Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Течната биопсия (ТБ) е концепция, която бързо набира популярност в биомедицинската област. Концепцията се основава главно на откриването на фрагменти от циркулираща извънклетъчна ДНК (ccfDNA), които се освобождават главно като малки фрагменти след клетъчна смърт в различни тъкани. Малка част от тези фрагменти произхождат от чужди (чужди) тъкани или организми. В настоящата работа ние приложихме тази концепция към мидите, сентинен вид, известен с високия си капацитет за филтриране на морска вода. Използваме способността на мидите да действат като естествени филтри за улавяне на фрагменти от екологична ДНК от различни източници, за да предоставим информация за биоразнообразието на морските крайбрежни екосистеми. Нашите резултати показват, че хемолимфата на мидите съдържа ДНК фрагменти, които варират значително по размер, от 1 до 5 kb. Секвенирането с дробовик показа, че голям брой ДНК фрагменти са от чужд микробен произход. Сред тях открихме ДНК фрагменти от бактерии, археи и вируси, включително вируси, за които е известно, че заразяват различни гостоприемници, често срещани в крайбрежните морски екосистеми. В заключение, нашето проучване показва, че концепцията за LB, приложена към мидите, представлява богат, но все още неизследван източник на знания за микробното разнообразие в морските крайбрежни екосистеми.
Въздействието на изменението на климата (ИЗК) върху биоразнообразието на морските екосистеми е бързо развиваща се област на изследване. Глобалното затопляне не само причинява важни физиологични стресове, но и разширява еволюционните граници на термичната стабилност на морските организми, засягайки местообитанията на редица видове, подтиквайки ги да търсят по-благоприятни условия [1, 2]. В допълнение към влиянието си върху биоразнообразието на метазоите, ИЗК нарушава деликатния баланс на взаимодействията между гостоприемника и микробите. Тази микробна дисбактериоза представлява сериозна заплаха за морските екосистеми, тъй като прави морските организми по-податливи на инфекциозни патогени [3, 4]. Смята се, че СС играят важна роля в масовите смъртни случаи, което е сериозен проблем за управлението на глобалните морски екосистеми [5, 6]. Това е важен въпрос, предвид икономическото, екологичното и хранителното въздействие на много морски видове. Това е особено вярно за двучерупчестите, живеещи в полярните региони, където ефектите от ИЗК са по-незабавни и тежки [6, 7]. Всъщност, двучерупчести като Mytilus spp. се използват широко за наблюдение на ефектите от ИЗК върху морските екосистеми. Не е изненадващо, че са разработени сравнително голям брой биомаркери за наблюдение на тяхното здраве, често използвайки двустепенен подход, включващ функционални биомаркери, базирани на ензимна активност или клетъчни функции, като клетъчна жизнеспособност и фагоцитна активност [8]. Тези методи включват и измерване на концентрацията на специфични индикатори за налягане, които се натрупват в меките тъкани след абсорбцията на големи количества морска вода. Високият филтрационен капацитет и полуотворената кръвоносна система на двучерупчестите обаче предоставят възможност за разработване на нови хемолимфни биомаркери, използвайки концепцията за течна биопсия (ТБ), прост и минимално инвазивен подход към управлението на пациентите. кръвни проби [9, 10]. Въпреки че в човешката ТБ могат да бъдат открити няколко вида циркулиращи молекули, тази концепция се основава предимно на анализ на ДНК секвениране на циркулиращи извънклетъчни ДНК (ccfDNA) фрагменти в плазмата. Всъщност наличието на циркулираща ДНК в човешката плазма е известно от средата на 20-ти век [11], но едва през последните години появата на високопроизводителни методи за секвениране доведе до клинична диагноза, базирана на ccfDNA. Наличието на тези циркулиращи ДНК фрагменти се дължи отчасти на пасивното освобождаване на геномна ДНК (ядрена и митохондриална) след клетъчната смърт. При здрави индивиди концентрацията на ccfDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да се увеличи 5–10 пъти при пациенти, страдащи от различни патологии или подложени на стрес, което води до увреждане на тъканите. При здрави индивиди концентрацията на ccfDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да се увеличи 5–10 пъти при пациенти, страдащи от различни патологии или подложени на стрес, което води до увреждане на тъканите. При здрави хора концентрацията на vkkDNK е в ниска норма (<10 ng/ml), но може да се повиши 5–10 пъти при болни с различна патология или подложени на стрес, предизвикващ увреждане на тъканите. При здрави хора концентрацията на cccDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да се увеличи 5–10 пъти при пациенти с различни патологии или под стрес, което води до увреждане на тъканите.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрациите на ccfDNA обикновено са ниски (<10 ng/ml) при здрави хора, но могат да бъдат увеличени с 5-10 пъти при пациенти с различни патологии или стрес, което води до увреждане на тъканите. Концентрациите на ccfDNA обикновено са ниски (<10 ng/ml) при здрави индивиди, но могат да се повишат 5-10 пъти при пациенти с различни патологии или стрес, което води до увреждане на тъканите.Размерът на фрагментите от ccfDNA варира в широки граници, но обикновено варира от 150 до 200 bp. [12]. Анализът на самостоятелно получена ccfDNA, т.е. ccfDNA от нормални или трансформирани клетки гостоприемници, може да се използва за откриване на генетични и епигенетични промени, налични в ядрения и/или митохондриалния геном, като по този начин помага на клиницистите да изберат специфични молекулярно-таргетирани терапии [13]. ccfDNA обаче може да бъде получена от чужди източници, като например ccfDNA от фетални клетки по време на бременност или от трансплантирани органи [14,15,16,17]. ccfDNA е също важен източник на информация за откриване на наличието на нуклеинови киселини на инфекциозен агент (чужд), което позволява неинвазивно откриване на широко разпространени инфекции, които не са идентифицирани чрез кръвни култури, като се избягва инвазивна биопсия на инфектирана тъкан [18]. Последните проучвания наистина показват, че човешката кръв съдържа богат източник на информация, която може да се използва за идентифициране на вирусни и бактериални патогени, и че около 1% от ccfDNA, открита в човешката плазма, е с чужд произход [19]. Тези проучвания показват, че биоразнообразието на циркулиращия микробиом на даден организъм може да бъде оценено с помощта на ccfDNA анализ. Доскоро обаче тази концепция се използваше изключително при хора и в по-малка степен при други гръбначни животни [20, 21].
В настоящата статия използваме LB потенциала, за да анализираме ccfDNA на Aulacomya atra, южен вид, често срещан на субантарктическите острови Кергелен, група острови на върха на голямо плато, образувано преди 35 милиона години при вулканично изригване. Използвайки in vitro експериментална система, открихме, че ДНК фрагменти в морска вода бързо се поемат от мидите и навлизат в хемолимфното отделение. Секвенирането с пушка показа, че ccfDNA на хемолимфата на мидите съдържа ДНК фрагменти от собствен и несобствен произход, включително симбиотични бактерии и ДНК фрагменти от биоми, типични за студени вулканични морски крайбрежни екосистеми. CCFDNA на хемолимфата съдържа и вирусни последователности, получени от вируси с различни гостоприемници. Открихме също ДНК фрагменти от многоклетъчни животни като костни риби, морски анемони, водорасли и насекоми. В заключение, нашето проучване показва, че концепцията за LB може да се приложи успешно към морски безгръбначни, за да се генерира богат геномен репертоар в морските екосистеми.
Възрастни (55-70 мм дълги) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) бяха събрани от междуприливните скалисти брегове на островите Кергелен (049°21.235 ю.ш., 070°13.490 и.д.) през декември 2018 г. Други възрастни сини миди (Mytilus spp.) бяха получени от търговски доставчик (PEI Mussel King Inc., остров Принц Едуард, Канада) и поставени в температурно контролиран (4°C) аериран резервоар, съдържащ 10–20 л изкуствена саламура с концентрация 32‰ (изкуствена морска сол Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, САЩ). За всеки експеримент бяха измерени дължината и теглото на отделните черупки.
Протокол с отворен достъп за тази програма е достъпен онлайн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Накратко, LB хемолимфа е събрана от абдукторните мускули, както е описано [22]. Хемолимфата е избистрена чрез центрофугиране при 1200×g за 3 минути, супернатантата е замразена (-20°C) до употреба. За изолиране и пречистване на cfDNA, пробите (1,5-2,0 ml) са размразени и обработени с помощта на NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) съгласно инструкциите на производителя. ccfDNA е съхранявана при -80°C до по-нататъшен анализ. В някои експерименти ccfDNA е изолирана и пречистена с помощта на QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада). Пречистената ДНК е количествено определена с помощта на стандартен PicoGreen анализ. Разпределението на фрагментите на изолираната ccfDNA беше анализирано чрез капилярна електрофореза, използвайки биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния) и High Sensitivity DNA Kit. Анализът беше извършен с 1 µl от ccfDNA пробата, съгласно инструкциите на производителя.
За секвениране на фрагменти от хемолимфа ccfDNA, Génome Québec (Монреал, Квебек, Канада) подготви shotgun библиотеки, използвайки комплекта Illumina DNA Mix от комплекта Illumina MiSeq PE75. Използван е стандартен адаптер (BioO). Суровите файлове с данни са достъпни от NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 и SRR8924809). Основното качество на разчитане е оценено с помощта на FastQC [23]. Trimmomatic [24] е използван за изрязване на адаптери и разчитания с лошо качество. Shotgun разчитанията с двойки краища бяха FLASH обединени в по-дълги единични разчитания с минимално припокриване от 20 bp, за да се избегнат несъответствия [25]. Обединените данни бяха анотирани с BLASTN, използвайки база данни за таксономия на двучерупчести NCBI (e стойност < 1e−3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените данни бяха анотирани с BLASTN, използвайки база данни за таксономия на двучерупчести NCBI (e стойност < 1e−3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените чтения бяха анотирани с помощта на BLASTN с използване на база данни за таксономия на двусъздадени молюски NCBI (значение e < 1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователни нива на ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените данни бяха анотирани с BLASTN, използвайки базата данни за таксономия на двучерупчести мекотели NCBI (e стойност < 1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 прах [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Обединените чтения бяха анотирани с помощта на BLASTN с използване на таксономична база данни за двусъздадени молюски NCBI (значение <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователни нива на ниска сложност беше извършено с DUST [26]. Обединените данни бяха анотирани с BLASTN, използвайки таксономичната база данни на NCBI за двучерупчести (e-стойност <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26].Четенията бяха разделени на две групи: свързани с двучерупчести последователности (тук наречени самостоятелни четения) и несвързани (несамостоятелни четения). Две групи бяха сглобени отделно с помощта на MEGAHIT за генериране на контиги [27]. Междувременно, таксономичното разпределение на четенията на чужди микробиоми беше класифицирано с помощта на Kraken2 [28] и графично представено чрез кръгова диаграма Krona на Galaxy [29, 30]. Оптималните kmers бяха определени като kmers-59 от нашите предварителни експерименти. След това самостоятелните контиги бяха идентифицирани чрез подравняване с BLASTN (база данни на двучерупчести NCBI, e стойност < 1e−10 и 60% хомология) за окончателна анотация. След това самостоятелните контиги бяха идентифицирани чрез подравняване с BLASTN (база данни на двучерупчести NCBI, e стойност < 1e−10 и 60% хомология) за окончателна анотация. След това собствените контиги бяха идентифицирани чрез съпоставяне с BLASTN (база данни на двусъздадените молюски NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) за окончателна анотация. След това самоконтигите бяха идентифицирани чрез съпоставяне с BLASTN (база данни за двучерупчести NCBI, e-стойност <1e-10 и 60% хомология) за окончателна анотация.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% След това бяха идентифицирани собствените контиги за окончателна анотация чрез съпоставяне с BLASTN (база данни NCBI за двусъздадени молюски, значение e <1e-10 и гомология 60%). След това самоконтигите бяха идентифицирани за окончателна анотация чрез съпоставяне с BLASTN (база данни за двучерупчести NCBI, e-стойност <1e-10 и 60% хомология). Успоредно с това, не-самостоятелни групови контиги бяха анотирани с BLASTN (база данни на nt NCBI, e стойност < 1e−10 и 60% хомология). Успоредно с това, не-самостоятелни групови контиги бяха анотирани с BLASTN (база данни на nt NCBI, e стойност < 1e−10 и 60% хомология). Паралелно чуждеродните групови контиги бяха анотирани с помощта на BLASTN (база данни nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Успоредно с това, контигите на чужди групи бяха анотирани с BLASTN (база данни NT NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Паралелно контиги, които не се отнасят към собствената група, са анотирани с помощта на BLASTN (база данни nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Успоредно с това, не-самостоятелни групови контиги бяха анотирани с BLASTN (база данни на nt NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология). BLASTX беше проведен и върху не-самостоятелни контиги, използвайки базите данни NCBI за протеини nr и RefSeq (e стойност < 1e−10 и 60% хомология). BLASTX беше проведен и върху не-самостоятелни контиги, използвайки базите данни NCBI за протеини nr и RefSeq (e стойност < 1e−10 и 60% хомология). BLASTX също беше проведен на несамостоятелни контигахи с използване на база данни белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX беше извършен и върху не-самостоятелни контиги, използвайки nr и RefSeq NCBI протеиновите бази данни (e стойност < 1e-10 и 60% хомология).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX също изпълняваше несамостоятелни контигами с използване на база данни белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX беше извършен и върху не-самостоятелни контиги, използвайки nr и RefSeq NCBI протеиновите бази данни (e стойност <1e-10 и 60% хомология).Пуловете BLASTN и BLASTX от не-самостоятелни контиги представляват крайните контиги (вижте Допълнителния файл).
Праймерите, използвани за PCR, са изброени в Таблица S1. Taq ДНК полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON) е използвана за амплифициране на целевите гени на ccfDNA. Използвани са следните реакционни условия: денатурация при 95°C за 3 минути, 95°C за 1 минута, зададена температура на отгряване за 1 минута, удължаване при 72°C за 1 минута, 35 цикъла и накрая 72°C в рамките на 10 минути. . PCR продуктите са разделени чрез електрофореза в агарозни гелове (1,5%), съдържащи SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) при 95 V.
Мидите (Mytilus spp.) бяха аклиматизирани в 500 ml окислена морска вода (32 PSU) в продължение на 24 часа при 4°C. Плазмидна ДНК, съдържаща вложка, кодираща кДНК последователността на човешки галектин-7 (NCBI номер за достъп L07769), беше добавена към флакона с крайна концентрация от 190 μg/μl. Мидите, инкубирани при същите условия без добавяне на ДНК, бяха контролата. Третият контролен резервоар съдържаше ДНК без миди. За да се следи качеството на ДНК в морската вода, проби от морска вода (20 μl; три повторения) бяха взети от всеки резервоар в посоченото време. За проследимост на плазмидната ДНК, LB мидите бяха събрани в посоченото време и анализирани чрез qPCR и ddPCR. Поради високото съдържание на сол в морската вода, аликвотни проби бяха разредени във вода с качество за PCR (1:10) преди всички PCR анализи.
Цифрова капкова PCR (ddPCR) беше проведена с помощта на протокола BioRad QX200 (Мисисага, Онтарио, Канада). Използвайте температурния профил, за да определите оптималната температура (Таблица S1). Капките бяха генерирани с помощта на генератор на капки QX200 (BioRad). ddPCR беше проведена, както следва: 95°C за 5 минути, 50 цикъла при 95°C за 30 секунди и дадена температура на отгряване за 1 минута и 72°C за 30 секунди, 4°C за 5 минути и 90°C в рамките на 5 минути. Броят на капките и положителните реакции (брой копия/µl) бяха измерени с помощта на четец на капки QX200 (BioRad). Проби с по-малко от 10 000 капки бяха отхвърлени. Контрол на профила не беше извършван всеки път, когато се провеждаше ddPCR.
qPCR беше проведена с помощта на Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидни, Австралия) и LGALS7 специфични праймери. Всички количествени PCR бяха проведени в 20 µl с помощта на QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR беше започната с 15-минутна инкубация при 95°C, последвана от 40 цикъла при 95°C за 10 секунди и при 60°C за 60 секунди с едно събиране на данни. Кривите на топене бяха генерирани чрез последователни измервания при 95°C за 5 секунди, 65°C за 60 секунди и 97°C в края на qPCR. Всяка qPCR беше проведена в три екземпляра, с изключение на контролните проби.
Тъй като мидите са известни с високата си скорост на филтрация, първо проучихме дали те могат да филтрират и задържат ДНК фрагменти, присъстващи в морската вода. Интересува ни също дали тези фрагменти се натрупват в полуотворената им лимфна система. Решихме този проблем експериментално, като проследихме съдбата на разтворимите ДНК фрагменти, добавени към резервоари със сини миди. За да улесним проследяването на ДНК фрагментите, използвахме чужда (не собствена) плазмидна ДНК, съдържаща човешкия ген галектин-7. ddPCR проследява плазмидни ДНК фрагменти в морска вода и миди. Нашите резултати показват, че ако количеството ДНК фрагменти в морската вода остава относително постоянно във времето (до 7 дни) при липса на миди, то при наличие на миди това ниво почти напълно изчезва в рамките на 8 часа (фиг. 1а,б). Фрагменти от екзогенна ДНК се откриват лесно в рамките на 15 минути в интравалвуларна течност и хемолимфа (фиг. 1в). Тези фрагменти могат да бъдат открити до 4 часа след експозицията. Тази филтрираща активност по отношение на ДНК фрагментите е сравнима с филтриращата активност на бактерии и водорасли [31]. Тези резултати показват, че мидите могат да филтрират и натрупват чужда ДНК в своите течни отделения.
Относителни концентрации на плазмидна ДНК в морска вода в присъствието (A) или отсъствието (B) на миди, измерени чрез ddPCR. В A резултатите са изразени като проценти, като границите на кутиите представляват 75-ия и 25-ия персентил. Напасната логаритмична крива е показана в червено, а площта, защрихована в сиво, представлява 95% доверителен интервал. В B червената линия представлява средната стойност, а синята линия представлява 95% доверителен интервал за концентрацията. C Натрупване на плазмидна ДНК в хемолимфата и клапната течност на мидите в различно време след добавянето на плазмидна ДНК. Резултатите са представени като абсолютен брой открити копия/mL (±SE).
След това изследвахме произхода на ccfDNA в миди, събрани от мидени легла на островите Кергелен, отдалечена група острови с ограничено антропогенно влияние. За тази цел, cccDNA от хемолимфи на миди беше изолирана и пречистена чрез методи, често използвани за пречистване на човешка cccDNA [32, 33]. Установихме, че средните концентрации на ccfDNA в хемолимфата в мидите са в ниския диапазон на микрограми на милилитър хемолимфа (вижте Таблица S2, Допълнителна информация). Този диапазон на концентрации е много по-голям, отколкото при здрави хора (ниски нанограми на милилитър), но в редки случаи, при пациенти с рак, нивото на ccfDNA може да достигне няколко микрограма на милилитър [34, 35]. Анализ на разпределението на размера на ccfDNA в хемолимфата показа, че тези фрагменти варират значително по размер, варирайки от 1000 bp до 5000 bp (фиг. 2). Подобни резултати са получени с помощта на силициев диоксид QIAamp Investigator Kit, метод, често използван в криминалистиката за бързо изолиране и пречистване на геномна ДНК от проби с ниска концентрация, включително ccfDNA [36].
Представителна ccfDNA електрофореграма на хемолимфа на миди. Екстрахирана с NucleoSnap Plasma Kit (горе) и QIAamp DNA Investigator Kit. B Виолинова диаграма, показваща разпределението на концентрациите на ccfDNA на хемолимфата (±SE) в мидите. Черните и червените линии представляват медианата и съответно първия и третия квартил.
Приблизително 1% от ccfDNA при хора и примати е с чужд източник [21, 37]. Като се има предвид полуотворената кръвоносна система на двучерупчестите, богатата на микроби морска вода и разпределението на размера на ccfDNA на мидите, предположихме, че ccfDNA на хемолимфата на мидите може да съдържа богат и разнообразен набор от микробна ДНК. За да проверим тази хипотеза, секвенирахме ccfDNA на хемолимфата от проби от Aulacomya atra, събрани от островите Кергелен, което доведе до над 10 милиона прочитания, 97,6% от които преминаха контрол на качеството. След това показанията бяха класифицирани според собствени и чужди източници, използвайки базите данни за двучерупчести BLASTN и NCBI (фиг. S1, допълнителна информация).
При хората, както ядрената, така и митохондриалната ДНК могат да бъдат освободени в кръвния поток [38]. В настоящото проучване обаче не беше възможно да се опише подробно ядрената геномна ДНК на мидите, тъй като геномът на A. atra не е секвениран или описан. Въпреки това, успяхме да идентифицираме редица ccfDNA фрагменти от нашия собствен произход, използвайки библиотеката с двучерупчести (фиг. S2, допълнителна информация). Също така потвърдихме наличието на ДНК фрагменти от нашия собствен произход чрез насочена PCR амплификация на тези гени на A. atra, които бяха секвенирани (фиг. 3). По подобен начин, като се има предвид, че митохондриалният геном на A. atra е достъпен в публични бази данни, могат да се намерят доказателства за наличието на митохондриални ccfDNA фрагменти в хемолимфата на A. atra. Наличието на митохондриални ДНК фрагменти беше потвърдено чрез PCR амплификация (фиг. 3).
Различни митохондриални гени присъстваха в хемолимфата на A. atra (червени точки – номер на склад: SRX5705969) и M. platensis (сини точки – номер на склад: SRX5705968), амплифицирани чрез PCR. Фигура е адаптирана от Breton et al., 2011 B Амплификация на хемолимфния супернатант от A. atra. Съхраняван върху FTA хартия. Използвайте 3 mm перфоратор, за да добавите директно към PCR епруветката, съдържаща PCR сместа.
Предвид изобилното микробно съдържание в морската вода, първоначално се фокусирахме върху характеризирането на микробните ДНК последователности в хемолимфата. За да направим това, използвахме две различни стратегии. Първата стратегия използваше Kraken2, програма за класификация на последователности, базирана на алгоритми, която може да идентифицира микробни последователности с точност, сравнима с BLAST и други инструменти [28]. Повече от 6719 прочитания бяха определени като от бактериален произход, докато 124 и 64 бяха съответно от археи и вируси (фиг. 4). Най-разпространените бактериални ДНК фрагменти бяха Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (фиг. 4а). Това разпределение е в съответствие с предишни изследвания на микробиома на морската синя мида [39, 40]. Gammaproteobacteria бяха основният клас Proteobacteria (44%), включително много Vibrionales (фиг. 4б). Методът ddPCR потвърди наличието на ДНК фрагменти от Vibrio в ccfDNA на хемолимфата на A. atra (фиг. 4в) [41]. За да се получи повече информация за бактериалния произход на ccfDNA, беше възприет допълнителен подход (фиг. S2, допълнителна информация). В този случай, припокриващите се четения бяха сглобени като четения с двойки краища и бяха класифицирани като самостоятелни (двучерупчести) или несамостоятелни с помощта на BLASTN и e стойност от 1e−3 и гранична стойност с >90% хомология. В този случай, припокриващите се четения бяха сглобени като четения с двойки краища и бяха класифицирани като самостоятелни (двучерупчести) или несамостоятелни с помощта на BLASTN и e стойност от 1e−3 и гранична стойност с >90% хомология. В този случай прекриващите се чтения бяха събрани като чтения с парни краища и бяха класифицирани като собствени (двутворчати моллюски) или чужди по произход с използване на BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомология> 90%. В този случай, припокриващите се показания бяха събрани като показания с двойки и бяха класифицирани като местни (двучерупчести) или неоригинални, използвайки BLASTN и e стойност от 1e-3 и гранична стойност с >90% хомология.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和 >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В този случай прекриващите се чтения бяха събрани като чтения с парни краища и класифицирани като собствени (двустворчати моллюски) или несобствени по произход с използване на стойности e BLASTN и 1e-3 и порога гомология> 90%. В този случай, припокриващите се четения бяха събрани като сдвоени четения и класифицирани като собствени (двучерупчести) или неоригинални, използвайки стойности на e BLASTN и 1e-3 ​​и праг на хомология >90%.Тъй като геномът на A. atra все още не е секвениран, използвахме стратегията за de novo асемблиране на асемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Общо 147 188 контига са идентифицирани като зависим (двучерупчести) произход. След това тези контиги бяха разбити с e-стойности от 1e-10, използвайки BLASTN и BLASTX. Тази стратегия ни позволи да идентифицираме 482 недвучерупчести фрагмента, присъстващи в ccfDNA на A. atra. Повече от половината (57%) от тези ДНК фрагменти са получени от бактерии, главно от хрилни симбионти, включително сулфотрофни симбионти, и от хрилни симбионти Solemya velum (фиг. 5).
Относително изобилие на типово ниво. B Микробно разнообразие на два основни типа (Firmicutes и Proteobacteria). Представителна амплификация на ddPCR C Vibrio spp. A. Фрагменти от 16S rRNA гена (синьо) в три атра хемолимфи.
Анализирани са общо 482 събрани контига. Общ профил на таксономичното разпределение на метагеномните контигни анотации (прокариоти и еукариоти). B Подробно разпределение на бактериални ДНК фрагменти, идентифицирани чрез BLASTN и BLASTX.
Анализът на Kraken2 също показа, че ccfDNA на мидите съдържа археални ДНК фрагменти, включително ДНК фрагменти от Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (фиг. 6a). Наличието на ДНК фрагменти, получени от Euryarchaeota и Crenarchaeota, открити преди това в микробната общност на калифорнийските миди, не би трябвало да е изненада [42]. Въпреки че Euryarchaeota често се свързва с екстремни условия, сега е признато, че както Euryarchaeota, така и Crenarcheota са сред най-често срещаните прокариоти в морската криогенна среда [43, 44]. Наличието на метаногенни микроорганизми в мидите не е изненадващо, предвид последните съобщения за обширни изтичания на метан от дънни течове на платото Кергелен [45] и евентуално микробно производство на метан, наблюдавано край бреговете на островите Кергелен [46].
След това вниманието ни се насочи към данни от ДНК вируси. Доколкото ни е известно, това е първото нецелевo изследване на вирусното съдържание в мидите. Както се очакваше, открихме ДНК фрагменти от бактериофаги (Caudovirales) (фиг. 6б). Най-често срещаната вирусна ДНК обаче идва от тип нуклеоцитовируси, известен още като ядрено-цитоплазмен голям ДНК вирус (NCLDV), който има най-големия геном от всички вируси. В рамките на този тип повечето ДНК последователности принадлежат към семействата Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чиито естествени гостоприемници включват гръбначни и членестоноги, докато малка част от тези ДНК последователности принадлежат на известни вирусологични водорасли. Заразява морски еукариотни водорасли. Последователностите са получени и от вируса Пандора, гигантският вирус с най-голям размер на генома от всички известни вирусни родове. Интересното е, че диапазонът от гостоприемници, за които е известно, че са заразени с вируса, определен чрез секвениране на ccfDNA на хемолимфа, е относително голям (фигура S3, допълнителна информация). Включва вируси, които заразяват насекоми като Baculoviridae и Iridoviridae, както и вируси, които заразяват амеби, водорасли и гръбначни животни. Открихме също така последователности, съответстващи на генома на Pithovirus sibericum. Питовирусите (известни също като „зомби вируси“) са изолирани за първи път от 30 000-годишна вечна замръзналост в Сибир [47]. По този начин нашите резултати са в съответствие с предишни доклади, показващи, че не всички съвременни видове на тези вируси са изчезнали [48] и че тези вируси може да присъстват в отдалечени субарктически морски екосистеми.
Накрая, тествахме дали можем да открием ДНК фрагменти от други многоклетъчни животни. Общо 482 чужди контига бяха идентифицирани чрез BLASTN и BLASTX с nt, nr и RefSeq библиотеки (геномни и протеинови). Нашите резултати показват, че сред чуждите фрагменти на ccfDNA на многоклетъчни животни преобладава ДНК от костни кости (фиг. 5). Открити са и ДНК фрагменти от насекоми и други видове. Сравнително голяма част от ДНК фрагментите не са идентифицирани, вероятно поради недостатъчното представяне на голям брой морски видове в геномните бази данни в сравнение със сухоземните видове [49].
В настоящата статия ние прилагаме концепцията за LB (лигаментна ДНК) към мидите, твърдейки, че секвенирането на ccfDNA от хемолимфа може да даде представа за състава на морските крайбрежни екосистеми. По-специално, ние открихме, че 1) хемолимфата на мидите съдържа относително високи концентрации (микрограмови нива) на относително големи (~1-5 kb) циркулиращи ДНК фрагменти; 2) тези ДНК фрагменти са както независими, така и ненезависими; 3) Сред чуждите източници на тези ДНК фрагменти открихме бактериална, археална и вирусна ДНК, както и ДНК на други многоклетъчни животни; 4) Натрупването на тези чужди ccfDNA фрагменти в хемолимфата се случва бързо и допринася за вътрешната филтрираща активност на мидите. В заключение, нашето проучване показва, че концепцията за LB, която досега се прилага главно в областта на биомедицината, кодира богат, но неизследван източник на знания, който може да се използва за по-добро разбиране на взаимодействието между сентинелните видове и тяхната среда.
В допълнение към приматите, изолиране на ccfDNA е съобщено и при бозайници, включително мишки, кучета, котки и коне [50, 51, 52]. Доколкото ни е известно обаче, нашето проучване е първото, което докладва за откриването и секвенирането на ccfDNA при морски видове с отворена кръвоносна система. Тази анатомична характеристика и филтрираща способност на мидите може, поне отчасти, да обясни различните характеристики на размера на циркулиращите ДНК фрагменти в сравнение с други видове. При хората повечето ДНК фрагменти, циркулиращи в кръвта, са малки фрагменти с размер от 150 до 200 bp с максимален пик от 167 bp [34, 53]. Малка, но значителна част от ДНК фрагментите са с размер между 300 и 500 bp, а около 5% са по-дълги от 900 bp. [54]. Причината за това разпределение на размера е, че основният източник на ccfDNA в плазмата се появява в резултат на клетъчна смърт, или поради клетъчна смърт, или поради некроза на циркулиращи хематопоетични клетки при здрави индивиди, или поради апоптоза на туморни клетки при пациенти с рак (известна като циркулираща туморна ДНК). , ctDNA). Разпределението на размера на хемолимфната ccfDNA, която открихме в мидите, варира от 1000 до 5000 bp, което предполага, че ccfDNA на мидите има различен произход. Това е логична хипотеза, тъй като мидите имат полуотворена съдова система и живеят в морска водна среда, съдържаща високи концентрации на микробна геномна ДНК. Всъщност, нашите лабораторни експерименти, използващи екзогенна ДНК, показаха, че мидите натрупват ДНК фрагменти в морска вода, поне след няколко часа те се разграждат след клетъчно поемане и/или се освобождават и/или се съхраняват в различни организации. Като се има предвид рядкостта на клетките (както прокариотни, така и еукариотни), използването на интравалвуларни компартменти ще намали количеството ccfDNA от собствени източници, както и от чужди източници. Като се има предвид значението на вродения имунитет на двучерупчестите и големия брой циркулиращи фагоцити, ние допълнително предположихме, че дори чужда ccfDNA е обогатена в циркулиращи фагоцити, които натрупват чужда ДНК при поглъщане на микроорганизми и/или клетъчни остатъци. Взети заедно, нашите резултати показват, че ccfDNA на хемолимфата на двучерупчестите е уникално хранилище на молекулярна информация и засилва статута им на стражеви видове.
Нашите данни показват, че секвенирането и анализът на фрагменти от ccfDNA на хемолимфа, получени от бактерии, могат да предоставят ключова информация за бактериалната флора на гостоприемника и бактериите, присъстващи в околната морска екосистема. Техниките за секвениране чрез изстрелване разкриха последователности от коменсалната бактерия A. atra (хрил), които биха били пропуснати, ако бяха използвани конвенционални методи за идентифициране на 16S rRNA, отчасти поради пристрастност към референтната библиотека. Всъщност, използването от нас на LB данни, събрани от M. platensis (platensis) в същия слой миди в Кергелен, показа, че съставът на бактериалните симбионти, свързани с хрилете, е един и същ и за двата вида миди (фиг. S4, допълнителна информация). Това сходство на две генетично различни миди може да отразява състава на бактериалните съобщества в студените, серни и вулканични находища на Кергелен [55, 56, 57, 58]. По-високи нива на микроорганизми, редуциращи сярата, са добре описани при събиране на миди от биотурбирани крайбрежни райони [59], като например бреговете на Порт о Франс. Друга възможност е флората на мидите-символи да бъде засегната от хоризонтално предаване [60, 61]. Необходими са още изследвания, за да се определи корелацията между морската среда, повърхността на морското дъно и състава на симбиотичните бактерии в мидите. Тези проучвания са в ход в момента.
Дължината и концентрацията на ccfDNA от хемолимфата, лекотата на пречистване и високото качество, позволяващо бързо секвениране с дробовик, са някои от многото предимства на използването на ccfDNA от миди за оценка на биоразнообразието в морските крайбрежни екосистеми. Този подход е особено ефективен за характеризиране на вирусни съобщества (вироми) в дадена екосистема [62, 63]. За разлика от бактериите, археите и еукариотите, вирусните геноми не съдържат филогенетично консервирани гени, като например 16S последователности. Нашите резултати показват, че течни биопсии от индикаторни видове като мидите могат да се използват за идентифициране на относително голям брой ccfDNA вирусни фрагменти, за които е известно, че заразяват гостоприемници, които обикновено обитават крайбрежните морски екосистеми. Това включва вируси, за които е известно, че заразяват протозои, членестоноги, насекоми, растения и бактериални вируси (напр. бактериофаги). Подобно разпределение беше установено, когато изследвахме вирома на ccfDNA от хемолимфата на сини миди (M. platensis), събран в същия миден слой в Кергелен (Таблица S2, Допълнителна информация). Секвенирането на ccfDNA с пушка наистина е нов подход, набиращ скорост в изучаването на вирома на хора или други видове [21, 37, 64]. Този подход е особено полезен за изучаване на двуверижни ДНК вируси, тъй като нито един ген не е запазен сред всички двуверижни ДНК вируси, представляващи най-разнообразния и широк клас вируси в Балтимор [65]. Въпреки че повечето от тези вируси остават некласифицирани и могат да включват вируси от напълно непозната част от вирусния свят [66], ние открихме, че виромите и диапазоните на гостоприемниците на мидите A. atra и M. platensis попадат между двата вида по подобен начин (вижте фигура S3, допълнителна информация). Това сходство не е изненадващо, тъй като може да отразява липса на селективност при усвояването на ДНК, присъстваща в околната среда. В момента са необходими бъдещи изследвания, използващи пречистена РНК, за да се характеризира РНК виромът.
В нашето проучване използвахме много строг процес на секвениране, адаптиран от работата на Коварски и колеги [37], които използваха двуетапно заличаване на обединени четения и контиги преди и след сглобяване на естествена ccfDNA, което доведе до висок дял на немаркирани четения. Следователно, не можем да изключим, че някои от тези немаркирани четения може все още да имат собствен произход, главно защото нямаме референтен геном за този вид миди. Използвахме този процес и защото бяхме загрижени за химерите между собствени и не-собствени четения и дължините на четенията, генерирани от Illumina MiSeq PE75. Друга причина за по-голямата част от некартографираните четения е, че голяма част от морските микроби, особено в отдалечени райони като Кергелен, не са анотирани. Използвахме Illumina MiSeq PE75, приемайки дължини на ccfDNA фрагментите, подобни на човешката ccfDNA. За бъдещи проучвания, като се имат предвид нашите резултати, показващи, че ccfDNA на хемолимфата има по-дълги четения от хората и/или бозайниците, препоръчваме използването на платформа за секвениране, по-подходяща за по-дълги ccfDNA фрагменти. Тази практика ще улесни значително идентифицирането на повече индикации за по-задълбочен анализ. Получаването на недостъпната в момента пълна ядрен геномна последователност на A. atra също би улеснило значително разграничаването на ccfDNA от собствени и чужди източници. Като се има предвид, че нашите изследвания са фокусирани върху възможността за прилагане на концепцията за течна биопсия към миди, се надяваме, че с използването на тази концепция в бъдещи изследвания ще бъдат разработени нови инструменти и тръбопроводи, за да се увеличи потенциалът на този метод за изучаване на микробното разнообразие на мидите. морска екосистема.
Като неинвазивен клиничен биомаркер, повишените нива на ccfDNA в човешката плазма са свързани с различни заболявания, тъканни увреждания и стресови състояния [67,68,69]. Това увеличение е свързано с освобождаването на ДНК фрагменти от собствен произход след тъканно увреждане. Разгледахме този проблем, използвайки остър топлинен стрес, при който мидите бяха изложени за кратко на температура от 30 °C. Извършихме този анализ върху три различни вида миди в три независими експеримента. Въпреки това, не открихме никаква промяна в нивата на ccfDNA след остър топлинен стрес (вижте Фигура S5, допълнителна информация). Това откритие може да обясни, поне отчасти, факта, че мидите имат полуотворена кръвоносна система и натрупват големи количества чужда ДНК поради високата си филтрираща активност. От друга страна, мидите, както много безгръбначни, може да са по-устойчиви на тъканни увреждания, предизвикани от стрес, като по този начин ограничават освобождаването на ccfDNA в тяхната хемолимфа [70, 71].
Към днешна дата, ДНК анализът на биоразнообразието във водните екосистеми се фокусира главно върху метабаркодирането на екологична ДНК (eDNA). Този метод обаче обикновено е ограничен при анализа на биоразнообразието, когато се използват праймери. Използването на shotgun секвениране заобикаля ограниченията на PCR и пристрастния подбор на набори от праймери. По този начин, в известен смисъл, нашият метод е по-близо до наскоро използвания високопроизводителен метод за eDNA Shotgun секвениране, който е способен директно да секвенира фрагментирана ДНК и да анализира почти всички организми [72, 73]. Съществуват обаче редица фундаментални проблеми, които отличават LB от стандартните eDNA методи. Разбира се, основната разлика между eDNA и LB е използването на естествени филтърни гостоприемници. Съобщава се за използването на морски видове като гъби и двучерупчести (Dresseina spp.) като естествен филтър за изучаване на eDNA [74, 75]. Проучването на Dreissena обаче използва тъканни биопсии, от които е извлечена ДНК. Анализът на ccfDNA от LB не изисква тъканна биопсия, специализирано и понякога скъпо оборудване и логистика, свързани с eDNA или тъканна биопсия. Всъщност, наскоро съобщихме, че ccfDNA от LB може да се съхранява и анализира с FTA поддръжка без поддържане на студена верига, което е основно предизвикателство за изследвания в отдалечени райони [76]. Екстракцията на ccfDNA от течни биопсии също е проста и осигурява висококачествена ДНК за shotgun секвениране и PCR анализ. Това е голямо предимство, предвид някои от техническите ограничения, свързани с eDNA анализа [77]. Простотата и ниската цена на метода за вземане на проби са особено подходящи и за дългосрочни програми за мониторинг. В допълнение към високата им филтрираща способност, друга добре позната характеристика на двучерупчестите е химичният мукополизахариден състав на тяхната слуз, който насърчава абсорбцията на вируси [78, 79]. Това прави двучерупчестите идеален естествен филтър за характеризиране на биоразнообразието и въздействието на изменението на климата в дадена водна екосистема. Въпреки че наличието на ДНК фрагменти, получени от гостоприемника, може да се разглежда като ограничение на метода в сравнение с eDNA, цената, свързана с наличието на такава нативна ccfDNA в сравнение с eDNA, е едновременно разбираема предвид огромното количество информация, достъпна за здравни изследвания. компенсиран гостоприемник. Това включва наличието на вирусни последователности, интегрирани в генома на гостоприемника. Това е особено важно за мидите, предвид наличието на хоризонтално предавани левкемични ретровируси в двучерупчестите [80, 81]. Друго предимство на LB пред eDNA е, че той използва фагоцитната активност на циркулиращите кръвни клетки в хемолимфата, която поглъща микроорганизмите (и техните геноми). Фагоцитозата е основната функция на кръвните клетки в двучерупчестите [82]. И накрая, методът се възползва от високия филтриращ капацитет на мидите (средно 1,5 л/ч морска вода) и двудневната циркулация, които увеличават смесването на различни слоеве морска вода, позволявайки улавянето на хетероложна eDNA. [83, 84]. По този начин, анализът на ccfDNA на мидите е интересен път, предвид хранителните, икономическите и екологичните въздействия на мидите. Подобно на анализа на LB, събран от хора, този метод също така открива възможността за измерване на генетични и епигенетични промени в ДНК на гостоприемника в отговор на екзогенни вещества. Например, могат да се предвидят технологии за секвениране от трето поколение за извършване на анализ на метилиране в целия геном в естествена ccfDNA, използвайки нанопорно секвениране. Този процес би трябвало да бъде улеснен от факта, че дължината на фрагментите от ccfDNA на мидите е идеално съвместима с платформи за секвениране с дълго четене, които позволяват анализ на метилиране на ДНК в целия геном от еднократно секвениране без необходимост от химични трансформации.85,86] Това е интересна възможност, тъй като е доказано, че моделите на метилиране на ДНК отразяват реакция на стрес в околната среда и се запазват в продължение на много поколения. Следователно, това може да предостави ценна информация за основните механизми, управляващи реакцията след излагане на климатични промени или замърсители [87]. Използването на LB обаче не е без ограничения. Излишно е да се казва, че това изисква наличието на индикаторни видове в екосистемата. Както бе споменато по-горе, използването на LB за оценка на биоразнообразието на дадена екосистема също изисква строг биоинформационен процес, който отчита наличието на ДНК фрагменти от източника. Друг основен проблем е наличието на референтни геноми за морски видове. Надеждата е, че инициативи като Проекта за геноми на морски бозайници и наскоро създадения проект Fish10k [88] ще улеснят подобен анализ в бъдеще. Прилагането на концепцията за LB към морски организми, хранещи се чрез филтриране на водата, е съвместимо и с най-новите постижения в технологията за секвениране, което я прави подходяща за разработването на многоомови биомаркери, които да предоставят важна информация за здравето на морските местообитания в отговор на екологичния стрес.
Данните за секвениране на генома са депозирани в архива за четене на секвенции на NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Въздействие на изменението на климата върху морския живот и екосистемите. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alpanidou V, Bevilacqua S и др. Разгледайте комбинираното въздействие на изменението на климата и други локални стресови фактори върху морската среда. general scientific environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Наука за първи март. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Намалената толерантност към топлина при повтарящи се условия на топлинен стрес обяснява високата лятна смъртност на сините миди. Научен доклад 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER и др. Последни промени в честотата, причините и степента на смъртност при животни. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S и др. Множество патогени, които не са специфични за вида, може да са причинили масова смъртност на Pinna nobilis. живот. 2020; 10: 238.
Брадли М., Кутс С. Дж., Дженкинс Е., О'Хара Т. М. Потенциално въздействие на изменението на климата върху зоонозните заболявания в Арктика. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Сините миди (Mytilus edulis spp.) като сигнални организми в мониторинга на замърсяването на крайбрежните зони: преглед. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравеня Г., Марсони С., Сиена С., Бардели А. Интегриране на течна биопсия в лечението на рак. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C и др. Съзряване на течна биопсия: Позволява циркулацията на туморната ДНК. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандел П., Метейс П. Нуклеинови киселини в човешка плазма. Протоколи от заседания на дъщерни дружества на Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Нова роля на безклетъчната ДНК като молекулярен маркер за лечение на рак. Количествено определяне на биомоларен анализ. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.У., Джефри С.С. Течната биопсия навлиза в клиниката – проблеми с внедряването и бъдещи предизвикателства. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW и др. Фетална ДНК присъства в майчината плазма и серум. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Изследване на протичането на бременността и нейните усложнения с помощта на циркулираща извънклетъчна РНК в кръвта на жени по време на бременност. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J и др. Течна биопсия: безклетъчна ДНК от донор се използва за откриване на алогенни лезии в бъбречна присадка. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Иновации в пренаталната диагностика: секвениране на генома на майчината плазма. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D и др. Бързо откриване на патогени с метагеномно секвениране от следващо поколение на инфектирани телесни течности. Nat Medicine. 2021;27:115-24.