Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing wis dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Biopsi cair (LB) minangka konsep sing saya tambah populer ing bidang biomedis. Konsep iki utamane adhedhasar deteksi fragmen DNA ekstraseluler sing sirkulasi (ccfDNA), sing utamane dirilis minangka fragmen cilik sawise pati sel ing macem-macem jaringan. Sebagian cilik saka fragmen kasebut asale saka jaringan utawa organisme asing (manca). Ing karya saiki, kita wis ngetrapake konsep iki kanggo kerang, spesies penjaga sing dikenal amarga kapasitas filtrasi banyu segara sing dhuwur. Kita nggunakake kemampuan kerang kanggo tumindak minangka filter alami kanggo nangkep fragmen DNA lingkungan saka macem-macem sumber kanggo menehi informasi babagan keanekaragaman hayati ekosistem pesisir laut. Asil kita nuduhake yen hemolimf kerang ngemot fragmen DNA sing ukurane beda-beda, saka 1 nganti 5 kb. Sekuensing senapan nuduhake yen akeh fragmen DNA asale saka mikroba asing. Antarane, kita nemokake fragmen DNA saka bakteri, archaea, lan virus, kalebu virus sing dikenal nginfeksi macem-macem host sing umum ditemokake ing ekosistem laut pesisir. Kesimpulane, panliten kita nuduhake yen konsep LB sing diterapake ing kerang minangka sumber kawruh sing sugih nanging durung dieksplorasi babagan keragaman mikroba ing ekosistem pesisir laut.
Dampak owah-owahan iklim (CC) marang keanekaragaman hayati ekosistem laut minangka bidang riset sing saya tambah akeh. Pemanasan global ora mung nyebabake tekanan fisiologis sing penting, nanging uga ndorong watesan evolusi stabilitas termal organisme laut, sing mengaruhi habitat sawetara spesies, sing nyebabake dheweke nggoleki kahanan sing luwih nguntungake [1, 2]. Saliyane mengaruhi keanekaragaman hayati metazoa, CC ngganggu keseimbangan interaksi inang-mikroba sing alus. Disbakteriosis mikroba iki dadi ancaman serius kanggo ekosistem laut amarga ndadekake organisme laut luwih rentan marang patogen infeksi [3, 4]. Dipercaya manawa SS nduweni peran penting ing kematian massal, sing dadi masalah serius kanggo manajemen ekosistem laut global [5, 6]. Iki minangka masalah penting amarga dampak ekonomi, ekologis, lan nutrisi saka akeh spesies laut. Iki utamane bener kanggo bivalvia sing urip ing wilayah kutub, ing ngendi efek CK luwih cepet lan parah [6, 7]. Nyatane, bivalvia kayata Mytilus spp. digunakake sacara wiyar kanggo ngawasi efek CC ing ekosistem laut. Ora nggumunake, akeh biomarker sing dikembangake kanggo ngawasi kesehatane, asring nggunakake pendekatan rong tingkat sing nglibatake biomarker fungsional adhedhasar aktivitas enzimatik utawa fungsi seluler kayata kelangsungan urip sel lan aktivitas fagositik [8]. Cara kasebut uga kalebu pangukuran konsentrasi indikator tekanan tartamtu sing nglumpuk ing jaringan alus sawise panyerepan banyu segara sing akeh. Nanging, kapasitas filtrasi sing dhuwur lan sistem sirkulasi semi-terbuka saka bivalvia menehi kesempatan kanggo ngembangake biomarker hemolimf anyar nggunakake konsep biopsi cair (LB), pendekatan sing prasaja lan minimal invasif kanggo manajemen pasien. sampel getih [9, 10]. Sanajan sawetara jinis molekul sirkulasi bisa ditemokake ing LB manungsa, konsep iki utamane adhedhasar analisis sekuensing DNA saka fragmen DNA ekstraseluler sing sirkulasi (ccfDNA) ing plasma. Nyatane, anané DNA sing sirkulasi ing plasma manungsa wis dikenal wiwit pertengahan abad kaping-20 [11], nanging mung ing taun-taun pungkasan munculé metode sekuensing throughput dhuwur wis nyebabake diagnosis klinis adhedhasar ccfDNA. Anane fragmen DNA sing sirkulasi iki sebagian disebabake dening pelepasan pasif DNA genomik (nuklir lan mitokondria) sawise pati sel. Ing individu sing sehat, konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng/mL) nanging bisa ditambah 5-10 kali lipat ing pasien sing nandhang macem-macem patologi utawa kena stres, sing nyebabake kerusakan jaringan. Ing individu sing sehat, konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng/mL) nanging bisa ditambah 5-10 kali lipat ing pasien sing nandhang macem-macem patologi utawa kena stres, sing nyebabake kerusakan jaringan. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухлиной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Ing wong sing sehat, konsentrasi cccDNA biasane kurang (<10 ng/mL), nanging bisa mundhak 5-10 kali lipat ing pasien kanthi macem-macem patologi utawa ing kahanan stres sing nyebabake kerusakan jaringan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承受可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у плица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Konsentrasi ccfDNA biasane kurang (<10 ng/ml) ing individu sing sehat, nanging bisa ditambah 5-10 kali lipat ing pasien kanthi macem-macem patologi utawa stres, sing nyebabake kerusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA beda-beda banget, nanging biasane antara 150 nganti 200 bp. [12]. Analisis ccfDNA sing asale dhewe, yaiku ccfDNA saka sel inang normal utawa sing diowahi, bisa digunakake kanggo ndeteksi owah-owahan genetik lan epigenetik sing ana ing genom nuklir lan/utawa mitokondria, saengga mbantu dokter milih terapi sing ditargetake molekuler tartamtu [13]. Nanging, ccfDNA bisa dipikolehi saka sumber manca kayata ccfDNA saka sel janin sajrone meteng utawa saka organ sing ditransplantasi [14,15,16,17]. ccfDNA uga minangka sumber informasi penting kanggo ndeteksi anané asam nukleat saka agen infeksi (asing), sing ngidini deteksi non-invasif infeksi sing nyebar sing ora diidentifikasi dening kultur getih, ngindhari biopsi invasif jaringan sing kena infeksi [18]. Panliten anyar pancen nuduhake yen getih manungsa ngemot sumber informasi sing sugih sing bisa digunakake kanggo ngenali patogen virus lan bakteri, lan udakara 1% saka ccfDNA sing ditemokake ing plasma manungsa asale saka manca [19]. Panliten-panliten iki nduduhake manawa keanekaragaman hayati mikrobioma sing ana ing sirkulasi organisme bisa ditaksir nggunakake analisis ccfDNA. Nanging, nganti saiki, konsep iki digunakake mung ing manungsa lan, ing tingkat sing luwih sithik, ing vertebrata liyane [20, 21].
Ing makalah iki, kita nggunakake potensial LB kanggo nganalisis ccfDNA saka Aulacomya atra, spesies kidul sing umum ditemokake ing Kapuloan Kerguelen subantartika, sawijining klompok pulo ing ndhuwur plato gedhe sing kawangun 35 yuta taun kepungkur. letusan gunung berapi. Nggunakake sistem eksperimen in vitro, kita nemokake manawa fragmen DNA ing banyu segara cepet dijupuk dening kerang lan mlebu ing kompartemen hemolimf. Sekuensing senapan wis nuduhake manawa hemolimf ccfDNA kerang ngemot fragmen DNA dhewe lan ora asale dhewe, kalebu bakteri simbiotik lan fragmen DNA saka bioma khas ekosistem pesisir laut vulkanik sing adhem. Hemolimf ccfDNA uga ngemot urutan virus sing asale saka virus kanthi kisaran inang sing beda. Kita uga nemokake fragmen DNA saka kewan multiseluler kayata iwak balung, anemon laut, ganggang lan serangga. Kesimpulane, panliten kita nuduhake manawa konsep LB bisa diterapake kanthi sukses kanggo invertebrata laut kanggo ngasilake repertoar genomik sing sugih ing ekosistem laut.
Iwak diwasa (dawane 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) lan Aulacomya atra (A. atra) dikumpulake saka pesisir watu intertidal Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Kepulauan Kerguelen ing Desember 2018. Kerang biru diwasa liyane (Mytilus spp.) dipikolehi saka pemasok komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) lan dilebokake ing tangki aerasi suhu sing dikontrol (4°C) sing ngemot 10–20 L banyu asin buatan 32‰. (uyah laut buatan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Kanggo saben eksperimen, dawa lan bobot cangkang individu diukur.
Protokol akses terbuka gratis kanggo program iki kasedhiya online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Cekakipun, hemolimf LB dipunklumpukake saking otot abduktor kados ingkang dipunjlentrehaken [22]. Hemolimf dipunjernihake kanthi sentrifugasi ing 1200 × g sajrone 3 menit, supernatan dibekukan (-20 °C) ngantos dipunginakaken. Kangge isolasi lan pemurnian cfDNA, sampel (1,5-2,0 ml) dipuncairaken lan dipunproses ngginakaken kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) miturut pandhuan pabrikan. ccfDNA disimpen ing suhu -80 °C ngantos dipunanalisis langkung lanjut. Ing sawetara eksperimen, ccfDNA dipunisolasi lan dipunmurnèkaké ngginakaken Kit Investigator DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA ingkang dipunmurnèkaké dipunkuantifikasi ngginakaken uji PicoGreen standar. Distribusi fragmen saka ccfDNA sing diisolasi dianalisis nganggo elektroforesis kapiler nggunakake bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) nggunakake Kit DNA Sensitivity Tinggi. Uji coba ditindakake nggunakake 1 µl sampel ccfDNA miturut pandhuan pabrikan.
Kanggo ngurutake fragmen hemolimf ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) nyiyapake pustaka shotgun nggunakake kit Illumina DNA Mix saka kit Illumina MiSeq PE75. Adaptor standar (BioO) digunakake. File data mentah kasedhiya saka Arsip Baca Urutan NCBI (SRR8924808 lan SRR8924809). Kualitas maca dhasar ditaksir nggunakake FastQC [23]. Trimmomatic [24] wis digunakake kanggo kliping adaptor lan maca kualitas sing kurang apik. Maca shotgun kanthi ujung sing dipasangake digabungake FLASH dadi maca tunggal sing luwih dawa kanthi tumpang tindih minimal 20 bp kanggo nyegah ketidakcocokan [25]. Maca sing digabung dianotasi nganggo BLASTN nggunakake database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 lan homologi 90%), lan masking urutan kompleksitas rendah ditindakake nggunakake DUST [26]. Maca sing digabung dianotasi nganggo BLASTN nggunakake database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 lan homologi 90%), lan masking urutan kompleksitas rendah ditindakake nggunakake DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчозвналючих < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Maca gabungan dianotasi nganggo BLASTN nggunakake database taksonomi bivalvia NCBI (nilai e < 1e-3 lan homologi 90%), lan masking urutan kompleksitas rendah ditindakake nggunakake DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，用数，用年进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 2进行 复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустволскмча (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с испольмьзоUST]. Maca gabungan dianotasi nganggo BLASTN nggunakake basis data taksonomi bivalvia NCBI (nilai e <1e-3 lan homologi 90%), lan masking urutan kompleksitas rendah ditindakake nggunakake DUST [26].Maca dipérang dadi rong klompok: sing ana gandhèngané karo urutan bivalvia (ing kéné diarani maca dhéwé) lan sing ora ana gandhèngané (ora maca dhéwé). Rong klompok dikumpulaké kanthi kapisah nggunakaké MEGAHIT kanggo ngasilaké contigs [27]. Sauntara kuwi, distribusi taksonomi maca mikrobioma alien diklasifikasikaké nggunakaké Kraken2 [28] lan diwakili sacara grafis déning diagram bunder Krona ing Galaxy [29, 30]. Kmer optimal ditemtokake dadi kmer-59 saka eksperimen awal kita. Kontinjensi mandiri banjur diidentifikasi kanthi cara alignment karo BLASTN (database NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 lan homologi 60%) kanggo anotasi pungkasan. Kontinjensi mandiri banjur diidentifikasi kanthi cara alignment karo BLASTN (database NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 lan homologi 60%) kanggo anotasi pungkasan. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1-0 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Kontinjensi mandiri banjur diidentifikasi kanthi cocog karo BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 lan homologi 60%) kanggo anotasi pungkasan.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал да NCBIн двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Kontigen-mandiri banjur diidentifikasi kanggo anotasi pungkasan kanthi cocog karo BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 lan homologi 60%). Ing wektu sing padha, contig klompok nonself dianotasi nganggo BLASTN (database nt NCBI, nilai e < 1e−10 lan homologi 60%). Ing wektu sing padha, contig klompok nonself dianotasi nganggo BLASTN (database nt NCBI, nilai e < 1e−10 lan homologi 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 % Bebarengan karo iku, kontig klompok manca dianotasi nganggo BLASTN (database NT NCBI, nilai e <1e-10 lan homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данNCных nt nt 1 гомология 60%). Ing wektu sing padha, contig klompok non-mandiri dianotasi nganggo BLASTN (database nt NCBI, nilai e <1e-10 lan homologi 60%). BLASTX uga ditindakake ing kontinjensi nonself nggunakake basis data NCBI protein nr lan RefSeq (nilai e < 1e−10 lan homologi 60%). BLASTX uga ditindakake ing kontinjensi nonself nggunakake basis data NCBI protein nr lan RefSeq (nilai e < 1e−10 lan homologi 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значологие использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение о 6%-10 e <1e%) BLASTX uga ditindakake ing non-self contigs nggunakake database protein nr lan RefSeq NCBI (nilai e < 1e-10 lan homologi 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) BLASTX uga ditindakake ing non-self-contigs nggunakake database protein nr lan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 lan homologi 60%).Kumpulan BLASTN lan BLASTX saka non-self-contigs makili contig pungkasan (deleng file Tambahan).
Primer sing digunakake kanggo PCR kadhaptar ing Tabel S1. Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakake kanggo ngamplifikasi gen target ccfDNA. Kondisi reaksi ing ngisor iki digunakake: denaturasi ing 95°C suwene 3 menit, 95°C suwene 1 menit, nyetel suhu annealing suwene 1 menit, elongasi ing 72°C suwene 1 menit, 35 siklus, lan pungkasane 72°C sajrone 10 menit. . Produk PCR dipisahake kanthi elektroforesis ing gel agarose (1,5%) sing ngemot SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) ing 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi ing 500 ml banyu segara sing dioksigenasi (32 PSU) sajrone 24 jam ing suhu 4°C. DNA plasmid sing ngemot sisipan sing ngode urutan cDNA galectin-7 manungsa (nomer aksesi NCBI L07769) ditambahake ing vial kanthi konsentrasi pungkasan 190 μg/μl. Kerang sing diinkubasi ing kahanan sing padha tanpa tambahan DNA minangka kontrol. Tangki kontrol katelu ngemot DNA tanpa kerang. Kanggo ngawasi kualitas DNA ing banyu segara, sampel banyu segara (20 μl; telung pengulangan) dijupuk saka saben tangki ing wektu sing dituduhake. Kanggo keterlacakan DNA plasmid, kerang LB dipanen ing wektu sing dituduhake lan dianalisis kanthi qPCR lan ddPCR. Amarga kandungan uyah banyu segara sing dhuwur, alikuot diencerke ing banyu kualitas PCR (1:10) sadurunge kabeh uji PCR.
PCR tetesan digital (ddPCR) ditindakake nggunakake protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Gunakake profil suhu kanggo nemtokake suhu optimal (Tabel S1). Tetesan digawe nggunakake generator tetesan QX200 (BioRad). ddPCR ditindakake kaya ing ngisor iki: 95°C suwene 5 menit, 50 siklus 95°C suwene 30 detik lan suhu annealing sing diwenehake suwene 1 menit lan 72°C suwene 30 detik, 4°C suwene 5 menit lan 90°C sajrone 5 menit. Jumlah tetesan lan reaksi positif (jumlah salinan/µl) diukur nggunakake pembaca tetesan QX200 (BioRad). Sampel kanthi kurang saka 10.000 tetesan ditolak. Kontrol pola ora ditindakake saben ddPCR dilakokake.
qPCR ditindakake nggunakake Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) lan primer khusus LGALS7. Kabeh PCR kuantitatif ditindakake ing 20 µl nggunakake QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR diwiwiti kanthi inkubasi 15 menit ing 95°C banjur 40 siklus ing 95°C suwene 10 detik lan ing 60°C suwene 60 detik kanthi siji pangumpulan data. Kurva leleh digawe nggunakake pangukuran berturut-turut ing 95°C suwene 5 detik, 65°C suwene 60 detik, lan 97°C ing pungkasan qPCR. Saben qPCR ditindakake kanthi rangkap telu, kajaba sampel kontrol.
Amarga kerang dikenal amarga tingkat filtrasi sing dhuwur, mula dhisik kita nyelidiki apa dheweke bisa nyaring lan nahan fragmen DNA sing ana ing banyu segara. Kita uga kepengin weruh apa fragmen kasebut nglumpuk ing sistem limfatik semi-terbuka. Kita ngrampungake masalah iki kanthi eksperimen kanthi nglacak nasib fragmen DNA sing larut sing ditambahake ing tangki kerang biru. Kanggo nggampangake pelacakan fragmen DNA, kita nggunakake DNA plasmid asing (dudu awake dhewe) sing ngemot gen galectin-7 manungsa. ddPCR nglacak fragmen DNA plasmid ing banyu segara lan kerang. Asil kita nuduhake yen jumlah fragmen DNA ing banyu segara tetep relatif konstan sajrone wektu (nganti 7 dina) tanpa kerang, mula nalika ana kerang, tingkat iki meh ilang sajrone 8 jam (Gambar 1a, b). Fragmen DNA eksogen gampang dideteksi sajrone 15 menit ing cairan intravalvular lan hemolimf (Gambar 1c). Fragmen kasebut isih bisa dideteksi nganti 4 jam sawise kena. Aktivitas penyaringan iki gegayutan karo fragmen DNA bisa dibandhingake karo aktivitas penyaringan bakteri lan ganggang [31]. Asil iki nuduhake yen kerang bisa nyaring lan nglumpukake DNA asing ing kompartemen cairane.
Konsentrasi relatif DNA plasmid ing banyu segara nalika ana (A) utawa ora ana (B) kerang, diukur nganggo ddPCR. Ing A, asil kasebut ditulis minangka persentase, kanthi wates kothak sing makili persentil kaping 75 lan kaping 25. Kurva logaritmik sing cocog dituduhake kanthi warna abang, lan area sing diarsir abu-abu makili interval kapercayan 95%. Ing B, garis abang makili rata-rata lan garis biru makili interval kapercayan 95% kanggo konsentrasi kasebut. C Akumulasi DNA plasmid ing hemolimf lan cairan katup kerang ing wektu sing beda sawise tambahan DNA plasmid. Asil ditampilake minangka salinan absolut sing dideteksi/mL (±SE).
Sabanjure, kita nyelidiki asal-usul ccfDNA ing kerang sing dikumpulake saka amben kerang ing Kepulauan Kerguelen, klompok pulo sing adoh kanthi pengaruh antropogenik sing winates. Kanggo tujuan iki, cccDNA saka hemolimf kerang diisolasi lan dimurnèkaké kanthi cara sing umum digunakake kanggo nyucèkaké cccDNA manungsa [32, 33]. Kita nemokake manawa konsentrasi ccfDNA hemolimf rata-rata ing kerang ana ing kisaran hemolimf mikrogram saben ml sing endhek (waca Tabel S2, Informasi Tambahan). Kisaran konsentrasi iki luwih gedhe tinimbang ing wong sing sehat (nanogram saben mililiter endhek), nanging ing kasus sing arang banget, ing pasien kanker, tingkat ccfDNA bisa tekan sawetara mikrogram saben mililiter [34, 35]. Analisis distribusi ukuran hemolimf ccfDNA nuduhake manawa fragmen kasebut beda-beda banget ukurane, wiwit saka 1000 bp nganti 1000 bp. nganti 5000 bp (Gambar 2). Asil sing padha uga dipikolehi nggunakake QIAamp Investigator Kit berbasis silika, metode sing umum digunakake ing ilmu forensik kanggo ngisolasi lan nyuceni DNA genomik kanthi cepet saka sampel DNA konsentrasi rendah, kalebu ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA representatif saka hemolimf kerang. Diekstrak nganggo Kit Plasma NucleoSnap (ndhuwur) lan Kit Investigator DNA QIAamp. Plot Biola B nuduhake distribusi konsentrasi hemolimf ccfDNA (±SE) ing kerang. Garis ireng lan abang makili median lan kuartil pertama lan katelu.
Kira-kira 1% ccfDNA ing manungsa lan primata nduweni sumber manca [21, 37]. Amarga sistem sirkulasi semi-terbuka saka bivalvia, banyu segara sing sugih mikroba, lan distribusi ukuran ccfDNA kerang, kita duwe hipotesis yen hemolimf ccfDNA kerang bisa uga ngemot kumpulan DNA mikroba sing sugih lan maneka warna. Kanggo nguji hipotesis iki, kita ngurut hemolimf ccfDNA saka sampel Aulacomya atra sing diklumpukake saka Kepulauan Kerguelen, ngasilake luwih saka 10 yuta bacaan, 97,6% sing lulus kontrol kualitas. Bacaan kasebut banjur diklasifikasikake miturut sumber dhewe lan non-dhewe nggunakake basis data bivalvia BLASTN lan NCBI (Gambar S1, Informasi Tambahan).
Ing manungsa, DNA nuklir lan mitokondria bisa dibebasake menyang aliran getih [38]. Nanging, ing panliten iki, ora bisa njlentrehake kanthi rinci DNA genomik nuklir kerang, amarga genom A. atra durung diurutake utawa diterangake. Nanging, kita bisa ngenali sawetara fragmen ccfDNA saka asal kita dhewe nggunakake perpustakaan bivalvia (Gambar S2, Informasi Tambahan). Kita uga ngonfirmasi anane fragmen DNA saka asal kita dhewe kanthi amplifikasi PCR sing diarahake saka gen A. atra sing diurutake (Gambar 3). Kajaba iku, amarga genom mitokondria A. atra kasedhiya ing basis data umum, wong bisa nemokake bukti kanggo anane fragmen ccfDNA mitokondria ing hemolimf A. atra. Anane fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi dening amplifikasi PCR (Gambar 3).
Maneka warna gen mitokondria ana ing hemolimf A. atra (titik abang - nomer stok: SRX5705969) lan M. platensis (titik biru - nomer stok: SRX5705968) sing diamplifikasi nganggo PCR. Gambar diadaptasi saka Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolimf saka A. atra Disimpen ing kertas FTA. Gunakake pelubang 3 mm kanggo ditambahake langsung menyang tabung PCR sing ngemot campuran PCR.
Amarga akeh banget kandungan mikroba ing banyu segara, wiwitane kita fokus ing karakterisasi urutan DNA mikroba ing hemolimf. Kanggo nindakake iki, kita nggunakake rong strategi sing beda. Strategi pertama nggunakake Kraken2, program klasifikasi urutan adhedhasar algoritma sing bisa ngenali urutan mikroba kanthi akurasi sing bisa dibandhingake karo BLAST lan alat liyane [28]. Luwih saka 6719 bacaan ditemtokake asale saka bakteri, dene 124 lan 64 saka archaea lan virus (Gambar 4). Fragmen DNA bakteri sing paling akeh yaiku Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), lan Bacteroidetes (17%) (Gambar 4a). Distribusi iki konsisten karo panliten sadurunge babagan mikrobioma kerang biru laut [39, 40]. Gammaproteobacteria minangka kelas utama Proteobacteria (44%), kalebu akeh Vibrionales (Gambar 4b). Metode ddPCR ngonfirmasi anané fragmen DNA Vibrio ing ccfDNA saka hemolimf A. atra (Gambar 4c) [41]. Kanggo entuk informasi luwih lengkap babagan asal bakteri saka ccfDNA, pendekatan tambahan ditindakake (Gambar S2, Informasi Tambahan). Ing kasus iki, bacaan sing tumpang tindih dirakit minangka bacaan ujung-pasangan lan diklasifikasikake minangka asal-usul dhewe (bivalvia) utawa ora asal-usul dhewe nggunakake BLASTN lan nilai e 1e−3 lan cutoff kanthi homologi >90%. Ing kasus iki, bacaan sing tumpang tindih dirakit minangka bacaan ujung-pasangan lan diklasifikasikake minangka asal-usul dhewe (bivalvia) utawa ora asal-usul dhewe nggunakake BLASTN lan nilai e 1e−3 lan cutoff kanthi homologi >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы какдрусныество моллюски) utawa чужие по происхождению с использованием BLASTN lan значения e 1e-3 lan отсечения с гомологией> 90%. Ing kasus iki, bacaan sing tumpang tindih dikumpulake minangka bacaan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka asli (bivalvia) utawa non-asli nggunakake BLASTN lan nilai e 1e-3 lan cutoff kanthi homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 和 和 和 和 3 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身……….. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственный моллюски) utawa несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Ing kasus iki, bacaan sing tumpang tindih dikumpulake minangka bacaan sing dipasangake lan diklasifikasikake minangka dhewe (bivalvia) utawa non-asli nggunakake nilai e BLASTN lan 1e-3 lan ambang homologi >90%.Amarga genom A. atra durung diurutake, kita nggunakake strategi perakitan de novo saka assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Total 147.188 contig wis diidentifikasi minangka dependent (bivalvia) asal. Contig iki banjur di-explode nganggo e-values ​​​​1e-10 nggunakake BLASTN lan BLASTX. Strategi iki ngidini kita ngenali 482 fragmen non-bivalvia sing ana ing A. atra ccfDNA. Luwih saka setengah (57%) saka fragmen DNA iki dipikolehi saka bakteri, utamane saka simbion insang, kalebu simbion sulfotrofik, lan saka simbion insang Solemya velum (Gambar 5).
Kelimpahan relatif ing tingkat tipe. B Keragaman mikroba saka rong filum utama (Firmicutes lan Proteobacteria). Amplifikasi representatif ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmen gen 16S rRNA (biru) ing telung hemolimf atra.
Total 482 contig sing dikumpulake dianalisis. Profil umum distribusi taksonomi anotasi contig metagenomik (prokariota lan eukariota). B Distribusi rinci fragmen DNA bakteri sing diidentifikasi dening BLASTN lan BLASTX.
Analisis Kraken2 uga nuduhake yen ccfDNA kerang ngandhut fragmen DNA archaeal, kalebu fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), lan Thaurmarcheota (11%) (Gambar 6a). Anane fragmen DNA sing asale saka Euryarchaeota lan Crenarchaeota, sing sadurunge ditemokake ing komunitas mikroba kerang California, ora bakal dadi kejutan [42]. Sanajan Euryarchaeota asring digandhengake karo kahanan ekstrem, saiki diakoni yen Euryarchaeota lan Crenarcheota kalebu prokariota sing paling umum ing lingkungan kriogenik laut [43, 44]. Anane mikroorganisme metanogenik ing kerang ora nggumunake, amarga laporan anyar babagan kebocoran metana sing ekstensif saka kebocoran ngisor ing Dataran Tinggi Kerguelen [45] lan kemungkinan produksi metana mikroba sing diamati ing pesisir Kepulauan Kerguelen [46].
Kawigatosan kita banjur pindhah menyang bacaan saka virus DNA. Sakwruh kawruh kita, iki minangka panliten off-target pisanan babagan isi virus kerang. Kaya sing dikarepake, kita nemokake fragmen DNA bakteriofag (Caudovirales) (Gambar 6b). Nanging, DNA virus sing paling umum asale saka filum nukleositovirus, uga dikenal minangka virus DNA gedhe sitoplasma nuklir (NCLDV), sing nduweni genom paling gedhe saka virus apa wae. Ing filum iki, umume urutan DNA kalebu kulawarga Mimimidoviridae (58%) lan Poxviridae (21%), sing inang alami kalebu vertebrata lan artropoda, dene sebagian cilik saka urutan DNA iki kalebu ganggang virologis sing dikenal. Nginfeksi ganggang eukariotik laut. Urutan kasebut uga dipikolehi saka virus Pandora, virus raksasa kanthi ukuran genom paling gedhe saka genera virus sing dikenal. Menarik, kisaran inang sing dikenal kena infeksi virus, kaya sing ditemtokake dening sekuensing hemolimfa ccfDNA, relatif gedhe (Gambar S3, Informasi Tambahan). Iki kalebu virus sing nginfeksi serangga kayata Baculoviridae lan Iridoviridae, uga virus sing nginfeksi amuba, ganggang, lan vertebrata. Kita uga nemokake urutan sing cocog karo genom Pithovirus sibericum. Pitovirus (uga dikenal minangka "virus zombie") pisanan diisolasi saka permafrost umur 30.000 taun ing Siberia [47]. Dadi, asil kita konsisten karo laporan sadurunge sing nuduhake yen ora kabeh spesies modern saka virus iki wis punah [48] lan virus iki bisa uga ana ing ekosistem laut subarctic sing adoh.
Pungkasan, kita nguji kanggo ndeleng apa kita bisa nemokake fragmen DNA saka kewan multiseluler liyane. Total 482 contig asing diidentifikasi dening BLASTN lan BLASTX nganggo perpustakaan nt, nr lan RefSeq (genomik lan protein). Asil kita nuduhake yen ing antarane fragmen asing ccfDNA kewan multiseluler, DNA balung balung dominan (Gambar 5). Fragmen DNA saka serangga lan spesies liyane uga wis ditemokake. Sebagian gedhe saka fragmen DNA durung diidentifikasi, bisa uga amarga kurang perwakilan saka akeh spesies laut ing basis data genomik dibandhingake karo spesies terestrial [49].
Ing makalah iki, kita ngetrapake konsep LB kanggo kerang, kanthi alesan manawa sekuensing tembakan hemolimf ccfDNA bisa menehi wawasan babagan komposisi ekosistem pesisir laut. Utamane, kita nemokake manawa 1) hemolimf kerang ngemot konsentrasi sing relatif dhuwur (tingkat mikrogram) saka fragmen DNA sing sirkulasi sing relatif gedhe (~1-5 kb); 2) fragmen DNA iki independen lan ora independen 3) Antarane sumber asing saka fragmen DNA iki, kita nemokake DNA bakteri, archaeal lan virus, uga DNA kewan multiseluler liyane; 4) Akumulasi fragmen ccfDNA asing iki ing hemolimf kedadeyan kanthi cepet lan nyumbang kanggo aktivitas penyaringan internal kerang. Kesimpulane, panliten kita nuduhake manawa konsep LB, sing nganti saiki wis diterapake utamane ing bidang biomedis, ngode sumber kawruh sing sugih nanging durung dieksplorasi sing bisa digunakake kanggo luwih ngerti interaksi antarane spesies sentinel lan lingkungane.
Saliyané primata, isolasi ccfDNA wis dilapurake ing mamalia, kalebu tikus, asu, kucing, lan jaran [50, 51, 52]. Nanging, miturut kawruh kita, panliten kita minangka sing pertama nglaporake deteksi lan sekuensing ccfDNA ing spesies laut kanthi sistem sirkulasi terbuka. Fitur anatomi lan kemampuan penyaringan kerang iki, paling ora sebagian, bisa nerangake karakteristik ukuran sing beda saka fragmen DNA sing sirkulasi dibandhingake karo spesies liyane. Ing manungsa, umume fragmen DNA sing sirkulasi ing getih minangka fragmen cilik kanthi ukuran wiwit 150 nganti 200 bp. kanthi puncak maksimum 167 bp [34, 53]. Sebagian cilik nanging signifikan saka fragmen DNA ukurane antara 300 lan 500 bp, lan udakara 5% luwih dawa tinimbang 900 bp. [54]. Alesan kanggo distribusi ukuran iki yaiku sumber utama ccfDNA ing plasma kedadeyan minangka akibat saka pati sel, amarga pati sel utawa amarga nekrosis sel hematopoietik sing sirkulasi ing individu sing sehat utawa amarga apoptosis sel tumor ing pasien kanker (dikenal minangka DNA tumor sing sirkulasi). , ctDNA). Distribusi ukuran hemolimf ccfDNA sing ditemokake ing kerang wiwit saka 1000 nganti 5000 bp, sing nuduhake yen kerang ccfDNA duwe asal sing beda. Iki minangka hipotesis logis, amarga kerang duwe sistem vaskular semi-terbuka lan urip ing lingkungan akuatik laut sing ngemot konsentrasi DNA genomik mikroba sing dhuwur. Nyatane, eksperimen laboratorium kita nggunakake DNA eksogen wis nuduhake yen kerang nglumpukake fragmen DNA ing banyu segara, paling ora sawise sawetara jam, dheweke bakal didegradasi sawise serapan seluler lan/utawa dirilis lan/utawa disimpen ing macem-macem organisasi. Amarga langkane sel (prokariotik lan eukariotik), panggunaan kompartemen intravalvular bakal nyuda jumlah ccfDNA saka sumber dhewe uga saka sumber manca. Ngelingi pentinge kekebalan bawaan bivalvia lan akehe fagosit sing sirkulasi, kita luwih lanjut nggawe hipotesis manawa ccfDNA asing uga sugih ing fagosit sing sirkulasi sing nglumpukake DNA asing nalika ngonsumsi mikroorganisme lan/utawa lebu seluler. Yen digabungake, asil kita nuduhake manawa hemolimf ccfDNA bivalvia minangka gudang informasi molekuler sing unik lan nguatake status minangka spesies penjaga.
Data kita nuduhake yen sekuensing lan analisis fragmen hemolimf ccfDNA sing asale saka bakteri bisa menehi informasi penting babagan flora bakteri inang lan bakteri sing ana ing ekosistem laut sekitar. Teknik sekuensing tembakan wis mbukak urutan bakteri komensal A. atra insang sing bakal ora kejawab yen metode identifikasi rRNA 16S konvensional digunakake, sebagian amarga bias perpustakaan referensi. Nyatane, panggunaan data LB sing diklumpukake saka M. platensis ing lapisan kerang sing padha ing Kerguelen nuduhake yen komposisi simbion bakteri sing ana gandhengane karo insang padha kanggo loro spesies kerang (Gambar S4, Informasi Tambahan). Kemiripan rong kerang sing beda sacara genetis iki bisa uga nggambarake komposisi komunitas bakteri ing endapan adhem, belerang, lan vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tingkat mikroorganisme pangurang belerang sing luwih dhuwur wis diterangake kanthi apik nalika panen kerang saka wilayah pesisir bioturbasi [59], kayata pesisir Port-au-France. Kamungkinan liyané yaiku flora kerang komensal bisa uga kena pengaruh transmisi horisontal [60, 61]. Riset luwih lanjut dibutuhake kanggo nemtokake korelasi antarane lingkungan laut, permukaan dasar laut, lan komposisi bakteri simbiotik ing kerang. Panliten kasebut saiki lagi ditindakake.
Dawane lan konsentrasi hemolimf ccfDNA, gampang dimurnèkaké, lan kualitas dhuwur kanggo ngidini sekuensing shotgun kanthi cepet minangka sawetara kaluwihan nggunakake ccfDNA kerang kanggo neliti keanekaragaman hayati ing ekosistem pesisir laut. Pendekatan iki efektif banget kanggo menehi ciri komunitas virus (viroma) ing ekosistem tartamtu [62, 63]. Ora kaya bakteri, archaea, lan eukariota, genom virus ora ngemot gen sing dilestarikan sacara filogenetik kayata urutan 16S. Asil kita nuduhake yen biopsi cair saka spesies indikator kayata kerang bisa digunakake kanggo ngenali jumlah fragmen virus ccfDNA sing relatif akeh sing dikenal nginfeksi inang sing biasane manggon ing ekosistem laut pesisir. Iki kalebu virus sing dikenal nginfeksi protozoa, artropoda, serangga, tanduran, lan virus bakteri (contone, bakteriofag). Distribusi sing padha ditemokake nalika kita mriksa viroma hemolimf ccfDNA kerang biru (M. platensis) sing diklumpukake ing lapisan kerang sing padha ing Kerguelen (Tabel S2, Informasi Tambahan). Sekuensing ccfDNA kanthi cara shotgun pancen minangka pendekatan anyar sing entuk momentum ing panliten virome manungsa utawa spesies liyane [21, 37, 64]. Pendekatan iki migunani banget kanggo nyinaoni virus DNA untai ganda, amarga ora ana gen tunggal sing dilestarikake ing antarane kabeh virus DNA untai ganda, sing makili kelas virus sing paling maneka warna lan jembar ing Baltimore [65]. Sanajan umume virus kasebut tetep ora diklasifikasikake lan bisa uga kalebu virus saka bagean sing ora dingerteni saka jagad virus [66], kita nemokake manawa virome lan rentang inang kerang A. atra lan M. platensis ana ing antarane rong spesies kasebut. kanthi cara sing padha (waca gambar S3, informasi tambahan). Kamiripan iki ora nggumunake, amarga bisa uga nuduhake kurang selektivitas ing panyerepan DNA sing ana ing lingkungan. Panliten ing mangsa ngarep nggunakake RNA sing dimurnèkaké saiki dibutuhake kanggo menehi ciri virome RNA.
Ing panliten kita, kita nggunakake pipeline sing ketat banget sing diadaptasi saka karya Kowarski lan kolega [37], sing nggunakake penghapusan rong langkah saka bacaan lan contig sing dikumpulake sadurunge lan sawise perakitan ccfDNA asli, sing nyebabake proporsi bacaan sing durung dipetakan sing dhuwur. Mulane, kita ora bisa ngilangi manawa sawetara bacaan sing durung dipetakan iki isih duwe asal-usul dhewe, utamane amarga kita ora duwe genom referensi kanggo spesies kerang iki. Kita uga nggunakake pipeline iki amarga kita prihatin babagan chimera antarane bacaan dhewe lan non-mandiri lan dawa bacaan sing diasilake dening Illumina MiSeq PE75. Alesan liyane kanggo mayoritas bacaan sing durung dipetakan yaiku akeh mikroba laut, utamane ing wilayah terpencil kayata Kerguelen, durung dianotasi. Kita nggunakake Illumina MiSeq PE75, kanthi nganggep dawa fragmen ccfDNA padha karo ccfDNA manungsa. Kanggo panliten ing mangsa ngarep, amarga asil kita nuduhake manawa hemolimf ccfDNA duwe bacaan sing luwih dawa tinimbang manungsa lan/utawa mamalia, disaranake nggunakake platform sekuensing sing luwih cocog kanggo fragmen ccfDNA sing luwih dawa. Praktik iki bakal nggampangake identifikasi indikasi liyane kanggo analisis sing luwih jero. Entuk urutan genom nuklir A. atra lengkap sing saiki ora kasedhiya uga bakal nggampangake diskriminasi ccfDNA saka sumber dhewe lan non-dhewe. Amarga riset kita wis fokus ing kemungkinan ngetrapake konsep biopsi cair kanggo kerang, kita ngarep-arep yen konsep iki digunakake ing riset ing mangsa ngarep, alat lan pipa anyar bakal dikembangake kanggo nambah potensi metode iki kanggo nyinaoni keragaman mikroba kerang. ekosistem laut.
Minangka biomarker klinis non-invasif, tingkat ccfDNA plasma manungsa sing dhuwur ana gandhengane karo macem-macem penyakit, kerusakan jaringan, lan kondisi stres [67,68,69]. Peningkatan iki ana gandhengane karo pelepasan fragmen DNA saka asale dhewe sawise kerusakan jaringan. Kita ngatasi masalah iki nggunakake stres panas akut, ing ngendi kerang kapapar suhu 30 °C. Kita nindakake analisis iki ing telung jinis kerang sing beda ing telung eksperimen independen. Nanging, kita ora nemokake owah-owahan ing tingkat ccfDNA sawise stres panas akut (waca Gambar S5, informasi tambahan). Panemuan iki bisa nerangake, paling ora sebagian, kasunyatan manawa kerang duwe sistem sirkulasi semi-terbuka lan nglumpukake DNA asing kanthi jumlah akeh amarga aktivitas penyaringan sing dhuwur. Ing sisih liya, kerang, kaya akeh invertebrata, bisa uga luwih tahan marang kerusakan jaringan sing disebabake stres, saengga mbatesi pelepasan ccfDNA ing hemolimfe [70, 71].
Nganti saiki, analisis DNA babagan keanekaragaman hayati ing ekosistem akuatik utamane fokus ing metabarcoding DNA lingkungan (eDNA). Nanging, metode iki biasane diwatesi ing analisis keanekaragaman hayati nalika primer digunakake. Panggunaan sekuensing shotgun ngatasi watesan PCR lan pilihan set primer sing bias. Dadi, ing sawijining pangertèn, metode kita luwih cedhak karo metode sekuensing eDNA Shotgun throughput dhuwur sing bubar digunakake, sing bisa langsung ngurut DNA sing difragmentasi lan nganalisis meh kabeh organisme [72, 73]. Nanging, ana sawetara masalah dhasar sing mbedakake LB saka metode eDNA standar. Mesthi wae, bedane utama antarane eDNA lan LB yaiku panggunaan host filter alami. Panggunaan spesies laut kayata spons lan bivalvia (Dresseina spp.) minangka filter alami kanggo nyinaoni eDNA wis dilaporake [74, 75]. Nanging, panliten Dreissena nggunakake biopsi jaringan saka ngendi DNA diekstrak. Analisis ccfDNA saka LB ora mbutuhake biopsi jaringan, peralatan khusus lan kadhangkala larang lan logistik sing ana gandhengane karo eDNA utawa biopsi jaringan. Nyatane, bubar iki kita nglaporake manawa ccfDNA saka LB bisa disimpen lan dianalisis nganggo dhukungan FTA tanpa njaga rantai adhem, sing dadi tantangan utama kanggo riset ing wilayah terpencil [76]. Ekstraksi ccfDNA saka biopsi cair uga prasaja lan nyedhiyakake DNA kualitas dhuwur kanggo sekuensing shotgun lan analisis PCR. Iki minangka kauntungan gedhe amarga sawetara watesan teknis sing ana gandhengane karo analisis eDNA [77]. Kesederhanaan lan biaya murah saka metode sampling uga cocog banget kanggo program pemantauan jangka panjang. Saliyane kemampuan penyaringan sing dhuwur, fitur liyane sing misuwur saka bivalvia yaiku komposisi mukopolisakarida kimia saka lendir, sing ningkatake penyerapan virus [78, 79]. Iki ndadekake bivalvia minangka filter alami sing ideal kanggo menehi ciri keanekaragaman hayati lan dampak perubahan iklim ing ekosistem akuatik tartamtu. Sanajan anané fragmen DNA sing asale saka inang bisa dideleng minangka watesan metode dibandhingake karo eDNA, biaya sing ana gandhengane karo duwe ccfDNA asli kasebut dibandhingake karo eDNA bisa dingerteni bebarengan kanggo akeh informasi sing kasedhiya kanggo studi kesehatan. inang offset. Iki kalebu anané urutan virus sing diintegrasi menyang genom inang. Iki penting banget kanggo kerang, amarga anané retrovirus leukemia sing ditularake sacara horisontal ing bivalvia [80, 81]. Kauntungan liyane saka LB tinimbang eDNA yaiku nggunakake aktivitas fagositik sel getih sing sirkulasi ing hemolimf, sing nguntal mikroorganisme (lan genome). Fagositosis minangka fungsi utama sel getih ing bivalvia [82]. Pungkasan, metode iki njupuk kauntungan saka kapasitas penyaringan kerang sing dhuwur (rata-rata 1,5 l/jam banyu segara) lan sirkulasi rong dina, sing nambah pencampuran lapisan banyu segara sing beda, sing ngidini penangkapan eDNA heterolog. [83, 84]. Dadi, analisis ccfDNA kerang minangka dalan sing menarik amarga dampak nutrisi, ekonomi, lan lingkungan saka kerang. Padha karo analisis LB sing dikumpulake saka manungsa, metode iki uga mbukak kemungkinan kanggo ngukur owah-owahan genetik lan epigenetik ing DNA inang minangka respon kanggo zat eksogen. Contone, teknologi sekuensing generasi katelu bisa dibayangake kanggo nindakake analisis metilasi genom ing ccfDNA asli nggunakake sekuensing nanopore. Proses iki kudu difasilitasi dening kasunyatan manawa dawa fragmen ccfDNA kerang cocog banget karo platform sekuensing sing dawa sing ngidini analisis metilasi DNA genom saka sekuensing tunggal tanpa perlu transformasi kimia.85,86] Iki minangka kemungkinan sing menarik, amarga wis dituduhake manawa pola metilasi DNA nggambarake respon marang stres lingkungan lan tetep ana sajrone pirang-pirang generasi. Mulane, bisa menehi wawasan sing penting babagan mekanisme sing ndasari sing ngatur respon sawise kena pengaruh perubahan iklim utawa polutan [87]. Nanging, panggunaan LB ora tanpa watesan. Ora perlu dikandhakake, iki mbutuhake anané spesies indikator ing ekosistem. Kaya sing wis kasebut ing ndhuwur, nggunakake LB kanggo netepake keanekaragaman hayati ekosistem tartamtu uga mbutuhake pipa bioinformatika sing ketat sing nganggep anané fragmen DNA saka sumber. Masalah utama liyane yaiku kasedhiyan genom referensi kanggo spesies laut. Dikarepake yen inisiatif kaya Proyek Genom Mamalia Laut lan proyek Fish10k sing nembe diadegake [88] bakal nggampangake analisis kasebut ing mangsa ngarep. Aplikasi konsep LB kanggo organisme sing mangan filter laut uga kompatibel karo kemajuan paling anyar ing teknologi sekuensing, saengga cocog banget kanggo pangembangan biomarker multi-ohm kanggo nyedhiyakake informasi penting babagan kesehatan habitat laut minangka respon kanggo stres lingkungan.
Data sekuensing genom wis disimpen ing Arsip Baca Urutan NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ing sangisore Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak owah-owahan iklim marang urip segara lan ekosistem. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, dkk. Coba pikirake dampak gabungan saka owah-owahan iklim lan stresor lokal liyane ing lingkungan laut. lingkungan ilmiah umum. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ilmu pisanan Maret. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleransi panas sing suda ing kahanan stres panas sing bola-bali nerangake kematian remis biru sing dhuwur ing mangsa panas. Laporan ilmiah 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, dkk. Owah-owahan anyar babagan frekuensi, panyebab, lan tingkat kematian kewan. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Akeh patogen non-spesies spesifik bisa nyebabake kematian massal Pinna nobilis. urip. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensi dampak owah-owahan iklim marang penyakit zoonotik Arktik. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Kerang biru (Mytilus edulis spp.) minangka organisme sinyal ing pemantauan polusi pesisir: tinjauan. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair ing perawatan kanker. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, dkk. Pematangan biopsi cair: Ngidini DNA tumor sirkulasi. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukleat ing plasma manungsa. Risalah rapat anak perusahaan Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran anyar kanggo DNA bebas sel minangka penanda molekuler kanggo perawatan kanker. Kuantifikasi analisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cair mlebu klinik – masalah implementasi lan tantangan ing mangsa ngarep. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW lan liya-liyane. DNA janin ana ing plasma lan serum ibu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Panliten babagan perjalanan kehamilan lan komplikasine nggunakake RNA ekstraseluler sing sirkulasi ing getih wanita sajrone kehamilan. Dopediatri. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, dkk. Biopsi cair: DNA bebas sel donor digunakake kanggo ndeteksi lesi alogenik ing cangkokan ginjel. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi ing diagnostik prenatal: sekuensing genom plasma ibu. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, dkk. Deteksi patogen cepet nganggo sekuensing metagenomik generasi sabanjure saka cairan awak sing kena infeksi. Nat Medicine. 2021;27:115-24.