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लिक्विड बायोप्सी (एलबी) जैव चिकित्सा क्षेत्र में तेजी से लोकप्रिय हो रही एक अवधारणा है। यह अवधारणा मुख्य रूप से परिसंचारी बाह्यकोशिकीय डीएनए (सीसीएफडीएनए) के टुकड़ों का पता लगाने पर आधारित है, जो विभिन्न ऊतकों में कोशिका मृत्यु के बाद छोटे टुकड़ों के रूप में निकलते हैं। इन टुकड़ों का एक छोटा हिस्सा बाहरी ऊतकों या जीवों से उत्पन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने इस अवधारणा को मसल्स पर लागू किया है, जो अपनी उच्च समुद्री जल निस्पंदन क्षमता के लिए जानी जाने वाली एक प्रहरी प्रजाति है। हम समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों की जैव विविधता के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए विभिन्न स्रोतों से पर्यावरणीय डीएनए टुकड़ों को पकड़ने के लिए मसल्स की प्राकृतिक फिल्टर के रूप में कार्य करने की क्षमता का उपयोग करते हैं। हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि मसल्स के हीमोलिम्फ में डीएनए के टुकड़े होते हैं जिनका आकार 1 से 5 किलोबी तक भिन्न होता है। शॉटगन सीक्वेंसिंग से पता चला कि डीएनए के टुकड़ों की एक बड़ी संख्या बाहरी सूक्ष्मजीवों से उत्पन्न होती है। इनमें, हमें बैक्टीरिया, आर्किया और वायरस के डीएनए टुकड़े मिले, जिनमें तटीय समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों में आमतौर पर पाए जाने वाले विभिन्न जीवों को संक्रमित करने वाले वायरस भी शामिल हैं। निष्कर्षतः, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि मसल्स पर लागू एलबी की अवधारणा समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों में सूक्ष्मजीव विविधता के बारे में ज्ञान का एक समृद्ध लेकिन अभी तक अनछुआ स्रोत है।
समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों की जैव विविधता पर जलवायु परिवर्तन (सीसी) का प्रभाव अनुसंधान का एक तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है। वैश्विक तापमान वृद्धि न केवल महत्वपूर्ण शारीरिक तनाव पैदा करती है, बल्कि समुद्री जीवों की ऊष्मीय स्थिरता की विकासवादी सीमाओं को भी आगे बढ़ाती है, जिससे कई प्रजातियों के आवास प्रभावित होते हैं और वे अधिक अनुकूल परिस्थितियों की तलाश करने के लिए प्रेरित होते हैं [1, 2]। मेटाज़ोअन की जैव विविधता को प्रभावित करने के अलावा, सीसी मेजबान-सूक्ष्मजीव अंतःक्रियाओं के नाजुक संतुलन को भी बिगाड़ देती है। यह सूक्ष्मजीवीय डिसबैक्टीरियोसिस समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों के लिए एक गंभीर खतरा है क्योंकि यह समुद्री जीवों को संक्रामक रोगजनकों के प्रति अधिक संवेदनशील बना देता है [3, 4]। ऐसा माना जाता है कि एसएस सामूहिक मृत्यु में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो वैश्विक समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों के प्रबंधन के लिए एक गंभीर समस्या है [5, 6]। कई समुद्री प्रजातियों के आर्थिक, पारिस्थितिक और पोषण संबंधी प्रभावों को देखते हुए यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। यह विशेष रूप से ध्रुवीय क्षेत्रों में रहने वाले द्विकपाटी जीवों के लिए सच है, जहां सीके के प्रभाव अधिक तात्कालिक और गंभीर होते हैं [6, 7]। वास्तव में, माइटिलस एसपीपी जैसे द्विकपाटी जीव। समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों पर जलवायु परिवर्तन के प्रभावों की निगरानी के लिए इनका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसमें कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि इनके स्वास्थ्य की निगरानी के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में बायोमार्कर विकसित किए गए हैं, जिनमें अक्सर एंजाइमेटिक गतिविधि या कोशिका जीवन क्षमता और फैगोसाइटिक गतिविधि जैसे कोशिकीय कार्यों पर आधारित कार्यात्मक बायोमार्कर को शामिल करते हुए दो-स्तरीय दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है [8]। इन विधियों में विशिष्ट दबाव संकेतकों की सांद्रता का मापन भी शामिल है जो बड़ी मात्रा में समुद्री जल के अवशोषण के बाद नरम ऊतकों में जमा होते हैं। हालांकि, द्विकपाटी जीवों की उच्च निस्पंदन क्षमता और अर्ध-खुली परिसंचरण प्रणाली तरल बायोप्सी (एलबी) की अवधारणा का उपयोग करके नए हेमोलाइम्फ बायोमार्कर विकसित करने का अवसर प्रदान करती है, जो रोगी प्रबंधन के लिए एक सरल और न्यूनतम आक्रामक दृष्टिकोण है। रक्त के नमूने [9, 10]। हालांकि मानव एलबी में कई प्रकार के परिसंचारी अणु पाए जा सकते हैं, यह अवधारणा मुख्य रूप से प्लाज्मा में परिसंचारी बाह्यकोशिकीय डीएनए (सीसीएफडीएनए) खंडों के डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण पर आधारित है। दरअसल, मानव प्लाज्मा में परिसंचारी डीएनए की उपस्थिति 20वीं शताब्दी के मध्य से ज्ञात है [11], लेकिन हाल के वर्षों में ही उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधियों के आगमन से ccfDNA पर आधारित नैदानिक ​​निदान संभव हो पाया है। इन परिसंचारी डीएनए खंडों की उपस्थिति आंशिक रूप से कोशिका मृत्यु के बाद जीनोमिक डीएनए (नाभिकीय और माइटोकॉन्ड्रियल) के निष्क्रिय रिलीज के कारण होती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, ccfDNA की सांद्रता सामान्यतः कम (<10 ng/mL) होती है, लेकिन विभिन्न विकारों से पीड़ित या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, ccfDNA की सांद्रता सामान्यतः कम (<10 ng/mL) होती है, लेकिन विभिन्न विकारों से पीड़ित या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но 5-10 दिनों में एक वर्ष से अधिक समय तक भुगतान किया जा सकता है उत्पाद विवरण: स्वस्थ लोगों में, cccDNA की सांद्रता सामान्यतः कम (<10 ng/mL) होती है, लेकिन विभिन्न विकारों से ग्रस्त रोगियों में या तनाव के कारण ऊतक क्षति होने पर यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है।在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。， ccfdna 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤हाँКонцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут 5-10 दिनों में एक वर्ष से कम समय में एक वर्ष से अधिक समय तक भुगतान किया जा सकता है стрессом, что приводит к повреждению тканей. स्वस्थ व्यक्तियों में ccfDNA की सांद्रता आमतौर पर कम (<10 ng/ml) होती है, लेकिन विभिन्न विकारों या तनाव से ग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है।ccfDNA खंडों का आकार व्यापक रूप से भिन्न होता है, लेकिन आमतौर पर 150 से 200 bp तक होता है। [12] स्व-व्युत्पन्न ccfDNA, अर्थात् सामान्य या रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं से प्राप्त ccfDNA का विश्लेषण, नाभिकीय और/या माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में मौजूद आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे चिकित्सकों को विशिष्ट आणविक-लक्षित उपचारों का चयन करने में सहायता मिलती है। [13] हालांकि, ccfDNA विदेशी स्रोतों से भी प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि गर्भावस्था के दौरान भ्रूण कोशिकाओं से या प्रत्यारोपित अंगों से प्राप्त ccfDNA। [14,15,16,17] ccfDNA संक्रामक एजेंट (विदेशी) के न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए भी जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, जो रक्त संवर्धन द्वारा पहचाने न जाने वाले व्यापक संक्रमणों का गैर-आक्रामक पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे संक्रमित ऊतक की आक्रामक बायोप्सी से बचा जा सकता है। [18] हाल के अध्ययनों से वास्तव में यह पता चला है कि मानव रक्त में वायरल और बैक्टीरियल रोगजनकों की पहचान करने के लिए उपयोगी जानकारी का एक समृद्ध स्रोत मौजूद है, और मानव प्लाज्मा में पाए जाने वाले ccfDNA का लगभग 1% विदेशी मूल का होता है [19]। ये अध्ययन दर्शाते हैं कि ccfDNA विश्लेषण का उपयोग करके किसी जीव के परिसंचारी माइक्रोबायोम की जैव विविधता का आकलन किया जा सकता है। हालांकि, हाल तक, इस अवधारणा का उपयोग केवल मनुष्यों में और कुछ हद तक अन्य कशेरुकी जीवों में ही किया जाता था [20, 21]।
इस शोधपत्र में, हम ऑलाकोमिया एट्रा की सीसीएफ़डीएनए का विश्लेषण करने के लिए एलबी (LB) विधि का उपयोग करते हैं। ऑलाकोमिया एट्रा एक दक्षिणी प्रजाति है जो उप-अंटार्कटिक केर्गुएलन द्वीप समूह में पाई जाती है। यह द्वीप समूह एक विशाल पठार के ऊपर स्थित है जिसका निर्माण 35 मिलियन वर्ष पूर्व ज्वालामुखी विस्फोट से हुआ था। एक इन विट्रो प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि समुद्री जल में मौजूद डीएनए खंड मसल्स द्वारा शीघ्रता से अवशोषित हो जाते हैं और हीमोलिम्फ में प्रवेश कर जाते हैं। शॉटगन अनुक्रमण से पता चला है कि मसल्स के हीमोलिम्फ सीसीएफ़डीएनए में स्वयं के और गैर-स्वयं के डीएनए खंड मौजूद हैं, जिनमें सहजीवी बैक्टीरिया और ठंडे ज्वालामुखी समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों के विशिष्ट बायोम से प्राप्त डीएनए खंड शामिल हैं। हीमोलिम्फ सीसीएफ़डीएनए में विभिन्न मेजबान श्रेणियों वाले वायरसों से प्राप्त वायरल अनुक्रम भी मौजूद हैं। हमने बोनी मछली, समुद्री एनीमोन, शैवाल और कीड़ों जैसे बहुकोशिकीय जीवों से प्राप्त डीएनए खंड भी पाए। निष्कर्षतः, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि एलबी अवधारणा को समुद्री अकशेरुकी जीवों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है ताकि समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों में एक समृद्ध जीनोमिक भंडार उत्पन्न किया जा सके।
वयस्क (55-70 मिमी लंबे) माइटिलस प्लेटेंसिस (एम. प्लेटेंसिस) और औलाकोमिया एट्रा (ए. एट्रा) को दिसंबर 2018 में पोर्ट-औ-फ्रांस (049°21.235 दक्षिण, 070°13.490 पूर्व) केर्गुएलन द्वीप समूह के चट्टानी तटों से एकत्र किया गया था। अन्य वयस्क नीले मसल्स (माइटिलस एसपीपी.) को एक व्यावसायिक आपूर्तिकर्ता (पीईआई मसल किंग इंक., प्रिंस एडवर्ड आइलैंड, कनाडा) से प्राप्त किया गया और उन्हें 10-20 लीटर कृत्रिम खारे पानी (कृत्रिम समुद्री नमक रीफ क्रिस्टल, इंस्टेंट ओशन, वर्जीनिया, यूएसए) से युक्त तापमान नियंत्रित (4°C) हवादार टैंक में रखा गया। प्रत्येक प्रयोग के लिए, प्रत्येक खोल की लंबाई और वजन को मापा गया।
इस कार्यक्रम के लिए एक निःशुल्क ओपन एक्सेस प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध है (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)। संक्षेप में, जैसा कि [22] में वर्णित है, एब्डक्टर मांसपेशियों से LB हीमोलिम्फ एकत्र किया गया था। हीमोलिम्फ को 3 मिनट के लिए 1200×g पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा स्पष्ट किया गया, और सुपरनेटेंट को उपयोग तक -20°C पर जमा दिया गया। cfDNA के पृथक्करण और शुद्धिकरण के लिए, नमूनों (1.5-2.0 मिली) को पिघलाया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार न्यूक्लियोस्नैप cfDNA किट (मैचेरी-नागेल, बेथलहम, पीए) का उपयोग करके संसाधित किया गया। ccfDNA को आगे के विश्लेषण तक -80°C पर संग्रहित किया गया। कुछ प्रयोगों में, ccfDNA को QIAamp DNA इन्वेस्टिगेटर किट (QIAGEN, टोरंटो, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके पृथक और शुद्ध किया गया। शुद्ध किए गए डीएनए की मात्रा का निर्धारण मानक पिकोग्रीन परख विधि का उपयोग करके किया गया। पृथक किए गए ccfDNA के विखंडन वितरण का विश्लेषण एजिलेंट 2100 बायोएनालाइजर (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज इंक., सांता क्लारा, कैलिफोर्निया) का उपयोग करके केशिका विद्युतफोरेसिस द्वारा उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट के साथ किया गया। यह परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 µl ccfDNA नमूने का उपयोग करके की गई।
हीमोलिम्फ ccfDNA खंडों की सीक्वेंसिंग के लिए, जेनोम क्यूबेक (मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) ने इलुमिना MiSeq PE75 किट के इलुमिना DNA मिक्स किट का उपयोग करके शॉटगन लाइब्रेरी तैयार की। एक मानक एडेप्टर (BioO) का उपयोग किया गया। रॉ डेटा फाइलें NCBI सीक्वेंस रीड आर्काइव (SRR8924808 और SRR8924809) से उपलब्ध हैं। बेसिक रीडिंग क्वालिटी का आकलन FastQC [23] का उपयोग करके किया गया। एडेप्टर और खराब गुणवत्ता वाले रीड्स को क्लिप करने के लिए Trimmomatic [24] का उपयोग किया गया है। मिसमैच से बचने के लिए, पेयर्ड एंड्स वाले शॉटगन रीड्स को कम से कम 20 bp के ओवरलैप के साथ लंबे सिंगल रीड्स में FLASH मर्ज किया गया [25]। मर्ज किए गए रीड्स को बाइवाल्व एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई मान < 1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और कम जटिलता वाले अनुक्रमों को DUST [26] का उपयोग करके मास्क किया गया था। मर्ज किए गए रीड्स को बाइवाल्व एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई मान < 1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और कम जटिलता वाले अनुक्रमों को DUST [26] का उपयोग करके मास्क किया गया था। BLASTN और использованием के बारे में अधिक जानें базы данных таксономии двустворчатых моллюсков एन.सी.बी.आई. 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было धूल के कण [26]। पूल्ड रीड्स को एनसीबीआई बाइवाल्व टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू < 1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग की गई थी।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 धूल [26]进行 复杂度 序列的。。。。 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN और использованием के बारे में अधिक जानें таксономической базы данных двустворчатых моллюсков एनसीबीआई (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности धूल का एक बड़ा हिस्सा धूल [26] है। पूल्ड रीड्स को एनसीबीआई बाइवाल्व टैक्सोनॉमिक डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग की गई थी।रीड्स को दो समूहों में विभाजित किया गया: द्विवल्वी अनुक्रमों से संबंधित (जिन्हें यहाँ स्व-रीड्स कहा गया है) और असंबंधित (गैर-स्व-रीड्स)। दोनों समूहों को अलग-अलग MEGAHIT का उपयोग करके कॉन्टिग्स उत्पन्न करने के लिए संयोजित किया गया [27]। इस बीच, एलियन माइक्रोबायोम रीड्स के वर्गीकरण वितरण को Kraken2 [28] का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया और गैलेक्सी [29, 30] पर क्रोना पाई चार्ट द्वारा ग्राफिक रूप से दर्शाया गया। हमारे प्रारंभिक प्रयोगों से इष्टतम केमेर्स को केमेर्स-59 केमेर्स के रूप में निर्धारित किया गया। इसके बाद, अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवॉल्व NCBI डेटाबेस, ई मान < 1e−10 और 60% समरूपता) के साथ संरेखण द्वारा सेल्फ कॉन्टिग्स की पहचान की गई। इसके बाद, अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवॉल्व NCBI डेटाबेस, ई मान < 1e−10 और 60% समरूपता) के साथ संरेखण द्वारा सेल्फ कॉन्टिग्स की पहचान की गई। इस लेख को पढ़ें сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсковNCBI, значение e <1e-10 और 60%) की कुल राशि एक वर्ष से अधिक है। इसके बाद, अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (NCBI बाइवाल्व डेटाबेस, ई मान <1e-10 और 60% समरूपता) के साथ मिलान करके सेल्फ-कॉन्टिग्स की पहचान की गई।BLASTN के लिए आवेदन करें (NCBI के लिए आवेदन पत्र देखें, e 值< 1e-10 和60% अधिक पढ़ेंBLASTN के लिए आवेदन करें (NCBI के लिए आवेदन पत्र देखें, e 值< 1e-10 和60% पिछले वर्ष की तुलना में एक वर्ष से अधिक समय तक ऋण प्राप्त करना BLASTN (NCBI для база данных база данных база данных для) पर एक नया भुगतान प्राप्त हुआ двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). इसके बाद, BLASTN (NCBI बाइवाल्व डेटाबेस, ई मान <1e-10 और 60% समरूपता) के साथ मिलान करके अंतिम एनोटेशन के लिए सेल्फ-कॉन्टिग्स की पहचान की गई। इसके समानांतर, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्स को BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% समरूपता) के साथ एनोटेट किया गया था। इसके समानांतर, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्स को BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% समरूपता) के साथ एनोटेट किया गया था। अधिक पढ़ें помощью BLASTN (база данных ntNCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). इसके समानांतर, विदेशी समूह कॉन्टिग्स को BLASTN (NT NCBI डेटाबेस, e मान <1e-10 और 60% समरूपता) के साथ एनोटेट किया गया था।अधिक पढ़ेंअधिक पढ़ें अधिक पढ़ें анотированы с помощью BLASTN (база данных ntNCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). इसके समानांतर, गैर-स्व समूह कॉन्टिग्स को BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e मान <1e-10 और 60% समरूपता) के साथ एनोटेट किया गया था। ब्लास्टएक्स को गैर-स्वयं कॉन्टिग्स पर भी एनआर और रेफसेक प्रोटीन एनसीबीआई डेटाबेस (ई मान < 1ई-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके आयोजित किया गया था। ब्लास्टएक्स को गैर-स्वयं कॉन्टिग्स पर भी एनआर और रेफसेक प्रोटीन एनसीबीआई डेटाबेस (ई मान < 1ई-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके आयोजित किया गया था। BLASTX ने यूरोपियन यूनियन को एक नया समर्थन दिया है баз данных белка nr и RefSeq NCPI (значение e <1e-10 и гомология 60%). ब्लास्टएक्स को गैर-स्वयं कॉन्टिग्स पर भी एनआर और रेफसेक एनसीबीआई प्रोटीन डेटाबेस (ई मान < 1ई-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके किया गया था।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट। BLASTX ने एक मोबाइल फोन को एक दूसरे से जोड़ा है баз данных белка nr и RefSeq NCPI (значение e <1e-10 и гомология 60%). ब्लास्टएक्स को गैर-स्वयं कॉन्टिग्स पर भी एनआर और रेफसेक एनसीबीआई प्रोटीन डेटाबेस (ई मान <1ई-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके किया गया था।गैर-स्व-कंटिग के BLASTN और BLASTX पूल अंतिम कंटिग्स का प्रतिनिधित्व करते हैं (पूरक फ़ाइल देखें)।
पीसीआर के लिए उपयोग किए गए प्राइमर तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं। ccfDNA लक्ष्य जीनों को प्रवर्धित करने के लिए Taq DNA पॉलीमरेज़ (बायो बेसिक कनाडा, मार्खम, ओंटारियो) का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित अभिक्रिया स्थितियों का उपयोग किया गया: 95°C पर 3 मिनट के लिए विसंतृप्ति, 95°C पर 1 मिनट के लिए, 1 मिनट के लिए निर्धारित एनीलिंग तापमान, 72°C पर 1 मिनट के लिए बढ़ाव, 35 चक्र, और अंत में 72°C पर 10 मिनट के भीतर। पीसीआर उत्पादों को 95 V पर SYBRTM सेफ डीएनए जेल स्टेन (इनविट्रोजन, बर्लिंगटन, ओंटारियो, कनाडा) युक्त एगारोज जैल (1.5%) में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पृथक किया गया था।
मसल्स (माइटिलस एसपीपी.) को 4°C तापमान पर 24 घंटे के लिए 500 मिलीलीटर ऑक्सीजन युक्त समुद्री जल (32 पीएसयू) में अनुकूलित किया गया। मानव गैलेक्टिन-7 सीडीएनए अनुक्रम (एनसीबीआई अभिगम संख्या L07769) को एन्कोड करने वाले एक इंसर्ट युक्त प्लास्मिड डीएनए को 190 μg/μl की अंतिम सांद्रता पर शीशी में मिलाया गया। डीएनए मिलाए बिना समान परिस्थितियों में इनक्यूबेट किए गए मसल्स को नियंत्रण के रूप में लिया गया। तीसरे नियंत्रण टैंक में मसल्स के बिना डीएनए था। समुद्री जल में डीएनए की गुणवत्ता की निगरानी के लिए, प्रत्येक टैंक से निर्धारित समय पर समुद्री जल के नमूने (20 μl; तीन बार) लिए गए। प्लास्मिड डीएनए की ट्रेसबिलिटी के लिए, एलबी मसल्स को निर्धारित समय पर एकत्र किया गया और qPCR और ddPCR द्वारा विश्लेषण किया गया। समुद्री जल में नमक की उच्च मात्रा के कारण, सभी पीसीआर परीक्षणों से पहले नमूनों को पीसीआर गुणवत्ता वाले पानी (1:10) में पतला किया गया।
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) बायोराड क्यूएक्स200 प्रोटोकॉल (मिसिसॉगा, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके किया गया। इष्टतम तापमान निर्धारित करने के लिए तापमान प्रोफ़ाइल का उपयोग करें (तालिका S1)। क्यूएक्स200 ड्रॉप जनरेटर (बायोराड) का उपयोग करके बूंदें उत्पन्न की गईं। डीडीपीसीआर को निम्नानुसार किया गया: 95°C पर 5 मिनट, 95°C पर 30 सेकंड के 50 चक्र और एक निश्चित एनीलिंग तापमान पर 1 मिनट, 72°C पर 30 सेकंड, 4°C पर 5 मिनट और 90°C पर 5 मिनट के भीतर। बूंदों की संख्या और सकारात्मक प्रतिक्रियाओं (प्रतियों की संख्या/µl) को क्यूएक्स200 ड्रॉप रीडर (बायोराड) का उपयोग करके मापा गया। 10,000 से कम बूंदों वाले नमूनों को अस्वीकार कर दिया गया। प्रत्येक डीडीपीसीआर चलाने पर पैटर्न नियंत्रण नहीं किया गया।
qPCR का प्रयोग रोटर-जीन® 3000 (कॉर्बेट रिसर्च, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) और LGALS7 विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके किया गया। सभी मात्रात्मक PCR 20 µl में क्वान्टीफास्ट SYBR ग्रीन PCR किट (QIAGEN) का उपयोग करके किए गए। qPCR की शुरुआत 95°C पर 15 मिनट के इनक्यूबेशन से हुई, जिसके बाद 95°C पर 10 सेकंड और 60°C पर 60 सेकंड के 40 चक्रों को एक डेटा संग्रह के साथ पूरा किया गया। मेल्टिंग कर्व 95°C पर 5 सेकंड, 65°C पर 60 सेकंड और qPCR के अंत में 97°C पर क्रमिक मापों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए। नियंत्रण नमूनों को छोड़कर, प्रत्येक qPCR को तीन बार दोहराया गया।
सीपियों की उच्च निस्पंदन क्षमता को देखते हुए, हमने सबसे पहले यह जांच की कि क्या वे समुद्री जल में मौजूद डीएनए खंडों को छानकर धारण कर सकती हैं। हम यह जानने में भी रुचि रखते थे कि क्या ये खंड उनके अर्ध-खुले लसीका तंत्र में जमा होते हैं। हमने नीले सीपियों के टैंकों में डाले गए घुलनशील डीएनए खंडों के भाग्य का पता लगाकर इस समस्या का प्रायोगिक रूप से समाधान किया। डीएनए खंडों का पता लगाने में आसानी के लिए, हमने मानव गैलेक्टिन-7 जीन युक्त बाहरी (स्वयं का नहीं) प्लास्मिड डीएनए का उपयोग किया। ddPCR समुद्री जल और सीपियों में प्लास्मिड डीएनए खंडों का पता लगाता है। हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि यदि सीपियों की अनुपस्थिति में समुद्री जल में डीएनए खंडों की मात्रा समय के साथ (7 दिनों तक) अपेक्षाकृत स्थिर रहती है, तो सीपियों की उपस्थिति में यह स्तर 8 घंटे के भीतर लगभग पूरी तरह से गायब हो जाता है (चित्र 1a,b)। बाह्य डीएनए के खंडों का पता 15 मिनट के भीतर अंतःवाल्वुलर द्रव और हीमोलिम्फ में आसानी से लगाया जा सकता है (चित्र 1c)। इन खंडों का पता एक्सपोजर के 4 घंटे बाद तक भी लगाया जा सकता है। डीएनए खंडों के संबंध में यह फ़िल्टरिंग गतिविधि बैक्टीरिया और शैवाल की फ़िल्टरिंग गतिविधि के तुलनीय है [31]। ये परिणाम बताते हैं कि मसल्स अपने तरल डिब्बों में विदेशी डीएनए को फ़िल्टर और जमा कर सकते हैं।
समुद्री जल में प्लास्मिड डीएनए की सापेक्ष सांद्रता, मसल्स की उपस्थिति (A) या अनुपस्थिति (B) में, ddPCR द्वारा मापी गई। A में, परिणाम प्रतिशत के रूप में दर्शाए गए हैं, जिसमें बॉक्स की सीमाएँ 75वें और 25वें प्रतिशतक को दर्शाती हैं। फिट किए गए लघुगणकीय वक्र को लाल रंग में दिखाया गया है, और धूसर रंग से छायांकित क्षेत्र 95% विश्वास अंतराल को दर्शाता है। B में, लाल रेखा माध्य को और नीली रेखा सांद्रता के लिए 95% विश्वास अंतराल को दर्शाती है। C में, प्लास्मिड डीएनए के योग के बाद विभिन्न समयों पर मसल्स के हीमोलिम्फ और वाल्वुलर द्रव में प्लास्मिड डीएनए का संचय दिखाया गया है। परिणाम प्रति मिलीलीटर (±SE) में पाए गए पूर्ण प्रतियों की संख्या के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं।
इसके बाद, हमने केर्गुएलन द्वीप समूह पर स्थित सीप के बिस्तरों से एकत्रित सीपों में ccfDNA की उत्पत्ति की जाँच की। केर्गुएलन द्वीप समूह दूरस्थ द्वीपों का एक ऐसा समूह है जहाँ मानवजनित प्रभाव सीमित है। इस उद्देश्य के लिए, सीप के हीमोलिम्फ से cccDNA को पृथक किया गया और मानव cccDNA को शुद्ध करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियों द्वारा शुद्ध किया गया [32, 33]। हमने पाया कि सीपों में हीमोलिम्फ ccfDNA की औसत सांद्रता कम माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर हीमोलिम्फ श्रेणी में है (तालिका S2, पूरक जानकारी देखें)। सांद्रता की यह श्रेणी स्वस्थ लोगों की तुलना में काफी अधिक है (कम नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर), लेकिन दुर्लभ मामलों में, कैंसर रोगियों में, ccfDNA का स्तर कई माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर तक पहुँच सकता है [34, 35]। हीमोलिम्फ ccfDNA के आकार वितरण के विश्लेषण से पता चला कि इन खंडों का आकार बहुत भिन्न होता है, जो 1000 bp से लेकर 5000 bp तक होता है (चित्र 2)। सिलिका-आधारित क्यूआईएम्प इन्वेस्टिगेटर किट का उपयोग करके समान परिणाम प्राप्त किए गए, जो फोरेंसिक विज्ञान में कम सांद्रता वाले डीएनए नमूनों से जीनोमिक डीएनए को तेजी से अलग करने और शुद्ध करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, जिसमें सीसीएफडीएनए [36] शामिल है।
मसल हीमोलिम्फ का प्रतिनिधि ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम। न्यूक्लियोस्नैप प्लाज्मा किट (ऊपर) और क्यूआईएम्प डीएनए इन्वेस्टिगेटर किट से निकाला गया। बी. मसल में हीमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) के वितरण को दर्शाने वाला वायलिन प्लॉट। काली और लाल रेखाएँ क्रमशः माध्यिका और प्रथम तथा तृतीय चतुर्थक को दर्शाती हैं।
मनुष्यों और प्राइमेट्स में पाए जाने वाले ccfDNA का लगभग 1% भाग बाहरी स्रोत से आता है [21, 37]। द्विकपाटी जीवों के अर्ध-खुले परिसंचरण तंत्र, सूक्ष्मजीवों से भरपूर समुद्री जल और मसल्स ccfDNA के आकार वितरण को देखते हुए, हमने यह परिकल्पना की कि मसल्स हीमोलिम्फ ccfDNA में सूक्ष्मजीवों के DNA का एक समृद्ध और विविध भंडार हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने केर्गुएलन द्वीप समूह से एकत्रित औलाकोमिया एट्रा नमूनों से हीमोलिम्फ ccfDNA का अनुक्रमण किया, जिससे 10 मिलियन से अधिक रीड्स प्राप्त हुए, जिनमें से 97.6% गुणवत्ता नियंत्रण में सफल रहे। इसके बाद, BLASTN और NCBI द्विकपाटी डेटाबेस का उपयोग करके इन रीड्स को स्व-स्रोत और गैर-स्व-स्रोत के अनुसार वर्गीकृत किया गया (चित्र S1, पूरक जानकारी)।
मनुष्यों में, नाभिकीय और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दोनों रक्तप्रवाह में छोड़े जा सकते हैं [38]। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में, मसल्स के नाभिकीय जीनोमिक डीएनए का विस्तृत वर्णन करना संभव नहीं था, क्योंकि ए. एट्रा जीनोम का अनुक्रमण या वर्णन नहीं किया गया है। फिर भी, हम द्विवल्वी पुस्तकालय का उपयोग करके अपने स्वयं के मूल के कई ccfDNA खंडों की पहचान करने में सक्षम थे (चित्र S2, पूरक जानकारी)। हमने अनुक्रमित ए. एट्रा जीनों के निर्देशित पीसीआर प्रवर्धन द्वारा अपने स्वयं के मूल के डीएनए खंडों की उपस्थिति की भी पुष्टि की (चित्र 3)। इसी प्रकार, चूंकि ए. एट्रा का माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेस में उपलब्ध है, इसलिए ए. एट्रा के हीमोलिम्फ में माइटोकॉन्ड्रियल ccfDNA खंडों की उपस्थिति के प्रमाण मिल सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए खंडों की उपस्थिति की पुष्टि पीसीआर प्रवर्धन द्वारा की गई (चित्र 3)।
पीसीआर द्वारा प्रवर्धित ए. एट्रा (लाल बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705969) और एम. प्लेटेंसिस (नीले बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705968) के हीमोलिम्फ में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल जीन मौजूद थे। चित्र ब्रेटन एट अल., 2011 से अनुकूलित है। बी. ए. एट्रा के हीमोलिम्फ सुपरनेटेंट का प्रवर्धन। एफटीए पेपर पर संग्रहित। पीसीआर मिश्रण युक्त पीसीआर ट्यूब में सीधे डालने के लिए 3 मिमी पंच का उपयोग करें।
समुद्री जल में प्रचुर मात्रा में सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति को देखते हुए, हमने प्रारंभ में हीमोलिम्फ में सूक्ष्मजीवों के डीएनए अनुक्रमों के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया। इसके लिए हमने दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग किया। पहली रणनीति में क्रैकन2 का उपयोग किया गया, जो एक एल्गोरिदम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण प्रोग्राम है और ब्लास्ट और अन्य उपकरणों के समान सटीकता के साथ सूक्ष्मजीव अनुक्रमों की पहचान कर सकता है [28]। 6719 से अधिक रीड्स को जीवाणु मूल का पाया गया, जबकि 124 और 64 क्रमशः आर्किया और वायरस से थे (चित्र 4)। सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले जीवाणु डीएनए खंड फर्मिक्यूट्स (46%), प्रोटीओबैक्टीरिया (27%) और बैक्टीरियोइडेट्स (17%) थे (चित्र 4a)। यह वितरण समुद्री नीले मसल्स माइक्रोबायोम के पिछले अध्ययनों के अनुरूप है [39, 40]। गैमाप्रोटीओबैक्टीरिया, प्रोटीओबैक्टीरिया का मुख्य वर्ग (44%) था, जिसमें कई वाइब्रियोनेल्स शामिल थे (चित्र 4b)। डीडीपीसीआर विधि ने ए. एट्रा हेमोलाइम्फ के सीसीसीएफडीएनए में विब्रियो डीएनए खंडों की उपस्थिति की पुष्टि की (चित्र 4सी) [41]। सीसीसीएफडीएनए के जीवाणु मूल के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक अतिरिक्त दृष्टिकोण अपनाया गया (चित्र एस2, पूरक जानकारी)। इस मामले में, ओवरलैप होने वाले रीड्स को पेयर्ड-एंड रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया और BLASTN और 1e−3 के e मान और >90% समरूपता वाले कटऑफ का उपयोग करके उन्हें स्व (द्विकपाटी) या गैर-स्व मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया। इस मामले में, ओवरलैप होने वाले रीड्स को पेयर्ड-एंड रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया और BLASTN और 1e−3 के e मान और >90% समरूपता वाले कटऑफ का उपयोग करके उन्हें स्व (द्विकपाटी) या गैर-स्व मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया। этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) और पढ़ें BLASTN और значения e 1e-3 और отсечения с гомологией> 90%। इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को पेयर्ड-एंडेड रीड्स के रूप में एकत्र किया गया और BLASTN और 1e-3 के e मान और >90% समरूपता के कटऑफ का उपयोग करके उन्हें मूल (द्विकपाटी) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया।90% से अधिक लाभ प्राप्त करने के लिए, BLASTN से 1e-3 प्राप्त करने के लिए>90% मेरे पास एक अच्छा विकल्प नहीं है (मैं एक अच्छा विकल्प चुन सकता हूं)।एक बार जब आप ब्लास्ट करना शुरू कर देते हैं, तो आप 1e-3 को बंद कर देते हैं।值和>90% 同源性 的分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые) моллюски) или несобственные по по по поисхождению с использованием ब्लास्टन और 1ई-3 की अधिकतम कीमत> 90%। इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को पेयर्ड-एंडेड रीड्स के रूप में एकत्र किया गया और ई बीएलएएसटीएएन और 1ई-3 मानों और 90% से अधिक की समरूपता सीमा का उपयोग करके स्वयं (द्विकपाटी) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया।चूंकि ए. एट्रा जीनोम का अनुक्रमण अभी तक नहीं हुआ है, इसलिए हमने मेगाहिट नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) असेंबलर की डी नोवो असेंबली रणनीति का उपयोग किया। कुल 147,188 कॉन्टिग्स को आश्रित (द्विकपाटी) मूल के रूप में पहचाना गया। इन कॉन्टिग्स को BLASTN और BLASTX का उपयोग करके 1e-10 के ई-मानों के साथ विस्तारित किया गया। इस रणनीति ने हमें ए. एट्रा ccfDNA में मौजूद 482 गैर-द्विकपाटी खंडों की पहचान करने में सक्षम बनाया। इन डीएनए खंडों में से आधे से अधिक (57%) बैक्टीरिया से प्राप्त हुए थे, मुख्य रूप से गिल सहजीवियों से, जिनमें सल्फोट्रोफिक सहजीवियां और गिल सहजीवी सोलेम्या वेलम शामिल हैं (चित्र 5)।
प्रकार स्तर पर सापेक्ष प्रचुरता। B दो मुख्य संघों (फर्मिक्यूट्स और प्रोटियोबैक्टीरिया) की सूक्ष्मजीव विविधता। ddPCR का प्रतिनिधि प्रवर्धन। C विब्रियो प्रजातियाँ। A. तीन एट्रा हीमोलिम्फ में 16S rRNA जीन (नीला) के खंड।
कुल 482 एकत्रित कॉन्टिग्स का विश्लेषण किया गया। मेटाजेनोमिक कॉन्टिग एनोटेशन (प्रोकेरियोट्स और यूकेरियोट्स) के वर्गीकरण वितरण का सामान्य प्रोफाइल। B BLASTN और BLASTX द्वारा पहचाने गए जीवाणु डीएनए खंडों का विस्तृत वितरण।
क्रैकन2 विश्लेषण से यह भी पता चला कि मसल्स के ccfDNA में आर्कियल डीएनए खंड मौजूद थे, जिनमें यूरीआर्कियोटा (65%), क्रेनार्चियोटा (24%) और थौरमार्चियोटा (11%) के डीएनए खंड शामिल थे (चित्र 6a)। यूरीआर्कियोटा और क्रेनार्चियोटा से प्राप्त डीएनए खंडों की उपस्थिति, जो पहले कैलिफ़ोर्नियाई मसल्स के सूक्ष्मजीव समुदाय में पाए गए थे, आश्चर्यजनक नहीं होनी चाहिए [42]। हालांकि यूरीआर्कियोटा अक्सर चरम स्थितियों से जुड़ा होता है, अब यह माना जाता है कि यूरीआर्कियोटा और क्रेनार्चियोटा दोनों समुद्री क्रायोजेनिक वातावरण में सबसे आम प्रोकैरियोट्स में से हैं [43, 44]। मसल्स में मीथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति आश्चर्यजनक नहीं है, क्योंकि केर्गुएलन पठार पर तल रिसाव से व्यापक मीथेन रिसाव की हालिया रिपोर्टों [45] और केर्गुएलन द्वीप समूह के तट पर देखे गए संभावित माइक्रोबियल मीथेन उत्पादन [46] को देखते हुए।
इसके बाद हमारा ध्यान डीएनए वायरस से प्राप्त रीडिंग पर केंद्रित हुआ। हमारी जानकारी के अनुसार, मसल्स में वायरस की मात्रा का यह पहला ऑफ-टारगेट अध्ययन है। उम्मीद के मुताबिक, हमें बैक्टीरियोफेज (कॉडोविरालेस) के डीएनए खंड मिले (चित्र 6b)। हालांकि, सबसे आम वायरल डीएनए न्यूक्लियोसाइटोवायरस के एक संघ से आता है, जिसे न्यूक्लियर साइटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए वायरस (NCLDV) के नाम से भी जाना जाता है, जिसका जीनोम किसी भी वायरस में सबसे बड़ा होता है। इस संघ के भीतर, अधिकांश डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोविरिडे (58%) और पॉक्सविरिडे (21%) परिवारों से संबंधित हैं, जिनके प्राकृतिक मेजबानों में कशेरुकी और आर्थ्रोपोड शामिल हैं, जबकि इन डीएनए अनुक्रमों का एक छोटा हिस्सा ज्ञात वायरोलॉजिकल शैवाल से संबंधित है। यह समुद्री यूकेरियोटिक शैवाल को संक्रमित करता है। ये अनुक्रम पैंडोरा वायरस से भी प्राप्त किए गए थे, जो किसी भी ज्ञात वायरल वंश के सबसे बड़े जीनोम आकार वाला विशाल वायरस है। दिलचस्प बात यह है कि हीमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमण द्वारा निर्धारित वायरस से संक्रमित ज्ञात मेजबानों की श्रेणी अपेक्षाकृत व्यापक थी (चित्र S3, पूरक जानकारी)। इसमें बैकुलोविरिडे और इरिडोविरिडे जैसे कीटों को संक्रमित करने वाले वायरस, साथ ही अमीबा, शैवाल और कशेरुकी जीवों को संक्रमित करने वाले वायरस शामिल हैं। हमें पिथोवायरस साइबेरिकम जीनोम से मेल खाने वाले अनुक्रम भी मिले। पिथोवायरस (जिन्हें "ज़ोंबी वायरस" भी कहा जाता है) को पहली बार साइबेरिया में 30,000 वर्ष पुराने पर्माफ्रॉस्ट से अलग किया गया था [47]। इस प्रकार, हमारे परिणाम पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं जो दर्शाते हैं कि इन वायरसों की सभी आधुनिक प्रजातियाँ विलुप्त नहीं हैं [48] और ये वायरस दूरस्थ उप-आर्कटिक समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों में मौजूद हो सकते हैं।
अंत में, हमने यह देखने के लिए परीक्षण किया कि क्या हम अन्य बहुकोशिकीय जीवों से डीएनए खंड प्राप्त कर सकते हैं। nt, nr और RefSeq लाइब्रेरी (जीनोमिक और प्रोटीन) के साथ BLASTN और BLASTX द्वारा कुल 482 विदेशी कॉन्टिग्स की पहचान की गई। हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि बहुकोशिकीय जीवों के ccfDNA के विदेशी खंडों में अस्थि हड्डियों के डीएनए की प्रधानता है (चित्र 5)। कीटों और अन्य प्रजातियों के डीएनए खंड भी पाए गए हैं। डीएनए खंडों का एक अपेक्षाकृत बड़ा हिस्सा पहचाना नहीं जा सका है, संभवतः स्थलीय प्रजातियों की तुलना में जीनोमिक डेटाबेस में समुद्री प्रजातियों की बड़ी संख्या के कम प्रतिनिधित्व के कारण [49]।
इस शोधपत्र में, हम मसल्स पर एलबी अवधारणा को लागू करते हुए यह तर्क देते हैं कि हीमोलिम्फ सीसीसीएफडीएनए शॉट सीक्वेंसिंग समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है। विशेष रूप से, हमने पाया कि 1) मसल्स के हीमोलिम्फ में अपेक्षाकृत बड़े (~1-5 केबी) परिसंचारी डीएनए खंडों की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (माइक्रोग्राम स्तर) होती है; 2) ये डीएनए खंड स्वतंत्र और गैर-स्वतंत्र दोनों प्रकार के होते हैं; 3) इन डीएनए खंडों के विदेशी स्रोतों में, हमने जीवाणु, आर्किया और वायरल डीएनए के साथ-साथ अन्य बहुकोशिकीय जीवों का डीएनए भी पाया; 4) हीमोलिम्फ में इन विदेशी सीसीसीएफडीएनए खंडों का संचय तेजी से होता है और मसल्स की आंतरिक फ़िल्टरिंग गतिविधि में योगदान देता है। निष्कर्षतः, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि एलबी की अवधारणा, जिसे अब तक मुख्य रूप से जैव चिकित्सा के क्षेत्र में लागू किया गया है, ज्ञान का एक समृद्ध लेकिन अनछुआ स्रोत है जिसका उपयोग प्रहरी प्रजातियों और उनके पर्यावरण के बीच की परस्पर क्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।
प्राइमेट्स के अलावा, चूहों, कुत्तों, बिल्लियों और घोड़ों सहित स्तनधारियों में ccfDNA अलगाव की रिपोर्ट की गई है [50, 51, 52]। हालांकि, हमारी जानकारी के अनुसार, हमारा अध्ययन खुले परिसंचरण तंत्र वाली समुद्री प्रजातियों में ccfDNA का पता लगाने और अनुक्रमण की रिपोर्ट करने वाला पहला अध्ययन है। मसल्स की यह शारीरिक विशेषता और फ़िल्टर करने की क्षमता, कम से कम आंशिक रूप से, अन्य प्रजातियों की तुलना में परिसंचारी डीएनए खंडों के विभिन्न आकार की विशेषताओं को समझा सकती है। मनुष्यों में, रक्त में परिसंचारी अधिकांश डीएनए खंड 150 से 200 बीपी के आकार के छोटे खंड होते हैं, जिनका अधिकतम शिखर 167 बीपी होता है [34, 53]। डीएनए खंडों का एक छोटा लेकिन महत्वपूर्ण हिस्सा 300 और 500 बीपी के बीच होता है, और लगभग 5% 900 बीपी से लंबे होते हैं [54]। इस आकार वितरण का कारण यह है कि प्लाज्मा में ccfDNA का मुख्य स्रोत कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप होता है, जो स्वस्थ व्यक्तियों में परिसंचारी हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं की कोशिका मृत्यु या परिगलन के कारण या कैंसर रोगियों में ट्यूमर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस (जिसे परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) के रूप में जाना जाता है) के कारण होता है। मसल्स में पाए गए हीमोलिम्फ ccfDNA का आकार वितरण 1000 से 5000 bp तक था, जो यह दर्शाता है कि मसल्स ccfDNA का स्रोत भिन्न है। यह एक तार्किक परिकल्पना है, क्योंकि मसल्स में अर्ध-खुली संवहनी प्रणाली होती है और वे उच्च सांद्रता वाले सूक्ष्मजीव जीनोमिक डीएनए युक्त समुद्री जलीय वातावरण में रहते हैं। वास्तव में, बाह्य डीएनए का उपयोग करके किए गए हमारे प्रयोगशाला प्रयोगों से पता चला है कि मसल्स समुद्री जल में डीएनए खंडों को जमा करते हैं, कम से कम कुछ घंटों के बाद वे कोशिकीय अवशोषण के बाद विघटित हो जाते हैं और/या विभिन्न संरचनाओं में मुक्त और/या संग्रहित हो जाते हैं। प्रोकेरियोटिक और यूकेरियोटिक दोनों प्रकार की कोशिकाओं की दुर्लभता को देखते हुए, वाल्व के भीतर के कंपार्टमेंट का उपयोग स्व-स्रोतों के साथ-साथ विदेशी स्रोतों से प्राप्त ccfDNA की मात्रा को कम कर देगा। द्विकपाटी जीवों की जन्मजात प्रतिरक्षा और परिसंचारी फैगोसाइट्स की बड़ी संख्या को ध्यान में रखते हुए, हमने यह परिकल्पना की कि परिसंचारी फैगोसाइट्स में विदेशी ccfDNA भी प्रचुर मात्रा में पाया जाता है, जो सूक्ष्मजीवों और/या कोशिकीय मलबे के अंतर्ग्रहण पर विदेशी DNA को संचित करते हैं। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि द्विकपाटी जीवों के हीमोलिम्फ में पाया जाने वाला ccfDNA आणविक जानकारी का एक अनूठा भंडार है और प्रहरी प्रजाति के रूप में उनकी स्थिति को सुदृढ़ करता है।
हमारे आंकड़ों से पता चलता है कि जीवाणु-व्युत्पन्न हेमोलाइम्फ ccfDNA खंडों के अनुक्रमण और विश्लेषण से मेजबान जीवाणु वनस्पति और आसपास के समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र में मौजूद जीवाणुओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी मिल सकती है। शॉट अनुक्रमण तकनीकों ने सहजीवी जीवाणु A. atra गिल के अनुक्रमों का खुलासा किया है, जो पारंपरिक 16S rRNA पहचान विधियों का उपयोग करने पर छूट जाते, जिसका आंशिक कारण संदर्भ पुस्तकालय पूर्वाग्रह है। वास्तव में, केर्गुएलन में उसी मसल्स परत में M. platensis से एकत्रित LB डेटा के हमारे उपयोग से पता चला कि गिल से जुड़े जीवाणु सहजीवियों की संरचना दोनों मसल्स प्रजातियों के लिए समान थी (चित्र S4, पूरक जानकारी)। दो आनुवंशिक रूप से भिन्न मसल्स की यह समानता केर्गुएलन के ठंडे, सल्फरयुक्त और ज्वालामुखी निक्षेपों में जीवाणु समुदायों की संरचना को दर्शा सकती है [55, 56, 57, 58]। पोर्ट-औ-फ्रांस के तट जैसे जैव-अशांत तटीय क्षेत्रों से सीपियों की कटाई करते समय सल्फर-कम करने वाले सूक्ष्मजीवों के उच्च स्तर का अच्छी तरह से वर्णन किया गया है [59]। एक अन्य संभावना यह है कि सीपियों के सहजीवी वनस्पति पर क्षैतिज संचरण का प्रभाव पड़ सकता है [60, 61]। समुद्री पर्यावरण, समुद्र तल की सतह और सीपियों में सहजीवी बैक्टीरिया की संरचना के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है। ये अध्ययन वर्तमान में जारी हैं।
समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों में जैव विविधता का आकलन करने के लिए मसल्स ccfDNA का उपयोग करने के कई लाभों में से कुछ हैं: हीमोलिम्फ ccfDNA की लंबाई और सांद्रता, इसके शुद्धिकरण में आसानी और तीव्र शॉटगन अनुक्रमण की अनुमति देने वाली उच्च गुणवत्ता। यह दृष्टिकोण किसी दिए गए पारिस्थितिक तंत्र में वायरल समुदायों (वाइरोम) के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से प्रभावी है [62, 63]। बैक्टीरिया, आर्किया और यूकेरियोट्स के विपरीत, वायरल जीनोम में 16S अनुक्रम जैसे आनुवंशिक रूप से संरक्षित जीन नहीं होते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि मसल्स जैसी संकेतक प्रजातियों से तरल बायोप्सी का उपयोग तटीय समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों में रहने वाले मेजबानों को संक्रमित करने वाले ज्ञात ccfDNA वायरस खंडों की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इसमें प्रोटोजोआ, आर्थ्रोपोड्स, कीड़े, पौधे और जीवाणु वायरस (जैसे, बैक्टीरियोफेज) को संक्रमित करने वाले वायरस शामिल हैं। जब हमने केर्गुएलन में एक ही मसल परत से एकत्रित नीले मसल्स (एम. प्लेटेंसिस) के हीमोलिम्फ ccfDNA वायरोम की जांच की, तो हमें इसी तरह का वितरण मिला (तालिका S2, पूरक जानकारी)। ccfDNA की शॉटगन सीक्वेंसिंग वास्तव में मनुष्यों या अन्य प्रजातियों के वायरोम के अध्ययन में गति पकड़ रही एक नई पद्धति है [21, 37, 64]। यह पद्धति विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस के अध्ययन के लिए उपयोगी है, क्योंकि सभी डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस में कोई भी एक जीन संरक्षित नहीं होता है, जो बाल्टीमोर में वायरस के सबसे विविध और व्यापक वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है [65]। हालांकि इनमें से अधिकांश वायरस अवर्गीकृत हैं और इनमें वायरल दुनिया के पूरी तरह से अज्ञात हिस्से के वायरस शामिल हो सकते हैं [66], हमने पाया कि मसल्स ए. एट्रा और एम. प्लेटेंसिस के वायरोम और मेजबान श्रेणियां दोनों प्रजातियों के बीच समान रूप से आती हैं (चित्र S3 देखें, अतिरिक्त जानकारी)। यह समानता आश्चर्यजनक नहीं है, क्योंकि यह पर्यावरण में मौजूद डीएनए के अवशोषण में चयनात्मकता की कमी को दर्शा सकती है। वर्तमान में, आरएनए वायरोम की विशेषताओं का पता लगाने के लिए शुद्ध आरएनए का उपयोग करके भविष्य में अध्ययन करने की आवश्यकता है।
हमारे अध्ययन में, हमने कोवार्स्की और उनके सहयोगियों [37] के कार्य से अनुकूलित एक अत्यंत कठोर प्रक्रिया का उपयोग किया, जिन्होंने मूल ccfDNA के संयोजन से पहले और बाद में पूल्ड रीड्स और कॉन्टिग्स के दो-चरणीय विलोपन का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में अनमैप्ड रीड्स प्राप्त हुए। इसलिए, हम इस संभावना से इनकार नहीं कर सकते कि इनमें से कुछ अनमैप्ड रीड्स का अपना मूल स्रोत हो सकता है, मुख्य रूप से इसलिए क्योंकि हमारे पास इस सीप प्रजाति के लिए कोई संदर्भ जीनोम नहीं है। हमने इस प्रक्रिया का उपयोग इसलिए भी किया क्योंकि हम स्वयं और गैर-स्वयं रीड्स के बीच काइमेरा और इलुमिना MiSeq PE75 द्वारा उत्पन्न रीड लंबाई के बारे में चिंतित थे। अधिकांश अनमैप्ड रीडिंग का एक अन्य कारण यह है कि अधिकांश समुद्री सूक्ष्मजीव, विशेष रूप से केर्गुएलन जैसे दूरस्थ क्षेत्रों में, एनोटेट नहीं किए गए हैं। हमने इलुमिना MiSeq PE75 का उपयोग किया, जिसमें ccfDNA खंड की लंबाई मानव ccfDNA के समान मानी गई। भविष्य के अध्ययनों के लिए, हमारे परिणामों को देखते हुए, जिनमें दिखाया गया है कि हीमोलिम्फ ccfDNA में मनुष्यों और/या स्तनधारियों की तुलना में लंबी रीड्स होती हैं, हम लंबे ccfDNA खंडों के लिए अधिक उपयुक्त अनुक्रमण प्लेटफॉर्म का उपयोग करने की सलाह देते हैं। इस प्रक्रिया से गहन विश्लेषण के लिए अधिक संकेतों की पहचान करना बहुत आसान हो जाएगा। वर्तमान में अनुपलब्ध संपूर्ण A. atra नाभिकीय जीनोम अनुक्रम प्राप्त करने से स्वयं और गैर-स्वयं स्रोतों से ccfDNA के विभेदन में भी काफी सहायता मिलेगी। चूंकि हमारा शोध मसल्स पर लिक्विड बायोप्सी की अवधारणा को लागू करने की संभावना पर केंद्रित है, हम आशा करते हैं कि भविष्य के शोध में इस अवधारणा के उपयोग से, मसल्स की सूक्ष्मजीव विविधता के अध्ययन के लिए इस विधि की क्षमता बढ़ाने हेतु नए उपकरण और पाइपलाइन विकसित किए जाएंगे।
एक गैर-आक्रामक नैदानिक ​​बायोमार्कर के रूप में, ccfDNA के बढ़े हुए मानव प्लाज्मा स्तर विभिन्न रोगों, ऊतक क्षति और तनाव की स्थितियों से जुड़े होते हैं [67,68,69]। यह वृद्धि ऊतक क्षति के बाद अपने मूल के डीएनए खंडों के निकलने से संबंधित है। हमने तीव्र ताप तनाव का उपयोग करके इस समस्या का समाधान किया, जिसमें मसल्स को थोड़े समय के लिए 30 डिग्री सेल्सियस तापमान पर रखा गया। हमने तीन अलग-अलग प्रकार के मसल्स पर तीन स्वतंत्र प्रयोगों में यह विश्लेषण किया। हालांकि, तीव्र ताप तनाव के बाद ccfDNA के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया (चित्र S5 देखें, अतिरिक्त जानकारी)। यह खोज कम से कम आंशिक रूप से इस तथ्य की व्याख्या कर सकती है कि मसल्स में अर्ध-खुला परिसंचरण तंत्र होता है और उनकी उच्च फ़िल्टरिंग गतिविधि के कारण वे बड़ी मात्रा में बाहरी डीएनए जमा कर लेते हैं। दूसरी ओर, मसल्स, कई अकशेरुकी जीवों की तरह, तनाव-प्रेरित ऊतक क्षति के प्रति अधिक प्रतिरोधी हो सकते हैं, जिससे उनके हीमोलिम्फ में ccfDNA के निकलने को सीमित किया जा सकता है [70, 71]।
आज तक, जलीय पारिस्थितिक तंत्रों में जैव विविधता के डीएनए विश्लेषण में मुख्य रूप से पर्यावरणीय डीएनए (ईडीएनए) मेटाबारकोडिंग पर ध्यान केंद्रित किया गया है। हालांकि, प्राइमर के उपयोग के कारण जैव विविधता विश्लेषण में यह विधि आमतौर पर सीमित होती है। शॉटगन सीक्वेंसिंग का उपयोग पीसीआर की सीमाओं और प्राइमर सेट के पक्षपातपूर्ण चयन को दूर करता है। इस प्रकार, एक तरह से, हमारी विधि हाल ही में उपयोग की जाने वाली उच्च-थ्रूपुट ईडीएनए शॉटगन सीक्वेंसिंग विधि के करीब है, जो खंडित डीएनए को सीधे अनुक्रमित करने और लगभग सभी जीवों का विश्लेषण करने में सक्षम है [72, 73]। हालांकि, कई मूलभूत मुद्दे हैं जो एलबी को मानक ईडीएनए विधियों से अलग करते हैं। निश्चित रूप से, ईडीएनए और एलबी के बीच मुख्य अंतर प्राकृतिक फिल्टर होस्ट का उपयोग है। ईडीएनए के अध्ययन के लिए प्राकृतिक फिल्टर के रूप में स्पंज और बाइवाल्व (ड्रेसेना एसपीपी.) जैसी समुद्री प्रजातियों के उपयोग की सूचना दी गई है [74, 75]। हालांकि, ड्रेसेना के अध्ययन में ऊतक बायोप्सी का उपयोग किया गया था जिससे डीएनए निकाला गया था। एलवी से सीसीसीएफडीएनए के विश्लेषण के लिए ऊतक जैव परीक्षण, विशेष और कभी-कभी महंगे उपकरण और ईडीएनए या ऊतक जैव परीक्षण से जुड़ी व्यवस्था की आवश्यकता नहीं होती है। वास्तव में, हमने हाल ही में बताया है कि एलबी से सीसीसीएफडीएनए को कोल्ड चेन बनाए बिना एफटीए सहायता से संग्रहित और विश्लेषित किया जा सकता है, जो दूरस्थ क्षेत्रों में अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती है [76]। तरल जैव परीक्षण से सीसीसीएफडीएनए का निष्कर्षण भी सरल है और शॉटगन अनुक्रमण और पीसीआर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाला डीएनए प्रदान करता है। ईडीएनए विश्लेषण से जुड़ी कुछ तकनीकी सीमाओं को देखते हुए यह एक बड़ा लाभ है [77]। नमूनाकरण विधि की सरलता और कम लागत दीर्घकालिक निगरानी कार्यक्रमों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। अपनी उच्च फ़िल्टरिंग क्षमता के अलावा, द्विकपाटी जीवों की एक और प्रसिद्ध विशेषता उनके श्लेष्म की रासायनिक म्यूकोपॉलीसेकेराइड संरचना है, जो वायरस के अवशोषण को बढ़ावा देती है [78, 79]। यह द्विकपाटी जीवों को किसी दिए गए जलीय पारिस्थितिकी तंत्र में जैव विविधता और जलवायु परिवर्तन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए एक आदर्श प्राकृतिक फ़िल्टर बनाता है। हालांकि मेजबान से प्राप्त डीएनए खंडों की उपस्थिति को ईडीएनए की तुलना में इस विधि की एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है, लेकिन स्वास्थ्य अध्ययनों के लिए उपलब्ध जानकारी की विशाल मात्रा को देखते हुए, ईडीएनए की तुलना में इस तरह के मूल सीसीएफडीएनए की लागत समझ में आती है। इसमें मेजबान के जीनोम में एकीकृत वायरल अनुक्रमों की उपस्थिति शामिल है। यह विशेष रूप से मसल्स के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि द्विकपाटी जीवों में क्षैतिज रूप से प्रसारित ल्यूकेमिक रेट्रोवायरस मौजूद होते हैं [80, 81]। ईडीएनए पर एलबी का एक अन्य लाभ यह है कि यह हेमोलाइम्फ में परिसंचारी रक्त कोशिकाओं की फैगोसाइटिक गतिविधि का लाभ उठाता है, जो सूक्ष्मजीवों (और उनके जीनोम) को निगल लेती हैं। द्विकपाटी जीवों में रक्त कोशिकाओं का मुख्य कार्य फैगोसाइटोसिस है [82]। अंत में, यह विधि मसल्स की उच्च फ़िल्टरिंग क्षमता (औसतन 1.5 लीटर/घंटा समुद्री जल) और दो-दिवसीय परिसंचरण का लाभ उठाती है, जो समुद्री जल की विभिन्न परतों के मिश्रण को बढ़ाती है, जिससे विषम ईडीएनए को ग्रहण किया जा सकता है। [83, 84]. इस प्रकार, मसल्स के पोषण संबंधी, आर्थिक और पर्यावरणीय प्रभावों को देखते हुए मसल्स ccfDNA विश्लेषण एक दिलचस्प मार्ग है। मनुष्यों से एकत्रित LB के विश्लेषण के समान, यह विधि भी बाह्य पदार्थों के प्रति प्रतिक्रिया में मेजबान DNA में आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों को मापने की संभावना खोलती है। उदाहरण के लिए, नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग करके मूल ccfDNA में जीनोम-व्यापी मेथाइलेशन विश्लेषण करने के लिए तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की कल्पना की जा सकती है। यह प्रक्रिया इस तथ्य से सुगम होनी चाहिए कि मसल्स ccfDNA खंडों की लंबाई आदर्श रूप से लॉन्ग-रीड अनुक्रमण प्लेटफार्मों के साथ संगत है जो रासायनिक रूपांतरणों की आवश्यकता के बिना एक ही अनुक्रमण रन से जीनोम-व्यापी DNA मेथाइलेशन विश्लेषण की अनुमति देते हैं। [85,86] यह एक दिलचस्प संभावना है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि DNA मेथाइलेशन पैटर्न पर्यावरणीय तनाव के प्रति प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं और कई पीढ़ियों तक बने रहते हैं। इसलिए, यह जलवायु परिवर्तन या प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने वाले अंतर्निहित तंत्रों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। [87] हालांकि, एलबी के उपयोग की कुछ सीमाएँ भी हैं। यह स्पष्ट है कि इसके लिए पारिस्थितिकी तंत्र में संकेतक प्रजातियों की उपस्थिति आवश्यक है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, किसी दिए गए पारिस्थितिकी तंत्र की जैव विविधता का आकलन करने के लिए एलबी का उपयोग करने हेतु एक कठोर जैवसूचना विज्ञान प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो स्रोत से डीएनए खंडों की उपस्थिति को ध्यान में रखती है। एक अन्य प्रमुख समस्या समुद्री प्रजातियों के लिए संदर्भ जीनोम की उपलब्धता है। आशा है कि मरीन मैमल जीनोम्स प्रोजेक्ट और हाल ही में स्थापित फिश10के प्रोजेक्ट [88] जैसी पहल भविष्य में इस प्रकार के विश्लेषण को सुगम बनाएंगी। समुद्री फिल्टर-फीडिंग जीवों पर एलबी अवधारणा का अनुप्रयोग अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में नवीनतम प्रगति के साथ भी संगत है, जिससे यह पर्यावरणीय तनाव के प्रति समुद्री आवासों के स्वास्थ्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने वाले मल्टी-ओम बायोमार्कर के विकास के लिए उपयुक्त है।
जीनोम अनुक्रमण डेटा को NCBI सीक्वेंस रीड आर्काइव https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 में बायोप्रोजेक्ट SRR8924808 के तहत जमा कर दिया गया है।
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