Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Жидкостная биопсия (ЖБ) — это концепция, быстро набирающая популярность в биомедицинской области. В основе этой концепции лежит обнаружение фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (цВДНК), которые в основном высвобождаются в виде небольших фрагментов после гибели клеток в различных тканях. Небольшая часть этих фрагментов происходит из чужеродных (чужеродных) тканей или организмов. В данной работе мы применили эту концепцию к мидиям, индикаторному виду, известному своей высокой способностью к фильтрации морской воды. Мы используем способность мидий выступать в качестве естественных фильтров для улавливания фрагментов ДНК из окружающей среды из различных источников, чтобы получить информацию о биоразнообразии морских прибрежных экосистем. Наши результаты показывают, что гемолимфа мидий содержит фрагменты ДНК, размер которых сильно варьируется, от 1 до 5 кб. Секвенирование методом «дробовика» показало, что большое количество фрагментов ДНК имеет чужеродное микробное происхождение. Среди них мы обнаружили фрагменты ДНК бактерий, архей и вирусов, включая вирусы, известные своей способностью инфицировать различных хозяев, обычно встречающихся в прибрежных морских экосистемах. В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB, примененная к мидиям, представляет собой богатый, но пока еще неизученный источник знаний о микробном разнообразии в морских прибрежных экосистемах.
Влияние изменения климата (ИК) на биоразнообразие морских экосистем является быстро развивающейся областью исследований. Глобальное потепление не только вызывает значительные физиологические стрессы, но и расширяет эволюционные пределы термостойкости морских организмов, влияя на среду обитания ряда видов и побуждая их искать более благоприятные условия [1, 2]. Помимо влияния на биоразнообразие многоклеточных организмов, ИК нарушает хрупкий баланс взаимодействий хозяин-микроб. Этот микробный дисбактериоз представляет серьезную угрозу для морских экосистем, поскольку делает морские организмы более восприимчивыми к инфекционным патогенам [3, 4]. Считается, что СС играют важную роль в массовой гибели, что является серьезной проблемой для управления глобальными морскими экосистемами [5, 6]. Это важная проблема, учитывая экономические, экологические и пищевые последствия для многих морских видов. Это особенно актуально для двустворчатых моллюсков, обитающих в полярных регионах, где последствия ИК более непосредственны и серьезны [6, 7]. В действительности, двустворчатые моллюски, такие как Mytilus spp., широко используются для мониторинга воздействия CC на морские экосистемы. Неудивительно, что для мониторинга их состояния было разработано сравнительно большое количество биомаркеров, часто с использованием двухуровневого подхода, включающего функциональные биомаркеры, основанные на ферментативной активности или клеточных функциях, таких как жизнеспособность клеток и фагоцитарная активность [8]. Эти методы также включают измерение концентрации специфических индикаторов давления, которые накапливаются в мягких тканях после поглощения большого количества морской воды. Однако высокая фильтрационная способность и полуоткрытая циркуляционная система двустворчатых моллюсков предоставляют возможность разработки новых биомаркеров гемолимфы с использованием концепции жидкостной биопсии (ЖБ), простого и минимально инвазивного подхода к ведению пациентов. Образцы крови [9, 10]. Хотя в человеческой ЖБ можно обнаружить несколько типов циркулирующих молекул, эта концепция в основном основана на анализе секвенирования ДНК фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) в плазме. В действительности, наличие циркулирующей ДНК в плазме человека известно с середины XX века [11], но только в последние годы появление высокопроизводительных методов секвенирования привело к клинической диагностике на основе циркулирующей ДНК. Наличие этих фрагментов циркулирующей ДНК частично обусловлено пассивным высвобождением геномной ДНК (ядерной и митохондриальной) после гибели клеток. У здоровых людей концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл), но может увеличиваться в 5–10 раз у пациентов, страдающих различными патологиями или подвергающихся стрессу, что приводит к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл), но может увеличиваться в 5–10 раз у пациентов, страдающих различными патологиями или подвергающихся стрессу, что приводит к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме недостаточна (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с хронической патологией или постоянным стрессом, приводящим к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация cccDNA обычно низкая (<10 нг/мл), но у пациентов с различными патологиями или в условиях стресса, приводящего к повреждению тканей, она может увеличиваться в 5–10 раз.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл, 5-10 мг/мл.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 нг/мл) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл) у здоровых людей, но может быть увеличена в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл) у здоровых людей, но может увеличиваться в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей.Размер фрагментов ccfDNA сильно варьируется, но обычно составляет от 150 до 200 п.н. [12]. Анализ ccfDNA собственного происхождения, т.е. ccfDNA из нормальных или трансформированных клеток хозяина, может быть использован для обнаружения генетических и эпигенетических изменений, присутствующих в ядерном и/или митохондриальном геноме, что помогает клиницистам выбирать специфические молекулярно-целевые методы лечения [13]. Однако ccfDNA может быть получена из чужеродных источников, таких как ccfDNA из клеток плода во время беременности или из трансплантированных органов [14,15,16,17]. ccfDNA также является важным источником информации для обнаружения присутствия нуклеиновых кислот инфекционного агента (чужеродного), что позволяет неинвазивно выявлять распространенные инфекции, не обнаруживаемые культурами крови, избегая инвазивной биопсии инфицированной ткани [18]. Недавние исследования действительно показали, что кровь человека содержит богатый источник информации, который можно использовать для идентификации вирусных и бактериальных патогенов, и что около 1% ccfDNA, обнаруженной в плазме человека, имеет чужеродное происхождение [19]. Эти исследования демонстрируют, что биоразнообразие циркулирующего микробиома организма можно оценить с помощью анализа ccfDNA. Однако до недавнего времени эта концепция использовалась исключительно у людей и, в меньшей степени, у других позвоночных [20, 21].
В данной работе мы используем потенциал ЛБ для анализа циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) Aulacomya atra, южного вида, широко распространенного на субантарктических островах Кергелен, группе островов на большом плато, образовавшемся 35 миллионов лет назад в результате вулканического извержения. Используя экспериментальную систему in vitro, мы обнаружили, что фрагменты ДНК в морской воде быстро поглощаются мидиями и попадают в гемолимфу. Секвенирование методом дробовика показало, что ccfDNA гемолимфы мидий содержит фрагменты ДНК собственного и чужеродного происхождения, включая симбиотические бактерии и фрагменты ДНК из биомов, типичных для холодных вулканических морских прибрежных экосистем. ccfDNA гемолимфы также содержит вирусные последовательности, полученные от вирусов с различным кругом хозяев. Мы также обнаружили фрагменты ДНК многоклеточных животных, таких как костистые рыбы, морские анемоны, водоросли и насекомые. В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB может быть успешно применена к морским беспозвоночным для создания богатого геномного репертуара в морских экосистемах.
Взрослые особи (55-70 мм длиной) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) были собраны на прибрежных скалистых берегах Порт-о-Франс (049°21.235 ю.ш., 070°13.490 в.д.) на островах Кергелен в декабре 2018 года. Другие взрослые особи синих мидий (Mytilus spp.) были получены от коммерческого поставщика (PEI Mussel King Inc., остров Принца Эдуарда, Канада) и помещены в аэрируемый резервуар с регулируемой температурой (4°C), содержащий 10–20 л искусственного рассола с концентрацией 32‰ (искусственная морская соль Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, США). Для каждого эксперимента измерялись длина и вес отдельных раковин.
Протокол этой программы с открытым доступом доступен онлайн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Вкратце, гемолимфу LB собирали из отводящих мышц, как описано [22]. Гемолимфу осветляли центрифугированием при 1200×g в течение 3 минут, супернатант замораживали (-20°C) до использования. Для выделения и очистки цДНК образцы (1,5-2,0 мл) размораживали и обрабатывали с использованием набора NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) в соответствии с инструкциями производителя. ЦДНК хранили при -80°C до дальнейшего анализа. В некоторых экспериментах цДНК выделяли и очищали с использованием набора QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада). Количественное определение очищенной ДНК проводилось с использованием стандартного анализа PicoGreen. Распределение фрагментов выделенной ccfDNA анализировалось методом капиллярного электрофореза с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) с применением набора для высокочувствительного анализа ДНК. Анализ проводился с использованием 1 мкл образца ccfDNA в соответствии с инструкциями производителя.
Для секвенирования фрагментов ccfDNA гемолимфы Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) подготовили библиотеки для секвенирования методом дробовика, используя набор Illumina DNA Mix из комплекта Illumina MiSeq PE75. Использовался стандартный адаптер (BioO). Исходные файлы данных доступны в архиве NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 и SRR8924809). Базовое качество чтения оценивалось с помощью FastQC [23]. Trimmomatic [24] использовался для обрезки адаптеров и чтения низкого качества. Чтения методом дробовика с парными концами были объединены с помощью FLASH в более длинные одиночные чтения с минимальным перекрытием 20 bp, чтобы избежать несовпадений [25]. Объединенные риды были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e−3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26]. Объединенные риды были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e−3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пыль [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26].Последовательности были разделены на две группы: связанные с последовательностями двустворчатых моллюсков (здесь называемые собственными последовательностями) и несвязанные (не собственные последовательности). Две группы были отдельно собраны с использованием MEGAHIT для генерации контигов [27]. Тем временем таксономическое распределение последовательностей чужеродного микробиома было классифицировано с помощью Kraken2 [28] и графически представлено круговой диаграммой Krona в Galaxy [29, 30]. Оптимальным k-мером по результатам наших предварительных экспериментов был определен k-мер-59. Затем для окончательной аннотации были идентифицированы собственные контиги путем выравнивания с помощью BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Затем для окончательной аннотации были идентифицированы собственные контиги путем выравнивания с помощью BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Затем собственные контиги были идентифицированы посредством парламентии с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Затем для окончательной аннотации были идентифицированы самоконтиги путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии).然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем рассмотрения с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Затем для окончательной аннотации были идентифицированы собственные контиги путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии). Параллельно контиги неродственных групп были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Параллельно контиги неродственных групп были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно контиги чужеродных групп были аннотированы с помощью BLASTN (база данных NT NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно контиги не относящихся к своей группе были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии). Также был проведен анализ BLASTX на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Также был проведен анализ BLASTX на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e−10 и 60% гомологии). BLASTX также проводился на нестоящих контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). Также был выполнен поиск BLASTX для несамостоятельных контигов с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e-10 и 60% гомологии).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性). BLASTX также выполнялся на нестоящих контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). Также был выполнен поиск BLASTX для несамостоятельных контигов с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и 60% гомологии).Пулы несамостоятельных контигов, полученные с помощью BLASTN и BLASTX, представляют собой окончательные контиги (см. дополнительный файл).
Праймеры, использованные для ПЦР, перечислены в таблице S1. Для амплификации целевых генов ccfDNA использовали ДНК-полимеразу Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON). Использовались следующие условия реакции: денатурация при 95°C в течение 3 минут, 95°C в течение 1 минуты, заданная температура отжига в течение 1 минуты, элонгация при 72°C в течение 1 минуты, 35 циклов, и, наконец, 72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5% агарозных гелях, содержащих краситель SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), при напряжении 95 В.
Мидии (Mytilus spp.) акклиматизировали в 500 мл насыщенной кислородом морской воды (32 PSU) в течение 24 часов при 4°C. В пробирку добавляли плазмидную ДНК, содержащую вставку, кодирующую последовательность кДНК человеческого галектина-7 (номер доступа NCBI L07769), в конечной концентрации 190 мкг/мкл. В качестве контроля использовали мидии, инкубированные в тех же условиях без добавления ДНК. В третьем контрольном резервуаре находилась ДНК без мидий. Для контроля качества ДНК в морской воде в указанное время из каждого резервуара отбирали пробы морской воды (20 мкл; три повтора). Для отслеживания плазмидной ДНК мидии LB собирали в указанное время и анализировали с помощью qPCR и ddPCR. Из-за высокого содержания соли в морской воде аликвоты разбавляли водой, подходящей для ПЦР (1:10), перед всеми ПЦР-анализами.
Цифровая капельная ПЦР (ddPCR) проводилась с использованием протокола BioRad QX200 (Миссиссауга, Онтарио, Канада). Для определения оптимальной температуры использовался температурный профиль (таблица S1). Капли генерировались с помощью генератора капель QX200 (BioRad). ddPCR проводилась следующим образом: 95°C в течение 5 мин, 50 циклов по 95°C в течение 30 с и заданной температуре отжига в течение 1 мин и 72°C в течение 30 с, 4°C в течение 5 мин и 90°C в течение 5 минут. Количество капель и положительных реакций (количество копий/мкл) измерялось с помощью считывателя капель QX200 (BioRad). Образцы с менее чем 10 000 капель отбраковывались. Контроль паттерна не проводился каждый раз при проведении ddPCR.
Количественная ПЦР (кПЦР) проводилась с использованием прибора Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) и специфических праймеров для LGALS7. Все количественные ПЦР выполнялись в объеме 20 мкл с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). КПЦР начиналась с 15-минутной инкубации при 95°C, за которой следовали 40 циклов при 95°C в течение 10 секунд и при 60°C в течение 60 секунд с одним сбором данных. Кривые плавления строились с использованием последовательных измерений при 95°C в течение 5 с, 65°C в течение 60 с и 97°C в конце кПЦР. Каждая кПЦР проводилась в трех повторениях, за исключением контрольных образцов.
Поскольку мидии известны своей высокой скоростью фильтрации, мы сначала исследовали, могут ли они фильтровать и удерживать фрагменты ДНК, присутствующие в морской воде. Нас также интересовало, накапливаются ли эти фрагменты в их полуоткрытой лимфатической системе. Мы решили этот вопрос экспериментально, отслеживая судьбу растворимых фрагментов ДНК, добавленных в резервуары с синими мидиями. Для облегчения отслеживания фрагментов ДНК мы использовали чужеродную (не собственную) плазмидную ДНК, содержащую ген человеческого галектина-7. Метод ddPCR позволяет отслеживать фрагменты плазмидной ДНК в морской воде и мидиях. Наши результаты показывают, что если количество фрагментов ДНК в морской воде оставалось относительно постоянным в течение времени (до 7 дней) в отсутствие мидий, то в присутствии мидий этот уровень почти полностью исчезал в течение 8 часов (рис. 1a,b). Фрагменты экзогенной ДНК легко обнаруживались в течение 15 минут во внутриклапанной жидкости и гемолимфе (рис. 1c). Эти фрагменты все еще можно было обнаружить в течение 4 часов после воздействия. Эта фильтрующая активность в отношении фрагментов ДНК сравнима с фильтрующей активностью бактерий и водорослей [31]. Эти результаты позволяют предположить, что мидии могут фильтровать и накапливать чужеродную ДНК в своих жидкостных отсеках.
Относительные концентрации плазмидной ДНК в морской воде в присутствии (A) или отсутствии (B) мидий, измеренные методом ddPCR. На рисунке A результаты выражены в процентах, границы прямоугольников соответствуют 75-му и 25-му процентилям. Аппроксимированная логарифмическая кривая показана красным цветом, а заштрихованная серым область представляет 95% доверительный интервал. На рисунке B красная линия представляет среднее значение, а синяя линия — 95% доверительный интервал для концентрации. C Накопление плазмидной ДНК в гемолимфе и клапанной жидкости мидий в разное время после добавления плазмидной ДНК. Результаты представлены в виде абсолютного количества обнаруженных копий/мл (±SE).
Далее мы исследовали происхождение ccfDNA в мидиях, собранных на мидиевых отмелях на островах Кергелен, отдаленной группе островов с ограниченным антропогенным воздействием. Для этой цели cccDNA из гемолимфы мидий была выделена и очищена методами, обычно используемыми для очистки человеческой cccDNA [32, 33]. Мы обнаружили, что средняя концентрация ccfDNA в гемолимфе мидий находится в диапазоне низких микрограммов на мл гемолимфы (см. Таблицу S2, Дополнительная информация). Этот диапазон концентраций значительно шире, чем у здоровых людей (низкие нанограммы на миллилитр), но в редких случаях, у онкологических больных, уровень ccfDNA может достигать нескольких микрограммов на миллилитр [34, 35]. Анализ распределения размеров фрагментов ccfDNA в гемолимфе показал, что эти фрагменты сильно различаются по размеру, варьируясь от 1000 п.н. до 5000 п.н. (Рис. 2). Аналогичные результаты были получены с использованием набора QIAamp Investigator Kit на основе диоксида кремния, метода, широко используемого в судебной медицине для быстрого выделения и очистки геномной ДНК из образцов ДНК низкой концентрации, включая ccfDNA [36].
Типичная электрофореграмма ccfDNA гемолимфы мидий. Экстракция проводилась с помощью набора NucleoSnap Plasma Kit (вверху) и набора QIAamp DNA Investigator Kit. B. Скрипичная диаграмма, показывающая распределение концентраций ccfDNA (±SE) в гемолимфе мидий. Черная и красная линии представляют медиану и первый и третий квартили соответственно.
Примерно 1% ccfDNA у людей и приматов имеет чужеродное происхождение [21, 37]. Учитывая полуоткрытую циркуляционную систему двустворчатых моллюсков, богатую микроорганизмами морскую воду и распределение размеров ccfDNA мидий, мы предположили, что ccfDNA гемолимфы мидий может содержать богатый и разнообразный пул микробной ДНК. Для проверки этой гипотезы мы секвенировали ccfDNA гемолимфы образцов Aulacomya atra, собранных на островах Кергелен, получив более 10 миллионов прочтений, 97,6% из которых прошли контроль качества. Затем прочтения были классифицированы по собственным и чужеродным источникам с использованием баз данных двустворчатых моллюсков BLASTN и NCBI (рис. S1, дополнительная информация).
У людей в кровоток могут попадать как ядерная, так и митохондриальная ДНК [38]. Однако в данном исследовании не удалось подробно описать ядерную геномную ДНК мидий, поскольку геном A. atra не был секвенирован или описан. Тем не менее, мы смогли идентифицировать ряд фрагментов ccfDNA собственного происхождения, используя библиотеку двустворчатых моллюсков (рис. S2, дополнительная информация). Мы также подтвердили наличие фрагментов ДНК собственного происхождения путем направленной ПЦР-амплификации тех генов A. atra, которые были секвенированы (рис. 3). Аналогично, учитывая, что митохондриальный геном A. atra доступен в общедоступных базах данных, можно найти доказательства наличия митохондриальных фрагментов ccfDNA в гемолимфе A. atra. Наличие фрагментов митохондриальной ДНК было подтверждено ПЦР-амплификацией (рис. 3).
В гемолимфе A. atra (красные точки – артикул: SRX5705969) и M. platensis (синие точки – артикул: SRX5705968), амплифицированной методом ПЦР, присутствовали различные митохондриальные гены. Рисунок адаптирован из работы Breton et al., 2011 B. Амплификация супернатанта гемолимфы A. atra. Хранили на бумаге FTA. Используйте пробойник диаметром 3 мм, чтобы добавить непосредственно в пробирку для ПЦР, содержащую смесь для ПЦР.
Учитывая обилие микроорганизмов в морской воде, мы первоначально сосредоточились на характеристике последовательностей микробной ДНК в гемолимфе. Для этого мы использовали две разные стратегии. Первая стратегия использовала Kraken2, программу классификации последовательностей на основе алгоритмов, которая может идентифицировать микробные последовательности с точностью, сравнимой с BLAST и другими инструментами [28]. Более 6719 прочтений были определены как имеющие бактериальное происхождение, в то время как 124 и 64 были от архей и вирусов соответственно (рис. 4). Наиболее многочисленными фрагментами бактериальной ДНК были Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (рис. 4a). Это распределение согласуется с предыдущими исследованиями микробиома морской синей мидии [39, 40]. Гаммапротеобактерии составляли основной класс Proteobacteria (44%), включая множество Vibrionales (рис. 4b). Метод ddPCR подтвердил наличие фрагментов ДНК Vibrio в ccfDNA гемолимфы A. atra (рис. 4c) [41]. Для получения дополнительной информации о бактериальном происхождении ccfDNA был использован дополнительный подход (рис. S2, дополнительная информация). В данном случае перекрывающиеся прочтения были объединены в парные прочтения и классифицированы как имеющие собственное (двустворчатые моллюски) или чужеродное происхождение с использованием BLASTN, значения e, равного 1e−3, и порогового значения гомологии >90%. В данном случае перекрывающиеся прочтения были объединены в парные прочтения и классифицированы как имеющие собственное (двустворчатые моллюски) или чужеродное происхождение с использованием BLASTN, значения e, равного 1e−3, и порогового значения гомологии >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значениями е 1e-3 и отсечения с гомологией > 90%. В данном случае перекрывающиеся прочтения были собраны как парные прочтения и классифицированы как нативные (двустворчатые) или неоригинальные с использованием BLASTN и значения e, равного 1e-3, а также порогового значения гомологии >90%.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и пороговой гомологии > 90%. В данном случае перекрывающиеся прочтения были собраны в виде парных прочтений и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или неоригинальные с использованием e BLASTN и значений 1e-3, а также порога гомологии >90%.Поскольку геном A. atra еще не секвенирован, мы использовали стратегию сборки de novo с помощью ассемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). В общей сложности было идентифицировано 147 188 контигов, имеющих зависимое (двустворчатые) происхождение. Затем эти контиги были расширены с e-значениями 1e-10 с использованием BLASTN и BLASTX. Эта стратегия позволила нам идентифицировать 482 фрагмента, не относящихся к двустворчатым моллюскам, присутствующих в ccfDNA A. atra. Более половины (57%) этих фрагментов ДНК были получены от бактерий, главным образом от симбионтов жабр, включая сульфотрофных симбионтов, и от симбионтов жабр Solemya velum (рис. 5).
Относительная численность на типовом уровне. B. Микробное разнообразие двух основных фил (Firmicutes и Proteobacteria). Репрезентативная амплификация ddPCR. C. Vibrio spp. A. Фрагменты гена 16S рРНК (синие) в трех гемолимфах атра.
В общей сложности было проанализировано 482 собранных контига. Общий профиль таксономического распределения аннотаций метагеномных контигов (прокариоты и эукариоты). B. Детальное распределение фрагментов бактериальной ДНК, идентифицированных с помощью BLASTN и BLASTX.
Анализ Kraken2 также показал, что ccfDNA мидий содержала фрагменты ДНК архей, включая фрагменты ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (рис. 6a). Присутствие фрагментов ДНК, полученных от Euryarchaeota и Crenarchaeota, ранее обнаруженных в микробном сообществе калифорнийских мидий, не должно вызывать удивления [42]. Хотя Euryarchaeota часто ассоциируются с экстремальными условиями, в настоящее время признано, что как Euryarchaeota, так и Crenarcheota являются одними из наиболее распространенных прокариот в морской криогенной среде [43, 44]. Присутствие метаногенных микроорганизмов в мидиях не вызывает удивления, учитывая недавние сообщения о масштабных утечках метана из донных протечек на плато Кергелен [45] и возможном микробном производстве метана, наблюдаемом у побережья островов Кергелен [46].
Затем наше внимание переключилось на анализ ДНК-вирусов. Насколько нам известно, это первое исследование вирусного состава мидий вне целевой области. Как и ожидалось, мы обнаружили фрагменты ДНК бактериофагов (Caudovirales) (рис. 6b). Однако наиболее распространенная вирусная ДНК происходит из филума нуклеоцитовирусов, также известных как ядерно-цитоплазматические крупные ДНК-вирусы (NCLDV), которые имеют самый большой геном среди всех вирусов. В этом филуме большинство последовательностей ДНК принадлежат семействам Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), естественными хозяевами которых являются позвоночные и членистоногие, в то время как небольшая часть этих последовательностей ДНК принадлежит известным вирусологическим водорослям. Инфицирует морские эукариотические водоросли. Последовательности также были получены от вируса Пандора, гигантского вируса с самым большим размером генома среди всех известных вирусных родов. Интересно, что диапазон хозяев, известных как зараженные вирусом, определенный с помощью секвенирования ccfDNA гемолимфы, был относительно широк (Рисунок S3, Дополнительная информация). Он включает вирусы, поражающие насекомых, таких как бакуловирусы и иридовириды, а также вирусы, поражающие амебы, водоросли и позвоночных. Мы также обнаружили последовательности, соответствующие геному Pithovirus sibericum. Питовирусы (также известные как «вирусы-зомби») были впервые выделены из вечной мерзлоты возрастом 30 000 лет в Сибири [47]. Таким образом, наши результаты согласуются с предыдущими сообщениями, показывающими, что не все современные виды этих вирусов вымерли [48] и что эти вирусы могут присутствовать в отдаленных субарктических морских экосистемах.
Наконец, мы проверили, можем ли мы найти фрагменты ДНК других многоклеточных животных. Всего с помощью BLASTN и BLASTX было идентифицировано 482 чужеродных контига с использованием библиотек nt, nr и RefSeq (геномных и белковых). Наши результаты показывают, что среди чужеродных фрагментов ccfDNA многоклеточных животных преобладает ДНК костных костей (рис. 5). Также были обнаружены фрагменты ДНК насекомых и других видов. Относительно большая часть фрагментов ДНК не была идентифицирована, возможно, из-за недостаточной представленности большого числа морских видов в геномных базах данных по сравнению с наземными видами [49].
В данной работе мы применяем концепцию ЛБ к мидиям, утверждая, что секвенирование ccfDNA гемолимфы может дать представление о составе морских прибрежных экосистем. В частности, мы обнаружили, что: 1) гемолимфа мидий содержит относительно высокие концентрации (микрограммовые уровни) относительно крупных (~1-5 кб) циркулирующих фрагментов ДНК; 2) эти фрагменты ДНК являются как независимыми, так и не независимыми; 3) среди чужеродных источников этих фрагментов ДНК мы обнаружили бактериальную, архейную и вирусную ДНК, а также ДНК других многоклеточных животных; 4) накопление этих чужеродных фрагментов ccfDNA в гемолимфе происходит быстро и способствует внутренней фильтрационной активности мидий. В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция ЛБ, которая до сих пор применялась в основном в области биомедицины, содержит богатый, но неизученный источник знаний, который может быть использован для лучшего понимания взаимодействия между индикаторными видами и их окружающей средой.
Помимо приматов, выделение ccfDNA было зарегистрировано у млекопитающих, включая мышей, собак, кошек и лошадей [50, 51, 52]. Однако, насколько нам известно, наше исследование является первым, в котором сообщается об обнаружении и секвенировании ccfDNA у морских видов с открытой системой кровообращения. Эта анатомическая особенность и фильтрующая способность мидий могут, по крайней мере частично, объяснить различные характеристики размеров циркулирующих фрагментов ДНК по сравнению с другими видами. У человека большинство фрагментов ДНК, циркулирующих в крови, представляют собой небольшие фрагменты размером от 150 до 200 п.н. с максимальным пиком в 167 п.н. [34, 53]. Небольшая, но значительная часть фрагментов ДНК имеет размер от 300 до 500 п.н., и около 5% длиннее 900 п.н. [54]. Причина такого распределения размеров заключается в том, что основным источником циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) в плазме является гибель клеток, либо вследствие клеточной смерти, либо вследствие некроза циркулирующих гемопоэтических клеток у здоровых людей, либо вследствие апоптоза опухолевых клеток у онкологических больных (известная как циркулирующая опухолевая ДНК, ctDNA). Распределение размеров ccfDNA гемолимфы, обнаруженное нами у мидий, варьировалось от 1000 до 5000 пар оснований, что предполагает различное происхождение ccfDNA у мидий. Это логичная гипотеза, поскольку мидии имеют полуоткрытую сосудистую систему и обитают в морской среде, содержащей высокие концентрации микробной геномной ДНК. В самом деле, наши лабораторные эксперименты с использованием экзогенной ДНК показали, что мидии накапливают фрагменты ДНК в морской воде, по крайней мере, через несколько часов после поглощения клетками они деградируют и/или высвобождаются и/или хранятся в различных органеллах. Учитывая редкость клеток (как прокариотических, так и эукариотических), использование внутриклапанных компартментов позволит уменьшить количество циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) как из собственных источников, так и из чужеродных. Принимая во внимание важность врожденного иммунитета двустворчатых моллюсков и большое количество циркулирующих фагоцитов, мы выдвинули гипотезу, что даже чужеродная ccfDNA обогащается в циркулирующих фагоцитах, которые накапливают чужеродную ДНК при поглощении микроорганизмов и/или клеточного мусора. В совокупности наши результаты показывают, что ccfDNA гемолимфы двустворчатых моллюсков является уникальным хранилищем молекулярной информации и подтверждает их статус как видов-индикаторов.
Наши данные показывают, что секвенирование и анализ фрагментов ccfDNA гемолимфы, полученных от бактерий, могут предоставить ключевую информацию о бактериальной флоре хозяина и бактериях, присутствующих в окружающей морской экосистеме. Методы секвенирования с использованием считывания выявили последовательности комменсальных бактерий A. atra, обнаруженные в жабрах, которые были бы пропущены при использовании традиционных методов идентификации 16S рРНК, отчасти из-за смещения референсной библиотеки. Фактически, использование нами данных LB, собранных с M. platensis в том же слое мидий на Кергелене, показало, что состав ассоциированных с жабрами бактериальных симбионтов был одинаковым для обоих видов мидий (рис. S4, дополнительная информация). Это сходство двух генетически разных мидий может отражать состав бактериальных сообществ в холодных, сернистых и вулканических отложениях Кергелена [55, 56, 57, 58]. Более высокие уровни сероредуцирующих микроорганизмов хорошо описаны при сборе мидий в прибрежных районах с биотурбацией [59], таких как побережье Порт-о-Франс. Другая возможность заключается в том, что комменсальная флора мидий может быть затронута горизонтальной передачей [60, 61]. Необходимы дополнительные исследования для определения корреляции между морской средой, поверхностью морского дна и составом симбиотических бактерий в мидиях. Эти исследования в настоящее время проводятся.
Длина и концентрация ccfDNA гемолимфы, простота ее очистки и высокое качество, позволяющее быстро проводить секвенирование методом дробовика, являются одними из многих преимуществ использования ccfDNA мидий для оценки биоразнообразия в морских прибрежных экосистемах. Этот подход особенно эффективен для характеристики вирусных сообществ (виромов) в данной экосистеме [62, 63]. В отличие от бактерий, архей и эукариот, вирусные геномы не содержат филогенетически консервативных генов, таких как последовательности 16S. Наши результаты показывают, что жидкие биопсии от индикаторных видов, таких как мидии, могут быть использованы для идентификации относительно большого количества фрагментов ccfDNA вирусов, известных своей способностью инфицировать хозяев, которые обычно обитают в прибрежных морских экосистемах. Это включает вирусы, известные своей способностью инфицировать простейших, членистоногих, насекомых, растения и бактериальные вирусы (например, бактериофаги). Аналогичное распределение было обнаружено при исследовании вирома ccfDNA гемолимфы синих мидий (M. platensis), собранных в том же слое мидий в Кергелене (таблица S2, дополнительная информация). Секвенирование ccfDNA методом дробовика действительно является новым подходом, набирающим обороты в изучении вирома человека или других видов [21, 37, 64]. Этот подход особенно полезен для изучения двухцепочечных ДНК-вирусов, поскольку ни один ген не является консервативным среди всех двухцепочечных ДНК-вирусов, представляющих наиболее разнообразный и широкий класс вирусов в Балтиморе [65]. Хотя большинство этих вирусов остаются неклассифицированными и могут включать вирусы из совершенно неизвестной части вирусного мира [66], мы обнаружили, что виромы и круги хозяев мидий A. atra и M. platensis находятся между двумя видами. Аналогичное сходство неудивительно, поскольку оно может отражать отсутствие избирательности в поглощении ДНК, присутствующей в окружающей среде. В настоящее время необходимы дальнейшие исследования с использованием очищенной РНК для характеристики РНК-вирома.
В нашем исследовании мы использовали очень строгий алгоритм, адаптированный из работы Коварски и коллег [37], которые использовали двухэтапное удаление объединенных прочтений и контигов до и после сборки нативной ccfDNA, что привело к высокой доле некартированных прочтений. Поэтому мы не можем исключить, что некоторые из этих некартированных прочтений могут иметь собственное происхождение, главным образом потому, что у нас нет референсного генома для этого вида мидий. Мы также использовали этот алгоритм, потому что нас беспокоили химеры между собственными и чужеродными прочтениями и длина прочтений, генерируемых Illumina MiSeq PE75. Еще одна причина большинства некартированных прочтений заключается в том, что многие морские микроорганизмы, особенно в отдаленных районах, таких как Кергелен, не были аннотированы. Мы использовали Illumina MiSeq PE75, предполагая, что длина фрагментов ccfDNA аналогична длине фрагментов человеческой ccfDNA. Учитывая наши результаты, показывающие, что циркулирующая внеклеточная ДНК гемолимфы имеет более длинные последовательности, чем у человека и/или млекопитающих, для будущих исследований мы рекомендуем использовать платформу секвенирования, более подходящую для более длинных фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК. Это значительно упростит выявление дополнительных признаков для более глубокого анализа. Получение в настоящее время недоступной полной последовательности ядерного генома A. atra также значительно облегчит дифференциацию циркулирующей внеклеточной ДНК от собственных и чужеродных источников. Поскольку наше исследование сосредоточено на возможности применения концепции жидкостной биопсии к мидиям, мы надеемся, что по мере использования этой концепции в будущих исследованиях будут разработаны новые инструменты и алгоритмы для повышения потенциала этого метода в изучении микробного разнообразия мидий в морской экосистеме.
В качестве неинвазивного клинического биомаркера повышенный уровень ccfDNA в плазме человека связан с различными заболеваниями, повреждением тканей и стрессовыми состояниями [67,68,69]. Это повышение связано с высвобождением фрагментов ДНК собственного происхождения после повреждения тканей. Мы исследовали этот вопрос, используя острый тепловой стресс, при котором мидии кратковременно подвергались воздействию температуры 30 °C. Мы провели этот анализ на трех разных типах мидий в трех независимых экспериментах. Однако мы не обнаружили каких-либо изменений в уровнях ccfDNA после острого теплового стресса (см. рисунок S5, дополнительная информация). Это открытие может объяснить, по крайней мере частично, тот факт, что мидии имеют полуоткрытую кровеносную систему и накапливают большое количество чужеродной ДНК благодаря своей высокой фильтрующей активности. С другой стороны, мидии, как и многие беспозвоночные, могут быть более устойчивы к повреждению тканей, вызванному стрессом, тем самым ограничивая высвобождение ccfDNA в их гемолимфе [70, 71].
До настоящего времени анализ ДНК биоразнообразия в водных экосистемах в основном был сосредоточен на метабаркодинге экологической ДНК (eDNA). Однако этот метод обычно ограничен в анализе биоразнообразия при использовании праймеров. Использование секвенирования методом «shotgun» позволяет обойти ограничения ПЦР и предвзятый выбор наборов праймеров. Таким образом, в некотором смысле наш метод ближе к недавно использованному высокопроизводительному методу секвенирования eDNA методом «shotgun», который позволяет напрямую секвенировать фрагментированную ДНК и анализировать практически все организмы [72, 73]. Однако существует ряд фундаментальных проблем, отличающих LB от стандартных методов eDNA. Конечно, главное различие между eDNA и LB заключается в использовании природных фильтрующих организмов. Сообщалось об использовании морских видов, таких как губки и двустворчатые моллюски (Dresseina spp.), в качестве природного фильтра для изучения eDNA [74, 75]. Однако в исследовании Дрейссены использовались биопсии тканей, из которых была выделена ДНК. Анализ ccfDNA из LB не требует биопсии тканей, специализированного и иногда дорогостоящего оборудования и логистики, связанных с eDNA или биопсией тканей. Фактически, мы недавно сообщили, что ccfDNA из LB можно хранить и анализировать с поддержкой FTA без поддержания холодовой цепи, что является серьезной проблемой для исследований в отдаленных районах [76]. Извлечение ccfDNA из жидких биопсий также просто и обеспечивает высококачественную ДНК для секвенирования методом дробовика и ПЦР-анализа. Это большое преимущество, учитывая некоторые технические ограничения, связанные с анализом eDNA [77]. Простота и низкая стоимость метода отбора проб также особенно подходят для программ долгосрочного мониторинга. В дополнение к их высокой фильтрующей способности, еще одной хорошо известной особенностью двустворчатых моллюсков является химический мукополисахаридный состав их слизи, который способствует поглощению вирусов [78, 79]. Это делает двустворчатых моллюсков идеальным природным фильтром для характеристики биоразнообразия и влияния изменения климата на данную водную экосистему. Хотя наличие фрагментов ДНК хозяина можно рассматривать как ограничение метода по сравнению с эДНК, стоимость, связанная с наличием такой нативной ccfDNA по сравнению с эДНК, одновременно понятна, учитывая огромный объем информации, доступной для исследований здоровья хозяина. Это включает в себя наличие вирусных последовательностей, интегрированных в геном хозяина. Это особенно важно для мидий, учитывая наличие горизонтально передаваемых лейкемических ретровирусов у двустворчатых моллюсков [80, 81]. Еще одним преимуществом LB перед эДНК является то, что он использует фагоцитарную активность циркулирующих клеток крови в гемолимфе, которые поглощают микроорганизмы (и их геномы). Фагоцитоз является основной функцией клеток крови у двустворчатых моллюсков [82]. Наконец, метод использует высокую фильтрующую способность мидий (в среднем 1,5 л/ч морской воды) и двухдневную циркуляцию, что увеличивает перемешивание различных слоев морской воды, позволяя захватывать гетерологичную эДНК. [83, 84]. Таким образом, анализ ccfDNA мидий представляет собой интересное направление, учитывая питательное, экономическое и экологическое воздействие мидий. Подобно анализу LB, собранного у людей, этот метод также открывает возможность измерения генетических и эпигенетических изменений в ДНК хозяина в ответ на экзогенные вещества. Например, можно предположить, что технологии секвенирования третьего поколения позволят проводить полногеномный анализ метилирования в нативной ccfDNA с использованием нанопорового секвенирования. Этот процесс должен быть облегчен тем фактом, что длина фрагментов ccfDNA мидий идеально совместима с платформами секвенирования длинных прочтений, которые позволяют проводить полногеномный анализ метилирования ДНК за один цикл секвенирования без необходимости химических преобразований. [85, 86] Это интересная возможность, поскольку было показано, что паттерны метилирования ДНК отражают реакцию на стресс окружающей среды и сохраняются на протяжении многих поколений. Следовательно, это может дать ценную информацию о лежащих в основе механизмах, управляющих реакцией после воздействия изменения климата или загрязняющих веществ [87]. Однако использование LB не лишено ограничений. Разумеется, это требует наличия индикаторных видов в экосистеме. Как упоминалось выше, использование LB для оценки биоразнообразия данной экосистемы также требует строгого биоинформатического конвейера, учитывающего наличие фрагментов ДНК из источника. Еще одной серьезной проблемой является доступность референсных геномов для морских видов. Есть надежда, что такие инициативы, как Проект геномов морских млекопитающих и недавно созданный проект Fish10k [88], облегчат такой анализ в будущем. Применение концепции LB к морским фильтрующим организмам также совместимо с последними достижениями в технологии секвенирования, что делает ее хорошо подходящей для разработки многоомных биомаркеров, предоставляющих важную информацию о состоянии морских местообитаний в ответ на стресс окружающей среды.
Данные секвенирования генома депонированы в архиве последовательностей NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 в разделе Bioprojects SRR8924808.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Дж. Влияние изменения климата на морскую жизнь и экосистемы. Cole Biology. 2009; 19: С.602–С.614.
Гисси Э., Манеа Э., Мазарис А.Д., Фраскетти С., Альмпаниду В., Бевилаква С. и др. Рассмотрите совокупное воздействие изменения климата и других локальных стрессовых факторов на морскую среду. Общая научная среда. 2021;755:142564.
Карелла Ф., Антуофермо Э., Фарина С., Салати Ф., Мандас Д., Прадо П. и др. ). Наука первого марта. 2020;7:48.
Серонт Л., Никастро К.Р., Зарди Г.И., Гобервиль Э. Сниженная устойчивость к жаре в условиях повторяющегося теплового стресса объясняет высокую летнюю смертность синих мидий. Научный отчет 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сипельски А.М., Нуссл С., Сервантес-Йошида К., Хван Дж.Л., Хубер Э.Р. и др. Последние изменения в частоте, причинах и масштабах гибели животных. Труды Национальной академии наук США. 2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена И., Мугетти Д., Черрути Ф., Хоссейни С. и др. Множественные невидоспецифичные патогены могли стать причиной массовой смертности Pinna nobilis. Жизнь. 2020;10:238.
Брэдли М., Каутс С.Дж., Дженкинс Э., О'Хара Т.М. Потенциальное влияние изменения климата на зоонозные заболевания в Арктике. Международный журнал циркумполярного здравоохранения. 2005; 64:468–77.
Бейер Дж., Грин Н.В., Брукс С., Аллан И.Дж., Руус А., Гомес Т. и др. Синие мидии (Mytilus edulis spp.) как сигнальные организмы в мониторинге загрязнения прибрежных районов: обзор. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравегна Г., Марсони С., Сиена С., Барделли А. Интеграция жидкостной биопсии в лечение рака. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Дж. К. М., Масси К., Гарсия-Корбачо Дж., Мульер Ф., Брентон Дж. Д., Калдас К. и др. Созревание опухолевой ДНК при жидкостной биопсии: позволяет ей циркулировать. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метайс П. Нуклеиновые кислоты в плазме крови человека. Протоколы заседаний дочерних компаний Общества биологии. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А.Дж., Унгерер В., Холденридер С. Новая роль внеклеточной ДНК в качестве молекулярного маркера для лечения рака. Количественная оценка биомолярного анализа. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Слэдж Г.В., Джеффри С.С. Жидкостная биопсия внедряется в клиническую практику – проблемы внедрения и будущие вызовы. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Й.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент И.Л., Редман К.В. и др. Фетальная ДНК присутствует в плазме и сыворотке крови матери. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Квейк С.Р. Изучение течения беременности и ее осложнений с использованием циркулирующей внеклеточной РНК в крови женщин во время беременности. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М., Шервуд К., Кеоун П., Шютц Э., Бек Дж., Стегбауэр Дж. и др. Жидкостная биопсия: использование внеклеточной ДНК донора для выявления аллогенных поражений в почечном трансплантате. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Й.М. Инновации в пренатальной диагностике: секвенирование генома материнской плазмы. Анна М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В., Дэн Х., Ли М., Суку Ю. Д., Аревало С., Страйк Д. и др. Быстрое обнаружение патогенов с помощью метагеномного секвенирования следующего поколения инфицированных биологических жидкостей. Nat Medicine. 2021;27:115-24.