Zikomo pochezera Nature.com. Mtundu wa msakatuli womwe mukugwiritsa ntchito uli ndi chithandizo chochepa cha CSS. Kuti mugwiritse ntchito bwino, tikukulimbikitsani kuti mugwiritse ntchito msakatuli wosinthidwa (kapena kuletsa Compatibility Mode mu Internet Explorer). Pakadali pano, kuti tipitirize kukuthandizani, tidzapanga tsamba lino lopanda masitayelo ndi JavaScript.
Liquid biopsy (LB) ndi lingaliro lomwe likutchuka mwachangu m'munda wa zamankhwala. Lingaliroli limachokera makamaka pakupeza zidutswa za DNA yozungulira yakunja (ccfDNA), zomwe zimatulutsidwa makamaka ngati zidutswa zazing'ono maselo atafa m'minofu yosiyanasiyana. Gawo laling'ono la zidutswazi limachokera ku minofu yakunja (yachilendo) kapena zamoyo. Mu ntchito yathu yapano, tagwiritsa ntchito lingaliro ili ku mussels, mtundu wa londa wodziwika ndi mphamvu yawo yayikulu yosefera madzi a m'nyanja. Timagwiritsa ntchito luso la mussels kugwira ntchito ngati zosefera zachilengedwe kuti tigwire zidutswa za DNA zachilengedwe kuchokera kuzinthu zosiyanasiyana kuti tipereke chidziwitso chokhudza mitundu yosiyanasiyana ya zachilengedwe zam'mphepete mwa nyanja. Zotsatira zathu zikuwonetsa kuti hemolymph ya mussel ili ndi zidutswa za DNA zomwe zimasiyana kwambiri kukula, kuyambira 1 mpaka 5 kb. Kutsatana kwa mfuti kunawonetsa kuti zidutswa zambiri za DNA ndi zochokera ku tizilombo tachilendo. Pakati pawo, tinapeza zidutswa za DNA kuchokera ku mabakiteriya, archaea, ndi mavairasi, kuphatikizapo mavairasi odziwika kuti amakhudza anthu osiyanasiyana omwe amapezeka m'malo am'nyanja am'mphepete mwa nyanja. Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB lomwe limagwiritsidwa ntchito pa nkhono limayimira gwero lolemera koma losafufuzidwa la chidziwitso chokhudza kusiyanasiyana kwa tizilombo toyambitsa matenda m'malo okhala m'mphepete mwa nyanja.
Zotsatira za kusintha kwa nyengo (CC) pa zamoyo zosiyanasiyana za m'nyanja ndi gawo lofufuza lomwe likukula mofulumira. Kutentha kwa dziko sikuti kumangoyambitsa mavuto akuluakulu a thupi, komanso kumakankhira malire a kusintha kwa kutentha kwa zamoyo zam'madzi, zomwe zimakhudza malo okhala mitundu ingapo ya zamoyo, zomwe zimawapangitsa kufunafuna mikhalidwe yabwino [1, 2]. Kuwonjezera pa kukhudza zamoyo zosiyanasiyana za m'nyanja, CC imasokoneza mgwirizano wofewa wa kuyanjana kwa tizilombo toyambitsa matenda ndi anthu. Dysbacteriosis ya tizilombo toyambitsa matenda iyi imabweretsa chiopsezo chachikulu ku zamoyo zam'madzi chifukwa imapangitsa zamoyo zam'madzi kukhala zosavuta kugwidwa ndi matenda opatsirana [3, 4]. Amakhulupirira kuti SS imagwira ntchito yofunika kwambiri pakufa kwa anthu ambiri, yomwe ndi vuto lalikulu pa kayendetsedwe ka zamoyo zam'madzi padziko lonse lapansi [5, 6]. Iyi ndi nkhani yofunika kwambiri poganizira za zachuma, zachilengedwe komanso zakudya zomwe mitundu yambiri yam'madzi imakhudzidwa nazo. Izi ndi zoona makamaka kwa ma bivalves okhala m'madera akumpoto, komwe zotsatira za CK zimakhala zachangu komanso zoopsa [6, 7]. Ndipotu, ma bivalves monga Mytilus spp. amagwiritsidwa ntchito kwambiri poyang'anira zotsatira za CC pa zamoyo zam'madzi. Nzosadabwitsa kuti ma biomarker ambiri apangidwa kuti aziyang'anira thanzi lawo, nthawi zambiri pogwiritsa ntchito njira ya magawo awiri yokhudzana ndi ma biomarker ogwira ntchito kutengera ntchito ya enzymatic kapena ntchito zamaselo monga kukhala bwino kwa maselo ndi ntchito ya phagocytic [8]. Njirazi zimaphatikizaponso kuyeza kuchuluka kwa zizindikiro za kupanikizika komwe kumasonkhana m'maselo ofewa pambuyo poyamwa madzi ambiri a m'nyanja. Komabe, mphamvu yayikulu yosefera komanso njira yozungulira ya ma bivalves imapereka mwayi wopanga ma biomarker atsopano a hemolymph pogwiritsa ntchito lingaliro la liquid biopsy (LB), njira yosavuta komanso yocheperako yoyang'anira odwala. [9, 10]. Ngakhale mitundu ingapo ya mamolekyu ozungulira ingapezeke mu LB ya anthu, lingaliroli limachokera makamaka pa kusanthula kwa DNA sequencing kwa zidutswa za DNA yozungulira ya extracellular (ccfDNA) mu plasma. Ndipotu, kukhalapo kwa DNA yozungulira mu plasma ya anthu kwadziwika kuyambira pakati pa zaka za m'ma 1900 [11], koma ndi m'zaka zaposachedwa pomwe kubwera kwa njira zapamwamba zotsatizana kwapangitsa kuti pakhale matenda azachipatala kutengera ccfDNA. Kupezeka kwa zidutswa za DNA zozungulira izi kumachitika chifukwa cha kutulutsidwa kwa DNA ya majini (ya nyukiliya ndi ya mitochondrial) pambuyo pa imfa ya maselo. Mwa anthu athanzi, kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kochepa (<10 ng/mL) koma kumatha kuwonjezeka ndi nthawi 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena omwe akuvutika ndi nkhawa, zomwe zimapangitsa kuti minofu iwonongeke. Mwa anthu athanzi, kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kochepa (<10 ng/mL) koma kumatha kuwonjezeka ndi nthawi 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena omwe akuvutika ndi nkhawa, zomwe zimapangitsa kuti minofu iwonongeke. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться pa 5–10 раз у больныхе пиличай различа приводящему к повреждению тканей. Kwa anthu athanzi, kuchuluka kwa cccDNA nthawi zambiri kumakhala kochepa (<10 ng/mL), koma kumatha kuwonjezeka ndi nthawi 5-10 kwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena omwe ali ndi nkhawa zomwe zimapangitsa kuti minofu iwonongeke.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的悢1者倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （(<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承叅 压5-10 倍 , 从而 组织。。.Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентонтовый стрессом, что приводит к повреждению тканей. Kuchuluka kwa ccfDNA nthawi zambiri kumakhala kotsika (<10 ng/ml) mwa anthu athanzi, koma kumatha kuwonjezeka ndi 5-10 mwa odwala omwe ali ndi matenda osiyanasiyana kapena kupsinjika maganizo, zomwe zimapangitsa kuti minofu iwonongeke.Kukula kwa zidutswa za ccfDNA kumasiyana kwambiri, koma nthawi zambiri kumakhala pakati pa 150 ndi 200 bp. [12]. Kusanthula kwa ccfDNA yodzipangira yokha, mwachitsanzo, ccfDNA kuchokera ku maselo abwinobwino kapena osinthidwa, kungagwiritsidwe ntchito kuzindikira kusintha kwa majini ndi epigenetic komwe kulipo mu genome ya nyukiliya ndi/kapena mitochondrial, motero kumathandiza asing'anga kusankha njira zinazake zochizira mamolekyulu [13]. Komabe, ccfDNA ingapezeke kuchokera kuzinthu zakunja monga ccfDNA kuchokera ku maselo a fetal panthawi ya mimba kapena kuchokera ku ziwalo zobzalidwa [14,15,16,17]. ccfDNA ndi gwero lofunikira la chidziwitso chodziwira kupezeka kwa ma nucleic acid a mankhwala opatsirana (achilendo), zomwe zimathandiza kuzindikira matenda ofala omwe samadziwika ndi ma cultures a magazi, kupewa biopsy yowononga minofu yodwala [18]. Kafukufuku waposachedwapa wasonyeza kuti magazi a munthu ali ndi gwero lochuluka la chidziwitso chomwe chingagwiritsidwe ntchito kuzindikira tizilombo toyambitsa matenda ndi mabakiteriya, ndipo pafupifupi 1% ya ccfDNA yomwe imapezeka mu plasma ya munthu ndi yachilendo [19]. Kafukufukuyu akusonyeza kuti mitundu yosiyanasiyana ya zamoyo zomwe zimazungulira m'thupi imatha kuyesedwa pogwiritsa ntchito kusanthula kwa ccfDNA. Komabe, mpaka posachedwapa, lingaliro ili linkagwiritsidwa ntchito mwa anthu okha, komanso, pang'ono, mwa nyama zina zokhala ndi vertebrate [20, 21].
Mu pepala lino, tikugwiritsa ntchito mphamvu ya LB pofufuza ccfDNA ya Aulacomya atra, mtundu wakum'mwera womwe umapezeka kwambiri ku Zilumba za Kerguelen zomwe zili pansi pa nthaka, gulu la zilumba zomwe zili pamwamba pa phiri lalikulu lomwe linapangidwa zaka 35 miliyoni zapitazo. Pogwiritsa ntchito njira yoyesera ya in vitro, tapeza kuti zidutswa za DNA m'madzi a m'nyanja zimatengedwa mwachangu ndi mussels ndikulowa mu hemolymph compartment. Kutsata mfuti kwawonetsa kuti mussel hemolymph ccfDNA ili ndi zidutswa za DNA zomwe sizimachokera zokha, kuphatikiza mabakiteriya ogwirizana ndi zidutswa za DNA kuchokera ku biomes zomwe zimakhala m'malo ozizira a m'mphepete mwa nyanja. Hemolymph ccfDNA ilinso ndi ma virus omwe amachokera ku ma virus omwe ali ndi mitundu yosiyanasiyana ya host. Tapezanso zidutswa za DNA kuchokera ku nyama zambiri monga mafupa, anemones a m'nyanja, algae ndi tizilombo. Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB lingagwiritsidwe ntchito bwino ku nyama zopanda mafupa am'madzi kuti apange repertoire yolemera ya genomic mu zachilengedwe zam'madzi.
Zamoyo zazikulu (55-70 mm kutalika) za Mytilus platensis (M. platensis) ndi Aulacomya atra (A. atra) zinasonkhanitsidwa kuchokera m'mphepete mwa miyala ya m'mphepete mwa nyanja ya Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Zilumba za Kerguelen mu Disembala 2018. Nkhono zina zazikulu zabuluu (Mytilus spp.) zinapezeka kuchokera kwa ogulitsa malonda (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ndipo zinayikidwa mu thanki yotenthetsera (4°C) yokhala ndi madzi okwana 10–20 L a madzi oundana a 32‰. (mchere wa m'nyanja wopangidwa Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Pa kuyesera kulikonse, kutalika ndi kulemera kwa zipolopolo za munthu payekha kunayesedwa.
Njira yotsegulira yaulere ya pulogalamuyi ikupezeka pa intaneti (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Mwachidule, hemolymph ya LB idasonkhanitsidwa kuchokera ku minofu ya abductor monga momwe tafotokozera [22]. Hemolymph idawunikidwa bwino ndi centrifugation pa 1200 × g kwa mphindi 3, supernatant idazizira (-20°C) mpaka itagwiritsidwa ntchito. Kuti ichotsedwe ndikuyeretsa cfDNA, zitsanzo (1.5-2.0 ml) zidasungunuka ndikukonzedwa pogwiritsa ntchito NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) malinga ndi malangizo a wopanga. ccfDNA idasungidwa pa -80°C mpaka kusanthula kwina. Mu zoyeserera zina, ccfDNA idachotsedwa ndikuyeretsedwa pogwiritsa ntchito QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). DNA yoyeretsedwa idayesedwa pogwiritsa ntchito PicoGreen assay yokhazikika. Kugawa kwa zidutswa za ccfDNA yopatulidwa kunawunikidwa pogwiritsa ntchito capillary electrophoresis pogwiritsa ntchito Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) pogwiritsa ntchito High Sensitivity DNA Kit. Kuyesaku kunachitika pogwiritsa ntchito 1 µl ya chitsanzo cha ccfDNA malinga ndi malangizo a wopanga.
Pofuna kutsata zigawo za hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) adakonza malaibulale a shotgun pogwiritsa ntchito Illumina DNA Mix kit ya Illumina MiSeq PE75 kit. Adaputala yokhazikika (BioO) idagwiritsidwa ntchito. Mafayilo a data osaphika akupezeka kuchokera ku NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ndi SRR8924809). Ubwino wowerengera woyambira udayesedwa pogwiritsa ntchito FastQC [23]. Trimmomatic [24] yagwiritsidwa ntchito podula ma adapter ndi ma read osabwino. Ma read a Shotgun okhala ndi malekezero ophatikizika adaphatikizidwa mu ma read amodzi aatali okhala ndi ma overlap osachepera 20 bp kuti apewe kusagwirizana [25]. Kuwerenga kophatikizidwa kunalembedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito database ya bivalve NCBI Taxonomy (e value < 1e−3 ndi 90% homology), ndipo kubisa ma sequences ovuta kwambiri kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26]. Kuwerenga kophatikizidwa kunalembedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito database ya bivalve NCBI Taxonomy (e value < 1e−3 ndi 90% homology), ndipo kubisa ma sequences ovuta kwambiri kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26]. BLASTN ndi BLASTN kufotokoza momwe mungapangire BLASTN polemba zolemba pamanja za NCBI
гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Kuwerenga kophatikizidwa kunalembedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito database ya NCBI bivalve taxonomy (e value < 1e-3 ndi 90% homology), ndipo kubisa kotsatizana kosavata kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 (（（<1e-3 and 90% 同源） 用 用 注释 合并 读数 ，并 使用荣数 [26]的。。。。BLASTN ndi BLASTN potengera momwe mungagwiritsire ntchito BLASTN pazida zowerengera <9% NCBI гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Kuwerenga kophatikizidwa kunalembedwa ndi BLASTN pogwiritsa ntchito database ya NCBI bivalve taxonomic (e value <1e-3 ndi 90% homology), ndipo kubisa kwa sequence kovuta kwambiri kunachitika pogwiritsa ntchito DUST [26].Ma Reads adagawidwa m'magulu awiri: okhudzana ndi ma bivalve sequences (pano amatchedwa self-reads) ndi osagwirizana (non-self-reads). Magulu awiri adasonkhanitsidwa padera pogwiritsa ntchito MEGAHIT kuti apange ma contigs [27]. Pakadali pano, kugawa kwa taxonomic kwa ma alien microbiome reads kudagawidwa pogwiritsa ntchito Kraken2 [28] ndipo kumayimiridwa mojambula ndi tchati cha Krona pie pa Galaxy [29, 30]. Ma kmers abwino kwambiri adapezeka kuti ndi ma kmers-59 kuchokera ku zoyeserera zathu zoyambirira. Kenako ma contig odziyimira pawokha adazindikirika pogwirizana ndi BLASTN (database ya bivalve NCBI, mtengo wa e < 1e−10 ndi 60% homology) kuti apereke ndemanga yomaliza. Kenako ma contig odziyimira pawokha adazindikirika pogwirizana ndi BLASTN (database ya bivalve NCBI, mtengo wa e < 1e−10 ndi 60% homology) kuti apereke ndemanga yomaliza. BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значени10) ndi BLASTN для окончательной аннотации. Kenako ma self-contig adazindikirika pofananiza ndi BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ndi 60% homology) kuti afotokozedwe komaliza.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐來识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN imakupatsani mwayi woti mugwiritse ntchito BLASTN (pogwiritsa ntchito pulogalamu yaposachedwa ya NCBI, NCBI, значение e <1e-10 ndi гомология 60%). Kenako ma self-contig adazindikirika kuti afotokozedwe komaliza pofananiza ndi BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ndi 60% homology). Mofananamo, magulu osakhala aumwini adalembedwa ndi BLASTN (database ya nt NCBI, mtengo wa e < 1e−10 ndi 60% homology). Mofananamo, magulu osakhala aumwini adalembedwa ndi BLASTN (database ya nt NCBI, mtengo wa e < 1e−10 ndi 60% homology). BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 ndi гомология 60%). Mofananamo, magulu akunja adalembedwa ndi BLASTN (database ya NT NCBI, mtengo wa e <1e-10 ndi 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, знагогние 0 <6e-0%). Mofananamo, magulu osadziyimira pawokha adalembedwa ndi BLASTN (database ya nt NCBI, mtengo wa e <1e-10 ndi 60% homology). BLASTX idachitidwanso pa ma nonself contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ndi 60% homology). BLASTX idachitidwanso pa ma nonself contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ndi 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr ndi RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ndi 6%). BLASTX idachitidwanso pa ma non-self contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq NCBI protein databases (e value < 1e-10 ndi 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 ndi 60%). BLASTX idachitidwanso pa ma non-self contigs pogwiritsa ntchito nr ndi RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 ndi 60% homology).Magulu a BLASTN ndi BLASTX a zinthu zomwe sizimadzigwirizanitsa okha akuyimira magawo omaliza (onani fayilo yowonjezera).
Ma primer omwe amagwiritsidwa ntchito pa PCR alembedwa mu Table S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) idagwiritsidwa ntchito kukulitsa majini ofunikira a ccfDNA. Zinthu zotsatirazi zidagwiritsidwa ntchito: denaturation pa 95°C kwa mphindi zitatu, 95°C kwa mphindi imodzi, kutentha kwa annealing kwa mphindi imodzi, elongation pa 72°C kwa mphindi imodzi, ma cycle 35, ndipo potsiriza 72°C mkati mwa mphindi 10. . Zogulitsa za PCR zidalekanitsidwa ndi electrophoresis mu agarose gels (1.5%) yokhala ndi SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) pa 95 V.
Nkhono (Mytilus spp.) zinazolowereka m'madzi a m'nyanja okwana 500 ml okometsedwa ndi mpweya (32 PSU) kwa maola 24 pa 4°C. DNA ya plasmid yokhala ndi cholembera cholembera chomwe chimagwiritsa ntchito njira ya human galectin-7 cDNA (NCBI accession number L07769) inawonjezedwa ku vial pamlingo womaliza wa 190 μg/μl. Nkhono zomwe zinayikidwa pansi pa mikhalidwe yomweyi popanda kuwonjezera DNA ndizo zinali zowongolera. Thanki yachitatu yowongolera inali ndi DNA yopanda nkhono. Kuti ayang'anire ubwino wa DNA m'madzi a m'nyanja, zitsanzo za madzi a m'nyanja (20 μl; kubwereza katatu) zinatengedwa kuchokera ku thanki iliyonse panthawi yomwe yasonyezedwa. Kuti DNA ya plasmid ipezeke mosavuta, nkhono za LB zinasonkhanitsidwa panthawi yomwe yasonyezedwa ndikuwunikidwa ndi qPCR ndi ddPCR. Chifukwa cha mchere wambiri m'madzi a m'nyanja, ma aliquots adasungunuka m'madzi abwino a PCR (1:10) mayeso onse a PCR asanayesedwe.
Kuyeza kwa digito kwa madontho a PCR (ddPCR) kunachitidwa pogwiritsa ntchito njira ya BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Gwiritsani ntchito mawonekedwe a kutentha kuti mudziwe kutentha koyenera (Table S1). Madontho anapangidwa pogwiritsa ntchito jenereta ya madontho a QX200 (BioRad). ddPCR inachitidwa motere: 95°C kwa mphindi 5, ma cycle 50 a 95°C kwa masekondi 30 ndi kutentha koperekedwa kwa mphindi 1 ndi 72°C kwa masekondi 30, 4°C kwa mphindi 5 ndi 90°C mkati mwa mphindi 5. Chiwerengero cha madontho ndi zotsatira zabwino (chiwerengero cha makope/µl) chinayesedwa pogwiritsa ntchito chowerengera madontho a QX200 (BioRad). Zitsanzo zokhala ndi madontho osakwana 10,000 zinakanidwa. Kuwongolera mawonekedwe sikunachitike nthawi iliyonse ddPCR ikagwiritsidwa ntchito.
qPCR idachitidwa pogwiritsa ntchito Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) ndi ma primer apadera a LGALS7. Ma PCR onse owerengeka adachitidwa mu 20 µl pogwiritsa ntchito QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR idayambitsidwa ndi kulowetsedwa kwa mphindi 15 pa kutentha kwa 95°C kutsatiridwa ndi ma cycle 40 pa kutentha kwa 95°C kwa masekondi 10 ndi pa kutentha kwa 60°C kwa masekondi 60 ndi kusonkhanitsa deta kamodzi. Ma curve osungunuka adapangidwa pogwiritsa ntchito miyeso yotsatizana pa 95°C kwa masekondi 5, 65°C kwa masekondi 60, ndi 97°C kumapeto kwa qPCR. qPCR iliyonse idachitidwa katatu, kupatula zitsanzo zowongolera.
Popeza nkhono zimadziwika ndi kuchuluka kwa kusefera kwamphamvu, choyamba tinafufuza ngati zingathe kusefera ndikusunga zidutswa za DNA zomwe zili m'madzi a m'nyanja. Tinalinso ndi chidwi chofuna kudziwa ngati zidutswazi zimasonkhana m'thupi lawo lotseguka. Tinathetsa vutoli mwa kuyesa pofufuza zomwe zachitika chifukwa cha zidutswa za DNA zosungunuka zomwe zawonjezeredwa ku matanki a nkhono zabuluu. Kuti tithandize kutsata zidutswa za DNA, tinagwiritsa ntchito DNA ya plasmid yachilendo (osati yokha) yokhala ndi jini la human galectin-7. ddPCR imatsata zidutswa za DNA ya plasmid m'madzi a m'nyanja ndi nkhono. Zotsatira zathu zikusonyeza kuti ngati kuchuluka kwa zidutswa za DNA m'madzi a m'nyanja kukanakhalabe kofanana pakapita nthawi (mpaka masiku 7) popanda nkhono, ndiye kuti pamaso pa nkhono mulingo uwu unatha pafupifupi mkati mwa maola 8 (Chithunzi 1a,b). Zidutswa za DNA yakunja zinapezeka mosavuta mkati mwa mphindi 15 mu madzi amkati ndi hemolymph (Chithunzi 1c). Zidutswa izi zikanatha kupezeka mpaka maola 4 mutalowa. Ntchito yosefera iyi yokhudzana ndi zidutswa za DNA ikufanana ndi ntchito yosefera ya mabakiteriya ndi algae [31]. Zotsatirazi zikusonyeza kuti nkhono zimatha kusefa ndikusonkhanitsa DNA yachilendo m'magawo awo amadzimadzi.
Kuchuluka kwa DNA ya plasmid m'madzi a m'nyanja ngati pali (A) kapena palibe (B), kuyezedwa ndi ddPCR. Mu A, zotsatira zake zimafotokozedwa ngati maperesenti, ndipo malire a mabokosi akuyimira ma percentiles a 75 ndi 25. Mzere wozungulira wa logarithmic ukuwonetsedwa mu wofiira, ndipo dera lomwe lili ndi imvi likuyimira nthawi yodalirika ya 95%. Mu B, mzere wofiira ukuyimira apakati ndipo mzere wabuluu ukuyimira nthawi yodalirika ya 95%. C Kusonkhanitsa DNA ya plasmid mu hemolymph ndi valvular fluid ya mussels nthawi zosiyanasiyana pambuyo powonjezera DNA ya plasmid. Zotsatira zake zimaperekedwa ngati makope athunthu opezeka/mL (±SE).
Kenako, tinafufuza komwe kunachokera ccfDNA mu nkhono zomwe zinasonkhanitsidwa kuchokera ku nkhono pa Zilumba za Kerguelen, gulu la zilumba zakutali zomwe zili ndi mphamvu yochepa yochokera kwa anthu. Pachifukwa ichi, cccDNA yochokera ku nkhono za hemolymph inachotsedwa ndikuyeretsedwa pogwiritsa ntchito njira zomwe zimagwiritsidwa ntchito kwambiri poyeretsa cccDNA ya anthu [32, 33]. Tinapeza kuti kuchuluka kwa hemolymph ccfDNA mu nkhono kuli mu micrograms zochepa pa ml ya hemolymph (onani Table S2, Zowonjezera Zowonjezera). Kuchuluka kumeneku kumakhala kwakukulu kwambiri kuposa kwa anthu athanzi (nanograms zochepa pa milliliter), koma nthawi zina, mwa odwala khansa, kuchuluka kwa ccfDNA kumatha kufika ma micrograms angapo pa milliliter [34, 35]. Kusanthula kwa kukula kwa hemolymph ccfDNA kunawonetsa kuti zidutswazi zimasiyana kwambiri kukula, kuyambira 1000 bp mpaka 1000 bp. mpaka 5000 bp (Chithunzi 2). Zotsatira zofananazi zinapezeka pogwiritsa ntchito QIAamp Investigator Kit yochokera ku silica, njira yomwe imagwiritsidwa ntchito kwambiri mu sayansi ya forensic kuti ipatule ndikuyeretsa DNA ya genomic mwachangu kuchokera ku zitsanzo za DNA zochepa, kuphatikizapo ccfDNA [36].
Electrophoregram yoyimira ccfDNA ya hemolymph ya nkhono. Yotengedwa ndi NucleoSnap Plasma Kit (pamwamba) ndi QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin plot yosonyeza kufalikira kwa hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) mu nkhono. Mizere yakuda ndi yofiira ikuyimira ma quartiles apakati ndi oyamba ndi achitatu, motsatana.
Pafupifupi 1% ya ccfDNA mwa anthu ndi anyani ili ndi gwero lachilendo [21, 37]. Popeza njira yozungulira ya bivalves, madzi a m'nyanja olemera tizilombo toyambitsa matenda, komanso kukula kwa ccfDNA ya mussel, tinaganiza kuti ccfDNA ya mussel hemolymph ikhoza kukhala ndi DNA ya tizilombo toyambitsa matenda yochuluka komanso yosiyanasiyana. Kuti tiyese lingaliro ili, tinasanthula ccfDNA ya hemolymph hemolymph kuchokera ku zitsanzo za Aulacomya atra zomwe zinasonkhanitsidwa kuchokera ku Zilumba za Kerguelen, zomwe zinapereka ma read oposa 10 miliyoni, 97.6% mwa iwo adapambana kulamulira khalidwe. Ma read adagawidwa malinga ndi magwero a iwo eni ndi omwe si a iwo eni pogwiritsa ntchito ma database a BLASTN ndi NCBI bivalve (Chithunzi S1, Zowonjezera).
Mwa anthu, DNA ya nyukiliya ndi mitochondrial imatha kutulutsidwa m'magazi [38]. Komabe, mu kafukufukuyu, sizinatheke kufotokoza mwatsatanetsatane DNA ya majini a nyukiliya ya mussels, popeza genome ya A. atra sinasankhidwe kapena kufotokozedwa. Komabe, tinatha kuzindikira zidutswa zingapo za ccfDNA zomwe tinachokera pogwiritsa ntchito laibulale ya bivalve (Chithunzi S2, Zowonjezera). Tinatsimikiziranso kukhalapo kwa zidutswa za DNA zomwe tinachokera potengera PCR amplification ya majini a A. atra omwe adasankhidwe (Chithunzi 3). Mofananamo, popeza genome ya mitochondrial ya A. atra ikupezeka m'ma database a anthu onse, munthu angapeze umboni wa kukhalapo kwa zidutswa za mitochondrial ccfDNA mu hemolymph ya A. atra. Kupezeka kwa zidutswa za mitochondrial DNA kunatsimikiziridwa ndi PCR amplification (Chithunzi 3).
Majini osiyanasiyana a mitochondrial analipo mu hemolymph ya A. atra (madontho ofiira - nambala ya stock: SRX5705969) ndi M. platensis (madontho abuluu - nambala ya stock: SRX5705968) yowonjezeredwa ndi PCR. Chithunzi chosinthidwa kuchokera ku Breton et al., 2011 B Kukula kwa hemolymph supernatant kuchokera ku A. atra Yosungidwa pa pepala la FTA. Gwiritsani ntchito 3 mm punch kuti muwonjezere mwachindunji ku chubu cha PCR chokhala ndi PCR mix.
Popeza kuti tizilombo toyambitsa matenda tili m'madzi a m'nyanja, poyamba tinayang'ana kwambiri pa momwe DNA ya tizilombo toyambitsa matenda imagwirira ntchito mu hemolymph. Kuti tichite izi, timagwiritsa ntchito njira ziwiri zosiyana. Njira yoyamba idagwiritsa ntchito Kraken2, pulogalamu yogawa ma algorithm yomwe ingathe kuzindikira ma bacterial sequences molondola mofanana ndi BLAST ndi zida zina [28]. Kuwerenga kopitilira 6719 kudapezeka kuti ndi kochokera ku bakiteriya, pomwe 124 ndi 64 zidachokera ku archaea ndi ma virus, motsatana (Chithunzi 4). Zidutswa zambiri za DNA ya bakiteriya zinali Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ndi Bacteroidetes (17%) (Chithunzi 4a). Kugawa kumeneku kukugwirizana ndi maphunziro am'mbuyomu a marine blue mussel microbiome [39, 40]. Gammaproteobacteria inali gulu lalikulu la Proteobacteria (44%), kuphatikiza ma Vibrionales ambiri (Chithunzi 4b). Njira ya ddPCR inatsimikizira kupezeka kwa zidutswa za Vibrio DNA mu ccfDNA ya A. atra hemolymph (Chithunzi 4c) [41]. Kuti mudziwe zambiri zokhudza chiyambi cha bakiteriya cha ccfDNA, njira yowonjezera inagwiritsidwa ntchito (Chithunzi S2, Zowonjezera). Pankhaniyi, ma read omwe adalumikizana adasonkhanitsidwa ngati ma read a paired-end ndipo adagawidwa ngati a self (bivalves) kapena nonself origin pogwiritsa ntchito BLASTN ndi e value ya 1e−3 ndi cutoff yokhala ndi >90% homology. Pankhaniyi, ma read omwe adalumikizana adasonkhanitsidwa ngati ma read a paired-end ndipo adagawidwa ngati a self (bivalves) kapena nonself origin pogwiritsa ntchito BLASTN ndi e value ya 1e−3 ndi cutoff yokhala ndi >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ndi были классифицированы как собственыство (двый) чужие по происхождению с использованием BLASTN ndi значения e 1e-3 ndi отсечения с гомологией> 90%. Pankhaniyi, mawerengedwe ophatikizana adasonkhanitsidwa ngati mawerengedwe ophatikizana ndipo adagawidwa ngati achikhalidwe (bivalve) kapena osakhala apachiyambi pogwiritsa ntchito BLASTN ndi e value ya 1e-3 ndipo adadulidwa ndi >90% homology.在這种情况下，重叠的读数组装為配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的值和>90%同源性的截止值分类為自身（双壳类）或非自身來源.在 這 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 為配 末端 读数 , 使用 使用 1e-3 d 1e-3 d 90% > 90%自身 （双 壳类） 非 自身。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ndi классифицированы как собственные (двуствор в парными концами) несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ndi 1e-3 ndi kutulutsa гомологии> 90%. Pankhaniyi, kuwerenga kophatikizana kunasonkhanitsidwa ngati kuwerenga komaliza ndipo kunagawidwa ngati kochokera ku ma bivalves kapena kochokera ku ma original pogwiritsa ntchito ma e BLASTN ndi ma values ​​a 1e-3 ndi mulingo wofanana >90%.Popeza genome ya A. atra sinakonzedwebe, tinagwiritsa ntchito njira yosonkhanitsira ya de novo ya MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler. Ma contig okwana 147,188 apezeka kuti ndi odalira (ma bivalves) ochokera. Ma contig awa adaphulitsidwa ndi ma e-values ​​​​a 1e-10 pogwiritsa ntchito BLASTN ndi BLASTX. Njirayi idatilola kuzindikira zidutswa 482 zomwe sizili bivalve zomwe zili mu A. atra ccfDNA. Zoposa theka (57%) za zidutswa za DNA izi zidapezeka kuchokera ku mabakiteriya, makamaka kuchokera ku ma gill symbionts, kuphatikiza ma sulfotrophic symbionts, komanso kuchokera ku ma gill symbionts Solemya velum (Chithunzi 5).
Kuchuluka koyerekeza pamlingo wa mtundu. B Kusiyanasiyana kwa tizilombo toyambitsa matenda ta phyla ziwiri zazikulu (Firmicutes ndi Proteobacteria). Kuwonjezeka koyimira kwa ddPCR C Vibrio spp. A. Zidutswa za jini ya 16S rRNA (buluu) mu ma hemolymph atatu a atra.
Ma contig okwana 482 omwe anasonkhanitsidwa anawunikidwa. Mbiri yonse ya kufalikira kwa taxonomic kwa metagenomic contig annotations (prokaryotes ndi eukaryotes). B Kufalikira mwatsatanetsatane kwa zidutswa za DNA ya bakiteriya zomwe zinadziwika ndi BLASTN ndi BLASTX.
Kusanthula kwa Kraken2 kunawonetsanso kuti nkhono za ccfDNA zinali ndi zidutswa za DNA zakale, kuphatikizapo zidutswa za DNA za Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ndi Thaurmarcheota (11%) (Chithunzi 6a). Kupezeka kwa zidutswa za DNA zochokera ku Euryarchaeota ndi Crenarchaeota, zomwe kale zinali m'gulu la tizilombo toyambitsa matenda a nkhono za ku California, sikuyenera kudabwitsa [42]. Ngakhale kuti Euryarchaeota nthawi zambiri imagwirizanitsidwa ndi zinthu zoopsa kwambiri, tsopano zadziwika kuti Euryarchaeota ndi Crenarcheota zonse ndi zina mwa ma prokaryotes odziwika kwambiri m'malo okhala ndi cryogenic m'nyanja [43, 44]. Kupezeka kwa tizilombo toyambitsa matenda a methanogenic m'nkhono sizodabwitsa, poganizira malipoti aposachedwa a kutuluka kwa methane kuchokera pansi pa Kerguelen Plateau [45] komanso kuthekera kwa kupanga methane ya tizilombo toyambitsa matenda komwe kwawonedwa m'mphepete mwa nyanja ya Kerguelen Islands [46].
Kenako chidwi chathu chinasamukira ku mawerengedwe ochokera ku ma virus a DNA. Monga momwe tikudziwira, uwu ndi kafukufuku woyamba wosakhudzana ndi kuchuluka kwa ma virus mu mussels. Monga momwe timayembekezera, tinapeza zidutswa za DNA za bacteriophages (Caudovirales) (Chithunzi 6b). Komabe, DNA yodziwika bwino ya ma virus imachokera ku phylum ya nucleocytoviruses, yomwe imadziwikanso kuti nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), yomwe ili ndi genome yayikulu kwambiri kuposa kachilombo kalikonse. Mkati mwa phylum iyi, ma DNA sequences ambiri ndi a m'banja la Mimimidoviridae (58%) ndi Poxviridae (21%), omwe ali ndi nyama zam'mimba ndi arthropods, pomwe gawo laling'ono la ma DNA awa ndi a algae odziwika bwino. Amakhudza algae ya m'nyanja ya eukaryotic. Ma DNA sequences adapezekanso kuchokera ku kachilombo ka Pandora, kachilombo kamene kali ndi genome yayikulu kwambiri kuposa mitundu ina iliyonse yodziwika bwino ya ma virus. Chochititsa chidwi n'chakuti, kuchuluka kwa anthu omwe amadziwika kuti ali ndi kachilomboka, monga momwe zimakhalira ndi hemolymph ccfDNA sequencing, kunali kwakukulu (Chithunzi S3, Zowonjezera). Zimaphatikizapo mavairasi omwe amapatsira tizilombo monga Baculoviridae ndi Iridoviridae, komanso mavairasi omwe amapatsira amoeba, algae ndi zamoyo zam'mimba. Tinapezanso ma sequence ofanana ndi genome ya Pithovirus sibericum. Ma Pitovirus (omwe amadziwikanso kuti "zombie virus") adayamba kupezedwa kuchokera ku permafrost yazaka 30,000 ku Siberia [47]. Chifukwa chake, zotsatira zathu zikugwirizana ndi malipoti am'mbuyomu omwe akuwonetsa kuti si mitundu yonse yamakono ya mavairasi awa yomwe yatha [48] ndipo mavairasi awa akhoza kukhala m'malo akutali a m'nyanja.
Pomaliza, tinayesa kuti tiwone ngati tingapeze zidutswa za DNA kuchokera ku nyama zina zokhala ndi maselo ambiri. BLASTN ndi BLASTX anapeza zinthu 482 zakunja zomwe zili ndi malaibulale a nt, nr ndi RefSeq (majini ndi mapuloteni). Zotsatira zathu zikusonyeza kuti pakati pa zidutswa zakunja za ccfDNA za nyama zokhala ndi maselo ambiri, DNA ya mafupa a mafupa imapezeka kwambiri (Chithunzi 5). Zidutswa za DNA kuchokera ku tizilombo ndi mitundu ina zapezekanso. Gawo lalikulu la zidutswa za DNA silinapezeke, mwina chifukwa cha kuchepa kwa mitundu yambiri ya m'madzi m'ma database a majini poyerekeza ndi mitundu ya padziko lapansi [49].
Mu pepala lino, tikugwiritsa ntchito lingaliro la LB pa nkhono, ponena kuti hemolymph ccfDNA shot sequencing ingapereke chidziwitso cha kapangidwe ka zamoyo zam'mphepete mwa nyanja. Makamaka, tapeza kuti 1) nkhono hemolymph ili ndi kuchuluka kwakukulu (ma microgram levels) a zidutswa zazikulu za DNA (~1-5 kb) zozungulira; 2) zidutswa za DNA izi zonse ndi zodziyimira pawokha komanso zosadziyimira pawokha 3) Pakati pa magwero akunja a zidutswa za DNA izi, tapeza DNA ya bakiteriya, yakale ndi ya kachilombo, komanso DNA ya nyama zina zambiri; 4) Kusonkhanitsa zidutswa za ccfDNA zakunja izi mu hemolymph kumachitika mwachangu ndipo kumathandizira kuti ntchito yosefera mkati mwa nkhono igwire ntchito. Pomaliza, kafukufuku wathu akuwonetsa kuti lingaliro la LB, lomwe lagwiritsidwa ntchito makamaka m'munda wa biomedicine, limalemba gwero lolemera koma losafufuzidwa la chidziwitso lomwe lingagwiritsidwe ntchito kumvetsetsa bwino mgwirizano pakati pa mitundu ya sentinel ndi malo awo.
Kuwonjezera pa anyani, ccfDNA yolekanitsidwa yanenedwa mwa nyama zoyamwitsa, kuphatikizapo mbewa, agalu, amphaka, ndi akavalo [50, 51, 52]. Komabe, malinga ndi zomwe tikudziwa, kafukufuku wathu ndiye woyamba kunena za kupezeka ndi kutsatizana kwa ccfDNA m'mitundu ya m'nyanja yokhala ndi njira yotseguka yoyendera magazi. Mbali imeneyi ya thupi ndi luso losefera la mussels, pang'ono pang'ono, lingathe kufotokoza kukula kosiyana kwa zidutswa za DNA zoyendayenda poyerekeza ndi mitundu ina. Mwa anthu, zidutswa zambiri za DNA zomwe zimayendayenda m'magazi ndi zidutswa zazing'ono zomwe zimakhala ndi kukula kuyambira 150 mpaka 200 bp. ndi chiwongola dzanja chachikulu cha 167 bp [34, 53]. Gawo laling'ono koma lofunika kwambiri la zidutswa za DNA lili pakati pa 300 ndi 500 bp, ndipo pafupifupi 5% ndi lalitali kuposa 900 bp. [54]. Chifukwa cha kufalikira kwa kukula kumeneku ndikuti gwero lalikulu la ccfDNA mu plasma limachitika chifukwa cha kufa kwa maselo, mwina chifukwa cha kufa kwa maselo kapena chifukwa cha kufalikira kwa maselo ozungulira hematopoietic mwa anthu athanzi kapena chifukwa cha apoptosis ya maselo otupa mwa odwala khansa (yomwe imadziwika kuti circulating tumor DNA). , ctDNA). Kufalikira kwa kukula kwa hemolymph ccfDNA komwe tidapeza mu mussels kunali kuyambira 1000 mpaka 5000 bp, zomwe zikusonyeza kuti mussel ccfDNA ili ndi chiyambi chosiyana. Iyi ndi lingaliro lomveka bwino, popeza mussels ali ndi semi-open vascular system ndipo amakhala m'malo am'madzi am'madzi okhala ndi kuchuluka kwakukulu kwa microbial genomic DNA. Ndipotu, kuyesa kwathu kwa labotale pogwiritsa ntchito exogenous DNA kwawonetsa kuti mussels amasonkhanitsa zidutswa za DNA m'madzi am'nyanja, osachepera maola ochepa pambuyo pake amawonongeka pambuyo poti maselo atengedwa ndi/kapena kutulutsidwa ndi/kapena kusungidwa m'mabungwe osiyanasiyana. Popeza maselo (omwe ndi a prokaryotic ndi eukaryotic) ndi ochepa, kugwiritsa ntchito magawo a intravalvular kudzachepetsa kuchuluka kwa ccfDNA kuchokera ku magwero odziyimira pawokha komanso ochokera kumayiko akunja. Poganizira kufunika kwa chitetezo chamthupi cha bivalve komanso kuchuluka kwa ma phagocyte ozungulira, tinaganizanso kuti ngakhale ccfDNA yakunja imakhala ndi ma phagocyte ozungulira omwe amasonkhanitsa DNA yakunja akameza tizilombo toyambitsa matenda ndi/kapena zinyalala zamaselo. Potengera zonse, zotsatira zathu zikuwonetsa kuti bivalve hemolymph ccfDNA ndi malo apadera osungira chidziwitso cha mamolekyu ndipo zimalimbitsa udindo wawo ngati mtundu wa londa.
Deta yathu ikusonyeza kuti kutsata ndi kusanthula zidutswa za hemolymph ccfDNA zochokera ku bakiteriya kungapereke chidziwitso chofunikira chokhudza zomera za bakiteriya zomwe zimapezeka komanso mabakiteriya omwe ali m'nyanja yozungulira. Njira zotsatana ndi mivi zavumbula kutsatana kwa mabakiteriya a commensal A. atra gill omwe akanasowa ngati njira zodziwika bwino za 16S rRNA zikanagwiritsidwa ntchito, chifukwa cha kusagwirizana kwa laibulale yowunikira. Ndipotu, kugwiritsa ntchito kwathu deta ya LB yomwe idasonkhanitsidwa kuchokera ku M. platensis mu gawo lomwelo la mussel ku Kerguelen kunawonetsa kuti kapangidwe ka mabakiteriya ogwirizana ndi gill anali ofanana pa mitundu yonse ya mussel (Chithunzi S4, Zowonjezera). Kufanana kumeneku kwa mussels awiri osiyana majini kungasonyeze kapangidwe ka mabakiteriya m'malo ozizira, a sulfure, ndi a volcano a Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Miyezo yambiri ya tizilombo toyambitsa matenda tochepetsa sulfure yafotokozedwa bwino pokolola mussels kuchokera kumadera a m'mphepete mwa nyanja omwe ali ndi bioturbated [59], monga gombe la Port-au-France. Kuthekera kwina ndikuti zomera za nkhono za commensal zitha kukhudzidwa ndi kufalikira kwa m'mphepete [60, 61]. Kafukufuku wowonjezereka akufunika kuti adziwe mgwirizano pakati pa chilengedwe cha m'nyanja, pamwamba pa nyanja, ndi kapangidwe ka mabakiteriya ogwirizana mu nkhono. Maphunziro awa akupitilira pano.
Kutalika ndi kuchuluka kwa hemolymph ccfDNA, kusavuta kwake kuyeretsa, komanso khalidwe labwino kwambiri lolola kutsatizana mwachangu kwa mfuti ndi zina mwa zabwino zambiri zogwiritsira ntchito mussel ccfDNA poyesa mitundu yosiyanasiyana ya zamoyo m'mphepete mwa nyanja. Njira imeneyi ndi yothandiza kwambiri pofotokozera magulu a mavairasi (viromes) m'chilengedwe china [62, 63]. Mosiyana ndi mabakiteriya, archaea, ndi eukaryotes, majini a mavairasi alibe majini osungidwa ndi phylogenetically monga 16S sequences. Zotsatira zathu zikusonyeza kuti majini ochokera ku mitundu yowonetsa monga mussels angagwiritsidwe ntchito kuzindikira kuchuluka kwakukulu kwa zidutswa za kachilombo ka ccfDNA zomwe zimadziwika kuti zimayambitsa anthu omwe nthawi zambiri amakhala m'chilengedwe cha m'nyanja. Izi zikuphatikizapo mavairasi omwe amadziwika kuti amakhudza ma protozoa, arthropods, tizilombo, zomera, ndi mavairasi a bakiteriya (monga bacteriophages). Kugawa kofananako kunapezeka pamene tinafufuza hemolymph ccfDNA virome ya mussels ya buluu (M. platensis) yomwe inasonkhanitsidwa mu gawo lomwelo la mussel ku Kerguelen (Table S2, Zowonjezera). Kusanthula kwa mfuti ya ccfDNA ndi njira yatsopano yomwe ikupita patsogolo pophunzira za virome ya anthu kapena mitundu ina [21, 37, 64]. Njirayi ndi yothandiza kwambiri pophunzira mavairasi a DNA okhala ndi mikwingwirima iwiri, popeza palibe jini imodzi yomwe imasungidwa pakati pa mavairasi onse a DNA okhala ndi mikwingwirima iwiri, omwe akuyimira gulu la mavairasi osiyanasiyana komanso ambiri ku Baltimore [65]. Ngakhale kuti mavairasi ambiriwa sanasankhidwe m'magulu ndipo angaphatikizepo mavairasi ochokera kudera losadziwika bwino la dziko la mavairasi [66], tapeza kuti ma viromes ndi magulu a mussels A. atra ndi M. platensis ali pakati pa mitundu iwiriyi mofanana (onani chithunzi S3, zambiri zowonjezera). Kufanana kumeneku sikudabwitsa, chifukwa kungasonyeze kusowa kwa kusankha pakutengera DNA komwe kulipo m'chilengedwe. Maphunziro amtsogolo pogwiritsa ntchito RNA yoyeretsedwa pakadali pano akufunika kuti afotokoze RNA virome.
Mu kafukufuku wathu, tinagwiritsa ntchito njira yolimba kwambiri yochokera ku ntchito ya Kowarski ndi anzake [37], omwe adagwiritsa ntchito njira ziwiri zochotsera zowerengera ndi zolumikizana pamodzi asanayambe komanso atasonkhanitsa ccfDNA yachilengedwe, zomwe zidapangitsa kuti chiwerengero chachikulu cha zowerengera zosajambulidwa chikhalebe ndi chiyambi chawo, makamaka chifukwa tilibe genome yofotokozera za mtundu uwu wa nkhono. Tinagwiritsanso ntchito njira iyi chifukwa tinkada nkhawa ndi ma chimera pakati pa zowerengera zaumwini ndi zosakhala zaumwini komanso kutalika kwa zowerengera zomwe zimapangidwa ndi Illumina MiSeq PE75. Chifukwa china chomwe ma readings ambiri osajambulidwa ndichakuti ma virus ambiri am'madzi, makamaka m'madera akutali monga Kerguelen, sanatchulidwe. Tinagwiritsa ntchito Illumina MiSeq PE75, poganiza kuti kutalika kwa zidutswa za ccfDNA kuli kofanana ndi ccfDNA ya anthu. Pa kafukufuku wamtsogolo, popeza zotsatira zathu zikusonyeza kuti hemolymph ccfDNA imakhala ndi kuwerenga kwakutali kuposa anthu ndi/kapena nyama zoyamwitsa, tikupangira kugwiritsa ntchito njira yotsatirira yomwe ingakhale yoyenera kwambiri pazidutswa zazitali za ccfDNA. Kuchita izi kupangitsa kuti zikhale zosavuta kuzindikira zizindikiro zambiri kuti ziwunikidwe mozama. Kupeza mndandanda wathunthu wa genome ya nyukiliya ya A. atra yomwe sikupezeka pakadali pano kungathandizenso kwambiri kusiyanitsa ccfDNA kuchokera ku magwero ake komanso omwe si ake. Popeza kafukufuku wathu wayang'ana kwambiri kuthekera kogwiritsa ntchito lingaliro la biopsy yamadzimadzi ku mussels, tikukhulupirira kuti popeza lingaliroli likugwiritsidwa ntchito mu kafukufuku wamtsogolo, zida zatsopano ndi mapaipi adzapangidwa kuti awonjezere kuthekera kwa njira iyi yophunzirira kusiyanasiyana kwa tizilombo toyambitsa matenda a mussels.
Monga chizindikiro chachipatala chosavulaza, kuchuluka kwa ccfDNA m'magazi mwa anthu kumagwirizanitsidwa ndi matenda osiyanasiyana, kuwonongeka kwa minofu, ndi mavuto [67,68,69]. Kuwonjezeka kumeneku kumakhudzana ndi kutulutsidwa kwa zidutswa za DNA zomwe zimachokera pambuyo pa kuwonongeka kwa minofu. Tinakambirana nkhaniyi pogwiritsa ntchito kutentha kwakukulu, komwe nkhono zinawonetsedwa kwakanthawi kutentha kwa 30 °C. Tinachita kusanthula kumeneku pa mitundu itatu yosiyanasiyana ya nkhono m'mayesero atatu odziyimira pawokha. Komabe, sitinapeze kusintha kulikonse mu milingo ya ccfDNA pambuyo pa kutentha kwakukulu (onani Chithunzi S5, zambiri zowonjezera). Kupeza kumeneku kungafotokoze, pang'ono, mfundo yakuti nkhono zili ndi njira yozungulira magazi yotseguka ndipo zimasonkhanitsa DNA yambiri yachilendo chifukwa cha ntchito yawo yosefera kwambiri. Kumbali ina, nkhono, monga zamoyo zambiri zopanda mafupa, zimatha kukhala zolimbana kwambiri ndi kuwonongeka kwa minofu komwe kumabwera chifukwa cha kupsinjika, motero zimaletsa kutulutsidwa kwa ccfDNA mu hemolymph yawo [70, 71].
Mpaka pano, kusanthula kwa DNA kwa zamoyo zosiyanasiyana m'madzi a m'nyanja kwakhala kukuyang'ana kwambiri pa DNA yachilengedwe (eDNA) metabarcoding. Komabe, njira iyi nthawi zambiri imakhala yochepa pakusanthula zamoyo zosiyanasiyana pamene ma primer akugwiritsidwa ntchito. Kugwiritsa ntchito shotgun sequencing kumapewa zoletsa za PCR ndi kusankha kosagwirizana kwa ma primer sets. Chifukwa chake, mwanjira ina, njira yathu ili pafupi ndi njira yogwiritsira ntchito high-throughput eDNA Shotgun sequencing yomwe yagwiritsidwa ntchito posachedwa, yomwe imatha kutsata mwachindunji DNA yogawanika ndikusanthula pafupifupi zamoyo zonse [72, 73]. Komabe, pali nkhani zingapo zazikulu zomwe zimasiyanitsa LB ndi njira zodziwika bwino za eDNA. Zachidziwikire, kusiyana kwakukulu pakati pa eDNA ndi LB ndikugwiritsa ntchito ma filter hosts achilengedwe. Kugwiritsa ntchito mitundu ya m'madzi monga masiponji ndi ma bivalves (Dresseina spp.) ngati fyuluta yachilengedwe yophunzirira eDNA kwanenedwa [74, 75]. Komabe, kafukufuku wa Dreissena adagwiritsa ntchito ma biopsies a minofu omwe DNA idachotsedwamo. Kusanthula kwa ccfDNA kuchokera ku LB sikufuna biopsy ya minofu, zida zapadera komanso nthawi zina zodula komanso zinthu zokhudzana ndi eDNA kapena biopsy ya minofu. Ndipotu, posachedwapa tanena kuti ccfDNA kuchokera ku LB ikhoza kusungidwa ndikusanthulidwa ndi chithandizo cha FTA popanda kusunga unyolo wozizira, zomwe ndi vuto lalikulu pa kafukufuku m'madera akutali [76]. Kutulutsa ccfDNA kuchokera ku biopsies yamadzimadzi ndikosavuta ndipo kumapereka DNA yapamwamba kwambiri yotsatizana ndi shotgun ndi kusanthula kwa PCR. Uwu ndi mwayi waukulu poganizira zina mwazofooka zaukadaulo zokhudzana ndi kusanthula kwa eDNA [77]. Kusavuta komanso mtengo wotsika wa njira yotsatsira zitsanzo ndizoyeneranso makamaka pamapulogalamu owunikira nthawi yayitali. Kuphatikiza pa luso lawo lalikulu losefera, chinthu china chodziwika bwino cha bivalves ndi kapangidwe ka mucopolysaccharide ka mucus wawo, komwe kumalimbikitsa kuyamwa kwa mavairasi [78, 79]. Izi zimapangitsa bivalves kukhala fyuluta yoyenera yachilengedwe yofotokozera zamoyo zosiyanasiyana komanso momwe kusintha kwa nyengo kumakhudzira chilengedwe cha m'madzi. Ngakhale kukhalapo kwa zidutswa za DNA zochokera ku host kungawoneke ngati cholepheretsa cha njira poyerekeza ndi eDNA, mtengo wokhudzana ndi kukhala ndi ccfDNA yochokera ku host poyerekeza ndi eDNA umamveka nthawi yomweyo chifukwa cha zambiri zomwe zilipo pa maphunziro azaumoyo. Izi zikuphatikizapo kukhalapo kwa ma virus sequences ophatikizidwa mu genome ya host host. Izi ndizofunikira kwambiri kwa mussels, chifukwa cha kukhalapo kwa ma retroviruses ofalikira mopingasa mu bivalves [80, 81]. Ubwino wina wa LB kuposa eDNA ndikuti umagwiritsa ntchito ntchito ya phagocytic ya maselo amagazi ozungulira mu hemolymph, yomwe imameza tizilombo toyambitsa matenda (ndi majini awo). Phagocytosis ndiye ntchito yayikulu ya maselo amagazi mu bivalves [82]. Pomaliza, njira iyi imagwiritsa ntchito mphamvu yayikulu yosefera ya mussels (pafupifupi 1.5 l/h ya madzi a m'nyanja) ndi kuyenda kwa masiku awiri, zomwe zimawonjezera kusakanikirana kwa zigawo zosiyanasiyana za madzi a m'nyanja, zomwe zimathandiza kuti eDNA ya heterologous igwire. [83, 84]. Motero, kusanthula kwa nkhono za ccfDNA ndi njira yosangalatsa poganizira za zotsatira za nkhono pazakudya, zachuma, komanso zachilengedwe. Mofanana ndi kusanthula kwa LB komwe kwasonkhanitsidwa kuchokera kwa anthu, njira iyi imatsegulanso mwayi woyesa kusintha kwa majini ndi epigenetic mu DNA ya wolandira poyankha zinthu zakunja. Mwachitsanzo, ukadaulo wowerengera wa mibadwo yachitatu ukhoza kuganiziridwa kuti uchite kusanthula kwa methylation ya genome mu ccfDNA yachilengedwe pogwiritsa ntchito nanopore sequencing. Njirayi iyenera kuthandizidwa ndi mfundo yakuti kutalika kwa zidutswa za nkhono za ccfDNA kumagwirizana bwino ndi nsanja zowerengera zakale zomwe zimalola kusanthula kwa methylation ya DNA ya genome kuchokera ku sequencing imodzi popanda kufunikira kusintha kwa mankhwala.85,86] Izi ndizotheka zosangalatsa, chifukwa zawonetsedwa kuti mapangidwe a methylation ya DNA amawonetsa yankho ku kupsinjika kwa chilengedwe ndipo amapitilira kwa mibadwo yambiri. Chifukwa chake, ikhoza kupereka chidziwitso chofunikira pa njira zomwe zimayambitsa kuyankha pambuyo pokumana ndi kusintha kwa nyengo kapena zodetsa [87]. Komabe, kugwiritsa ntchito LB sikuli kopanda malire. Mosakayikira, izi zimafuna kukhalapo kwa mitundu yowonetsa mu chilengedwe. Monga tafotokozera pamwambapa, kugwiritsa ntchito LB poyesa zamoyo zosiyanasiyana za chilengedwe china kumafunanso njira yolimba ya bioinformatics yomwe imaganizira kupezeka kwa zidutswa za DNA kuchokera ku gwero. Vuto lina lalikulu ndi kupezeka kwa majini ofunikira a zamoyo zam'madzi. Tikukhulupirira kuti mapulogalamu monga Marine Mammal Genomes Project ndi pulojekiti ya Fish10k yomwe yakhazikitsidwa posachedwapa [88] athandizira kusanthula koteroko mtsogolo. Kugwiritsa ntchito lingaliro la LB pa zamoyo zam'madzi zodyetsa zosefera kumagwirizananso ndi kupita patsogolo kwaposachedwa muukadaulo wotsatizana, zomwe zimapangitsa kuti zikhale zoyenera kwambiri pakupanga ma biomarker a multi-ohm kuti apereke chidziwitso chofunikira chokhudza thanzi la malo okhala m'madzi poyankha kupsinjika kwa chilengedwe.
Deta yokhudza kutsata kwa majini yasungidwa mu NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pansi pa Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Zotsatira za kusintha kwa nyengo pa zamoyo zam'madzi ndi zachilengedwe. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ndi ena. Taganizirani za zotsatira za kusintha kwa nyengo ndi zinthu zina zomwe zimayambitsa mavuto m'deralo pa chilengedwe cha m'nyanja. chilengedwe cha sayansi. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Sayansi yoyamba ya Marichi. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Kuchepa kwa kupirira kutentha pansi pa kutentha mobwerezabwereza kumafotokoza za imfa zambiri za blue mussels m'chilimwe. Lipoti la sayansi 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ndi ena. Kusintha kwaposachedwa kwa kuchuluka kwa imfa, zomwe zimayambitsa komanso kuchuluka kwa imfa za nyama. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Tizilombo toyambitsa matenda tambiri tokhala ndi mitundu ingapo titha kuyambitsa kufa kwa anthu ambiri a Pinna nobilis. Moyo. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Zotsatira zomwe zingachitike chifukwa cha kusintha kwa nyengo pa matenda a zoonotic ku Arctic. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ndi ena. Nkhono zabuluu (Mytilus edulis spp.) monga zizindikiro za zamoyo mu kuyang'anira kuipitsidwa kwa m'mphepete mwa nyanja: ndemanga. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Kuphatikiza kwa biopsy yamadzimadzi mu chithandizo cha khansa. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, ndi ena. Kukhwima kwa biopsy yamadzimadzi: Kumalola DNA ya chotupa kufalikira. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic acids mu plasma ya anthu. Zolemba za msonkhano wa mabungwe a Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Udindo watsopano wa DNA yopanda maselo monga chizindikiro cha mamolekyulu pochiza khansa. Kuyeza kwa kusanthula kwa biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Kufufuza kwa madzi m'thupi kumalowa m'chipatala - mavuto okhudzana ndi kukhazikitsa ndi mavuto amtsogolo. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ndi ena. DNA ya mwana wosabadwayo imapezeka mu plasma ya amayi ndi seramu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Kafukufuku wa nthawi ya mimba ndi mavuto ake pogwiritsa ntchito RNA yozungulira kunja kwa thupi m'magazi a akazi panthawi ya mimba. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, ndi ena. Kufufuza kwamadzimadzi: DNA yopanda maselo operekedwa imagwiritsidwa ntchito kuzindikira zilonda za allogeneic mu graft ya impso. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations mu diagnostics prenatal: mother's plasma genome sequencing. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, ndi ena. Kuzindikira mwachangu matenda opatsirana pogwiritsa ntchito njira yatsopano yodziwira madzi amthupi omwe ali ndi kachilombo. Nat Medicine. 2021;27:115-24.