Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A biopsia líquida (BL) é un concepto que está a gañar popularidade rapidamente no campo biomédico. O concepto baséase principalmente na detección de fragmentos de ADN extracelular circulante (ADNcc), que se liberan principalmente como pequenos fragmentos despois da morte celular en varios tecidos. Unha pequena proporción destes fragmentos provén de tecidos ou organismos alleos (estranxeiros). No traballo actual, aplicamos este concepto aos mexillóns, unha especie sentinela coñecida pola súa alta capacidade de filtración de auga de mar. Usamos a capacidade dos mexillóns para actuar como filtros naturais para capturar fragmentos de ADN ambiental dunha variedade de fontes para proporcionar información sobre a biodiversidade dos ecosistemas costeiros mariños. Os nosos resultados mostran que a hemolinfa do mexillón contén fragmentos de ADN que varían moito en tamaño, de 1 a 5 kb. A secuenciación por escopeta mostrou que un gran número de fragmentos de ADN son de orixe microbiana allea. Entre eles, atopamos fragmentos de ADN de bacterias, arqueas e virus, incluídos virus que se sabe que infectan unha variedade de hóspedes que se atopan habitualmente nos ecosistemas mariños costeiros. En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto de LB aplicado aos mexillóns representa unha fonte de coñecemento rica pero aínda inexplorada sobre a diversidade microbiana nos ecosistemas mariños costeiros.
O impacto do cambio climático (CC) na biodiversidade dos ecosistemas mariños é unha área de investigación en rápido crecemento. O quecemento global non só causa importantes estreses fisiolóxicos, senón que tamén empurra os límites evolutivos da estabilidade térmica dos organismos mariños, afectando o hábitat dun gran número de especies, o que as leva a buscar condicións máis favorables [1, 2]. Ademais de afectar a biodiversidade dos metazoos, o CC altera o delicado equilibrio das interaccións hóspede-microbiano. Esta disbacteriose microbiana supón unha seria ameaza para os ecosistemas mariños, xa que fai que os organismos mariños sexan máis susceptibles aos patóxenos infecciosos [3, 4]. Crese que os SS xogan un papel importante nas mortes masivas, o que supón un problema grave para a xestión dos ecosistemas mariños globais [5, 6]. Esta é unha cuestión importante dados os impactos económicos, ecolóxicos e nutricionais de moitas especies mariñas. Isto é especialmente certo para os bivalvos que viven nas rexións polares, onde os efectos do CK son máis inmediatos e graves [6, 7]. De feito, bivalvos como Mytilus spp. utilízanse amplamente para monitorizar os efectos do CC nos ecosistemas mariños. Non é de estrañar que se desenvolvese un número relativamente grande de biomarcadores para monitorizar a súa saúde, a miúdo empregando unha abordaxe de dous niveis que inclúe biomarcadores funcionais baseados na actividade encimática ou en funcións celulares como a viabilidade celular e a actividade fagocítica [8]. Estes métodos tamén inclúen a medición da concentración de indicadores de presión específicos que se acumulan nos tecidos brandos despois da absorción de grandes cantidades de auga de mar. Non obstante, a alta capacidade de filtración e o sistema circulatorio semiaberto dos bivalvos ofrecen a oportunidade de desenvolver novos biomarcadores da hemolinfa empregando o concepto de biopsia líquida (LB), unha abordaxe sinxela e minimamente invasiva para a xestión de pacientes. mostras de sangue [9, 10]. Aínda que se poden atopar varios tipos de moléculas circulantes no LB humano, este concepto baséase principalmente na análise de secuenciación de ADN de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA) no plasma. De feito, a presenza de ADN circulante no plasma humano coñécese desde mediados do século XX [11], pero só nos últimos anos a chegada dos métodos de secuenciación de alto rendemento levou ao diagnóstico clínico baseado no ccfDNA. A presenza destes fragmentos de ADN circulante débese en parte á liberación pasiva de ADN xenómico (nuclear e mitocondrial) despois da morte celular. En individuos sans, a concentración de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), pero pode aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patoloxías ou están sometidos a estrés, o que provoca danos nos tecidos. En individuos sans, a concentración de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), pero pode aumentar de 5 a 10 veces en pacientes que padecen diversas patoloxías ou están sometidos a estrés, o que provoca danos nos tecidos. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться повышаться 10 в больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. En persoas sas, a concentración de cccDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), pero pode aumentar de 5 a 10 veces en pacientes con diversas patoloxías ou baixo estrés que provoca danos nos tecidos.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滍炟在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 掅理 或 掅理 或 手中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны 10 увеличе ны пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. As concentracións de ccfDNA adoitan ser baixas (<10 ng/ml) en individuos sans, pero poden aumentar entre 5 e 10 veces en pacientes con diversas patoloxías ou estrés, o que provoca danos nos tecidos.O tamaño dos fragmentos de ccfDNA varía moito, pero normalmente oscila entre os 150 e os 200 pb. [12]. A análise de ccfDNA autoderivado, é dicir, ccfDNA de células hóspedes normais ou transformadas, pódese empregar para detectar cambios xenéticos e epixenéticos presentes no xenoma nuclear e/ou mitocondrial, axudando así aos médicos a seleccionar terapias específicas dirixidas a moleculares [13]. Non obstante, o ccfDNA pódese obter de fontes alleas, como o ccfDNA de células fetais durante o embarazo ou de órganos transplantados [14,15,16,17]. O ccfDNA tamén é unha fonte importante de información para detectar a presenza de ácidos nucleicos dun axente infeccioso (estraño), o que permite a detección non invasiva de infeccións xeneralizadas non identificadas por hemocultivos, evitando a biopsia invasiva do tecido infectado [18]. Estudos recentes demostraron que o sangue humano contén unha rica fonte de información que se pode empregar para identificar patóxenos virais e bacterianos, e que aproximadamente o 1 % do ccfDNA atopado no plasma humano é de orixe allea [19]. Estes estudos demostran que a biodiversidade do microbioma circulante dun organismo pódese avaliar mediante a análise de ccfDNA. Non obstante, ata hai pouco, este concepto utilizábase exclusivamente en humanos e, en menor medida, noutros vertebrados [20, 21].
No presente artigo, empregamos o potencial LB para analizar o ccfDNA de Aulacomya atra, unha especie meridional que se atopa habitualmente nas illas Kerguelen subantárticas, un grupo de illas situadas na cima dunha gran meseta que se formou hai 35 millóns de anos nunha erupción volcánica. Usando un sistema experimental in vitro, descubrimos que os fragmentos de ADN da auga do mar son absorbidos rapidamente polos mexillóns e entran no compartimento da hemolinfa. A secuenciación por escopeta demostrou que o ccfDNA da hemolinfa do mexillón contén fragmentos de ADN de orixe propia e non propia, incluíndo bacterias simbióticas e fragmentos de ADN de biomas típicos dos ecosistemas costeiros mariños volcánicos fríos. O ccfDNA da hemolinfa tamén contén secuencias virais derivadas de virus con diferentes rangos de hóspedes. Tamén atopamos fragmentos de ADN de animais multicelulares como peixes óseos, anemones de mar, algas e insectos. En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto LB pódese aplicar con éxito a invertebrados mariños para xerar un rico repertorio xenómico nos ecosistemas mariños.
Recolléronse adultos (55-70 mm de lonxitude) de Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) das costas rochosas intermareais de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Illas Kerguelen en decembro de 2018. Outros mexillóns azuis adultos (Mytilus spp.) obtivéronse dun provedor comercial (PEI Mussel King Inc., Illa do Príncipe Eduardo, Canadá) e colocáronse nun tanque aireado con temperatura controlada (4 °C) que contiña de 10 a 20 L de salmoira artificial ao 32‰ (sal mariña artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virxinia, EUA). Para cada experimento, medíronse a lonxitude e o peso das cunchas individuais.
Un protocolo de acceso aberto e gratuíto para este programa está dispoñible en liña (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). En resumo, a hemolinfa LB recolleuse dos músculos abductores como se describe [22]. A hemolinfa clarificouse mediante centrifugación a 1200 × g durante 3 minutos e o sobrenadante conxelouse (-20 °C) ata o seu uso. Para o illamento e a purificación do cfDNA, as mostras (1,5-2,0 ml) descongeláronse e procesáronse usando o kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segundo as instrucións do fabricante. O ccfDNA almacenouse a -80 °C ata a súa análise posterior. Nalgúns experimentos, o ccfDNA illouse e purificouse usando o kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadá). O ADN purificado cuantificouse usando un ensaio estándar PicoGreen. A distribución de fragmentos do ccfDNA illado analizouse mediante electroforese capilar empregando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) e un kit de ADN de alta sensibilidade. O ensaio realizouse con 1 µl da mostra de ccfDNA segundo as instrucións do fabricante.
Para a secuenciación de fragmentos de ADNc de hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparou bibliotecas de escopeta usando o kit Illumina DNA Mix do kit Illumina MiSeq PE75. Utilizouse un adaptador estándar (BioO). Os ficheiros de datos brutos están dispoñibles no Arquivo de Lectura de Secuencias do NCBI (SRR8924808 e SRR8924809). A calidade da lectura básica avaliouse usando FastQC [23]. Utilizouse Trimmomatic [24] para adaptadores de recorte e lecturas de mala calidade. As lecturas de escopeta con extremos emparellados combináronse mediante FLASH en lecturas únicas máis longas cunha superposición mínima de 20 pb para evitar desaxustes [25]. As lecturas fusionadas foron anotadas con BLASTN usando unha base de datos de taxonomía do NCBI de bivalvos (valor de e < 1e−3 e 90 % de homoloxía) e o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade realizouse usando DUST [26]. As lecturas fusionadas foron anotadas con BLASTN usando unha base de datos de taxonomía do NCBI de bivalvos (valor de e < 1e−3 e 90 % de homoloxía) e o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade realizouse usando DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 e 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй сложности было выполнено с использованием PO [26]. As lecturas agrupadas anotáronse con BLASTN usando a base de datos de taxonomía de bivalvos do NCBI (valor de e < 1e-3 e 90 % de homoloxía) e o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade realizouse usando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌并的诌数］，数，D62进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 Ｈ 读数 Ｈ 注释 合并 读数 Ｈ 62进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой Ѕнотированы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй носитель сложности было выполнено с использованием PO [26]. As lecturas agrupadas anotáronse con BLASTN usando a base de datos taxonómica de bivalvos do NCBI (valor de e <1e-3 e 90 % de homoloxía) e o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade realizouse usando DUST [26].As lecturas dividíronse en dous grupos: relacionadas con secuencias de bivalvos (aquí chamadas autolecturas) e non relacionadas (non autolecturas). Dous grupos foron ensamblados por separado usando MEGAHIT para xerar contigs [27]. Mentres tanto, a distribución taxonómica das lecturas do microbioma alleo clasificouse usando Kraken2 [28] e representouse graficamente mediante un gráfico circular de Krona en Galaxy [29, 30]. Determinouse que os kmers óptimos eran os kmers-59 a partir dos nosos experimentos preliminares. Os autocontigs identificáronse mediante aliñamento con BLASTN (base de datos de bivalvos NCBI, valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía) para unha anotación final. Os autocontigs identificáronse mediante aliñamento con BLASTN (base de datos de bivalvos NCBI, valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía) para unha anotación final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытх двхуставо моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Os autocontigs identificáronse mediante a súa correspondencia con BLASTN (base de datos de bivalvos do NCBI, valor de e <1e-10 e 60 % de homoloxía) para a anotación final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сол BLAS данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Os autocontigs identificáronse para a anotación final mediante a súa correspondencia con BLASTN (base de datos de bivalvos do NCBI, valor de e <1e-10 e 60 % de homoloxía). En paralelo, os contigs de grupos non propios foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía). En paralelo, os contigs de grupos non propios foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данннач, e non <1e-10 e гомология 60%). En paralelo, os contigs de grupos alleos foron anotados con BLASTN (base de datos NT NCBI, valor de e <1e-10 e 60 % de homoloxía).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью назна NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). En paralelo, os contigs de grupos non propios foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor de e <1e-10 e 60 % de homoloxía). Tamén se realizou BLASTX en contigs non propios empregando as bases de datos NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía). Tamén se realizou BLASTX en contigs non propios empregando as bases de datos NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor de e < 1e−10 e 60 % de homoloxía). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq nr e <1e-10 и гомология 60%). Tamén se realizou BLASTX en contigs non propios empregando as bases de datos de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor de e < 1e-10 e 60 % de homoloxía).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０ 性 60 %。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０ 性 60 %。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC e nr BI (Ref. <1e-10 e гомология 60%). Tamén se realizou BLASTX en contigs non propios empregando as bases de datos de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor de e <1e-10 e 60 % de homoloxía).Os conxuntos BLASTN e BLASTX de contigs non propios representan os contigs finais (véxase o ficheiro complementario).
Os cebadores empregados para a PCR indícanse na Táboa S1. A ADN polimerase Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) empregouse para amplificar os xenes diana do ccfDNA. Empregáronse as seguintes condicións de reacción: desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, 95 °C durante 1 minuto, temperatura de hibridación establecida durante 1 minuto, alongamento a 72 °C durante 1 minuto, 35 ciclos e, finalmente, 72 °C en 10 minutos. Os produtos da PCR separáronse por electroforese en xeles de ágarosa (1,5 %) que contiñan a tinguidura de xel de ADN SYBRTM Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Os mexillóns (Mytilus spp.) aclimatáronse en 500 ml de auga de mar osixenada (32 PSU) durante 24 horas a 4 °C. Engadiuse ao vial ADN plasmídico que contiña un inserto que codifica a secuencia de ADNc da galectina-7 humana (número de acceso do NCBI L07769) a unha concentración final de 190 μg/μl. Os mexillóns incubados nas mesmas condicións sen adición de ADN foron o control. O terceiro tanque de control contiña ADN sen mexillóns. Para controlar a calidade do ADN na auga de mar, tomáronse mostras de auga de mar (20 μl; tres repeticións) de cada tanque no momento indicado. Para a rastrexabilidade do ADN plasmídico, os mexillóns LB recolléronse nos momentos indicados e analizáronse mediante qPCR e ddPCR. Debido ao alto contido en sal da auga de mar, as alícuotas diluíronse en auga con calidade PCR (1:10) antes de todos os ensaios de PCR.
A PCR dixital en gotas (ddPCR) realizouse empregando o protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadá). Empregouse o perfil de temperatura para determinar a temperatura óptima (Táboa S1). As gotas xeráronse empregando un xerador de gotas QX200 (BioRad). A ddPCR levouse a cabo do seguinte xeito: 95 °C durante 5 min, 50 ciclos de 95 °C durante 30 s e unha temperatura de hibridación determinada durante 1 min e 72 °C durante 30 s, 4 °C durante 5 min e 90 °C en 5 minutos. O número de gotas e reaccións positivas (número de copias/µl) mediuse empregando un lector de gotas QX200 (BioRad). As mostras con menos de 10 000 gotas foron rexeitadas. O control do patrón non se realizou cada vez que se executou a ddPCR.
A qPCR realizouse empregando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) e cebadores específicos para LGALS7. Todas as PCR cuantitativas realizáronse en 20 µl empregando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). A qPCR iniciouse cunha incubación de 15 minutos a 95 °C, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos e a 60 °C durante 60 segundos cunha recollida de datos. As curvas de fusión xeráronse empregando medicións sucesivas a 95 °C durante 5 s, 65 °C durante 60 s e 97 °C ao final da qPCR. Cada qPCR realizouse por triplicado, agás para as mostras de control.
Dado que os mexillóns son coñecidos pola súa alta taxa de filtración, primeiro investigamos se podían filtrar e reter fragmentos de ADN presentes na auga de mar. Tamén nos interesaba saber se estes fragmentos se acumulan no seu sistema linfático semiaberto. Resolvemos este problema experimentalmente rastrexando o destino dos fragmentos de ADN solubles engadidos aos tanques de mexillóns azuis. Para facilitar o rastrexo dos fragmentos de ADN, empregamos ADN plasmídico alleo (non propio) que contén o xene humano da galectina-7. A ddPCR rastrexa fragmentos de ADN plasmídico na auga de mar e nos mexillóns. Os nosos resultados mostran que se a cantidade de fragmentos de ADN na auga de mar se mantiña relativamente constante ao longo do tempo (ata 7 días) en ausencia de mexillóns, entón en presenza de mexillóns este nivel case desaparecía por completo en 8 horas (Fig. 1a, b). Os fragmentos de ADN exóxeno detectáronse facilmente en 15 minutos no líquido intravalvular e na hemolinfa (Fig. 1c). Estes fragmentos aínda se podían detectar ata 4 horas despois da exposición. Esta actividade de filtrado con respecto aos fragmentos de ADN é comparable á actividade de filtrado das bacterias e as algas [31]. Estes resultados suxiren que os mexillóns poden filtrar e acumular ADN alleo nos seus compartimentos fluídos.
Concentracións relativas de ADN plasmídico en auga de mar en presenza (A) ou ausencia (B) de mexillóns, medidas por ddPCR. En A, os resultados exprésanse como porcentaxes, cos bordos das caixas representando os percentiles 75 e 25. A curva logarítmica axustada móstrase en vermello e a área sombreada en gris representa o intervalo de confianza do 95 %. En B, a liña vermella representa a media e a liña azul representa o intervalo de confianza do 95 % para a concentración. C Acumulación de ADN plasmídico na hemolinfa e no líquido valvular dos mexillóns en diferentes momentos despois da adición de ADN plasmídico. Os resultados preséntanse como copias absolutas detectadas/mL (±EE).
A continuación, investigamos a orixe do ccfDNA en mexillóns recollidos en bancos de mexillóns nas illas Kerguelen, un remoto grupo de illas con influencia antropoxénica limitada. Para este propósito, illouse e purificouse o cccDNA das hemolinfas de mexillóns mediante métodos que se usan habitualmente para purificar o cccDNA humano [32, 33]. Descubrimos que as concentracións medias de ccfDNA de hemolinfa nos mexillóns están no rango baixo de microgramos por ml de hemolinfa (véxase a Táboa S2, Información complementaria). Este rango de concentracións é moito maior que en persoas sas (baixos nanogramos por mililitro), pero en casos raros, en pacientes con cancro, o nivel de ccfDNA pode alcanzar varios microgramos por mililitro [34, 35]. Unha análise da distribución de tamaño do ccfDNA de hemolinfa mostrou que estes fragmentos varían moito en tamaño, desde 1000 bp ata 1000 bp e ata 5000 bp (Fig. 2). Obtivéronse resultados semellantes empregando o kit QIAamp Investigator baseado en sílice, un método empregado habitualmente na ciencia forense para illar e purificar rapidamente o ADN xenómico de mostras de ADN de baixa concentración, incluído o ccfDNA [36].
Electroforegrama representativo de ccfDNA da hemolinfa do mexillón. Extraído co kit de plasma NucleoSnap (arriba) e o kit QIAamp DNA Investigator. B Gráfico en diagonal que mostra a distribución das concentracións de ccfDNA da hemolinfa (±AE) nos mexillóns. As liñas negra e vermella representan a mediana e o primeiro e terceiro cuartís, respectivamente.
Aproximadamente o 1 % do ccfDNA en humanos e primates ten unha fonte allea [21, 37]. Dado o sistema circulatorio semiaberto dos bivalvos, a auga de mar rica en microbios e a distribución de tamaños do ccfDNA de mexillón, formulamos a hipótese de que o ccfDNA de hemolinfa de mexillón pode conter un conxunto rico e diverso de ADN microbiano. Para probar esta hipótese, secuenciamos o ccfDNA de hemolinfa de mostras de Aulacomya atra recollidas nas illas Kerguelen, o que produciu máis de 10 millóns de lecturas, das cales o 97,6 % superaron o control de calidade. As lecturas clasificáronse entón segundo as fontes propias e non propias utilizando as bases de datos de bivalvos BLASTN e NCBI (Fig. S1, información complementaria).
Nos humanos, tanto o ADN nuclear como o mitocondrial poden liberarse na corrente sanguínea [38]. Non obstante, no presente estudo non foi posible describir en detalle o ADN xenómico nuclear dos mexillóns, dado que o xenoma de A. atra non foi secuenciado nin descrito. Non obstante, puidemos identificar varios fragmentos de ccfDNA da nosa propia orixe usando a biblioteca de bivalvos (Fig. S2, Información suplementaria). Tamén confirmamos a presenza de fragmentos de ADN da nosa propia orixe mediante a amplificación por PCR dirixida dos xenes de A. atra que foron secuenciados (Fig. 3). Do mesmo xeito, dado que o xenoma mitocondrial de A. atra está dispoñible en bases de datos públicas, pódense atopar evidencias da presenza de fragmentos de ccfDNA mitocondrial na hemolinfa de A. atra. A presenza de fragmentos de ADN mitocondrial confirmouse mediante amplificación por PCR (Fig. 3).
Varios xenes mitocondriais estaban presentes na hemolinfa de A. atra (puntos vermellos - número de rexistro: SRX5705969) e M. platensis (puntos azuis - número de rexistro: SRX5705968) amplificados por PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificación do sobrenadante de hemolinfa de A. atra Almacenado en papel FTA. Use un punzón de 3 mm para engadilo directamente ao tubo de PCR que contén a mestura de PCR.
Dado o abundante contido microbiano na auga do mar, inicialmente centrámonos na caracterización das secuencias de ADN microbiano na hemolinfa. Para iso, empregamos dúas estratexias diferentes. A primeira estratexia empregou Kraken2, un programa de clasificación de secuencias baseado en algoritmos que pode identificar secuencias microbianas cunha precisión comparable a BLAST e outras ferramentas [28]. Determinouse que máis de 6719 lecturas eran de orixe bacteriana, mentres que 124 e 64 procedían de arqueas e virus, respectivamente (Fig. 4). Os fragmentos de ADN bacteriano máis abundantes foron Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) e Bacteroidetes (17 %) (Fig. 4a). Esta distribución é consistente con estudos previos do microbioma do mexillón azul mariño [39, 40]. As gammaproteobacteria foron a clase principal de Proteobacteria (44 %), incluíndo moitas Vibrionales (Fig. 4b). O método ddPCR confirmou a presenza de fragmentos de ADN de Vibrio no ccfDNA da hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41]. Para obter máis información sobre a orixe bacteriana do ccfDNA, adoptouse unha estratexia adicional (Fig. S2, Información suplementaria). Neste caso, as lecturas que se solapaban ensambláronse como lecturas de extremos emparellados e clasificáronse como de orixe propia (bivalvos) ou non propia usando BLASTN e un valor e de 1e−3 e un corte con homoloxía >90 %. Neste caso, as lecturas que se solapaban ensambláronse como lecturas de extremos emparellados e clasificáronse como de orixe propia (bivalvos) ou non propia usando BLASTN e un valor e de 1e−3 e un corte con homoloxía >90 %. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами e концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование моллюски отсечения с гомологией> 90%. Neste caso, as lecturas superpostas recolléronse como lecturas de extremos emparellados e clasificáronse como nativas (bivalvas) ou non orixinais usando BLASTN e un valor de e de 1e-3 e un corte con homoloxía >90 %.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 的 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами e концами и класыникасы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использовани e BLAS 1e-3 e порога гомологии> 90%. Neste caso, as lecturas superpostas recolléronse como lecturas de pares e clasificáronse como propias (bivalvos) ou non orixinais usando valores de e BLASTN e 1e-3 e un limiar de homoloxía >90 %.Dado que o xenoma de A. atra aínda non foi secuenciado, empregamos a estratexia de ensamblaxe de novo do ensamblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Identificáronse un total de 147.188 contigs como dependentes (bivalvos) da orixe. Estes contigs foron entón explotados con valores e de 1e-10 usando BLASTN e BLASTX. Esta estratexia permitiunos identificar 482 fragmentos non bivalvos presentes no ccfDNA de A. atra. Máis da metade (57 %) destes fragmentos de ADN obtivéronse de bacterias, principalmente de simbiontes branquiais, incluídos simbiontes sulfotróficos, e de simbiontes branquiais Solemya velum (Fig. 5).
Abundancia relativa a nivel de tipo. B Diversidade microbiana de dous filos principais (Firmicutes e Proteobacteria). Amplificación representativa de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmentos do xene ARNr 16S (azul) en tres hemolinfas atra.
Analizáronse un total de 482 contigs recollidos. Perfil xeral da distribución taxonómica das anotacións de contigs metaxenómicos (procariotas e eucariotas). B Distribución detallada dos fragmentos de ADN bacteriano identificados por BLASTN e BLASTX.
A análise de Kraken2 tamén mostrou que o ccfDNA de mexillón contiña fragmentos de ADN arqueal, incluídos fragmentos de ADN de Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) e Thaurmarcheota (11 %) (Fig. 6a). A presenza de fragmentos de ADN derivados de Euryarchaeota e Crenarchaeota, que se atopaban anteriormente na comunidade microbiana dos mexillóns californianos, non debería sorprender [42]. Aínda que Euryarchaeota adoita asociarse a condicións extremas, agora recoñécese que tanto Euryarchaeota como Crenarcheota están entre os procariotas máis comúns no ambiente crioxénico mariño [43, 44]. A presenza de microorganismos metanóxenos nos mexillóns non é sorprendente, dados os informes recentes de extensas fugas de metano de fugas do fondo da meseta de Kerguelen [45] e a posible produción microbiana de metano observada fronte á costa das illas Kerguelen [46].
A nosa atención centrouse entón nas lecturas de virus de ADN. Ata onde sabemos, este é o primeiro estudo fóra do obxectivo do contido de virus nos mexillóns. Como era de esperar, atopamos fragmentos de ADN de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b). Non obstante, o ADN viral máis común provén dun filo de nucleocitovirus, tamén coñecido como virus de ADN grande citoplasmático nuclear (NCLDV), que ten o xenoma máis grande de todos os virus. Dentro deste filo, a maioría das secuencias de ADN pertencen ás familias Mimimidoviridae (58 %) e Poxviridae (21 %), cuxos hóspedes naturais inclúen vertebrados e artrópodos, mentres que unha pequena proporción destas secuencias de ADN pertence a algas virolóxicas coñecidas. Infecta algas eucariotas mariñas. As secuencias tamén se obtiveron do virus Pandora, o virus xigante co maior tamaño de xenoma de calquera xénero viral coñecido. Curiosamente, a gama de hóspedes que se sabe que están infectados co virus, determinada pola secuenciación de ccfDNA da hemolinfa, era relativamente grande (Figura S3, Información suplementaria). Inclúe virus que infectan insectos como Baculoviridae e Iridoviridae, así como virus que infectan amebas, algas e vertebrados. Tamén atopamos secuencias que coinciden co xenoma do Pithovirus sibericum. Os pitovirus (tamén coñecidos como "virus zombis") illáronse por primeira vez do permafrost de 30.000 anos de antigüidade en Siberia [47]. Polo tanto, os nosos resultados son consistentes con informes previos que mostran que non todas as especies modernas destes virus están extintas [48] e que estes virus poden estar presentes en ecosistemas mariños subárticos remotos.
Finalmente, realizamos probas para ver se podiamos atopar fragmentos de ADN doutros animais multicelulares. Identificáronse un total de 482 contigs alleos mediante BLASTN e BLASTX con bibliotecas nt, nr e RefSeq (xenómicas e de proteínas). Os nosos resultados mostran que, entre os fragmentos alleos de ccfDNA de animais multicelulares, predomina o ADN de ósos óseos (Fig. 5). Tamén se atoparon fragmentos de ADN de insectos e outras especies. Non se identificou unha parte relativamente grande dos fragmentos de ADN, posiblemente debido á subrepresentación dun gran número de especies mariñas nas bases de datos xenómicas en comparación coas especies terrestres [49].
No presente artigo, aplicamos o concepto de LB aos mexillóns, argumentando que a secuenciación por disparo de ccfDNA da hemolinfa pode proporcionar información sobre a composición dos ecosistemas costeiros mariños. En particular, descubrimos que 1) a hemolinfa do mexillón contén concentracións relativamente altas (niveis de microgramos) de fragmentos de ADN circulante relativamente grandes (~1-5 kb); 2) estes fragmentos de ADN son tanto independentes como non independentes; 3) Entre as fontes alleas destes fragmentos de ADN, atopamos ADN bacteriano, arqueal e viral, así como ADN doutros animais multicelulares; 4) A acumulación destes fragmentos de ccfDNA alleos na hemolinfa ocorre rapidamente e contribúe á actividade de filtrado interno dos mexillóns. En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto de LB, que ata o de agora se aplicou principalmente no campo da biomedicina, codifica unha fonte de coñecemento rica pero inexplorada que se pode usar para comprender mellor a interacción entre as especies sentinela e o seu ambiente.
Ademais dos primates, informouse do illamento de ccfDNA en mamíferos, incluíndo ratos, cans, gatos e cabalos [50, 51, 52]. Non obstante, segundo o noso coñecemento, o noso estudo é o primeiro en informar da detección e secuenciación de ccfDNA en especies mariñas cun sistema de circulación aberta. Esta característica anatómica e a capacidade de filtrado dos mexillóns poden, polo menos en parte, explicar as diferentes características de tamaño dos fragmentos de ADN circulantes en comparación con outras especies. Nos humanos, a maioría dos fragmentos de ADN que circulan no sangue son pequenos fragmentos que varían en tamaño de 150 a 200 pb cun pico máximo de 167 pb [34, 53]. Unha pequena pero significativa porción dos fragmentos de ADN ten un tamaño de entre 300 e 500 pb, e aproximadamente o 5 % son máis longos que 900 pb [54]. A razón desta distribución de tamaño é que a principal fonte de ccfDNA no plasma ocorre como resultado da morte celular, xa sexa debido á morte celular ou debido á necrose das células hematopoéticas circulantes en individuos sans ou debido á apoptose de células tumorais en pacientes con cancro (coñecido como ADN tumoral circulante, ctDNA). A distribución de tamaño do ccfDNA da hemolinfa que atopamos nos mexillóns oscilaba entre os 1000 e os 5000 pb, o que suxire que o ccfDNA do mexillón ten unha orixe diferente. Esta é unha hipótese lóxica, xa que os mexillóns teñen un sistema vascular semiaberto e viven en ambientes acuáticos mariños que conteñen altas concentracións de ADN xenómico microbiano. De feito, os nosos experimentos de laboratorio con ADN exóxeno demostraron que os mexillóns acumulan fragmentos de ADN na auga do mar; polo menos despois dalgunhas horas, degrádanse despois da captación celular e/ou libéranse e/ou almacénanse en diversas organizacións. Dada a rareza das células (tanto procariotas como eucariotas), o uso de compartimentos intravalvulares reducirá a cantidade de ccfDNA procedente de autofontes, así como de fontes alleas. Considerando a importancia da inmunidade innata dos bivalvos e o gran número de fagocitos circulantes, formulamos a hipótese de que mesmo o ccfDNA alleo se enriquece nos fagocitos circulantes que acumulan ADN alleo tras a inxestión de microorganismos e/ou residuos celulares. En conxunto, os nosos resultados mostran que o ccfDNA da hemolinfa de bivalvos é un repositorio único de información molecular e reforza o seu status como especie sentinela.
Os nosos datos indican que a secuenciación e análise de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bacterias poden proporcionar información clave sobre a flora bacteriana do hóspede e as bacterias presentes no ecosistema mariño circundante. As técnicas de secuenciación por disparos revelaron secuencias da bacteria comensal A. atra gill que se terían pasado por alto se se empregasen os métodos convencionais de identificación de ARNr 16S, debido en parte a un sesgo de biblioteca de referencia. De feito, o noso uso de datos LB recollidos de M. platensis na mesma capa de mexillóns en Kerguelen mostrou que a composición dos simbiontes bacterianos asociados ás branquias era a mesma para ambas as especies de mexillóns (Fig. S4, Información suplementaria). Esta semellanza de dous mexillóns xeneticamente diferentes pode reflectir a composición das comunidades bacterianas nos depósitos fríos, sulfurosos e volcánicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Describíronse ben niveis máis altos de microorganismos redutores de xofre ao recolectar mexillóns de zonas costeiras bioturbadas [59], como a costa de Port-au-France. Outra posibilidade é que a flora comensal de mexillóns poida verse afectada pola transmisión horizontal [60, 61]. Necesítase máis investigación para determinar a correlación entre o ambiente mariño, a superficie do fondo mariño e a composición das bacterias simbióticas nos mexillóns. Estes estudos están actualmente en curso.
A lonxitude e a concentración do ccfDNA da hemolinfa, a súa facilidade de purificación e a súa alta calidade para permitir unha secuenciación rápida por escopeta son algunhas das moitas vantaxes de usar o ccfDNA de mexillón para avaliar a biodiversidade nos ecosistemas costeiros mariños. Esta estratexia é especialmente eficaz para caracterizar as comunidades virais (viromas) nun ecosistema determinado [62, 63]. A diferenza das bacterias, as arqueas e os eucariotas, os xenomas virais non conteñen xenes conservados filoxeneticamente, como as secuencias 16S. Os nosos resultados indican que as biopsias líquidas de especies indicadoras como os mexillóns poden usarse para identificar un número relativamente grande de fragmentos de virus ccfDNA que se sabe que infectan hóspedes que normalmente habitan nos ecosistemas mariños costeiros. Isto inclúe virus que se sabe que infectan protozoos, artrópodos, insectos, plantas e virus bacterianos (por exemplo, bacteriófagos). Atopouse unha distribución similar cando examinamos o viroma ccfDNA da hemolinfa de mexillóns azuis (M. platensis) recollidos na mesma capa de mexillóns en Kerguelen (Táboa S2, Información complementaria). A secuenciación por escopeta de ccfDNA é, de feito, unha nova estratexia que está a gañar impulso no estudo do viroma dos humanos ou doutras especies [21, 37, 64]. Esta estratexia é particularmente útil para estudar virus de ADN bicatenario, xa que non se conserva ningún xene entre todos os virus de ADN bicatenario, o que representa a clase de virus máis diversa e ampla de Baltimore [65]. Aínda que a maioría destes virus permanecen sen clasificar e poden incluír virus dunha parte completamente descoñecida do mundo viral [66], descubrimos que os viromas e os rangos de hóspedes dos mexillóns A. atra e M. platensis sitúanse entre as dúas especies, de xeito similar (véxase a figura S3, información adicional). Esta semellanza non é sorprendente, xa que pode reflectir unha falta de selectividade na captación de ADN presente no ambiente. Actualmente son necesarios estudos futuros con ARN purificado para caracterizar o viroma de ARN.
No noso estudo, empregamos unha canle de secuenciación moi rigorosa adaptada do traballo de Kowarski e colegas [37], que empregaron unha eliminación en dous pasos de lecturas agrupadas e contigs antes e despois do ensamblaxe do ccfDNA nativo, o que resultou nunha alta proporción de lecturas non mapeadas. Polo tanto, non podemos descartar que algunhas destas lecturas non mapeadas poidan ter a súa propia orixe, principalmente porque non temos un xenoma de referencia para esta especie de mexillón. Tamén empregamos esta canle porque nos preocupaban as quimeras entre as lecturas propias e non propias e as lonxitudes de lectura xeradas polo Illumina MiSeq PE75. Outra razón para a maioría das lecturas non cartografadas é que moitos dos microbios mariños, especialmente en zonas remotas como Kerguelen, non foron anotados. Empregamos Illumina MiSeq PE75, asumindo lonxitudes de fragmentos de ccfDNA similares ás do ccfDNA humano. Para estudos futuros, dados os nosos resultados que mostran que o ccfDNA da hemolinfa ten lecturas máis longas que as dos humanos e/ou mamíferos, recomendamos usar unha plataforma de secuenciación máis axeitada para fragmentos de ccfDNA máis longos. Esta práctica facilitará moito a identificación de máis indicios para unha análise máis profunda. A obtención da secuencia completa do xenoma nuclear de *A. atra*, actualmente non dispoñible, tamén facilitaría enormemente a discriminación do ADNc ccf de fontes propias e non propias. Dado que a nosa investigación se centrou na posibilidade de aplicar o concepto de biopsia líquida aos mexillóns, esperamos que, a medida que este concepto se utilice en investigacións futuras, se desenvolvan novas ferramentas e canles de traballo para aumentar o potencial deste método para estudar a diversidade microbiana dos mexillóns no ecosistema mariño.
Como biomarcador clínico non invasivo, os niveis elevados de ccfDNA no plasma humano están asociados a diversas enfermidades, danos nos tecidos e condicións de estrés [67,68,69]. Este aumento está asociado á liberación de fragmentos de ADN da súa propia orixe despois do dano nos tecidos. Abordamos este problema empregando o estrés térmico agudo, no que os mexillóns foron expostos brevemente a unha temperatura de 30 °C. Realizamos esta análise en tres tipos diferentes de mexillóns en tres experimentos independentes. Non obstante, non atopamos ningún cambio nos niveis de ccfDNA despois do estrés térmico agudo (véxase a Figura S5, información adicional). Este descubrimento pode explicar, polo menos en parte, o feito de que os mexillóns teñen un sistema circulatorio semiaberto e acumulan grandes cantidades de ADN alleo debido á súa alta actividade de filtrado. Por outra banda, os mexillóns, como moitos invertebrados, poden ser máis resistentes ao dano nos tecidos inducido polo estrés, o que limita a liberación de ccfDNA na súa hemolinfa [70, 71].
Ata a data, a análise de ADN da biodiversidade en ecosistemas acuáticos centrouse principalmente na metacodificación de barras do ADN ambiental (ADN ambiental). Non obstante, este método adoita estar limitado na análise de biodiversidade cando se usan cebadores. O uso da secuenciación por escopeta evita as limitacións da PCR e a selección sesgada de conxuntos de cebadores. Así, nun certo sentido, o noso método está máis preto do método de secuenciación por escopeta de ADN ambiental de alto rendemento utilizado recentemente, que é capaz de secuenciar directamente ADN fragmentado e analizar case todos os organismos [72, 73]. Non obstante, hai unha serie de cuestións fundamentais que distinguen o LB dos métodos estándar de ADN ambiental. Por suposto, a principal diferenza entre o ADN ambiental e o LB é o uso de hóspedes filtros naturais. Informouse do uso de especies mariñas como esponxas e bivalvos (Dreisseina spp.) como filtro natural para estudar o ADN ambiental [74, 75]. Non obstante, o estudo de Dreissena utilizou biopsias de tecidos das que se extraeu ADN. A análise de ccfDNA de LB non require biopsia de tecido, equipos especializados e ás veces caros nin loxística asociada ao ADN ambiental ou á biopsia de tecidos. De feito, recentemente informamos de que o ccfDNA de LB pódese almacenar e analizar con soporte FTA sen manter unha cadea de frío, o que supón un gran desafío para a investigación en zonas remotas [76]. A extracción de ccfDNA de biopsias líquidas tamén é sinxela e proporciona ADN de alta calidade para a secuenciación por escopeta e a análise PCR. Esta é unha gran vantaxe dadas algunhas das limitacións técnicas asociadas á análise de ADN ambiental [77]. A simplicidade e o baixo custo do método de mostraxe tamén son especialmente axeitados para programas de seguimento a longo prazo. Ademais da súa alta capacidade de filtrado, outra característica ben coñecida dos bivalvos é a composición química de mucopolisacáridos do seu moco, que promove a absorción de virus [78, 79]. Isto fai dos bivalvos un filtro natural ideal para caracterizar a biodiversidade e o impacto do cambio climático nun determinado ecosistema acuático. Aínda que a presenza de fragmentos de ADN derivados do hóspede pode considerarse unha limitación do método en comparación co ADN ambiental, o custo asociado a ter un ccfDNA nativo deste tipo en comparación co ADN ambiental é simultaneamente comprensible pola gran cantidade de información dispoñible para estudos de saúde do hóspede compensado. Isto inclúe a presenza de secuencias virais integradas no xenoma do hóspede. Isto é especialmente importante para os mexillóns, dada a presenza de retrovirus leucémicos de transmisión horizontal nos bivalvos [80, 81]. Outra vantaxe do LB sobre o ADN ambiental é que aproveita a actividade fagocítica das células sanguíneas circulantes na hemolinfa, que envolve microorganismos (e os seus xenomas). A fagocitose é a función principal das células sanguíneas nos bivalvos [82]. Finalmente, o método aproveita a alta capacidade de filtrado dos mexillóns (media de 1,5 l/h de auga de mar) e a circulación de dous días, que aumentan a mestura de diferentes capas de auga de mar, permitindo a captura de ADN ambiental heterólogo. [83, 84]. Polo tanto, a análise de ccfDNA de mexillón é unha vía interesante dados os impactos nutricionais, económicos e ambientais dos mexillóns. De xeito similar á análise de LB recollido de humanos, este método tamén abre a posibilidade de medir os cambios xenéticos e epixenéticos no ADN do hóspede en resposta a substancias exóxenas. Por exemplo, pódense concibir tecnoloxías de secuenciación de terceira xeración para realizar análises de metilación de todo o xenoma en ccfDNA nativo mediante secuenciación de nanoporos. Este proceso debería verse facilitado polo feito de que a lonxitude dos fragmentos de ccfDNA de mexillón é idealmente compatible con plataformas de secuenciación de lectura longa que permiten a análise de metilación do ADN de todo o xenoma a partir dunha única execución de secuenciación sen necesidade de transformacións químicas.85,86] Esta é unha posibilidade interesante, xa que se demostrou que os patróns de metilación do ADN reflicten unha resposta ao estrés ambiental e persisten durante moitas xeracións. Polo tanto, pode proporcionar información valiosa sobre os mecanismos subxacentes que rexen a resposta despois da exposición ao cambio climático ou aos contaminantes [87]. Non obstante, o uso de LB non está exento de limitacións. Non fai falta dicir que isto require a presenza de especies indicadoras no ecosistema. Como se mencionou anteriormente, o uso de LB para avaliar a biodiversidade dun determinado ecosistema tamén require unha canle bioinformática rigorosa que teña en conta a presenza de fragmentos de ADN da fonte. Outro problema importante é a dispoñibilidade de xenomas de referencia para as especies mariñas. Espérase que iniciativas como o Proxecto Xenomas de Mamíferos Mariños e o proxecto Fish10k, recentemente establecido [88], faciliten esta análise no futuro. A aplicación do concepto LB a organismos mariños que se alimentan por filtración tamén é compatible cos últimos avances na tecnoloxía de secuenciación, o que o fai moi axeitado para o desenvolvemento de biomarcadores multi-ohmios para proporcionar información importante sobre a saúde dos hábitats mariños en resposta ao estrés ambiental.
Os datos de secuenciación do xenoma foron depositados no Arquivo de Lectura de Secuencias do NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 baixo o Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacto do cambio climático na vida mariña e nos ecosistemas. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Considerar os impactos combinados do cambio climático e outros factores de estrés locais no medio mariño. *Entorno científico xeral*. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ciencia do primeiro de marzo. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. A redución da tolerancia á calor en condicións de estrés térmico repetitivo explica a alta mortalidade estival dos mexillóns azuis. Informe científico 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Cambios recentes na frecuencia, as causas e o alcance das mortes de animais. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Múltiples patóxenos non específicos dunha especie poden causar a mortalidade masiva de Pinna nobilis. A vida. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impacto potencial do cambio climático nas enfermidades zoonóticas do Ártico. Int J Circumpolar Health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mexillóns azuis (Mytilus edulis spp.) como organismos sinalizadores na vixilancia da contaminación costeira: unha revisión. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integración da biopsia líquida no tratamento do cancro. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maduración da biopsia líquida: permite que o ADN tumoral circule. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos no plasma humano. Actas das reunións das filiais de Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un novo papel para o ADN libre de células como marcador molecular para o tratamento do cancro. Cuantificación da análise biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS A biopsia líquida entra na clínica: problemas de implementación e desafíos futuros. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW e outros. O ADN fetal está presente no plasma e soro maternos. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudo do curso do embarazo e as súas complicacións mediante o uso de ARN extracelular circulante no sangue das mulleres durante o embarazo. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsia líquida: utilízase ADN libre de células doantes para detectar lesións aloxénicas nun enxerto renal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovacións no diagnóstico prenatal: secuenciación do xenoma do plasma materno. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Detección rápida de patóxenos con secuenciación metaxenómica de nova xeración de fluídos corporais infectados. Nat Medicine. 2021;27:115-24.