Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Biopsia lichidă (LB) este un concept care câștigă rapid popularitate în domeniul biomedical. Conceptul se bazează în principal pe detectarea fragmentelor de ADN extracelular circulant (ADNcc), care sunt eliberate în principal sub formă de fragmente mici după moartea celulară în diverse țesuturi. O mică parte din aceste fragmente provin din țesuturi sau organisme străine. În lucrarea actuală, am aplicat acest concept la midii, o specie santinelă cunoscută pentru capacitatea sa ridicată de filtrare a apei de mare. Folosim capacitatea midiilor de a acționa ca filtre naturale pentru a capta fragmente de ADN din mediu dintr-o varietate de surse pentru a oferi informații despre biodiversitatea ecosistemelor marine costiere. Rezultatele noastre arată că hemolimfa midiilor conține fragmente de ADN care variază foarte mult ca dimensiune, de la 1 la 5 kb. Secvențierea prin metoda shotgun a arătat că un număr mare de fragmente de ADN sunt de origine microbiană străină. Printre acestea, am găsit fragmente de ADN de la bacterii, archaea și virusuri, inclusiv virusuri despre care se știe că infectează o varietate de gazde întâlnite în mod obișnuit în ecosistemele marine costiere. În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul de LB aplicat midiilor reprezintă o sursă bogată, dar încă neexplorată, de cunoștințe despre diversitatea microbiană din ecosistemele marine costiere.
Impactul schimbărilor climatice (CC) asupra biodiversității ecosistemelor marine este un domeniu de cercetare aflat în plină expansiune. Încălzirea globală nu numai că provoacă stresuri fiziologice importante, dar împinge și limitele evolutive ale stabilității termice a organismelor marine, afectând habitatul unui număr de specii, determinându-le să caute condiții mai favorabile [1, 2]. Pe lângă faptul că afectează biodiversitatea metazoarelor, CC perturbă echilibrul delicat al interacțiunilor gazdă-microbiene. Această disbacterioză microbiană reprezintă o amenințare serioasă pentru ecosistemele marine, deoarece face organismele marine mai susceptibile la agenți patogeni infecțioși [3, 4]. Se crede că SS joacă un rol important în decesele în masă, ceea ce reprezintă o problemă serioasă pentru gestionarea ecosistemelor marine globale [5, 6]. Aceasta este o problemă importantă, având în vedere impactul economic, ecologic și nutrițional al multor specii marine. Acest lucru este valabil mai ales pentru bivalvele care trăiesc în regiunile polare, unde efectele CK sunt mai imediate și mai severe [6, 7]. De fapt, bivalve precum Mytilus spp. sunt utilizate pe scară largă pentru a monitoriza efectele CC asupra ecosistemelor marine. Nu este surprinzător faptul că un număr relativ mare de biomarkeri au fost dezvoltați pentru a monitoriza starea lor de sănătate, adesea folosind o abordare pe două niveluri care implică biomarkeri funcționali bazați pe activitatea enzimatică sau funcții celulare, cum ar fi viabilitatea celulară și activitatea fagocitară [8]. Aceste metode includ, de asemenea, măsurarea concentrației indicatorilor de presiune specifici care se acumulează în țesuturile moi după absorbția unor cantități mari de apă de mare. Cu toate acestea, capacitatea mare de filtrare și sistemul circulator semi-deschis al bivalvelor oferă o oportunitate de a dezvolta noi biomarkeri ai hemolimfei folosind conceptul de biopsie lichidă (LB), o abordare simplă și minim invazivă pentru gestionarea pacienților. probe de sânge [9, 10]. Deși în LB uman se pot găsi mai multe tipuri de molecule circulante, acest concept se bazează în principal pe analiza secvențierii ADN-ului fragmentelor de ADN extracelular circulant (ADNcc) în plasmă. De fapt, prezența ADN-ului circulant în plasma umană este cunoscută încă de la mijlocul secolului al XX-lea [11], dar abia în ultimii ani apariția metodelor de secvențiere de mare randament a condus la diagnostic clinic bazat pe ADNcc. Prezența acestor fragmente de ADN circulant se datorează parțial eliberării pasive de ADN genomic (nuclear și mitocondrial) după moartea celulară. La persoanele sănătoase, concentrația de ADNc este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate fi crescută de 5-10 ori la pacienții care suferă de diverse patologii sau sunt supuși stresului, rezultând leziuni tisulare. La persoanele sănătoase, concentrația de ADNc este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate fi crescută de 5-10 ori la pacienții care suferă de diverse patologii sau sunt supuși stresului, rezultând leziuni tisulare. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться повышаться вр5–НК больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. La persoanele sănătoase, concentrația de ADNccc este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate crește de 5-10 ori la pacienții cu diverse patologii sau aflați sub stres care duce la deteriorarea țesuturilor.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致怌导致滍炟在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 掅理 或 扅理 或 手 掣 手中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны 10 увеличе ны 10 пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Concentrațiile de ccfDNA sunt de obicei scăzute (<10 ng/ml) la persoanele sănătoase, dar pot fi crescute de 5-10 ori la pacienții cu diverse patologii sau stres, rezultând leziuni tisulare.Dimensiunea fragmentelor de ADNcc variază foarte mult, dar de obicei variază între 150 și 200 pb. [12]. Analiza ADNcc auto-derivat, adică ADNcc din celule gazdă normale sau transformate, poate fi utilizată pentru a detecta modificările genetice și epigenetice prezente în genomul nuclear și/sau mitocondrial, ajutând astfel medicii să selecteze terapii specifice cu țintă moleculară [13]. Cu toate acestea, ADNcc poate fi obținut din surse străine, cum ar fi ADNcc din celulele fetale în timpul sarcinii sau din organe transplantate [14,15,16,17]. ADNcc este, de asemenea, o sursă importantă de informații pentru detectarea prezenței acizilor nucleici ai unui agent infecțios (străin), ceea ce permite detectarea neinvazivă a infecțiilor răspândite neidentificate prin hemoculturi, evitând biopsia invazivă a țesutului infectat [18]. Studii recente au arătat într-adevăr că sângele uman conține o sursă bogată de informații care poate fi utilizată pentru a identifica agenți patogeni virali și bacterieni și că aproximativ 1% din ADNcc găsit în plasma umană este de origine străină [19]. Aceste studii demonstrează că biodiversitatea microbiomului circulant al unui organism poate fi evaluată folosind analiza ADN-ului ccf. Cu toate acestea, până de curând, acest concept a fost utilizat exclusiv la oameni și, într-o măsură mai mică, la alte vertebrate [20, 21].
În lucrarea de față, folosim potențialul LB pentru a analiza ADN-ul ccf al Aulacomya atra, o specie sudică întâlnită frecvent în Insulele Kerguelen subantarctice, un grup de insule situate pe un platou vast format acum 35 de milioane de ani, în urma unei erupții vulcanice. Folosind un sistem experimental in vitro, am descoperit că fragmentele de ADN din apa de mare sunt rapid absorbite de midii și intră în compartimentul hemolimfei. Secvențierea cu shotgun a arătat că ADN-ul ccf al hemolimfei de midii conține fragmente de ADN de origine proprie și non-auto, inclusiv bacterii simbiotice și fragmente de ADN din biomuri tipice ecosistemelor marine costiere vulcanice reci. ADN-ul ccf al hemolimfei conține, de asemenea, secvențe virale derivate din virusuri cu diferite game de gazde. De asemenea, am găsit fragmente de ADN de la animale multicelulare, cum ar fi peștii osoși, anemonele de mare, algele și insectele. În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul LB poate fi aplicat cu succes la nevertebratele marine pentru a genera un repertoriu genomic bogat în ecosistemele marine.
Adulții (55-70 mm lungime) Mytilus platensis (M. platensis) și Aulacomya atra (A. atra) au fost colectați de pe țărmurile stâncoase intertidale ale orașului Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Insulele Kerguelen în decembrie 2018. Alte midii albastre adulte (Mytilus spp.) au fost obținute de la un furnizor comercial (PEI Mussel King Inc., Insula Prințului Edward, Canada) și plasate într-un rezervor aerat cu temperatură controlată (4°C) care conține 10-20 l de saramură artificială de 32‰ (sare de mare artificială Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SUA). Pentru fiecare experiment, au fost măsurate lungimea și greutatea cochiliilor individuale.
Un protocol gratuit cu acces deschis pentru acest program este disponibil online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Pe scurt, hemolimfa LB a fost colectată din mușchii abductori așa cum este descris [22]. Hemolimfa a fost clarificată prin centrifugare la 1200×g timp de 3 minute, supernatantul a fost congelat (-20°C) până la utilizare. Pentru izolarea și purificarea ADN-ului cf, probele (1,5-2,0 ml) au fost decongelate și procesate folosind kitul NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul ccf a fost păstrat la -80°C până la analize ulterioare. În unele experimente, ADN-ul ccf a fost izolat și purificat folosind kitul QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). ADN-ul purificat a fost cuantificat folosind un test standard PicoGreen. Distribuția fragmentelor de ADN ccf izolat a fost analizată prin electroforeză capilară utilizând un bioanalizator Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) și un kit de ADN de înaltă sensibilitate. Testul a fost efectuat utilizând 1 µl de probă de ADN ccf, conform instrucțiunilor producătorului.
Pentru secvențierea fragmentelor de ADNcc din hemolimfă, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) a preparat biblioteci shotgun folosind kitul Illumina DNA Mix al kitului Illumina MiSeq PE75. S-a utilizat un adaptor standard (BioO). Fișierele cu date brute sunt disponibile din Arhiva de citire a secvențelor NCBI (SRR8924808 și SRR8924809). Calitatea citirii de bază a fost evaluată folosind FastQC [23]. Trimmomatic [24] a fost utilizat pentru secvențierea adaptoarelor și citirile de calitate slabă. Citirile shotgun cu capete pereche au fost îmbinate FLASH în citiri individuale mai lungi, cu o suprapunere minimă de 20 pb pentru a evita nepotrivirile [25]. Citirile îmbinate au fost adnotate cu BLASTN folosind o bază de date NCBI Taxonomy pentru bivalve (valoare e < 1e−3 și omologie 90%), iar mascarea secvențelor cu complexitate redusă a fost efectuată folosind DUST [26]. Citirile îmbinate au fost adnotate cu BLASTN folosind o bază de date NCBI Taxonomy pentru bivalve (valoare e < 1e−3 și omologie 90%), iar mascarea secvențelor cu complexitate redusă a fost efectuată folosind DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных танных таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй сложности было выполнено с использованием PRAF [26]. Citirile grupate au fost adnotate cu BLASTN folosind baza de date NCBI pentru taxonomia bivalvelor (valoare e < 1e-3 și omologie 90%), iar mascarea secvențelor de complexitate redusă a fost efectuată folosind DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌并的诌数＿，同源性）用BLASTN进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 憎 并 读数 憎2 ）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой Ѕнотированы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй ностель сложности было выполнено с использованием PRAF [26]. Citirile grupate au fost adnotate cu BLASTN folosind baza de date taxonomică a bivalvelor NCBI (valoare e <1e-3 și omologie 90%), iar mascarea secvențelor cu complexitate redusă a fost efectuată folosind DUST [26].Citirile au fost împărțite în două grupuri: legate de secvențele de bivalve (numite aici auto-citiri) și neînrudite (non-auto-citiri). Două grupuri au fost asamblate separat folosind MEGAHIT pentru a genera contig-uri [27]. Între timp, distribuția taxonomică a citirilor microbiomului străin a fost clasificată folosind Kraken2 [28] și reprezentată grafic printr-o diagramă circulară Krona pe Galaxy [29, 30]. Kmer-ul optim a fost determinat a fi kmer-59 din experimentele noastre preliminare. Autocontigurile au fost apoi identificate prin aliniere cu BLASTN (baza de date NCBI pentru bivalve, valoare e < 1e−10 și omologie 60%) pentru o adnotare finală. Autocontigurile au fost apoi identificate prin aliniere cu BLASTN (baza de date NCBI pentru bivalve, valoare e < 1e−10 și omologie 60%) pentru o adnotare finală. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытх двхустаны моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Auto-contigurile au fost apoi identificate prin potrivire cu BLASTN (baza de date NCBI pentru bivalve, valoare e <1e-10 și omologie 60%) pentru adnotarea finală.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сол BLAS данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Auto-contigurile au fost apoi identificate pentru adnotarea finală prin potrivire cu BLASTN (baza de date NCBI bivalve, valoare e <1e-10 și omologie 60%). În paralel, contigurile grupurilor non-self au fost adnotate cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoare e < 1e−10 și omologie 60%). În paralel, contigurile grupurilor non-self au fost adnotate cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoare e < 1e−10 și omologie 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN <1e-10 și гомология 60%). În paralel, contigurile grupurilor străine au fost adnotate cu BLASTN (baza de date NT NCBI, valoare e <1e-10 și omologie 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组釤。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组釤。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). În paralel, contigurile grupurilor non-self au fost adnotate cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoare e <1e-10 și omologie 60%). BLASTX a fost efectuat și pe contig-uri non-self folosind bazele de date NCBI pentru proteine ​​nr și RefSeq (valoare e < 1e−10 și omologie 60%). BLASTX a fost efectuat și pe contig-uri non-self folosind bazele de date NCBI pentru proteine ​​nr și RefSeq (valoare e < 1e−10 și omologie 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX a fost efectuat și pe contig-uri non-self folosind bazele de date cu proteine ​​nr și RefSeq NCBI (valoare e < 1e-10 și omologie 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怼 性 60%。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怼 性 60%。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC e BI (Ref. <1e-10 și гомология 60%). BLASTX a fost efectuat și pe contig-uri non-self folosind bazele de date cu proteine ​​nr și RefSeq NCBI (valoare e <1e-10 și omologie 60%).Grupurile BLASTN și BLASTX de contiguri non-auto-reprezintă contigurii finali (vezi fișierul suplimentar).
Primerii utilizați pentru PCR sunt enumerați în Tabelul S1. ADN polimeraza Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) a fost utilizată pentru a amplifica genele țintă ccfADN. Au fost utilizate următoarele condiții de reacție: denaturare la 95°C timp de 3 minute, 95°C timp de 1 minut, temperatură de recoacere stabilită timp de 1 minut, elongație la 72°C timp de 1 minut, 35 de cicluri și, în final, la 72°C în decurs de 10 minute. Produsele PCR au fost separate prin electroforeză în geluri de agaroză (1,5%) conținând colorant SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) la 95 V.
Midiile (Mytilus spp.) au fost aclimatizate în 500 ml de apă de mare oxigenată (32 PSU) timp de 24 de ore la 4°C. ADN-ul plasmidic care conține un insert care codifică secvența de ADNc a galectinei-7 umane (număr de acces NCBI L07769) a fost adăugat în fiolă la o concentrație finală de 190 μg/μl. Midiile incubate în aceleași condiții fără adăugare de ADN au constituit controlul. Al treilea rezervor de control conținea ADN fără midii. Pentru a monitoriza calitatea ADN-ului din apa de mare, s-au prelevat probe de apă de mare (20 μl; trei repetiții) din fiecare rezervor la momentul indicat. Pentru trasabilitatea ADN-ului plasmidic, midiile LB au fost recoltate la momentele indicate și analizate prin qPCR și ddPCR. Datorită conținutului ridicat de sare al apei de mare, alicotele au fost diluate în apă de calitate PCR (1:10) înainte de toate testele PCR.
PCR-ul digital cu picături (ddPCR) a fost efectuat utilizând protocolul BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Utilizați profilul de temperatură pentru a determina temperatura optimă (Tabelul S1). Picăturile au fost generate utilizând un generator de picături QX200 (BioRad). ddPCR-ul a fost efectuat după cum urmează: 95°C timp de 5 minute, 50 de cicluri de 95°C timp de 30 de secunde și o temperatură de recoacere dată timp de 1 minut și 72°C timp de 30 de secunde, 4°C timp de 5 minute și 90°C în decurs de 5 minute. Numărul de picături și reacțiile pozitive (numărul de copii/µl) au fost măsurate utilizând un cititor de picături QX200 (BioRad). Probele cu mai puțin de 10.000 de picături au fost respinse. Controlul modelului nu a fost efectuat de fiecare dată când s-a rulat ddPCR.
qPCR a fost efectuat utilizând Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) și primeri specifici LGALS7. Toate PCR-urile cantitative au fost efectuate în 20 µl utilizând kitul QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). qPCR a fost inițiat cu o incubare de 15 minute la 95°C, urmată de 40 de cicluri la 95°C timp de 10 secunde și la 60°C timp de 60 de secunde cu o singură colectare de date. Curbele de topire au fost generate utilizând măsurători succesive la 95°C timp de 5 secunde, 65°C timp de 60 de secunde și 97°C la sfârșitul qPCR. Fiecare qPCR a fost efectuat în triplicat, cu excepția probelor de control.
Întrucât midiile sunt cunoscute pentru rata lor ridicată de filtrare, am investigat mai întâi dacă acestea pot filtra și reține fragmentele de ADN prezente în apa de mare. De asemenea, am fost interesați să aflăm dacă aceste fragmente se acumulează în sistemul lor limfatic semi-deschis. Am rezolvat această problemă experimental, urmărind soarta fragmentelor de ADN solubile adăugate în bazinele de midii albastre. Pentru a facilita urmărirea fragmentelor de ADN, am utilizat ADN plasmidic străin (nu auto) care conține gena umană galectină-7. ddPCR urmărește fragmentele de ADN plasmidic în apa de mare și midii. Rezultatele noastre arată că, dacă cantitatea de fragmente de ADN din apa de mare a rămas relativ constantă în timp (până la 7 zile) în absența midiilor, atunci în prezența midiilor acest nivel a dispărut aproape complet în decurs de 8 ore (Fig. 1a,b). Fragmente de ADN exogen au fost detectate cu ușurință în decurs de 15 minute în lichidul intravalvular și hemolimfă (Fig. 1c). Aceste fragmente au putut fi detectate până la 4 ore după expunere. Această activitate de filtrare în ceea ce privește fragmentele de ADN este comparabilă cu activitatea de filtrare a bacteriilor și algelor [31]. Aceste rezultate sugerează că midiile pot filtra și acumula ADN străin în compartimentele lor fluide.
Concentrațiile relative de ADN plasmidic în apa de mare în prezența (A) sau absența (B) midiilor, măsurate prin ddPCR. În A, rezultatele sunt exprimate ca procente, marginile casetelor reprezentând percentilele 75 și 25. Curba logaritmică ajustată este prezentată cu roșu, iar zona umbrită cu gri reprezintă intervalul de încredere de 95%. În B, linia roșie reprezintă media, iar linia albastră reprezintă intervalul de încredere de 95% pentru concentrație. C Acumularea de ADN plasmidic în hemolimfa și lichidul valvular al midiilor la momente diferite după adăugarea ADN plasmidic. Rezultatele sunt prezentate ca copii absolute detectate/mL (±SE).
În continuare, am investigat originea ADN-ului ccf din midiile colectate din bancurile de midii de pe Insulele Kerguelen, un grup îndepărtat de insule cu influență antropogenă limitată. În acest scop, ADN-ul ccc din hemolimfele de midii a fost izolat și purificat prin metode utilizate în mod obișnuit pentru purificarea ADN-ului ccc uman [32, 33]. Am constatat că concentrațiile medii de ADN ccf din hemolimfă în midii sunt în intervalul scăzut de micrograme per ml de hemolimfă (vezi Tabelul S2, Informații suplimentare). Acest interval de concentrații este mult mai mare decât la persoanele sănătoase (nanograme scăzute per mililitru), dar în cazuri rare, la pacienții cu cancer, nivelul de ADN ccf poate ajunge la câteva micrograme per mililitru [34, 35]. O analiză a distribuției dimensiunilor ADN-ului ccf din hemolimfă a arătat că aceste fragmente variază foarte mult ca dimensiune, variind de la 1000 pb la 1000 pb până la 5000 pb (Fig. 2). Rezultate similare au fost obținute utilizând kitul QIAamp Investigator pe bază de silice, o metodă utilizată în mod obișnuit în știința criminalistică pentru izolarea și purificarea rapidă a ADN-ului genomic din probe de ADN cu concentrație scăzută, inclusiv ccfDNA [36].
Electroforegramă ccfADN reprezentativă a hemolimfei de midii. Extrasă cu kitul NucleoSnap Plasma (sus) și kitul QIAamp DNA Investigator. Diagrama B Violin prezintă distribuția concentrațiilor de ccfADN din hemolimfă (±SE) la midii. Liniile negre și roșii reprezintă mediana, respectiv primul și al treilea quartil.
Aproximativ 1% din ADN-ul ccf de la oameni și primate are o sursă străină [21, 37]. Având în vedere sistemul circulator semi-deschis al bivalvelor, apa de mare bogată în microbi și distribuția mărimii ADN-ului ccf de midii, am emis ipoteza că ADN-ul ccf de hemolimfă de midii ar putea conține un fond bogat și divers de ADN microbian. Pentru a testa această ipoteză, am secvențiat ADN-ul ccf de hemolimfă din probe de Aulacomya atra colectate din Insulele Kerguelen, obținând peste 10 milioane de citiri, dintre care 97,6% au trecut controlul calității. Citirile au fost apoi clasificate în funcție de surse proprii și non-proprii folosind bazele de date BLASTN și NCBI pentru bivalve (Fig. S1, Informații suplimentare).
La om, atât ADN-ul nuclear, cât și cel mitocondrial pot fi eliberate în fluxul sanguin [38]. Cu toate acestea, în prezentul studiu, nu a fost posibil să se descrie în detaliu ADN-ul genomic nuclear al midiilor, având în vedere că genomul A. atra nu a fost secvențiat sau descris. Cu toate acestea, am reușit să identificăm o serie de fragmente de ADN ccf de origine proprie folosind biblioteca de bivalve (Fig. S2, Informații suplimentare). De asemenea, am confirmat prezența fragmentelor de ADN de origine proprie prin amplificarea PCR dirijată a acelor gene A. atra care au fost secvențiate (Fig. 3). În mod similar, având în vedere că genomul mitocondrial al A. atra este disponibil în bazele de date publice, se pot găsi dovezi ale prezenței fragmentelor de ADN ccf mitocondrial în hemolimfa A. atra. Prezența fragmentelor de ADN mitocondrial a fost confirmată prin amplificarea PCR (Fig. 3).
Diverse gene mitocondriale au fost prezente în hemolimfa de A. atra (puncte roșii – număr de stoc: SRX5705969) și M. platensis (puncte albastre – număr de stoc: SRX5705968) amplificate prin PCR. Figură adaptată după Breton et al., 2011 B Amplificarea supernatantului de hemolimfă de la A. atra. Păstrat pe hârtie FTA. Se utilizează un perforator de 3 mm pentru a adăuga direct în tubul PCR care conține amestecul PCR.
Având în vedere conținutul microbian abundent din apa de mare, ne-am concentrat inițial pe caracterizarea secvențelor de ADN microbian din hemolimfă. Pentru a realiza acest lucru, folosim două strategii diferite. Prima strategie a utilizat Kraken2, un program de clasificare a secvențelor bazat pe algoritmi, care poate identifica secvențe microbiene cu o precizie comparabilă cu BLAST și alte instrumente [28]. Peste 6719 de citiri au fost determinate a fi de origine bacteriană, în timp ce 124 și 64 au provenit de la archaea, respectiv virusuri (Fig. 4). Cele mai abundente fragmente de ADN bacterian au fost Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) și Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Această distribuție este în concordanță cu studiile anterioare asupra microbiomului midiilor albastre marine [39, 40]. Gammaproteobacteria au fost principala clasă de Proteobacterii (44%), inclusiv multe Vibrionales (Fig. 4b). Metoda ddPCR a confirmat prezența fragmentelor de ADN Vibrio în ADN-ul ccf al hemolimfei A. atra (Fig. 4c) [41]. Pentru a obține mai multe informații despre originea bacteriană a ADN-ului ccf, a fost adoptată o abordare suplimentară (Fig. S2, Informații suplimentare). În acest caz, citirile care s-au suprapus au fost asamblate ca citiri la capete pereche și au fost clasificate ca fiind de origine proprie (bivalve) sau non-proprie folosind BLASTN și o valoare e de 1e−3 și o limită cu omologie >90%. În acest caz, citirile care s-au suprapus au fost asamblate ca citiri la capete pereche și au fost clasificate ca fiind de origine proprie (bivalve) sau non-proprie folosind BLASTN și o valoare e de 1e−3 și o limită cu omologie >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование ме зованием зованием зованием BLAS 3 отсечения с гомологией> 90%. În acest caz, citirile suprapuse au fost colectate ca citiri cu perechi și au fost clasificate ca native (bivalve) sau neoriginale folosind BLASTN și o valoare e de 1e-3 și o limită de clasificare cu o omologie >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 用 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классиками и классиканы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использований e BLAS 1e-3 и порога гомологии> 90%. În acest caz, citirile suprapuse au fost colectate ca citiri cu perechi și clasificate ca proprii (bivalve) sau neoriginale folosind valorile e BLASTN și 1e-3 și un prag de omologie >90%.Întrucât genomul A. atra nu a fost încă secvențiat, am utilizat strategia de asamblare de novo a asamblorului MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Un total de 147.188 de contig-uri au fost identificate ca fiind dependenți (bivalve) de origine. Aceste contig-uri au fost apoi explodate cu valori e de 1e-10 folosind BLASTN și BLASTX. Această strategie ne-a permis să identificăm 482 de fragmente non-bivalve prezente în ccfDNA-ul A. atra. Mai mult de jumătate (57%) din aceste fragmente de ADN au fost obținute din bacterii, în principal din simbioți branhiali, inclusiv simbioți sulfotrofi, și din simbioți branhiali Solemya velum (Fig. 5).
Abundență relativă la nivel de tip. B Diversitate microbiană a două încrengături principale (Firmicutes și Proteobacteria). Amplificare reprezentativă a ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmente ale genei ARNr 16S (albastru) în trei hemolimfe atrale.
Au fost analizați un total de 482 de contig-uri colectate. Profil general al distribuției taxonomice a adnotărilor metagenomice ale contig-urilor (procariote și eucariote). B Distribuția detaliată a fragmentelor de ADN bacterian identificate prin BLASTN și BLASTX.
Analiza Kraken2 a arătat, de asemenea, că ADN-ul ccf al midiilor conținea fragmente de ADN arheal, inclusiv fragmente de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) și Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Prezența fragmentelor de ADN derivate din Euryarchaeota și Crenarchaeota, găsite anterior în comunitatea microbiană a midiilor californiene, nu ar trebui să fie o surpriză [42]. Deși Euryarchaeota este adesea asociată cu condiții extreme, acum se recunoaște că atât Euryarchaeota, cât și Crenarcheota se numără printre cele mai comune procariote din mediul criogenic marin [43, 44]. Prezența microorganismelor metanogene în midii nu este surprinzătoare, având în vedere rapoartele recente despre scurgeri extinse de metan din scurgerile de pe fundul Platoului Kerguelen [45] și posibila producție microbiană de metan observată în largul coastei Insulelor Kerguelen [46].
Atenția noastră s-a îndreptat apoi către citirile obținute de la virusurile ADN. Din câte știm, acesta este primul studiu în afara țintei privind conținutul de virus din midii. Așa cum era de așteptat, am găsit fragmente de ADN de bacteriofagi (Caudovirales) (Fig. 6b). Cu toate acestea, cel mai comun ADN viral provine dintr-un filum de nucleocitovirusuri, cunoscut și sub numele de virusul ADN citoplasmatic nuclear mare (NCLDV), care are cel mai mare genom dintre toate virusurile. În cadrul acestui filum, majoritatea secvențelor de ADN aparțin familiilor Mimimidoviridae (58%) și Poxviridae (21%), ale căror gazde naturale includ vertebrate și artropode, în timp ce o mică proporție din aceste secvențe de ADN aparține algelor virologice cunoscute. Infectează algele eucariote marine. Secvențele au fost obținute și de la virusul Pandora, virusul gigant cu cea mai mare dimensiune a genomului dintre toate genurile virale cunoscute. Interesant este că gama de gazde cunoscute ca fiind infectate cu virusul, determinată prin secvențierea ADN-ului ccf al hemolimfei, a fost relativ mare (Figura S3, Informații suplimentare). Aceasta include virusuri care infectează insecte precum Baculoviridae și Iridoviridae, precum și virusuri care infectează amoebe, alge și vertebrate. De asemenea, am găsit secvențe care corespund genomului Pithovirus sibericum. Pitovirusurile (cunoscute și sub numele de „virusuri zombie”) au fost izolate pentru prima dată din permafrostul vechi de 30.000 de ani din Siberia [47]. Astfel, rezultatele noastre sunt în concordanță cu rapoartele anterioare care arată că nu toate speciile moderne ale acestor virusuri sunt dispărute [48] și că aceste virusuri pot fi prezente în ecosisteme marine subarctice îndepărtate.
În cele din urmă, am testat dacă am putea găsi fragmente de ADN de la alte animale multicelulare. Un total de 482 de contig-uri străine au fost identificate prin BLASTN și BLASTX cu biblioteci nt, nr și RefSeq (genomice și proteice). Rezultatele noastre arată că printre fragmentele străine de ccfADN ale animalelor multicelulare predomină ADN-ul oaselor osoase (Fig. 5). De asemenea, au fost găsite fragmente de ADN de la insecte și alte specii. O parte relativ mare a fragmentelor de ADN nu a fost identificată, posibil din cauza subreprezentării unui număr mare de specii marine în bazele de date genomice în comparație cu speciile terestre [49].
În lucrarea de față, aplicăm conceptul de LB la midii, argumentând că secvențierea ADN-ului ccf al hemolimfei poate oferi informații despre compoziția ecosistemelor marine costiere. În special, am constatat că 1) hemolimfa midiilor conține concentrații relativ mari (niveluri de micrograme) de fragmente de ADN circulante relativ mari (~1-5 kb); 2) aceste fragmente de ADN sunt atât independente, cât și neindependente; 3) Printre sursele străine ale acestor fragmente de ADN, am găsit ADN bacterian, arheal și viral, precum și ADN al altor animale multicelulare; 4) Acumularea acestor fragmente străine de ADN ccf în hemolimfă are loc rapid și contribuie la activitatea de filtrare internă a midiilor. În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul de LB, care până acum a fost aplicat în principal în domeniul biomedicinei, codifică o sursă bogată, dar neexplorată, de cunoștințe, care poate fi utilizată pentru a înțelege mai bine interacțiunea dintre speciile santinelă și mediul lor.
Pe lângă primate, izolarea ADN-ului ccf a fost raportată și la mamifere, inclusiv șoareci, câini, pisici și cai [50, 51, 52]. Cu toate acestea, din câte știm, studiul nostru este primul care raportează detectarea și secvențierea ADN-ului ccf la speciile marine cu un sistem de circulație deschisă. Această caracteristică anatomică și capacitatea de filtrare a midiilor pot explica, cel puțin parțial, caracteristicile diferite ale dimensiunilor fragmentelor de ADN circulante în comparație cu alte specii. La oameni, majoritatea fragmentelor de ADN care circulă în sânge sunt fragmente mici, cu dimensiuni cuprinse între 150 și 200 pb, cu un vârf maxim de 167 pb [34, 53]. O porțiune mică, dar semnificativă, a fragmentelor de ADN are o dimensiune cuprinsă între 300 și 500 pb, iar aproximativ 5% sunt mai lungi de 900 pb [54]. Motivul acestei distribuții dimensionale este că principala sursă de ADNcc din plasmă apare ca urmare a morții celulare, fie din cauza morții celulare, fie din cauza necrozei celulelor hematopoietice circulante la indivizi sănătoși, fie din cauza apoptozei celulelor tumorale la pacienții cu cancer (cunoscută sub numele de ADN tumoral circulant, ctADN). Distribuția dimensională a ADNcc din hemolimfă pe care am găsit-o la midii a variat de la 1000 la 5000 pb, sugerând că ADNcc din midii are o origine diferită. Aceasta este o ipoteză logică, deoarece midiile au un sistem vascular semi-deschis și trăiesc în medii acvatice marine care conțin concentrații mari de ADN genomic microbian. De fapt, experimentele noastre de laborator care utilizează ADN exogen au arătat că midiile acumulează fragmente de ADN în apa de mare, cel puțin după câteva ore acestea fiind degradate după absorbția celulară și/sau eliberate și/sau depozitate în diverse organizări. Având în vedere raritatea celulelor (atât procariote, cât și eucariote), utilizarea compartimentelor intravalvulare va reduce cantitatea de ADNcc din surse proprii, precum și din surse străine. Având în vedere importanța imunității înnăscute la bivalve și numărul mare de fagocite circulante, am emis ipoteza suplimentară că, până și ADN-ul ccf străin este îmbogățit în fagocite circulante care acumulează ADN străin la ingerarea de microorganisme și/sau resturi celulare. Luate împreună, rezultatele noastre arată că ADN-ul ccf al hemolimfei bivalve este un depozitar unic de informații moleculare și le consolidează statutul de specie santinelă.
Datele noastre indică faptul că secvențierea și analiza fragmentelor de ADNccf din hemolimfă derivate din bacterii pot oferi informații cheie despre flora bacteriană gazdă și bacteriile prezente în ecosistemul marin înconjurător. Tehnicile de secvențiere prin shot au dezvăluit secvențe ale bacteriei comensale A. atra gill care ar fi fost ratate dacă s-ar fi utilizat metode convenționale de identificare a ARNr 16S, parțial din cauza unei erori de bibliotecă de referință. De fapt, utilizarea datelor LB colectate de la M. platensis în același strat de midii de la Kerguelen a arătat că compoziția simbionților bacterieni asociați cu branhiile a fost aceeași pentru ambele specii de midii (Fig. S4, Informații suplimentare). Această similaritate a două midii genetic diferite poate reflecta compoziția comunităților bacteriene din depozitele reci, sulfuroase și vulcanice de la Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Niveluri mai ridicate de microorganisme reducătoare de sulf au fost bine descrise la recoltarea midiilor din zonele de coastă bioturbate [59], cum ar fi coasta Port-au-France. O altă posibilitate este ca flora comensală de midii să fie afectată de transmiterea orizontală [60, 61]. Sunt necesare mai multe cercetări pentru a determina corelația dintre mediul marin, suprafața fundului mării și compoziția bacteriilor simbiotice din midii. Aceste studii sunt în curs de desfășurare.
Lungimea și concentrația ADN-ului ccf al hemolimfei, ușurința sa de purificare și calitatea înaltă pentru a permite secvențierea rapidă prin metoda shotgun sunt câteva dintre numeroasele avantaje ale utilizării ADN-ului ccf al midiilor pentru a evalua biodiversitatea în ecosistemele marine costiere. Această abordare este deosebit de eficientă pentru caracterizarea comunităților virale (viromilor) într-un anumit ecosistem [62, 63]. Spre deosebire de bacterii, archaea și eucariote, genomurile virale nu conțin gene conservate filogenetic, cum ar fi secvențele 16S. Rezultatele noastre indică faptul că biopsiile lichide de la specii indicatoare, cum ar fi midiile, pot fi utilizate pentru a identifica un număr relativ mare de fragmente de virus ccfADN despre care se știe că infectează gazdele care locuiesc de obicei în ecosistemele marine costiere. Acestea includ virusuri despre care se știe că infectează protozoare, artropode, insecte, plante și virusuri bacteriene (de exemplu, bacteriofagi). O distribuție similară a fost constatată atunci când am examinat viromul ADN-ului ccf al hemolimfei midiilor albastre (M. platensis) colectate în același strat de midii la Kerguelen (Tabelul S2, Informații suplimentare). Secvențierea prin metoda „shotgun” a ADN-ului ccf este într-adevăr o nouă abordare care câștigă teren în studiul viromului uman sau al altor specii [21, 37, 64]. Această abordare este deosebit de utilă pentru studierea virusurilor cu ADN dublu catenar, deoarece nicio genă singulară nu este conservată printre toate virusurile cu ADN dublu catenar, reprezentând cea mai diversă și largă clasă de virusuri din Baltimore [65]. Deși majoritatea acestor virusuri rămân neclasificate și pot include virusuri dintr-o parte complet necunoscută a lumii virale [66], am constatat că viromurile și gamele gazdă ale midiilor A. atra și M. platensis se încadrează în mod similar între cele două specii (vezi figura S3, informații suplimentare). Această similaritate nu este surprinzătoare, deoarece poate reflecta o lipsă de selectivitate în absorbția ADN-ului prezent în mediu. În prezent, sunt necesare studii viitoare care utilizează ARN purificat pentru a caracteriza viromul ARN.
În studiul nostru, am utilizat o secvențiere foarte riguroasă, adaptată din munca lui Kowarski și a colegilor [37], care au utilizat o ștergere în doi pași a citirilor grupate și a contigurilor înainte și după asamblarea ADN-ului ccf nativ, rezultând o proporție mare de citiri necartografiate. Prin urmare, nu putem exclude faptul că unele dintre aceste citiri necartografiate ar putea avea încă propria origine, în principal pentru că nu avem un genom de referință pentru această specie de midii. De asemenea, am utilizat această secvențiere deoarece eram preocupați de himerele dintre citirile self și non-self și de lungimile citirilor generate de Illumina MiSeq PE75. Un alt motiv pentru majoritatea citirilor necartografiate este că o mare parte dintre microbii marini, în special în zone îndepărtate, cum ar fi Kerguelen, nu au fost adnotați. Am utilizat Illumina MiSeq PE75, presupunând lungimi ale fragmentelor de ADN ccf similare cu cele ale ADN ccf uman. Pentru studiile viitoare, având în vedere rezultatele noastre care arată că ADN ccf al hemolimfei are citiri mai lungi decât oamenii și/sau mamiferele, recomandăm utilizarea unei platforme de secvențiere mai potrivite pentru fragmente de ADN ccf mai lungi. Această practică va facilita mult identificarea mai multor indicații pentru o analiză mai aprofundată. Obținerea secvenței complete a genomului nuclear A. atra, disponibilă în prezent, ar facilita, de asemenea, foarte mult discriminarea ADN-ului ccf din surse proprii și din surse non-proprii. Având în vedere că cercetarea noastră s-a concentrat pe posibilitatea aplicării conceptului de biopsie lichidă la midii, sperăm că, pe măsură ce acest concept va fi utilizat în cercetările viitoare, vor fi dezvoltate noi instrumente și proiecte pentru a crește potențialul acestei metode de a studia diversitatea microbiană a midiilor din ecosistemul marin.
Ca biomarker clinic neinvaziv, nivelurile crescute de ccfDNA în plasma umană sunt asociate cu diverse boli, leziuni tisulare și condiții de stres [67,68,69]. Această creștere este asociată cu eliberarea de fragmente de ADN de origine proprie după deteriorarea țesuturilor. Am abordat această problemă utilizând stres termic acut, în care midiile au fost expuse pentru scurt timp la o temperatură de 30 °C. Am efectuat această analiză pe trei tipuri diferite de midii în trei experimente independente. Cu toate acestea, nu am găsit nicio modificare a nivelurilor de ccfDNA după stresul termic acut (vezi Figura S5, informații suplimentare). Această descoperire poate explica, cel puțin parțial, faptul că midiile au un sistem circulator semi-deschis și acumulează cantități mari de ADN străin datorită activității lor de filtrare ridicate. Pe de altă parte, midiile, la fel ca multe nevertebrate, pot fi mai rezistente la deteriorarea țesuturilor indusă de stres, limitând astfel eliberarea de ccfDNA în hemolimfa lor [70, 71].
Până în prezent, analiza ADN-ului biodiversității în ecosistemele acvatice s-a concentrat în principal pe metacodificarea ADN-ului de mediu (eDNA). Cu toate acestea, această metodă este de obicei limitată în analiza biodiversității atunci când se utilizează primeri. Utilizarea secvențierii shotgun eludează limitările PCR și selecția părtinitoare a seturilor de primeri. Astfel, într-un fel, metoda noastră este mai apropiată de metoda recent utilizată de secvențiere eDNA Shotgun de mare randament, care este capabilă să secvențieze direct ADN fragmentat și să analizeze aproape toate organismele [72, 73]. Cu toate acestea, există o serie de aspecte fundamentale care disting LB de metodele standard de eDNA. Desigur, principala diferență dintre eDNA și LB este utilizarea gazdelor filtrante naturale. A fost raportată utilizarea speciilor marine, cum ar fi bureții și bivalvele (Dreisseina spp.), ca filtru natural pentru studierea eDNA [74, 75]. Cu toate acestea, studiul lui Dreissena a utilizat biopsii tisulare din care a fost extras ADN. Analiza ccfADN din LB nu necesită biopsie tisulară, echipamente specializate și uneori costisitoare și logistica asociată cu eDNA sau biopsia tisulară. De fapt, am raportat recent că ADN-ul ccf din LB poate fi stocat și analizat cu suport FTA fără a menține un lanț frigorific, ceea ce reprezintă o provocare majoră pentru cercetarea în zonele îndepărtate [76]. Extracția ADN-ului ccf din biopsiile lichide este, de asemenea, simplă și oferă ADN de înaltă calitate pentru secvențierea rapidă și analiza PCR. Acesta este un mare avantaj, având în vedere unele dintre limitările tehnice asociate cu analiza ADN-ului e [77]. Simplitatea și costul redus al metodei de eșantionare sunt, de asemenea, deosebit de potrivite pentru programele de monitorizare pe termen lung. Pe lângă capacitatea lor ridicată de filtrare, o altă caracteristică bine-cunoscută a bivalvelor este compoziția chimică mucopolisaharidă a mucusului lor, care promovează absorbția virusurilor [78, 79]. Acest lucru face ca bivalvele să fie un filtru natural ideal pentru caracterizarea biodiversității și a impactului schimbărilor climatice într-un anumit ecosistem acvatic. Deși prezența fragmentelor de ADN derivate din gazdă poate fi văzută ca o limitare a metodei în comparație cu ADN-ul e, costul asociat cu deținerea unui astfel de ADN ccf nativ în comparație cu ADN-ul e este simultan de înțeles, având în vedere cantitatea vastă de informații disponibile pentru studiile de sănătate a gazdei offset. Aceasta include prezența secvențelor virale integrate în genomul gazdei. Acest lucru este deosebit de important pentru midii, având în vedere prezența retrovirusurilor leucemice transmise orizontal la bivalve [80, 81]. Un alt avantaj al LB față de ADN-ul ecologic este că exploatează activitatea fagocitară a celulelor sanguine circulante în hemolimfă, care înghite microorganismele (și genomurile acestora). Fagocitoza este funcția principală a celulelor sanguine la bivalve [82]. În cele din urmă, metoda profită de capacitatea mare de filtrare a midiilor (în medie 1,5 l/h de apă de mare) și de circulația pe două zile, care cresc amestecarea diferitelor straturi de apă de mare, permițând captarea ADN-ului ecologic heterolog. [83, 84]. Astfel, analiza ccfADN-ului de midii este o cale interesantă, având în vedere impactul nutrițional, economic și de mediu al midiilor. Similar analizei LB colectate de la oameni, această metodă deschide, de asemenea, posibilitatea măsurării modificărilor genetice și epigenetice din ADN-ul gazdei ca răspuns la substanțe exogene. De exemplu, se pot avea în vedere tehnologiile de secvențiere de a treia generație pentru a efectua analize de metilare la nivelul întregului genom în ADN-ul ccf nativ utilizând secvențierea cu nanopori. Acest proces ar trebui să fie facilitat de faptul că lungimea fragmentelor de ADN ccf de midii este ideal compatibilă cu platformele de secvențiere cu citire lungă care permit analiza metilării ADN-ului la nivelul întregului genom dintr-o singură rundă de secvențiere, fără a fi nevoie de transformări chimice.85,86] Aceasta este o posibilitate interesantă, deoarece s-a demonstrat că modelele de metilare a ADN-ului reflectă un răspuns la stresul mediului și persistă de-a lungul mai multor generații. Prin urmare, poate oferi informații valoroase despre mecanismele care stau la baza răspunsului după expunerea la schimbările climatice sau la poluanți [87]. Cu toate acestea, utilizarea LB nu este lipsită de limitări. Inutil să mai spunem că acest lucru necesită prezența speciilor indicator în ecosistem. Așa cum s-a menționat mai sus, utilizarea LB pentru a evalua biodiversitatea unui anumit ecosistem necesită, de asemenea, o conductă bioinformatică riguroasă care să ia în considerare prezența fragmentelor de ADN din sursă. O altă problemă majoră este disponibilitatea genomurilor de referință pentru speciile marine. Se speră că inițiative precum Proiectul Genomului Mamiferelor Marine și proiectul Fish10k, recent înființat [88], vor facilita astfel de analize în viitor. Aplicarea conceptului LB la organismele marine care se hrănesc prin filtrare este, de asemenea, compatibilă cu cele mai recente progrese în tehnologia de secvențiere, ceea ce îl face potrivit pentru dezvoltarea de biomarkeri multi-ohm pentru a oferi informații importante despre sănătatea habitatelor marine ca răspuns la stresul mediului.
Datele de secvențiere a genomului au fost depuse în Arhiva de citire a sequenței NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sub denumirea Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impactul schimbărilor climatice asupra vieții marine și ecosistemelor. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S și alții. Luați în considerare impactul combinat al schimbărilor climatice și al altor factori de stres locali asupra mediului marin. „Mediul științific general”. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Știința de la 1 martie. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleranța redusă la căldură în condiții de stres termic repetitiv explică mortalitatea ridicată de vară a midiilor albastre. Raport științific 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Schimbări recente în frecvența, cauzele și amploarea deceselor animalelor. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Mai mulți agenți patogeni care nu sunt specifici speciilor ar putea fi cauzat mortalitatea în masă a Pinna nobilis. Viaţă. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impactul potențial al schimbărilor climatice asupra bolilor zoonotice arctice. Int J Circumpolar Health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. și alții. Midiile albastre (Mytilus edulis spp.) ca organisme semnal în monitorizarea poluării costiere: o analiză. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrarea biopsiei lichide în tratamentul cancerului. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maturarea biopsiei lichide: Permite circulația ADN-ului tumoral. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acizi nucleici în plasma umană. Proces-verbal al ședințelor filialelor Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nou rol al ADN-ului liber ca marker molecular pentru tratamentul cancerului. Cuantificarea analizei biomolare. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia lichidă intră în clinică – probleme de implementare și provocări viitoare. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW și alții. ADN-ul fetal este prezent în plasma și serul matern. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studiu al evoluției sarcinii și al complicațiilor acesteia utilizând ARN extracelular circulant în sângele femeilor în timpul sarcinii. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsie lichidă: ADN-ul liber de celule donatoare este utilizat pentru a detecta leziunile alogene într-o grefă de rinichi. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovații în diagnosticul prenatal: secvențierea genomului plasmei materne. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D și colab. Detectarea rapidă a agenților patogeni cu secvențiere metagenomică de ultimă generație a fluidelor corporale infectate. Nat Medicine. 2021;27:115-24.