҷиро ҷамъ мекунанд. Натиҷаҳои умумӣ нишон медиҳанд, ки ccfDNA-и гемолимфаи дуқабата як анбори беназири маълумоти молекулавӣ буда, мақоми онҳоро ҳамчун як намуди посбон тақвият медиҳад.
Маълумоти мо нишон медиҳад, ки пайдарпайӣ ва таҳлили пораҳои гемолимфаи ccfDNA-и аз бактерияҳо гирифташуда метавонанд маълумоти калидӣ дар бораи флораи бактериявии мизбон ва бактерияҳое, ки дар экосистемаи баҳрии атроф мавҷуданд, пешниҳод кунанд. Усулҳои пайдарпайии тирпарронӣ пайдарпайии бактерияҳои комменсалии A. atra gill-ро ошкор карданд, ки агар усулҳои анъанавии муайянкунии rRNA-и 16S истифода мешуданд, аз даст мерафтанд, ки қисман аз сабаби таассуби китобхонаи истинодӣ мебошад. Дар асл, истифодаи маълумоти LB-и мо, ки аз M. platensis дар ҳамон қабати мидия дар Кергуэлен ҷамъоварӣ шудааст, нишон дод, ки таркиби симбионтҳои бактериявии марбут ба гилл барои ҳарду намуди мидия якхела буд (Расми S4, Маълумоти иловагӣ). Ин монандӣ байни ду мидияи аз ҷиҳати генетикӣ гуногун метавонад таркиби ҷамоатҳои бактериявиро дар конҳои сард, сулфурдор ва вулқонии Кергуэлен инъикос кунад [55, 56, 57, 58]. Сатҳи баланди микроорганизмҳои камкунандаи сулфур ҳангоми ҷамъоварии мидияҳо аз минтақаҳои соҳилии биотурбатшуда [59], ба монанди соҳили Порт-о-Франс, хуб тавсиф шудааст. Эҳтимоли дигар ин аст, ки флораи мидияҳои комменсалӣ метавонад аз интиқоли уфуқӣ таъсир гирад [60, 61]. Барои муайян кардани робитаи байни муҳити баҳрӣ, сатҳи қаъри баҳр ва таркиби бактерияҳои симбиотикӣ дар мидияҳо таҳқиқоти бештар лозим аст. Ин таҳқиқот айни замон идома доранд.
Дарозӣ ва консентратсияи ccfDNA-и гемолимфа, осонии тозакунии он ва сифати баланд барои имкон додани пайдарпайии босуръати тирпарронӣ баъзе аз бартариҳои зиёди истифодаи ccfDNA-и мидия барои арзёбии гуногунии биологӣ дар экосистемаҳои соҳилии баҳрӣ мебошанд. Ин равиш махсусан барои тавсифи ҷамоатҳои вирусӣ (виромҳо) дар экосистемаи додашуда самаранок аст [62, 63]. Бар хилофи бактерияҳо, археяҳо ва эукариотҳо, геномҳои вирусӣ генҳои филогенетикӣ ҳифзшуда, ба монанди пайдарпайиҳои 16S-ро надоранд. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки биопсияҳои моеъ аз намудҳои нишондиҳанда, ба монанди мидияҳо, метавонанд барои муайян кардани шумораи нисбатан зиёди пораҳои вирусҳои ccfDNA истифода шаванд, ки маълум аст, ки мизбонҳоеро сироят мекунанд, ки одатан дар экосистемаҳои соҳилии баҳр зиндагӣ мекунанд. Ин вирусҳоеро дар бар мегирад, ки маълум аст, ки протозоаҳо, артроподҳо, ҳашаротҳо, растаниҳо ва вирусҳои бактериявӣ (масалан, бактериофагҳо)-ро сироят мекунанд. Тақсимоти монанд ҳангоми таҳқиқи вируси гемолимфаи ccfDNA-и мидияҳои кабуд (M. platensis), ки дар ҳамон қабати мидия дар Кергуэлен ҷамъоварӣ шудаанд, пайдо шуд (Ҷадвали S2, Маълумоти иловагӣ). Пайдарпайии ccfDNA дар ҳақиқат як равиши навест, ки дар омӯзиши вируси одамон ё дигар намудҳо суръат мегирад [21, 37, 64]. Ин равиш махсусан барои омӯзиши вирусҳои ДНК-и дуқабатаи он муфид аст, зеро дар байни ҳамаи вирусҳои ДНК-и дуқабатаи он ягон ген ҳифз нашудааст, ки гуногунтарин ва васеътарин синфи вирусҳоро дар Балтимор намояндагӣ мекунанд [65]. Гарчанде ки аксари ин вирусҳо тасниф нашудаанд ва метавонанд вирусҳоро аз қисмати комилан номаълуми ҷаҳони вирусӣ дар бар гиранд [66], мо муайян кардем, ки вирусҳо ва диапазонҳои мизбони мидияҳо A. atra ва M. platensis дар байни ин ду намуд ҷойгиранд. ба ҳамин монанд (нигаред ба расми S3, маълумоти иловагӣ). Ин монандӣ ҳайратовар нест, зеро он метавонад набудани интихобӣ дар ҷабби ДНК-и мавҷуд дар муҳити зистро инъикос кунад. Тадқиқотҳои оянда бо истифода аз РНК-и тозашуда айни замон барои тавсифи вируси РНК заруранд.
Дар таҳқиқоти худ, мо як лӯлаи хеле сахтро истифода бурдем, ки аз кори Коварски ва ҳамкоронаш [37] мутобиқ карда шуда буд, ки аз несткунии думарҳилаии муттасили хонишҳо ва пайвастагиҳо пеш аз ва баъд аз ҷамъ кардани ccfDNA-и маҳаллӣ истифода бурданд, ки дар натиҷа фоизи баланди хонишҳои хаританашуда ба вуҷуд омад. Аз ин рӯ, мо наметавонем истисно кунем, ки баъзе аз ин хонишҳои хаританашуда метавонанд то ҳол пайдоиши худро дошта бошанд, асосан аз он сабаб, ки мо барои ин намуди мидия геноми истинодӣ надорем. Мо инчунин ин лӯларо истифода бурдем, зеро мо дар бораи химераҳо байни хонишҳои худӣ ва ғайрихудӣ ва дарозии хониш, ки аз ҷониби Illumina MiSeq PE75 тавлид шудааст, нигарон будем. Сабаби дигари аксарияти хонишҳои нодидагирифташуда ин аст, ки қисми зиёди микробҳои баҳрӣ, махсусан дар минтақаҳои дурдаст ба монанди Кергуэлен, шарҳ дода нашудаанд. Мо Illumina MiSeq PE75-ро истифода бурдем, бо тахмин задани дарозии пораҳои ccfDNA ба ccfDNA-и инсонӣ монанд аст. Барои таҳқиқоти оянда, бо назардошти натиҷаҳои мо, ки нишон медиҳанд, ки гемолимфаи ccfDNA нисбат ба одамон ва/ё ширхӯрон хондани дарозтар дорад, мо тавсия медиҳем, ки платформаи пайдарпайиро истифода баред, ки барои пораҳои дарозтари ccfDNA мувофиқтар аст. Ин амалия муайян кардани нишонаҳои бештарро барои таҳлили амиқтар хеле осон мекунад. Ба даст овардани пайдарпайии пурраи геноми ҳастаии A. atra, ки айни замон дастрас нест, инчунин фарқ кардани ccfDNA-ро аз манбаъҳои худӣ ва ғайрихудӣ хеле осон мекунад. Бо назардошти он, ки таҳқиқоти мо ба имконияти татбиқи мафҳуми биопсияи моеъ ба мидияҳо нигаронида шудааст, мо умедворем, ки азбаски ин мафҳум дар таҳқиқоти оянда истифода мешавад, асбобҳо ва лӯлаҳои нав барои афзоиши потенсиали ин усул барои омӯзиши гуногунии микробҳои мидияҳо таҳия карда мешаванд. экосистемаи баҳрӣ.
Ҳамчун як биомаркери клиникии ғайриинвазивӣ, сатҳи баланди ccfDNA дар плазмаи инсон бо бемориҳои гуногун, осеби бофтаҳо ва ҳолатҳои стресс алоқаманд аст [67,68,69]. Ин афзоиш бо раҳо шудани пораҳои ДНК-и пайдоиши худ пас аз осеби бофтаҳо алоқаманд аст. Мо ин масъаларо бо истифода аз стресси шадиди гармӣ ҳал кардем, ки дар он мидияҳо ба таври кӯтоҳ ба ҳарорати 30 °C дучор карда шуданд. Мо ин таҳлилро дар се намуди гуногуни мидияҳо дар се таҷрибаи мустақил анҷом додем. Аммо, мо пас аз стресси шадиди гармӣ ягон тағйирот дар сатҳи ccfDNA пайдо накардем (нигаред ба расми S5, маълумоти иловагӣ). Ин кашфиёт метавонад ҳадди аққал қисман онро шарҳ диҳад, ки мидияҳо системаи гардиши хуни нимкушода доранд ва миқдори зиёди ДНК-и бегонаро аз сабаби фаъолияти баланди филтратсияи худ ҷамъ мекунанд. Аз тарафи дигар, мидияҳо, мисли бисёр бесутунмӯҳраҳо, метавонанд ба осеби бофтаҳои аз стресс ба вуҷуд омада тобовартар бошанд ва бо ин васила раҳо шудани ccfDNA-ро дар гемолимфаи худ маҳдуд кунанд [70, 71].
То имрӯз, таҳлили ДНК-и гуногунии биологӣ дар экосистемаҳои обӣ асосан ба метабаркодгузории ДНК-и муҳити зист (eDNA) нигаронида шудааст. Аммо, ин усул одатан ҳангоми истифодаи праймерҳо дар таҳлили гуногунии биологӣ маҳдуд аст. Истифодаи пайдарпайии туфанг маҳдудиятҳои PCR ва интихоби ғаразноки маҷмӯи праймерҳоро сарфи назар мекунад. Ҳамин тариқ, аз як ҷиҳат, усули мо ба усули пайдарпайии туфанги eDNA бо суръати баланд, ки ба наздикӣ истифода мешавад, наздиктар аст, ки қодир аст ДНК-и порашударо мустақиман пайдарпайӣ кунад ва қариб ҳамаи организмҳоро таҳлил кунад [72, 73]. Бо вуҷуди ин, як қатор масъалаҳои асосӣ мавҷуданд, ки LB-ро аз усулҳои стандартии eDNA фарқ мекунанд. Албатта, фарқи асосии байни eDNA ва LB истифодаи мизбонҳои табиии филтр мебошад. Истифодаи намудҳои баҳрӣ, ба монанди исфанҷҳо ва думолчаҳо (Dresseina spp.) ҳамчун филтри табиӣ барои омӯзиши eDNA гузориш шудааст [74, 75]. Аммо, таҳқиқоти Дрейссена биопсияҳои бофтаро истифода бурд, ки аз онҳо ДНК истихроҷ карда шуд. Таҳлили ccfDNA аз LB биопсияи бофта, таҷҳизоти махсус ва баъзан гаронбаҳо ва логистикаи марбут ба eDNA ё биопсияи бофтаро талаб намекунад. Дар асл, мо ба наздикӣ хабар додем, ки ccfDNA аз LB метавонад бо дастгирии FTA бе нигоҳ доштани занҷири хунук нигоҳ дошта ва таҳлил карда шавад, ки ин барои таҳқиқот дар минтақаҳои дурдаст як мушкили асосӣ аст [76]. Истихроҷи ccfDNA аз биопсияҳои моеъ низ содда аст ва ДНК-и баландсифатро барои пайдарпайии тирпарронӣ ва таҳлили PCR таъмин мекунад. Ин як бартарии бузург аст, бо назардошти баъзе маҳдудиятҳои техникии марбут ба таҳлили eDNA [77]. Соддагӣ ва арзиши пасти усули намунагирӣ инчунин барои барномаҳои мониторинги дарозмуддат махсусан мувофиқ аст. Илова бар қобилияти баланди филтркунии онҳо, як хусусияти дигари маъруфи думолбачаҳо таркиби мукополисахариди кимиёвии луобашон мебошад, ки ба ҷабби вирусҳо мусоидат мекунад [78, 79]. Ин думолбачаҳоро ба як филтри табиии беҳтарин барои тавсифи гуногунии биологӣ ва таъсири тағирёбии иқлим дар экосистемаи муайяни обӣ табдил медиҳад. Гарчанде ки мавҷудияти пораҳои ДНК-и аз ҷониби мизбон гирифташударо метавон ҳамчун маҳдудияти усул дар муқоиса бо eDNA дид, хароҷоти марбут ба доштани чунин ccfDNA-и табиӣ дар муқоиса бо eDNA ҳамзамон бо миқдори зиёди иттилооте, ки барои таҳқиқоти саломатӣ дастрас аст, фаҳмо аст. мизбони ҷуброншуда. Ин мавҷудияти пайдарпайиҳои вирусиро дар бар мегирад, ки ба геноми мизбони мизбон ворид карда шудаанд. Ин барои мидияҳо махсусан муҳим аст, бо назардошти мавҷудияти ретровирусҳои лейкемии уфуқӣ дар дуқабата [80, 81]. Бартарии дигари LB нисбат ба eDNA дар он аст, ки он аз фаъолияти фагоситикии ҳуҷайраҳои хуни гардишкунанда дар гемолимфа, ки микроорганизмҳоро (ва геномҳои онҳоро) фурӯ мебарад, истифода мебарад. Фагоцитоз вазифаи асосии ҳуҷайраҳои хун дар дуқабата мебошад [82]. Ниҳоят, усул аз қобилияти баланди филтркунии мидияҳо (ба ҳисоби миёна 1,5 л/соат оби баҳр) ва гардиши дурӯза истифода мебарад, ки омезиши қабатҳои гуногуни оби баҳрро зиёд мекунанд ва имкон медиҳанд, ки eDNA-и гетерологӣ гирифта шавад. [83, 84]. Ҳамин тариқ, таҳлили ccfDNA-и мидия бо назардошти таъсири ғизоӣ, иқтисодӣ ва экологӣ ба мидияҳо як роҳи ҷолиб аст. Монанди таҳлили LB, ки аз одамон ҷамъоварӣ шудааст, ин усул инчунин имконияти чен кардани тағйироти генетикӣ ва эпигенетикӣ дар ДНК-и мизбонро дар посух ба моддаҳои экзогенӣ фароҳам меорад. Масалан, технологияҳои секвенсияи насли сеюмро метавон барои анҷом додани таҳлили метилизатсияи саросари геном дар ccfDNA-и маҳаллӣ бо истифода аз секвенсияи нанопораҳо пешбинӣ кард. Ин раванд бояд бо он далел осон карда шавад, ки дарозии пораҳои ccfDNA-и мидияҳо бо платформаҳои секвенсияи дарозхондашуда комилан мувофиқ аст, ки имкон медиҳад таҳлили метилизатсияи ДНК-и саросари геном аз як даври секвенсия бидуни ниёз ба табдилоти кимиёвӣ анҷом дода шавад.85,86] Ин як имконияти ҷолиб аст, зеро нишон дода шудааст, ки намунаҳои метилизатсияи ДНК вокунишро ба стресси муҳити зист инъикос мекунанд ва дар тӯли бисёр наслҳо боқӣ мемонанд. Аз ин рӯ, он метавонад фаҳмиши арзишмандро дар бораи механизмҳои аслии танзимкунандаи вокуниш пас аз дучор шудан ба тағирёбии иқлим ё ифлоскунандаҳо пешниҳод кунад [87]. Аммо, истифодаи LB бе маҳдудият нест. Ногуфта намонад, ки ин мавҷудияти намудҳои нишондиҳандаро дар экосистема талаб мекунад. Тавре ки дар боло қайд карда шуд, истифодаи LB барои арзёбии гуногунии биологии як экосистемаи муайян инчунин як лӯлаи биоинформатикии қатъиро талаб мекунад, ки мавҷудияти пораҳои ДНК-ро аз манбаъ ба назар мегирад. Мушкилоти дигари асосӣ дастрасии геномҳои истинодӣ барои намудҳои баҳрӣ мебошад. Умед аст, ки ташаббусҳо ба монанди Лоиҳаи геномҳои ширхӯрони баҳрӣ ва лоиҳаи ба наздикӣ таъсисёфтаи Fish10k [88] чунин таҳлилро дар оянда осон хоҳанд кард. Татбиқи консепсияи LB ба организмҳои ғизодиҳии баҳрӣ бо филтр инчунин бо пешрафтҳои навтарин дар технологияи секвенсия мувофиқ аст, ки онро барои таҳияи биомаркерҳои бисёромӣ барои пешниҳоди маълумоти муҳим дар бораи саломатии муҳити зисти баҳрӣ дар посух ба стресси экологӣ хеле мувофиқ мегардонад.
Маълумоти пайдарпайии геном дар бойгонии хондани пайдарпайии NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 дар зери лоиҳаҳои Bioprojects SRR8924808 нигоҳ дошта шудааст.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Ҷ. Таъсири тағйирёбии иқлим ба ҳаёти баҳрӣ ва экосистемаҳо. Коул Биология. 2009; 19: P602–P614.
Гисси Э, Манеа Э, Мазарис А.Д., Фрасчетти С, Алпаниду В., Бевилаква С. ва дигарон. Таъсири якҷояи тағйирёбии иқлим ва дигар омилҳои стрессии маҳаллиро ба муҳити баҳрӣ баррасӣ кунед. муҳити илмии умумӣ. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Илми якуми март. 2020;7:48.
Серонт Л, Никастро КР, Зарди ГИ, Гобервилл Э. Таҳаммулпазирии пасти гармӣ дар шароити стресси такрории гармӣ фавти баланди мидияҳои кабудро дар тобистон шарҳ медиҳад. Ҳисоботи илмӣ 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сиепиелски А.М., Нуссле С., Сервантес-Йошида К., Хван Ҷ.Л., Хубер Э.Р. ва дигарон. Тағйироти ахир дар басомад, сабабҳо ва дараҷаи фавти ҳайвонот. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Якчанд микроорганизмҳои патогенӣ, ки ба намудҳо хос нестанд, метавонанд боиси марги оммавии Pinna nobilis шаванд. Ҳаёт. 2020;10:238.
Брэдли М, Куттс СҶ, Ҷенкинс Э, О'Ҳара ТМ. Таъсири эҳтимолии тағйирёбии иқлим ба бемориҳои зоонозии Арктика. Маҷаллаи байналмилалии саломатии Circumpolar. 2005; 64:468–77.
Бейер Ҷ., Грин NW, Брукс С., Аллан IJ, Руус А., Гомес Т. ва дигарон. Мидияҳои кабуд (Mytilus edulis spp.) ҳамчун организмҳои сигналӣ дар мониторинги ифлосшавии соҳилӣ: баррасӣ. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравегна Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Ҳамгироии биопсияи моеъ дар табобати саратон. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Ҷ.С.М., Масси К., Гарсия-Корбачо Ҷ., Мулиер Ф., Брентон Ҷ.Д., Калдас К. ва дигарон. Пуррашавии биопсияи моеъ: имкон медиҳад, ки ДНК-и варам гардиш кунад. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандел П., Метайс П. Кислотаҳои нуклеинӣ дар плазмаи инсон. Протоколи ҷаласаҳои филиалҳои Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Бронхорст AJ, Унгерер W, Холденридер С. Нақши нав барои ДНК-и беҳуҷайра ҳамчун нишони молекулавӣ барои табобати саратон. Миқдори таҳлили биомолярӣ. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Ҷеффри С.С. Биопсияи моеъ ба клиника ворид мешавад - масъалаҳои татбиқ ва мушкилоти оянда. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент ИЛ., Редман К.В. ва дигарон. ДНК-и ҷанин дар плазма ва зардоби модар мавҷуд аст. Лансет. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Ҷ., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Квейк С.Р. Омӯзиши ҷараёни ҳомиладорӣ ва мушкилоти он бо истифода аз РНК-и берунҳуҷайравии гардишкунанда дар хуни занон ҳангоми ҳомиладорӣ. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеовн П, Шютс Э, Бек Ҷ, Стегбауэр Ҷ ва дигарон. Биопсияи моеъ: ДНК-и бидуни ҳуҷайраҳои донор барои муайян кардани захмҳои аллогенӣ дар пайванди гурда истифода мешавад. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Навовариҳо дар ташхиси перинаталӣ: пайдарпайии геноми плазмаи модар. Анна М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В, Денг Х, Ли М, Суку ЮД, Аревало С, Страйк Д ва дигарон. Муайянкунии босуръати патогенҳо бо пайдарпайии метагеномикии насли ояндаи моеъҳои сироятёфтаи бадан. Nat Medicine. 2021;27:115-24.