Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Ang liquid biopsy (LB) ay isang konsepto na mabilis na sumisikat sa larangan ng biomedikal. Ang konsepto ay pangunahing nakabatay sa pagtuklas ng mga fragment ng circulating extracellular DNA (ccfDNA), na pangunahing inilalabas bilang maliliit na fragment pagkatapos ng pagkamatay ng cell sa iba't ibang tisyu. Ang isang maliit na proporsyon ng mga fragment na ito ay nagmumula sa mga dayuhang (dayuhang) tisyu o organismo. Sa kasalukuyang pag-aaral, inilapat namin ang konseptong ito sa mga tahong, isang sentinel species na kilala sa kanilang mataas na kapasidad sa pagsasala ng tubig-dagat. Ginagamit namin ang kakayahan ng mga tahong na kumilos bilang natural na mga pansala upang makuha ang mga fragment ng DNA sa kapaligiran mula sa iba't ibang mapagkukunan upang magbigay ng impormasyon tungkol sa biodiversity ng mga marine coastal ecosystem. Ipinapakita ng aming mga resulta na ang mussel hemolymph ay naglalaman ng mga fragment ng DNA na lubhang nag-iiba-iba ang laki, mula 1 hanggang 5 kb. Ipinakita ng shotgun sequencing na ang isang malaking bilang ng mga fragment ng DNA ay nagmula sa ibang bansang microbial. Kabilang sa mga ito, natagpuan namin ang mga fragment ng DNA mula sa bacteria, archaea, at mga virus, kabilang ang mga virus na kilalang nakakahawa sa iba't ibang host na karaniwang matatagpuan sa mga coastal marine ecosystem. Bilang konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB na inilapat sa mga tahong ay kumakatawan sa isang mayaman ngunit hindi pa nagagalugad na mapagkukunan ng kaalaman tungkol sa pagkakaiba-iba ng mikrobyo sa mga ekosistema sa baybaying dagat.
Ang epekto ng pagbabago ng klima (CC) sa biodiversity ng mga marine ecosystem ay isang mabilis na lumalagong larangan ng pananaliksik. Ang global warming ay hindi lamang nagdudulot ng mahahalagang physiological stress, kundi itinutulak din nito ang mga limitasyon sa ebolusyon ng thermal stability ng mga organismo sa dagat, na nakakaapekto sa tirahan ng ilang species, na nag-uudyok sa kanila na maghanap ng mas kanais-nais na mga kondisyon [1, 2]. Bukod sa pag-apekto sa biodiversity ng mga metazoan, sinisira ng CC ang maselang balanse ng mga interaksyon ng host-microbial. Ang microbial dysbacteriosis na ito ay nagdudulot ng seryosong banta sa mga marine ecosystem dahil ginagawa nitong mas madaling kapitan ang mga organismo sa dagat sa mga nakakahawang pathogen [3, 4]. Pinaniniwalaan na ang SS ay may mahalagang papel sa malawakang pagkamatay, na isang seryosong problema para sa pamamahala ng mga pandaigdigang marine ecosystem [5, 6]. Ito ay isang mahalagang isyu dahil sa mga epekto sa ekonomiya, ekolohiya, at nutrisyon ng maraming marine species. Ito ay totoo lalo na para sa mga bivalve na naninirahan sa mga polar region, kung saan ang mga epekto ng CK ay mas agaran at matindi [6, 7]. Sa katunayan, ang mga bivalve tulad ng Mytilus spp. ay malawakang ginagamit upang subaybayan ang mga epekto ng CC sa mga marine ecosystem. Hindi kataka-taka, isang medyo malaking bilang ng mga biomarker ang nabuo upang masubaybayan ang kanilang kalusugan, kadalasang gumagamit ng two-tier approach na kinasasangkutan ng mga functional biomarker batay sa enzymatic activity o cellular functions tulad ng cell viability at phagocytic activity [8]. Kasama rin sa mga pamamaraang ito ang pagsukat ng konsentrasyon ng mga partikular na tagapagpahiwatig ng presyon na naiipon sa malambot na tisyu pagkatapos ng pagsipsip ng malalaking halaga ng tubig dagat. Gayunpaman, ang mataas na kapasidad ng pagsasala at semi-open circulatory system ng mga bivalve ay nagbibigay ng pagkakataon upang bumuo ng mga bagong hemolymph biomarker gamit ang konsepto ng liquid biopsy (LB), isang simple at minimally invasive na diskarte sa pamamahala ng pasyente. mga sample ng dugo [9, 10]. Bagama't maraming uri ng circulating molecule ang matatagpuan sa human LB, ang konseptong ito ay pangunahing batay sa DNA sequencing analysis ng mga circulating extracellular DNA (ccfDNA) fragment sa plasma. Sa katunayan, ang pagkakaroon ng circulating DNA sa human plasma ay kilala na simula pa noong kalagitnaan ng ika-20 siglo [11], ngunit nitong mga nakaraang taon lamang humantong ang pagdating ng mga high-throughput sequencing methods sa clinical diagnosis batay sa ccfDNA. Ang pagkakaroon ng mga pira-pirasong DNA na ito na umiikot ay bahagyang dahil sa pasibong paglabas ng genomic DNA (nuclear at mitochondrial) pagkatapos ng pagkamatay ng cell. Sa mga malulusog na indibidwal, ang konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL) ngunit maaaring tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyenteng dumaranas ng iba't ibang patolohiya o napapailalim sa stress, na nagreresulta sa pinsala sa tissue. Sa mga malulusog na indibidwal, ang konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL) ngunit maaaring tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyenteng dumaranas ng iba't ibang patolohiya o napapailalim sa stress, na nagreresulta sa pinsala sa tissue. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухлчо патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sa malulusog na tao, ang konsentrasyon ng cccDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL), ngunit maaari itong tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyenteng may iba't ibang patolohiya o nasa ilalim ng stress na humahantong sa pinsala sa tisyu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损会。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 或 承叛可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у млица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ang mga konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/ml) sa mga malulusog na indibidwal, ngunit maaaring tumaas nang 5-10 beses sa mga pasyenteng may iba't ibang patolohiya o stress, na nagreresulta sa pinsala sa tisyu.Ang laki ng mga fragment ng ccfDNA ay lubhang nag-iiba, ngunit kadalasan ay mula 150 hanggang 200 bp. [12]. Ang pagsusuri ng self-derived ccfDNA, i.e., ccfDNA mula sa normal o transformed host cells, ay maaaring gamitin upang matukoy ang mga pagbabago sa henetiko at epigenetic na naroroon sa nuclear at/o mitochondrial genome, sa gayon ay nakakatulong sa mga clinician na pumili ng mga partikular na molecular-targeted therapies [13]. Gayunpaman, ang ccfDNA ay maaaring makuha mula sa mga dayuhang mapagkukunan tulad ng ccfDNA mula sa mga fetal cell habang nagbubuntis o mula sa mga transplanted organ [14,15,16,17]. Ang ccfDNA ay isa ring mahalagang mapagkukunan ng impormasyon para sa pagtuklas ng presensya ng mga nucleic acid ng isang nakakahawang ahente (dayuhan), na nagbibigay-daan sa hindi nagsasalakay na pagtuklas ng mga laganap na impeksyon na hindi natukoy ng mga blood culture, na iniiwasan ang nagsasalakay na biopsy ng mga nahawaang tisyu [18]. Ipinakita nga ng mga kamakailang pag-aaral na ang dugo ng tao ay naglalaman ng masaganang mapagkukunan ng impormasyon na maaaring gamitin upang matukoy ang mga viral at bacterial pathogens, at na humigit-kumulang 1% ng ccfDNA na matatagpuan sa plasma ng tao ay nagmula sa ibang bansa [19]. Ipinapakita ng mga pag-aaral na ito na ang biodiversity ng circulating microbiome ng isang organismo ay maaaring masuri gamit ang ccfDNA analysis. Gayunpaman, hanggang kamakailan lamang, ang konseptong ito ay ginamit lamang sa mga tao at, sa mas mababang antas, sa iba pang mga vertebrate [20, 21].
Sa kasalukuyang papel, ginagamit namin ang potensyal ng LB upang suriin ang ccfDNA ng Aulacomya atra, isang uri ng hayop sa timog na karaniwang matatagpuan sa subantarctic Kerguelen Islands, isang grupo ng mga isla sa ibabaw ng isang malaking talampas na nabuo 35 milyong taon na ang nakalilipas. pagsabog ng bulkan. Gamit ang isang in vitro experimental system, natuklasan namin na ang mga fragment ng DNA sa tubig-dagat ay mabilis na nasisipsip ng mga tahong at pumapasok sa hemolymph compartment. Ipinakita ng shotgun sequencing na ang mussel hemolymph ccfDNA ay naglalaman ng mga fragment ng DNA na sarili at hindi nagmula sa sarili, kabilang ang mga symbiotic bacteria at mga fragment ng DNA mula sa mga biome na tipikal sa malamig na volcanic marine coastal ecosystem. Ang Hemolymph ccfDNA ay naglalaman din ng mga viral sequence na nagmula sa mga virus na may iba't ibang host range. Nakakita rin kami ng mga fragment ng DNA mula sa mga multicellular na hayop tulad ng bony fish, sea anemone, algae at mga insekto. Bilang konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB ay maaaring matagumpay na mailapat sa mga marine invertebrate upang makabuo ng isang mayamang genomic repertoire sa mga marine ecosystem.
Ang mga nasa hustong gulang na tahong (55-70 mm ang haba) na Mytilus platensis (M. platensis) at Aulacomya atra (A. atra) ay kinolekta mula sa mabatong baybayin ng Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .), Kerguelen Islands noong Disyembre 2018. Ang iba pang nasa hustong gulang na tahong na asul (Mytilus spp.) ay nakuha mula sa isang komersyal na supplier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) at inilagay sa isang tangkeng may aerasyon na kontrolado ang temperatura (4°C) na naglalaman ng 10–20 L ng 32‰ artipisyal na brine. (artipisyal na asin sa dagat na Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Para sa bawat eksperimento, sinukat ang haba at bigat ng mga indibidwal na shell.
Isang libreng open access protocol para sa programang ito ang makukuha online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Sa madaling salita, ang LB hemolymph ay kinolekta mula sa mga kalamnan ng abductor gaya ng inilarawan [22]. Ang hemolymph ay nilinaw sa pamamagitan ng centrifugation sa 1200×g sa loob ng 3 minuto, ang supernatant ay pinalamig (-20°C) hanggang sa gamitin. Para sa paghihiwalay at paglilinis ng cfDNA, ang mga sample (1.5-2.0 ml) ay tinunaw at pinoproseso gamit ang NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang ccfDNA ay iniimbak sa -80°C hanggang sa karagdagang pagsusuri. Sa ilang mga eksperimento, ang ccfDNA ay inihiwalay at pinadalisay gamit ang QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Ang pinadalisay na DNA ay tinantiya gamit ang isang karaniwang PicoGreen assay. Ang distribusyon ng fragment ng nakahiwalay na ccfDNA ay sinuri sa pamamagitan ng capillary electrophoresis gamit ang isang Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gamit ang isang High Sensitivity DNA Kit. Ang assay ay isinagawa gamit ang 1 µl ng sample ng ccfDNA ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.
Para sa sequencing ng mga fragment ng hemolymph ccfDNA, ang Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ay naghanda ng mga shotgun library gamit ang Illumina DNA Mix kit ng Illumina MiSeq PE75 kit. Isang standard adapter (BioO) ang ginamit. Ang mga raw data file ay makukuha mula sa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 at SRR8924809). Ang basic reading quality ay tinasa gamit ang FastQC [23]. Ang Trimmomatic [24] ay ginamit para sa mga clipping adapter at mga mababang kalidad na read. Ang mga shotgun read na may mga nakapares na dulo ay pinagsama sa FLASH sa mas mahahabang single read na may minimum na overlap na 20 bp upang maiwasan ang mga hindi pagkakatugma [25]. Ang mga pinagsamang pagbasa ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN gamit ang isang bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 at 90% homology), at ang pag-mask ng mga low-complexity sequence ay isinagawa gamit ang DUST [26]. Ang mga pinagsamang pagbasa ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN gamit ang isang bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 at 90% homology), at ang pag-mask ng mga low-complexity sequence ay isinagawa gamit ang DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчозвналюмч < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Ang mga pinagsamang pagbasa ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomy database (e value < 1e-3 at 90% homology), at ang low complexity sequence masking ay isinagawa gamit ang DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，年敽，用年进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 6繨 ， 2进行 复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствохючат (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с исполнено с исполмьзоUST]. Ang mga pinagsamang pagbasa ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 at 90% homology), at ang low complexity sequence masking ay isinagawa gamit ang DUST [26].Ang mga read ay hinati sa dalawang grupo: may kaugnayan sa mga sequence ng bivalve (tinatawag dito na self-reads) at walang kaugnayan (mga non-self-reads). Dalawang grupo ang magkahiwalay na binuo gamit ang MEGAHIT upang makabuo ng mga contig [27]. Samantala, ang taxonomic distribution ng mga alien microbiome read ay inuri gamit ang Kraken2 [28] at grapikong kinakatawan ng isang Krona pie chart sa Galaxy [29, 30]. Ang pinakamainam na kmers ay natukoy na kmers-59 mula sa aming mga paunang eksperimento. Ang mga self contig ay kinilala sa pamamagitan ng pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 at 60% homology) para sa isang pangwakas na anotasyon. Ang mga self contig ay kinilala sa pamamagitan ng pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 at 60% homology) para sa isang pangwakas na anotasyon. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллючиск, 1 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Ang mga self-contig ay kinilala sa pamamagitan ng pagtutugma laban sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 at 60% homology) para sa pangwakas na anotasyon.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал NCBIн двустворчатых моллюсков, значение at <1e-10 at гомология 60%). Ang mga self-contig ay kinilala para sa pangwakas na anotasyon sa pamamagitan ng pagtutugma laban sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 at 60% homology). Kasabay nito, ang mga nonself group contigs ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 at 60% homology). Kasabay nito, ang mga nonself group contigs ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 at 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 мио. Kasabay nito, ang mga dayuhang grupo ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 at 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt nt 1 гомология 60%). Kasabay nito, ang mga non-self group contigs ay nilagyan ng anotasyon gamit ang BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 at 60% homology). Isinagawa rin ang BLASTX sa mga nonself contig gamit ang nr at RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 at 60% homology). Isinagawa rin ang BLASTX sa mga nonself contig gamit ang nr at RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 at 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение лио <1e%) Isinagawa rin ang BLASTX sa mga non-self contigs gamit ang nr at RefSeq NCBI protein databases (e value < 1e-10 at 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同60% 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同60% 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Isinagawa rin ang BLASTX sa mga non-self contigs gamit ang nr at RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 at 60% homology).Ang mga pool ng BLASTN at BLASTX ng mga non-self-contig ay kumakatawan sa mga pangwakas na contig (tingnan ang Karagdagang file).
Ang mga primer na ginamit para sa PCR ay nakalista sa Table S1. Ginamit ang Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) upang palakasin ang mga target gene ng ccfDNA. Ang mga sumusunod na kondisyon ng reaksyon ay ginamit: denaturation sa 95°C sa loob ng 3 minuto, 95°C sa loob ng 1 minuto, itinakda ang temperatura ng annealing sa loob ng 1 minuto, elongation sa 72°C sa loob ng 1 minuto, 35 cycle, at panghuli ay 72°C sa loob ng 10 minuto. . Ang mga produkto ng PCR ay pinaghiwalay sa pamamagitan ng electrophoresis sa agarose gels (1.5%) na naglalaman ng SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) sa 95 V.
Ang mga tahong (Mytilus spp.) ay iniangkop sa 500 ml na oxygenated seawater (32 PSU) sa loob ng 24 oras sa 4°C. Ang plasmid DNA na naglalaman ng insert na nagko-code sa human galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) ay idinagdag sa vial sa huling konsentrasyon na 190 μg/μl. Ang mga tahong na in-incubate sa ilalim ng parehong mga kondisyon nang walang idinagdag na DNA ang siyang kontrol. Ang ikatlong control tank ay naglalaman ng DNA na walang tahong. Upang masubaybayan ang kalidad ng DNA sa tubig-dagat, ang mga sample ng tubig-dagat (20 μl; tatlong pag-uulit) ay kinuha mula sa bawat tangke sa itinakdang oras. Para sa traceability ng plasmid DNA, ang mga LB na tahong ay inani sa itinakdang oras at sinuri sa pamamagitan ng qPCR at ddPCR. Dahil sa mataas na nilalaman ng alat ng tubig-dagat, ang mga aliquot ay diluted sa tubig na may kalidad ng PCR (1:10) bago ang lahat ng PCR assays.
Isinagawa ang digital droplet PCR (ddPCR) gamit ang BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada). Gamitin ang temperature profile upang matukoy ang pinakamainam na temperatura (Table S1). Ang mga patak ay nabuo gamit ang isang QX200 drop generator (BioRad). Ang ddPCR ay isinagawa tulad ng sumusunod: 95°C sa loob ng 5 minuto, 50 cycle ng 95°C sa loob ng 30 segundo at isang ibinigay na annealing temperature sa loob ng 1 minuto at 72°C sa loob ng 30 segundo, 4°C sa loob ng 5 minuto at 90°C sa loob ng 5 minuto. Ang bilang ng mga patak at positibong reaksyon (bilang ng mga kopya/µl) ay sinukat gamit ang isang QX200 drop reader (BioRad). Ang mga sample na may mas mababa sa 10,000 droplet ay tinanggihan. Ang pattern control ay hindi isinagawa sa bawat oras na pinatakbo ang ddPCR.
Isinagawa ang qPCR gamit ang Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) at mga primer na partikular sa LGALS7. Lahat ng quantitative PCR ay isinagawa sa 20 µl gamit ang QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Sinimulan ang qPCR sa 15 minutong incubation sa 95°C na sinundan ng 40 cycle sa 95°C sa loob ng 10 segundo at sa 60°C sa loob ng 60 segundo na may isang koleksyon ng datos. Ang mga melting curve ay nabuo gamit ang magkakasunod na pagsukat sa 95°C sa loob ng 5 segundo, 65°C sa loob ng 60 segundo, at 97°C sa pagtatapos ng qPCR. Ang bawat qPCR ay isinagawa nang tatlong beses, maliban sa mga control sample.
Dahil kilala ang mga tahong sa kanilang mataas na antas ng pagsasala, una naming sinuri kung kaya nilang salain at panatilihin ang mga fragment ng DNA na nasa tubig-dagat. Interesado rin kami kung naiipon ba ang mga fragment na ito sa kanilang semi-open lymphatic system. Nalutas namin ang isyung ito sa pamamagitan ng eksperimento sa pamamagitan ng pagsubaybay sa kapalaran ng mga natutunaw na fragment ng DNA na idinagdag sa mga tangke ng asul na tahong. Upang mapadali ang pagsubaybay sa mga fragment ng DNA, gumamit kami ng dayuhan (hindi self) plasmid DNA na naglalaman ng human galectin-7 gene. Sinusubaybayan ng ddPCR ang mga fragment ng plasmid DNA sa tubig-dagat at tahong. Ipinapakita ng aming mga resulta na kung ang dami ng mga fragment ng DNA sa tubig-dagat ay nanatiling medyo pare-pareho sa paglipas ng panahon (hanggang 7 araw) nang walang tahong, kung gayon sa presensya ng mga tahong, ang antas na ito ay halos ganap na nawala sa loob ng 8 oras (Fig. 1a,b). Ang mga fragment ng exogenous DNA ay madaling matukoy sa loob ng 15 minuto sa intravalvular fluid at hemolymph (Fig. 1c). Ang mga fragment na ito ay maaari pa ring matukoy hanggang 4 na oras pagkatapos ng pagkakalantad. Ang aktibidad ng pagsasala na ito kaugnay ng mga fragment ng DNA ay maihahambing sa aktibidad ng pagsasala ng bacteria at algae [31]. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang mga tahong ay maaaring magsala at mag-ipon ng dayuhang DNA sa kanilang mga kompartamento ng likido.
Mga relatibong konsentrasyon ng plasmid DNA sa tubig-dagat sa presensya (A) o kawalan (B) ng mga tahong, sinusukat gamit ang ddPCR. Sa A, ang mga resulta ay ipinapahayag bilang mga porsyento, kung saan ang mga hangganan ng mga kahon ay kumakatawan sa ika-75 at ika-25 percentile. Ang fitted logarithmic curve ay ipinapakita sa pula, at ang lugar na may kulay abo ay kumakatawan sa 95% confidence interval. Sa B, ang pulang linya ay kumakatawan sa mean at ang asul na linya ay kumakatawan sa 95% confidence interval para sa konsentrasyon. C Akumulasyon ng plasmid DNA sa hemolymph at valvular fluid ng mga tahong sa iba't ibang oras pagkatapos ng pagdaragdag ng plasmid DNA. Ang mga resulta ay ipinapakita bilang mga absolute copies na nakita/mL (±SE).
Susunod, sinuri namin ang pinagmulan ng ccfDNA sa mga tahong na nakolekta mula sa mga kama ng tahong sa Kerguelen Islands, isang liblib na grupo ng mga isla na may limitadong impluwensya ng tao. Para sa layuning ito, ang cccDNA mula sa mga hemolymph ng tahong ay inihiwalay at pinadalisay sa pamamagitan ng mga pamamaraang karaniwang ginagamit upang linisin ang cccDNA ng tao [32, 33]. Natuklasan namin na ang average na konsentrasyon ng hemolymph ccfDNA sa mga tahong ay nasa mababang micrograms bawat ml na hanay ng hemolymph (tingnan ang Table S2, Karagdagang Impormasyon). Ang hanay na ito ng mga konsentrasyon ay mas malaki kaysa sa mga malulusog na tao (mababang nanograms bawat milliliter), ngunit sa mga bihirang kaso, sa mga pasyenteng may kanser, ang antas ng ccfDNA ay maaaring umabot sa ilang micrograms bawat milliliter [34, 35]. Ang isang pagsusuri sa distribusyon ng laki ng hemolymph ccfDNA ay nagpakita na ang mga fragment na ito ay lubhang nag-iiba sa laki, mula 1000 bp hanggang 1000 bp. hanggang 5000 bp (Fig. 2). Nakamit ang mga katulad na resulta gamit ang silica-based QIAamp Investigator Kit, isang pamamaraang karaniwang ginagamit sa forensic science upang mabilis na ihiwalay at linisin ang genomic DNA mula sa mga sample ng DNA na may mababang konsentrasyon, kabilang ang ccfDNA [36].
Kinatawan na ccfDNA electrophoregram ng hemolymph ng tahong. Kinuha gamit ang NucleoSnap Plasma Kit (itaas) at QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin plot na nagpapakita ng distribusyon ng mga konsentrasyon ng hemolymph ccfDNA (±SE) sa mga tahong. Ang mga itim at pulang linya ay kumakatawan sa median at una at ikatlong quartile, ayon sa pagkakabanggit.
Humigit-kumulang 1% ng ccfDNA sa mga tao at primate ay may dayuhang pinagmulan [21, 37]. Dahil sa semi-open circulatory system ng mga bivalve, mayaman sa microbial na tubig-dagat, at ang distribusyon ng laki ng tahong ccfDNA, aming hinuha na ang hemolymph ccfDNA ng tahong ay maaaring naglalaman ng mayaman at magkakaibang pool ng microbial DNA. Upang masubukan ang hypothesis na ito, sinuri namin ang hemolymph ccfDNA mula sa mga sample ng Aulacomya atra na nakolekta mula sa Kerguelen Islands, na nagbunga ng mahigit 10 milyong reads, 97.6% nito ay nakapasa sa quality control. Ang mga readings ay inuri ayon sa self at non-self sources gamit ang BLASTN at NCBI bivalve databases (Fig. S1, Supplementary Information).
Sa mga tao, ang parehong nuclear at mitochondrial DNA ay maaaring ilabas sa daluyan ng dugo [38]. Gayunpaman, sa kasalukuyang pag-aaral, hindi posible na ilarawan nang detalyado ang nuclear genomic DNA ng mga tahong, dahil ang genome ng A. atra ay hindi pa nase-sequence o nailarawan. Gayunpaman, natukoy namin ang ilang mga fragment ng ccfDNA na nagmula sa amin gamit ang bivalve library (Fig. S2, Supplementary Information). Kinumpirma rin namin ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na nagmula sa amin sa pamamagitan ng directed PCR amplification ng mga gene ng A. atra na na-sequence (Fig. 3). Gayundin, dahil ang mitochondrial genome ng A. atra ay makukuha sa mga pampublikong database, makakahanap ng ebidensya para sa pagkakaroon ng mga fragment ng mitochondrial ccfDNA sa hemolymph ng A. atra. Ang pagkakaroon ng mga fragment ng mitochondrial DNA ay kinumpirma ng PCR amplification (Fig. 3).
Iba't ibang mitochondrial gene ang makikita sa hemolymph ng A. atra (mga pulang tuldok – stock number: SRX5705969) at M. platensis (mga asul na tuldok – stock number: SRX5705968) na pinalaki sa pamamagitan ng PCR. Ang larawan ay hinango mula sa Breton et al., 2011 B. Pagpapalaki ng hemolymph supernatant mula sa A. atra. Nakaimbak sa papel na FTA. Gumamit ng 3 mm punch upang direktang idagdag sa PCR tube na naglalaman ng PCR mix.
Dahil sa masaganang nilalaman ng mikrobyo sa tubig-dagat, una naming pinagtuunan ng pansin ang paglalarawan ng mga sequence ng microbial DNA sa hemolymph. Upang magawa ito, gumamit kami ng dalawang magkaibang estratehiya. Ang unang estratehiya ay gumamit ng Kraken2, isang programang pang-klasipikasyon ng sequence batay sa algorithm na maaaring tumukoy ng mga sequence ng mikrobyo na may katumpakan na maihahambing sa BLAST at iba pang mga kagamitan [28]. Mahigit sa 6719 na nabasa ang natukoy na nagmula sa bakterya, habang 124 at 64 ay mula sa archaea at mga virus, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 4). Ang pinakamaraming fragment ng bacterial DNA ay ang Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), at Bacteroidetes (17%) (Larawan 4a). Ang distribusyon na ito ay naaayon sa mga nakaraang pag-aaral ng marine blue mussel microbiome [39, 40]. Ang Gammaproteobacteria ang pangunahing klase ng Proteobacteria (44%), kabilang ang maraming Vibrionales (Larawan 4b). Kinumpirma ng pamamaraang ddPCR ang presensya ng mga fragment ng Vibrio DNA sa ccfDNA ng A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41]. Upang makakuha ng karagdagang impormasyon tungkol sa pinagmulan ng bacteria ng ccfDNA, isang karagdagang pamamaraan ang ginamit (Fig. S2, Karagdagang Impormasyon). Sa kasong ito, ang mga read na nag-overlap ay pinagsama-sama bilang mga paired-end read at inuri bilang self (bivalves) o nonself origin gamit ang BLASTN at isang e value na 1e−3 at isang cutoff na may >90% homology. Sa kasong ito, ang mga read na nag-overlap ay pinagsama-sama bilang mga paired-end read at inuri bilang self (bivalves) o nonself origin gamit ang BLASTN at isang e value na 1e−3 at isang cutoff na may >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированыстостик моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Sa kasong ito, ang mga magkakapatong na pagbasa ay tinipon bilang mga paired-ended na pagbasa at inuri bilang katutubo (bivalve) o hindi orihinal gamit ang BLASTN at e value na 1e-3 at cutoff na may >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 和 和 的3> blastn 的3> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстоствены моллюски) o несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Sa kasong ito, ang mga magkakapatong na pagbasa ay kinolekta bilang mga paired-ended na pagbasa at inuri bilang sarili (mga bivalve) o hindi orihinal gamit ang mga halaga ng e BLASTN at 1e-3 at isang homology threshold na >90%.Dahil hindi pa nase-sequence ang genome ng A. atra, ginamit namin ang de novo assembly strategy ng MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler. Isang kabuuang 147,188 contigs ang natukoy bilang dependent (bivalves) na pinagmulan. Ang mga contig na ito ay pinasabog gamit ang mga e-values ​​​​na 1e-10 gamit ang BLASTN at BLASTX. Ang estratehiyang ito ay nagbigay-daan sa amin upang matukoy ang 482 non-bivalve fragments na nasa A. atra ccfDNA. Mahigit sa kalahati (57%) ng mga DNA fragment na ito ay nakuha mula sa bacteria, pangunahin mula sa mga gill symbionts, kabilang ang mga sulfotrophic symbionts, at mula sa mga gill symbionts na Solemya velum (Fig. 5).
Relatibong kasaganaan sa antas ng uri. B Pagkakaiba-iba ng mikrobyo ng dalawang pangunahing phyla (Firmicutes at Proteobacteria). Kinatawan na amplipikasyon ng ddPCR C Vibrio spp. A. Mga fragment ng 16S rRNA gene (asul) sa tatlong atra hemolymph.
Isang kabuuang 482 na nakolektang contig ang sinuri. Pangkalahatang profile ng taxonomic distribution ng metagenomic contig annotation (prokaryotes at eukaryotes). B Detalyadong distribusyon ng mga bacterial DNA fragment na kinilala ng BLASTN at BLASTX.
Ipinakita rin ng pagsusuri ng Kraken2 na ang tahong ccfDNA ay naglalaman ng mga archaeal na fragment ng DNA, kabilang ang mga fragment ng DNA ng Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), at Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na nagmula sa Euryarchaeota at Crenarchaeota, na dating natagpuan sa microbial community ng mga tahong sa California, ay hindi dapat ikagulat [42]. Bagama't ang Euryarchaeota ay madalas na iniuugnay sa mga matinding kondisyon, kinikilala na ngayon na ang parehong Euryarchaeota at Crenarcheota ay kabilang sa mga pinakakaraniwang prokaryote sa marine cryogenic environment [43, 44]. Ang pagkakaroon ng mga methanogenic microorganism sa mga tahong ay hindi nakakagulat, dahil sa mga kamakailang ulat ng malawakang pagtagas ng methane mula sa mga pagtagas sa ilalim sa Kerguelen Plateau [45] at posibleng produksyon ng microbial methane na naobserbahan sa baybayin ng Kerguelen Islands [46].
Pagkatapos ay lumipat ang aming atensyon sa mga pagbasa mula sa mga DNA virus. Sa abot ng aming kaalaman, ito ang unang off-target na pag-aaral ng nilalaman ng virus ng mga tahong. Gaya ng inaasahan, nakakita kami ng mga fragment ng DNA ng mga bacteriophage (Caudovirales) (Fig. 6b). Gayunpaman, ang pinakakaraniwang viral DNA ay nagmula sa isang phylum ng mga nucleocytovirus, na kilala rin bilang nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), na may pinakamalaking genome sa anumang virus. Sa loob ng phylum na ito, karamihan sa mga sequence ng DNA ay kabilang sa mga pamilyang Mimimidoviridae (58%) at Poxviridae (21%), na ang mga natural na host ay kinabibilangan ng mga vertebrate at arthropod, habang ang isang maliit na proporsyon ng mga sequence ng DNA na ito ay kabilang sa kilalang virological algae. Nakakahawa sa marine eukaryotic algae. Ang mga sequence ay nakuha rin mula sa Pandora virus, ang higanteng virus na may pinakamalaking laki ng genome sa anumang kilalang viral genera. Kapansin-pansin, ang hanay ng mga host na kilalang nahawaan ng virus, ayon sa natukoy ng hemolymph ccfDNA sequencing, ay medyo malaki (Figure S3, Karagdagang Impormasyon). Kabilang dito ang mga virus na nakakaapekto sa mga insekto tulad ng Baculoviridae at Iridoviridae, pati na rin ang mga virus na nakakaapekto sa amoeba, algae at vertebrates. Natagpuan din namin ang mga sequence na tumutugma sa genome ng Pithovirus sibericum. Ang mga Pitovirus (kilala rin bilang "mga zombie virus") ay unang inihiwalay mula sa 30,000 taong gulang na permafrost sa Siberia [47]. Kaya, ang aming mga resulta ay naaayon sa mga nakaraang ulat na nagpapakita na hindi lahat ng modernong species ng mga virus na ito ay wala na [48] at ang mga virus na ito ay maaaring naroroon sa mga liblib na subarctic marine ecosystem.
Panghuli, sinubukan namin upang makita kung makakahanap kami ng mga fragment ng DNA mula sa iba pang mga multicellular na hayop. Isang kabuuang 482 na dayuhang contig ang natukoy ng BLASTN at BLASTX gamit ang mga library ng nt, nr at RefSeq (genomic at protein). Ipinapakita ng aming mga resulta na sa mga dayuhang fragment ng ccfDNA ng mga multicellular na hayop, nangingibabaw ang DNA ng mga butong payat (Fig. 5). Natagpuan din ang mga fragment ng DNA mula sa mga insekto at iba pang mga species. Isang medyo malaking bahagi ng mga fragment ng DNA ang hindi pa natukoy, posibleng dahil sa kakulangan ng representasyon ng isang malaking bilang ng mga species ng dagat sa mga genomic database kumpara sa mga terrestrial species [49].
Sa kasalukuyang papel, inilalapat namin ang konsepto ng LB sa mga tahong, na nangangatwiran na ang hemolymph ccfDNA shot sequencing ay maaaring magbigay ng kaalaman sa komposisyon ng mga marine coastal ecosystem. Sa partikular, natuklasan namin na 1) ang mussel hemolymph ay naglalaman ng medyo mataas na konsentrasyon (mga antas ng microgram) ng medyo malalaki (~1-5 kb) na mga circulating DNA fragment; 2) ang mga DNA fragment na ito ay parehong independiyente at hindi independiyente 3) Sa mga dayuhang pinagmumulan ng mga DNA fragment na ito, natagpuan namin ang bacterial, archaeal at viral DNA, pati na rin ang DNA ng iba pang multicellular na hayop; 4) Ang akumulasyon ng mga dayuhang ccfDNA fragment na ito sa hemolymph ay mabilis na nangyayari at nakakatulong sa internal filtering activity ng mga tahong. Bilang konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB, na sa ngayon ay pangunahing inilalapat sa larangan ng biomedicine, ay nagko-code ng isang mayaman ngunit hindi pa nagagalugad na mapagkukunan ng kaalaman na maaaring magamit upang mas maunawaan ang interaksyon sa pagitan ng mga sentinel species at ng kanilang kapaligiran.
Bukod sa mga primate, naiulat na rin ang paghihiwalay ng ccfDNA sa mga mammal, kabilang ang mga daga, aso, pusa, at kabayo [50, 51, 52]. Gayunpaman, sa aming kaalaman, ang aming pag-aaral ang unang nag-uulat ng pagtuklas at pagkakasunod-sunod ng ccfDNA sa mga uri ng hayop sa dagat na may bukas na sistema ng sirkulasyon. Ang katangiang anatomikal at kakayahang magsala ng mga tahong ay maaaring, kahit papaano, ipaliwanag ang iba't ibang katangian ng laki ng mga fragment ng DNA na umiikot kumpara sa ibang mga uri ng hayop. Sa mga tao, karamihan sa mga fragment ng DNA na umiikot sa dugo ay maliliit na fragment na may sukat mula 150 hanggang 200 bp. na may pinakamataas na peak na 167 bp [34, 53]. Ang isang maliit ngunit makabuluhang bahagi ng mga fragment ng DNA ay nasa pagitan ng 300 at 500 bp ang laki, at humigit-kumulang 5% ay mas mahaba kaysa sa 900 bp. [54]. Ang dahilan ng distribusyon ng laki na ito ay ang pangunahing pinagmumulan ng ccfDNA sa plasma ay nangyayari bilang resulta ng pagkamatay ng selula, alinman dahil sa pagkamatay ng selula o dahil sa nekrosis ng mga circulating hematopoietic cells sa malulusog na indibidwal o dahil sa apoptosis ng mga tumor cells sa mga pasyenteng may kanser (kilala bilang circulating tumor DNA). , ctDNA). Ang distribusyon ng laki ng hemolymph ccfDNA na aming natagpuan sa mga tahong ay mula 1000 hanggang 5000 bp, na nagmumungkahi na ang ccfDNA ng tahong ay may ibang pinagmulan. Ito ay isang lohikal na hypothesis, dahil ang mga tahong ay may semi-open vascular system at naninirahan sa mga marine aquatic environment na naglalaman ng mataas na konsentrasyon ng microbial genomic DNA. Sa katunayan, ang aming mga eksperimento sa laboratoryo gamit ang exogenous DNA ay nagpakita na ang mga tahong ay nag-iipon ng mga fragment ng DNA sa tubig-dagat, kahit man lang pagkatapos ng ilang oras ay nabubulok ang mga ito pagkatapos ng cellular uptake at/o inilalabas at/o iniimbak sa iba't ibang organisasyon. Dahil sa pambihira ng mga selula (parehong prokaryotic at eukaryotic), ang paggamit ng mga intravalvular compartment ay magbabawas sa dami ng ccfDNA mula sa mga self-sources pati na rin mula sa mga dayuhang pinagmumulan. Kung isasaalang-alang ang kahalagahan ng likas na kaligtasan sa sakit ng mga bivalve at ang malaking bilang ng mga phagocyte na umiikot, lalo pa naming ipinapalagay na kahit ang mga dayuhang ccfDNA ay pinayaman ng mga umiikot na phagocyte na nag-iipon ng mga dayuhang DNA kapag nakain ang mga mikroorganismo at/o mga labi ng selula. Kung pagsasama-samahin, ipinapakita ng aming mga resulta na ang bivalve hemolymph ccfDNA ay isang natatanging imbakan ng impormasyong molekular at pinatitibay ang kanilang katayuan bilang isang sentinel species.
Ipinapahiwatig ng aming datos na ang sequencing at pagsusuri ng mga fragment ng hemolymph ccfDNA na nagmula sa bakterya ay maaaring magbigay ng mahalagang impormasyon tungkol sa host bacterial flora at bacteria na nasa nakapalibot na marine ecosystem. Ang mga pamamaraan ng shot sequencing ay nagsiwalat ng mga sequence ng commensal bacteria na A. atra gill na maaaring hindi napansin kung ginamit ang mga conventional 16S rRNA identification methods, dahil sa bahagi sa isang reference library bias. Sa katunayan, ang aming paggamit ng LB data na nakolekta mula sa M. platensis sa parehong layer ng tahong sa Kerguelen ay nagpakita na ang komposisyon ng gill-associated bacterial symbionts ay pareho para sa parehong species ng tahong (Fig. S4, Karagdagang Impormasyon). Ang pagkakatulad na ito ng dalawang magkaibang genetically tahong ay maaaring sumasalamin sa komposisyon ng mga bacterial community sa malamig, sulfurous, at volcanic deposits ng Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Ang mas mataas na antas ng sulfur-reducing microorganisms ay mahusay na inilarawan kapag nag-aani ng mga tahong mula sa mga bioturbated coastal area [59], tulad ng baybayin ng Port-au-France. Ang isa pang posibilidad ay ang flora ng commensal mussel ay maaaring maapektuhan ng horizontal transmission [60, 61]. Kailangan ng mas maraming pananaliksik upang matukoy ang ugnayan sa pagitan ng kapaligirang dagat, ibabaw ng sahig ng dagat, at ang komposisyon ng symbiotic bacteria sa mga tahong. Ang mga pag-aaral na ito ay kasalukuyang isinasagawa.
Ang haba at konsentrasyon ng hemolymph ccfDNA, ang kadalian ng paglilinis nito, at mataas na kalidad upang payagan ang mabilis na shotgun sequencing ay ilan sa maraming bentahe ng paggamit ng mussel ccfDNA upang masuri ang biodiversity sa mga marine coastal ecosystem. Ang pamamaraang ito ay lalong epektibo para sa paglalarawan ng mga viral community (virome) sa isang partikular na ecosystem [62, 63]. Hindi tulad ng bacteria, archaea, at eukaryotes, ang mga viral genome ay hindi naglalaman ng mga phylogenetically conserved genes tulad ng 16S sequences. Ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang mga likidong biopsy mula sa mga indicator species tulad ng mga tahong ay maaaring gamitin upang matukoy ang medyo malaking bilang ng mga fragment ng ccfDNA virus na kilala na nakakahawa sa mga host na karaniwang naninirahan sa mga coastal marine ecosystem. Kabilang dito ang mga virus na kilala na nakakahawa sa mga protozoa, arthropod, insekto, halaman, at bacterial virus (hal., bacteriophage). Natagpuan ang isang katulad na distribusyon nang suriin namin ang hemolymph ccfDNA virome ng mga blue mussel (M. platensis) na nakolekta sa parehong layer ng tahong sa Kerguelen (Table S2, Karagdagang Impormasyon). Ang shotgun sequencing ng ccfDNA ay tunay ngang isang bagong pamamaraan na nakakakuha ng momentum sa pag-aaral ng virome ng mga tao o iba pang uri [21, 37, 64]. Ang pamamaraang ito ay partikular na kapaki-pakinabang para sa pag-aaral ng mga double-stranded DNA virus, dahil walang iisang gene ang nakonserba sa lahat ng double-stranded DNA virus, na kumakatawan sa pinaka-magkakaiba at malawak na uri ng mga virus sa Baltimore [65]. Bagama't karamihan sa mga virus na ito ay nananatiling hindi nauuri at maaaring kabilang ang mga virus mula sa isang ganap na hindi kilalang bahagi ng mundo ng virus [66], natuklasan namin na ang mga virome at host range ng mga tahong na A. atra at M. platensis ay nasa pagitan ng dalawang uri. nang magkatulad (tingnan ang figure S3, karagdagang impormasyon). Hindi nakakagulat ang pagkakatulad na ito, dahil maaaring sumasalamin ito sa kakulangan ng selectivity sa pagsipsip ng DNA na nasa kapaligiran. Ang mga pag-aaral sa hinaharap gamit ang purified RNA ay kasalukuyang kinakailangan upang makilala ang RNA virome.
Sa aming pag-aaral, gumamit kami ng isang napakahigpit na pipeline na inangkop mula sa gawain nina Kowarski at mga kasamahan [37], na gumamit ng two-step deletion ng pooled reads at contigs bago at pagkatapos ng pag-assemble ng katutubong ccfDNA, na nagresulta sa mataas na proporsyon ng mga hindi na-map na reads. Samakatuwid, hindi namin maaaring isantabi na ang ilan sa mga hindi na-map na reads na ito ay maaaring mayroon pa ring sariling pinagmulan, pangunahin dahil wala kaming reference genome para sa species ng tahong na ito. Ginamit din namin ang pipeline na ito dahil nag-aalala kami tungkol sa mga chimera sa pagitan ng self at non-self reads at ang mga haba ng read na nabuo ng Illumina MiSeq PE75. Ang isa pang dahilan para sa karamihan ng mga hindi pa na-chart na reading ay ang karamihan sa mga marine microbes, lalo na sa mga liblib na lugar tulad ng Kerguelen, ay hindi pa na-annotate. Ginamit namin ang Illumina MiSeq PE75, sa pag-aakalang ang haba ng fragment ng ccfDNA ay katulad ng ccfDNA ng tao. Para sa mga pag-aaral sa hinaharap, dahil sa aming mga resulta na nagpapakita na ang hemolymph ccfDNA ay may mas mahabang reads kaysa sa mga tao at/o mammal, inirerekomenda namin ang paggamit ng isang sequencing platform na mas angkop para sa mas mahabang fragment ng ccfDNA. Mas mapapadali ng ganitong kasanayan ang pagtukoy ng mas maraming indikasyon para sa mas malalim na pagsusuri. Ang pagkuha ng kasalukuyang hindi magagamit na kumpletong A. atra nuclear genome sequence ay lubos ding magpapadali sa pagkilala ng ccfDNA mula sa sarili at di-sariling mga pinagmumulan. Dahil nakatuon ang aming pananaliksik sa posibilidad ng paglalapat ng konsepto ng liquid biopsy sa mga tahong, umaasa kami na habang ginagamit ang konseptong ito sa mga pananaliksik sa hinaharap, magkakaroon ng mga bagong kagamitan at pipeline upang mapataas ang potensyal ng pamamaraang ito upang pag-aralan ang microbial diversity ng mga tahong sa marine ecosystem.
Bilang isang hindi nagsasalakay na klinikal na biomarker, ang mataas na antas ng ccfDNA sa plasma ng tao ay nauugnay sa iba't ibang sakit, pinsala sa tisyu, at mga kondisyon ng stress [67,68,69]. Ang pagtaas na ito ay nauugnay sa paglabas ng mga fragment ng DNA na nagmula sa sarili nitong pinagmulan pagkatapos ng pinsala sa tisyu. Tinugunan namin ang isyung ito gamit ang talamak na stress sa init, kung saan ang mga tahong ay panandaliang nalantad sa temperaturang 30 °C. Isinagawa namin ang pagsusuring ito sa tatlong magkakaibang uri ng tahong sa tatlong independiyenteng eksperimento. Gayunpaman, wala kaming nakitang anumang pagbabago sa mga antas ng ccfDNA pagkatapos ng talamak na stress sa init (tingnan ang Figure S5, karagdagang impormasyon). Ang pagtuklas na ito ay maaaring magpaliwanag, kahit papaano, sa katotohanan na ang mga tahong ay may semi-open circulatory system at nag-iipon ng malaking halaga ng dayuhang DNA dahil sa kanilang mataas na aktibidad sa pagsala. Sa kabilang banda, ang mga tahong, tulad ng maraming invertebrate, ay maaaring mas lumalaban sa pinsala sa tisyu na dulot ng stress, sa gayon ay nililimitahan ang paglabas ng ccfDNA sa kanilang hemolymph [70, 71].
Sa kasalukuyan, ang pagsusuri ng DNA ng biodiversity sa mga aquatic ecosystem ay pangunahing nakatuon sa environmental DNA (eDNA) metabarcoding. Gayunpaman, ang pamamaraang ito ay karaniwang limitado sa pagsusuri ng biodiversity kapag ginagamit ang mga primer. Ang paggamit ng shotgun sequencing ay nakakaiwas sa mga limitasyon ng PCR at sa biased na pagpili ng mga primer sets. Kaya, sa isang diwa, ang aming pamamaraan ay mas malapit sa kamakailang ginamit na high-throughput eDNA Shotgun sequencing method, na kayang direktang i-sequence ang pira-pirasong DNA at suriin ang halos lahat ng organismo [72, 73]. Gayunpaman, mayroong ilang mga pangunahing isyu na nagpapaiba sa LB mula sa mga karaniwang pamamaraan ng eDNA. Siyempre, ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng eDNA at LB ay ang paggamit ng mga natural na filter host. Ang paggamit ng mga marine species tulad ng mga sponge at bivalve (Dresseina spp.) bilang isang natural na filter para sa pag-aaral ng eDNA ay naiulat na [74, 75]. Gayunpaman, ang pag-aaral ni Dreissena ay gumamit ng mga tissue biopsy kung saan kinuha ang DNA. Ang pagsusuri ng ccfDNA mula sa LB ay hindi nangangailangan ng tissue biopsy, espesyalisado at kung minsan ay mamahaling kagamitan at logistik na nauugnay sa eDNA o tissue biopsy. Sa katunayan, kamakailan naming iniulat na ang ccfDNA mula sa LB ay maaaring iimbak at suriin gamit ang suporta ng FTA nang hindi pinapanatili ang isang cold chain, na isang malaking hamon para sa pananaliksik sa mga liblib na lugar [76]. Ang pagkuha ng ccfDNA mula sa mga likidong biopsy ay simple rin at nagbibigay ng mataas na kalidad na DNA para sa shotgun sequencing at PCR analysis. Ito ay isang malaking bentahe dahil sa ilan sa mga teknikal na limitasyon na nauugnay sa eDNA analysis [77]. Ang pagiging simple at mababang gastos ng paraan ng sampling ay partikular ding angkop para sa mga pangmatagalang programa sa pagsubaybay. Bilang karagdagan sa kanilang mataas na kakayahan sa pag-filter, ang isa pang kilalang katangian ng mga bivalve ay ang kemikal na mucopolysaccharide na komposisyon ng kanilang mucus, na nagtataguyod ng pagsipsip ng mga virus [78, 79]. Ginagawa nitong isang mainam na natural na filter ang mga bivalve para sa paglalarawan ng biodiversity at ang epekto ng pagbabago ng klima sa isang partikular na aquatic ecosystem. Bagama't ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na nagmula sa host ay maaaring makita bilang isang limitasyon ng pamamaraan kumpara sa eDNA, ang gastos na nauugnay sa pagkakaroon ng naturang katutubong ccfDNA kumpara sa eDNA ay sabay na mauunawaan para sa napakaraming impormasyong magagamit para sa mga pag-aaral sa kalusugan. offset host. Kabilang dito ang pagkakaroon ng mga viral sequence na isinama sa genome ng host host. Ito ay lalong mahalaga para sa mga tahong, dahil sa pagkakaroon ng mga horizontally transmitted leukemic retrovirus sa mga bivalve [80, 81]. Ang isa pang bentahe ng LB kaysa sa eDNA ay ang paggamit nito sa phagocytic activity ng mga circulating blood cell sa hemolymph, na siyang lumalamon sa mga microorganism (at sa kanilang mga genome). Ang phagocytosis ang pangunahing tungkulin ng mga blood cell sa mga bivalve [82]. Panghuli, sinasamantala ng pamamaraan ang mataas na kapasidad sa pag-filter ng mga tahong (average na 1.5 l/h ng tubig-dagat) at dalawang-araw na sirkulasyon, na nagpapataas ng paghahalo ng iba't ibang layer ng tubig-dagat, na nagpapahintulot sa pagkuha ng heterologous eDNA. [83, 84]. Kaya, ang pagsusuri ng mussel ccfDNA ay isang kawili-wiling paraan dahil sa mga epekto sa nutrisyon, ekonomiya, at kapaligiran ng mga tahong. Katulad ng pagsusuri ng LB na nakolekta mula sa mga tao, binubuksan din ng pamamaraang ito ang posibilidad ng pagsukat ng mga genetic at epigenetic na pagbabago sa host DNA bilang tugon sa mga exogenous na sangkap. Halimbawa, ang mga teknolohiya ng sequencing ng ikatlong henerasyon ay maaaring isaalang-alang upang magsagawa ng pagsusuri ng methylation sa buong genome sa katutubong ccfDNA gamit ang nanopore sequencing. Ang prosesong ito ay dapat mapadali ng katotohanan na ang haba ng mga fragment ng tahong ccfDNA ay mainam na tugma sa mga long-read sequencing platform na nagpapahintulot sa pagsusuri ng methylation ng DNA sa buong genome mula sa isang solong sequencing run nang hindi nangangailangan ng mga chemical transformation.85,86] Ito ay isang kawili-wiling posibilidad, dahil ipinakita na ang mga pattern ng methylation ng DNA ay sumasalamin sa isang tugon sa stress sa kapaligiran at nagpapatuloy sa maraming henerasyon. Samakatuwid, maaari itong magbigay ng mahalagang pananaw sa mga pinagbabatayan na mekanismo na namamahala sa tugon pagkatapos ng pagkakalantad sa pagbabago ng klima o mga pollutant [87]. Gayunpaman, ang paggamit ng LB ay hindi walang mga limitasyon. Hindi na kailangang sabihin, nangangailangan ito ng pagkakaroon ng mga indicator species sa ecosystem. Gaya ng nabanggit sa itaas, ang paggamit ng LB upang masuri ang biodiversity ng isang partikular na ecosystem ay nangangailangan din ng isang mahigpit na pipeline ng bioinformatics na isinasaalang-alang ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA mula sa pinagmulan. Ang isa pang pangunahing problema ay ang pagkakaroon ng mga reference genome para sa mga marine species. Inaasahan na ang mga inisyatibo tulad ng Marine Mammal Genomes Project at ang kamakailang itinatag na proyektong Fish10k [88] ay magpapadali sa ganitong pagsusuri sa hinaharap. Ang aplikasyon ng konsepto ng LB sa mga organismong kumakain ng filter sa dagat ay tugma rin sa mga pinakabagong pagsulong sa teknolohiya ng sequencing, na ginagawa itong angkop para sa pagbuo ng mga multi-ohm biomarker upang magbigay ng mahahalagang impormasyon tungkol sa kalusugan ng mga tirahan sa dagat bilang tugon sa stress sa kapaligiran.
Ang datos ng genome sequencing ay idineposito sa NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sa ilalim ng Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Epekto ng pagbabago ng klima sa buhay dagat at mga ekosistema. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Isaalang-alang ang pinagsamang epekto ng pagbabago ng klima at iba pang lokal na stressor sa kapaligirang dagat. pangkalahatang kapaligirang siyentipiko. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Agham ng una ng Marso. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ang nabawasang pagtitiis sa init sa ilalim ng paulit-ulit na mga kondisyon ng stress sa init ay nagpapaliwanag sa mataas na pagkamatay ng mga blue mussel sa tag-init. Ulat pang-agham 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Mga kamakailang pagbabago sa dalas, sanhi at lawak ng pagkamatay ng mga hayop. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Maaaring nagdulot ng mass mortality ng Pinna nobilis ang maramihang mga pathogen na hindi partikular sa mga species. Buhay. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensyal na epekto ng pagbabago ng klima sa mga sakit na zoonotic sa Arctic. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mga tahong na asul (Mytilus edulis spp.) bilang mga organismong nagbibigay ng senyales sa pagsubaybay sa polusyon sa baybayin: isang pagsusuri. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Pagsasama ng likidong biopsy sa paggamot ng kanser. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Pagkahinog ng likidong biopsy: Pinapayagan ang DNA ng tumor na umikot. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Mga nucleic acid sa plasma ng tao. Katitikan ng pagpupulong ng mga subsidiary ng Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Isang bagong papel para sa cell-free DNA bilang isang molecular marker para sa paggamot sa kanser. Pagkuwantipika ng biomolar analysis. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Pumasok na sa klinika ang likidong biopsy – mga isyu sa implementasyon at mga hamon sa hinaharap. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW at iba pa. Ang DNA ng sanggol ay nasa plasma at serum ng ina. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Pag-aaral sa takbo ng pagbubuntis at mga komplikasyon nito gamit ang umiikot na extracellular RNA sa dugo ng mga kababaihan habang nagbubuntis. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Liquid biopsy: ginagamit ang donor cell-free DNA upang matukoy ang mga allogeneic lesion sa isang kidney graft. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Mga Inobasyon sa mga diagnostic sa panahon ng pagbubuntis: maternal plasma genome sequencing. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Mabilis na pagtuklas ng pathogen gamit ang susunod na henerasyon ng metagenomic sequencing ng mga nahawaang likido sa katawan. Nat Medicine. 2021;27:115-24.