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La biopsia líquida (BL) es un concepto que está ganando popularidad rápidamente en el campo biomédico. Se basa principalmente en la detección de fragmentos de ADN extracelular circulante (ADNcf), que se liberan como pequeños fragmentos tras la muerte celular en diversos tejidos. Una pequeña proporción de estos fragmentos proviene de tejidos u organismos extraños. En este trabajo, hemos aplicado este concepto a los mejillones, una especie centinela conocida por su alta capacidad de filtración de agua de mar. Aprovechamos la capacidad de los mejillones para actuar como filtros naturales y capturar fragmentos de ADN ambiental de diversas fuentes, lo que nos permite obtener información sobre la biodiversidad de los ecosistemas costeros marinos. Nuestros resultados muestran que la hemolinfa de los mejillones contiene fragmentos de ADN de tamaño muy variable, de 1 a 5 kb. La secuenciación aleatoria reveló que un gran número de fragmentos de ADN son de origen microbiano. Entre ellos, encontramos fragmentos de ADN de bacterias, arqueas y virus, incluyendo virus conocidos por infectar a diversos huéspedes comunes en los ecosistemas marinos costeros. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB aplicado a los mejillones representa una fuente de conocimiento rica pero aún inexplorada sobre la diversidad microbiana en los ecosistemas costeros marinos.
El impacto del cambio climático (CC) en la biodiversidad de los ecosistemas marinos es un área de investigación en rápido crecimiento. El calentamiento global no solo causa importantes estrés fisiológico, sino que también empuja los límites evolutivos de la estabilidad térmica de los organismos marinos, afectando el hábitat de varias especies, impulsándolas a buscar condiciones más favorables [1, 2]. Además de afectar la biodiversidad de los metazoos, el CC altera el delicado equilibrio de las interacciones huésped-microbio. Esta disbiosis microbiana representa una seria amenaza para los ecosistemas marinos, ya que hace que los organismos marinos sean más susceptibles a los patógenos infecciosos [3, 4]. Se cree que los SS juegan un papel importante en las muertes masivas, lo cual es un problema grave para la gestión de los ecosistemas marinos globales [5, 6]. Este es un tema importante dados los impactos económicos, ecológicos y nutricionales de muchas especies marinas. Esto es especialmente cierto para los bivalvos que viven en las regiones polares, donde los efectos del CK son más inmediatos y severos [6, 7]. De hecho, bivalvos como Mytilus spp. son ampliamente utilizados para monitorear los efectos del CC en los ecosistemas marinos. No es sorprendente que se haya desarrollado un número relativamente grande de biomarcadores para monitorear su salud, a menudo utilizando un enfoque de dos niveles que involucra biomarcadores funcionales basados ​​en la actividad enzimática o funciones celulares tales como la viabilidad celular y la actividad fagocítica [8]. Estos métodos también incluyen la medición de la concentración de indicadores de presión específicos que se acumulan en los tejidos blandos después de la absorción de grandes cantidades de agua de mar. Sin embargo, la alta capacidad de filtración y el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos brindan una oportunidad para desarrollar nuevos biomarcadores de hemolinfa utilizando el concepto de biopsia líquida (BL), un enfoque simple y mínimamente invasivo para el manejo del paciente. muestras de sangre [9, 10]. Aunque se pueden encontrar varios tipos de moléculas circulantes en la BL humana, este concepto se basa principalmente en el análisis de secuenciación de ADN de fragmentos de ADN extracelular circulante (ADNcfc) en plasma. De hecho, la presencia de ADN circulante en el plasma humano se conoce desde mediados del siglo XX [11], pero solo en los últimos años, gracias al desarrollo de métodos de secuenciación de alto rendimiento, se ha podido realizar un diagnóstico clínico basado en el ADN libre circulante. La presencia de estos fragmentos de ADN circulante se debe, en parte, a la liberación pasiva de ADN genómico (nuclear y mitocondrial) tras la muerte celular. En individuos sanos, la concentración de ADN libre circulante (ccfDNA) suele ser baja (<10 ng/ml), pero puede aumentar entre 5 y 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o que están sometidos a estrés, lo que provoca daños en los tejidos. En individuos sanos, la concentración de ADN libre circulante (ccfDNA) suele ser baja (<10 ng/ml), pero puede aumentar entre 5 y 10 veces en pacientes que padecen diversas patologías o que están sometidos a estrés, lo que provoca daños en los tejidos. Para una mayor concentración de líquido en la norma mínima (<10 ng/ml), no se puede colocar entre 5 y 10 veces más rápidamente. patología o подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. En personas sanas, la concentración de cccDNA suele ser baja (<10 ng/ml), pero puede aumentar entre 5 y 10 veces en pacientes con diversas patologías o bajo estrés que provoca daño tisular.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но moгут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Las concentraciones de ADN libre circulante suelen ser bajas (<10 ng/ml) en individuos sanos, pero pueden aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patologías o estrés, lo que provoca daño tisular.El tamaño de los fragmentos de ccfDNA varía ampliamente, pero generalmente oscila entre 150 y 200 pb. [12]. El análisis del ccfDNA autoderivado, es decir, el ccfDNA de células huésped normales o transformadas, puede utilizarse para detectar cambios genéticos y epigenéticos presentes en el genoma nuclear y/o mitocondrial, lo que ayuda a los médicos a seleccionar terapias moleculares dirigidas específicas [13]. Sin embargo, el ccfDNA puede obtenerse de fuentes externas, como el ccfDNA de células fetales durante el embarazo o de órganos trasplantados [14,15,16,17]. El ccfDNA también es una fuente importante de información para detectar la presencia de ácidos nucleicos de un agente infeccioso (extraño), lo que permite la detección no invasiva de infecciones generalizadas no identificadas por cultivos de sangre, evitando la biopsia invasiva del tejido infectado [18]. Estudios recientes han demostrado que la sangre humana contiene una rica fuente de información que puede utilizarse para identificar patógenos virales y bacterianos, y que aproximadamente el 1 % del ADN libre circulante (ADNlc) presente en el plasma humano es de origen externo [19]. Estos estudios demuestran que la biodiversidad del microbioma circulante de un organismo puede evaluarse mediante el análisis del ADNlc. Sin embargo, hasta hace poco, este concepto se utilizaba exclusivamente en humanos y, en menor medida, en otros vertebrados [20, 21].
En el presente trabajo, utilizamos el potencial de LB para analizar el ccfDNA de Aulacomya atra, una especie austral que se encuentra comúnmente en las islas Kerguelen subantárticas, un grupo de islas sobre una gran meseta formada hace 35 millones de años por una erupción volcánica. Mediante un sistema experimental in vitro, descubrimos que los fragmentos de ADN en el agua de mar son rápidamente absorbidos por los mejillones y entran en el compartimento de la hemolinfa. La secuenciación de escopeta ha demostrado que el ccfDNA de la hemolinfa del mejillón contiene fragmentos de ADN de origen propio y ajeno, incluyendo bacterias simbióticas y fragmentos de ADN de biomas típicos de ecosistemas costeros marinos volcánicos fríos. El ccfDNA de la hemolinfa también contiene secuencias virales derivadas de virus con diferentes rangos de hospedadores. También encontramos fragmentos de ADN de animales multicelulares como peces óseos, anémonas de mar, algas e insectos. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB puede aplicarse con éxito a invertebrados marinos para generar un rico repertorio genómico en ecosistemas marinos.
Se recolectaron ejemplares adultos (55-70 mm de largo) de Mytilus platensis (M. platensis) y Aulacomya atra (A. atra) de las costas rocosas intermareales de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .), Islas Kerguelen en diciembre de 2018. Otros mejillones azules adultos (Mytilus spp.) se obtuvieron de un proveedor comercial (PEI Mussel King Inc., Isla del Príncipe Eduardo, Canadá) y se colocaron en un tanque aireado con temperatura controlada (4 °C) que contenía 10–20 L de salmuera artificial de 32‰ (sal marina artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, EE. UU.). Para cada experimento, se midieron la longitud y el peso de las conchas individuales.
Un protocolo de acceso abierto gratuito para este programa está disponible en línea (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Brevemente, la hemolinfa LB se recolectó de los músculos abductores como se describe [22]. La hemolinfa se clarificó mediante centrifugación a 1200×g durante 3 minutos, el sobrenadante se congeló (-20°C) hasta su uso. Para el aislamiento y purificación de cfDNA, las muestras (1,5-2,0 ml) se descongelaron y procesaron utilizando el kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) según las instrucciones del fabricante. El ccfDNA se almacenó a -80°C hasta su posterior análisis. En algunos experimentos, el ccfDNA se aisló y purificó utilizando el kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadá). El ADN purificado se cuantificó utilizando un ensayo PicoGreen estándar. La distribución de fragmentos del ccfDNA aislado se analizó mediante electroforesis capilar utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) con un kit de ADN de alta sensibilidad. El ensayo se realizó con 1 µl de la muestra de ccfDNA siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para la secuenciación de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparó bibliotecas de secuenciación aleatoria utilizando el kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75. Se utilizó un adaptador estándar (BioO). Los archivos de datos brutos están disponibles en el Archivo de Lecturas de Secuencias del NCBI (SRR8924808 y SRR8924809). La calidad básica de lectura se evaluó utilizando FastQC [23]. Trimmomatic [24] se ha utilizado para recortar adaptadores y lecturas de baja calidad. Las lecturas aleatorias con extremos emparejados se fusionaron FLASH en lecturas únicas más largas con una superposición mínima de 20 pb para evitar desajustes [25]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN utilizando una base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e−3 y 90 % de homología), y se realizó el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad utilizando DUST [26]. Las lecturas fusionadas se anotaron con BLASTN utilizando una base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e−3 y 90 % de homología), y se realizó el enmascaramiento de secuencias de baja complejidad utilizando DUST [26]. La configuración obligatoria se realiza mediante anotación con BLASTN utilizando bases de datos de la industria NCBI. (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), una mascarilla que no se puede utilizar con polvo [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos de taxonomía de bivalvos del NCBI (valor e < 1e-3 y 90% de homología), y se realizó un enmascaramiento de secuencias de baja complejidad utilizando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 polvo [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽La configuración obligatoria es la annotirovania con el uso de BLASTN con la aplicación de bases de datos de software NCBI (значение e <1e-3 y 90% de homologías), una máscara de polvo no deseada que se utiliza con polvo [26]. Las lecturas agrupadas se anotaron con BLASTN utilizando la base de datos taxonómica de bivalvos del NCBI (valor e <1e-3 y 90% de homología), y se realizó un enmascaramiento de secuencias de baja complejidad utilizando DUST [26].Las lecturas se dividieron en dos grupos: relacionadas con secuencias de bivalvos (denominadas aquí lecturas propias) y no relacionadas (lecturas no propias). Ambos grupos se ensamblaron por separado utilizando MEGAHIT para generar contigs [27]. Mientras tanto, la distribución taxonómica de las lecturas del microbioma alienígena se clasificó utilizando Kraken2 [28] y se representó gráficamente mediante un gráfico circular de Krona en Galaxy [29, 30]. El k-mero óptimo se determinó como k-mero-59 a partir de nuestros experimentos preliminares. Posteriormente, se identificaron los contigs propios mediante alineación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e < 1e−10 y 60 % de homología) para una anotación final. Posteriormente, se identificaron los contigs propios mediante alineación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e < 1e−10 y 60 % de homología) para una anotación final. Затем собственные контиги были идентицированы путем сопоставления с BLASTN (baza данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Posteriormente, se identificaron los autocontigs mediante la comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología) para la anotación final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (baza данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение y <1e-10 y гомология 60%). Posteriormente, se identificaron los autocontigs para su anotación final mediante la comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos del NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología). Paralelamente, los contigs del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e−10 y 60% de homología). Paralelamente, los contigs del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e−10 y 60% de homología). Paralelamente, los grupos de grupos completos cuentan con comentarios adicionales con BLASTN (basa de nt NCBI, clasificación y <1e-10 y homología 60%). Paralelamente, los contigs del grupo extranjero se anotaron con BLASTN (base de datos NT NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Paralelamente, no pertenece al grupo integrado, sino que incluye comentarios de BLASTN (basado en NCBI, artículos y <1e-10) y geología 60%). Paralelamente, los contigs del grupo no propio se anotaron con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e <1e-10 y 60% de homología). También se realizó un análisis BLASTX en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq del NCBI (valor e < 1e−10 y 60% de homología). También se realizó un análisis BLASTX en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq del NCBI (valor e < 1e−10 y 60% de homología). BLASTX está disponible para todas las conexiones no deseadas con la aplicación RefSeq NCBI (escrito y <1e-10) гомология 60%). También se realizó un análisis BLASTX en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq del NCBI (valor e < 1e-10 y 60% de homología).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX está disponible para todas las conexiones no especificadas con RefSeq NCBI (configuración y <1e-10 y homologación) 60%). También se realizó un análisis BLASTX en contigs no propios utilizando las bases de datos de proteínas nr y RefSeq del NCBI (valor e <1e-10 y 60% de homología).Los conjuntos de contigs no propios obtenidos mediante BLASTN y BLASTX representan los contigs finales (véase el archivo complementario).
Los cebadores utilizados para la PCR se enumeran en la Tabla S1. Se utilizó la ADN polimerasa Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) para amplificar los genes diana del ccfDNA. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, 95 °C durante 1 minuto, temperatura de hibridación establecida durante 1 minuto, elongación a 72 °C durante 1 minuto, 35 ciclos y, finalmente, 72 °C durante 10 minutos. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa (1,5 %) que contenían SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Los mejillones (Mytilus spp.) se aclimataron en 500 ml de agua de mar oxigenada (32 PSU) durante 24 horas a 4 °C. Se añadió ADN plasmídico que contenía un inserto que codificaba la secuencia de ADNc de la galectina-7 humana (número de acceso NCBI L07769) al vial a una concentración final de 190 μg/μl. Los mejillones incubados en las mismas condiciones sin adición de ADN sirvieron como control. El tercer tanque de control contenía ADN sin mejillones. Para monitorizar la calidad del ADN en el agua de mar, se tomaron muestras de agua de mar (20 μl; tres repeticiones) de cada tanque en el tiempo indicado. Para la trazabilidad del ADN plasmídico, se recolectaron mejillones LB en los tiempos indicados y se analizaron mediante qPCR y ddPCR. Debido al alto contenido de sal del agua de mar, las alícuotas se diluyeron en agua de calidad para PCR (1:10) antes de todos los ensayos de PCR.
Se realizó PCR digital de gotas (ddPCR) utilizando el protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadá). Utilice el perfil de temperatura para determinar la temperatura óptima (Tabla S1). Las gotas se generaron utilizando un generador de gotas QX200 (BioRad). La ddPCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 95 °C durante 5 min, 50 ciclos de 95 °C durante 30 s y una temperatura de hibridación determinada durante 1 min y 72 °C durante 30 s, 4 °C durante 5 min y 90 °C en 5 min. El número de gotas y reacciones positivas (número de copias/µl) se midió utilizando un lector de gotas QX200 (BioRad). Se rechazaron las muestras con menos de 10 000 gotas. No se realizó un control de patrón cada vez que se ejecutó la ddPCR.
Se realizó la qPCR utilizando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) y cebadores específicos para LGALS7. Todas las PCR cuantitativas se realizaron en un volumen de 20 µl utilizando el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). La qPCR se inició con una incubación de 15 min a 95 °C, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos y a 60 °C durante 60 segundos, con una adquisición de datos. Las curvas de fusión se generaron mediante mediciones sucesivas a 95 °C durante 5 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C al final de la qPCR. Cada qPCR se realizó por triplicado, excepto las muestras de control.
Dado que los mejillones son conocidos por su alta tasa de filtración, primero investigamos si podían filtrar y retener fragmentos de ADN presentes en el agua de mar. También nos interesaba saber si estos fragmentos se acumulaban en su sistema linfático semiabierto. Resolvimos este problema experimentalmente rastreando el destino de los fragmentos de ADN solubles añadidos a tanques de mejillones azules. Para facilitar el seguimiento de los fragmentos de ADN, utilizamos ADN plasmídico extraño (no propio) que contenía el gen de la galectina-7 humana. La ddPCR rastrea los fragmentos de ADN plasmídico en el agua de mar y en los mejillones. Nuestros resultados muestran que si la cantidad de fragmentos de ADN en el agua de mar se mantuvo relativamente constante a lo largo del tiempo (hasta 7 días) en ausencia de mejillones, entonces en presencia de mejillones este nivel desapareció casi por completo en 8 horas (Fig. 1a,b). Los fragmentos de ADN exógeno se detectaron fácilmente en 15 minutos en el líquido intravalvular y la hemolinfa (Fig. 1c). Estos fragmentos aún podían detectarse hasta 4 horas después de la exposición. Esta actividad de filtrado con respecto a los fragmentos de ADN es comparable a la actividad de filtrado de bacterias y algas [31]. Estos resultados sugieren que los mejillones pueden filtrar y acumular ADN extraño en sus compartimentos fluidos.
Concentraciones relativas de ADN plasmídico en agua de mar en presencia (A) o ausencia (B) de mejillones, medidas por ddPCR. En A, los resultados se expresan como porcentajes, con los bordes de las cajas representando los percentiles 75 y 25. La curva logarítmica ajustada se muestra en rojo, y el área sombreada en gris representa el intervalo de confianza del 95 %. En B, la línea roja representa la media y la línea azul representa el intervalo de confianza del 95 % para la concentración. C Acumulación de ADN plasmídico en la hemolinfa y el líquido valvular de los mejillones en diferentes momentos después de la adición de ADN plasmídico. Los resultados se presentan como copias absolutas detectadas/mL (±EE).
A continuación, investigamos el origen del ccfDNA en mejillones recolectados en bancos de mejillones en las Islas Kerguelen, un grupo remoto de islas con influencia antropogénica limitada. Para ello, se aisló y purificó el cccDNA de la hemolinfa de los mejillones mediante métodos comúnmente utilizados para purificar el cccDNA humano [32, 33]. Encontramos que las concentraciones promedio de ccfDNA en la hemolinfa de los mejillones se encuentran en el rango de microgramos bajos por ml de hemolinfa (véase la Tabla S2, Información complementaria). Este rango de concentraciones es mucho mayor que en personas sanas (nanogramos bajos por mililitro), pero en casos raros, en pacientes con cáncer, el nivel de ccfDNA puede alcanzar varios microgramos por mililitro [34, 35]. Un análisis de la distribución del tamaño del ccfDNA de la hemolinfa mostró que estos fragmentos varían mucho en tamaño, desde 1000 pb hasta 5000 pb (Fig. 2). Se obtuvieron resultados similares utilizando el kit QIAamp Investigator basado en sílice, un método comúnmente utilizado en la ciencia forense para aislar y purificar rápidamente el ADN genómico de muestras de ADN de baja concentración, incluido el ccfDNA [36].
Electroferograma representativo de ccfDNA de la hemolinfa del mejillón. Extraído con el kit NucleoSnap Plasma (arriba) y el kit QIAamp DNA Investigator. B Gráfico de violín que muestra la distribución de las concentraciones de ccfDNA en la hemolinfa (±EE) de los mejillones. Las líneas negra y roja representan la mediana y el primer y tercer cuartil, respectivamente.
Aproximadamente el 1% del ccfDNA en humanos y primates tiene una fuente externa [21, 37]. Dado el sistema circulatorio semiabierto de los bivalvos, el agua de mar rica en microorganismos y la distribución de tamaño del ccfDNA de los mejillones, planteamos la hipótesis de que el ccfDNA de la hemolinfa de los mejillones podría contener una reserva rica y diversa de ADN microbiano. Para probar esta hipótesis, secuenciamos el ccfDNA de la hemolinfa de muestras de Aulacomya atra recolectadas en las Islas Kerguelen, obteniendo más de 10 millones de lecturas, de las cuales el 97,6% pasó el control de calidad. Las lecturas se clasificaron según fuentes propias y ajenas utilizando las bases de datos BLASTN y NCBI para bivalvos (Fig. S1, Información complementaria).
En humanos, tanto el ADN nuclear como el mitocondrial pueden liberarse al torrente sanguíneo [38]. Sin embargo, en el presente estudio, no fue posible describir en detalle el ADN genómico nuclear de los mejillones, dado que el genoma de A. atra no ha sido secuenciado ni descrito. No obstante, pudimos identificar varios fragmentos de ccfDNA de nuestro propio origen utilizando la biblioteca de bivalvos (Fig. S2, Información complementaria). También confirmamos la presencia de fragmentos de ADN de nuestro propio origen mediante amplificación por PCR dirigida de aquellos genes de A. atra que fueron secuenciados (Fig. 3). De manera similar, dado que el genoma mitocondrial de A. atra está disponible en bases de datos públicas, se puede encontrar evidencia de la presencia de fragmentos de ccfDNA mitocondrial en la hemolinfa de A. atra. La presencia de fragmentos de ADN mitocondrial fue confirmada por amplificación por PCR (Fig. 3).
Se detectaron varios genes mitocondriales en la hemolinfa de A. atra (puntos rojos – número de catálogo: SRX5705969) y M. platensis (puntos azules – número de catálogo: SRX5705968) amplificados por PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificación del sobrenadante de hemolinfa de A. atra Almacenado en papel FTA. Utilice un punzón de 3 mm para añadirlo directamente al tubo de PCR que contiene la mezcla de PCR.
Dado el abundante contenido microbiano en el agua de mar, inicialmente nos centramos en la caracterización de secuencias de ADN microbiano en la hemolinfa. Para ello, utilizamos dos estrategias diferentes. La primera estrategia utilizó Kraken2, un programa de clasificación de secuencias basado en algoritmos que puede identificar secuencias microbianas con una precisión comparable a BLAST y otras herramientas [28]. Se determinó que más de 6719 lecturas eran de origen bacteriano, mientras que 124 y 64 eran de arqueas y virus, respectivamente (Fig. 4). Los fragmentos de ADN bacteriano más abundantes fueron Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) y Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Esta distribución es consistente con estudios previos del microbioma del mejillón azul marino [39, 40]. Gammaproteobacteria fue la clase principal de Proteobacteria (44%), incluyendo muchos Vibrionales (Fig. 4b). El método ddPCR confirmó la presencia de fragmentos de ADN de Vibrio en el ccfDNA de la hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41]. Para obtener más información sobre el origen bacteriano del ccfDNA, se adoptó un enfoque adicional (Fig. S2, Información complementaria). En este caso, las lecturas que se superponían se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o ajeno utilizando BLASTN y un valor e de 1e−3 y un umbral con >90% de homología. En este caso, las lecturas que se superponían se ensamblaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como de origen propio (bivalvos) o ajeno utilizando BLASTN y un valor e de 1e−3 y un umbral con >90% de homología. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по по происхождению с использованием BLASTN and значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recopilaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como nativas (bivalvos) o no originales utilizando BLASTN y un valor e de 1e-3 y un umbral con >90% de homología.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. En este caso, las lecturas superpuestas se recopilaron como lecturas de extremos emparejados y se clasificaron como propias (bivalvos) o no originales utilizando eBLASTN y valores de 1e-3 y un umbral de homología >90%.Dado que el genoma de A. atra aún no ha sido secuenciado, utilizamos la estrategia de ensamblaje de novo del ensamblador de secuenciación de próxima generación (NGS) MEGAHIT. Se identificaron un total de 147.188 contigs como dependientes (bivalvos) de origen. Estos contigs se expandieron con valores e de 1e-10 utilizando BLASTN y BLASTX. Esta estrategia nos permitió identificar 482 fragmentos no bivalvos presentes en el ccfDNA de A. atra. Más de la mitad (57%) de estos fragmentos de ADN se obtuvieron de bacterias, principalmente de simbiontes branquiales, incluidos simbiontes sulfotróficos, y de simbiontes branquiales Solemya velum (Fig. 5).
Abundancia relativa a nivel de tipo. B Diversidad microbiana de dos filos principales (Firmicutes y Proteobacteria). Amplificación representativa de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmentos del gen del ARNr 16S (azul) en tres hemolinfas de atra.
Se analizaron un total de 482 contigs recopilados. Perfil general de la distribución taxonómica de las anotaciones de contigs metagenómicos (procariotas y eucariotas). B Distribución detallada de los fragmentos de ADN bacteriano identificados mediante BLASTN y BLASTX.
El análisis de Kraken2 también mostró que el ccfDNA del mejillón contenía fragmentos de ADN de arqueas, incluidos fragmentos de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) y Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). La presencia de fragmentos de ADN derivados de Euryarchaeota y Crenarchaeota, previamente encontrados en la comunidad microbiana de los mejillones de California, no debería sorprender [42]. Aunque Euryarchaeota se asocia a menudo con condiciones extremas, ahora se reconoce que tanto Euryarchaeota como Crenarcheota se encuentran entre los procariotas más comunes en el ambiente criogénico marino [43, 44]. La presencia de microorganismos metanogénicos en los mejillones no es sorprendente, dados los informes recientes de extensas fugas de metano desde el fondo marino en la meseta de Kerguelen [45] y la posible producción microbiana de metano observada frente a la costa de las islas Kerguelen [46].
Nuestra atención se centró entonces en las lecturas de virus de ADN. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio fuera de objetivo del contenido viral de mejillones. Como era de esperar, encontramos fragmentos de ADN de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b). Sin embargo, el ADN viral más común proviene de un filo de nucleocitovirus, también conocido como virus de ADN grande citoplasmático nuclear (NCLDV), que tiene el genoma más grande de cualquier virus. Dentro de este filo, la mayoría de las secuencias de ADN pertenecen a las familias Mimimidoviridae (58%) y Poxviridae (21%), cuyos huéspedes naturales incluyen vertebrados y artrópodos, mientras que una pequeña proporción de estas secuencias de ADN pertenecen a algas virológicas conocidas. Infecta algas eucariotas marinas. Las secuencias también se obtuvieron del virus Pandora, el virus gigante con el tamaño de genoma más grande de cualquier género viral conocido. Curiosamente, el rango de huéspedes conocidos infectados con el virus, según lo determinado por la secuenciación del ccfDNA de la hemolinfa, fue relativamente amplio (Figura S3, Información complementaria). Incluye virus que infectan insectos como Baculoviridae e Iridoviridae, así como virus que infectan amebas, algas y vertebrados. También encontramos secuencias que coinciden con el genoma de Pithovirus sibericum. Los pitovroides (también conocidos como "virus zombis") se aislaron por primera vez del permafrost de Siberia de 30 000 años de antigüedad [47]. Por lo tanto, nuestros resultados son consistentes con informes previos que muestran que no todas las especies modernas de estos virus están extintas [48] y que estos virus pueden estar presentes en ecosistemas marinos subárticos remotos.
Finalmente, probamos si podíamos encontrar fragmentos de ADN de otros animales multicelulares. Se identificaron un total de 482 contigs extraños mediante BLASTN y BLASTX con bibliotecas nt, nr y RefSeq (genómicas y de proteínas). Nuestros resultados muestran que entre los fragmentos extraños de ccfDNA de animales multicelulares predomina el ADN de huesos (Fig. 5). También se han encontrado fragmentos de ADN de insectos y otras especies. Una parte relativamente grande de los fragmentos de ADN no se ha identificado, posiblemente debido a la subrepresentación de un gran número de especies marinas en las bases de datos genómicas en comparación con las especies terrestres [49].
En el presente trabajo, aplicamos el concepto de LB a los mejillones, argumentando que la secuenciación de ADN circulante libre (ccfDNA) de la hemolinfa puede proporcionar información sobre la composición de los ecosistemas costeros marinos. En particular, encontramos que: 1) la hemolinfa de los mejillones contiene concentraciones relativamente altas (niveles de microgramos) de fragmentos de ADN circulante relativamente grandes (~1-5 kb); 2) estos fragmentos de ADN son tanto independientes como no independientes; 3) entre las fuentes externas de estos fragmentos de ADN, encontramos ADN bacteriano, arqueal y viral, así como ADN de otros animales multicelulares; 4) la acumulación de estos fragmentos de ccfDNA externos en la hemolinfa ocurre rápidamente y contribuye a la actividad de filtrado interno de los mejillones. En conclusión, nuestro estudio demuestra que el concepto de LB, que hasta ahora se ha aplicado principalmente en el campo de la biomedicina, codifica una fuente de conocimiento rica pero inexplorada que puede utilizarse para comprender mejor la interacción entre las especies centinela y su entorno.
Además de los primates, se ha informado del aislamiento de ccfDNA en mamíferos, incluidos ratones, perros, gatos y caballos [50, 51, 52]. Sin embargo, hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en informar la detección y secuenciación de ccfDNA en especies marinas con un sistema de circulación abierto. Esta característica anatómica y la capacidad de filtrado de los mejillones pueden, al menos en parte, explicar las diferentes características de tamaño de los fragmentos de ADN circulantes en comparación con otras especies. En humanos, la mayoría de los fragmentos de ADN que circulan en la sangre son fragmentos pequeños que varían en tamaño de 150 a 200 pb, con un pico máximo de 167 pb [34, 53]. Una pequeña pero significativa porción de fragmentos de ADN tienen un tamaño entre 300 y 500 pb, y alrededor del 5% son más largos que 900 pb [54]. La razón de esta distribución de tamaño es que la principal fuente de ccfDNA en plasma ocurre como resultado de la muerte celular, ya sea debido a la muerte celular o debido a la necrosis de células hematopoyéticas circulantes en individuos sanos o debido a la apoptosis de células tumorales en pacientes con cáncer (conocido como ADN tumoral circulante, ctDNA). La distribución de tamaño del ccfDNA de hemolinfa que encontramos en mejillones osciló de 1000 a 5000 pb, lo que sugiere que el ccfDNA de mejillón tiene un origen diferente. Esta es una hipótesis lógica, ya que los mejillones tienen un sistema vascular semiabierto y viven en ambientes acuáticos marinos que contienen altas concentraciones de ADN genómico microbiano. De hecho, nuestros experimentos de laboratorio utilizando ADN exógeno han demostrado que los mejillones acumulan fragmentos de ADN en el agua de mar, al menos después de unas horas se degradan después de la captación celular y/o se liberan y/o se almacenan en diversas organizaciones. Dada la escasez de células (tanto procariotas como eucariotas), el uso de compartimentos intravalvulares reducirá la cantidad de ADN libre circulante (ADNlc) tanto de origen propio como externo. Considerando la importancia de la inmunidad innata de los bivalvos y la gran cantidad de fagocitos circulantes, planteamos la hipótesis de que incluso el ADNlc externo se enriquece en los fagocitos circulantes que acumulan ADN extraño tras la ingestión de microorganismos o restos celulares. En conjunto, nuestros resultados demuestran que el ADNlc de la hemolinfa de los bivalvos constituye un repositorio único de información molecular y refuerza su condición de especie centinela.
Nuestros datos indican que la secuenciación y el análisis de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bacterias pueden proporcionar información clave sobre la flora bacteriana del huésped y las bacterias presentes en el ecosistema marino circundante. Las técnicas de secuenciación de disparo han revelado secuencias de la bacteria comensal A. atra branquia que se habrían pasado por alto si se hubieran utilizado métodos convencionales de identificación de ARNr 16S, debido en parte a un sesgo de la biblioteca de referencia. De hecho, nuestro uso de datos LB recolectados de M. platensis en la misma capa de mejillones en Kerguelen mostró que la composición de simbiontes bacterianos asociados a las branquias era la misma para ambas especies de mejillones (Fig. S4, Información suplementaria). Esta similitud de dos mejillones genéticamente diferentes puede reflejar la composición de las comunidades bacterianas en los depósitos fríos, sulfurosos y volcánicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Se han descrito niveles más altos de microorganismos reductores de azufre cuando se recolectan mejillones de áreas costeras bioturbadas [59], como la costa de Port-au-France. Otra posibilidad es que la flora comensal de los mejillones se vea afectada por la transmisión horizontal [60, 61]. Se necesita más investigación para determinar la correlación entre el ambiente marino, la superficie del fondo marino y la composición de las bacterias simbióticas en los mejillones. Estos estudios están actualmente en curso.
La longitud y concentración del ccfDNA de hemolinfa, su facilidad de purificación y su alta calidad para permitir la secuenciación rápida de escopeta son algunas de las muchas ventajas de usar el ccfDNA de mejillón para evaluar la biodiversidad en ecosistemas costeros marinos. Este enfoque es especialmente efectivo para caracterizar comunidades virales (viromas) en un ecosistema dado [62, 63]. A diferencia de las bacterias, las arqueas y los eucariotas, los genomas virales no contienen genes conservados filogenéticamente como las secuencias 16S. Nuestros resultados indican que las biopsias líquidas de especies indicadoras como los mejillones pueden usarse para identificar cantidades relativamente grandes de fragmentos virales de ccfDNA que se sabe que infectan huéspedes que habitan típicamente ecosistemas marinos costeros. Esto incluye virus que se sabe que infectan protozoos, artrópodos, insectos, plantas y virus bacterianos (por ejemplo, bacteriófagos). Se encontró una distribución similar cuando examinamos el viroma de ccfDNA de hemolinfa de mejillones azules (M. platensis) recolectados en la misma capa de mejillones en Kerguelen (Tabla S2, Información suplementaria). La secuenciación de escopeta de ccfDNA es de hecho un nuevo enfoque que está ganando impulso en el estudio del viroma de humanos u otras especies [21, 37, 64]. Este enfoque es particularmente útil para estudiar virus de ADN de doble cadena, ya que ningún gen individual se conserva entre todos los virus de ADN de doble cadena, que representan la clase de virus más diversa y amplia en Baltimore [65]. Aunque la mayoría de estos virus permanecen sin clasificar y pueden incluir virus de una parte completamente desconocida del mundo viral [66], encontramos que los viromas y rangos de hospedadores de los mejillones A. atra y M. platensis se encuentran entre las dos especies. de manera similar (ver figura S3, información adicional). Esta similitud no es sorprendente, ya que puede reflejar una falta de selectividad en la captación de ADN presente en el ambiente. Actualmente se necesitan estudios futuros que utilicen ARN purificado para caracterizar el viroma de ARN.
En nuestro estudio, utilizamos un flujo de trabajo muy riguroso adaptado del trabajo de Kowarski y colegas [37], quienes utilizaron una eliminación en dos pasos de lecturas agrupadas y contigs antes y después del ensamblaje del ccfDNA nativo, lo que resultó en una alta proporción de lecturas no mapeadas. Por lo tanto, no podemos descartar que algunas de estas lecturas no mapeadas puedan tener su propio origen, principalmente porque no tenemos un genoma de referencia para esta especie de mejillón. También utilizamos este flujo de trabajo porque nos preocupaban las quimeras entre lecturas propias y no propias y las longitudes de lectura generadas por Illumina MiSeq PE75. Otra razón para la mayoría de lecturas no mapeadas es que gran parte de los microbios marinos, especialmente en áreas remotas como Kerguelen, no han sido anotados. Utilizamos Illumina MiSeq PE75, asumiendo longitudes de fragmentos de ccfDNA similares al ccfDNA humano. Para futuros estudios, dados nuestros resultados que muestran que el ccfDNA de la hemolinfa tiene lecturas más largas que las de humanos y/o mamíferos, recomendamos utilizar una plataforma de secuenciación más adecuada para fragmentos de ccfDNA más largos. Esta práctica facilitará la identificación de más indicios para un análisis más profundo. La obtención de la secuencia completa del genoma nuclear de A. atra, actualmente no disponible, también facilitaría enormemente la discriminación del ccfDNA de fuentes propias y ajenas. Dado que nuestra investigación se ha centrado en la posibilidad de aplicar el concepto de biopsia líquida a los mejillones, esperamos que, a medida que este concepto se utilice en futuras investigaciones, se desarrollen nuevas herramientas y flujos de trabajo para aumentar el potencial de este método para estudiar la diversidad microbiana de los mejillones en el ecosistema marino.
Como biomarcador clínico no invasivo, los niveles elevados de ccfDNA en plasma humano se asocian con diversas enfermedades, daño tisular y condiciones de estrés [67,68,69]. Este aumento se asocia con la liberación de fragmentos de ADN de su propio origen tras el daño tisular. Abordamos este problema utilizando estrés térmico agudo, en el que los mejillones fueron expuestos brevemente a una temperatura de 30 °C. Realizamos este análisis en tres tipos diferentes de mejillones en tres experimentos independientes. Sin embargo, no encontramos ningún cambio en los niveles de ccfDNA después del estrés térmico agudo (véase la Figura S5, información adicional). Este hallazgo puede explicar, al menos en parte, el hecho de que los mejillones tengan un sistema circulatorio semiabierto y acumulen grandes cantidades de ADN extraño debido a su alta actividad de filtración. Por otro lado, los mejillones, como muchos invertebrados, pueden ser más resistentes al daño tisular inducido por el estrés, limitando así la liberación de ccfDNA en su hemolinfa [70, 71].
Hasta la fecha, el análisis de ADN de la biodiversidad en ecosistemas acuáticos se ha centrado principalmente en el metabarcoding de ADN ambiental (ADNe). Sin embargo, este método suele estar limitado en el análisis de biodiversidad cuando se utilizan cebadores. El uso de secuenciación de escopeta sortea las limitaciones de la PCR y la selección sesgada de conjuntos de cebadores. Por lo tanto, en cierto sentido, nuestro método se acerca al método de secuenciación de eADNe de alto rendimiento utilizado recientemente, que puede secuenciar directamente ADN fragmentado y analizar casi todos los organismos [72, 73]. Sin embargo, hay una serie de cuestiones fundamentales que distinguen a LB de los métodos estándar de eADN. Por supuesto, la principal diferencia entre eADN y LB es el uso de huéspedes de filtro natural. Se ha informado del uso de especies marinas como esponjas y bivalvos (Dresseina spp.) como filtro natural para estudiar eADN [74, 75]. Sin embargo, el estudio de Dreissena utilizó biopsias de tejido de las que se extrajo el ADN. El análisis de ccfDNA de LB no requiere biopsia de tejido, equipos especializados y a veces costosos, ni la logística asociada con el eDNA o la biopsia de tejido. De hecho, recientemente informamos que el ccfDNA de LB se puede almacenar y analizar con soporte FTA sin mantener una cadena de frío, lo cual es un gran desafío para la investigación en áreas remotas [76]. La extracción de ccfDNA de biopsias líquidas también es simple y proporciona ADN de alta calidad para secuenciación de escopeta y análisis de PCR. Esto es una gran ventaja dadas algunas de las limitaciones técnicas asociadas con el análisis de eDNA [77]. La simplicidad y el bajo costo del método de muestreo también son particularmente adecuados para programas de monitoreo a largo plazo. Además de su alta capacidad de filtración, otra característica bien conocida de los bivalvos es la composición química de mucopolisacáridos de su moco, que promueve la absorción de virus [78, 79]. Esto convierte a los bivalvos en un filtro natural ideal para caracterizar la biodiversidad y el impacto del cambio climático en un ecosistema acuático determinado. Aunque la presencia de fragmentos de ADN derivados del huésped puede considerarse una limitación del método en comparación con el eDNA, el costo asociado a tener dicho ccfDNA nativo en comparación con el eDNA es comprensible por la gran cantidad de información disponible para estudios de salud. huésped compensado. Esto incluye la presencia de secuencias virales integradas en el genoma del huésped. Esto es especialmente importante para los mejillones, dada la presencia de retrovirus leucémicos transmitidos horizontalmente en bivalvos [80, 81]. Otra ventaja de LB sobre eDNA es que explota la actividad fagocítica de las células sanguíneas circulantes en la hemolinfa, que engullen microorganismos (y sus genomas). La fagocitosis es la función principal de las células sanguíneas en bivalvos [82]. Finalmente, el método aprovecha la alta capacidad de filtración de los mejillones (promedio de 1,5 l/h de agua de mar) y la circulación de dos días, que aumentan la mezcla de diferentes capas de agua de mar, permitiendo la captura de eDNA heterólogo. [83, 84]. Por lo tanto, el análisis de ccfDNA de mejillones es una vía interesante dados los impactos nutricionales, económicos y ambientales de los mejillones. De manera similar al análisis de LB recolectado de humanos, este método también abre la posibilidad de medir cambios genéticos y epigenéticos en el ADN del huésped en respuesta a sustancias exógenas. Por ejemplo, se pueden contemplar tecnologías de secuenciación de tercera generación para realizar análisis de metilación en todo el genoma en ccfDNA nativo usando secuenciación de nanoporos. Este proceso debería facilitarse por el hecho de que la longitud de los fragmentos de ccfDNA de mejillones es idealmente compatible con plataformas de secuenciación de lectura larga que permiten análisis de metilación de ADN en todo el genoma a partir de una sola corrida de secuenciación sin necesidad de transformaciones químicas.85,86] Esta es una posibilidad interesante, ya que se ha demostrado que los patrones de metilación del ADN reflejan una respuesta al estrés ambiental y persisten durante muchas generaciones. Por lo tanto, puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos subyacentes que rigen la respuesta después de la exposición al cambio climático o contaminantes [87]. Sin embargo, el uso de LB no está exento de limitaciones. Huelga decir que esto requiere la presencia de especies indicadoras en el ecosistema. Como se mencionó anteriormente, el uso de LB para evaluar la biodiversidad de un ecosistema determinado también requiere un riguroso proceso bioinformático que tenga en cuenta la presencia de fragmentos de ADN de la fuente. Otro problema importante es la disponibilidad de genomas de referencia para especies marinas. Se espera que iniciativas como el Proyecto de Genomas de Mamíferos Marinos y el recientemente establecido proyecto Fish10k [88] faciliten este tipo de análisis en el futuro. La aplicación del concepto LB a organismos marinos filtradores también es compatible con los últimos avances en tecnología de secuenciación, lo que la hace idónea para el desarrollo de biomarcadores multiohm que proporcionen información importante sobre la salud de los hábitats marinos en respuesta al estrés ambiental.
Los datos de secuenciación del genoma se han depositado en el Archivo de Lecturas de Secuencias del NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 bajo el Bioproyecto SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacto del cambio climático en la vida marina y los ecosistemas. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Considerar los impactos combinados del cambio climático y otros factores de estrés locales en el medio marino. Entorno científico general. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ciencia del primero de marzo. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La menor tolerancia al calor bajo condiciones de estrés térmico repetitivo explica la alta mortalidad estival de los mejillones azules. Informe científico 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Cambios recientes en la frecuencia, causas y alcance de las muertes de animales. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Múltiples patógenos no específicos de especie pueden haber causado una mortalidad masiva de Pinna nobilis. Vida. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impacto potencial del cambio climático en las enfermedades zoonóticas del Ártico. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mejillones azules (Mytilus edulis spp.) como organismos indicadores en el monitoreo de la contaminación costera: una revisión. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integración de la biopsia líquida en el tratamiento del cáncer. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maduración de la biopsia líquida: permite la circulación del ADN tumoral. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos en plasma humano. Actas de las reuniones de las filiales de la Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nuevo papel para el ADN libre de células como marcador molecular para el tratamiento del cáncer. Cuantificación del análisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. La biopsia líquida llega a la clínica: problemas de implementación y desafíos futuros. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW y otros. El ADN fetal está presente en el plasma y el suero maternos. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Estudio del curso del embarazo y sus complicaciones mediante ARN extracelular circulante en la sangre de mujeres durante el embarazo. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsia líquida: el ADN libre de células del donante se utiliza para detectar lesiones alogénicas en un injerto renal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaciones en el diagnóstico prenatal: secuenciación del genoma del plasma materno. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Detección rápida de patógenos mediante secuenciación metagenómica de nueva generación de fluidos corporales infectados. Nat Medicine. 2021;27:115-24.