Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäkli. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Suwuk biopsiýa (SB) biolukmançylyk ulgamynda çalt meşhurlyk gazanýan düşünjedir. Bu düşünje, esasan, dürli dokumalarda öýjük ölüminden soň kiçi bölekler hökmünde bölünip çykýan aýlanýan öýjükara DNK-nyň (ccfDNK) böleklerini anyklamaga esaslanýar. Bu bölekleriň az bölegi daşary ýurt (daşary ýurt) dokumalaryndan ýa-da organizmlerden gelip çykýar. Häzirki işimizde bu düşünje deňiz suwunyň ýokary süzgüç ukyby bilen tanalýan gözegçilik görnüşi bolan midiýalara ulanyldy. Deňiz kenarýaka ekosistemalarynyň biodürlüligi barada maglumat bermek üçin dürli çeşmelerden daşky gurşawyň DNK böleklerini tutmak üçin midiýalaryň tebigy süzgüç hökmünde hereket etmek ukybyny ulanýarys. Netijelerimiz midiýa gemolimfasynyň ölçegleri boýunça 1-den 5 kb-a çenli üýtgeýän DNK böleklerini öz içine alýandygyny görkezýär. Tüpeň bilen yzygiderlilik köp sanly DNK bölekleriniň daşary ýurt mikrob gelip çykyşlydygyny görkezdi. Olaryň arasynda kenarýaka deňiz ekosistemalarynda giňden duş gelýän dürli eýeleri ýokuşdyrýandygy mälim bolan wiruslar bilen birlikde bakteriýalardan, arheýalardan we wiruslardan DNK böleklerini tapdyk. Netijede, biziň gözlegimiz midiýalara ulanylýan LB konsepsiýasynyň deňiz kenarýaka ekosistemalaryndaky mikrob dürlüligi barada baý, ýöne heniz öwrenilmedik bilim çeşmesi bolandygyny görkezýär.
Howanyň üýtgemeginiň (HD) deňiz ekosistemalarynyň biodürlüligine täsiri ylmy-barlag işleriniň çalt ösýän ugrydyr. Global ýylylyk diňe bir möhüm fiziologiki stressleri döretmän, eýsem deňiz organizmleriniň termal durnuklylygynyň ewolýusiýa çäklerini hem peseldýär, birnäçe görnüşleriň ýaşaýyş gurşawyna täsir edýär we olary has amatly şertleri gözlemäge iterýär [1, 2]. Metazoalaryň biodürlüligine täsir etmekden başga-da, HD eýe-mikrob özara täsirleriniň näzik deňagramlylygyny bozýar. Bu mikrobial disbakterioz deňiz organizmlerini ýokanç kesel döredijilere has duýgur edýändigi sebäpli deňiz ekosistemalaryna çynlakaý howp döredýär [3, 4]. HD-niň köpçülikleýin ölümlerde möhüm rol oýnaýandygyna ynanýarlar, bu bolsa global deňiz ekosistemalaryny dolandyrmak üçin çynlakaý mesele [5, 6]. Bu köp deňiz görnüşleriniň ykdysady, ekologiýa we iýmit täsirlerini göz öňünde tutup, möhüm meseledir. Bu, esasanam, HD-niň täsiri has gyssagly we agyr bolan polýar sebitlerde ýaşaýan iki gaplakly molyuskalar üçin degişlidir [6, 7]. Aslynda, Mytilus spp. ýaly iki gaplakly molyuskalar HD-niň deňiz ekosistemalaryna täsirini gözegçilik etmek üçin giňden ulanylýar. Geň däl, olaryň saglygyny gözegçilikde saklamak üçin biomarkerleriň deňeşdirme boýunça köp sanlysy işlenip düzüldi, köplenç fermentatiw işjeňlige ýa-da öýjükleriň ýaşaýyş ukyby we fagositik işjeňlik ýaly öýjük funksiýalaryna esaslanýan funksional biomarkerleri öz içine alýan iki derejeli çemeleşme ulanylýar [8]. Bu usullar şeýle hem deňiz suwunyň köp mukdaryny siňdirenden soň ýumşak dokumalarda toplanýan aýratyn basyş görkezijileriniň konsentrasiýasyny ölçemegi öz içine alýar. Şeýle-de bolsa, iki gapakly mopluklaryň ýokary süzgüç ukyby we ýarym açyk gan aýlanyş ulgamy hassalary dolandyrmak üçin ýönekeý we minimal inwaziw çemeleşme bolan suwuk biopsiýa (SB) konsepsiýasyny ulanyp, täze gemolimfa biomarkerlerini işläp düzmek mümkinçiligini berýär. gan nusgalary [9, 10]. Adam SB-de birnäçe görnüşli aýlanýan molekulalar tapylyp bilinse-de, bu konsepsiýa, esasan, plazmadaky aýlanýan öýjükara DNK (ccfDNA) bölekleriniň DNK yzygiderliliginiň seljermesine esaslanýar. Aslynda, adam plazmasynda aýlanýan DNK-nyň bardygy 20-nji asyryň ortalaryndan bäri bellidir [11], ýöne ýokary öndürijilikli yzygiderlilik usullarynyň peýda bolmagy diňe soňky ýyllarda SBDNA esasynda kliniki diagnozyň goýulmagyna getirdi. Bu aýlanýan DNK bölekleriniň bolmagy, öýjük ölüminden soň genom DNK-synyň (ýadro we mitohondrial) passiw boşadylmagy bilen baglanyşyklydyr. Sagdyn adamlarda ccfDNK-nyň konsentrasiýasy adatça pes bolýar (<10 ng/ml), ýöne dürli patologiýalardan ejir çekýän ýa-da stresse duçar bolýan näsaglarda 5–10 esse ýokarlanyp, dokumalaryň zeperlenmegine sebäp bolýar. Sagdyn adamlarda ccfDNK-nyň konsentrasiýasy adatça pes bolýar (<10 ng/ml), ýöne dürli patologiýalardan ejir çekýän ýa-da stresse duçar bolýan näsaglarda 5–10 esse ýokarlanyp, dokumalaryň zeperlenmegine sebäp bolýar. У здоровых людей маран вккДНК в земме низкая (<10 нг / гир), но может повишаться в 5-10 раз у больных с различной патолиией ​​или подвергающихся лаву, при провящему к повреждению Sagdyn adamlarda kkkDNK-nyň konsentrasiýasy adatça pes bolýar (<10 ng/ml), ýöne dürli patologiýalary bolan ýa-da dokumalaryň zeperlenmegine getirýän stress astynda bolan näsaglarda ol 5–10 esse ýokarlanyp biler.CcfDNA 的浓度通常较低（ <10 ng / mL ），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加 5-10 倍，从而导致组织损伤。10 ng 个体 c ccfdna 的 10 10 ng / mlКонцентрации ccfDNA обикно низкие (<10 нг / зир) у здоровых людей, ноябрь могут быть увеличены в 5-10 раз у удов с различными пидологиями или чисом, что при имитит к повреждению тканей. Sagdyn adamlarda ccfDNK-nyň konsentrasiýasy adatça pes (<10 ng/ml) bolýar, ýöne dürli patologiýalary ýa-da stressi bolan näsaglarda 5-10 esse ýokarlanyp, dokumalaryň zeperlenmegine sebäp bolýar.ccfDNK bölekleriniň ululygy dürli-dürli bolýar, ýöne adatça 150-den 200 bp-e çenli üýtgeýär. [12]. Öz-özünden alnan ccfDNK-nyň, ýagny kadaly ýa-da özgerdilen öýjüklerden alnan ccfDNK-nyň analizi ýadro we/ýa-da mitohondrial genomda bar bolan genetiki we epigenetiki üýtgeşmeleri anyklamak üçin ulanylyp bilner, şeýlelik bilen lukmanlara belli bir molekulýar maksatly terapiýalary saýlamaga kömek edýär [13]. Şeýle-de bolsa, ccfDNK-ny daşarky çeşmelerden, mysal üçin, göwrelilik döwründe döl öýjüklerinden ýa-da transplantasiýa edilen organlardan alnan ccfDNK-dan alyp bolýar [14,15,16,17]. ccfDNK şeýle hem ýokanç agentiň (daşary ýurt) nuklein kislotalarynyň bardygyny anyklamak üçin möhüm maglumat çeşmesidir, bu bolsa gan medeniýetleri arkaly anyklanmadyk giňden ýaýran ýokançlyklary inwaziw däl anyklamaga mümkinçilik berýär we ýokançlanan dokumalaryň inwaziw biopsiýasyndan gaça durýar [18]. Soňky barlaglar hakykatdanam adam ganynda wirusly we bakteriýa patogenlerini anyklamak üçin ulanylyp bilinjek baý maglumat çeşmesiniň bardygyny we adam plazmasynda tapylan ccfDNK-nyň takmynan 1% -iniň daşary ýurtdan gelip çykandygyny görkezdi [19]. Bu barlaglar organizmiň aýlanýan mikrobiomynyň biodürlüliginiň ccfDNA analizi arkaly bahalandyrylyp bilinjekdigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, ýakynda çenli bu düşünje diňe adamlarda we az derejede beýleki oňurgaly haýwanlarda ulanylýardy [20, 21].
Şu makalada biz 35 million ýyl mundan ozal emele gelen uly platonyň üstünde ýerleşýän adalar topary bolan subantarktik Kerguelen adalarynda giňden duş gelýän günorta görnüşi bolan Aulacomya atranyň ccfDNK-syny seljermek üçin LB potensialyny ulanýarys. wulkan püskürmesi. In vitro synag ulgamyny ulanyp, deňiz suwundaky DNK bölekleriniň midiýalar tarapyndan çalt kabul edilip, gemolimfa bölümine girýändigini anykladyk. Tüpeň yzygiderliligi midiýa gemolimfa ccfDNK-nyň özünden we özünden gelip çykan DNK böleklerini, şol sanda sowuk wulkan deňiz kenarýaka ekosistemalaryna mahsus bolan biomlardan simbiotik bakteriýalary we DNK böleklerini öz içine alýandygyny görkezdi. Gemolimfa ccfDNK-da dürli eýeçilik aralyklary bolan wiruslardan alynýan wirus yzygiderlilikleri hem bar. Şeýle hem, süňkli balyklar, deňiz anemonlary, suw otlary we mör-möjekler ýaly köp öýjükli haýwanlardan DNK böleklerini tapdyk. Netijede, biziň gözlegimiz LB konsepsiýasynyň deňiz ekosistemalarynda baý genom repertuaryny döretmek üçin deňiz oňurgasyzlaryna üstünlikli ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
Uly ýaşly (55-70 mm uzynlykda) Mytilus platensis (M. platensis) we Aulacomya atra (A. atra) 2018-nji ýylyň dekabrynda Port-o-Fransyň daşlyk kenarlaryndan (049°21.235 S, 070°13.490 E.) ýygnaldy. Kerguelen adalaryndan beýleki uly ýaşly gök midiýalar (Mytilus spp.) täjirçilik üpjün edijisinden (PEI Mussel King Inc., Şazada Edward adasy, Kanada) alyndy we 10–20 litr 32‰ emeli duzly suw (emeli deňiz duzy Reef Crystal, Instant Ocean, Wirjiniýa, ABŞ) bolan temperatura gözegçilik edilýän (4°C) howalandyrylan akwariuma ýerleşdirildi. Her bir tejribe üçin aýratyn gabyklaryň uzynlygy we agramy ölçeldi.
Bu programma üçin mugt açyk giriş protokoly internetde elýeterlidir (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Gysgaça aýdylanda, LB gemolimfa [22] beýan edilişi ýaly abduktor myşsalaryndan ýygnaldy. Gemolimfa 1200 × g-da 3 minutlap santrifuga arkaly arassalandy, üstki gatlak ulanylýança doňduryldy (-20°C). cfDNK-ny bölüp almak we arassalamak üçin nusgalar (1,5-2,0 ml) eredilip, öndürijiň görkezmelerine laýyklykda NucleoSnap cfDNK toplumy (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) arkaly işlenildi. ccfDNK goşmaça seljermä çenli -80°C-de saklandy. Käbir tejribelerde ccfDNK QIAamp DNK derňew toplumy (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) arkaly bölünip alyndy we arassalandy. Arassalanan DNK standart PicoGreen synagy arkaly kesgitlenildi. Aýrylyp alnan ccfDNK-nyň bölekleriniň paýlanyşy, ýokary duýgurlykly DNK toplumy ulanylyp, Agilent 2100 bioanalizatoryny (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ulanyp, kapillýar elektroforez arkaly seljerildi. Synag öndürijiň görkezmelerine laýyklykda 1 µl ccfDNK nusgasyny ulanyp geçirildi.
Gemolimfa ccfDNK bölekleriniň yzygiderliligini kesgitlemek üçin Génome Québec (Monreal, Kwebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 toplumynyň Illumina DNA Mix toplumyny ulanyp, tüpeň kitaphanalaryny taýýarlady. Standart adapter (BioO) ulanyldy. Çig maglumat faýllary NCBI yzygiderliligini okamak arhiwinden (SRR8924808 we SRR8924809) elýeterlidir. Esasy okamak hili FastQC [23] ulanylyp bahalandyryldy. Trimmomatic [24] kesiji adapterler we pes hilli okamak üçin ulanyldy. Jübüt uçlary bolan tüpeň okamaklary gabat gelmezligiň öňüni almak üçin FLASH iň az 20 bp gabat gelýän uzyn ýeke okamaklara birleşdirildi [25]. Birleşdirilen okalyşlar iki gaply NCBI Taksonomiýa maglumat bazasyny (e gymmaty < 1e−3 we 90% gomologiýa) ulanyp BLASTN bilen belliklendi we pes çylşyrymlylykly yzygiderlikleriň maskalanmagy DUST [26] ulanyp ýerine ýetirildi. Birleşdirilen okalyşlar iki gaply NCBI Taksonomiýa maglumat bazasyny (e gymmaty < 1e−3 we 90% gomologiýa) ulanyp BLASTN bilen belliklendi we pes çylşyrymlylykly yzygiderlikleriň maskalanmagy DUST [26] ulanyp ýerine ýetirildi. Объединенные чтения были аннотированя с помощью BLASTN с использованием басы Кных так такомии двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% tutholиоми) выполнено с использованием DUST [26]. Bileleşdirilen okalyşlar NCBI iki gaply taksonomiýa maglumat bazasyny ulanyp BLASTN bilen belliklendi (e gymmaty < 1e-3 we 90% gomologiýa) we pes çylşyrymlylykly yzygiderlik maskasy DUST [26] ulanyp ýerine ýetirildi.使用双壳类 NCBI 分类数据库（ e 值 <1e-3 和 90% AST BLASTN 注释合并的读数，并使用 DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（ <1e-3 和 90% 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 tozan [26] 进行 复杂度 序列 使用Объединенные чтения были аннотированя с помощью BLASTN с использованием так консомической басы чырных двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% tutологиии) выполнено с использованием DUST [26]. Bileleşdirilen okalyşlar NCBI iki gaply taksonomiki maglumat bazasyny (e gymmaty <1e-3 we 90% gomologiýa) ulanyp BLASTN bilen belliklendi we pes çylşyrymlylykly yzygiderlik maskasy DUST [26] ulanyp ýerine ýetirildi.Okalmalar iki topara bölündi: iki gaplamaly yzygiderlikler bilen baglanyşykly (bu ýerde öz-özüni okaýanlar diýilýär) we baglanyşykly däl (öz-özüni okaýan däl). Iki topar MEGAHIT ulanyp aýratynlykda ýygnaldy we kontigleri döretdi [27]. Şol bir wagtyň özünde, gelmişek mikrobiom okamalarynyň taksonomiki paýlanyşy Kraken2 [28] ulanyp klassifikasiýa edildi we grafiki taýdan Galaxy-da Krona diagrammasy bilen görkezildi [29, 30]. Ilkinji tejribelerimizden iň gowy kmerler kmerler-59 diýlip kesgitlenildi. Soňra öz-özüne baglylyklar soňky bellik üçin BLASTN (iki gaply NCBI maglumat bazasy, e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa) bilen deňleşdirilip kesgitlenildi. Soňra öz-özüne baglylyklar soňky bellik üçin BLASTN (iki gaply NCBI maglumat bazasy, e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa) bilen deňleşdirilip kesgitlenildi. ЗАТЕМ собственные бастиги были идентифицирован путем сопоставления с BLASTN (База чанных двустворч чех моллюсков NCBI, значение e <1e-10 ижидология 60%) для окончательной аннотации. Soňra öz-özüne baglylyklar soňky bellik üçin BLASTN (NCBI iki gaplakly maglumat bazasy, e gymmaty <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen deňeşdirmek arkaly kesgitlenildi.然后通过与 BLASTN （双壳贝类 NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与 BLASTN （双壳贝类 NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% Затем были идентифицированя собственные бартиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (Баса чәннех NCBI длу двустворч чех моллюсксков, значение e <1e-10 и чингология 60%). Soňra öz-özüne bagly maglumatlar BLASTN (NCBI iki gaplakly maglumat bazasy, e gymmaty <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen deňeşdirmek arkaly gutarnykly düşündiriş üçin kesgitlenildi. Şeýle hem, öz-özünden däl toparyň kontigleri BLASTN (nt NCBI maglumat bazasy, e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa) bilen bellik edildi. Şeýle hem, öz-özünden däl toparyň kontigleri BLASTN (nt NCBI maglumat bazasy, e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa) bilen bellik edildi. Параллельно чужеродные групповые бастиги были аннотированя с помощью BLASTN (База чныных nt NCBI, значение e <1e-10 идология 60%). Şeýle hem, daşary ýurtly toparyň kontigleri BLASTN (NT NCBI maglumat bazasy, e gymmaty <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen bellik edildi.平行地，用 BLASTN （nt NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用 BLASTN （nt NCBI 数据库， e 值 <1e-10 和 60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно кстиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотирован с помощю BLASTN (База чныных NCBI, значение e <1e-10 и Идология 60%). Şeýle hem, öz-özünden däl topar kontigleri BLASTN (nt NCBI maglumat bazasy, e gymmaty <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen bellik edildi. BLASTX şeýle hem nr we RefSeq protein NCBI maglumat bazalaryny ulanyp, öz-özünden däl kontiglerde geçirildi (e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa). BLASTX şeýle hem nr we RefSeq protein NCBI maglumat bazalaryny ulanyp, öz-özünden däl kontiglerde geçirildi (e gymmaty < 1e−10 we 60% gomologiýa). BLASTX также был проведен на амамамостоятельных абтитигах с использованием басных белка nr RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX şeýle hem nr we RefSeq NCBI belok maglumat bazalaryny ulanyp, öz-özünden däl kontiglerde geçirildi (e gymmaty < 1e-10 we 60% gomologiýa).还使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库对非自身重叠群进行了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源性）。还使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库对非自身重叠群进行了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源性）。 BLASTX также виполняли на амамостоятельных атитигах с использованием басных белка nr RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX şeýle hem nr we RefSeq NCBI belok maglumat bazalaryny ulanyp (e gymmaty <1e-10 we 60% gomologiýa) öz-özünden däl kontiglerde geçirildi.Öz-özüne bagly bolmadyk BLASTN we BLASTX howuzlary soňky baglanyşygy görkezýär (Goşmaça faýla serediň).
PCR üçin ulanylan praýmerler S1 tablisasynda görkezilen. ccfDNK nyşana genlerini güýçlendirmek üçin Taq DNK polimerazasy (Bio Basic Canada, Markham, ON) ulanyldy. Aşakdaky reaksiýa şertleri ulanyldy: 95°C-da 3 minut denaturasiýa, 1 minut 95°C, 1 minutlap ýumşatmak temperaturasyny sazlamak, 72°C-da 1 minutlap uzaltmak, 35 sikl we ahyrsoňy 10 minutda 72°C. . PCR önümleri 95 V-da SYBRTM Howpsuz DNK Gel Boýagyny (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) öz içine alýan agaroza gellerinde (1,5%) elektroforez arkaly bölündi.
Midiýalar (Mytilus spp.) 500 ml kislorodly deňiz suwunda (32 PSU) 4°C-da 24 sagatlap akklimatizasiýa edildi. Adam galektini-7 kDNK yzygiderliligini kodlaýan plazmid DNK-sy (NCBI giriş belgisi L07769) flakona 190 μg/μl jemleýji konsentrasiýada goşuldy. DNK goşulmazdan şol bir şertlerde inkubasiýa edilen midýalar gözegçilik boldy. Üçünji gözegçilik bakynda midýalar ýok DNK bardy. Deňiz suwundaky DNK-nyň hilini gözegçilik etmek üçin, görkezilen wagtda her bakdan deňiz suwunyň nusgalary (20 μl; üç gezek gaýtalanma) alyndy. Plazmid DNK-nyň yzarlanmagy üçin, görkezilen wagtlarda LB midýalary ýygnaldy we qPCR we ddPCR arkaly seljerildi. Deňiz suwunyň duz mukdarynyň ýokary bolmagy sebäpli, ähli PCR synaglaryndan öň alikwotlar PCR hilli suwda (1:10) suwlandyryldy.
Sanly damja PZR (ddPCR) BioRad QX200 protokoly (Mississauga, Ontario, Kanada) arkaly geçirildi. Optimal temperaturany kesgitlemek üçin temperatura profilini ulanyň (S1 tablisa). Damjalar QX200 damja generatory (BioRad) arkaly döredildi. ddPCR aşakdaky ýaly geçirildi: 95°C 5 minut, 95°C-iň 50 sikli 30 sekunt we berlen gyzdyrma temperaturasy 1 minut we 72°C 30 sekunt, 4°C 5 minut we 90°C 5 minutyň dowamynda. Damjalaryň sany we oňyn reaksiýalar (nusgalaryň sany/µl) QX200 damja okaýjy (BioRad) arkaly ölçeldi. 10,000-den az damjaly nusgalar ret edildi. Nyşan gözegçiligi her gezek ddPCR geçirilende ýerine ýetirilmedi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidneý, Awstraliýa) we LGALS7 üçin ýörite praýmerler ulanylyp geçirildi. Ähli mukdary PCR-ler QuantiFast SYBR Ýaşyl PCR Kit (QIAGEN) ulanylyp 20 µl-de geçirildi. qPCR 95°C-da 15 minutlyk inkubasiýa bilen, soňra 95°C-da 10 sekunt we 60°C-da 60 sekuntlap ​​40 sikl bilen bir maglumat ýygnamak bilen başlandy. Ereme egrileri qPCR-iň ahyrynda 95°C-da 5 sekunt, 65°C-da 60 sekunt we 97°C-da yzygiderli ölçegler ulanylyp döredildi. Her bir qPCR, gözegçilik nusgalaryndan başga, üç gezek geçirildi.
Midiýalar ýokary süzgüç tizligi bilen tanalýandygy sebäpli, ilki bilen deňiz suwunda bar bolan DNK böleklerini süzüp we saklap bilýändigini öwrendik. Şeýle hem, bu bölekleriň ýarym açyk limfa ulgamynda toplanyp-toplanmaýandygy bilen gyzyklandyk. Bu meseläni gök midiýa akwariumlaryna goşulan ereýän DNK bölekleriniň ykbalyny yzarlamak arkaly tejribe arkaly çözdik. DNK böleklerini yzarlamagy ýeňilleşdirmek üçin, adam galektini-7 genini öz içine alýan daşary ýurtly (öz-özünden däl) plazmid DNK-ny ulandyk. ddPCR deňiz suwundaky we midiýalardaky plazmid DNK böleklerini yzarlaýar. Netijelerimiz, deňiz suwundaky DNK bölekleriniň mukdarynyň midiýalar ýok wagty (7 güne çenli) deňeşdirme boýunça üýtgewsiz galandygyny, midiýalaryň ýanynda bolsa, bu derejäniň 8 sagadyň içinde diýen ýaly doly ýitip gidendigini görkezýär (1a, b surat). Ekzogen DNK bölekleri klapan içi suwuklykda we gemolimfada 15 minutda aňsatlyk bilen ýüze çykaryldy (1c surat). Bu bölekleri täsir edilenden soň 4 sagada çenli ýüze çykarmak mümkin. DNK böleklerine degişli bu süzgüç işjeňligi bakteriýalaryň we suw otlarynyň süzgüç işjeňligine deňeşdirip bolýar [31]. Bu netijeler midiýalaryň öz suwuklyk bölümlerinde daşary ýurt DNK-syny süzüp we toplap bilýändigini görkezýär.
Deňiz suwundaky plazmid DNK-nyň midiýalaryň barlygynda (A) ýa-da ýoklugynda (B) deňeşdirilen konsentrasiýalary, ddPCR arkaly ölçenýär. A-da netijeler göterim hökmünde görkezilýär, gutularyň çäkleri 75-nji we 25-nji persentilleri görkezýär. Logarifmik egri gyzyl reňkde görkezilýär, çal reňkde çekilen meýdan bolsa 95% ynam aralygyny görkezýär. B-de gyzyl çyzyk ortaça, gök çyzyk bolsa konsentrasiýanyň 95% ynam aralygyny görkezýär. C Plazmid DNK goşulandan soň dürli wagtlarda midiýalaryň gemolimfasynda we klapan suwuklygynda plazmid DNK-nyň toplanmagy. Netijeler anyklanan absolýut nusgalar/ml (±SE) hökmünde görkezilýär.
Soňra, biz antropogen täsiri çäkli bolan uzakdaky adalar topary bolan Kerguelen adalaryndaky midiýa düşeklerinden ýygnalan midiýalarda ccfDNK-nyň gelip çykyşyny öwrendik. Şu maksat bilen, midiýa gemolimfalaryndan cccDNK bölünip alyndy we adam cccDNK-ny arassalamak üçin giňden ulanylýan usullar bilen arassalanyldy [32, 33]. Biz midiýalardaky gemolimfa ccfDNK-nyň ortaça konsentrasiýasynyň ml gemolimfada pes mikrogram aralygyndadygyny anykladyk (Goşmaça Maglumata, S2 tablisasyna serediň). Bu konsentrasiýa diapazony sagdyn adamlardakydan has uly (millilitrde pes nanogramma), ýöne seýrek ýagdaýlarda, rak keselinden ejir çekýän hassalarda ccfDNK-nyň derejesi millilitrde birnäçe mikrograma ýetip biler [34, 35]. Gemolimfa ccfDNK-nyň ululyk paýlanyşynyň seljermesi bu bölekleriň ululygy boýunça örän tapawutlanýandygyny, 1000 bp-den 1000 bp-e çenli, 5000 bp-e çenli üýtgeýändigini görkezdi (2-nji surat). Şeýle netijeler kremniý esasly QIAamp derňewçi toplumy arkaly alyndy, bu usul kazyýet ylmynda ccfDNK-ny öz içine alýan pes konsentrasiýaly DNK nusgalaryndan genom DNK-ny çalt bölüp almak we arassalamak üçin giňden ulanylýar [36].
Midiýa gemolimfasynyň wekilçilikli ccfDNA elektroforegrammasy. NucleoSnap Plasma Kit (ýokarda) we QIAamp DNA derňewçisi Kit bilen çykaryldy. Midiýalarda gemolimfa ccfDNA konsentrasiýalarynyň (±SE) paýlanyşyny görkezýän B Skripka diagrammasy. Gara we gyzyl çyzyklar degişlilikde medianany we birinji we üçünji kwartilleri görkezýär.
Adamlarda we primatlarda ccfDNK-nyň takmynan 1% -i daşary ýurt çeşmesine eýedir [21, 37]. Iki gaplakly molyusklaryň ýarym açyk gan aýlanyş ulgamyny, mikroblara baý deňiz suwuny we midiýa ccfDNK-nyň ululyk paýlanyşyny göz öňünde tutup, biz midiýa gemolimfa ccfDNK-nyň baý we dürli mikrob DNK-syny öz içine alyp biljekdigini çakladyk. Bu gipotezany barlamak üçin, biz Kerguelen adalaryndan ýygnalan Aulacomya atra nusgalaryndan gemolimfa ccfDNK-ny yzygiderlikledik we 10 milliondan gowrak okama aldyk, olaryň 97,6% -i hil gözegçiliginden geçdi. Soňra okamalar BLASTN we NCBI iki gaplakly molyusklaryň maglumat bazalaryny ulanyp, özbaşdak we özbaşdak däl çeşmelere görä klassifikasiýa edildi (S1-nji surat, Goşmaça maglumat).
Adamlarda ýadro we mitohondrial DNK-nyň ikisi hem gana goýberilip bilner [38]. Şeýle-de bolsa, şu barlagda, A. atra genomynyň yzygiderliligi ýa-da beýany bolmandygy sebäpli, midiýalaryň ýadro genom DNK-syny jikme-jik beýan etmek mümkin bolmady. Şeýle-de bolsa, iki gaplakly kitaphanany ulanyp, özümiziň gelip çykyşymyzdan bolan birnäçe ccfDNA böleklerini anyklap bildik (S2-nji surat, Goşmaça maglumat). Şeýle hem, yzygiderliligi bolan şol A. atra genleriniň gönükdirilen PZR güýçlendirmesi arkaly özümiziň gelip çykyşymyzdan bolan DNK bölekleriniň bardygyny tassykladyk (3-nji surat). Şonuň ýaly-da, A. atra mitohondrial genomynyň umumy maglumat bazalarynda elýeterlidigini göz öňünde tutup, A. atra gemolimfasynda mitohondrial ccfDNA bölekleriniň bardygynyň subutnamalaryny tapyp bolýar. Mitohondrial DNK bölekleriniň bardygy PZR güýçlendirmesi bilen tassyklanyldy (3-nji surat).
A. atra (gyzyl nokatlar - stok belgisi: SRX5705969) we M. platensis (gök nokatlar - stok belgisi: SRX5705968) gemolimfasynda PCR arkaly güýçlendirilen dürli mitohondrial genler bardy. Surat Breton we beýlekilerden, 2011-nji ýyldan alyndy. B A. atra-dan gemolimfanyň üstki böleginiň güýçlendirilmegi FTA kagyzynda saklanýar. PCR garyndysyny öz içine alýan PCR turbasyna gönüden-göni goşmak üçin 3 mm deşiji ulanyň.
Deňiz suwundaky köp sanly mikrobial maddalary göz öňünde tutup, biz ilki gemolimfadaky mikrobial DNK yzygiderlikleriniň häsiýetnamasyna üns berdik. Munuň üçin iki dürli strategiýany ulanýarys. Birinji strategiýada BLAST we beýleki gurallar bilen deňeşdirip boljak takyklykda mikrobial yzygiderlikleri kesgitläp bilýän algoritm esasynda yzygiderlik klassifikasiýa programmasy bolan Kraken2 ulanyldy [28]. 6719-dan gowrak okalma bakteriýalardan gelip çykandygy anyklandy, degişlilikde 124 we 64-si arheýalardan we wiruslardan alyndy (4-nji surat). Iň köp bakteriýa DNK bölekleri Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) we Bacteroidetes (17%) boldy (4a-njy surat). Bu paýlanyş deňiz gök midiýa mikrobiomynyň öňki barlaglary bilen gabat gelýär [39, 40]. Gammaproteobacteria köp Vibrionales bilen birlikde Proteobacteria-nyň esasy klasydy (44%) (4b-nji surat). ddPCR usuly A. atra gemolimfasynyň ccfDNK-synda Vibrio DNK bölekleriniň bardygyny tassyklady (4c-nji surat) [41]. ccfDNK-nyň bakteriýa gelip çykyşy barada has giňişleýin maglumat almak üçin goşmaça çemeleşme ulanyldy (S2-nji surat, Goşmaça maglumat). Bu ýagdaýda, üst-üste düşen okamalar jübüt uçly okamalar hökmünde ýygnaldy we BLASTN we 1e−3 e gymmaty hem-de >90% gomologiýaly kesişme ulanylyp, öz-özünden (iki gaplakly) ýa-da öz-özünden gelip çykan hökmünde klassifikasiýa edildi. Bu ýagdaýda, üst-üste düşen okamalar jübüt uçly okamalar hökmünde ýygnaldy we BLASTN we 1e−3 e gymmaty hem-de >90% gomologiýaly kesişme ulanylyp, öz-özünden (iki gaplakly) ýa-da öz-özünden gelip çykan hökmünde klassifikasiýa edildi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собрания как чения с парными концами и были конссифицированя как собственные (двустворчяе моллюски) или чужие по происхождению с сспользове с консульологией> 90%. Bu ýagdaýda, üst-üste düşýän okamalar jübütlenen okamalar hökmünde ýygnaldy we BLASTN we 1e-3 e gymmaty hem-de >90% gomologiýa bilen kesişme ulanylyp, asyl (iki gapakly) ýa-da asyl däl hökmünde klassifikasiýa edildi.AST BLASTN 和 1e-3 的 e 值和> 90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。使用 这 种 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраня как чентия с парными концами һәм мсисифицированя как собственные (двустворч чате моллюски) или чиобобственнее по происхождению с испольчовы консульологии> 90%. Bu ýagdaýda, üst-üste düşýän okamalar jübütlenen okamalar hökmünde ýygnaldy we e BLASTN we 1e-3 gymmatlyklaryny hem-de gomologiýa bosagasyny >90% ulanyp, öz (iki gapgakly) ýa-da asyl däl hökmünde klassifikasiýa edildi.A. atra genomy heniz yzygiderlikleşdirilmändigi sebäpli, biz MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler-iň de novo assembler strategiýasyny ulandyk. Jemi 147,188 kontig gelip çykyşyna bagly (iki gaplakly) hökmünde kesgitlenildi. Soňra bu kontigler BLASTN we BLASTX ulanylyp 1e-10 e-bahalary bilen bölündi. Bu strategiýa bize A. atra ccfDNK-da bar bolan 482 iki gaplakly däl bölegi kesgitlemäge mümkinçilik berdi. Bu DNK bölekleriniň ýarysyndan gowragy (57%) bakteriýalardan, esasan sulfotrofik simbiontlary öz içine alýan gill simbiontlaryndan we gill simbiontlary Solemya velum-dan alyndy (5-nji surat).
Tip derejesindäki deňeşdirme bolçulygy. B Iki esasy fila (Firmicutes we Proteobacteria)-nyň mikrob dürlüligi. ddPCR-iň wekilçilikli güýçlenmegi C Vibrio spp. A. Üç atra gemolimfasynda 16S rRNA geniniň bölekleri (gök).
Jemi 482 sany ýygnalan kontig seljerildi. Metagenomik kontig annotasiýalarynyň (prokariotlar we eukariotlar) taksonomik paýlanyşynyň umumy profili. B BLASTN we BLASTX arkaly kesgitlenen bakteriýa DNK bölekleriniň jikme-jik paýlanyşy.
Kraken2 analizi şeýle hem midiýa ccfDNK-synda Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) we Thaurmarcheota (11%) DNK bölekleri ýaly arheal DNK bölekleriniň bardygyny görkezdi (6a-njy surat). Kaliforniýa midiýalarynyň mikrob jemgyýetinde öň tapylan Euryarchaeota we Crenarchaeota-dan alynýan DNK bölekleriniň bolmagy geň galdyrmaly däl [42]. Euryarchaeota köplenç ekstremal şertler bilen baglanyşykly bolsa-da, häzirki wagtda Euryarchaeota we Crenarcheota-nyň deňiz kriogen gurşawynda iň köp duş gelýän prokariotlaryň arasyndadygy ykrar edilýär [43, 44]. Kerguelen platosyndaky düýp syzmalaryndan köp mukdarda metan syzmalary [45] we Kerguelen adalarynyň kenarynda mikrob metan önümçiliginiň bolmagy barada soňky habarlar göz öňünde tutulanda [46], midiýalarda metanogen mikroorganizmleriň bolmagy geň galdyryjy däl.
Soňra ünsümiz DNK wiruslaryndan alnan okamalara gönükdirildi. Bilşimiz ýaly, bu midiýalaryň wirus mazmunynyň ilkinji maksatdan daşary barlagydyr. Garaşylyşy ýaly, biz bakteriofaglaryň (Caudovirales) DNK böleklerini tapdyk (6b-njy surat). Şeýle-de bolsa, iň köp duş gelýän wirus DNK-sy nukleotsitowiruslaryň bir filumyndan, ýagny ýadro sitoplazmatiki uly DNK wirusy (NCLDV) diýlip hem atlandyrylýan filumdan gelip çykýar, ol islendik wirusyň iň uly genomyna eýedir. Bu filumyň içinde DNK yzygiderlikleriniň köpüsi Mimimidoviridae (58%) we Poxviridae (21%) maşgalalaryna degişlidir, olaryň tebigy eýeleri oňurgaly we artropodly haýwanlary öz içine alýar, şol bir wagtyň özünde bu DNK yzygiderlikleriniň az bölegi belli wirusologik suw otlaryna degişlidir. Deňiz eukariot suw otlaryna ýokuşýar. Yzygiderlikler şeýle hem belli wirus uruglarynyň iň uly genom ölçegine eýe bolan ägirt uly wirus bolan Pandora wirusyndan alyndy. Gyzykly tarapy, gemolimfa ccfDNA yzygiderligi arkaly kesgitlenen wirus bilen ýokuşan diýlip bilinýän eýeleriň diapazony deňeşdirme boýunça ulydy (S3-nji surat, Goşmaça maglumat). Ol Baculoviridae we Iridoviridae ýaly mör-möjeklere ýokuşýan wiruslary, şeýle hem amýoblara, suw otlaryna we oňurgaly haýwanlara ýokuşýan wiruslary öz içine alýar. Şeýle hem, Pithovirus sibericum genomyna gabat gelýän yzygiderlikleri tapdyk. Pitowiruslar ("zombi wiruslary" diýlip hem atlandyrylýar) ilkinji gezek Sibirdäki 30,000 ýyllyk hemişelik doňaklykdan bölünip alyndy [47]. Şeýlelik bilen, biziň netijelerimiz bu wiruslaryň häzirki zaman görnüşleriniň hemmesiniň ýok bolmandygyny [48] we bu wiruslaryň uzak subarktika deňiz ekosistemalarynda bolmagynyň mümkindigini görkezýän öňki hasabatlar bilen gabat gelýär.
Ahyrsoňy, biz beýleki köp öýjükli haýwanlardan DNK böleklerini tapyp biljekdigimizi barlamak üçin synag geçirdik. BLASTN we BLASTX arkaly nt, nr we RefSeq kitaphanalary (genom we belok) bilen jemi 482 daşary ýurt kontigi anyklandy. Netijelerimiz köp öýjükli haýwanlaryň ccfDNK-synyň daşary ýurt bölekleriniň arasynda süňk süňkleriniň DNK-synyň agdyklyk edýändigini görkezýär (5-nji surat). Mör-möjeklerden we beýleki görnüşlerden DNK bölekleri hem tapyldy. DNK bölekleriniň deňeşdirme boýunça uly bölegi anyklanmady, belki-de, gury ýer görnüşlerine garanyňda genom maglumat bazalarynda deňiz görnüşleriniň köp sanlysynyň az görkezilmegi sebäpli [49].
Şu makalada biz LB konsepsiýasyny midiýalara ulanýarys we gemolimfanyň ccfDNA-synyň yzygiderliliginiň deňiz kenarýaka ekosistemalarynyň düzümi barada düşünje berip biljekdigini öňe sürýäris. Hususan-da, biz 1) midiýa gemolimfasynyň uly (~1-5 kb) aýlanýan DNK bölekleriniň deňeşdirme boýunça ýokary konsentrasiýalaryny (mikrogram derejelerini) öz içine alýandygyny; 2) bu DNK bölekleriniň garaşsyz we garaşsyz däldigini anykladyk. 3) Bu DNK bölekleriniň daşary ýurt çeşmeleriniň arasynda bakteriýalaryň, arheal we wirus DNK-syny, şeýle hem beýleki köp öýjükli haýwanlaryň DNK-syny tapdyk; 4) Bu daşary ýurt ccfDNA bölekleriniň gemolimfada toplanmagy çalt bolup geçýär we midiýalaryň içki süzgüç işjeňligine goşant goşýar. Netijede, biziň gözlegimiz şu wagta çenli esasan biolukmançylyk ulgamynda ulanylan LB konsepsiýasynyň gözegçilikçi görnüşleri bilen olaryň daşky gurşawynyň arasyndaky özara täsiri has gowy düşünmek üçin ulanylyp bilinjek baý, ýöne öwrenilmedik bilim çeşmesini kodlaşdyrýandygyny görkezýär.
Primatlardan başga-da, syçanlarda, itlerde, pişiklerde we atlarda ccfDNK-nyň izolýasiýa edilmegi barada habar berildi [50, 51, 52]. Şeýle-de bolsa, biziň bilşimiz ýaly, biziň gözlegimiz açyk aýlanyşyk ulgamy bolan deňiz görnüşlerinde ccfDNK-nyň anyklanmagy we yzygiderliligi barada habar berýän ilkinji gözlegdir. Midýalaryň bu anatomiki aýratynlygy we süzgüç ukyby, iň bolmanda bölekleýin, aýlanýan DNK bölekleriniň beýleki görnüşlere garanyňda dürli ululykdaky aýratynlyklaryny düşündirip biler. Adamlarda gan aýlanýan DNK bölekleriniň köpüsi 150-den 200 bp-e çenli ululykda bolan kiçi böleklerdir, iň ýokary depesi 167 bp [34, 53]. DNK bölekleriniň kiçi, ýöne möhüm bölegi 300 bilen 500 bp aralygynda we takmynan 5% -i 900 bp-den uzyn. [54]. Bu ölçeg paýlanyşynyň sebäbi, plazmadaky ccfDNK-nyň esasy çeşmesiniň öýjük ölümi netijesinde ýüze çykmagydyr, ýagny sagdyn adamlarda öýjük ölümi ýa-da aýlanýan gematopoetik öýjükleriň nekrozynyň netijesinde ýa-da rak keselinden ejir çekýän hassalarda (aýlanýan şiş DNK diýlip atlandyrylýar) şiş öýjükleriniň apoptozy sebäpli. , ctDNK). Midýalarda tapan gemolimfa ccfDNK-nyň ölçeg paýlanyşy 1000-den 5000 bp-e çenli boldy, bu bolsa midýa ccfDNK-nyň başga bir gelip çykyşynyň bardygyny görkezýär. Bu logiki gipoteza, sebäbi midýalar ýarym açyk damar ulgamyna eýedir we mikrob genom DNK-synyň ýokary konsentrasiýalaryny öz içine alýan deňiz suw gurşawynda ýaşaýarlar. Aslynda, ekzogen DNK ulanyp geçiren laboratoriýa tejribelerimiz midýalaryň deňiz suwunda DNK böleklerini toplaýandygyny, azyndan birnäçe sagatdan soň öýjük tarapyndan kabul edilenden soň dargaýandygyny we/ýa-da boşadylýandygyny we/ýa-da dürli guramalarda saklanýandygyny görkezdi. Öýjükleriň (prokariot we eukariot) seýrek bolmagyny göz öňünde tutup, klapan içi bölümleriň ulanylmagy öz çeşmelerinden, şeýle hem daşary ýurtlardan gelýän ccfDNK-nyň mukdaryny azaldar. Iki gaplakly dogabitdi immunitetiň we aýlanýan fagositleriň köp sanlysynyň ähmiýetini göz öňünde tutup, biz hatda daşary ýurt ccfDNK-nyň hem mikroorganizmleri we/ýa-da öýjük galyndylaryny ýuwutanda daşary ýurt DNK-syny toplaýan aýlanýan fagositler bilen baýlaşýandygyny has-da öňe sürdik. Netijelerimiz bilelikde iki gaplakly gemolimfa ccfDNK-nyň molekulýar maglumatyň özboluşly ammarydygyny we olaryň gözegçilik görnüşi hökmünde statusyny berkidýändigini görkezýär.
Biziň maglumatlarymyz bakteriýalardan alynýan gemolimfa ccfDNA bölekleriniň yzygiderliliginiň we seljermesiniň eýe bakteriýa florasy we töweregindäki deňiz ekosistemasynda bar bolan bakteriýalar barada esasy maglumatlary berip biljekdigini görkezýär. Atyş yzygiderliliginiň usullary, eger däp bolan 16S rRNA identifikasiýa usullary ulanylan bolsa, belli bolmadyk komensal bakteriýa A. atra gill-iň yzygiderliliklerini ýüze çykardy, bu bolsa, bölekleýin salgylanma kitaphanasynyň tarapgöýlügi sebäplidir. Aslynda, Kerguelendäki şol bir midiýa gatlagynda M. platensis-den ýygnalan LB maglumatlaryny ulanmagymyz, gill bilen baglanyşykly bakteriýa simbiontlarynyň düzüminiň iki midiýa görnüşi üçin hem birmeňzeşdigini görkezdi (S4 surat, Goşmaça maglumat). Iki genetiki taýdan tapawutly midiýanyň bu meňzeşligi Kergueleniň sowuk, kükürtli we wulkan çökündilerinde bakteriýa jemgyýetleriniň düzümini görkezip biler [55, 56, 57, 58]. Port-o-Frans kenary ýaly bioturbatlaşdyrylan kenarýaka ýerlerinden [59] midiýalary ýygnalanda, kükürdi azaldýan mikroorganizmleriň ýokary derejesi gowy beýan edildi. Başga bir mümkinçilik, komensal midiýa florasynyň gorizontal geçişden täsirlenmegi mümkin [60, 61]. Deňiz gurşawynyň, deňiz düýbüniň ýüzüniň we midiýalardaky simbiotik bakteriýalaryň düzüminiň arasyndaky baglanyşygy kesgitlemek üçin has köp ylmy barlaglar gerek. Bu barlaglar häzirki wagtda dowam edýär.
Gemolimfa ccfDNK-nyň uzynlygy we konsentrasiýasy, arassalamak aňsatlygy we çalt tüpeň yzygiderliligini üpjün etmek üçin ýokary hilliligi deňiz kenarýaka ekosistemalarynda biodürlüligi bahalandyrmak üçin midiýa ccfDNK-ny ulanmagyň köp sanly artykmaçlyklarynyň käbiridir. Bu çemeleşme, aýratyn hem, belli bir ekosistemada wirus jemgyýetlerini (wiromlary) häsiýetlendirmek üçin netijelidir [62, 63]. Bakteriýalardan, arheýalardan we eukariotlardan tapawutlylykda, wirus genomlarynda 16S yzygiderliligi ýaly filogenetik taýdan goralan genler ýok. Netijelerimiz, midiýalar ýaly görkeziji görnüşlerden alnan suwuk biopsiýalaryň, adatça kenarýaka deňiz ekosistemalarynda ýaşaýan eýeleri ýokuşdyrýandygy mälim bolan ccfDNK wirus bölekleriniň deňeşdirme boýunça köp sanlysyny kesgitlemek üçin ulanylyp bilinjekdigini görkezýär. Bu protozoalara, artropodlara, mör-möjeklere, ösümliklere we bakteriýa wiruslaryna (meselem, bakteriofaglara) ýokuşdyrýandygy mälim bolan wiruslary öz içine alýar. Kerguelende şol bir midiýa gatlagynda ýygnalan gök midiýalaryň (M. platensis) gemolimfa ccfDNK wiromyny barlanymyzda meňzeş paýlanyş tapyldy (S2 tablisa, Goşmaça maglumat). ccfDNK-nyň tüpeň bilen yzygiderliligi, hakykatdanam, adamlaryň ýa-da beýleki görnüşleriň wiromyny öwrenmekde täze bir depgin gazanýan çemeleşmedir [21, 37, 64]. Bu çemeleşme, aýratyn hem, iki zynjyrly DNK wiruslaryny öwrenmek üçin peýdalydyr, sebäbi Baltimordaky iň dürli we giň wirus synpyny görkezýän ähli iki zynjyrly DNK wiruslarynyň arasynda ýekeje gen hem saklanyp galmaýar [65]. Bu wiruslaryň köpüsi klassifikasiýa edilmän galsa-da we wirus dünýäsiniň düýbünden näbelli böleginden wiruslary öz içine alyp bilse-de [66], biz A. atra we M. platensis midiýalarynyň wiromlarynyň we eýeleriniň iki görnüşiň arasynda ýerleşýändigini anykladyk. meňzeş (S3 suratyna, goşmaça maglumata serediň). Bu meňzeşlik geň däl, sebäbi ol daşky gurşawda bar bolan DNK-nyň özleşdirilmeginde selektiwligiň ýoklugyny görkezip biler. Häzirki wagtda RNK wiromyny häsiýetlendirmek üçin arassalanan RNK ulanyp geljekki barlaglar zerurdyr.
Biz öz gözlegimizde Kowarski we kärdeşleriniň işinden uýgunlaşdyrylan örän berk turbageçirijini ulandyk [37], olar ýerli ccfDNK-ny ýygnamazdan öň we soň birleşdirilen okamalaryň we kontigleriň iki ädimli pozulmagyny ulandylar, bu bolsa kartalaşdyrylmadyk okamalaryň ýokary paýyna getirdi. Şonuň üçin, bu kartalaşdyrylmadyk okamalaryň käbiriniň öz gelip çykyşynyň bolmagynyň mümkindigini ret edip bilmeris, esasan hem bu midiýa görnüşi üçin salgylanma genomymyz ýok. Şeýle hem, biz bu turbageçirijini ulandyk, sebäbi biz öz-özüni we öz-özüni okamalaryň arasyndaky himeralar we Illumina MiSeq PE75 tarapyndan döredilen okama uzynlygy barada alada edýärdik. Kartalaşdyrylmadyk okamalaryň köpüsiniň başga bir sebäbi, deňiz mikroblarynyň köpüsiniň, esasanam Kerguelen ýaly uzak ýerlerde, belliklenmänligidir. Biz ccfDNK böleginiň uzynlygynyň adam ccfDNK-syna meňzeşdigini çaklap, Illumina MiSeq PE75 ulandyk. Geljekki barlaglar üçin, gemolimf ccfDNK-nyň adamlara we/ýa-da süýt emdirijilere garanda has uzyn okalyşlara eýedigini görkezýän netijelerimizi göz öňünde tutup, has uzyn ccfDNK bölekleri üçin has amatly yzygiderlilik platformasyny ulanmagy maslahat berýäris. Bu tejribe has çuňňur seljerme üçin has köp alamatlary anyklamagy has ýeňilleşdirer. Häzirki wagtda elýeterli bolmadyk doly A. atra ýadro genomynyň yzygiderliligini almak ccfDNK-nyň öz we öz çeşmelerden tapawutlandyrylmagyny hem ep-esli ýeňilleşdirer. Barlaglarymyzyň suwuk biopsiýa konsepsiýasyny midiýalara ulanmak mümkinçiligine gönükdirilendigini göz öňünde tutup, bu konsepsiýa geljekki barlaglarda ulanylanda, midiýalaryň mikrobial dürlüligini öwrenmek üçin bu usulyň mümkinçiliklerini ýokarlandyrmak üçin täze gurallaryň we turbageçirijileriň işlenip düzüljekdigine umyt edýäris. deňiz ekosistemasy.
Inwaziw däl kliniki biomarker hökmünde, adam plazmasyndaky ccfDNK-nyň ýokary derejesi dürli keseller, dokumalaryň zeperlenmegi we stress şertleri bilen baglanyşyklydyr [67,68,69]. Bu artma dokumalaryň zeperlenmeginden soň öz gelip çykyşly DNK bölekleriniň çykmagy bilen baglanyşyklydyr. Biz bu meseläni ýiti ýylylyk stresini ulanyp çözdik, bu ýerde midiýalar gysga wagtlyk 30 °C temperatura sezewar edildi. Biz bu analizi üç sany garaşsyz synagda üç dürli midiýa görnüşinde geçirdik. Şeýle-de bolsa, ýiti ýylylyk stresinden soň ccfDNK derejesinde hiç hili üýtgeşiklik tapmadyk (S5-nji surata, goşmaça maglumata serediň). Bu açyş, azyndan bölekleýin, midiýalaryň ýarym açyk gan aýlanyş ulgamyna eýedigini we ýokary süzgüç işjeňligi sebäpli köp mukdarda daşary ýurt DNK-syny toplaýandygyny düşündirip biler. Beýleki tarapdan, midiýalar, köp oňurgasyz haýwanlar ýaly, stress sebäpli dokumalaryň zeperlenmegine has çydamly bolup biler, şonuň üçin olaryň gemolimfasynda ccfDNK-nyň çykmagyny çäklendirýär [70, 71].
Şu güne çenli suw ekosistemalarynda biodürlüligiň DNK analizi, esasan, daşky gurşawyň DNK-synyň (eDNK) metabarkodyna gönükdirildi. Şeýle-de bolsa, bu usul, adatça, praýmerler ulanylanda biodürlüligiň analizinde çäkli bolýar. Tüpeňli yzygiderliligiň ulanylmagy PCR-iň çäklendirmelerini we praýmer toplumlarynyň birtaraply saýlanmagyny aýlanyp geçýär. Şeýlelik bilen, belli bir manyda, biziň usulymyz ýakynda ulanylan ýokary öndürijilikli eDNK-ly Tüpeňli yzygiderliligiň usulyna has ýakyn, ol böleklenen DNK-ny gönüden-göni yzygiderlilige geçirip we diýen ýaly ähli organizmleri analizläp bilýär [72, 73]. Şeýle-de bolsa, LB-ni standart eDNK usullaryndan tapawutlandyrýan birnäçe esasy meseleler bar. Elbetde, eDNK bilen LB-niň arasyndaky esasy tapawut tebigy süzgüç eýeleriniň ulanylmagydyr. eDNK-ny öwrenmek üçin tebigy süzgüç hökmünde gubkalar we iki gapakly molyusklar (Dresseina spp.) ýaly deňiz görnüşleriniň ulanylmagy barada habar berildi [74, 75]. Şeýle-de bolsa, Dreissenanyň gözleginde DNK alynýan dokumalaryň biopsiýalary ulanyldy. LB-den ccfDNK-ny analizlemek üçin dokuma biopsiýasy, ýöriteleşdirilen we käte gymmat enjamlar we eDNK ýa-da dokuma biopsiýasy bilen baglanyşykly logistika gerek däl. Aslynda, ýakynda biz LB-den ccfDNK-ny sowuk zynjyry saklamazdan FTA goldawy bilen saklap we analiz edip boljakdygyny habar berdik, bu bolsa uzak ýerlerde ylmy barlaglar üçin uly kynçylyk döredýär [76]. Suwuk biopsiýalardan ccfDNK-ny çykarmak hem ýönekeý we tüpeň yzygiderliligini kesgitlemek we PCR analizi üçin ýokary hilli DNK üpjün edýär. Bu eDNK analizi bilen baglanyşykly käbir tehniki çäklendirmeleri göz öňünde tutup, uly artykmaçlykdyr [77]. Nusga almak usulynyň ýönekeýligi we arzanlygy uzak möhletli gözegçilik maksatnamalary üçin hem has amatlydyr. Ýokary süzgüç ukybyndan başga-da, iki gaplakly mopluklaryň başga bir meşhur aýratynlygy, olaryň mukusynyň himiki mukopolisaharid düzümi bolup, wiruslaryň siňmegine ýardam edýär [78, 79]. Bu iki gaplakly mopluklary belli bir suw ekosistemasynda biodürlüligi we howanyň üýtgemeginiň täsirini häsiýetlendirmek üçin ideal tebigy süzgüje öwürýär. Hojaýyndan alynýan DNK bölekleriniň bolmagy eDNK bilen deňeşdirilende usulyň çäklendirilmegi hökmünde görülip bilinse-de, şeýle ýerli ccfDNK-nyň eDNK bilen deňeşdirilende bolmagy bilen baglanyşykly çykdajylar saglyk barlaglary üçin elýeterli maglumatlaryň köp mukdary üçin düşnükli. ofset hojaýyny. Bu hojaýynyň genomyna integrasiýa edilen wirus yzygiderlikleriniň bolmagyny öz içine alýar. Bu, iki gaplamaly mopluklarda gorizontal geçirilýän leýkemik retrowiruslaryň bardygyny göz öňünde tutup, midiýalar üçin has möhümdir [80, 81]. LB-niň eDNK-dan başga bir artykmaçlygy, onuň mikroorganizmleri (we olaryň genomlaryny) öz içine alýan gemolimfadaky aýlanýan gan öýjükleriniň fagositik işjeňligini ulanmagydyr. Fagositoz iki gaplamaly mopluklardaky gan öýjükleriniň esasy funksiýasydyr [82]. Ahyrsoňy, usul midiýalaryň ýokary süzgüç ukybyndan (ortaça 1,5 l/sagat deňiz suwy) we iki günlük aýlanyşdan peýdalanýar, bu bolsa deňiz suwunyň dürli gatlaklarynyň garyşmagyny artdyrýar we geterologik eDNK-ny tutmaga mümkinçilik berýär. [83, 84]. Şeýlelik bilen, midiýa ccfDNK analizi midiýalaryň iýmit, ykdysady we daşky gurşawa täsirini göz öňünde tutup, gyzykly bir ugur bolup durýar. Adamlardan ýygnalan LB analizine meňzeş, bu usul şeýle hem ekzogen maddalara jogap hökmünde eýe DNK-syndaky genetiki we epigenetiki üýtgeşmeleri ölçemek mümkinçiligini açýar. Mysal üçin, nanopora yzygiderligini ulanyp, ýerli ccfDNK-da genom boýunça metilleşme analizini geçirmek üçin üçünji nesil yzygiderligini tehnologiýalary göz öňünde tutup bolýar. Bu proses midiýa ccfDNK bölekleriniň uzynlygynyň himiki özgerişlere mätäçlik bolmazdan bir yzygiderliginiden genom boýunça DNK metilleşme analizini geçirmäge mümkinçilik berýän uzak okalýan yzygiderliginininininininininininininininininininininininininiini ...niininiininiine, ol howa üýtgemelerine ýa-da hapalanýan maddalara täsir edenden soň reaksiýany düzgünleşdirýän esas mehanizmler barada gymmatly düşünje berip biler [87]. Şeýle-de bolsa, LB-niň ulanylmagy çäklendirmesiz däl. Elbetde, bu ekosistemada görkeziji görnüşleriň bolmagyny talap edýär. Ýokarda agzalyp geçilişi ýaly, belli bir ekosistemanyň biodürlüligini bahalandyrmak üçin LB ulanmak, çeşmeden DNK bölekleriniň bardygyny hasaba alýan berk bioinformatika geçirijisini hem talap edýär. Başga bir esasy mesele deňiz görnüşleri üçin salgylanma genomlarynyň elýeterliligidir. Deňiz süýt emdirijileriniň genom taslamasy we ýakynda döredilen Fish10k taslamasy [88] ýaly başlangyçlaryň geljekde şeýle seljermäni ýeňilleşdirjekdigine umyt edilýär. LB konsepsiýasynyň deňiz süzgüçinden iýmitlenýän organizmlere ulanylmagy yzygiderlilik tehnologiýasyndaky iň soňky ösüşler bilen hem gabat gelýär, bu bolsa daşky gurşawyň stresine jogap hökmünde deňiz ýaşaýyş ýerleriniň saglygy barada möhüm maglumat bermek üçin köp ohmly biomarkerleriň işlenip düzülmegi üçin amatlydyr.
Genom yzygiderliliginiň maglumatlary NCBI yzygiderlik okamak arhiwine https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 salgysynda Bioprojects SRR8924808 bölüminde ýerleşdirildi.
Brierley AS, Kingsford MJ Howanyň üýtgemeginiň deňiz jandarlaryna we ekosistemalaryna täsiri. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S we beýlekiler. Howanyň üýtgemeginiň we beýleki ýerli stres faktorlarynyň deňiz gurşawyna bilelikdäki täsirlerini göz öňünde tutuň. umumy ylmy gurşaw. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P we ş.m. ). Mart aýynyň birinji güni. 2020; 7: 48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Gaýtalanýan ýylylyk stres şertlerinde ýylylyga çydamlylygyň peselmegi gök midiýalaryň tomusky ölüm derejesiniň ýokary bolmagyny düşündirýär. Ylmy hasabat 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Servantes-Ýoşida K, Hwan JL, Huber ER we başg. Haýwanlaryň ölüminiň ýygylygynda, sebäplerinde we derejesinde soňky üýtgeşmeler. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Skarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S we ş.m. Birnäçe görnüşe mahsus däl patogenler Pinna nobilisiň köpçülikleýin ölümine sebäp bolup biler. Durmuş. 2020; 10: 238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Howanyň üýtgemeginiň Arktikanyň zoonotik kesellerine mümkin täsiri. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. we başg. Gök midiýalar (Mytilus edulis spp.) kenarýaka hapalanmasynyň gözegçiliginde signal organizmleri hökmünde: syn. Mart Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Rak keselini bejermekde suwuk biopsiýanyň integrasiýasy. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C we başg. Suwuk biopsiýanyň ýetişmegi: şişiň DNK-synyň aýlanmagyna mümkinçilik berýär. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Adam plazmasyndaky nuklein kislotalary. Soc Biol bölümleriniň duşuşygynyň teswirnamasy. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Rak keselini bejermek üçin molekulýar marker hökmünde öýjüksiz DNK-nyň täze roly. Biomolýar analiziň mukdaryny kesgitlemek. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Suwuk biopsiýa klinika girýär - ornaşdyryş meseleleri we geljekki kynçylyklar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW we başgalar. Dölüň DNK-sy enäniň plazmasynda we syworotkasynda bar. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Göwrelilik döwründe aýallaryň ganynda aýlanýan hüjrearadan daşary RNK-ny ulanyp, göwreliligiň gidişini we onuň kynçylyklaryny öwrenmek. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J we başg. Suwuk biopsiýa: böwrek transplantatynda allogeniki zeperlenmeleri ýüze çykarmak üçin donor öýjüksiz DNK ulanylýar. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Prenatal diagnostikada innowasiýalar: enäniň plazma genomynyň yzygiderligi. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D we başg. Ýokançly beden suwuklyklarynyň indiki nesil metagenomik yzygiderligi bilen patogenleri çalt anyklamak. Nat Medicine. 2021;27:115-24.