Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A folyékony biopszia (LB) egy olyan koncepció, amely gyorsan népszerűvé válik a biomedicinális területen. A koncepció főként a keringő extracelluláris DNS (ccfDNS) fragmentumainak kimutatásán alapul, amelyek főként kis fragmentumokként szabadulnak fel a sejtek pusztulása után különböző szövetekben. Ezen fragmentumok kis része idegen (idegen) szövetekből vagy organizmusokból származik. Jelenlegi munkánkban ezt a koncepciót kagylókra alkalmaztuk, egy őrszemfajra, amely magas tengervíz-szűrő képességéről ismert. A kagylók természetes szűrőként való működésének képességét használjuk ki arra, hogy környezeti DNS-fragmentumokat rögzítsünk különféle forrásokból, és így információkat szolgáltassunk a tengeri part menti ökoszisztémák biológiai sokféleségéről. Eredményeink azt mutatják, hogy a kagyló hemolimfája olyan DNS-fragmentumokat tartalmaz, amelyek mérete nagymértékben változik, 1-től 5 kb-ig. A sörétes szekvenálás kimutatta, hogy nagyszámú DNS-fragmentum idegen mikrobiális eredetű. Közöttük baktériumokból, archeákból és vírusokból származó DNS-fragmentumokat találtunk, beleértve azokat a vírusokat is, amelyekről ismert, hogy a part menti tengeri ökoszisztémákban gyakran előforduló gazdaszervezeteket fertőznek meg. Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy az LB koncepciójának alkalmazása a kagylókra gazdag, de eddig feltáratlan tudásforrást jelent a tengeri part menti ökoszisztémák mikrobiális sokféleségéről.
A klímaváltozás (KK) tengeri ökoszisztémák biológiai sokféleségére gyakorolt ​​hatása egy gyorsan növekvő kutatási terület. A globális felmelegedés nemcsak jelentős fiziológiai stresszt okoz, hanem a tengeri élőlények termikus stabilitásának evolúciós határait is kitolja, számos faj élőhelyét érintve, arra késztetve őket, hogy kedvezőbb feltételeket keressenek [1, 2]. A metazoánok biológiai sokféleségére gyakorolt ​​hatás mellett a KK felborítja a gazda-mikroba kölcsönhatások kényes egyensúlyát. Ez a mikrobiális diszbakteriózis komoly veszélyt jelent a tengeri ökoszisztémákra, mivel fogékonyabbá teszi a tengeri élőlényeket a fertőző kórokozókkal szemben [3, 4]. Úgy vélik, hogy a tengeri baktériumok fontos szerepet játszanak a tömeges pusztulásban, ami komoly problémát jelent a globális tengeri ökoszisztémák kezelése szempontjából [5, 6]. Ez egy fontos kérdés, tekintettel számos tengeri faj gazdasági, ökológiai és táplálkozási hatásaira. Ez különösen igaz a sarkvidékeken élő kagylókra, ahol a KK hatásai közvetlenebbek és súlyosabbak [6, 7]. Valójában a kagylókat, mint például a Mytilus spp., széles körben használják a KK tengeri ökoszisztémákra gyakorolt ​​hatásainak monitorozására. Nem meglepő módon viszonylag nagyszámú biomarkert fejlesztettek ki az egészségi állapotuk monitorozására, gyakran kétszintű megközelítést alkalmazva, amely enzimatikus aktivitáson vagy sejtfunkciókon, például sejtek életképességén és fagocita aktivitásán alapuló funkcionális biomarkereket foglal magában [8]. Ezek a módszerek magukban foglalják a specifikus nyomásindikátorok koncentrációjának mérését is, amelyek nagy mennyiségű tengervíz felszívódása után halmozódnak fel a lágy szövetekben. A kagylók nagy szűrőkapacitása és félig nyitott keringési rendszere azonban lehetőséget ad új hemolimfa biomarkerek kifejlesztésére a folyékony biopszia (LB) koncepciójának felhasználásával, amely egy egyszerű és minimálisan invazív megközelítés a betegellátásban. vérminták [9, 10]. Bár az emberi LB-ben többféle keringő molekula található, ez a koncepció elsősorban a plazmában keringő extracelluláris DNS (ccfDNS) fragmensek DNS-szekvenálási elemzésén alapul. Valójában a keringő DNS jelenléte az emberi plazmában a 20. század közepe óta ismert [11], de csak az utóbbi években a nagy áteresztőképességű szekvenálási módszerek megjelenése vezetett a ccfDNS-en alapuló klinikai diagnózishoz. Ezen keringő DNS-fragmensek jelenléte részben a genomiális DNS (nukleáris és mitokondriális) passzív felszabadulásának köszönhető a sejthalál után. Egészséges egyéneknél a ccfDNS koncentrációja normális esetben alacsony (<10 ng/ml), de különféle patológiákban szenvedő vagy stressznek kitett betegeknél 5-10-szeresére is megnőhet, ami szövetkárosodást okozhat. Egészséges egyéneknél a ccfDNS koncentrációja normális esetben alacsony (<10 ng/ml), de különféle patológiákban szenvedő vagy stressznek kitett betegeknél 5-10-szeresére is megnőhet, ami szövetkárosodást okozhat. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разнрация вккДНК в норме низкая патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Egészséges emberekben a cccDNS koncentrációja normális esetben alacsony (<10 ng/ml), de 5-10-szeresére is emelkedhet különféle patológiákkal küzdő betegeknél, vagy stressz hatására, ami szövetkárosodáshoz vezet.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍㼌从而寤致瀍㼌从而寤致瀍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 ng/ml)中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 працинто различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. A ccfDNS koncentrációja általában alacsony (<10 ng/ml) egészséges egyéneknél, de 5-10-szeresére emelkedhet különféle patológiákkal vagy stresszel küzdő betegeknél, ami szövetkárosodást eredményez.A ccfDNS fragmensek mérete széles skálán mozog, de általában 150 és 200 bp között mozog. [12]. A saját eredetű ccfDNS, azaz a normál vagy transzformált gazdasejtekből származó ccfDNS elemzése felhasználható a nukleáris és/vagy mitokondriális genomban jelen lévő genetikai és epigenetikai változások kimutatására, ezáltal segítve a klinikusokat a specifikus molekuláris célzott terápiák kiválasztásában [13]. A ccfDNS azonban idegen forrásokból is nyerhető, például magzati sejtekből származó ccfDNS-ből terhesség alatt vagy átültetett szervekből [14,15,16,17]. A ccfDNS fontos információforrás a fertőző ágensek (idegen) nukleinsavainak jelenlétének kimutatásában is, ami lehetővé teszi a vérkultúrák által nem azonosított széles körben elterjedt fertőzések non-invazív kimutatását, elkerülve a fertőzött szövet invazív biopsziáját [18]. A legújabb tanulmányok valóban kimutatták, hogy az emberi vér gazdag információforrást tartalmaz, amely felhasználható vírusos és bakteriális kórokozók azonosítására, és hogy az emberi plazmában található ccfDNS körülbelül 1%-a idegen eredetű [19]. Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy egy szervezet keringő mikrobiomjának biodiverzitása ccfDNS-analízissel értékelhető. Azonban egészen a közelmúltig ezt a koncepciót kizárólag embereknél, és kisebb mértékben más gerinceseknél használták [20, 21].
Jelen tanulmányban az LB-potenciált használjuk az Aulacomya atra ccfDNS-ének elemzésére, amely egy déli faj, és gyakran előfordul a szubantarktiszi Kerguelen-szigeteken, egy nagy fennsík tetején található szigetcsoporton, amely 35 millió évvel ezelőtt alakult ki egy vulkánkitörés során. Egy in vitro kísérleti rendszer segítségével azt tapasztaltuk, hogy a tengervízben lévő DNS-fragmenseket a kagylók gyorsan felveszik, és bejutnak a hemolimfa rekeszbe. Sörétes puskás szekvenálás kimutatta, hogy a kagyló hemolimfa ccfDNS-e saját és nem saját eredetű DNS-fragmenseket tartalmaz, beleértve a szimbiotikus baktériumokat és a hideg vulkanikus tengeri part menti ökoszisztémákra jellemző biomokból származó DNS-fragmenseket. A hemolimfa ccfDNS különböző gazdaszervezetekből származó vírusszekvenciákat is tartalmaz. Többsejtű állatokból, például csontos halakból, tengeri rózsákból, algákból és rovarokból származó DNS-fragmenseket is találtunk. Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy az LB-koncepció sikeresen alkalmazható tengeri gerinctelenekre, gazdag genomiális repertoár létrehozása érdekében a tengeri ökoszisztémákban.
2018 decemberében Port-au-France (049°21.235 D, 070°13.490 K) árapály menti sziklás partjainál gyűjtöttek kifejlett Mytilus platensis (M. platensis) és Aulacomya atra (A. atra) egyedeket. Más kifejlett kékkagylókat (Mytilus spp.) egy kereskedelmi beszállítótól (PEI Mussel King Inc., Prince Edward-sziget, Kanada) szereztek be, és egy 10–20 liter 32‰-os mesterséges sóoldatot (mesterséges tengeri só, Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) tartalmazó, szabályozott hőmérsékletű (4°C) levegőztetett tartályba helyeztek. Minden kísérlethez megmérték az egyes héjak hosszát és súlyát.
A programhoz egy ingyenes, nyílt hozzáférésű protokoll érhető el online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Röviden, az LB hemolimfát az abduktor izmokból gyűjtöttük a leírtak szerint [22]. A hemolimfát 1200×g-vel 3 percig centrifugálással tisztítottuk, a felülúszót felhasználásig lefagyasztottuk (-20°C). A cfDNS izolálásához és tisztításához a mintákat (1,5-2,0 ml) felolvasztottuk és a NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segítségével dolgoztuk fel a gyártó utasításai szerint. A ccfDNS-t -80°C-on tároltuk a további elemzésig. Néhány kísérletben a ccfDNS-t a QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) segítségével izoláltuk és tisztítottuk. A tisztított DNS-t standard PicoGreen assay-vel kvantifikáltuk. Az izolált ccfDNS fragmentumeloszlását kapilláris elektroforézissel elemeztük Agilent 2100 bioanalizátor (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) és nagy érzékenységű DNS-készlet alkalmazásával. A vizsgálatot 1 µl ccfDNS-mintával végeztük a gyártó utasításai szerint.
A hemolimfa ccfDNS fragmensek szekvenálásához a Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) shotgun könyvtárakat készített az Illumina MiSeq PE75 készlet Illumina DNA Mix készletének felhasználásával. Standard adaptert (BioO) használtak. A nyers adatfájlok az NCBI Sequence Read Archive-ból (SRR8924808 és SRR8924809) érhetők el. Az alapvető leolvasási minőséget FastQC [23] segítségével értékelték. A Trimmomatic [24] programot használták az adapterek vágása és a gyenge minőségű leolvasások esetén. A párosított végű shotgun leolvasásokat FLASH módon egyesítették hosszabb, egyetlen leolvasássá, legalább 20 bp átfedéssel, hogy elkerüljék az eltéréseket [25]. Az egyesített leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk egy kéthéjú NCBI taxonómiai adatbázis felhasználásával (e-érték < 1e−3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciák maszkolását pedig DUST [26] segítségével végeztük. Az egyesített leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk egy kéthéjú NCBI taxonómiai adatbázis felhasználásával (e-érték < 1e−3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciák maszkolását pedig DUST [26] segítségével végeztük. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуствы NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнениено с POR [26]. Az összegyűjtött leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk az NCBI kéthéjú taxonómiai adatbázis felhasználásával (e-érték < 1e-3 és 90%-os homológia), és alacsony komplexitású szekvenciamaszkolást végeztünk DUST [26] segítségével.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数 [使类数并的读数]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннутворхчств даннытых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 és 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности былне выспологии использованием DUST [26]. Az összegyűjtött leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk az NCBI kéthéjú taxonómiai adatbázis felhasználásával (e-érték <1e-3 és 90%-os homológia), és alacsony komplexitású szekvenciamaszkolást végeztünk DUST [26] segítségével.A leolvasásokat két csoportra osztottuk: a kagylószekvenciákhoz kapcsolódókra (itt önleolvasásoknak nevezzük) és nem kapcsolódókra (nem önleolvasásoknak). Két csoportot külön-külön állítottunk össze a MEGAHIT segítségével kontigok létrehozásához [27]. Eközben az idegen mikrobiom leolvasások taxonómiai eloszlását a Kraken2 [28] segítségével osztályoztuk, és grafikusan ábrázoltuk egy Krona kördiagrammal a Galaxy [29, 30] készüléken. Az optimális kmer értéket az előzetes kísérleteink alapján kmer-59-nek határoztuk meg. Az önkontigeket ezután a BLASTN-nel (kagyló NCBI adatbázis, e-érték <1e−10 és 60%-os homológia) való összehangolással azonosítottuk a végső annotációhoz. Az önkontigeket ezután a BLASTN-nel (kagyló NCBI adatbázis, e-érték <1e−10 és 60%-os homológia) való összehangolással azonosítottuk a végső annotációhoz. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двустволючатыNC значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Az önkontigokat ezután a BLASTN-nel (NCBI kagyló adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia) való összehasonlítással azonosítottuk a végső annotációhoz.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Az önkontigokat ezután a végső annotációhoz azonosítottuk a BLASTN-nel (NCBI kagyló adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia) való összehasonlítással. Ezzel párhuzamosan a nem önálló csoportkontigokat BLASTN-nel (nt NCBI adatbázis, e-érték < 1e−10 és 60%-os homológia) annotáltuk. Ezzel párhuzamosan a nem önálló csoportkontigokat BLASTN-nel (nt NCBI adatbázis, e-érték < 1e−10 és 60%-os homológia) annotáltuk. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt лигимо0, значениея 60%). Ezzel párhuzamosan az idegen csoportkontigokat BLASTN-nel (NT NCBI adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia) annotáltuk.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠用平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠用 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннчхе <1e-10 és гомология 60%). Ezzel párhuzamosan a nem önálló csoportkontigokat BLASTN-nel annotáltuk (nt NCBI adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia). A BLASTX-et nem önálló kontigokon is elvégezték az nr és RefSeq protein NCBI adatbázisok felhasználásával (e-érték < 1e−10 és 60%-os homológia). A BLASTX-et nem önálló kontigokon is elvégezték az nr és RefSeq protein NCBI adatbázisok felhasználásával (e-érték < 1e−10 és 60%-os homológia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знаeч1e) гомология 60%). A BLASTX-et nem-önmagán kontigokon is elvégeztük az nr és a RefSeq NCBI fehérjeadatbázisok felhasználásával (e-érték < 1e-10 és 60%-os homológia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 源 傌源 傌源 傌 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 源 傌源 傌源 傌 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значени-10 игиго NCBI (значени-1) 60%). A BLASTX vizsgálatot nem-önmag kontigokon is elvégeztük az nr és a RefSeq NCBI fehérjeadatbázisok felhasználásával (e-érték <1e-10 és 60%-os homológia).A nem önkontigok BLASTN és BLASTX csoportjai a végső kontigokat képviselik (lásd a kiegészítő fájlt).
A PCR-hez használt primerek felsorolása az S1. táblázatban található. A ccfDNS célgének amplifikálásához Taq DNS polimerázt (Bio Basic Canada, Markham, ON) használtunk. A következő reakciókörülményeket alkalmaztuk: denaturáció 95°C-on 3 percig, 95°C-on 1 percig, beállított hőkezelési hőmérséklet 1 percig, elongáció 72°C-on 1 percig, 35 ciklus, és végül 72°C 10 percen belül. A PCR-termékeket SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) tartalmazó agaróz gélben (1,5%), 95 V feszültségen elektroforézissel választottuk el.
A kagylókat (Mytilus spp.) 500 ml oxigénes tengervízben (32 PSU) akklimatizáltuk 24 órán át 4°C-on. A humán galektin-7 cDNS szekvenciát kódoló inszertet tartalmazó plazmid DNS-t (NCBI hozzáférési szám: L07769) adtuk az üvegcsébe 190 μg/μl végkoncentrációban. Kontrollként DNS hozzáadása nélkül, azonos körülmények között inkubált kagylók szolgáltak. A harmadik kontrolltartály kagyló nélküli DNS-t tartalmazott. A tengervízben lévő DNS minőségének monitorozására a megadott időpontokban tengervízmintákat (20 μl; három ismétlés) vettünk minden tartályból. A plazmid DNS nyomon követhetősége érdekében az LB kagylókat a megadott időpontokban begyűjtöttük, és qPCR és ddPCR segítségével elemeztük. A tengervíz magas sótartalma miatt az alikvotokat PCR minőségű vízzel (1:10 arányban) hígítottuk minden PCR vizsgálat előtt.
A digitális csepp PCR-t (ddPCR) a BioRad QX200 protokollal (Mississauga, Ontario, Kanada) végeztük. Az optimális hőmérséklet meghatározásához a hőmérsékleti profilt használtuk (S1. táblázat). A cseppeket QX200 cseppgenerátorral (BioRad) állítottuk elő. A ddPCR-t a következőképpen végeztük: 95°C 5 percig, 50 ciklus 95°C-on 30 másodpercig és adott hőkezelési hőmérsékleten 1 percig, majd 72°C-on 30 másodpercig, 4°C-on 5 percig és 90°C-on 5 percen belül. A cseppek számát és a pozitív reakciókat (kópiaszám/µl) QX200 cseppleolvasóval (BioRad) mértük. A 10 000 cseppnél kevesebb mintát tartalmazó mintákat elutasítottuk. Mintázatkontrollt nem végeztünk minden alkalommal, amikor a ddPCR-t futtattuk.
A qPCR-t Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ausztrália) készülékkel és LGALS7 specifikus primerekkel végeztük. Minden kvantitatív PCR-t 20 µl-ben, QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) felhasználásával végeztünk. A qPCR-t 15 perces inkubációval indítottuk 95°C-on, majd 40 ciklussal 95°C-on 10 másodpercig és 60°C-on 60 másodpercig, egyetlen adatgyűjtéssel. Az olvadási görbéket egymást követő mérésekkel generáltuk 95°C-on 5 másodpercig, 65°C-on 60 másodpercig és a qPCR végén 97°C-on. Minden qPCR-t háromszor végeztünk, kivéve a kontrollmintákat.
Mivel a kagylók magas szűrési sebességükről ismertek, először azt vizsgáltuk, hogy képesek-e szűrni és visszatartani a tengervízben található DNS-fragmentumokat. Az is érdekelt minket, hogy ezek a fragmensek felhalmozódnak-e a félig nyitott nyirokrendszerükben. Ezt a problémát kísérletileg oldottuk meg, a kékkagyló-tartályokhoz adott oldható DNS-fragmentumok sorsát követve. A DNS-fragmentumok nyomon követésének megkönnyítése érdekében idegen (nem saját) plazmid DNS-t használtunk, amely az emberi galektin-7 gént tartalmazza. A ddPCR plazmid DNS-fragmentumokat követ nyomon tengervízben és kagylókban. Eredményeink azt mutatják, hogy ha a tengervízben lévő DNS-fragmentumok mennyisége kagylók hiányában idővel viszonylag állandó maradt (akár 7 napig), akkor kagylók jelenlétében ez a szint 8 órán belül szinte teljesen eltűnt (1a.,b. ábra). Az exogén DNS-fragmentumokat 15 percen belül könnyen ki lehetett mutatni az intravalvuláris folyadékban és a hemolimfában (1c. ábra). Ezek a fragmensek az expozíció után akár 4 órával is kimutathatók voltak. Ez a DNS-fragmentumokra vonatkozó szűrőaktivitás összehasonlítható a baktériumok és algák szűrőaktivitásával [31]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kagylók képesek szűrni és felhalmozni az idegen DNS-t a folyadékrekeszeikben.
A plazmid DNS relatív koncentrációi tengervízben kagylók jelenlétében (A) vagy hiányában (B), ddPCR-rel mérve. Az A-ban az eredményeket százalékban fejezzük ki, a dobozok szegélyei a 75. és 25. percentilist jelölik. Az illesztett logaritmikus görbe pirossal látható, a szürkeárnyalatos terület a 95%-os konfidenciaintervallumot jelöli. A B-ben a piros vonal az átlagot, a kék vonal pedig a koncentráció 95%-os konfidenciaintervallumát jelöli. C A plazmid DNS felhalmozódása a kagylók hemolimfájában és billentyűfolyadékában a plazmid DNS hozzáadása utáni különböző időpontokban. Az eredményeket abszolút detektált kópiák/ml (±SE) formában adjuk meg.
Ezután megvizsgáltuk a ccfDNS eredetét a Kerguelen-szigetek kagylótelepeiről gyűjtött kagylókban. A szigetek egy távoli, korlátozott antropogén befolyással rendelkező szigetcsoport. Ebből a célból a kagyló hemolimfáiból származó cccDNS-t izoláltuk és tisztítottuk az emberi cccDNS tisztítására általánosan használt módszerekkel [32, 33]. Azt tapasztaltuk, hogy a hemolimfa ccfDNS átlagos koncentrációja a kagylókban az alacsony mikrogramm/ml hemolimfa tartományban van (lásd az S2. táblázatot, Kiegészítő információk). Ez a koncentrációtartomány sokkal nagyobb, mint az egészséges embereknél (alacsony nanogramm/milliliter), de ritka esetekben, rákos betegeknél, a ccfDNS szintje elérheti a több mikrogrammot/millilitert [34, 35]. A hemolimfa ccfDNS méreteloszlásának elemzése azt mutatta, hogy ezek a fragmensek mérete nagymértékben változik, 1000 bp-tól 1000 bp-ig, egészen 5000 bp-ig terjedhet (2. ábra). Hasonló eredményeket kaptak a szilícium-dioxid-alapú QIAamp Investigator Kit használatával is, amely egy olyan módszer, amelyet általánosan használnak a törvényszéki tudományokban a genomiális DNS gyors izolálására és tisztítására alacsony koncentrációjú DNS-mintákból, beleértve a ccfDNS-t is [36].
Kagyló hemolimfa reprezentatív ccfDNS elektroforegramja. NucleoSnap Plasma Kittel (felül) és QIAamp DNA Investigator Kittel extrahálva. B Hegedűdiagram, amely a hemolimfa ccfDNS koncentrációjának (±SE) eloszlását mutatja kagylókban. A fekete és piros vonalak a mediánt, illetve az első és harmadik kvartilist jelölik.
Az emberekben és a főemlősökben található ccfDNS körülbelül 1%-a idegen forrásból származik [21, 37]. Tekintettel a kagylók félig nyitott keringési rendszerére, a mikrobákban gazdag tengervízre és a kagyló ccfDNS méreteloszlására, azt feltételeztük, hogy a kagyló hemolimfa ccfDNS gazdag és változatos mikrobiális DNS-készletet tartalmazhat. E hipotézis teszteléséhez a Kerguelen-szigetekről gyűjtött Aulacomya atra minták hemolimfa ccfDNS-ét szekvenáltuk, több mint 10 millió leolvasást kapva, amelyek 97,6%-a megfelelt a minőségellenőrzésen. A leolvasásokat ezután saját és nem saját források szerint osztályoztuk a BLASTN és az NCBI kagylóadatbázisok segítségével (S1. ábra, Kiegészítő információk).
Emberben mind a nukleáris, mind a mitokondriális DNS bekerülhet a véráramba [38]. A jelenlegi tanulmányban azonban nem volt lehetséges részletesen leírni a kagylók nukleáris genomiális DNS-ét, mivel az A. atra genomját még nem szekvenálták vagy írták le. A kagylókönyvtár segítségével azonban számos saját eredetű ccfDNS-fragmentumot azonosítottunk (S2. ábra, Kiegészítő információk). A saját eredetű DNS-fragmentumok jelenlétét a szekvenált A. atra gének irányított PCR-amplifikációjával is megerősítettük (3. ábra). Hasonlóképpen, mivel az A. atra mitokondriális genomja nyilvános adatbázisokban elérhető, bizonyítékot találhatunk a mitokondriális ccfDNS-fragmentumok jelenlétére az A. atra hemolimfájában. A mitokondriális DNS-fragmentumok jelenlétét PCR-amplifikációval igazoltuk (3. ábra).
Különböző mitokondriális gének voltak jelen az A. atra (piros pontok – törzsszám: SRX5705969) és az M. platensis (kék pontok – törzsszám: SRX5705968) hemolimfájában, melyeket PCR-rel amplifikáltak. Az ábra Breton et al., 2011 alapján adaptálva. B Az A. atra hemolimfa felülúszójának amplifikációja FTA papíron tárolva. 3 mm-es lyukasztóval közvetlenül a PCR keveréket tartalmazó PCR csőbe adagolva.
Tekintettel a tengervíz bőséges mikrobiális tartalmára, kezdetben a hemolimfában található mikrobiális DNS-szekvenciák jellemzésére összpontosítottunk. Ehhez két különböző stratégiát alkalmaztunk. Az első stratégia a Kraken2-t használta, egy algoritmus-alapú szekvenciaosztályozó programot, amely a BLAST-hez és más eszközökhöz hasonló pontossággal képes azonosítani a mikrobiális szekvenciákat [28]. Több mint 6719 leolvasás bakteriális eredetűnek bizonyult, míg 124, illetve 64 archeából, illetve vírusból származott (4. ábra). A leggyakoribb bakteriális DNS-fragmensek a Firmicutes (46%), a Proteobacteria (27%) és a Bacteroidetes (17%) voltak (4a. ábra). Ez az eloszlás összhangban van a tengeri kékkagyló mikrobiomjának korábbi vizsgálataival [39, 40]. A gammaproteobaktériumok alkották a Proteobacteriumok fő osztályát (44%), beleértve számos Vibrionales-t (4b. ábra). A ddPCR módszer megerősítette a Vibrio DNS-fragmensek jelenlétét az A. atra hemolimfa ccfDNS-ében (4c. ábra) [41]. A ccfDNS bakteriális eredetével kapcsolatos további információk megszerzése érdekében további megközelítést alkalmaztunk (S2. ábra, Kiegészítő információk). Ebben az esetben az átfedésben lévő leolvasásokat párosított végű leolvasásokként állítottuk össze, és BLASTN és 1e−3 e-érték, valamint >90%-os homológiával rendelkező határérték alapján saját (kagylók) vagy nem saját eredetűként osztályoztuk. Ebben az esetben az átfedésben lévő leolvasásokat párosított végű leolvasásokként állítottuk össze, és BLASTN és 1e−3 e-érték, valamint >90%-os homológiával rendelkező határérték alapján saját (kagylók) vagy nem saját eredetűként osztályoztuk. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиронвацоныка (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечечеюсески homologia > 90%. Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat párosított leolvasásként gyűjtöttük össze, és BLASTN és 1e-3 e-érték, valamint >90%-os homológiával rendelkező határérték alapján natívnak (kagyló) vagy nem eredetinek minősítettük.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的和>90%和 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 璚1ne 用 使用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифибцирокныныны (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и полюски и поллюски homologia> 90%. Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat párosított leolvasásként gyűjtöttük össze, és sajátként (kagylók) vagy nem eredetiként osztályoztuk e BLASTN és 1e-3 értékek, valamint >90%-os homológia küszöbérték felhasználásával.Mivel az A. atra genomját még nem szekvenálták, a MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler de novo összeszerelési stratégiáját alkalmaztuk. Összesen 147 188 kontiget azonosítottunk származási függőként (kagylóként). Ezeket a kontiget ezután BLASTN és BLASTX segítségével 1e-10 e-értékekkel bontottuk fel. Ez a stratégia lehetővé tette számunkra, hogy 482 nem kagylóeredetű fragmenst azonosítsunk az A. atra ccfDNS-ében. Ezen DNS-fragmensek több mint felét (57%-át) baktériumokból nyertük, főként kopoltyúszimbiónákból, beleértve a szulfotróf szimbiontákat is, és a Solemya velum kopoltyúszimbiónákból (5. ábra).
Relatív abundancia típusszinten. B Két fő törzs (Firmicutes és Proteobacteria) mikrobiális diverzitása. A ddPCR reprezentatív amplifikációja C Vibrio spp. A. A 16S rRNA gén fragmentumai (kék) három atra hemolimfában.
Összesen 482 gyűjtött kontiget elemeztek. A metagenomikus kontig annotációk taxonómiai eloszlásának általános profilja (prokarióták és eukarióták). B A BLASTN és BLASTX segítségével azonosított bakteriális DNS-fragmensek részletes eloszlása.
A Kraken2 elemzés azt is kimutatta, hogy a kagyló ccfDNS-e archeális DNS-fragmenseket tartalmazott, beleértve az Euryarchaeota (65%), a Crenarchaeota (24%) és a Thaurmarcheota (11%) DNS-fragmenseit (6a. ábra). Az Euryarchaeota és Crenarchaeota eredetű DNS-fragmensek jelenléte, amelyeket korábban a kaliforniai kagylók mikrobiális közösségében találtak, nem meglepő [42]. Bár az Euryarchaeota gyakran extrém körülményekhez kapcsolódik, ma már elismert tény, hogy mind az Euryarchaeota, mind a Crenarcheota a leggyakoribb prokarióták közé tartozik a tengeri kriogén környezetben [43, 44]. A metanogén mikroorganizmusok jelenléte a kagylókban nem meglepő, tekintve a Kerguelen-fennsíkon található fenékszivárgásokból származó kiterjedt metánszivárgásokról szóló közelmúltbeli jelentéseket [45], valamint a Kerguelen-szigetek partjainál megfigyelt lehetséges mikrobiális metántermelést [46].
Figyelmünk ezután a DNS-vírusok leolvasására irányult. Tudomásunk szerint ez az első, a kagylók vírustartalmát vizsgáló, nem célzott vizsgálat. Ahogy az várható volt, bakteriofágok (Caudovirales) DNS-fragmenseit találtuk (6b. ábra). A leggyakoribb vírus DNS azonban a nukleocitovírusok egy törzséből származik, más néven a nukleáris citoplazmatikus nagy DNS-vírusból (NCLDV), amely a vírusok közül a legnagyobb genommal rendelkezik. Ezen a törzsön belül a legtöbb DNS-szekvencia a Mimimidoviridae (58%) és a Poxviridae (21%) családokhoz tartozik, amelyek természetes gazdái közé tartoznak a gerincesek és az ízeltlábúak, míg ezen DNS-szekvenciák kis része ismert virológiai algákhoz tartozik. Tengeri eukarióta algákat fertőz meg. A szekvenciákat a Pandora vírusból is nyertük, amely az összes ismert vírusnemzetség közül a legnagyobb genomméretű óriásvírus. Érdekes módon a hemolimfa ccfDNS-szekvenálással meghatározott, a vírussal fertőzött gazdaszervezetek köre viszonylag nagy volt (S3. ábra, Kiegészítő információk). Ide tartoznak olyan vírusok, amelyek rovarokat, például a Baculoviridae és az Iridoviridae fajokat fertőznek meg, valamint amőbákat, algákat és gerinceseket fertőző vírusok is. Találtunk a Pithovirus sibericum genomjával megegyező szekvenciákat is. A pitovírusokat (más néven „zombivírusokat”) először 30 000 éves szibériai permafrosztból izolálták [47]. Így eredményeink összhangban vannak a korábbi jelentésekkel, amelyek azt mutatták, hogy nem minden modern faj halt ki ezekből a vírusokból [48], és hogy ezek a vírusok távoli szubarktikus tengeri ökoszisztémákban is jelen lehetnek.
Végül teszteltük, hogy találunk-e más többsejtű állatokból származó DNS-fragmentumokat. Összesen 482 idegen kontiget azonosítottunk a BLASTN és a BLASTX segítségével nt, nr és RefSeq könyvtárak (genomikai és fehérje) segítségével. Eredményeink azt mutatják, hogy a többsejtű állatok ccfDNS-ének idegen fragmentumai között a csontos csontok DNS-e dominál (5. ábra). Rovarokból és más fajokból származó DNS-fragmentumokat is találtunk. A DNS-fragmentumok viszonylag nagy részét nem azonosítottuk, valószínűleg a szárazföldi fajokhoz képest nagyszámú tengeri faj alulreprezentáltsága miatt a genomikai adatbázisokban [49].
Jelen tanulmányunkban az LB koncepciót alkalmazzuk kagylókra, azzal érvelve, hogy a hemolimfa ccfDNS szekvenálása betekintést nyújthat a tengeri part menti ökoszisztémák összetételébe. Különösen azt találtuk, hogy 1) a kagyló hemolimfája viszonylag nagy koncentrációban (mikrogramm szinten) tartalmaz viszonylag nagy (~1-5 kb) keringő DNS-fragmentumokat; 2) ezek a DNS-fragmentumok függetlenek és nem függetlenek is lehetnek; 3) Ezen DNS-fragmentumok idegen forrásai között bakteriális, archaeális és vírusos DNS-t, valamint más többsejtű állatok DNS-ét is találtunk; 4) Ezen idegen ccfDNS-fragmentumok felhalmozódása a hemolimfában gyorsan bekövetkezik, és hozzájárul a kagylók belső szűrőtevékenységéhez. Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy az LB koncepció, amelyet eddig főként a biomedicina területén alkalmaztak, gazdag, de feltáratlan tudásforrást rejt, amely felhasználható a sentinel fajok és környezetük közötti kölcsönhatás jobb megértésére.
A főemlősök mellett emlősökben, köztük egerekben, kutyákban, macskákban és lovakban is kimutatták a ccfDNS izolálását [50, 51, 52]. Tudomásunk szerint azonban ez a tanulmány az első, amely nyílt keringési rendszerrel rendelkező tengeri fajokban számolt be a ccfDNS kimutatásáról és szekvenálására. A kagylók ezen anatómiai jellemzője és szűrőképessége legalább részben magyarázhatja a keringő DNS-fragmensek eltérő méretjellemzőit más fajokhoz képest. Emberben a vérben keringő DNS-fragmensek többsége kis méretű, 150 és 200 bp közötti méretű, a maximális csúcs 167 bp [34, 53]. A DNS-fragmensek kis, de jelentős része 300 és 500 bp közötti méretű, és körülbelül 5%-uk hosszabb, mint 900 bp [54]. Ennek a méreteloszlásnak az az oka, hogy a ccfDNS fő forrása a plazmában sejthalál eredményeként fordul elő, akár sejthalál, akár a keringő hematopoietikus sejtek nekrózisa miatt egészséges egyénekben, akár a tumorsejtek apoptózisa miatt rákos betegekben (más néven keringő tumor DNS). , ctDNS). A kagylókban talált hemolimfa ccfDNS méreteloszlása ​​1000 és 5000 bp között mozgott, ami arra utal, hogy a kagyló ccfDNS-e más eredetű. Ez egy logikus hipotézis, mivel a kagylók félig nyitott érrendszerrel rendelkeznek, és olyan tengeri vízi környezetben élnek, amely nagy koncentrációban tartalmaz mikrobiális genomiális DNS-t. Valójában exogén DNS-sel végzett laboratóriumi kísérleteink kimutatták, hogy a kagylók DNS-fragmenseket halmoznak fel a tengervízben, legalább néhány óra elteltével a sejtekbe történő felvétel után lebomlanak és/vagy felszabadulnak és/vagy különböző szervezetekben tárolódnak. A sejtek ritkasága (mind a prokarióta, mind az eukarióta) miatt az intravalvuláris rekeszek használata csökkenti a saját forrásból, valamint az idegen forrásból származó ccfDNS mennyiségét. Figyelembe véve a kagylók veleszületett immunitásának fontosságát és a keringő fagociták nagy számát, továbbá azt a hipotézist állítottuk fel, hogy még az idegen ccfDNS is feldúsul a keringő fagocitákban, amelyek idegen DNS-t halmoznak fel mikroorganizmusok és/vagy sejtes törmelékek lenyelésekor. Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a kagylók hemolimfa ccfDNS-e a molekuláris információk egyedülálló tárháza, és megerősíti őrszemfaj státuszát.
Adataink azt mutatják, hogy a baktériumokból származó hemolimfa ccfDNS-fragmensek szekvenálása és elemzése kulcsfontosságú információkkal szolgálhat a gazda baktériumflóráról és a környező tengeri ökoszisztémában jelen lévő baktériumokról. A shot szekvenálási technikák feltárták a kommenzális baktérium A. atra kopoltyújának olyan szekvenciáit, amelyek a hagyományos 16S rRNA azonosítási módszerek alkalmazása esetén – részben a referenciakönyvtárak torzítása miatt – elmaradtak volna. Valójában a Kerguelenben található, ugyanabban a kagylórétegben található M. platensisből gyűjtött LB-adatok felhasználása azt mutatta, hogy a kopoltyúhoz kapcsolódó bakteriális szimbionták összetétele mindkét kagylófaj esetében azonos volt (S4. ábra, Kiegészítő információk). Két genetikailag eltérő kagyló hasonlósága tükrözheti a baktériumközösségek összetételét Kerguelen hideg, kénes és vulkanikus üledékeiben [55, 56, 57, 58]. A kéncsökkentő mikroorganizmusok magasabb szintjét jól leírták a kagylók bioturbált part menti területekről, például Port-au-France partjairól történő betakarításakor [59]. Egy másik lehetőség, hogy a kommenzális kagylóflórát befolyásolhatja a horizontális átvitel [60, 61]. További kutatásokra van szükség a tengeri környezet, a tengerfenék felszíne és a kagylókban élő szimbiotikus baktériumok összetétele közötti összefüggés meghatározásához. Ezek a vizsgálatok jelenleg folyamatban vannak.
A hemolimfa ccfDNS hossza és koncentrációja, könnyű tisztítása és a gyors sörétes szekvenálást lehetővé tevő magas minősége a kagyló ccfDNS használatának számos előnye közül néhány a tengeri part menti ökoszisztémák biológiai sokféleségének felmérésére. Ez a megközelítés különösen hatékony egy adott ökoszisztéma vírusközösségeinek (virómáinak) jellemzésére [62, 63]. A baktériumokkal, archeákkal és eukariótákkal ellentétben a vírusgenomok nem tartalmaznak filogenetikailag konzervált géneket, például 16S szekvenciákat. Eredményeink azt mutatják, hogy az indikátorfajokból, például a kagylókból vett folyékony biopsziák felhasználhatók a part menti tengeri ökoszisztémákban jellemzően élő gazdaszervezeteket megfertőző ccfDNS vírusfragmensek viszonylag nagyszámú ccfDNS vírusfragmens azonosítására. Ide tartoznak a protozoonokat, ízeltlábúakat, rovarokat, növényeket és bakteriális vírusokat (pl. bakteriofágokat) megfertőző vírusok. Hasonló eloszlást találtunk, amikor Kerguelenben ugyanabban a kagylórétegben gyűjtött kékkagyló (M. platensis) hemolimfa ccfDNS virómját vizsgáltuk (S2. táblázat, Kiegészítő információk). A ccfDNS sörétes puskával történő szekvenálása valóban egy új megközelítés, amely lendületet vesz az emberek vagy más fajok viromjának vizsgálatában [21, 37, 64]. Ez a megközelítés különösen hasznos a kétszálú DNS-vírusok tanulmányozásában, mivel az összes kétszálú DNS-vírus között nincs egyetlen konzervált gén sem, amelyek Baltimore legváltozatosabb és legszélesebb vírusosztályát képviselik [65]. Bár ezeknek a vírusoknak a többsége továbbra sem osztályozható, és a vírusvilág egy teljesen ismeretlen részéből származó vírusokat is tartalmazhatnak [66], azt találtuk, hogy az A. atra és az M. platensis kagylók virómjai és gazdanövény-tartománya hasonlóképpen a két faj közé esik (lásd az S3. ábrát, további információk). Ez a hasonlóság nem meglepő, mivel tükrözheti a környezetben jelen lévő DNS felvételének szelektivitásának hiányát. Jelenleg tisztított RNS-t alkalmazó további vizsgálatokra van szükség az RNS-virom jellemzéséhez.
Tanulmányunkban egy nagyon szigorú folyamatot alkalmaztunk, amelyet Kowarski és kollégái [37] munkájából adaptáltunk, akik a natív ccfDNS összeszerelése előtt és után kétlépéses deléciót alkalmaztak az összegyűjtött leolvasásokban és kontigokban, ami a leképezetlen leolvasások nagy arányát eredményezte. Ezért nem zárhatjuk ki, hogy ezeknek a leképezetlen leolvasásoknak némelyikének továbbra is saját eredete lehet, elsősorban azért, mert nincs referencia genomunk ehhez a kagylófajhoz. Ezt a folyamatot azért is használtuk, mert aggódtunk a saját és nem saját leolvasások közötti kimérák, valamint az Illumina MiSeq PE75 által generált leolvasási hosszak miatt. A feltérképezetlen leolvasások többségének másik oka az, hogy a tengeri mikrobák nagy részét, különösen a távoli területeken, például Kerguelenben, nem annotálták. Az Illumina MiSeq PE75-öt használtuk, feltételezve, hogy a ccfDNS fragmensek hossza hasonló az emberi ccfDNS-hez. A jövőbeli vizsgálatokhoz, mivel eredményeink azt mutatják, hogy a hemolimfa ccfDNS hosszabb leolvasásokkal rendelkezik, mint az emberek és/vagy az emlősök, egy hosszabb ccfDNS fragmensekhez alkalmasabb szekvenálási platform használatát javasoljuk. Ez a gyakorlat sokkal könnyebbé teszi a mélyebb elemzéshez szükséges indikációk azonosítását. A jelenleg nem elérhető teljes A. atra nukleáris genomszekvencia megszerzése nagyban megkönnyítené a ccfDNS megkülönböztetését a saját és a nem saját forrásokból. Tekintettel arra, hogy kutatásunk a folyékony biopszia koncepciójának kagylókra való alkalmazásának lehetőségére összpontosított, reméljük, hogy ahogy ezt a koncepciót a jövőbeli kutatásokban alkalmazzák, új eszközöket és vizsgálati folyamatokat fejlesztenek ki, amelyek növelik a módszer potenciálját a kagylók mikrobiális sokféleségének tanulmányozásában a tengeri ökoszisztémában.
Nem invazív klinikai biomarkerként a ccfDNS emelkedett emberi plazmaszintje különféle betegségekkel, szövetkárosodással és stresszes állapotokkal hozható összefüggésbe [67,68,69]. Ez a növekedés a saját eredetű DNS-fragmensek felszabadulásával jár a szövetkárosodás után. Ezt a problémát akut hőstresszel vizsgáltuk, amelynek során a kagylókat rövid ideig 30 °C hőmérsékletnek tették ki. Ezt az elemzést három különböző típusú kagylón végeztük el három független kísérletben. Azonban nem találtunk változást a ccfDNS-szintekben akut hőstressz után (lásd az S5. ábrát, további információk). Ez a felfedezés legalább részben magyarázhatja azt a tényt, hogy a kagylók félig nyitott keringési rendszerrel rendelkeznek, és nagy mennyiségű idegen DNS-t halmoznak fel magas szűrőaktivitásuk miatt. Másrészt a kagylók, sok gerinctelen állathoz hasonlóan, jobban ellenállhatnak a stressz okozta szövetkárosodásnak, ezáltal korlátozva a ccfDNS felszabadulását a hemolimfájukban [70, 71].
A vízi ökoszisztémák biodiverzitásának DNS-elemzése eddig főként a környezeti DNS (eDNS) metabarkódolására összpontosított. Ez a módszer azonban általában korlátozott a biodiverzitás-elemzésben primerek használata esetén. A shotgun szekvenálás használata megkerüli a PCR korlátait és a primerkészletek elfogult kiválasztását. Így bizonyos értelemben módszerünk közelebb áll a nemrégiben használt nagy áteresztőképességű eDNA Shotgun szekvenálási módszerhez, amely képes közvetlenül szekvenálni a fragmentált DNS-t és szinte minden élőlényt elemezni [72, 73]. Azonban számos alapvető probléma megkülönbözteti az LB-t a standard eDNS-módszerektől. Természetesen az eDNS és az LB közötti fő különbség a természetes szűrő gazdaszervezetek használata. Jelentések szerint tengeri fajok, például szivacsok és kagylók (Dresseina spp.) természetes szűrőként szolgálnak az eDNS vizsgálatához [74, 75]. Dreissena tanulmánya azonban olyan szövetbiopsziákat használt, amelyekből DNS-t vontak ki. Az LB-ből származó ccfDNS elemzése nem igényel szövetbiopsziát, speciális és néha drága berendezéseket és az eDNS-hez vagy a szövetbiopsziához kapcsolódó logisztikát. Valójában nemrégiben beszámoltunk arról, hogy az LB-ből származó ccfDNS tárolható és elemezhető FTA-támogatással hideglánc fenntartása nélkül, ami komoly kihívást jelent a távoli területeken végzett kutatások számára [76]. A ccfDNS kinyerése folyékony biopsziákból szintén egyszerű, és kiváló minőségű DNS-t biztosít a sörétes szekvenáláshoz és a PCR-elemzéshez. Ez nagy előnyt jelent az eDNS-elemzéssel kapcsolatos néhány technikai korlát miatt [77]. A mintavételi módszer egyszerűsége és alacsony költsége különösen alkalmas hosszú távú monitorozási programokhoz is. A magas szűrési képességük mellett a kagylók egy másik jól ismert tulajdonsága a nyálka kémiai mukopoliszacharid-összetétele, amely elősegíti a vírusok felszívódását [78, 79]. Ez teszi a kagylókat ideális természetes szűrővé a biológiai sokféleség és az éghajlatváltozás hatásának jellemzésére egy adott vízi ökoszisztémában. Bár a gazdaszervezetből származó DNS-fragmensek jelenléte a módszer korlátozásának tekinthető az eDNS-hez képest, az ilyen natív ccfDNS-sel járó költségek az eDNS-hez képest egyidejűleg érthetőek az egészségügyi vizsgálatokhoz rendelkezésre álló hatalmas mennyiségű információ miatt. offset host. Ez magában foglalja a gazdaszervezet genomjába integrálódott vírusszekvenciák jelenlétét. Ez különösen fontos a kagylók esetében, tekintettel a horizontálisan terjedő leukémiás retrovírusok jelenlétére a kagylókban [80, 81]. Az LB egy másik előnye az eDNS-sel szemben, hogy kihasználja a hemolimfában keringő vérsejtek fagocita aktivitását, amely elnyeli a mikroorganizmusokat (és azok genomját). A fagocitózis a vérsejtek fő funkciója a kagylókban [82]. Végül a módszer kihasználja a kagylók magas szűrőkapacitását (átlagosan 1,5 l/h tengervíz) és a kétnapos keringést, amelyek fokozzák a tengervíz különböző rétegeinek keveredését, lehetővé téve a heterológ eDNS befogását. [83, 84]. Így a kagyló ccfDNS-elemzése érdekes terület a kagylók táplálkozási, gazdasági és környezeti hatásai miatt. Az emberektől gyűjtött LB elemzéséhez hasonlóan ez a módszer is lehetőséget ad a gazdaszervezet DNS-ében bekövetkező genetikai és epigenetikai változások mérésére exogén anyagokra adott válaszként. Például a harmadik generációs szekvenálási technológiák elképzelhetők genomszintű metilációs analízis elvégzésére natív ccfDNS-ben nanopórus szekvenálás segítségével. Ezt a folyamatot elősegítheti az a tény, hogy a kagyló ccfDNS-fragmentumainak hossza ideális esetben kompatibilis a hosszú leolvasási idejű szekvenálási platformokkal, amelyek lehetővé teszik a genomszintű DNS-metilációs analízist egyetlen szekvenálási futtatásból kémiai transzformációk nélkül.85,86] Ez egy érdekes lehetőség, mivel kimutatták, hogy a DNS-metilációs mintázatok a környezeti stresszre adott választ tükrözik, és több generáción át fennmaradnak. Ezért értékes betekintést nyújthatnak az éghajlatváltozásnak vagy szennyező anyagoknak való kitettség utáni választ szabályozó mögöttes mechanizmusokba [87]. Az LB használata azonban nem korlátlan. Mondani sem kell, hogy ehhez indikátorfajok jelenléte szükséges az ökoszisztémában. Amint azt fentebb említettük, az LB használata egy adott ökoszisztéma biológiai sokféleségének felmérésére szigorú bioinformatikai folyamatot is igényel, amely figyelembe veszi a forrásból származó DNS-fragmentumok jelenlétét. Egy másik fő probléma a tengeri fajok referencia genomjainak elérhetősége. Remélhetőleg az olyan kezdeményezések, mint a Tengeri Emlősök Genomjai Projekt és a nemrégiben létrehozott Fish10k projekt [88], a jövőben megkönnyítik majd az ilyen elemzéseket. Az LB-koncepció alkalmazása a tengeri szűrővel táplálkozó élőlényekre a szekvenálási technológia legújabb fejlesztéseivel is kompatibilis, így kiválóan alkalmas többohmos biomarkerek fejlesztésére, amelyek fontos információkat nyújtanak a tengeri élőhelyek egészségéről a környezeti stresszre adott válaszként.
A genomszekvenálási adatokat az NCBI szekvenciaolvasási archívumában (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) helyezték el a Bioprojects SRR8924808 alatt.
Brierley AS, Kingsford MJ A klímaváltozás hatása a tengeri élővilágra és az ökoszisztémákra. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S és mások. Vizsgáljuk meg az éghajlatváltozás és más helyi stresszorok együttes hatásait a tengeri környezetre. általános tudományos környezet. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P és mások. ). Március elseje tudománya. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Az ismétlődő hőstressz körülmények között csökkent hőtűrés magyarázza a kékkagylók magas nyári halálozási arányát. Tudományos jelentés 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER és mások. Az állati elhullások gyakoriságának, okainak és mértékének legújabb változásai. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S és mások. Több, nem fajspecifikus kórokozó okozhatta a Pinna nobilis tömeges elhullását. Élet. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Az éghajlatváltozás lehetséges hatása az arktiszi zoonózisokra. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. és mások. Kékkagylók (Mytilus edulis spp.), mint jelzőorganizmusok a part menti szennyezés monitorozásában: áttekintés. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. A folyékony biopszia integrációja a rákkezelésben. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C és munkatársai. Folyékony biopsziás érlelés: Lehetővé teszi a tumor DNS keringését. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsavak az emberi plazmában. A Soc Biol leányvállalatainak üléseinek jegyzőkönyvei. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. A sejtmentes DNS új szerepe, mint molekuláris marker a rákkezelésben. Biomoláris analízis kvantifikációja. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS A folyékony biopszia bekerül a klinikába – megvalósítási kérdések és jövőbeli kihívások. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW és mások. Magzati DNS jelen van az anyai plazmában és szérumban. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR: A terhesség lefolyásának és szövődményeinek vizsgálata nők vérében keringő extracelluláris RNS felhasználásával terhesség alatt. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J és munkatársai. Folyékony biopszia: donorsejtektől mentes DNS-t használnak allogén elváltozások kimutatására veseátültetésben. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovációk a prenatális diagnosztikában: anyai plazma genom szekvenálás. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D és munkatársai. Gyors kórokozó-kimutatás fertőzött testnedvek következő generációs metagenomikai szekvenálásával. Nat Medicine. 2021;27:115-24.