Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Жидкостная биопсия (LB) — это концепция, которая быстро набирает популярность в области биомедицины. Концепция в основном основана на обнаружении фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA), которые в основном высвобождаются в виде небольших фрагментов после гибели клеток в различных тканях. Небольшая часть этих фрагментов происходит из чужеродных (чужеродных) тканей или организмов. В текущей работе мы применили эту концепцию к мидиям, виду-сентинелу, известному своей высокой способностью фильтровать морскую воду. Мы используем способность мидий действовать как естественные фильтры для захвата фрагментов ДНК окружающей среды из различных источников, чтобы предоставить информацию о биоразнообразии морских прибрежных экосистем. Наши результаты показывают, что гемолимфа мидий содержит фрагменты ДНК, которые сильно различаются по размеру, от 1 до 5 кб. Секвенирование методом дробовика показало, что большое количество фрагментов ДНК имеют чужеродное микробное происхождение. Среди них мы обнаружили фрагменты ДНК бактерий, архей и вирусов, включая вирусы, которые, как известно, заражают различных хозяев, обычно встречающихся в прибрежных морских экосистемах. В заключение следует отметить, что наше исследование показывает, что концепция LB применительно к мидиям представляет собой богатый, но пока неизученный источник знаний о микробном разнообразии в морских прибрежных экосистемах.
Влияние изменения климата (ИК) на биоразнообразие морских экосистем является быстрорастущей областью исследований. Глобальное потепление не только вызывает важные физиологические стрессы, но и раздвигает эволюционные пределы тепловой стабильности морских организмов, влияя на среду обитания ряда видов, побуждая их искать более благоприятные условия [1, 2]. Помимо влияния на биоразнообразие метазоа, ИК нарушает тонкий баланс взаимодействий хозяина и микробов. Этот микробный дисбактериоз представляет серьезную угрозу для морских экосистем, поскольку он делает морские организмы более восприимчивыми к инфекционным патогенам [3, 4]. Считается, что ИК играют важную роль в массовой гибели, что является серьезной проблемой для управления глобальными морскими экосистемами [5, 6]. Это важный вопрос, учитывая экономические, экологические и пищевые последствия многих морских видов. Это особенно актуально для двустворчатых моллюсков, обитающих в полярных регионах, где эффекты ИК более непосредственны и серьезны [6, 7]. Фактически, двустворчатые моллюски, такие как Mytilus spp., широко используются для мониторинга эффектов CC на морские экосистемы. Неудивительно, что было разработано относительно большое количество биомаркеров для мониторинга их здоровья, часто с использованием двухуровневого подхода, включающего функциональные биомаркеры, основанные на ферментативной активности или клеточных функциях, таких как жизнеспособность клеток и фагоцитарная активность [8]. Эти методы также включают измерение концентрации специфических индикаторов давления, которые накапливаются в мягких тканях после поглощения больших объемов морской воды. Однако высокая фильтрационная способность и полуоткрытая кровеносная система двустворчатых моллюсков предоставляют возможность разрабатывать новые биомаркеры гемолимфы с использованием концепции жидкой биопсии (ЖБ), простого и минимально инвазивного подхода к лечению пациентов. образцов крови [9, 10]. Хотя в ЖБ человека можно обнаружить несколько типов циркулирующих молекул, эта концепция в первую очередь основана на анализе секвенирования ДНК фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) в плазме. Фактически, наличие циркулирующей ДНК в плазме человека известно с середины 20-го века [11], но только в последние годы появление методов высокопроизводительного секвенирования привело к клинической диагностике на основе ccfDNA. Наличие этих циркулирующих фрагментов ДНК отчасти обусловлено пассивным высвобождением геномной ДНК (ядерной и митохондриальной) после смерти клетки. У здоровых людей концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл), но может быть повышена в 5–10 раз у пациентов, страдающих различными патологиями или подвергающихся стрессу, что приводит к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл), но может быть повышена в 5–10 раз у пациентов, страдающих различными патологиями или подвергающихся стрессу, что приводит к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме недостаточна (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с хронической патологией или постоянным стрессом, приводящим к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация кзкДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но она может увеличиваться в 5–10 раз у пациентов с различными патологиями или при стрессе, приводящем к повреждению тканей.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл, 5-10 мг/мл.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 нг/мл) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл) у здоровых людей, но может быть увеличена в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Концентрация ccfDNA обычно низкая (<10 нг/мл) у здоровых людей, но может быть увеличена в 5–10 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей.Размер фрагментов ccfDNA широко варьируется, но обычно составляет от 150 до 200 п.н. [12]. Анализ собственной ccfDNA, т.е. ccfDNA из нормальных или трансформированных клеток хозяина, может быть использован для обнаружения генетических и эпигенетических изменений, присутствующих в ядерном и/или митохондриальном геноме, тем самым помогая врачам выбирать конкретные молекулярно-таргетные терапии [13]. Однако ccfDNA может быть получена из чужеродных источников, таких как ccfDNA из фетальных клеток во время беременности или из трансплантированных органов [14,15,16,17]. ccfDNA также является важным источником информации для обнаружения присутствия нуклеиновых кислот инфекционного агента (чужеродного), что позволяет неинвазивно обнаруживать широко распространенные инфекции, не идентифицированные с помощью посевов крови, избегая инвазивной биопсии инфицированной ткани [18]. Недавние исследования действительно показали, что человеческая кровь содержит богатый источник информации, которая может быть использована для идентификации вирусных и бактериальных патогенов, и что около 1% ccfDNA, обнаруженной в плазме человека, имеет чужеродное происхождение [19]. Эти исследования показывают, что биоразнообразие циркулирующего микробиома организма можно оценить с помощью анализа ccfDNA. Однако до недавнего времени эта концепция использовалась исключительно в отношении людей и, в меньшей степени, в отношении других позвоночных [20, 21].
В настоящей статье мы используем потенциал LB для анализа ccfDNA Aulacomya atra, южного вида, обычно встречающегося на субантарктических островах Кергелен, группе островов на вершине большого плато, образовавшегося 35 миллионов лет назад. вулканического извержения. Используя экспериментальную систему in vitro, мы обнаружили, что фрагменты ДНК в морской воде быстро поглощаются мидиями и попадают в гемолимфальный отсек. Метод дробового секвенирования показал, что ccfDNA гемолимфы мидий содержит фрагменты ДНК собственного и чужеродного происхождения, включая симбиотические бактерии и фрагменты ДНК из биомов, типичных для холодных вулканических морских прибрежных экосистем. ccfDNA гемолимфы также содержит вирусные последовательности, полученные из вирусов с различными диапазонами хозяев. Мы также обнаружили фрагменты ДНК многоклеточных животных, таких как костистые рыбы, морские анемоны, водоросли и насекомые. В заключение следует отметить, что наше исследование демонстрирует, что концепция LB может быть успешно применена к морским беспозвоночным для создания богатого геномного репертуара в морских экосистемах.
Взрослые особи (длиной 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) были собраны с приливно-отливных скалистых берегов Порт-о-Франс (049°21.235 ю.ш., 070°13.490 в.д.). Острова Кергелен в декабре 2018 года. Другие взрослые особи голубых мидий (Mytilus spp.) были получены от коммерческого поставщика (PEI Mussel King Inc., Остров Принца Эдуарда, Канада) и помещены в аэрируемый резервуар с контролируемой температурой (4°C), содержащий 10–20 л искусственного рассола 32‰. (искусственная морская соль Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, США). Для каждого эксперимента измерялись длина и вес отдельных раковин.
Бесплатный открытый протокол доступа для этой программы доступен в Интернете (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Вкратце, гемолимфа LB была собрана из отводящих мышц, как описано [22]. Гемолимфа была очищена центрифугированием при 1200×g в течение 3 минут, супернатант был заморожен (-20 °C) до использования. Для выделения и очистки cfDNA образцы (1,5-2,0 мл) были разморожены и обработаны с помощью набора NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) в соответствии с инструкциями производителя. ccfDNA хранилась при -80 °C до дальнейшего анализа. В некоторых экспериментах ccfDNA была выделена и очищена с помощью набора QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Очищенную ДНК количественно определяли с помощью стандартного анализа PicoGreen. Распределение фрагментов выделенной ccfDNA анализировали с помощью капиллярного электрофореза с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) с использованием набора High Sensitivity DNA Kit. Анализ проводили с использованием 1 мкл образца ccfDNA в соответствии с инструкциями производителя.
Для секвенирования фрагментов ccfDNA гемолимфы Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) подготовили библиотеки Shotgun с использованием набора Illumina DNA Mix из набора Illumina MiSeq PE75. Использовался стандартный адаптер (BioO). Файлы необработанных данных доступны в архиве считывания последовательностей NCBI (SRR8924808 и SRR8924809). Базовое качество считывания оценивалось с помощью FastQC [23]. Trimmomatic [24] использовался для обрезки адаптеров и считываний низкого качества. Чтения Shotgun с парными концами были объединены FLASH в более длинные одиночные считывания с минимальным перекрытием 20 п.н., чтобы избежать несоответствий [25]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e−3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e−3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пыль [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные прочтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с помощью DUST [26].Считывания были разделены на две группы: связанные с последовательностями двустворчатых моллюсков (здесь называемые самосчитываниями) и не связанные (несамосчитываниями). Две группы были отдельно собраны с использованием MEGAHIT для генерации контигов [27]. Между тем, таксономическое распределение считываний чужеродных микробиомов было классифицировано с использованием Kraken2 [28] и графически представлено в виде круговой диаграммы Krona на Galaxy [29, 30]. Оптимальным kmers было определено kmers-59 из наших предварительных экспериментов. Затем самоконтиги были идентифицированы путем выравнивания с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии) для окончательной аннотации. Затем самоконтиги были идентифицированы путем выравнивания с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии) для окончательной аннотации. Затем собственные контиги были идентифицированы посредством парламентии с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Затем самоконтиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии) для окончательной аннотации.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем рассмотрения с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Затем самоконтиги были идентифицированы для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии). Параллельно контиги чужеродных групп аннотировались с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Параллельно контиги чужеродных групп аннотировались с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e < 1e−10 и 60% гомологии). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно контиги чужеродных групп аннотировались с помощью BLASTN (база данных NT NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно контиги несамостоятельных групп аннотировались с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и 60% гомологии). BLASTX также проводился на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e−10 и 60% гомологии). BLASTX также проводился на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e−10 и 60% гомологии). BLASTX также проводился на нестоящих контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также был выполнен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e < 1e-10 и 60% гомологии).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性). BLASTX также выполнялся на нестоящих контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также был выполнен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и 60% гомологии).Пулы BLASTN и BLASTX несамостоятельных контигов представляют собой конечные контиги (см. Дополнительный файл).
Праймеры, используемые для ПЦР, перечислены в Таблице S1. Для амплификации целевых генов ccfDNA использовалась ДНК-полимераза Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON). Были использованы следующие условия реакции: денатурация при 95°C в течение 3 минут, 95°C в течение 1 минуты, установленная температура отжига в течение 1 минуты, элонгация при 72°C в течение 1 минуты, 35 циклов и, наконец, 72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозных гелях (1,5%), содержащих краситель SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) при 95 В.
Мидии (Mytilus spp.) акклиматизировались в 500 мл насыщенной кислородом морской воды (32 PSU) в течение 24 часов при температуре 4°C. Плазмидная ДНК, содержащая вставку, кодирующую последовательность кДНК человеческого галектина-7 (номер доступа NCBI L07769), была добавлена ​​во флакон в конечной концентрации 190 мкг/мкл. Мидии, инкубированные в тех же условиях без добавления ДНК, были контролем. Третий контрольный резервуар содержал ДНК без мидий. Для контроля качества ДНК в морской воде образцы морской воды (20 мкл; три повтора) были взяты из каждого резервуара в указанное время. Для отслеживания плазмидной ДНК мидии LB были собраны в указанное время и проанализированы с помощью qPCR и ddPCR. Из-за высокого содержания соли в морской воде аликвоты были разбавлены в воде качества PCR (1:10) перед всеми анализами PCR.
Цифровая капельная ПЦР (ddPCR) проводилась с использованием протокола BioRad QX200 (Миссиссога, Онтарио, Канада). Используйте температурный профиль для определения оптимальной температуры (таблица S1). Капли были получены с использованием генератора капель QX200 (BioRad). ddPCR проводилась следующим образом: 95°C в течение 5 мин, 50 циклов по 95°C в течение 30 с и заданная температура отжига в течение 1 мин и 72°C в течение 30 с, 4°C в течение 5 мин и 90°C в течение 5 минут. Количество капель и положительных реакций (количество копий/мкл) измерялось с использованием ридера капель QX200 (BioRad). Образцы с менее чем 10 000 капель были отклонены. Контроль образца не проводился при каждом запуске ddPCR.
qPCR проводили с использованием Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) и специфических праймеров LGALS7. Все количественные ПЦР проводили в 20 мкл с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR начинали с 15-минутной инкубации при 95°C, за которой следовали 40 циклов при 95°C в течение 10 секунд и при 60°C в течение 60 секунд с одним сбором данных. Кривые плавления получали с использованием последовательных измерений при 95°C в течение 5 секунд, 65°C в течение 60 секунд и 97°C в конце qPCR. Каждая qPCR проводилась в трех повторах, за исключением контрольных образцов.
Поскольку мидии известны своей высокой скоростью фильтрации, мы сначала исследовали, могут ли они фильтровать и удерживать фрагменты ДНК, присутствующие в морской воде. Нас также интересовало, накапливаются ли эти фрагменты в их полуоткрытой лимфатической системе. Мы решили эту проблему экспериментально, отследив судьбу растворимых фрагментов ДНК, добавленных в резервуары с мидиями. Для облегчения отслеживания фрагментов ДНК мы использовали чужеродную (не собственную) плазмидную ДНК, содержащую ген галектина-7 человека. ddPCR отслеживает фрагменты плазмидной ДНК в морской воде и мидиях. Наши результаты показывают, что если количество фрагментов ДНК в морской воде оставалось относительно постоянным с течением времени (до 7 дней) в отсутствие мидий, то в присутствии мидий этот уровень почти полностью исчезал в течение 8 часов (рис. 1a,b). Фрагменты экзогенной ДНК легко обнаруживались в течение 15 минут во внутриклапанной жидкости и гемолимфе (рис. 1c). Эти фрагменты все еще можно было обнаружить до 4 часов после воздействия. Эта фильтрующая активность в отношении фрагментов ДНК сопоставима с фильтрующей активностью бактерий и водорослей [31]. Эти результаты показывают, что мидии могут фильтровать и накапливать чужеродную ДНК в своих жидкостных отсеках.
Относительные концентрации плазмидной ДНК в морской воде в присутствии (A) или отсутствии (B) мидий, измеренные с помощью ddPCR. На рисунке A результаты выражены в процентах, при этом границы прямоугольников представляют 75-й и 25-й процентили. Подогнанная логарифмическая кривая показана красным цветом, а область, заштрихованная серым цветом, представляет 95% доверительный интервал. На рисунке B красная линия представляет среднее значение, а синяя линия представляет 95% доверительный интервал для концентрации. C Накопление плазмидной ДНК в гемолимфе и клапанной жидкости мидий в разное время после добавления плазмидной ДНК. Результаты представлены в виде абсолютных копий, обнаруженных/мл (±SE).
Далее мы исследовали происхождение ccfDNA в мидиях, собранных с мидийных отмелей на островах Кергелен, удаленной группе островов с ограниченным антропогенным влиянием. Для этой цели cccDNA из гемолимф мидий была выделена и очищена методами, обычно используемыми для очистки человеческой cccDNA [32, 33]. Мы обнаружили, что средние концентрации ccfDNA гемолимфы в мидиях находятся в диапазоне низких микрограммов на мл гемолимфы (см. Таблицу S2, Дополнительная информация). Этот диапазон концентраций намного больше, чем у здоровых людей (низкие нанограммы на миллилитр), но в редких случаях у онкологических больных уровень ccfDNA может достигать нескольких микрограммов на миллилитр [34, 35]. Анализ распределения размеров ccfDNA гемолимфы показал, что эти фрагменты сильно различаются по размеру, варьируясь от 1000 п.н. до 1000 п.н. до 5000 п.н. (рис. 2). Аналогичные результаты были получены с использованием набора QIAamp Investigator Kit на основе кремния, метода, который обычно используется в судебной экспертизе для быстрого выделения и очистки геномной ДНК из образцов ДНК с низкой концентрацией, включая ccfDNA [36].
Типичная электрофореграмма ccfDNA гемолимфы мидий. Извлечено с помощью набора NucleoSnap Plasma Kit (вверху) и набора QIAamp DNA Investigator Kit. B Скрипичный график, показывающий распределение концентраций ccfDNA гемолимфы (±SE) в мидиях. Черные и красные линии представляют медиану и первый и третий квартили соответственно.
Приблизительно 1% ccfDNA у людей и приматов имеет чужеродное происхождение [21, 37]. Учитывая полуоткрытую кровеносную систему двустворчатых моллюсков, богатую микробами морскую воду и распределение размеров ccfDNA мидий, мы предположили, что ccfDNA гемолимфы мидий может содержать богатый и разнообразный пул микробной ДНК. Чтобы проверить эту гипотезу, мы секвенировали ccfDNA гемолимфы из образцов Aulacomya atra, собранных с островов Кергелен, что дало более 10 миллионов прочтений, 97,6% из которых прошли контроль качества. Затем прочтения были классифицированы в соответствии с собственными и чужеродными источниками с использованием баз данных двустворчатых моллюсков BLASTN и NCBI (рис. S1, дополнительная информация).
У людей как ядерная, так и митохондриальная ДНК может высвобождаться в кровоток [38]. Однако в настоящем исследовании не удалось подробно описать ядерную геномную ДНК мидий, учитывая, что геном A. atra не был секвенирован или описан. Однако нам удалось идентифицировать ряд фрагментов ccfDNA нашего собственного происхождения с помощью библиотеки двустворчатых моллюсков (рис. S2, дополнительная информация). Мы также подтвердили наличие фрагментов ДНК нашего собственного происхождения с помощью направленной ПЦР-амплификации тех генов A. atra, которые были секвенированы (рис. 3). Аналогичным образом, учитывая, что митохондриальный геном A. atra доступен в публичных базах данных, можно найти доказательства наличия фрагментов митохондриальной ccfDNA в гемолимфе A. atra. Наличие фрагментов митохондриальной ДНК было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации (рис. 3).
Различные митохондриальные гены присутствовали в гемолимфе A. atra (красные точки — инвентарный номер: SRX5705969) и M. platensis (синие точки — инвентарный номер: SRX5705968), амплифицированной с помощью ПЦР. Рисунок адаптирован из Breton et al., 2011 B Амплификация супернатанта гемолимфы из A. atra Хранится на бумаге FTA. Используйте 3-миллиметровый дырокол, чтобы добавить непосредственно в пробирку для ПЦР, содержащую смесь для ПЦР.
Учитывая обильное микробное содержание в морской воде, мы изначально сосредоточились на характеристике микробных последовательностей ДНК в гемолимфе. Для этого мы используем две разные стратегии. Первая стратегия использовала Kraken2, программу классификации последовательностей на основе алгоритмов, которая может идентифицировать микробные последовательности с точностью, сопоставимой с BLAST и другими инструментами [28]. Было определено, что более 6719 прочтений имеют бактериальное происхождение, в то время как 124 и 64 были от архей и вирусов соответственно (рис. 4). Наиболее распространенными фрагментами бактериальной ДНК были Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (рис. 4a). Это распределение согласуется с предыдущими исследованиями микробиома морских мидий [39, 40]. Гамма-протеобактерии были основным классом Proteobacteria (44%), включая множество Vibrionales (рис. 4b). Метод ddPCR подтвердил наличие фрагментов ДНК Vibrio в ccfDNA гемолимфы A. atra (рис. 4c) [41]. Чтобы получить больше информации о бактериальном происхождении ccfDNA, был применен дополнительный подход (рис. S2, Дополнительная информация). В этом случае перекрывающиеся прочтения были собраны в парные конечные прочтения и классифицированы как имеющие собственное (двустворчатые моллюски) или чужеродное происхождение с использованием BLASTN и значения e 1e−3 и порогового значения с гомологией >90%. В этом случае перекрывающиеся прочтения были собраны в парные конечные прочтения и классифицированы как имеющие собственное (двустворчатые моллюски) или чужеродное происхождение с использованием BLASTN и значения e 1e−3 и порогового значения с гомологией >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значениями e 1e-3 и отсечения с гомологией > 90%. В этом случае перекрывающиеся прочтения были собраны как парные прочтения и классифицированы как нативные (двустворчатые) или неоригинальные с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и порогового значения с >90% гомологии.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и пороговой гомологии > 90%. В этом случае перекрывающиеся прочтения были собраны как парные прочтения и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или неоригинальные с использованием значений e BLASTN и 1e-3, а также порога гомологии >90%.Поскольку геном A. atra еще не был секвенирован, мы использовали стратегию сборки de novo ассемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Всего было идентифицировано 147 188 контигов как зависящих (двустворчатые) от происхождения. Затем эти контиги были взорваны с e-значениями 1e-10 с помощью BLASTN и BLASTX. Эта стратегия позволила нам идентифицировать 482 фрагмента, не принадлежащих двустворчатым моллюскам, присутствующих в ccfDNA A. atra. Более половины (57%) этих фрагментов ДНК были получены от бактерий, в основном от симбионтов жабр, включая сульфотрофных симбионтов, и от симбионтов жабр Solemya velum (рис. 5).
Относительное обилие на уровне типа. B Микробное разнообразие двух основных филумов (Firmicutes и Proteobacteria). Представительная амплификация ddPCR C Vibrio spp. A. Фрагменты гена 16S рРНК (синие) в трех гемолимфах атр.
Всего было проанализировано 482 собранных контига. Общий профиль таксономического распределения аннотаций метагеномных контигов (прокариоты и эукариоты). B Детальное распределение фрагментов бактериальной ДНК, идентифицированных с помощью BLASTN и BLASTX.
Анализ Kraken2 также показал, что ccfDNA мидий содержала фрагменты ДНК архей, включая фрагменты ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (рис. 6a). Присутствие фрагментов ДНК, полученных от Euryarchaeota и Crenarchaeota, ранее обнаруженных в микробном сообществе калифорнийских мидий, не должно вызывать удивления [42]. Хотя Euryarchaeota часто ассоциируется с экстремальными условиями, в настоящее время признано, что как Euryarchaeota, так и Crenarcheota являются одними из наиболее распространенных прокариот в морской криогенной среде [43, 44]. Присутствие метаногенных микроорганизмов в мидиях неудивительно, учитывая недавние сообщения о масштабных утечках метана из донных утечек на плато Кергелен [45] и возможном микробном производстве метана, наблюдаемом у побережья островов Кергелен [46].
Затем наше внимание переключилось на показания ДНК-вирусов. Насколько нам известно, это первое нецелевое исследование вирусного содержания мидий. Как и ожидалось, мы обнаружили фрагменты ДНК бактериофагов (Caudovirales) (рис. 6b). Однако наиболее распространенная вирусная ДНК происходит из филума нуклеоцитовирусов, также известного как ядерный цитоплазматический большой ДНК-вирус (NCLDV), который имеет самый большой геном среди всех вирусов. В пределах этого филума большинство последовательностей ДНК принадлежат семействам Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чьими естественными хозяевами являются позвоночные и членистоногие, в то время как небольшая часть этих последовательностей ДНК принадлежит известным вирусологическим водорослям. Заражает морские эукариотические водоросли. Последовательности были также получены из вируса Пандора, гигантского вируса с самым большим размером генома среди всех известных вирусных родов. Интересно, что диапазон хозяев, известных как инфицированные вирусом, как определено с помощью секвенирования ccfDNA гемолимфы, был относительно большим (Рисунок S3, Дополнительная информация). Он включает вирусы, которые заражают насекомых, таких как Baculoviridae и Iridoviridae, а также вирусы, которые заражают амебу, водоросли и позвоночных. Мы также обнаружили последовательности, соответствующие геному Pithovirus sibericum. Питовирусы (также известные как «вирусы-зомби») были впервые выделены из 30 000-летней вечной мерзлоты в Сибири [47]. Таким образом, наши результаты согласуются с предыдущими отчетами, показывающими, что не все современные виды этих вирусов вымерли [48] и что эти вирусы могут присутствовать в отдаленных субарктических морских экосистемах.
Наконец, мы проверили, сможем ли мы найти фрагменты ДНК других многоклеточных животных. Всего 482 чужеродных контига были идентифицированы BLASTN и BLASTX с библиотеками nt, nr и RefSeq (геномными и белковыми). Наши результаты показывают, что среди чужеродных фрагментов ccfDNA многоклеточных животных преобладает ДНК костных костей (рис. 5). Также были обнаружены фрагменты ДНК насекомых и других видов. Относительно большая часть фрагментов ДНК не была идентифицирована, возможно, из-за недостаточной представленности большого количества морских видов в геномных базах данных по сравнению с наземными видами [49].
В настоящей статье мы применяем концепцию LB к мидиям, утверждая, что секвенирование ccfDNA гемолимфы может дать представление о составе морских прибрежных экосистем. В частности, мы обнаружили, что 1) гемолимфа мидий содержит относительно высокие концентрации (уровни микрограммов) относительно больших (~1-5 кб) циркулирующих фрагментов ДНК; 2) эти фрагменты ДНК являются как независимыми, так и ненезависимыми; 3) Среди чужеродных источников этих фрагментов ДНК мы обнаружили бактериальную, архейную и вирусную ДНК, а также ДНК других многоклеточных животных; 4) Накопление этих чужеродных фрагментов ccfDNA в гемолимфе происходит быстро и способствует внутренней фильтрующей активности мидий. В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB, которая до сих пор применялась в основном в области биомедицины, кодирует богатый, но неисследованный источник знаний, который можно использовать для лучшего понимания взаимодействия между видами-сентинелами и их средой.
Помимо приматов, изоляция ccfDNA была зарегистрирована у млекопитающих, включая мышей, собак, кошек и лошадей [50, 51, 52]. Однако, насколько нам известно, наше исследование является первым, в котором сообщается об обнаружении и секвенировании ccfDNA у морских видов с открытой системой кровообращения. Эта анатомическая особенность и фильтрующая способность мидий могут, по крайней мере частично, объяснить различные характеристики размера циркулирующих фрагментов ДНК по сравнению с другими видами. У людей большинство фрагментов ДНК, циркулирующих в крови, представляют собой небольшие фрагменты размером от 150 до 200 п.н. с максимальным пиком в 167 п.н. [34, 53]. Небольшая, но значительная часть фрагментов ДНК имеет размер от 300 до 500 п.н., и около 5% имеют длину более 900 п.н. [54]. Причина такого распределения размеров заключается в том, что основной источник ccfDNA в плазме возникает в результате гибели клеток, либо из-за гибели клеток, либо из-за некроза циркулирующих гемопоэтических клеток у здоровых людей, либо из-за апоптоза опухолевых клеток у онкологических больных (известно как циркулирующая опухолевая ДНК). , ctDNA). Распределение размеров ccfDNA гемолимфы, которое мы обнаружили у мидий, варьировалось от 1000 до 5000 п.н., что позволяет предположить, что ccfDNA мидий имеет другое происхождение. Это логичная гипотеза, поскольку мидии имеют полуоткрытую сосудистую систему и живут в морской водной среде, содержащей высокие концентрации микробной геномной ДНК. Фактически, наши лабораторные эксперименты с использованием экзогенной ДНК показали, что мидии накапливают фрагменты ДНК в морской воде, по крайней мере через несколько часов они деградируют после поглощения клетками и/или высвобождаются и/или хранятся в различных организациях. Учитывая редкость клеток (как прокариотических, так и эукариотических), использование внутриклапанных отсеков уменьшит количество ccfDNA из собственных источников, а также из чужеродных источников. Учитывая важность врожденного иммунитета двустворчатых моллюсков и большое количество циркулирующих фагоцитов, мы далее предположили, что даже чужеродная ccfDNA обогащается в циркулирующих фагоцитах, которые накапливают чужеродную ДНК при попадании в организм микроорганизмов и/или клеточного детрита. В совокупности наши результаты показывают, что ccfDNA гемолимфы двустворчатых моллюсков является уникальным хранилищем молекулярной информации и укрепляет их статус как вида-сентина.
Наши данные указывают на то, что секвенирование и анализ фрагментов ccfDNA гемолимфы бактериального происхождения могут предоставить ключевую информацию о бактериальной флоре хозяина и бактериях, присутствующих в окружающей морской экосистеме. Методы секвенирования методом выстрела выявили последовательности комменсальных бактерий A. atra gill, которые были бы пропущены, если бы использовались обычные методы идентификации 16S рРНК, отчасти из-за смещения референтной библиотеки. Фактически, наше использование данных LB, собранных от M. platensis в том же слое мидий на Кергелене, показало, что состав бактериальных симбионтов, связанных с жабрами, был одинаковым для обоих видов мидий (рис. S4, дополнительная информация). Это сходство двух генетически разных мидий может отражать состав бактериальных сообществ в холодных, сернистых и вулканических отложениях Кергелена [55, 56, 57, 58]. Более высокие уровни микроорганизмов, восстанавливающих серу, были хорошо описаны при сборе мидий из биотурбированных прибрежных районов [59], таких как побережье Порт-о-Франс. Другая возможность заключается в том, что комменсальная флора мидий может быть затронута горизонтальной передачей [60, 61]. Необходимы дополнительные исследования для определения корреляции между морской средой, поверхностью морского дна и составом симбиотических бактерий в мидиях. Эти исследования в настоящее время продолжаются.
Длина и концентрация ccfDNA гемолимфы, простота ее очистки и высокое качество, позволяющее проводить быстрое дробовое секвенирование, являются одними из многих преимуществ использования ccfDNA мидий для оценки биоразнообразия в морских прибрежных экосистемах. Этот подход особенно эффективен для характеристики вирусных сообществ (виромов) в данной экосистеме [62, 63]. В отличие от бактерий, архей и эукариот, вирусные геномы не содержат филогенетически консервативных генов, таких как последовательности 16S. Наши результаты показывают, что жидкие биопсии из индикаторных видов, таких как мидии, могут использоваться для идентификации относительно большого количества фрагментов вируса ccfDNA, которые, как известно, заражают хозяев, которые обычно населяют прибрежные морские экосистемы. Сюда входят вирусы, которые, как известно, заражают простейших, членистоногих, насекомых, растения и бактериальные вирусы (например, бактериофаги). Аналогичное распределение было обнаружено, когда мы исследовали виром ccfDNA гемолимфы голубых мидий (M. platensis), собранных в том же слое мидий в Кергелене (таблица S2, дополнительная информация). Дробовик-секвенирование ccfDNA действительно является новым подходом, набирающим обороты в изучении вирома человека или других видов [21, 37, 64]. Этот подход особенно полезен для изучения двухцепочечных ДНК-вирусов, поскольку ни один ген не сохраняется среди всех двухцепочечных ДНК-вирусов, представляющих наиболее разнообразный и широкий класс вирусов в Балтиморе [65]. Хотя большинство этих вирусов остаются неклассифицированными и могут включать вирусы из совершенно неизвестной части вирусного мира [66], мы обнаружили, что виромы и диапазоны хозяев мидий A. atra и M. platensis попадают между двумя видами. аналогично (см. рисунок S3, дополнительная информация). Это сходство неудивительно, поскольку оно может отражать отсутствие селективности в поглощении ДНК, присутствующей в окружающей среде. В настоящее время необходимы дальнейшие исследования с использованием очищенной РНК для характеристики РНК-вирома.
В нашем исследовании мы использовали очень строгий конвейер, адаптированный из работы Коварски и коллег [37], которые использовали двухэтапное удаление объединенных прочтений и контигов до и после сборки нативной ccfDNA, что привело к высокой доле некартированных прочтений. Поэтому мы не можем исключить, что некоторые из этих некартированных прочтений все еще могут иметь свое собственное происхождение, в первую очередь потому, что у нас нет референсного генома для этого вида мидий. Мы также использовали этот конвейер, потому что были обеспокоены химерами между собственными и чужими прочтениями и длинами прочтений, сгенерированными Illumina MiSeq PE75. Другая причина большинства некартированных прочтений заключается в том, что большая часть морских микробов, особенно в отдаленных районах, таких как Кергелен, не были аннотированы. Мы использовали Illumina MiSeq PE75, предполагая, что длины фрагментов ccfDNA аналогичны человеческой ccfDNA. Для будущих исследований, учитывая наши результаты, показывающие, что гемолимфальная ccfDNA имеет более длинные считывания, чем у людей и/или млекопитающих, мы рекомендуем использовать платформу секвенирования, более подходящую для более длинных фрагментов ccfDNA. Такая практика значительно облегчит выявление большего количества показаний для более глубокого анализа. Получение в настоящее время недоступной полной последовательности ядерного генома A. atra также значительно облегчит различение ccfDNA из собственных и чужеродных источников. Учитывая, что наше исследование было сосредоточено на возможности применения концепции жидкой биопсии к мидиям, мы надеемся, что по мере использования этой концепции в будущих исследованиях будут разработаны новые инструменты и трубопроводы для увеличения потенциала этого метода для изучения микробного разнообразия мидий. морская экосистема.
Как неинвазивный клинический биомаркер, повышенные уровни ccfDNA в плазме человека связаны с различными заболеваниями, повреждением тканей и стрессовыми состояниями [67,68,69]. Это увеличение связано с высвобождением фрагментов ДНК собственного происхождения после повреждения тканей. Мы решили эту проблему, используя острый тепловой стресс, при котором мидии кратковременно подвергались воздействию температуры 30 °C. Мы провели этот анализ на трех различных типах мидий в трех независимых экспериментах. Однако мы не обнаружили никаких изменений в уровнях ccfDNA после острого теплового стресса (см. Рисунок S5, дополнительная информация). Это открытие может объяснить, по крайней мере частично, тот факт, что мидии имеют полуоткрытую кровеносную систему и накапливают большое количество чужеродной ДНК из-за своей высокой фильтрующей активности. С другой стороны, мидии, как и многие беспозвоночные, могут быть более устойчивы к вызванному стрессом повреждению тканей, тем самым ограничивая высвобождение ccfDNA в их гемолимфе [70, 71].
На сегодняшний день анализ ДНК биоразнообразия в водных экосистемах в основном был сосредоточен на метабаркодировании экологической ДНК (eDNA). Однако этот метод обычно ограничен в анализе биоразнообразия при использовании праймеров. Использование дробового секвенирования позволяет обойти ограничения ПЦР и предвзятый выбор наборов праймеров. Таким образом, в некотором смысле наш метод ближе к недавно используемому высокопроизводительному методу дробового секвенирования eDNA, который способен напрямую секвенировать фрагментированную ДНК и анализировать почти все организмы [72, 73]. Однако существует ряд фундаментальных проблем, которые отличают LB от стандартных методов eDNA. Конечно, основным отличием между eDNA и LB является использование естественных хозяев-фильтров. Сообщалось об использовании морских видов, таких как губки и двустворчатые моллюски (Dresseina spp.), в качестве естественного фильтра для изучения eDNA [74, 75]. Однако в исследовании Дрейссены использовались биопсии тканей, из которых была извлечена ДНК. Анализ ccfDNA из LB не требует биопсии ткани, специализированного и иногда дорогостоящего оборудования и логистики, связанной с eDNA или биопсией ткани. Фактически, мы недавно сообщили, что ccfDNA из LB можно хранить и анализировать с поддержкой FTA без поддержания холодовой цепи, что является серьезной проблемой для исследований в отдаленных районах [76]. Извлечение ccfDNA из жидких биопсий также просто и обеспечивает высокое качество ДНК для дробового секвенирования и ПЦР-анализа. Это большое преимущество, учитывая некоторые технические ограничения, связанные с анализом eDNA [77]. Простота и низкая стоимость метода отбора проб также особенно подходят для долгосрочных программ мониторинга. Помимо их высокой фильтрующей способности, другой хорошо известной особенностью двустворчатых моллюсков является химический мукополисахаридный состав их слизи, который способствует поглощению вирусов [78, 79]. Это делает двустворчатых моллюсков идеальным естественным фильтром для характеристики биоразнообразия и воздействия изменения климата в данной водной экосистеме. Хотя наличие фрагментов ДНК, полученных от хозяина, можно рассматривать как ограничение метода по сравнению с eDNA, стоимость, связанная с наличием такой нативной ccfDNA по сравнению с eDNA, одновременно понятна для огромного количества информации, доступной для исследований здоровья. offset host. Это включает в себя наличие вирусных последовательностей, интегрированных в геном хозяина-хозяина. Это особенно важно для мидий, учитывая наличие горизонтально передаваемых лейкозных ретровирусов у двустворчатых моллюсков [80, 81]. Еще одним преимуществом LB перед eDNA является то, что он использует фагоцитарную активность циркулирующих клеток крови в гемолимфе, которая поглощает микроорганизмы (и их геномы). Фагоцитоз является основной функцией клеток крови у двустворчатых моллюсков [82]. Наконец, метод использует преимущества высокой фильтрующей способности мидий (в среднем 1,5 л/ч морской воды) и двухдневной циркуляции, которые увеличивают смешивание различных слоев морской воды, позволяя захватывать гетерологичную eDNA. [83, 84]. Таким образом, анализ ccfDNA мидий является интересным направлением, учитывая пищевые, экономические и экологические воздействия мидий. Подобно анализу LB, собранных у людей, этот метод также открывает возможность измерения генетических и эпигенетических изменений в ДНК хозяина в ответ на экзогенные вещества. Например, можно предусмотреть технологии секвенирования третьего поколения для проведения анализа метилирования по всему геному в нативной ccfDNA с использованием нанопорового секвенирования. Этот процесс должен быть облегчен тем фактом, что длина фрагментов ccfDNA мидий идеально совместима с платформами секвенирования с длинными считываниями, которые позволяют проводить анализ метилирования ДНК по всему геному из одного цикла секвенирования без необходимости химических преобразований.85,86] Это интересная возможность, поскольку было показано, что паттерны метилирования ДНК отражают ответ на экологический стресс и сохраняются на протяжении многих поколений. Следовательно, он может дать ценную информацию о базовых механизмах, управляющих реакцией после воздействия изменения климата или загрязняющих веществ [87]. Однако использование LB не лишено ограничений. Само собой разумеется, что для этого требуется наличие индикаторных видов в экосистеме. Как упоминалось выше, использование LB для оценки биоразнообразия данной экосистемы также требует строгого биоинформатического конвейера, который учитывает наличие фрагментов ДНК из источника. Еще одной серьезной проблемой является доступность референтных геномов для морских видов. Есть надежда, что такие инициативы, как проект «Геномы морских млекопитающих» и недавно созданный проект Fish10k [88], облегчат такой анализ в будущем. Применение концепции LB к морским фильтрующим организмам также совместимо с последними достижениями в технологии секвенирования, что делает ее хорошо подходящей для разработки многоомных биомаркеров для предоставления важной информации о здоровье морских местообитаний в ответ на экологический стресс.
Данные секвенирования генома были размещены в архиве последовательностей NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 в разделе «Биопроекты SRR8924808».
Brierley AS, Kingsford MJ Влияние изменения климата на морскую жизнь и экосистемы. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S и др. Рассмотрите совокупное воздействие изменения климата и других локальных факторов стресса на морскую среду. Общая научная окружающая среда. 2021;755:142564.
Карелла Ф., Антуофермо Э., Фарина С., Салати Ф., Мандас Д., Прадо П. и др. ). Наука первого марта. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Снижение толерантности к жаре в условиях повторяющегося теплового стресса объясняет высокую летнюю смертность голубых мидий. Научный отчет 2019; 9:17498.
Фей СБ, Сьепельски А.М., Нуссле С., Сервантес-Йошида К., Хван Дж.Л., Хубер Э.Р. и др. Недавние изменения частоты, причин и масштабов гибели животных. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена И., Мугетти Д., Черрути Ф., Хоссейни С. и др. Множественные невидоспецифичные патогены могли стать причиной массовой смертности Pinna nobilis. Жизнь. 2020;10:238.
Брэдли М., Куттс С.Дж., Дженкинс Э., О'Хара Т.М. Потенциальное воздействие изменения климата на зоонозные заболевания в Арктике. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Бейер Дж., Грин Н.В., Брукс С., Аллан И.Дж., Руус А., Гомес Т. и др. Голубые мидии (Mytilus edulis spp.) как сигнальные организмы в мониторинге загрязнения прибрежных вод: обзор. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сиравенья Г., Марсони С., Сиена С., Барделли А. Интеграция жидкой биопсии в лечение рака. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C и др. Созревание жидкой биопсии: позволяет опухолевой ДНК циркулировать. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метаис П. Нуклеиновые кислоты в плазме человека. Протоколы заседаний дочерних компаний Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А.Дж., Унгерер В., Холденридер С. Новая роль бесклеточной ДНК как молекулярного маркера для лечения рака. Количественная оценка биомолярного анализа. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Джеффри С.С. Жидкая биопсия внедряется в клинику – вопросы внедрения и будущие задачи. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW и др. Фетальная ДНК присутствует в плазме и сыворотке матери. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Исследование течения беременности и ее осложнений с использованием циркулирующей внеклеточной РНК в крови женщин во время беременности. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М., Шервуд К., Киоун П., Шютц Э., Бек Дж., Стегбауэр Дж. и др. Жидкостная биопсия: бесклеточная ДНК донора используется для обнаружения аллогенных поражений в почечном трансплантате. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан ФК, Ло ЙМ Инновации в пренатальной диагностике: секвенирование генома материнской плазмы. Анна МД. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D и др. Быстрое обнаружение патогенов с помощью метагеномного секвенирования следующего поколения инфицированных биологических жидкостей. Nat Medicine. 2021;27:115-24.