Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η υγρή βιοψία (LB) είναι μια έννοια που κερδίζει γρήγορα δημοτικότητα στον βιοϊατρικό τομέα. Η έννοια βασίζεται κυρίως στην ανίχνευση θραυσμάτων κυκλοφορούντος εξωκυτταρικού DNA (ccfDNA), τα οποία απελευθερώνονται κυρίως ως μικρά θραύσματα μετά τον κυτταρικό θάνατο σε διάφορους ιστούς. Ένα μικρό ποσοστό αυτών των θραυσμάτων προέρχεται από ξένους (ξένους) ιστούς ή οργανισμούς. Στην τρέχουσα εργασία μας, έχουμε εφαρμόσει αυτήν την έννοια σε μύδια, ένα είδος-φρουρό γνωστό για την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος του θαλασσινού νερού. Χρησιμοποιούμε την ικανότητα των μυδιών να λειτουργούν ως φυσικά φίλτρα για να συλλαμβάνουν θραύσματα DNA του περιβάλλοντος από μια ποικιλία πηγών, ώστε να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη βιοποικιλότητα των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αιμολέμφος των μυδιών περιέχει θραύσματα DNA που ποικίλλουν σημαντικά σε μέγεθος, από 1 έως 5 kb. Η αλληλούχιση με βολβό έδειξε ότι ένας μεγάλος αριθμός θραυσμάτων DNA είναι ξένης μικροβιακής προέλευσης. Μεταξύ αυτών, βρήκαμε θραύσματα DNA από βακτήρια, αρχαία και ιούς, συμπεριλαμβανομένων ιών που είναι γνωστό ότι μολύνουν μια ποικιλία ξενιστών που βρίσκονται συνήθως σε παράκτια θαλάσσια οικοσυστήματα. Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια του LB που εφαρμόζεται στα μύδια αντιπροσωπεύει μια πλούσια αλλά ακόμη ανεξερεύνητη πηγή γνώσης σχετικά με τη μικροβιακή ποικιλομορφία στα θαλάσσια παράκτια οικοσυστήματα.
Η επίδραση της κλιματικής αλλαγής (ΚΚ) στη βιοποικιλότητα των θαλάσσιων οικοσυστημάτων αποτελεί έναν ταχέως αναπτυσσόμενο τομέα έρευνας. Η υπερθέρμανση του πλανήτη όχι μόνο προκαλεί σημαντικές φυσιολογικές πιέσεις, αλλά και ωθεί τα εξελικτικά όρια της θερμικής σταθερότητας των θαλάσσιων οργανισμών, επηρεάζοντας το βιότοπο ορισμένων ειδών, ωθώντας τα να αναζητήσουν ευνοϊκότερες συνθήκες [1, 2]. Εκτός από την επίδραση στη βιοποικιλότητα των μετάζωων, η ΚΚ διαταράσσει την ευαίσθητη ισορροπία των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-μικροβίου. Αυτή η μικροβιακή δυσβακτηρίωση αποτελεί σοβαρή απειλή για τα θαλάσσια οικοσυστήματα, καθώς καθιστά τους θαλάσσιους οργανισμούς πιο ευάλωτους σε μολυσματικούς παθογόνους παράγοντες [3, 4]. Πιστεύεται ότι οι ΚΚ διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στους μαζικούς θανάτους, γεγονός που αποτελεί σοβαρό πρόβλημα για τη διαχείριση των παγκόσμιων θαλάσσιων οικοσυστημάτων [5, 6]. Αυτό είναι ένα σημαντικό ζήτημα δεδομένων των οικονομικών, οικολογικών και διατροφικών επιπτώσεων πολλών θαλάσσιων ειδών. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα δίθυρα που ζουν στις πολικές περιοχές, όπου οι επιπτώσεις της ΚΚ είναι πιο άμεσες και σοβαρές [6, 7]. Στην πραγματικότητα, δίθυρα όπως το Mytilus spp. χρησιμοποιούνται ευρέως για την παρακολούθηση των επιπτώσεων της ΚΚ στα θαλάσσια οικοσυστήματα. Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι έχει αναπτυχθεί ένας σχετικά μεγάλος αριθμός βιοδεικτών για την παρακολούθηση της υγείας τους, συχνά χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση δύο επιπέδων που περιλαμβάνει λειτουργικούς βιοδείκτες βασισμένους στην ενζυμική δραστηριότητα ή σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η βιωσιμότητα των κυττάρων και η φαγοκυτταρική δραστηριότητα [8]. Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν επίσης τη μέτρηση της συγκέντρωσης συγκεκριμένων δεικτών πίεσης που συσσωρεύονται στους μαλακούς ιστούς μετά την απορρόφηση μεγάλων ποσοτήτων θαλασσινού νερού. Ωστόσο, η υψηλή ικανότητα διήθησης και το ημι-ανοιχτό κυκλοφορικό σύστημα των δίθυρων παρέχουν την ευκαιρία για την ανάπτυξη νέων βιοδεικτών αιμολέμφου χρησιμοποιώντας την έννοια της υγρής βιοψίας (LB), μιας απλής και ελάχιστα επεμβατικής προσέγγισης στη διαχείριση ασθενών. Παρόλο που διάφοροι τύποι κυκλοφορούντων μορίων μπορούν να βρεθούν στο ανθρώπινο LB, αυτή η έννοια βασίζεται κυρίως στην ανάλυση αλληλούχισης DNA θραυσμάτων κυκλοφορούντος εξωκυτταρικού DNA (ccfDNA) στο πλάσμα. Στην πραγματικότητα, η παρουσία κυκλοφορούντος DNA στο ανθρώπινο πλάσμα είναι γνωστή από τα μέσα του 20ού αιώνα [11], αλλά μόνο τα τελευταία χρόνια η έλευση μεθόδων αλληλούχισης υψηλής απόδοσης οδήγησε στην κλινική διάγνωση με βάση το ccfDNA. Η παρουσία αυτών των κυκλοφορούντων θραυσμάτων DNA οφείλεται εν μέρει στην παθητική απελευθέρωση γονιδιωματικού DNA (πυρηνικού και μιτοχονδριακού) μετά τον κυτταρικό θάνατο. Σε υγιή άτομα, η συγκέντρωση του ccfDNA είναι κανονικά χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς που πάσχουν από διάφορες παθολογίες ή υποβάλλονται σε στρες, με αποτέλεσμα τη βλάβη των ιστών. Σε υγιή άτομα, η συγκέντρωση του ccfDNA είναι κανονικά χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς που πάσχουν από διάφορες παθολογίες ή υποβάλλονται σε στρες, με αποτέλεσμα τη βλάβη των ιστών. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), αλλά μπορεί να повышаться σε 5–10 ανά больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводяврщежему. Σε υγιείς ανθρώπους, η συγκέντρωση του cccDNA είναι κανονικά χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς με διάφορες παθολογίες ή υπό στρες που οδηγεί σε βλάβη των ιστών.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Οι συγκεντρώσεις ccfDNA είναι πολύ χαμηλές (<10 ng/ml) σε ανώμαλες λάτρες, αλλά μπορούν να αυξηθούν σε 5-10 φορές σε ασθενείς με διαταραχές παθολογίας ή στρεσσομ, что приводит к повреждению тканей. Οι συγκεντρώσεις ccfDNA είναι συνήθως χαμηλές (<10 ng/ml) σε υγιή άτομα, αλλά μπορούν να αυξηθούν 5-10 φορές σε ασθενείς με διάφορες παθολογίες ή στρες, με αποτέλεσμα τη βλάβη των ιστών.Το μέγεθος των θραυσμάτων ccfDNA ποικίλλει ευρέως, αλλά συνήθως κυμαίνεται από 150 έως 200 bp. [12]. Η ανάλυση του αυτοπαραγόμενου ccfDNA, δηλαδή του ccfDNA από φυσιολογικά ή μετασχηματισμένα κύτταρα ξενιστή, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση γενετικών και επιγενετικών αλλαγών που υπάρχουν στο πυρηνικό ή/και μιτοχονδριακό γονιδίωμα, βοηθώντας έτσι τους κλινικούς ιατρούς να επιλέξουν συγκεκριμένες μοριακά στοχευμένες θεραπείες [13]. Ωστόσο, το ccfDNA μπορεί να ληφθεί από ξένες πηγές, όπως το ccfDNA από εμβρυϊκά κύτταρα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης ή από μεταμοσχευμένα όργανα [14,15,16,17]. Το ccfDNA είναι επίσης μια σημαντική πηγή πληροφοριών για την ανίχνευση της παρουσίας νουκλεϊκών οξέων ενός μολυσματικού παράγοντα (ξένου), γεγονός που επιτρέπει τη μη επεμβατική ανίχνευση εκτεταμένων λοιμώξεων που δεν αναγνωρίζονται από καλλιέργειες αίματος, αποφεύγοντας την επεμβατική βιοψία μολυσμένου ιστού [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν πράγματι δείξει ότι το ανθρώπινο αίμα περιέχει μια πλούσια πηγή πληροφοριών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση ιικών και βακτηριακών παθογόνων, και ότι περίπου το 1% του ccfDNA που βρίσκεται στο ανθρώπινο πλάσμα είναι ξένης προέλευσης [19]. Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι η βιοποικιλότητα του κυκλοφορούντος μικροβιώματος ενός οργανισμού μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας ανάλυση ccfDNA. Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα, αυτή η έννοια χρησιμοποιούνταν αποκλειστικά στους ανθρώπους και, σε μικρότερο βαθμό, σε άλλα σπονδυλωτά [20, 21].
Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιούμε το δυναμικό LB για να αναλύσουμε το ccfDNA του Aulacomya atra, ενός νότιου είδους που βρίσκεται συνήθως στα υποανταρκτικά νησιά Kerguelen, μια ομάδα νησιών στην κορυφή ενός μεγάλου οροπεδίου που σχηματίστηκε πριν από 35 εκατομμύρια χρόνια. Χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό σύστημα in vitro, διαπιστώσαμε ότι τα θραύσματα DNA στο θαλασσινό νερό απορροφώνται γρήγορα από τα μύδια και εισέρχονται στο διαμέρισμα της αιμολέμφου. Η αλληλούχιση με κυνηγετικό όπλο έδειξε ότι το ccfDNA της αιμολέμφου μυδιών περιέχει θραύσματα DNA δικής της και μη δικής της προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων συμβιωτικών βακτηρίων και θραυσμάτων DNA από βιοσυστήματα τυπικά των ψυχρών ηφαιστειακών θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων. Το ccfDNA της αιμολέμφου περιέχει επίσης ιικές αλληλουχίες που προέρχονται από ιούς με διαφορετικές περιοχές ξενιστών. Βρήκαμε επίσης θραύσματα DNA από πολυκύτταρα ζώα όπως οστεώδη ψάρια, θαλάσσιες ανεμώνες, φύκια και έντομα. Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια του LB μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία σε θαλάσσια ασπόνδυλα για να δημιουργήσει ένα πλούσιο γονιδιωματικό ρεπερτόριο σε θαλάσσια οικοσυστήματα.
Ενήλικα μύδια (μήκους 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) και Aulacomya atra (A. atra) συλλέχθηκαν από τις παλιρροιακές βραχώδεις ακτές του Port-au-France (049°21.235 Ν, 070°13.490 Α). Νήσοι Kerguelen τον Δεκέμβριο του 2018. Άλλα ενήλικα μπλε μύδια (Mytilus spp.) αποκτήθηκαν από εμπορικό προμηθευτή (PEI Mussel King Inc., Νήσος Πρίγκιπα Εδουάρδου, Καναδάς) και τοποθετήθηκαν σε αεριζόμενη δεξαμενή ελεγχόμενης θερμοκρασίας (4°C) που περιείχε 10-20 L τεχνητής άλμης 32‰ (τεχνητό θαλασσινό αλάτι Reef Crystal, Instant Ocean, Βιρτζίνια, ΗΠΑ). Για κάθε πείραμα, μετρήθηκε το μήκος και το βάρος των μεμονωμένων κελυφών.
Ένα δωρεάν πρωτόκολλο ανοιχτής πρόσβασης για αυτό το πρόγραμμα είναι διαθέσιμο στο διαδίκτυο (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Εν συντομία, η αιμολέμφος LB συλλέχθηκε από τους απαγωγούς μύες όπως περιγράφεται [22]. Η αιμολέμφος διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 1200×g για 3 λεπτά, το υπερκείμενο καταψύχθηκε (-20°C) μέχρι τη χρήση. Για την απομόνωση και τον καθαρισμό του cfDNA, δείγματα (1,5-2,0 ml) αποψύχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ccfDNA αποθηκεύτηκε στους -80°C μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Σε ορισμένα πειράματα, το ccfDNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς). Το καθαρισμένο DNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική δοκιμασία PicoGreen. Η κατανομή θραυσμάτων του απομονωμένου ccfDNA αναλύθηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) και ένα κιτ DNA υψηλής ευαισθησίας. Η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 1 µl του δείγματος ccfDNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Για την αλληλούχιση θραυσμάτων αιμολεμφικού ccfDNA, η Génome Québec (Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς) ετοίμασε βιβλιοθήκες κυνηγετικών όπλων χρησιμοποιώντας το κιτ Illumina DNA Mix του κιτ Illumina MiSeq PE75. Χρησιμοποιήθηκε ένας τυπικός προσαρμογέας (BioO). Αρχεία ακατέργαστων δεδομένων είναι διαθέσιμα από το Αρχείο Ανάγνωσης Ακολουθιών NCBI (SRR8924808 και SRR8924809). Η βασική ποιότητα ανάγνωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το FastQC [23]. Το Trimmomatic [24] έχει χρησιμοποιηθεί για την αποκοπή προσαρμογέων και αναγνώσεων χαμηλής ποιότητας. Οι αναγνώσεις κυνηγετικών όπλων με ζευγαρωμένα άκρα συγχωνεύθηκαν με FLASH σε μεγαλύτερες μονές αναγνώσεις με ελάχιστη επικάλυψη 20 bp για την αποφυγή αναντιστοιχιών [25]. Οι συγχωνευμένες αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας μια βάση δεδομένων ταξινόμησης NCBI για δίθυρα (τιμή e < 1e-3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη αλληλουχιών χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26]. Οι συγχωνευμένες αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας μια βάση δεδομένων ταξινόμησης NCBI για δίθυρα (τιμή e < 1e-3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη αλληλουχιών χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26]. Объединенные чтения были антированы со помош BLASTN με χρήση BLASTN ναννых τάξωνομιι двустворчатых моллюсков NCBI (σημασία e < 1e-3 και 90% μετριότατη μετάδοση), было выполнено со использованием DUST [26]. Οι συγκεντρωτικές αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων ταξινόμησης δίθυρων NCBI (τιμή e < 1e-3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη αλληλουχίας χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数 注释合并的读数进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 用 用 注释 合并 读数进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN με την βοήθεια του BLASTN με την χρήση του ταξονόμικου NCBI (σημασία και <1e-3 και 90% μετά από μικρή ηλικία), было выполнено со использованием DUST [26]. Οι συγκεντρωτικές αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων ταξινόμησης δίθυρων NCBI (τιμή e <1e-3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη αλληλουχίας χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26].Οι αναγνώσεις χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: σχετιζόμενες με αλληλουχίες δίθυρων (εδώ ονομάζονται αυτοαναγνώσεις) και άσχετες (μη αυτοαναγνώσεις). Δύο ομάδες συναρμολογήθηκαν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας το MEGAHIT για τη δημιουργία συνεχόμενων αλληλουχιών [27]. Εν τω μεταξύ, η ταξινομική κατανομή των αναγνώσεων εξωγήινου μικροβιώματος ταξινομήθηκε χρησιμοποιώντας το Kraken2 [28] και αναπαραστήθηκε γραφικά από ένα διάγραμμα κυκλικής ροής Krona στο Galaxy [29, 30]. Τα βέλτιστα kmers προσδιορίστηκαν ως kmers-59 από τα προκαταρκτικά μας πειράματα. Τα αυτοσυνδεδεμένα σημεία ταυτοποιήθηκαν στη συνέχεια με ευθυγράμμιση με το BLASTN (βάση δεδομένων NCBI δίθυρων, τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%) για τελική σχολίαση. Τα αυτοσυνδεδεμένα σημεία ταυτοποιήθηκαν στη συνέχεια με ευθυγράμμιση με το BLASTN (βάση δεδομένων NCBI δίθυρων, τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%) για τελική σχολίαση. Το σημείωμα του NCBI είναι <1e-10 και γεγονότης 60%) για το BLASTN. Τα αυτοσυνδεδεμένα μόρια ταυτοποιήθηκαν στη συνέχεια με αντιστοίχιση με το BLASTN (βάση δεδομένων δίθυρων NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%) για τελική σχολίαση.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Υπόλοιπες πληροφορίες για ενημερωμένες ενδείξεις σημείωσης με το BLASTN (βάση δεδομένων του NCBI για δημιουργούς του μολλιούσκου, σημασία και <1e-10 και %). Στη συνέχεια, τα αυτοσυνδεδεμένα σημεία ταυτοποιήθηκαν για τελική σχολίαση με αντιστοίχιση με το BLASTN (βάση δεδομένων δίθυρων NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%). Παράλληλα, οι μη αυτο-ομαδικές συνεχόμενες ομάδες σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%). Παράλληλα, οι μη αυτο-ομαδικές συνεχόμενες ομάδες σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%). Παράλληλο chugerodnыe grouppovыe contigi bыly annotirovanы with pomoщьyu BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Παράλληλα, οι συνεχόμενες ξένες ομάδες σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων NT NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Παράλληλη σύγκρουση, δεν είναι относящиеся к κοινόχρηστη ομάδα, αλλά ανενόχλητη με βοηθητική BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Παράλληλα, οι μη αυτοομαδοποιημένες συνεχόμενες περιοχές σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%). Η BLASTX διεξήχθη επίσης σε μη αυτοσυνδεδεμένα μόρια χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων NCBI πρωτεϊνών nr και RefSeq (τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%). Η BLASTX διεξήχθη επίσης σε μη αυτοσυνδεδεμένα μόρια χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων NCBI πρωτεϊνών nr και RefSeq (τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%). Το BLASTX также был проведен на несамостоятельных κοντίγαχ με χρήση των βασικών αριθμών αριθμών και RefSeq NCBI (σημασία e <1e-10 και γομολογία 60%). Η BLASTX πραγματοποιήθηκε επίσης σε μη αυτοσυνδεδεμένες αλληλουχίες χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών nr και RefSeq NCBI (τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr και RefSeq NCBI (σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Η BLASTX πραγματοποιήθηκε επίσης σε μη αυτοσυνδεδεμένες αλληλουχίες χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών nr και RefSeq NCBI (τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%).Οι ομάδες BLASTN και BLASTX των μη αυτοσυνδεδεμένων συνεχόμενων αντιπροσωπεύουν τα τελικά συνεχόμενα (βλ. Συμπληρωματικό αρχείο).
Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR παρατίθενται στον Πίνακα S1. Η DNA πολυμεράση Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση των γονιδίων-στόχων ccfDNA. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες αντίδρασης: μετουσίωση στους 95°C για 3 λεπτά, 95°C για 1 λεπτό, καθορισμένη θερμοκρασία ανόπτησης για 1 λεπτό, επιμήκυνση στους 72°C για 1 λεπτό, 35 κύκλοι και τέλος 72°C εντός 10 λεπτών. . Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτές αγαρόζης (1,5%) που περιείχαν SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Καναδάς) στα 95 V.
Τα μύδια (Mytilus spp.) εγκλιματίστηκαν σε 500 ml οξυγονωμένου θαλασσινού νερού (32 PSU) για 24 ώρες στους 4°C. Πλασμιδιακό DNA που περιείχε ένα ένθετο που κωδικοποιεί την αλληλουχία cDNA της ανθρώπινης γαλεκτίνης-7 (αριθμός πρόσβασης NCBI L07769) προστέθηκε στο φιαλίδιο σε τελική συγκέντρωση 190 μg/μl. Τα μύδια που επωάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες χωρίς προσθήκη DNA ήταν ο έλεγχος. Η τρίτη δεξαμενή ελέγχου περιείχε DNA χωρίς μύδια. Για την παρακολούθηση της ποιότητας του DNA στο θαλασσινό νερό, ελήφθησαν δείγματα θαλασσινού νερού (20 μl· τρεις επαναλήψεις) από κάθε δεξαμενή την καθορισμένη ώρα. Για την ιχνηλασιμότητα του πλασμιδιακού DNA, τα μύδια LB συλλέχθηκαν στις καθορισμένες ώρες και αναλύθηκαν με qPCR και ddPCR. Λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι του θαλασσινού νερού, τα δείγματα αραιώθηκαν σε νερό ποιότητας PCR (1:10) πριν από όλες τις δοκιμασίες PCR.
Η ψηφιακή PCR σταγονιδίων (ddPCR) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο BioRad QX200 (Mississauga, Οντάριο, Καναδάς). Χρησιμοποιήστε το προφίλ θερμοκρασίας για να προσδιορίσετε τη βέλτιστη θερμοκρασία (Πίνακας S1). Οι σταγόνες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια γεννήτρια σταγόνων QX200 (BioRad). Η ddPCR πραγματοποιήθηκε ως εξής: 95°C για 5 λεπτά, 50 κύκλοι 95°C για 30 δευτερόλεπτα και δεδομένη θερμοκρασία ανόπτησης για 1 λεπτό και 72°C για 30 δευτερόλεπτα, 4°C για 5 λεπτά και 90°C εντός 5 λεπτών. Ο αριθμός των σταγόνων και των θετικών αντιδράσεων (αριθμός αντιγράφων/µl) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης σταγόνων QX200 (BioRad). Δείγματα με λιγότερα από 10.000 σταγόνες απορρίφθηκαν. Δεν πραγματοποιήθηκε έλεγχος προτύπου κάθε φορά που εκτελούνταν ddPCR.
Η qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Σίδνεϊ, Αυστραλία) και ειδικούς εκκινητές LGALS7. Όλες οι ποσοτικές PCR πραγματοποιήθηκαν σε 20 µl χρησιμοποιώντας το QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Η qPCR ξεκίνησε με επώαση 15 λεπτών στους 95°C, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95°C για 10 δευτερόλεπτα και στους 60°C για 60 δευτερόλεπτα με μία συλλογή δεδομένων. Οι καμπύλες τήξης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας διαδοχικές μετρήσεις στους 95°C για 5 δευτερόλεπτα, στους 65°C για 60 δευτερόλεπτα και στους 97°C στο τέλος της qPCR. Κάθε qPCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν, εκτός από τα δείγματα ελέγχου.
Δεδομένου ότι τα μύδια είναι γνωστά για τον υψηλό ρυθμό διήθησης, αρχικά διερευνήσαμε εάν μπορούσαν να φιλτράρουν και να συγκρατήσουν θραύσματα DNA που υπάρχουν στο θαλασσινό νερό. Μας ενδιέφερε επίσης το εάν αυτά τα θραύσματα συσσωρεύονται στο ημι-ανοιχτό λεμφικό τους σύστημα. Επιλύσαμε αυτό το ζήτημα πειραματικά εντοπίζοντας την τύχη των διαλυτών θραυσμάτων DNA που προστέθηκαν σε δεξαμενές μπλε μυδιών. Για να διευκολύνουμε την παρακολούθηση θραυσμάτων DNA, χρησιμοποιήσαμε ξένο (όχι ίδιο) πλασμιδιακό DNA που περιείχε το ανθρώπινο γονίδιο γαλεκτίνης-7. Η ddPCR ανιχνεύει θραύσματα πλασμιδιακού DNA σε θαλασσινό νερό και μύδια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εάν η ποσότητα θραυσμάτων DNA στο θαλασσινό νερό παρέμενε σχετικά σταθερή με την πάροδο του χρόνου (έως και 7 ημέρες) απουσία μυδιών, τότε παρουσία μυδιών αυτό το επίπεδο εξαφανιζόταν σχεδόν εντελώς εντός 8 ωρών (Εικ. 1α,β). Θραύσματα εξωγενούς DNA ανιχνεύθηκαν εύκολα εντός 15 λεπτών σε ενδοβαλβιδικό υγρό και αιμολέμφο (Εικ. 1γ). Αυτά τα θραύσματα μπορούσαν να ανιχνευθούν έως και 4 ώρες μετά την έκθεση. Αυτή η δραστικότητα φιλτραρίσματος σε σχέση με τα θραύσματα DNA είναι συγκρίσιμη με τη δραστικότητα φιλτραρίσματος των βακτηρίων και των φυκών [31]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μύδια μπορούν να φιλτράρουν και να συσσωρεύουν ξένο DNA στα υγρά τους διαμερίσματα.
Σχετικές συγκεντρώσεις πλασμιδιακού DNA σε θαλασσινό νερό παρουσία (Α) ή απουσία (Β) μυδιών, μετρημένες με ddPCR. Στο Α, τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά, με τα όρια των πλαισίων να αντιπροσωπεύουν το 75ο και 25ο εκατοστημόριο. Η προσαρμοσμένη λογαριθμική καμπύλη εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα και η περιοχή με γκρι σκίαση αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Στο Β, η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο και η μπλε γραμμή αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για τη συγκέντρωση. Γ Συσσώρευση πλασμιδιακού DNA στην αιμολέμφο και το βαλβιδικό υγρό των μυδιών σε διαφορετικούς χρόνους μετά την προσθήκη πλασμιδιακού DNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως απόλυτα αντίγραφα που ανιχνεύθηκαν/mL (±SE).
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την προέλευση του ccfDNA σε μύδια που συλλέχθηκαν από μύδια στα νησιά Kerguelen, μια απομακρυσμένη ομάδα νησιών με περιορισμένη ανθρωπογενή επιρροή. Για τον σκοπό αυτό, το cccDNA από αιμολέμφες μυδιών απομονώθηκε και καθαρίστηκε με μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον καθαρισμό του ανθρώπινου cccDNA [32, 33]. Διαπιστώσαμε ότι οι μέσες συγκεντρώσεις ccfDNA αιμολέμφου στα μύδια βρίσκονται στο χαμηλό εύρος μικρογραμμαρίων ανά ml αιμολέμφου (βλ. Πίνακα S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Αυτό το εύρος συγκεντρώσεων είναι πολύ μεγαλύτερο από ό,τι σε υγιείς ανθρώπους (χαμηλά νανογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο), αλλά σε σπάνιες περιπτώσεις, σε ασθενείς με καρκίνο, το επίπεδο του ccfDNA μπορεί να φτάσει αρκετά μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο [34, 35]. Μια ανάλυση της κατανομής μεγέθους του ccfDNA αιμολέμφου έδειξε ότι αυτά τα θραύσματα ποικίλλουν σημαντικά σε μέγεθος, κυμαινόμενο από 1000 bp έως 1000 bp έως και 5000 bp (Εικ. 2). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Investigator με βάση το πυρίτιο, μια μέθοδο που χρησιμοποιείται συνήθως στην εγκληματολογική επιστήμη για την ταχεία απομόνωση και καθαρισμό του γονιδιωματικού DNA από δείγματα DNA χαμηλής συγκέντρωσης, συμπεριλαμβανομένου του ccfDNA [36].
Αντιπροσωπευτικό ηλεκτροφόρημα ccfDNA αιμολέμφου μυδιού. Εκχυλίστηκε με το NucleoSnap Plasma Kit (πάνω) και το QIAamp DNA Investigator Kit. Β Διάγραμμα βιολιού που δείχνει την κατανομή των συγκεντρώσεων ccfDNA αιμολέμφου (±SE) σε μύδια. Οι μαύρες και κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν τη διάμεση τιμή και το πρώτο και τρίτο τεταρτημόριο, αντίστοιχα.
Περίπου το 1% του ccfDNA στους ανθρώπους και τα πρωτεύοντα θηλαστικά έχει ξένη πηγή [21, 37]. Δεδομένου του ημι-ανοιχτού κυκλοφορικού συστήματος των δίθυρων, του πλούσιου σε μικροβιακά θαλασσινού νερού και της κατανομής μεγέθους του ccfDNA των μυδιών, υποθέσαμε ότι το ccfDNA της αιμολέμφου των μυδιών μπορεί να περιέχει μια πλούσια και ποικίλη ομάδα μικροβιακού DNA. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, αλληλουχήσαμε το ccfDNA της αιμολέμφου από δείγματα Aulacomya atra που συλλέχθηκαν από τα νησιά Kerguelen, αποδίδοντας πάνω από 10 εκατομμύρια αναγνώσεις, το 97,6% των οποίων πέρασε τον ποιοτικό έλεγχο. Οι αναγνώσεις στη συνέχεια ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τις ίδιες και τις μη ίδιες πηγές χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων δίθυρων BLASTN και NCBI (Εικ. S1, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).
Στους ανθρώπους, τόσο το πυρηνικό όσο και το μιτοχονδριακό DNA μπορούν να απελευθερωθούν στην κυκλοφορία του αίματος [38]. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, δεν ήταν δυνατό να περιγραφεί λεπτομερώς το πυρηνικό γονιδιωματικό DNA των μυδιών, δεδομένου ότι το γονιδίωμα του A. atra δεν έχει αλληλουχηθεί ή περιγραφεί. Ωστόσο, καταφέραμε να αναγνωρίσουμε έναν αριθμό θραυσμάτων ccfDNA δικής μας προέλευσης χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη δίθυρων (Εικ. S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Επιβεβαιώσαμε επίσης την παρουσία θραυσμάτων DNA δικής μας προέλευσης με κατευθυνόμενη ενίσχυση PCR αυτών των γονιδίων του A. atra που αλληλουχήθηκαν (Εικ. 3). Ομοίως, δεδομένου ότι το μιτοχονδριακό γονιδίωμα του A. atra είναι διαθέσιμο σε δημόσιες βάσεις δεδομένων, μπορούν να βρεθούν στοιχεία για την παρουσία θραυσμάτων μιτοχονδριακού ccfDNA στην αιμολέμφο του A. atra. Η παρουσία θραυσμάτων μιτοχονδριακού DNA επιβεβαιώθηκε με ενίσχυση PCR (Εικ. 3).
Διάφορα μιτοχονδριακά γονίδια υπήρχαν στην αιμολέμφο του A. atra (κόκκινες κουκκίδες – αριθμός αποθέματος: SRX5705969) και του M. platensis (μπλε κουκκίδες – αριθμός αποθέματος: SRX5705968) που ενισχύθηκαν με PCR. Σχήμα προσαρμοσμένο από τον Breton et al., 2011 B Ενίσχυση του υπερκείμενου υγρού αιμολέμφου από το A. atra Αποθηκεύτηκε σε χαρτί FTA. Χρησιμοποιήστε ένα διατρητικό εργαλείο 3 mm για να το προσθέσετε απευθείας στο σωληνάριο PCR που περιέχει το μείγμα PCR.
Δεδομένου του άφθονου μικροβιακού περιεχομένου στο θαλασσινό νερό, αρχικά εστιάσαμε στον χαρακτηρισμό των αλληλουχιών μικροβιακού DNA στην αιμολέμφο. Για να το πετύχουμε αυτό, χρησιμοποιούμε δύο διαφορετικές στρατηγικές. Η πρώτη στρατηγική χρησιμοποίησε το Kraken2, ένα πρόγραμμα ταξινόμησης αλληλουχιών βασισμένο σε αλγόριθμο που μπορεί να αναγνωρίσει μικροβιακές αλληλουχίες με ακρίβεια συγκρίσιμη με το BLAST και άλλα εργαλεία [28]. Περισσότερες από 6719 αναγνώσεις προσδιορίστηκαν ως βακτηριακής προέλευσης, ενώ 124 και 64 προέρχονταν από αρχαία και ιούς, αντίστοιχα (Εικ. 4). Τα πιο άφθονα θραύσματα βακτηριακού DNA ήταν Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) και Bacteroidetes (17%) (Εικ. 4α). Αυτή η κατανομή είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες του μικροβιώματος του θαλάσσιου μπλε μυδιού [39, 40]. Τα γ-πρωτεοβακτήρια ήταν η κύρια κατηγορία των Πρωτεοβακτηρίων (44%), συμπεριλαμβανομένων πολλών Vibrionales (Εικ. 4b). Η μέθοδος ddPCR επιβεβαίωσε την παρουσία θραυσμάτων DNA Vibrio στο ccfDNA της αιμολέμφου A. atra (Εικ. 4c) [41]. Για να ληφθούν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την βακτηριακή προέλευση του ccfDNA, ακολουθήθηκε μια πρόσθετη προσέγγιση (Σχήμα S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Σε αυτήν την περίπτωση, οι αναγνώσεις που επικαλύπτονταν συγκεντρώθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαρωμένων άκρων και ταξινομήθηκαν ως αυτο-προέλευσης (δίθυρα) ή μη αυτο-προέλευσης χρησιμοποιώντας BLASTN και τιμή e 1e-3 και αποκοπή με ομολογία >90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι αναγνώσεις που επικαλύπτονταν συγκεντρώθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαρωμένων άκρων και ταξινομήθηκαν ως αυτο-προέλευσης (δίθυρα) ή μη αυτο-προέλευσης χρησιμοποιώντας BLASTN και τιμή e 1e-3 και αποκοπή με ομολογία >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со партными concami και были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) ή чужие по происхольждени 1e-3 и отсечения со гомологией> 90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι επικαλυπτόμενες αναγνώσεις συλλέχθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαρωμένων άκρων και ταξινομήθηκαν ως εγγενείς (δίθυρες) ή μη πρωτότυπες χρησιμοποιώντας BLASTN και τιμή e 1e-3 και αποκοπή με ομολογία >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 猿1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со партными concami και classificirovanы όπως μεσομπστβεννыε (двусчатые моллюски) ή несобственные блюще быль были и несобственные по происхолждени 1e-3 и порога τομολογίες> 90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι επικαλυπτόμενες αναγνώσεις συλλέχθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαρωμένων άκρων και ταξινομήθηκαν ως δικές τους (δίθυρες) ή μη πρωτότυπες χρησιμοποιώντας τιμές e BLASTN και 1e-3 και όριο ομολογίας >90%.Δεδομένου ότι το γονιδίωμα του A. atra δεν έχει ακόμη αλληλουχηθεί, χρησιμοποιήσαμε τη στρατηγική de novo συναρμολόγησης του συναρμολογητή αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) MEGAHIT. Συνολικά 147.188 contigs έχουν ταυτοποιηθεί ως εξαρτώμενα (δίθυρα) προέλευσης. Αυτά τα contigs στη συνέχεια αναλύθηκαν με τιμές e 1e-10 χρησιμοποιώντας BLASTN και BLASTX. Αυτή η στρατηγική μας επέτρεψε να ταυτοποιήσουμε 482 μη δίθυρα θραύσματα που υπάρχουν στο ccfDNA του A. atra. Περισσότερα από τα μισά (57%) αυτών των θραυσμάτων DNA ελήφθησαν από βακτήρια, κυρίως από συμβιωτικούς οργανισμούς βραγχίων, συμπεριλαμβανομένων των σουλφοτροφικών συμβιωτών, και από συμβιωτικούς οργανισμούς βραγχίων Solemya velum (Εικ. 5).
Σχετική αφθονία σε επίπεδο τύπου. Β Μικροβιακή ποικιλομορφία δύο κύριων φύλων (Firmicutes και Proteobacteria). Αντιπροσωπευτική ενίσχυση της ddPCR Γ Vibrio spp. Α. Θραύσματα του γονιδίου 16S rRNA (μπλε) σε τρεις αιμολέμφες atra.
Αναλύθηκαν συνολικά 482 συλλεγμένα contigs. Γενικό προφίλ της ταξινομικής κατανομής των μεταγονιδιωματικών σχολιασμών contig (προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά). Β Λεπτομερής κατανομή θραυσμάτων βακτηριακού DNA που ταυτοποιήθηκαν από BLASTN και BLASTX.
Η ανάλυση Kraken2 έδειξε επίσης ότι το ccfDNA των μυδιών περιείχε θραύσματα DNA αρχαίων, συμπεριλαμβανομένων θραυσμάτων DNA των Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) και Thaurmarcheota (11%) (Εικ. 6α). Η παρουσία θραυσμάτων DNA που προέρχονται από τα Euryarchaeota και Crenarchaeota, τα οποία είχαν βρεθεί προηγουμένως στη μικροβιακή κοινότητα των μυδιών της Καλιφόρνια, δεν θα πρέπει να αποτελεί έκπληξη [42]. Αν και τα Euryarchaeota συχνά συνδέονται με ακραίες συνθήκες, πλέον αναγνωρίζεται ότι τόσο τα Euryarchaeota όσο και τα Crenarcheota είναι από τα πιο κοινά προκαρυωτικά στο θαλάσσιο κρυογονικό περιβάλλον [43, 44]. Η παρουσία μεθανογόνων μικροοργανισμών στα μύδια δεν προκαλεί έκπληξη, δεδομένων των πρόσφατων αναφορών για εκτεταμένες διαρροές μεθανίου από διαρροές πυθμένα στο οροπέδιο Kerguelen [45] και την πιθανή παραγωγή μικροβιακού μεθανίου που παρατηρήθηκε στα ανοικτά των ακτών των Νήσων Kerguelen [46].
Στη συνέχεια, η προσοχή μας στράφηκε σε μετρήσεις από ιούς DNA. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη εκτός στόχου για την περιεκτικότητα σε ιούς των μυδιών. Όπως αναμενόταν, βρήκαμε θραύσματα DNA βακτηριοφάγων (Caudovirales) (Εικ. 6b). Ωστόσο, το πιο συνηθισμένο ιικό DNA προέρχεται από ένα φύλο πυρηνοκυτταροϊών, γνωστό και ως πυρηνικός κυτταροπλασματικός ιός μεγάλου DNA (NCLDV), ο οποίος έχει το μεγαλύτερο γονιδίωμα από οποιονδήποτε ιό. Μέσα σε αυτό το φύλο, οι περισσότερες αλληλουχίες DNA ανήκουν στις οικογένειες Mimimidoviridae (58%) και Poxviridae (21%), των οποίων οι φυσικοί ξενιστές περιλαμβάνουν σπονδυλωτά και αρθρόποδα, ενώ ένα μικρό ποσοστό αυτών των αλληλουχιών DNA ανήκει σε γνωστά ιολογικά φύκια. Μολύνει θαλάσσια ευκαρυωτικά φύκια. Οι αλληλουχίες ελήφθησαν επίσης από τον ιό Pandora, τον γιγαντιαίο ιό με το μεγαλύτερο μέγεθος γονιδιώματος από οποιοδήποτε γνωστό ιικό γένος. Είναι ενδιαφέρον ότι το εύρος των ξενιστών που είναι γνωστό ότι έχουν μολυνθεί με τον ιό, όπως προσδιορίστηκε με την αλληλούχιση αιμολεμφικού ccfDNA, ήταν σχετικά μεγάλο (Σχήμα S3, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Περιλαμβάνει ιούς που μολύνουν έντομα όπως οι Baculoviridae και οι Iridoviridae, καθώς και ιούς που μολύνουν αμοιβάδες, φύκια και σπονδυλωτά. Βρήκαμε επίσης αλληλουχίες που ταιριάζουν με το γονιδίωμα του Pithovirus sibericum. Οι πιτοϊοί (επίσης γνωστοί ως «ιοί ζόμπι») απομονώθηκαν για πρώτη φορά από μόνιμα παγωμένο έδαφος 30.000 ετών στη Σιβηρία [47]. Έτσι, τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι δεν έχουν εξαφανιστεί όλα τα σύγχρονα είδη αυτών των ιών [48] και ότι αυτοί οι ιοί μπορεί να υπάρχουν σε απομακρυσμένα υποαρκτικά θαλάσσια οικοσυστήματα.
Τέλος, εξετάσαμε αν μπορούσαμε να βρούμε θραύσματα DNA από άλλα πολυκύτταρα ζώα. Συνολικά 482 ξένα contigs ταυτοποιήθηκαν από τα BLASTN και BLASTX με βιβλιοθήκες nt, nr και RefSeq (γονιδιωματικές και πρωτεϊνικές). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μεταξύ των ξένων θραυσμάτων του ccfDNA πολυκύτταρων ζώων κυριαρχεί το DNA των οστών (Εικ. 5). Έχουν επίσης βρεθεί θραύσματα DNA από έντομα και άλλα είδη. Ένα σχετικά μεγάλο μέρος των θραυσμάτων DNA δεν έχει ταυτοποιηθεί, πιθανώς λόγω της υποεκπροσώπησης μεγάλου αριθμού θαλάσσιων ειδών στις γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων σε σύγκριση με τα χερσαία είδη [49].
Στην παρούσα εργασία, εφαρμόζουμε την έννοια του LB στα μύδια, υποστηρίζοντας ότι η αλληλούχιση του ccfDNA της αιμολέμφου μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τη σύνθεση των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι 1) η αιμολέμφος των μυδιών περιέχει σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις (επίπεδα μικρογραμμαρίων) σχετικά μεγάλων (~1-5 kb) κυκλοφορούντων θραυσμάτων DNA· 2) αυτά τα θραύσματα DNA είναι ανεξάρτητα και μη ανεξάρτητα· 3) Μεταξύ των ξένων πηγών αυτών των θραυσμάτων DNA, βρήκαμε βακτηριακό, αρχαϊκό και ιικό DNA, καθώς και DNA άλλων πολυκύτταρων ζώων· 4) Η συσσώρευση αυτών των ξένων θραυσμάτων ccfDNA στην αιμολέμφο συμβαίνει ταχέως και συμβάλλει στην εσωτερική δραστηριότητα φιλτραρίσματος των μυδιών. Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια του LB, η οποία μέχρι στιγμής έχει εφαρμοστεί κυρίως στον τομέα της βιοϊατρικής, κωδικοποιεί μια πλούσια αλλά ανεξερεύνητη πηγή γνώσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ειδών-φρουρών και του περιβάλλοντός τους.
Εκτός από τα πρωτεύοντα, έχει αναφερθεί απομόνωση ccfDNA σε θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων ποντικών, σκύλων, γατών και αλόγων [50, 51, 52]. Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, η μελέτη μας είναι η πρώτη που αναφέρει την ανίχνευση και την αλληλούχιση του ccfDNA σε θαλάσσια είδη με σύστημα ανοιχτής κυκλοφορίας. Αυτό το ανατομικό χαρακτηριστικό και η ικανότητα φιλτραρίσματος των μυδιών μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να εξηγήσει τα διαφορετικά χαρακτηριστικά μεγέθους των κυκλοφορούντων θραυσμάτων DNA σε σύγκριση με άλλα είδη. Στους ανθρώπους, τα περισσότερα θραύσματα DNA που κυκλοφορούν στο αίμα είναι μικρά θραύσματα που κυμαίνονται σε μέγεθος από 150 έως 200 bp με μέγιστη κορυφή 167 bp [34, 53]. Ένα μικρό αλλά σημαντικό μέρος των θραυσμάτων DNA έχει μέγεθος μεταξύ 300 και 500 bp και περίπου το 5% είναι μεγαλύτερο από 900 bp. [54]. Ο λόγος για αυτήν την κατανομή μεγέθους είναι ότι η κύρια πηγή του ccfDNA στο πλάσμα εμφανίζεται ως αποτέλεσμα του κυτταρικού θανάτου, είτε λόγω κυτταρικού θανάτου είτε λόγω νέκρωσης των κυκλοφορούντων αιμοποιητικών κυττάρων σε υγιή άτομα ή λόγω απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο (γνωστό ως κυκλοφορούν DNA όγκου). Η κατανομή μεγέθους του αιμολεμφικού ccfDNA που βρήκαμε στα μύδια κυμαινόταν από 1000 έως 5000 bp, υποδηλώνοντας ότι το ccfDNA των μυδιών έχει διαφορετική προέλευση. Αυτή είναι μια λογική υπόθεση, καθώς τα μύδια έχουν ημι-ανοιχτό αγγειακό σύστημα και ζουν σε θαλάσσια υδάτινα περιβάλλοντα που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις μικροβιακού γονιδιωματικού DNA. Στην πραγματικότητα, τα εργαστηριακά μας πειράματα με εξωγενές DNA έχουν δείξει ότι τα μύδια συσσωρεύουν θραύσματα DNA στο θαλασσινό νερό, τουλάχιστον μετά από λίγες ώρες αποικοδομούνται μετά την κυτταρική πρόσληψη ή/και απελευθερώνονται ή/και αποθηκεύονται σε διάφορους οργανισμούς. Δεδομένης της σπανιότητας των κυττάρων (τόσο των προκαρυωτικών όσο και των ευκαρυωτικών), η χρήση ενδοθυριδικών διαμερισμάτων θα μειώσει την ποσότητα του ccfDNA από αυτοφυείς πηγές καθώς και από ξένες πηγές. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της έμφυτης ανοσίας των δίθυρων και τον μεγάλο αριθμό κυκλοφορούντων φαγοκυττάρων, υποθέσαμε περαιτέρω ότι ακόμη και το ξένο ccfDNA είναι εμπλουτισμένο στα κυκλοφορούντα φαγοκύτταρα που συσσωρεύουν ξένο DNA κατά την κατάποση μικροοργανισμών ή/και κυτταρικών υπολειμμάτων. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ccfDNA της δίθυρης αιμολέμφου είναι ένα μοναδικό αποθετήριο μοριακών πληροφοριών και ενισχύει την ιδιότητά τους ως είδος-φρουρός.
Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αλληλούχιση και η ανάλυση θραυσμάτων αιμολεμφικού ccfDNA που προέρχονται από βακτήρια μπορούν να παράσχουν βασικές πληροφορίες σχετικά με τη βακτηριακή χλωρίδα του ξενιστή και τα βακτήρια που υπάρχουν στο περιβάλλον θαλάσσιο οικοσύστημα. Οι τεχνικές αλληλούχισης με βολή έχουν αποκαλύψει αλληλουχίες των συμβιωτικών βακτηρίων A. atra στα βράγχια που θα είχαν χαθεί εάν είχαν χρησιμοποιηθεί συμβατικές μέθοδοι ταυτοποίησης 16S rRNA, εν μέρει λόγω μεροληψίας βιβλιοθήκης αναφοράς. Στην πραγματικότητα, η χρήση δεδομένων LB που συλλέχθηκαν από το M. platensis στο ίδιο στρώμα μυδιών στο Kerguelen έδειξε ότι η σύνθεση των βακτηριακών συμβιωτών που σχετίζονται με τα βράγχια ήταν η ίδια και για τα δύο είδη μυδιών (Εικ. S4, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Αυτή η ομοιότητα δύο γενετικά διαφορετικών μυδιών μπορεί να αντανακλά τη σύνθεση των βακτηριακών κοινοτήτων στις ψυχρές, θειούχες και ηφαιστειακές αποθέσεις του Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Υψηλότερα επίπεδα μικροοργανισμών που μειώνουν το θείο έχουν περιγραφεί καλά κατά τη συλλογή μυδιών από βιοτουρβωμένες παράκτιες περιοχές [59], όπως οι ακτές του Port-au-France. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η χλωρίδα των συμβιωτικών μυδιών μπορεί να επηρεάζεται από οριζόντια μετάδοση [60, 61]. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ του θαλάσσιου περιβάλλοντος, της επιφάνειας του βυθού και της σύνθεσης των συμβιωτικών βακτηρίων στα μύδια. Αυτές οι μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη.
Το μήκος και η συγκέντρωση του αιμολεμφικού ccfDNA, η ευκολία καθαρισμού του και η υψηλή ποιότητά του που επιτρέπει την ταχεία αλληλούχιση με βολβό είναι μερικά από τα πολλά πλεονεκτήματα της χρήσης του ccfDNA μυδιών για την αξιολόγηση της βιοποικιλότητας σε θαλάσσια παράκτια οικοσυστήματα. Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για τον χαρακτηρισμό ιικών κοινοτήτων (ιώματα) σε ένα δεδομένο οικοσύστημα [62, 63]. Σε αντίθεση με τα βακτήρια, τα αρχαία και τα ευκαρυωτικά, τα ιικά γονιδιώματα δεν περιέχουν φυλογενετικά διατηρημένα γονίδια όπως οι αλληλουχίες 16S. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι υγρές βιοψίες από είδη-δείκτες όπως τα μύδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση σχετικά μεγάλου αριθμού θραυσμάτων ιού ccfDNA που είναι γνωστό ότι μολύνουν ξενιστές που συνήθως κατοικούν σε παράκτια θαλάσσια οικοσυστήματα. Αυτό περιλαμβάνει ιούς που είναι γνωστό ότι μολύνουν πρωτόζωα, αρθρόποδα, έντομα, φυτά και βακτηριακούς ιούς (π.χ. βακτηριοφάγους). Παρόμοια κατανομή βρέθηκε όταν εξετάσαμε το ιώμα αιμολεμφικού ccfDNA των μπλε μυδιών (M. platensis) που συλλέχθηκε στο ίδιο στρώμα μυδιών στο Kerguelen (Πίνακας S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Η αλληλούχιση του ccfDNA με ιοντίζουσα ορμή είναι πράγματι μια νέα προσέγγιση που κερδίζει έδαφος στη μελέτη του ιού των ανθρώπων ή άλλων ειδών [21, 37, 64]. Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τη μελέτη ιών δίκλωνου DNA, καθώς κανένα μεμονωμένο γονίδιο δεν διατηρείται μεταξύ όλων των ιών δίκλωνου DNA, αντιπροσωπεύοντας την πιο ποικίλη και ευρεία κατηγορία ιών στη Βαλτιμόρη [65]. Αν και οι περισσότεροι από αυτούς τους ιούς παραμένουν αταξινόμητοι και μπορεί να περιλαμβάνουν ιούς από ένα εντελώς άγνωστο μέρος του ιικού κόσμου [66], διαπιστώσαμε ότι τα ιώματα και οι περιοχές ξενιστών των μυδιών A. atra και M. platensis εμπίπτουν μεταξύ των δύο ειδών, ομοίως (βλ. σχήμα S3, πρόσθετες πληροφορίες). Αυτή η ομοιότητα δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς μπορεί να αντανακλά την έλλειψη επιλεκτικότητας στην πρόσληψη DNA που υπάρχει στο περιβάλλον. Μελλοντικές μελέτες που χρησιμοποιούν καθαρό RNA είναι επί του παρόντος απαραίτητες για τον χαρακτηρισμό του ιού RNA.
Στη μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε μια πολύ αυστηρή διαδικασία βασισμένη στο έργο του Kowarski και των συναδέλφων του [37], οι οποίοι χρησιμοποίησαν μια διαγραφή δύο σταδίων των συγκεντρωμένων αναγνώσεων και των συνεχόμενων τμημάτων πριν και μετά τη συναρμολόγηση του εγγενούς ccfDNA, με αποτέλεσμα ένα υψηλό ποσοστό μη χαρτογραφημένων αναγνώσεων. Επομένως, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι ορισμένες από αυτές τις μη χαρτογραφημένες αναγνώσεις μπορεί να έχουν ακόμα τη δική τους προέλευση, κυρίως επειδή δεν έχουμε γονιδίωμα αναφοράς για αυτό το είδος μυδιού. Χρησιμοποιήσαμε επίσης αυτήν την διαδικασία επειδή ανησυχούσαμε για τις χίμαιρες μεταξύ των αυτοαναγνώσεων και των μη αυτοαναγνώσεων και τα μήκη ανάγνωσης που δημιουργούνται από το Illumina MiSeq PE75. Ένας άλλος λόγος για την πλειονότητα των αχαρτογράφητων αναγνώσεων είναι ότι πολλά από τα θαλάσσια μικρόβια, ειδικά σε απομακρυσμένες περιοχές όπως το Kerguelen, δεν έχουν σχολιαστεί. Χρησιμοποιήσαμε το Illumina MiSeq PE75, υποθέτοντας μήκη θραυσμάτων ccfDNA παρόμοια με το ανθρώπινο ccfDNA. Για μελλοντικές μελέτες, δεδομένων των αποτελεσμάτων μας που δείχνουν ότι το ccfDNA της αιμολεμφικής ccfDNA έχει μεγαλύτερες αναγνώσεις από τους ανθρώπους ή/και τα θηλαστικά, συνιστούμε τη χρήση μιας πλατφόρμας αλληλούχισης που είναι πιο κατάλληλη για μεγαλύτερα θραύσματα ccfDNA. Αυτή η πρακτική θα διευκολύνει πολύ τον εντοπισμό περισσότερων ενδείξεων για βαθύτερη ανάλυση. Η απόκτηση της μη διαθέσιμης πλήρους αλληλουχίας πυρηνικού γονιδιώματος του A. atra θα διευκόλυνε επίσης σημαντικά τη διάκριση του ccfDNA από αυτοφυείς και μη αυτοφυείς πηγές. Δεδομένου ότι η έρευνά μας έχει επικεντρωθεί στη δυνατότητα εφαρμογής της έννοιας της υγρής βιοψίας σε μύδια, ελπίζουμε ότι καθώς αυτή η έννοια χρησιμοποιείται σε μελλοντική έρευνα, θα αναπτυχθούν νέα εργαλεία και αγωγοί για να αυξηθούν οι δυνατότητες αυτής της μεθόδου για τη μελέτη της μικροβιακής ποικιλομορφίας των μυδιών. θαλάσσιο οικοσύστημα.
Ως μη επεμβατικός κλινικός βιοδείκτης, τα αυξημένα επίπεδα ccfDNA στο ανθρώπινο πλάσμα σχετίζονται με διάφορες ασθένειες, βλάβες ιστών και καταστάσεις στρες [67,68,69]. Αυτή η αύξηση σχετίζεται με την απελευθέρωση θραυσμάτων DNA ίδιας προέλευσης μετά από βλάβη ιστών. Αντιμετωπίσαμε αυτό το ζήτημα χρησιμοποιώντας οξεία θερμική καταπόνηση, κατά την οποία τα μύδια εκτέθηκαν για λίγο σε θερμοκρασία 30 °C. Πραγματοποιήσαμε αυτήν την ανάλυση σε τρεις διαφορετικούς τύπους μυδιών σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ωστόσο, δεν βρήκαμε καμία αλλαγή στα επίπεδα ccfDNA μετά από οξεία θερμική καταπόνηση (βλ. Σχήμα S5, πρόσθετες πληροφορίες). Αυτή η ανακάλυψη μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, το γεγονός ότι τα μύδια έχουν ημι-ανοιχτό κυκλοφορικό σύστημα και συσσωρεύουν μεγάλες ποσότητες ξένου DNA λόγω της υψηλής δραστικότητας φιλτραρίσματος. Από την άλλη πλευρά, τα μύδια, όπως πολλά ασπόνδυλα, μπορεί να είναι πιο ανθεκτικά στη βλάβη των ιστών που προκαλείται από το στρες, περιορίζοντας έτσι την απελευθέρωση ccfDNA στην αιμολέμφο τους [70, 71].
Μέχρι σήμερα, η ανάλυση DNA της βιοποικιλότητας σε υδάτινα οικοσυστήματα έχει επικεντρωθεί κυρίως στην μεταγραμματοποίηση του περιβαλλοντικού DNA (eDNA). Ωστόσο, αυτή η μέθοδος συνήθως περιορίζεται στην ανάλυση βιοποικιλότητας όταν χρησιμοποιούνται εκκινητές. Η χρήση της αλληλούχισης shotgun παρακάμπτει τους περιορισμούς της PCR και την μεροληπτική επιλογή συνόλων εκκινητών. Έτσι, κατά μία έννοια, η μέθοδός μας είναι πιο κοντά στην πρόσφατα χρησιμοποιούμενη μέθοδο αλληλούχισης Shotgun eDNA υψηλής απόδοσης, η οποία είναι σε θέση να αλληλουχήσει άμεσα το κατακερματισμένο DNA και να αναλύσει σχεδόν όλους τους οργανισμούς [72, 73]. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένα θεμελιώδη ζητήματα που διακρίνουν την LB από τις τυπικές μεθόδους eDNA. Φυσικά, η κύρια διαφορά μεταξύ του eDNA και της LB είναι η χρήση φυσικών ξενιστών φίλτρου. Έχει αναφερθεί η χρήση θαλάσσιων ειδών όπως τα σφουγγάρια και τα δίθυρα (Dresseina spp.) ως φυσικού φίλτρου για τη μελέτη του eDNA [74, 75]. Ωστόσο, η μελέτη του Dreissena χρησιμοποίησε βιοψίες ιστών από τις οποίες εξήχθη DNA. Η ανάλυση του ccfDNA από το LB δεν απαιτεί βιοψία ιστού, εξειδικευμένο και μερικές φορές ακριβό εξοπλισμό και υλικοτεχνική υποστήριξη που σχετίζεται με το eDNA ή τη βιοψία ιστού. Μάλιστα, πρόσφατα αναφέραμε ότι το ccfDNA από το LB μπορεί να αποθηκευτεί και να αναλυθεί με υποστήριξη FTA χωρίς να διατηρείται ψυχρή αλυσίδα, η οποία αποτελεί σημαντική πρόκληση για την έρευνα σε απομακρυσμένες περιοχές [76]. Η εξαγωγή ccfDNA από υγρές βιοψίες είναι επίσης απλή και παρέχει DNA υψηλής ποιότητας για αλληλούχιση shotgun και ανάλυση PCR. Αυτό είναι ένα μεγάλο πλεονέκτημα δεδομένων ορισμένων τεχνικών περιορισμών που σχετίζονται με την ανάλυση eDNA [77]. Η απλότητα και το χαμηλό κόστος της μεθόδου δειγματοληψίας είναι επίσης ιδιαίτερα κατάλληλα για μακροπρόθεσμα προγράμματα παρακολούθησης. Εκτός από την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος, ένα άλλο γνωστό χαρακτηριστικό των δίθυρων είναι η χημική σύνθεση βλεννοπολυσακχαριτών της βλέννας τους, η οποία προάγει την απορρόφηση ιών [78, 79]. Αυτό καθιστά τα δίθυρα ένα ιδανικό φυσικό φίλτρο για τον χαρακτηρισμό της βιοποικιλότητας και των επιπτώσεων της κλιματικής αλλαγής σε ένα δεδομένο υδάτινο οικοσύστημα. Αν και η παρουσία θραυσμάτων DNA που προέρχονται από τον ξενιστή μπορεί να θεωρηθεί ως περιορισμός της μεθόδου σε σύγκριση με το eDNA, το κόστος που σχετίζεται με την ύπαρξη ενός τέτοιου φυσικού ccfDNA σε σύγκριση με το eDNA είναι ταυτόχρονα κατανοητό για την τεράστια ποσότητα πληροφοριών που είναι διαθέσιμες για μελέτες υγείας. Αυτό περιλαμβάνει την παρουσία ιικών αλληλουχιών ενσωματωμένων στο γονιδίωμα του ξενιστή. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα μύδια, δεδομένης της παρουσίας οριζόντια μεταδιδόμενων λευχαιμικών ρετροϊών στα δίθυρα [80, 81]. Ένα άλλο πλεονέκτημα του LB έναντι του eDNA είναι ότι εκμεταλλεύεται τη φαγοκυτταρική δραστηριότητα των κυκλοφορούντων αιμοσφαιρίων στην αιμολέμφο, η οποία κατακλύζει τους μικροοργανισμούς (και τα γονιδιώματά τους). Η φαγοκυττάρωση είναι η κύρια λειτουργία των αιμοσφαιρίων στα δίθυρα [82]. Τέλος, η μέθοδος εκμεταλλεύεται την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος των μυδιών (μέσος όρος 1,5 l/h θαλασσινού νερού) και την κυκλοφορία δύο ημερών, που αυξάνουν την ανάμειξη διαφορετικών στρωμάτων θαλασσινού νερού, επιτρέποντας τη σύλληψη ετερόλογου eDNA. [83, 84]. Έτσι, η ανάλυση του ccfDNA των μυδιών αποτελεί μια ενδιαφέρουσα οδό δεδομένων των διατροφικών, οικονομικών και περιβαλλοντικών επιπτώσεων των μυδιών. Παρόμοια με την ανάλυση του LB που συλλέγεται από ανθρώπους, αυτή η μέθοδος ανοίγει επίσης τη δυνατότητα μέτρησης γενετικών και επιγενετικών αλλαγών στο DNA του ξενιστή σε απόκριση σε εξωγενείς ουσίες. Για παράδειγμα, μπορούν να προβλεφθούν τεχνολογίες αλληλούχισης τρίτης γενιάς για την εκτέλεση ανάλυσης μεθυλίωσης σε ολόκληρο το γονιδίωμα σε φυσικό ccfDNA χρησιμοποιώντας αλληλούχιση νανοπόρων. Αυτή η διαδικασία θα πρέπει να διευκολυνθεί από το γεγονός ότι το μήκος των θραυσμάτων ccfDNA των μυδιών είναι ιδανικά συμβατό με πλατφόρμες αλληλούχισης μακράς ανάγνωσης που επιτρέπουν την ανάλυση μεθυλίωσης DNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα από μία μόνο εκτέλεση αλληλούχισης χωρίς την ανάγκη χημικών μετασχηματισμών.85,86] Αυτή είναι μια ενδιαφέρουσα πιθανότητα, καθώς έχει αποδειχθεί ότι τα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA αντανακλούν μια απόκριση στο περιβαλλοντικό στρες και επιμένουν για πολλές γενιές. Επομένως, μπορεί να παρέχει πολύτιμη εικόνα για τους υποκείμενους μηχανισμούς που διέπουν την απόκριση μετά από έκθεση σε κλιματική αλλαγή ή ρύπους [87]. Ωστόσο, η χρήση του LB δεν είναι χωρίς περιορισμούς. Περιττό να πούμε ότι αυτό απαιτεί την παρουσία δεικτών ειδών στο οικοσύστημα. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η χρήση του LB για την αξιολόγηση της βιοποικιλότητας ενός δεδομένου οικοσυστήματος απαιτεί επίσης μια αυστηρή βιοπληροφορική διαδικασία που λαμβάνει υπόψη την παρουσία θραυσμάτων DNA από την πηγή. Ένα άλλο σημαντικό πρόβλημα είναι η διαθεσιμότητα γονιδιωμάτων αναφοράς για θαλάσσια είδη. Ελπίζεται ότι πρωτοβουλίες όπως το Marine Mammal Genomes Project και το πρόσφατα ιδρυθέν έργο Fish10k [88] θα διευκολύνουν μια τέτοια ανάλυση στο μέλλον. Η εφαρμογή της έννοιας του LB σε θαλάσσιους οργανισμούς που τρέφονται με φίλτρα είναι επίσης συμβατή με τις τελευταίες εξελίξεις στην τεχνολογία αλληλούχισης, καθιστώντας την κατάλληλη για την ανάπτυξη βιοδεικτών πολλαπλών ohm για την παροχή σημαντικών πληροφοριών σχετικά με την υγεία των θαλάσσιων οικοτόπων σε απόκριση στο περιβαλλοντικό στρες.
Τα δεδομένα αλληλούχισης γονιδιώματος έχουν κατατεθεί στο Αρχείο Ανάγνωσης Αλληλουχίας NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 στην ενότητα Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής στη θαλάσσια ζωή και τα οικοσυστήματα. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Εξετάστε τις συνδυασμένες επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής και άλλων τοπικών παραγόντων στρες στο θαλάσσιο περιβάλλον. γενικό επιστημονικό περιβάλλον. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Επιστήμη της πρώτης Μαρτίου. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Η μειωμένη ανοχή στη θερμότητα υπό συνθήκες επαναλαμβανόμενης θερμικής καταπόνησης εξηγεί την υψηλή θνησιμότητα των μπλε μυδιών το καλοκαίρι. Επιστημονική έκθεση 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Πρόσφατες αλλαγές στη συχνότητα, τα αίτια και την έκταση των θανάτων ζώων. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Πολλαπλά παθογόνα μη ειδικά για το είδος μπορεί να έχουν προκαλέσει μαζική θνησιμότητα του Pinna nobilis. Ζωή. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Πιθανός αντίκτυπος της κλιματικής αλλαγής στις ζωονόσους της Αρκτικής. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Μπλε μύδια (Mytilus edulis spp.) ως οργανισμοί-σηματοδότης στην παρακολούθηση της παράκτιας ρύπανσης: μια ανασκόπηση. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Ενσωμάτωση της υγρής βιοψίας στη θεραπεία του καρκίνου. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Ωρίμανση υγρής βιοψίας: Επιτρέπει την κυκλοφορία του DNA του όγκου. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Νουκλεϊκά οξέα σε ανθρώπινο πλάσμα. Πρακτικά συνεδριάσεων των θυγατρικών της Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ένας νέος ρόλος για το DNA χωρίς κύτταρα ως μοριακός δείκτης για τη θεραπεία του καρκίνου. Ποσοτικοποίηση της βιομοριακής ανάλυσης. 2019;17:100087.
Ιγνατιάδης Μ., Sledge GW, Jeffrey SS Η υγρή βιοψία εισέρχεται στην κλινική – ζητήματα εφαρμογής και μελλοντικές προκλήσεις. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW και άλλοι. Εμβρυϊκό DNA υπάρχει στο μητρικό πλάσμα και ορό. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Μελέτη της πορείας της εγκυμοσύνης και των επιπλοκών της χρησιμοποιώντας κυκλοφορούν εξωκυτταρικό RNA στο αίμα γυναικών κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Υγρή βιοψία: DNA χωρίς κύτταρα δότη χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αλλογενών αλλοιώσεων σε νεφρικό μόσχευμα. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Καινοτομίες στην προγεννητική διάγνωση: αλληλούχιση γονιδιώματος μητρικού πλάσματος. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Ταχεία ανίχνευση παθογόνων με μεταγονιδιωματική αλληλούχιση επόμενης γενιάς μολυσμένων σωματικών υγρών. Nat Medicine. 2021;27:115-24.