Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Сыек биопсия (СБ) - биомедицина өлкәсендә тиз арада популярлаша барган концепция. Концепция, нигездә, төрле тукымаларда күзәнәк үлгәннән соң кечкенә фрагментлар рәвешендә чыгарыла торган, әйләнештәге күзәнәктән тыш ДНК (ccfDNA) фрагментларын ачыклауга нигезләнгән. Бу фрагментларның аз өлеше чит (чит) тукымалардан яки организмнардан килеп чыга. Хәзерге эштә без бу концепцияне диңгез суын фильтрлау сәләте белән билгеле булган сакчы төре булган мидияләргә кулландык. Без мидияләрнең табигый фильтрлар буларак эш итү сәләтен төрле чыганаклардан әйләнә-тирә мохит ДНК фрагментларын тоту өчен кулланабыз, диңгез яр буендагы экосистемаларның биологик төрлелеге турында мәгълүмат бирү өчен. Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, мидия гемолимфасында зурлыгы буенча бик нык аерылып торган, 1 дән 5 кб га кадәр булган ДНК фрагментлары бар. Мылтык белән эзлекле тикшерү күп санлы ДНК фрагментларының чит микроб чыгышлы булуын күрсәтте. Алар арасында без бактерияләрдән, архейлардан һәм вируслардан ДНК фрагментларын таптык, шул исәптән яр буендагы диңгез экосистемаларында еш очрый торган төрле хуҗаларны зарарлый торган вируслар да бар. Йомгаклап әйткәндә, безнең тикшеренү күрсәткәнчә, мидияләргә кулланылган LB төшенчәсе диңгез яр буендагы экосистемалардагы микроб төрлелеге турында бай, ләкин әлегә өйрәнелмәгән белем чыганагы булып тора.
Климат үзгәрешенең (КК) диңгез экосистемаларының биологик төрлелегенә йогынтысы - тикшеренүләрнең тиз үсә торган өлкәсе. Глобаль җылыну мөһим физиологик стресслар гына түгел, ә диңгез организмнарының термик тотрыклылыгының эволюцион чикләрен дә киметә, берничә төрнең яшәү мохитенә тәэсир итә, аларны уңайлырак шартлар эзләргә этәрә [1, 2]. Метазоаннарның биологик төрлелегенә йогынты ясаудан тыш, КК хуҗа-микроб үзара бәйләнешләренең нечкә балансын боза. Бу микроб дисбактериозы диңгез экосистемаларына җитди куркыныч тудыра, чөнки ул диңгез организмнарын йогышлы патогеннарга бирешүчәнрәк итә [3, 4]. КК күпләп үлемдә мөһим роль уйный дип санала, бу глобаль диңгез экосистемаларын идарә итү өчен җитди проблема [5, 6]. Бу күп кенә диңгез төрләренең икътисади, экологик һәм туклану йогынтысын исәпкә алганда мөһим мәсьәлә. Бу, бигрәк тә, КК йогынтысы тизрәк һәм җитдирәк булган поляр төбәкләрдә яшәүче ике капкачлы моллюсклар өчен дөрес [6, 7]. Чынлыкта, Mytilus spp. кебек ике капкачлы моллюсклар ККның диңгез экосистемаларына йогынтысын күзәтү өчен киң кулланыла. Гаҗәп түгел, аларның сәламәтлеген күзәтү өчен чагыштырмача күп биомаркерлар эшләнгән, еш кына ферментатив активлыкка яки күзәнәкнең яшәүчәнлеге һәм фагоцитоз активлыгы кебек күзәнәк функцияләренә нигезләнгән функциональ биомаркерларны үз эченә алган ике дәрәҗәле ысул кулланыла [8]. Бу ысулларга шулай ук ​​диңгез суының күп күләмен сеңдергәннән соң йомшак тукымаларда тупланган специфик басым күрсәткечләренең концентрациясен үлчәү дә керә. Ләкин, ике капкачлы ... Бу әйләнештәге ДНК фрагментларының булуы өлешчә күзәнәк үлгәннән соң геном ДНКсының (ядро һәм митохондриаль) пассив бүленеп чыгуы белән бәйле. Сәламәт кешеләрдә ccfДНК концентрациясе гадәттә түбән (<10 нг/мл), ләкин төрле патологияләрдән интегүче яки стресс кичерүче пациентларда ул 5–10 тапкыр артырга мөмкин, бу исә тукымаларга зыян китерә. Сәламәт кешеләрдә ccfДНК концентрациясе гадәттә түбән (<10 нг/мл), ләкин төрле патологияләрдән интегүче яки стресс кичерүче пациентларда ул 5–10 тапкыр артырга мөмкин, бу исә тукымаларга зыян китерә. У здоровых людей гаран вккДНК в умеме низкая (<10 нг / гир), но может повышаться в 5-10 раз у больных с различной патоголией или подвергающихся аву, при эвящему к поврежидию тч. Сәламәт кешеләрдә cccДНК концентрациясе гадәттә түбән (<10 нг/мл), ләкин төрле патологияләре булган яки тукымаларга зыян китерә торган стресс астында булган пациентларда ул 5–10 тапкыр артырга мөмкин.CcfDNA 的浓度通常较低（ <10 ng / mL ），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加 5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 c ccfdna 的 浓度 较 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10Концентрации ccfDNA обикно низкие (<10 нг / зира) у здоровых людей, ноябрь могут быть увеличены в 5-10 раз у удов с различными пидологиями или чисом, что при имитит к повреждению тканей. Сәламәт кешеләрдә ccfДНК концентрациясе гадәттә түбән (<10 нг/мл), ләкин төрле патологияләре яки стресс кичергән пациентларда 5-10 тапкыр артырга мөмкин, бу тукымаларга зыян китерә.ccfDNA фрагментларының зурлыгы төрлечә була, ләкин гадәттә 150 дән 200 б.п. га кадәр. [12]. Үзеннән алынган ccfDNA анализы, ягъни нормаль яки трансформацияләнгән хуҗа күзәнәкләреннән алынган ccfDNA, ядро ​​һәм/яки митохондриаль геномда булган генетик һәм эпигенетик үзгәрешләрне ачыклау өчен кулланылырга мөмкин, шуның белән клиник белгечләргә махсус молекуляр-максатлы терапияләрне сайларга ярдәм итә [13]. Ләкин ccfDNA чит чыганаклардан, мәсәлән, йөклелек вакытында феталь күзәнәкләреннән яки күчереп утыртылган органнардан ccfDNA алырга мөмкин [14,15,16,17]. ccfDNA шулай ук ​​инфекция агентының (чит) нуклеин кислоталары булуын ачыклау өчен мөһим мәгълүмат чыганагы булып тора, бу кан культуралары белән билгеләнмәгән киң таралган инфекцияләрне инвазив булмаган рәвештә ачыкларга мөмкинлек бирә, зарарланган тукымаларның инвазив биопсиясеннән саклана [18]. Соңгы тикшеренүләр чыннан да кеше канында вируслы һәм бактериаль патогеннарны ачыклау өчен кулланылырга мөмкин булган бай мәгълүмат чыганагы булуын һәм кеше плазмасында табылган ccfDNAның якынча 1% чит чыгышлы булуын күрсәтте [19]. Бу тикшеренүләр организмның әйләнештәге микробиомының биологик төрлелеген ccfDNA анализы ярдәмендә бәяләргә мөмкин булуын күрсәтә. Ләкин, күптән түгелгә кадәр бу төшенчә кешеләрдә генә һәм, азрак дәрәҗәдә, башка умырткалыларда гына кулланылды [20, 21].
Бу мәкаләдә без LB потенциалын кулланып, Aulacomya atraның көньяк төре булган ccfDNA анализын ясыйбыз, ул 35 миллион ел элек барлыкка килгән зур плато өстендә урнашкан утраулар төркеме булган субантарктик Кергелен утрауларында еш очрый. Вулкан атылуы. In vitro эксперименталь системасын кулланып, без диңгез суындагы ДНК фрагментларының мидияләр тарафыннан тиз арада үзләштерелүен һәм гемолимфа бүлегенә керүен ачыкладык. Мылтык белән секвенирлау күрсәткәнчә, мидия гемолимфасы ccfDNAсында үз һәм үзеннән булмаган ДНК фрагментлары, шул исәптән салкын вулкан диңгез яр буе экосистемаларына хас булган биомнардан симбиотик бактерияләр һәм ДНК фрагментлары бар. Гемолимфа ccfDNAсында шулай ук ​​төрле хуҗа диапазонлы вируслардан алынган вирус эзлеклелекләре бар. Без шулай ук ​​сөякле балыклар, диңгез актинияләре, суүсемнәр һәм бөҗәкләр кебек күп күзәнәкле хайваннардан ДНК фрагментларын таптык. Йомгаклап әйткәндә, безнең тикшеренү LB концепциясен диңгез умырткасызларына уңышлы кулланып, диңгез экосистемаларында бай геном репертуарын булдырырга мөмкин икәнен күрсәтә.
Өлкән мидияләр (55-70 мм озынлыкта) Mytilus platensis (M. platensis) һәм Aulacomya atra (A. atra) 2018 елның декабрендә Порт-о-Франсның ташлы ярларыннан (049°21.235 көньяк, 070°13.490 көнчыгыш) җыелган. Кергелен утрауларыннан башка өлкән зәңгәр мидияләр (Mytilus spp.) коммерция тәэмин итүчесеннән (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард утравы, Канада) алынган һәм 10–20 л 32‰ ясалма тозлы су (Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, АКШ) тутырылган температура контрольдә тотыла торган (4°C) һаваландырылган бакка урнаштырылган. Һәр эксперимент өчен аерым кабырчыкларның озынлыгы һәм авырлыгы үлчәнгән.
Бу программа өчен бушлай ачык керү протоколы онлайн режимда бар (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Кыскасы, LB гемолимфа [22] тасвирланганча абдуктор мускулларыннан җыелды. Гемолимфа 1200 × g тизлектә 3 минут дәвамында центрифугалау юлы белән ачыкланды, өслек катламы кулланылганчы туңдырылды (-20°C). cfDNAны аеру һәм чистарту өчен үрнәкләр (1,5-2,0 мл) эретелде һәм җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп NucleoSnap cfDNA комплекты (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ярдәмендә эшкәртелде. ccfDNA -80°C температурада алга таба анализ ясалганчы сакланды. Кайбер тәҗрибәләрдә ccfDNA QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) ярдәмендә аерылды һәм чистартылды. Чистартылган ДНК стандарт PicoGreen анализы ярдәмендә санланды. Изоляцияләнгән ccfDNA фрагментларының таралышы Agilent 2100 биоанализаторы (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) ярдәмендә капилляр электрофорез ярдәмендә югары сизгерлекле ДНК комплекты ярдәмендә анализланды. Анализ җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, 1 мкл ccfDNA үрнәген кулланып башкарылды.
Гемолимфа ccfДНК фрагментларын секвенирлау өчен, Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 комплектының Illumina DNA Mix комплектын кулланып мылтык китапханәләрен әзерләде. Стандарт адаптер (BioO) кулланылды. Чимал мәгълүмат файллары NCBI Sequence Read Archive'дан (SRR8924808 һәм SRR8924809) алырга мөмкин. Төп уку сыйфаты FastQC [23] ярдәмендә бәяләнде. Trimmomatic [24] адаптерларны кисү һәм начар сыйфатлы укулар өчен кулланылды. Парлы очлары булган мылтык укулары FLASH белән озынрак бер укуларга берләштерелде, туры килмәүләрне булдырмас өчен, минималь 20 bp кабатлану белән. Берләштерелгән укулар ике капкачлы NCBI таксономиясе мәгълүмат базасын кулланып BLASTN белән аннотацияләнде (e кыйммәте < 1e−3 һәм 90% гомология), ә түбән катлаулылыктагы эзлеклелекләрне маскировкалау DUST [26] ярдәмендә башкарылды. Берләштерелгән укулар ике капкачлы NCBI таксономиясе мәгълүмат базасын кулланып BLASTN белән аннотацияләнде (e кыйммәте < 1e−3 һәм 90% гомология), ә түбән катлаулылыктагы эзлеклелекләрне маскировкалау DUST [26] ярдәмендә башкарылды. Объединенные чтения былы аннотированя с помощью БЛАСТН с использованием басы конных так такомоми двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% чолхолии), с выполнено с использованием ДУСТ [26]. Берләштерелгән укулар NCBI ике капкачлы таксономия мәгълүмат базасын кулланып BLASTN белән аннотацияләнде (e кыйммәте < 1e-3 һәм 90% гомология), һәм түбән катлаулылыктагы эзлеклелек маскировкасы DUST [26] ярдәмендә башкарылды.使用双壳类 NCBI 分类数据库（ e 值 <1e-3 和 90% 同源性）用 BLASTN 注释合并的读数，并使用 DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（ <1e-3 和 90% 同源） 使用 使用 使用 使用 使用 使用 тузан [26] 进行 复杂度 序列 使用 使用 使用 使用 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения былы аннотированя с помощью БЛАСТН с использованием таксономической басы чырных двустворч чех моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% Ешологии), а маскирование послое выполнено с использованием ДУСТ [26]. Берләштерелгән укулар NCBI ике капкачлы таксономик мәгълүмат базасын кулланып BLASTN белән аннотацияләнде (e кыйммәте <1e-3 һәм 90% гомология), ә түбән катлаулылыктагы эзлеклелек маскировкасы DUST [26] ярдәмендә башкарылды.Укулар ике төркемгә бүленде: ике капкачлы эзлеклелекләр белән бәйле (монда үз-үзен укулар дип атала) һәм бәйләнешсез (үз-үзен укулар түгел). Ике төркем аерым рәвештә MEGAHIT ярдәмендә җыелды, контиглар барлыкка китерелде [27]. Шул ук вакытта, чит микробиом укуларының таксономик бүленеше Kraken2 [28] ярдәмендә классификацияләнде һәм график рәвештә Галактикадагы Krona пирог диаграммасы белән күрсәтелде [29, 30]. Алдан үткәрелгән экспериментлар нәтиҗәсендә оптималь кмерлар кмерс-59 дип билгеләнде. Аннары үз-үзен тоташтыручылар соңгы аннотация өчен BLASTN (ике капкачлы NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология) белән тигезләү юлы белән билгеләнде. Аннары үз-үзен тоташтыручылар соңгы аннотация өчен BLASTN (ике капкачлы NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология) белән тигезләү юлы белән билгеләнде. ЗАТЕМ собственные Бабтиги былы идентифицирован путем сопоставления с БЛАСТН (База чаных двустворч чех моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и ижрология 60%) для окончательной аннотации. Аннары үз-үзен тоташтыручылар соңгы аңлатма өчен BLASTN (NCBI ике капкачлы мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән чагыштыру юлы белән ачыкланды.然后通过与 BLASTN （双壳贝类 NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与 BLASTN （双壳贝类 NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% Затем были идент Сифицированя собственные бартиги для охончательной аннотации путем сопоставления с БЛАСТН (База чанных NCBI длу двустворчамех моллюсков, значение e <1e-10 и чингология 60%). Аннары үз-үзен тоташтыручылар BLASTN (NCBI ике капкачлы мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән чагыштыру юлы белән соңгы аннотация өчен билгеләнде. Параллель рәвештә, үз-үзен тотмаган төркем контиглары BLASTN белән билгеләнде (nt NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология). Параллель рәвештә, үз-үзен тотмаган төркем контиглары BLASTN белән билгеләнде (nt NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология). Параллельно чужеродные групповые кыртиги былы аннотированя с помощю Бластн (База чанных nt NCBI, значение e <1e-10 и кидология 60%). Параллель рәвештә, чит төркем контиглары BLASTN (NT NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән билгеләнде.NC BLASTN （nt NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）注释非自身组重叠群。NC BLASTN （nt NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно кәртиги, не относящиеся к собственной группе, былы аннотированя с помощуу БЛАСТН (База чаныхх NCBI, значение e <1e-10 и идология 60%). Параллель рәвештә, үз-үзен төркемгә кертмәгән контиглар BLASTN (nt NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән билгеләнде. BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq протеин NCBI мәгълүмат базаларын кулланып, үз-үзенә бәйле булмаган матдәләрдә дә үткәрелде (e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq протеин NCBI мәгълүмат базаларын кулланып, үз-үзенә бәйле булмаган матдәләрдә дә үткәрелде (e кыйммәте < 1e−10 һәм 60% гомология). БЛАСТС также был проведен на амамамостоятельных Абтитигах с использованием Базных белка nr һәм RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq NCBI аксым мәгълүмат базаларын кулланып үз-үзенә бәйле булмаган матдәләрдә дә башкарылды (e кыйммәте < 1e-10 һәм 60% гомология).还使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库对非自身重叠群进行了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源性）。还使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库对非自身重叠群进行了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源性）。 BLASTX также выполняли на амамостоятельных констигах с использованием басянх белка nr һәм RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq NCBI аксым мәгълүмат базаларын кулланып үз-үзенә бәйле булмаган матдәләрдә дә башкарылды (e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология).Үз-үзенә бәйле булмаган BLASTN һәм BLASTX пуллары соңгы бәйләнешләрне күрсәтә (өстәмә файлны карагыз).
ПЦР өчен кулланылган праймерлар S1 таблицасында күрсәтелгән. ccfДНК максатлы геннарын көчәйтү өчен Taq ДНК полимеразасы (Bio Basic Canada, Markham, ON) кулланылды. Түбәндәге реакция шартлары кулланылды: 95°C температурада 3 минут денатурация, 95°C температурада 1 минут, җылыту температурасын 1 минутка билгеләү, 72°C температурада 1 минутка элонгация, 35 цикл һәм ниһаять, 10 минут эчендә 72°C. . ПЦР продуктлары 95 В көчәнештә SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Berlington, ON, Канада) булган агароз гелләрендә (1,5%) электрофорез ярдәмендә аерылды.
Мидияләр (Mytilus spp.) 500 мл кислородлы диңгез суында (32 PSU) 4°C температурада 24 сәгать дәвамында акклиматизацияләнде. Кеше галектин-7 кДНК эзлеклелеген кодлаучы өстәмәне үз эченә алган плазмид ДНКсы (NCBI керү номеры L07769) флаконга 190 мкг/мкл концентрациясендә өстәлде. ДНК өстәмичә шул ук шартларда инкубацияләнгән мидияләр контроль булды. Өченче контроль бак мидиясез ДНКны үз эченә алды. Диңгез суындагы ДНК сыйфатын күзәтү өчен, күрсәтелгән вакытта һәр бактан диңгез суы үрнәкләре (20 мкл; өч кабатлау) алынды. Плазмид ДНКсын күзәтү өчен, күрсәтелгән вакытта LB мидияләре җыелды һәм qPCR һәм ddPCR ярдәмендә анализланды. Диңгез суының тоз күләме югары булу сәбәпле, барлык ПЦР анализлары алдыннан аликвотлар ПЦР сыйфатлы суда (1:10) сыекландырылды.
Цифрлы тамчылы ПЦР (ddPCR) BioRad QX200 протоколы (Миссиссога, Онтарио, Канада) ярдәмендә башкарылды. Оптималь температураны билгеләү өчен температура профилен кулланыгыз (S1 таблицасы). Тамчылар QX200 тамчы генераторы (BioRad) ярдәмендә булдырылды. ddPCR түбәндәгечә башкарылды: 95°C температурада 5 минут, 95°C температураның 50 циклы 30 с һәм бирелгән җылыту температурасы 1 минут һәм 72°C температурада 30 с, 4°C температурада 5 минут һәм 90°C температурада 5 минут эчендә. Тамчылар саны һәм уңай реакцияләр (экземплярлар саны/мкл) QX200 тамчы уку җайланмасы (BioRad) ярдәмендә үлчәнде. 10 000 дән кимрәк тамчылы үрнәкләр кире кагылды. ddPCR һәр тапкыр эшләнгәч, үрнәк контроле башкарылмады.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) һәм LGALS7 махсус праймерлары ярдәмендә башкарылды. Барлык санлы ПЦРлар да QuantiFast SYBR Green PCR комплекты (QIAGEN) ярдәмендә 20 мкл эчендә башкарылды. qPCR 95°C температурада 15 минут инкубацияләү белән башланды, аннары 95°C температурада 10 секунд һәм 60°C температурада 60 секунд дәвамында 40 цикл бер мәгълүмат җыю белән башкарылды. Эрү кәкреләре qPCR ахырында 95°C температурада 5 секунд, 65°C температурада 60 секунд һәм 97°C температурада бер-бер артлы үлчәүләр ярдәмендә булдырылды. Контроль үрнәкләреннән кала, һәр qPCR өч тапкыр башкарылды.
Мидияләр югары фильтрация тизлеге белән билгеле булганлыктан, без башта аларның диңгез суындагы ДНК фрагментларын фильтрлап саклый алуларын тикшердек. Без шулай ук ​​бу фрагментларның ярым ачык лимфа системасында туплану-топланмавы белән кызыксындык. Без бу мәсьәләне зәңгәр мидия бакларына өстәлгән эри торган ДНК фрагментларының язмышын күзәтеп, эксперименталь рәвештә хәл иттек. ДНК фрагментларын күзәтүне җиңеләйтү өчен, без кеше галектин-7 генын үз эченә алган чит (үзен түгел) плазмид ДНКсын кулландык. ddPCR диңгез суында һәм мидияләрдә плазмид ДНК фрагментларын эзли. Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, әгәр диңгез суындагы ДНК фрагментлары мидияләр булмаганда вакыт узу белән (7 көнгә кадәр) чагыштырмача даими булып калса, мидияләр булганда бу дәрәҗә 8 сәгать эчендә диярлек тулысынча юкка чыккан (1a, b рәсем). Экзоген ДНК фрагментлары клапан эчендәге сыеклыкта һәм гемолимфада 15 минут эчендә җиңел ачыкланды (1c рәсем). Бу фрагментларны тәэсир иткәннән соң 4 сәгатькә кадәр ачыкларга мөмкин иде. ДНК фрагментларына карата бу фильтрлау активлыгы бактерияләр һәм суүсемнәрнең фильтрлау активлыгына тиң [31]. Бу нәтиҗәләр мидияләрнең үзләренең сыеклык бүлекләрендә чит ДНКны фильтрлый һәм туплый алуын күрсәтә.
Мидияләр булганда (А) яки булмаганда (В) диңгез суындагы плазмид ДНКсының чагыштырма концентрацияләре, ddPCR ярдәмендә үлчәнгән. А вариантында нәтиҗәләр процентларда күрсәтелгән, рамкаларның чикләре 75 нче һәм 25 нче процентильләрне күрсәтә. Логарифмик кәкре кызыл төс белән күрсәтелгән, ә соры төс белән бизәлгән мәйдан 95% ышаныч интервалын күрсәтә. В вариантында кызыл сызык уртачаны, ә зәңгәр сызык концентрация өчен 95% ышаныч интервалын күрсәтә. C Плазмид ДНКсы өстәлгәннән соң төрле вакытта мидияләрнең гемолимфасында һәм клапан сыекчасында плазмид ДНКсы туплануы. Нәтиҗәләр табылган абсолют күчермәләр/мл (±SE) буларак күрсәтелгән.
Аннары, без Кергелен утрауларында мидияләр түтәлләреннән җыелган мидияләрдә ccfDNA килеп чыгышын тикшердек, бу утраулар антропоген йогынтысы чикләнгән ерак төркем. Моның өчен мидия гемолимфаларыннан cccDNA кеше cccDNAсын чистарту өчен гадәттә кулланыла торган ысуллар белән аерып алынды һәм чистартылды [32, 33]. Без мидияләрдә уртача гемолимфа ccfDNA концентрациясенең гемолимфага микрограмм/мл диапазонында булуын ачыкладык (өстәмә мәгълүмат өчен S2 таблицасын карагыз). Бу концентрация диапазоны сәламәт кешеләргә караганда күпкә зуррак (миллилитрга түбән нанограмм), ләкин сирәк очракларда, яман шеш белән авыручыларда ccfDNA дәрәҗәсе миллилитрга берничә микрограммга җитәргә мөмкин [34, 35]. Гемолимфа ccfDNA зурлыгы бүленешен анализлау бу фрагментларның зурлыгы буенча бик нык аерылып торуын күрсәтте, 1000 б.п.дан 1000 б.п.га кадәр. 5000 б.п.га кадәр (2 нче рәсем). Охшаш нәтиҗәләр кремний диоксиды нигезендәге QIAamp Investigator Kit ярдәмендә алынган, бу ысул суд-медицина фәнендә ccfDNAны да кертеп, түбән концентрацияле ДНК үрнәкләреннән геном ДНКсын тиз аеру һәм чистарту өчен еш кулланыла [36].
Мидия гемолимфасының репрезентатив ccfДНК электрофореграммасы. NucleoSnap Plasma Kit (өстә) һәм QIAamp ДНК тикшерүче комплекты белән алынган. Мидияләрдә гемолимфа ccfДНК концентрациясенең (±SE) бүленешен күрсәтүче B скрипка графигы. Кара һәм кызыл сызыклар медиананы, ә беренче һәм өченче квартильләрне күрсәтә.
Кешеләрдә һәм приматларда якынча 1% ккфДНК чит чыганактан килә [21, 37]. Ике капкачлы моллюскларның ярым ачык кан әйләнеше системасы, микробларга бай диңгез суы һәм мидия ккфДНКсының зурлык бүленешен исәпкә алып, без мидия гемолимфа ккфДНКсында бай һәм төрле микроб ДНКсы булырга мөмкин дигән гипотеза чыгардык. Бу гипотезаны тикшерү өчен, без Кергелен утрауларыннан җыелган Аулакомья атра үрнәкләреннән гемолимфа ккфДНКсын секвенцияләдек, 10 миллионнан артык уку нәтиҗәсе алдык, шуларның 97,6% ы сыйфат контролен үтте. Аннары укулар BLASTN һәм NCBI ике капкачлы моллюск мәгълүмат базаларын кулланып, үз һәм үз булмаган чыганаклар буенча классификацияләнде (S1 рәсем, Өстәмә мәгълүмат).
Кешеләрдә, ядро ​​һәм митохондриаль ДНК канга чыгарылырга мөмкин [38]. Ләкин, бу тикшеренүдә, мидияләрнең ядро ​​геном ДНКсын җентекләп тасвирлау мөмкин булмады, чөнки A. atra геномы секвенирланмаган яки тасвирланмаган. Шулай да, без ике капкачлы китапханә ярдәмендә үзебезнең чыгышлы берничә ccfDNA фрагментларын ачыклый алдык (S2 рәсем, Өстәмә мәгълүмат). Без шулай ук ​​секвенирланган A. atra геннарын юнәлтелгән ПЦР амплификациясе ярдәмендә үзебезнең чыгышлы ДНК фрагментларының булуын расладык (3 нче рәсем). Шулай ук, A. atra митохондриаль геномы ачык мәгълүмат базаларында булуын исәпкә алып, A. atra гемолимфасында митохондриаль ccfDNA фрагментларының булуын расларга мөмкин. Митохондриаль ДНК фрагментларының булуы ПЦР амплификациясе белән расланды (3 нче рәсем).
ПЦР ярдәмендә көчәйтелгән A. atra (кызыл нокталар - запас номеры: SRX5705969) һәм M. platensis (зәңгәр нокталар - запас номеры: SRX5705968) гемолимфасында төрле митохондриаль геннар булган. Рәсем Breton et al., 2011 B материалыннан алынган. A. atra'дан гемолимфа өслеген көчәйтү. FTA кәгазендә сакланган. ПЦР катнашмасы булган ПЦР пробиркасына турыдан-туры өстәү өчен 3 мм перфоратор кулланыгыз.
Диңгез суындагы микробларның күп булуын исәпкә алып, без башта гемолимфадагы микроб ДНК эзлеклелеген характерлауга игътибар иттек. Моның өчен без ике төрле стратегия кулланабыз. Беренче стратегиядә BLAST һәм башка кораллар белән чагыштырырлык төгәллек белән микроб эзлеклелеген ачыклый алырлык алгоритмга нигезләнгән эзлеклелек классификация программасы Kraken2 кулланылды [28]. 6719 дан артык уку бактериаль чыгышлы дип билгеләнде, ә 124 һәм 64е архей һәм вируслардан иде (4 нче рәсем). Иң күп бактериаль ДНК фрагментлары Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) һәм Bacteroidetes (17%) иде (4а рәсем). Бу бүленеш диңгез зәңгәр мидия микробиомының алдагы тикшеренүләре белән туры килә [39, 40]. Гаммапротеобактерияләр Proteobacteriaларның төп классы иде (44%), шул исәптән күп Vibrionales (4б рәсем). ddPCR ысулы A. atra гемолимфасының ccfДНКсында Вибрио ДНК фрагментларының булуын раслады (4c рәсем) [41]. ccfДНКның бактериаль килеп чыгышы турында күбрәк мәгълүмат алу өчен өстәмә ысул кулланылды (S2 рәсем, Өстәмә мәгълүмат). Бу очракта, капланган укулар парлы укулар буларак җыелган һәм BLASTN һәм 1e−3 e кыйммәте, һәм >90% гомологияле чикләү кулланып үз-үзеннән (ике капкачлы) яки үз-үзеннән булмаган дип классификацияләнгән. Бу очракта, капланган укулар парлы укулар буларак җыелган һәм BLASTN һәм 1e−3 e кыйммәте, һәм >90% гомологияле чикләү кулланып үз-үзеннән (ике капкачлы) яки үз-үзеннән булмаган дип классификацияләнгән. В этом случае перекрывающиеся ч чентия были собраня как чентия с парными концами и были мисифицированя как собственные (двустворчяе моллюски) или чужие по происхождению с сспользовы кигологией> 90%. Бу очракта, кабатланучы укулар парлы укулар буларак җыелган һәм BLASTN һәм 1e-3 e кыйммәтен кулланып, һәм >90% гомология белән чикләү кулланып, туган (ике капкачлы) яки оригиналь булмаган дип классификацияләнгән.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用 КАРАШ 和 1e-3 的 e 值和> 90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。A 1e-3 使用 使用 使用 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраня как чентия с парными консами һәм асисифицированя как собственные (двустворч чате моллюски) или чиробственнее по происхождению с испольчовы кигологии> 90%. Бу очракта, кабатланучы укулар парлы укулар буларак җыелган һәм e BLASTN һәм 1e-3 кыйммәтләрен һәм гомология бусагасын >90% кулланып үз (ике капкачлы) яки оригиналь булмаган дип классификацияләнгән.A. atra геномы әле секвенирланмаганлыктан, без MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ассемблерының de novo ассемблер стратегиясен кулландык. Барлыгы 147,188 контиг килеп чыгышы буенча бәйле (ике капкачлы) дип билгеләнде. Аннары бу контиглар BLASTN һәм BLASTX кулланып 1e-10 e-кыйммәтләре белән шартлатылды. Бу стратегия безгә A. atra ccfDNA'да булган 482 ике капкачлы булмаган фрагментны ачыкларга мөмкинлек бирде. Бу ДНК фрагментларының яртысыннан артыгы (57%) бактерияләрдән, нигездә, сульфотрофик симбионтларны да кертеп, желбезәк симбионтларыннан һәм желбезәк симбионтлары Solemya velum'нан алынды (5 нче рәсем).
Тип дәрәҗәсендә чагыштырмача күплек. B Ике төп филаның (Firmicutes һәм Proteobacteria) микроб төрлелеге. ddPCRның репрезентатив көчәйтүе C Vibrio spp. A. Өч атра гемолимфасында 16S рРНК генының фрагментлары (зәңгәр).
Барлыгы 482 җыелган контиг анализланды. Метагеномик контиг аннотацияләренең (прокариотлар һәм эукариотлар) таксономик бүленешенең гомуми профиле. B BLASTN һәм BLASTX ярдәмендә ачыкланган бактериаль ДНК фрагментларының җентекле бүленеше.
Kraken2 анализы шулай ук ​​мидия ccf ДНКсында архей ДНК фрагментлары, шул исәптән Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) һәм Thaurmarcheota (11%) ДНК фрагментлары булуын күрсәтте (6а рәсем). Элегрәк Калифорния мидияләренең микроб җәмгыятендә табылган Euryarchaeota һәм Crenarchaeotaдан алынган ДНК фрагментларының булуы гаҗәпләндермәскә тиеш [42]. Euryarchaeota еш кына экстремаль шартлар белән бәйле булса да, хәзер Euryarchaeota да, Crenarcheota да диңгез криоген мохитендә иң еш очрый торган прокариотлар арасында булуы таныла [43, 44]. Кергелен платосындагы төп агып чыгулардан метан агып чыгулары турында соңгы хәбәрләрне [45] һәм Кергелен утраулары ярында микроб метан җитештерүе күзәтелүен исәпкә алганда [46], мидияләрдә метаноген микроорганизмнарның булуы гаҗәпләндерми.
Аннары игътибарыбыз ДНК вирусларыннан алынган күрсәткечләргә юнәлде. Безнең белүебезчә, бу мидияләрнең вирус эчтәлеген тикшерүнең беренче максаттан тыш тикшеренүе. Көтелгәнчә, без бактериофагларның (Caudovirales) ДНК фрагментларын таптык (6б рәсем). Ләкин иң еш очрый торган вирус ДНКсы нуклеоцитовируслар филумыннан килә, ул шулай ук ​​​​ядро цитоплазматик зур ДНК вирусы (NCLDV) дип тә атала, ул теләсә нинди вирусның иң зур геномына ия. Бу филум эчендә күпчелек ДНК эзлеклелекләре Mimimidoviridae (58%) һәм Poxviridae (21%) гаиләләренә карый, аларның табигый хуҗалары арасында умырткалылар һәм артроподлар бар, ә бу ДНК эзлеклелекләренең аз өлеше билгеле вирусологик суүсемнәргә карый. Диңгез эукариот суүсемнәрен зарарлый. Эзлеклелекләр шулай ук ​​​​мәгълүм вируслар арасында иң зур геном зурлыгына ия булган гигант вирус - Пандора вирусыннан алынган. Кызыклысы шунда ки, гемолимфа ccfДНК секвенирлавы ярдәмендә билгеләнгәнчә, вирус белән зарарланган дип саналган хуҗалар диапазоны чагыштырмача зур булган (S3 нче рәсем, Өстәмә мәгълүмат). Ул Baculoviridae һәм Iridoviridae кебек бөҗәкләрне зарарлаучы вирусларны, шулай ук ​​амеба, суүсемнәр һәм умырткалы хайваннарны зарарлаучы вирусларны үз эченә ала. Без шулай ук ​​Pithovirus sibericum геномына туры килә торган секвенирларны таптык. Питовируслар (шулай ук ​​"зомби вируслары" дип тә атала) беренче тапкыр Себердәге 30 000 еллык мәңгелек туңлыктан аерылган [47]. Шулай итеп, безнең нәтиҗәләр бу вирусларның барлык заманча төрләре дә юкка чыкмаганлыгын [48] һәм бу вирусларның ерак субарктик диңгез экосистемаларында булырга мөмкинлеген күрсәтүче элеккеге докладлар белән туры килә.
Ниһаять, без башка күп күзәнәкле хайваннарның ДНК фрагментларын таба алу-алмавын тикшердек. BLASTN һәм BLASTX ярдәмендә барлыгы 482 чит контиг ачыкланды, алар nt, nr һәм RefSeq китапханәләре (геном һәм аксым). Безнең нәтиҗәләр күп күзәнәкле хайваннарның ccfДНКсының чит фрагментлары арасында сөяк сөякләренең ДНКсы өстенлек итә икәнен күрсәтә (5 нче рәсем). Бөҗәкләр һәм башка төрләрнең ДНК фрагментлары да табылган. ДНК фрагментларының чагыштырмача зур өлеше ачыкланмаган, мөгаен, геном мәгълүмат базаларында коры җир төрләре белән чагыштырганда күп санлы диңгез төрләренең аз күрсәтелүенә бәйле [49].
Бу мәкаләдә без LB концепциясен мидияләргә кулланабыз, гемолимфа ccfDNA ату секвенирлавы диңгез яр буендагы экосистемаларның составы турында мәгълүмат бирә ала дип раслыйбыз. Аерым алганда, без шуны ачыкладык: 1) мидия гемолимфасында чагыштырмача зур (~1-5 кб) әйләнештәге ДНК фрагментларының чагыштырмача югары концентрацияләре (микрограмм дәрәҗәләре) бар; 2) бу ДНК фрагментлары бәйсез һәм бәйсез түгел; 3) Бу ДНК фрагментларының чит чыганаклары арасында без бактерия, архейаль һәм вирус ДНКсын, шулай ук ​​башка күп күзәнәкле хайваннарның ДНКсын таптык; 4) Бу чит ccfDNA фрагментларының гемолимфада туплануы тиз бара һәм мидияләрнең эчке фильтрлау активлыгына өлеш кертә. Йомгаклап әйткәндә, безнең тикшеренү әлегә кадәр нигездә биомедицина өлкәсендә кулланылган LB концепциясенең сакчы төрләре һәм аларның мохите арасындагы үзара бәйләнешне яхшырак аңлау өчен кулланылырга мөмкин булган бай, ләкин өйрәнелмәгән белем чыганагын кодлый икәнен күрсәтә.
Приматлардан тыш, имезүчеләрдә, шул исәптән тычканнарда, этләрдә, мәчеләрдә һәм атларда ccfDNA изоляциясе турында хәбәр ителгән [50, 51, 52]. Ләкин, безнең белүебезчә, безнең тикшеренү ачык кан әйләнеше системасы булган диңгез төрләрендә ccfDNA ны ачыклау һәм секвенирлау турында хәбәр иткән беренче тикшеренү. Мидияләрнең бу анатомик үзенчәлеге һәм фильтрлау сәләте, кимендә өлешчә, кан әйләнешендәге ДНК фрагментларының башка төрләр белән чагыштырганда төрле зурлыктагы үзенчәлекләрен аңлатырга мөмкин. Кешеләрдә кан әйләнешендәге ДНК фрагментларының күбесе 150 дән 200 б.п. га кадәр зурлыктагы кечкенә фрагментлар, максималь пигы 167 б.п. [34, 53]. ДНК фрагментларының кечкенә, ләкин әһәмиятле өлеше 300 дән 500 б.п. га кадәр зурлыкта, һәм якынча 5% 900 б.п. дан озынрак. [54]. Бу зурлык бүленешенең сәбәбе шунда: плазмадагы ccfDNA төп чыганагы күзәнәк үлеме нәтиҗәсендә барлыкка килә, я күзәнәк үлеме аркасында, я сәламәт кешеләрдә кан әйләнеше күзәнәкләренең некрозы аркасында, я яман шеш авыруларында шеш күзәнәкләренең апоптозы аркасында (кан әйләнеше шеш ДНКсы дип атала). , ctDNA). Мидияләрдә тапкан гемолимфа ccfDNA зурлыгы бүленеше 1000 дән 5000 bp га кадәр булган, бу мидия ccfDNAсының башка килеп чыгышы булуын күрсәтә. Бу логик гипотеза, чөнки мидияләрнең ярым ачык кан тамырлары системасы бар һәм алар микроб геном ДНКсының югары концентрациясен үз эченә алган диңгез су мохитендә яшиләр. Чынлыкта, экзоген ДНК кулланып үткәргән лаборатория тәҗрибәләребез мидияләрнең диңгез суында ДНК фрагментларын туплавын күрсәтте, ким дигәндә берничә сәгатьтән соң алар күзәнәк тарафыннан кабул ителгәннән соң таркала һәм/яки төрле оешмаларда чыгарыла һәм/яки саклана. Күзәнәкләрнең (прокариот һәм эукариот күзәнәкләрнең) сирәк булуын исәпкә алып, клапан эчендәге бүлекләрне куллану үз чыганакларыннан да, чит чыганаклардан да ккфДНК күләмен киметәчәк. Ике капкачлы тумыштан килгән иммунитетның мөһимлеген һәм кан әйләнешендәге фагоцитларның күплеген исәпкә алып, без хәтта чит ккфДНК да кан әйләнешендәге фагоцитлар белән баетылган дип фаразладык, алар микроорганизмнарны һәм/яки күзәнәк калдыкларын йотканда чит ДНК туплана. Гомумән алганда, безнең нәтиҗәләр ике капкачлы гемолимфа ккфДНК молекуляр мәгълүматның уникаль саклагычы булуын һәм аларның сакчы төр буларак статусын ныгытуын күрсәтә.
Безнең мәгълүматлар бактерияләрдән алынган гемолимфа ccfДНК фрагментларын секвенирлау һәм анализлау хуҗа бактерия флорасы һәм тирә-юньдәге диңгез экосистемасында булган бактерияләр турында төп мәгълүмат бирә алуын күрсәтә. Ату секвенирлау ысуллары гадәти 16S рРНК идентификацияләү ысуллары кулланылган очракта, өлешчә белешмә китапханәсенә карата тайпылыш аркасында, A. atra gill комменсаль бактерияләренең секвенирларын ачыклады. Чынлыкта, Кергелендагы бер үк мидия катламында M. platensis'тан җыелган LB мәгълүматларын куллануыбыз мидияләрнең ике төре өчен дә гель белән бәйле бактерия симбионтларының составы бер үк булуын күрсәтте (S4 рәсем, Өстәмә мәгълүмат). Ике генетик яктан төрле мидиянең бу охшашлыгы Кергеленның салкын, күкертле һәм вулкан утырмаларында бактерия җәмгыятьләренең составын чагылдырырга мөмкин [55, 56, 57, 58]. Порт-о-Франс яры кебек биологик турбацияләнгән яр буе зоналарыннан мидияләр җыйганда [59] күкертне киметүче микроорганизмнарның югарырак дәрәҗәләре яхшы тасвирланган. Тагын бер мөмкинлек - комменсаль мидия флорасы горизонталь тапшырудан тәэсирләнергә мөмкин [60, 61]. Диңгез мохите, диңгез төбе өслеге һәм мидияләрдәге симбиотик бактерияләр составы арасындагы корреляцияне билгеләү өчен күбрәк тикшеренүләр кирәк. Бу тикшеренүләр хәзерге вакытта дәвам итә.
Гемолимфа ccfDNA озынлыгы һәм концентрациясе, чистарту җиңеллеге һәм тиз арада скверлау мөмкинлеге бирә торган югары сыйфат - диңгез яр буе экосистемаларында биологик төрлелекне бәяләү өчен мидия ccfDNA куллануның күп өстенлекләренең кайберләре. Бу алым, бигрәк тә, билгеле бер экосистемадагы вируслы җәмгыятьләрне (виромнарны) характерлау өчен нәтиҗәле [62, 63]. Бактерияләрдән, археялардан һәм эукариотлардан аермалы буларак, вирус геномнарында 16S эзлеклелеге кебек филогенетик яктан сакланган геннар юк. Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, мидияләр кебек индикатор төрләрдән алынган сыек биопсияләр яр буе диңгез экосистемаларында яшәүче хуҗаларны зарарлый торган чагыштырмача күп санлы ccfDNA вирус фрагментларын ачыклау өчен кулланылырга мөмкин. Моңа гади организмнарны, артроподларны, бөҗәкләрне, үсемлекләрне һәм бактериаль вирусларны (мәсәлән, бактериофагларны) зарарлый торган вируслар керә. Кергелендагы шул ук мидия катламында җыелган зәңгәр мидияләрнең (M. platensis) гемолимфа ccfDNA виромын тикшергәндә охшаш таралыш табылды (S2 таблицасы, Өстәмә мәгълүмат). ccfДНКны мылтык белән секвенирлау, чыннан да, кешеләр яки башка төрләрнең вирусомын өйрәнүдә яңа алым булып тора [21, 37, 64]. Бу алым, бигрәк тә, ике чылбырлы ДНК вирусларын өйрәнү өчен файдалы, чөнки Балтимордагы иң төрле һәм киң вируслар классын тәкъдим итүче барлык ике чылбырлы ДНК вируслары арасында бер генә ген да сакланмаган [65]. Бу вирусларның күбесе классификацияләнмәгән булып калса да һәм вирус дөньясының бөтенләй билгесез өлешеннән вирусларны үз эченә алса да [66], без мидияләр A. atra һәм M. platensis вирусомнары һәм хуҗа диапазоннарының ике төр арасында булуын ачыкладык. охшаш рәвештә (S3 рәсемен, өстәмә мәгълүматны карагыз). Бу охшашлык гаҗәп түгел, чөнки ул әйләнә-тирә мохиттә булган ДНКны үзләштерүдә сайлап алу җитмәвен чагылдырырга мөмкин. Хәзерге вакытта РНК вирусомын характерлау өчен чистартылган РНК кулланып киләчәк тикшеренүләр кирәк.
Безнең тикшеренүдә без Коварски һәм хезмәттәшләренең эшләреннән алынган бик катгый конвейер кулландык [37], алар туган ccfDNA җыю алдыннан һәм аннан соң берләштерелгән укуларны һәм контигларны ике адымлы бетерүне кулланганнар, нәтиҗәдә карталаштырылмаган укуларның зур өлеше барлыкка килгән. Шуңа күрә, без бу карталаштырылмаган укуларның кайберләренең үз чыгышлары булуын кире кага алмыйбыз, нигездә, бездә бу мидия төре өчен белешмә геномы булмаганга. Без шулай ук ​​бу конвейерны кулландык, чөнки без үз һәм үз булмаган укулар арасындагы химералардан һәм Illumina MiSeq PE75 тарафыннан тудырылган уку озынлыкларыннан борчылдык. Карталаштырылмаган укуларның күпчелегенең тагын бер сәбәбе - диңгез микробларының күбесе, бигрәк тә Кергелен кебек ерак районнарда, аннотацияләнмәгән. Без Illumina MiSeq PE75 кулландык, ccfDNA фрагментларының озынлыгы кеше ccfDNAсына охшаш дип фаразладык. Киләчәк тикшеренүләр өчен, гемолимфа ccfDNA'ның кешеләргә һәм/яки имезүчеләргә караганда озаграк укылачагын күрсәтүче нәтиҗәләребезне исәпкә алып, без озынрак ccfDNA фрагментлары өчен кулайрак булган секвенирлау платформасын кулланырга киңәш итәбез. Бу практика тирәнрәк анализ өчен күбрәк күрсәткечләрне ачыклауны күпкә җиңеләйтәчәк. Хәзерге вакытта мөмкин булмаган тулы A. atra ядро ​​геномы эзлеклелеген алу ccfDNA'ны үз һәм үз булмаган чыганаклардан аеруны да зур җиңеләйтер иде. Безнең тикшеренүләр мидияләргә сыек биопсия концепциясен куллану мөмкинлегенә юнәлтелгәнлектән, бу концепция киләчәктәге тикшеренүләрдә кулланылганлыктан, мидияләрнең микроб төрлелеген өйрәнү өчен бу ысулның потенциалын арттыру өчен яңа кораллар һәм торбаүткәргечләр эшләнәчәк дип өметләнәбез. диңгез экосистемасы.
Инвазив булмаган клиник биомаркер буларак, кеше плазмасында ccfDNA дәрәҗәләренең югары булуы төрле авырулар, тукымаларның зарарлануы һәм стресс шартлары белән бәйле [67,68,69]. Бу арту тукымаларның зарарлануыннан соң үз чыгышлы ДНК фрагментларының чыгарылуы белән бәйле. Без бу мәсьәләне кискен җылылык стрессы ярдәмендә хәл иттек, анда мидияләр кыска вакытка 30 °C температурага дучар ителде. Без бу анализны өч төрле мидиядә өч бәйсез экспериментта үткәрдек. Ләкин кискен җылылык стрессыннан соң ccfDNA дәрәҗәсендә бернинди үзгәреш тапмадык (S5 рәсемен, өстәмә мәгълүматны карагыз). Бу ачыш, ким дигәндә өлешчә, мидияләрнең ярым ачык кан әйләнеше системасына ия булуын һәм югары фильтрлау активлыгы аркасында күп күләмдә чит ДНК туплавын аңлатырга мөмкин. Икенче яктан, мидияләр, күп кенә умырткасызлар кебек, стресс китереп чыгарган тукымаларның зарарлануына чыдамрак булырга мөмкин, шуның белән аларның гемолимфасында ccfDNA чыгарылуын чикли [70, 71].
Бүгенге көнгә кадәр су экосистемаларында биологик төрлелекнең ДНК анализы, нигездә, әйләнә-тирә мохит ДНК (eDNA) метабаркодлауга юнәлтелгән. Ләкин, бу ысул гадәттә праймерлар кулланылганда биологик төрлелек анализында чикләнгән. Мылтык секвенирлавын куллану ПЦР чикләүләрен һәм праймерлар җыелмаларын сайлауны урап уза. Шулай итеп, билгеле бер мәгънәдә, безнең ысул күптән түгел кулланылган югары җитештерүчәнле eDNA мылтык секвенирлавы ысулына якынрак, ул фрагментланган ДНКны турыдан-туры секвенирларга һәм барлык организмнарны диярлек анализларга сәләтле [72, 73]. Ләкин, LBны стандарт eDNA ысулларыннан аерып торган берничә фундаменталь мәсьәлә бар. Әлбәттә, eDNA һәм LB арасындагы төп аерма - табигый фильтр хуҗаларын куллану. eDNAны өйрәнү өчен табигый фильтр буларак губкалар һәм ике капкачлы моллюскалар (Dresseina spp.) кебек диңгез төрләрен куллану турында хәбәр ителгән [74, 75]. Ләкин, Дрейссена тикшеренүендә ДНК алынган тукыма биопсияләре кулланылган. LBдан ccfDNA анализы өчен тукыма биопсиясе, махсуслаштырылган һәм кайвакыт кыйммәтле җиһазлар һәм eDNA яки тукыма биопсиясе белән бәйле логистика кирәк түгел. Чынлыкта, без күптән түгел LBдан ccfDNAны салкын чылбырны сакламыйча FTA ярдәме белән сакларга һәм анализларга мөмкин дип хәбәр иттек, бу ерак районнардагы тикшеренүләр өчен зур кыенлык тудыра [76]. Сыек биопсияләрдән ccfDNAны алу да гади һәм мылтык секвенирлавы һәм ПЦР анализы өчен югары сыйфатлы ДНК бирә. Бу eDNA анализы белән бәйле кайбер техник чикләүләрне исәпкә алганда зур өстенлек [77]. Үрнәк алу ысулының гадилеге һәм түбән бәясе озак вакытлы мониторинг программалары өчен дә аеруча яраклы. Югары фильтрлау сәләтеннән тыш, ике капкачлы моллюскаларның тагын бер билгеле үзенчәлеге - аларның лайласының химик мукополисахарид составы, ул вирусларның сеңүен стимуллаштыра [78, 79]. Бу ике капкачлы моллюскаларны билгеле бер су экосистемасында биологик төрлелекне һәм климат үзгәрешенең йогынтысын характерлау өчен идеаль табигый фильтр итә. Хуҗадан алынган ДНК фрагментларының булуы методның eDNA белән чагыштырганда чикләнүе буларак каралса да, eDNA белән чагыштырганда мондый натив ccfDNA булу белән бәйле чыгымнар сәламәтлек саклау тикшеренүләре өчен күп мәгълүмат күләме белән аңлашыла. офсет хуҗасы. Моңа хуҗа хуҗасының геномына интеграцияләнгән вирус эзлеклелеге керә. Бу, бигрәк тә, мидияләр өчен мөһим, чөнки ике капкачлыларда горизонталь рәвештә тапшырыла торган лейкемик ретровируслар бар [80, 81]. LB-ның eDNA белән чагыштырганда тагын бер өстенлеге шунда ки, ул гемолимфада кан әйләнеше күзәнәкләренең фагоцитар активлыгын файдалана, ул микроорганизмнарны (һәм аларның геномнарын) йота. Фагоцитоз - ике капкачлыларда кан күзәнәкләренең төп функциясе [82]. Ниһаять, метод мидияләрнең югары фильтрлау сәләтен (уртача 1,5 л/сәг диңгез суы) һәм ике көнлек кан әйләнешен куллана, бу диңгез суының төрле катламнары катнашмасын арттыра, гетерологик eDNAны тотарга мөмкинлек бирә. [83, 84]. Шулай итеп, мидияләрнең туклыклы, икътисади һәм әйләнә-тирә мохиткә йогынтысын исәпкә алганда, мидияләрнең ccfDNA анализы кызыклы юнәлеш булып тора. Кешеләрдән җыелган LB анализына охшаш, бу ысул шулай ук ​​экзоген матдәләргә җавап итеп хуҗа ДНКсындагы генетик һәм эпигенетик үзгәрешләрне үлчәү мөмкинлеген ача. Мәсәлән, нанопоралы секвенирлау ярдәмендә табигый ccfDNAда геном буенча метиллашу анализын үткәрү өчен өченче буын секвенирлау технологияләрен күз алдына китерергә мөмкин. Бу процессны мидия ccfDNA фрагментларының озынлыгы озын укулы секвенирлау платформалары белән идеаль рәвештә туры килүе белән җиңеләйтергә кирәк, алар химик трансформацияләргә мохтаҗлыксыз бер секвенирлау агымыннан геном буенча ДНК метиллашу анализын үткәрергә мөмкинлек бирә.85,86] Бу кызыклы мөмкинлек, чөнки ДНК метиллашу үрнәкләренең әйләнә-тирә мохит стрессына җавапны чагылдыруы һәм күп буыннар дәвамында саклануы күрсәтелгән. Шуңа күрә ул климат үзгәрүенә яки пычраткыч матдәләргә дучар булганнан соң җавапны көйләүче төп механизмнар турында кыйммәтле мәгълүмат бирә ала [87]. Ләкин LB куллану чикләүләрсез түгел. Әлбәттә, моның өчен экосистемада индикатор төрләренең булуы кирәк. Югарыда әйтелгәнчә, билгеле бер экосистеманың биологик төрлелеген бәяләү өчен LB куллану шулай ук ​​чыганактан ДНК фрагментлары булуын исәпкә алучы катгый биоинформатика конвейерын таләп итә. Тагын бер зур проблема - диңгез төрләре өчен эталон геномнарның булуы. Диңгез имезүчеләре геномнары проекты һәм күптән түгел оештырылган Fish10k проекты [88] кебек башлангычлар киләчәктә мондый анализны җиңеләйтер дип өметләнәбез. LB концепциясен диңгез фильтрлары белән тукланучы организмнарга куллану шулай ук ​​секвенирлау технологиясендәге соңгы казанышлар белән туры килә, бу аны әйләнә-тирә мохит стрессына җавап итеп диңгез яшәү урыннарының сәламәтлеге турында мөһим мәгълүмат бирү өчен күп омлы биомаркерлар эшләү өчен бик уңайлы итә.
Геном секвенирлавы мәгълүматлары NCBI секвенирлавы архивында https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 адресы буенча Bioprojects SRR8924808 бүлегендә сакланган.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Дж. Климат үзгәрешенең диңгез тереклегенә һәм экосистемаларына йогынтысы. Коул Биология. 2009; 19: P602–P614.
Гисси Э, Манеа Э, Мазарис А.Д., Фраскетти С, Альпаниду В, Бевилакуа С һ.б. Климат үзгәрешенең һәм башка җирле стресс факторларының диңгез мохитенә берләшкән йогынтысын карап чыгыгыз. гомуми фәнни мохит. 2021;755:142564.
Карелла Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П һ.б. ). Беренче март фәне. 2020; 7: 48.
Серонт Л, Никастро КР, Зарди Г.И., Гобервилл Э. Кабатланучы җылылык стрессы шартларында җылылыкка чыдамлылыкның кимүе зәңгәр мидияләрнең җәйге үлеменең югары булуын аңлата. Фәнни отчет 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сиепиельски А.М., Нуссле С., Сервантес-Йошида К., Хван Дж.Л., Хубер Э.Р. һ.б. Хайваннар үлеменең ешлыгы, сәбәпләре һәм дәрәҗәсендәге соңгы үзгәрешләр. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Скарпа Ф, Санна Д, Аззена I, Мугетти Д, Серрути Ф, Хоссейни С һ.б. Төрле булмаган специфик патогеннар Пинна нобилисының күпләп үлеменә китерергә мөмкин. Тормыш. 2020; 10: 238.
Брэдли М, Куттс С.Дж., Дженкинс Э., О'Хара Т.М. Климат үзгәрешенең Арктика зооноз авыруларына потенциаль йогынтысы. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. һ.б. Зәңгәр мидияләр (Mytilus edulis spp.) яр буендагы пычрану мониторингында сигнал организмнары буларак: күзәтү. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравенья Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Сыек биопсияне яман шешне дәвалауда куллану. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Дж.К.М., Масси К., Гарсия-Корбачо Дж., Мульер Ф., Брентон Дж.Д., Калдас К. һ.б. Сыек биопсия өлгерүе: шеш ДНКсының әйләнешенә мөмкинлек бирә. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метайс П. Кеше плазмасындагы нуклеин кислоталары. Soc Biol филиалларының очрашу протоколлары. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А.Дж., Унгерер В., Холденридер С. Яман шешне дәвалау өчен молекуляр маркер буларак күзәнәксез ДНКның яңа роле. Биомоляр анализның санлаштыруы. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Джеффри С.С. Сыек биопсия клиникага керә - гамәлгә ашыру мәсьәләләре һәм киләчәккә кагылышлы кыенлыклар. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент ИЛ, Редман К.В. һәм башкалар. Яралгы ДНКсы ананың плазмасында һәм сывороткасында бар. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Квейк С.Р. Йөклелек вакытында хатын-кызларның канында әйләнештә булган күзәнәктән тыш РНК кулланып, йөклелек барышын һәм аның өзлегүләрен өйрәнү. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеон П, Шютц Э, Бек Дж, Стегбауэр Дж һ.б. Сыек биопсия: бөер трансплантатында аллоген җәрәхәтләрне ачыклау өчен донор күзәнәксез ДНК кулланыла. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Пренаталь диагностикада инновацияләр: ана плазмасы геномын секвенирлау. Анна М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В, Дэн Х, Ли М, Суку ЙД, Аревало С, Страйк Д һ.б. Инфекцияләнгән тән сыеклыкларын киләсе буын метагеномик секвенирлау белән патогеннарны тиз ачыклау. Nat Medicine. 2021;27:115-24.