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O le biopsy vai (LB) o se manatu ua vave ona lauiloa i le matata fa'afoma'i. O le manatu e fa'avae tele i luga o le iloa o vaega o le DNA extracellular (ccfDNA) o lo'o feoa'i solo, lea e masani ona fa'asa'olotoina o ni vaega laiti pe a uma ona oti sela i aano eseese. O se vaega itiiti o nei vaega e afua mai i aano po'o meaola mai fafo (mai fafo). I galuega o lo'o iai nei, ua matou fa'aogaina lenei manatu i mussels, o se ituaiga leoleo e lauiloa i lo latou gafatia maualuga e fa'amamā ai le vai. Matou te fa'aogaina le gafatia o mussels e fai ma faamama masani e pu'e ai vaega o le DNA o le siosiomaga mai le tele o punaoa e tu'uina atu ai fa'amatalaga e uiga i le tele o meaola eseese o si'osi'omaga i le talafatai. O a matou taunu'uga e fa'aalia ai o le mussel hemolymph o lo'o i ai ni vaega o le DNA e matua'i eseese lava le lapo'a, mai le 1 i le 5 kb. O le fa'asologa o fana na fa'aalia ai o le tele o vaega o le DNA e afua mai i siama mai fafo. I totonu oi latou, na matou maua ai ni vaega o le DNA mai siama, archaea, ma siama, e aofia ai siama e iloa e a'afia ai le tele o mea e masani ona maua i si'osi'omaga i le talafatai. I le faaiuga, o la matou suʻesuʻega ua faʻaalia ai o le manatu o le LB e faʻaaogaina i mussels o se punaoa taua o le malamalama e uiga i le eseesega o siama i totonu o siʻosiʻomaga o le gataifale.
O le a'afiaga o suiga o le tau (CC) i le tele o ituaiga o meaola o le gataifale o se vaega o su'esu'ega o lo'o vave ona tuputupu a'e. O le fa'avevela o le lalolagi e le gata ina mafua ai ni fa'alavelave taua fa'aletino, ae fa'apea fo'i ona tuleia ai tapula'a o le evolusione o le mautu o le vevela o meaola o le gataifale, e a'afia ai nofoaga o le tele o ituaiga, ma fa'aosofia ai i latou e saili ni tulaga e sili atu ona lelei [1, 2]. I le fa'aopoopoga i le a'afiaga o le tele o ituaiga o metazoans, e fa'alavelaveina e le CC le paleni maaleale o fegalegaleaiga a le 'au talimalo ma microbial. O lenei microbial dysbacteriosis e mafua ai se lamatiaga tele i meaola o le gataifale ona e fa'afaigofie ai ona a'afia meaola o le gataifale i siama pipisi [3, 4]. E talitonuina o le SS e iai sona sao taua i le tele o maliu, o se fa'afitauli tele lea mo le puleaina o meaola o le gataifale i le lalolagi atoa [5, 6]. O se mataupu taua tele lea ona o a'afiaga tau tamaoaiga, fa'alenatura ma mea'ai o le tele o ituaiga o meaola o le gataifale. E moni lava lenei mea mo bivalves e nonofo i itulagi polar, lea e vave ma ogaoga ai a'afiaga o le CK [6, 7]. O le mea moni, o bivalves e pei o Mytilus spp. e fa'aaogaina lautele e mata'ituina ai a'afiaga o le CC i meaola o le gataifale. E lē o se mea e ofo ai, o le tele o fa'ailoga o meaola ua atia'e e mata'ituina ai lo latou soifua maloloina, e masani ona fa'aogaina se auala e lua-vaega e aofia ai fa'ailoga o meaola fa'atino e fa'avae i luga o gaioiga fa'anatura po'o galuega fa'atino a le sela e pei o le ola o le sela ma le gaioiga o le phagocytic [8]. O nei metotia e aofia ai fo'i le fuaina o le fa'aputuga o fa'ailoga fa'apitoa o le mamafa e fa'aputuina i totonu o a'ano vaivai pe a uma ona mitiia le tele o le vai sami. Peita'i, o le maualuga o le gafatia o le fa'amamāina ma le faiga o le ta'avale e le'i tatala o bivalves e maua ai se avanoa e atiina ae ai fa'ailoga fou o le hemolymph e fa'aaoga ai le manatu o le biopsy vai (LB), o se auala faigofie ma e itiiti le osofa'iga i le pulega o ma'i. fa'ata'ita'iga toto [9, 10]. E ui lava e mafai ona maua le tele o ituaiga o molela'au e tafe i le LB o le tagata, o lenei manatu e fa'avae muamua lava i luga o le su'esu'ega o le DNA o vaega o le DNA extracellular (ccfDNA) o lo'o tafe i le plasma. O le mea moni, o le i ai o le DNA o lo'o tafe i le plasma o le tagata ua iloa talu mai le ogatotonu o le 20 seneturi [11], ae na'o tausaga talu ai nei na o'o mai ai le fa'alauiloaina o metotia fa'asologa maualuga ua o'o atu ai i le fa'amaoniga fa'aklinikal e fa'avae i luga o le ccfDNA. O le iai o nei fasi DNA o loʻo feoaʻi solo e mafua ona o le faʻasaʻolotoina o le DNA genomic (nuclear ma mitochondrial) pe a uma le oti o le sela. I tagata soifua maloloina, o le tele o le ccfDNA e masani ona maualalo (<10 ng/mL) ae e mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i gasegase o loʻo mafatia i faʻamaʻi eseese pe oʻo i le atuatuvale, ma iʻu ai i le faʻaleagaina o aano. I tagata soifua maloloina, o le tele o le ccfDNA e masani ona maualalo (<10 ng/mL) ae e mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i gasegase o loʻo mafatia i faʻamaʻi eseese pe oʻo i le atuatuvale, ma iʻu ai i le faʻaleagaina o aano. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться i 5–10 раз ухльчо патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. I tagata soifua maloloina, o le tele o le cccDNA e masani lava ona maualalo (<10 ng/mL), ae e mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i gasegase e iai faʻamaʻi eseese pe i lalo o le atuatuvale lea e oʻo atu ai i le faʻaleagaina o aano.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 ，从而导致组织损义。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 或 承受可 增加 5-10 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损织Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз умлица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. E masani ona maualalo le maualuga o le ccfDNA (<10 ng/ml) i tagata soifua maloloina, ae e mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i tagata mamaʻi e iai faʻamaʻi eseese poʻo le atuatuvale, ma iʻu ai i le faʻaleagaina o aano.E matuā eseese lava le telē o fasi ccfDNA, ae e masani lava ona mai le 150 i le 200 bp. [12]. O le suʻesuʻeina o le ccfDNA e maua mai ia te ia lava, e pei o le ccfDNA mai sela masani poʻo sela ua suia, e mafai ona faʻaaogaina e iloa ai suiga tau kenera ma epigenetic o loʻo iai i le genome o le nuclear ma/poʻo le mitochondrial, ma fesoasoani ai i fomaʻi e filifili ni togafitiga faʻapitoa e faʻatatau i molecular [13]. Peitaʻi, e mafai ona maua le ccfDNA mai punaoa mai fafo e pei o le ccfDNA mai sela o le pepe i le taimi o le maitaga poʻo mai totoga ua toe totoina [14,15,16,17]. O le ccfDNA o se punaoa taua foi o faʻamatalaga mo le iloa o le iai o nucleic acids o se siama pipisi (mai fafo), lea e mafai ai ona iloa e le o se osofaʻiga o faʻamaʻi pipisi lautele e le o iloa e ala i aganuʻu toto, e aloese ai mai le biopsy osofaʻi o aano ua aʻafia [18]. O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia ai o le toto o le tagata o loʻo iai se punaoa tele o faʻamatalaga e mafai ona faʻaaogaina e iloa ai siama viral ma bacterial, ma e tusa ma le 1% o le ccfDNA o loʻo maua i le plasma o le tagata e afua mai i fafo [19]. O nei suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai e mafai ona iloiloina le tele o meaola eseese o loʻo feoaʻi solo i totonu o se meaola e ala i le faʻaaogaina o le auʻiliʻiliga o le ccfDNA. Peitaʻi, seʻia oʻo mai talu ai nei, o lenei manatu sa faʻaaogaina faʻapitoa i tagata ma, i se tulaga itiiti ifo, i isi vertebrates [20, 21].
I le pepa o loʻo iai nei, matou te faʻaaogaina le malosiaga LB e iloilo ai le ccfDNA o le Aulacomya atra, o se ituaiga i saute e masani ona maua i le subantarctic Kerguelen Islands, o se vaega o motu i luga o se laufanua tele na fausia i le 35 miliona tausaga talu ai. O le pa o le mauga mu. I le faʻaaogaina o se faiga faʻataʻitaʻi in vitro, na matou iloa ai o vaega o le DNA i le sami e vave ona aveina e mussels ma ulufale atu i le vaega hemolymph. Ua faʻaalia e le faʻasologa o fana fana o le mussel hemolymph ccfDNA o loʻo i ai vaega o le DNA o ona lava aʻafiaga ma e le o ia lava, e aofia ai siama symbiotic ma vaega o le DNA mai biomes e masani ai i siosiomaga malulu o le sami i le talafatai. O loʻo i ai foʻi i le Hemolymph ccfDNA faʻasologa o viral e maua mai i viruses ma vaega eseese o le talimalo. Na matou maua foʻi vaega o le DNA mai manu e tele sela e pei o iʻa ponaivi, anemones sami, limu ma iniseti. I le faʻaiʻuga, o la matou suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai e mafai ona faʻaaogaina ma le manuia le manatu o le LB i invertebrates o le sami e faʻatupu ai se genomic repertoire mauoa i siosiomaga o le sami.
O i'a matutua (55-70 mm le umi) Mytilus platensis (M. platensis) ma le Aulacomya atra (A. atra) na aoina mai matafaga papa'u i le va o le tai ma le sami o Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Kerguelen Islands ia Tesema 2018. O isi i'a matutua lanumoana (Mytilus spp.) na maua mai se kamupani fa'atau oloa (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanata) ma tu'u i totonu o se tane e pulea le vevela (4°C) e iai le ea e 10–20 L o le 32‰ masima fa'apitoa. (masima sami fa'apitoa Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, ISA). Mo fa'ata'ita'iga ta'itasi, na fuaina ai le umi ma le mamafa o atigi ta'itasi.
O lo'o maua i luga ole initaneti se fa'atulagaga e leai se totogi mo lenei polokalame (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). I se fa'apu'upu'u, na aoina le hemolymph LB mai maso abductor e pei ona fa'amatalaina [22]. Na fa'amaninoina le hemolymph e ala i le centrifugation i le 1200×g mo le 3 minute, na fa'a'aisa le supernatant (-20°C) se'ia o'o ina fa'aaogaina. Mo le vavae'eseina ma le fa'amamāina o le cfDNA, o fa'ata'ita'iga (1.5-2.0 ml) na fa'amaluluina ma fa'agasolo e fa'aaoga ai le NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi. Na teuina le ccfDNA i le -80°C se'ia o'o ina faia nisi su'esu'ega. I nisi o fa'ata'ita'iga, na vavae'eseina ma fa'amamāina le ccfDNA e fa'aaoga ai le QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanata). Na fuaina le DNA fa'amamāina e fa'aaoga ai se su'ega masani a PicoGreen. O le tufatufaina atu o fasi vaega o le ccfDNA ua vavae'eseina sa su'esu'eina e ala i le capillary electrophoresis e fa'aaoga ai le Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) e fa'aaoga ai le High Sensitivity DNA Kit. Sa faia le su'ega e fa'aaoga ai le 1 µl o le fa'ata'ita'iga ccfDNA e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa.
Mo le fa'asologaina o vaega o le hemolymph ccfDNA, na saunia e le Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanata) ni faletusi fana e fa'aaoga ai le Illumina DNA Mix kit o le Illumina MiSeq PE75 kit. Na fa'aaoga se adapter masani (BioO). O faila fa'amaumauga mata e maua mai le NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ma le SRR8924809). Na iloiloina le tulaga lelei o le faitauga autu e fa'aaoga ai le FastQC [23]. Na fa'aaoga le Trimmomatic [24] mo le tipiina o adapters ma faitauga e le lelei. O faitauga fana ma pito fa'apipi'i na tu'ufa'atasia i ni faitauga uumi e tasi ma se fa'aopoopoga e itiiti ifo i le 20 bp e 'alo'ese ai mai le le fetaui [25]. O faitauga ua tuufaatasia sa fa'ailoa mai i le BLASTN e fa'aaoga ai se fa'amaumauga o le bivalve NCBI Taxonomy (e value < 1e−3 ma le 90% homology), ma o le ufiufiina o fa'asologa e le faigata tele sa faia e fa'aaoga ai le DUST [26]. O faitauga ua tuufaatasia sa fa'ailoa mai i le BLASTN e fa'aaoga ai se fa'amaumauga o le bivalve NCBI Taxonomy (e value < 1e−3 ma le 90% homology), ma o le ufiufiina o fa'asologa e le faigata tele sa faia e fa'aaoga ai le DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчочатылюхнич < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Sa fa'ailoa mai faitauga fa'atasi i le BLASTN e fa'aaoga ai le fa'amaumauga o le NCBI bivalve taxonomy (e value < 1e-3 ma le 90% homology), ma sa fa'atinoina le fa'amaufa'ailogaina o le fa'asologa o mea e maualalo le faigata e fa'aaoga ai le DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 众< 1e-3 和90% 同源性）用 BLASTN 注释合并的读使，用数，并数，生进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 6用 pefu ， 6用进行 复杂度 序列 的。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуство BIрмчат (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с [исполнено с испольдзо]. O faitauga fa'aputu sa fa'ailoa mai i le BLASTN e fa'aaoga ai le NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 ma le 90% homology), ma o le low complexity sequence masking sa fa'atinoina e fa'aaoga ai le DUST [26].Sa vaevaeina faitauga i ni vaega se lua: e fesoʻotaʻi ma faʻasologa o bivalve (e taʻua iinei o faitauga e oe lava ia) ma e le fesoʻotaʻi (e le o faitauga e oe lava ia). E lua vaega na tuʻufaʻatasia eseese e faʻaaoga ai le MEGAHIT e faʻatupu ai ni contigs [27]. I le taimi nei, o le tufatufaina atu o le taxonomic o faitauga a tagata ese mai meaola ninii sa faʻavasegaina e faʻaaoga ai le Kraken2 [28] ma faʻatusalia faʻataʻitaʻi e se siata pai Krona i luga o le Galaxy [29, 30]. O kmers sili ona lelei na fuafuaina o kmers-59 mai a matou faʻataʻitaʻiga muamua. Ona fa'ailoa lea o mea e feso'ota'i ma ia lava e ala i le fa'atulagaina ma le BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 ma le 60% homology) mo se fa'amatalaga mulimuli. Ona fa'ailoa lea o mea e feso'ota'i ma ia lava e ala i le fa'atulagaina ma le BLASTN (bivalve NCBI database, e value < 1e−10 ma le 60% homology) mo se fa'amatalaga mulimuli. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиски, 1 мозлюBIск, 10000000 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Ona fa'ailoa lea o mea e feso'ota'i ma ia lava e ala i le fa'atusatusaina ma le BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ma le 60% homology) mo le fa'amatalaga mulimuli.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал даNCBIн двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ma гомология 60%). Ona fa'ailoa lea o mea e tutusa ma ia lava mo le fa'amatalaga mulimuli e ala i le fa'atusatusaina ma le BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ma le 60% homology). I le taimi lava e tasi, o vaega e le o ni tagata lava ia na fa'ailoa mai ai le BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 ma le 60% homology). I le taimi lava e tasi, o vaega e le o ni tagata lava ia na fa'ailoa mai ai le BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 ma le 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 %) I le taimi lava e tasi, o vaega eseese mai fafo na fa'ailoa mai ai le BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 ma le 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даNCные nt 1 гомология 60%). I le taimi lava e tasi, o vaega e le o ni vaega tutoatasi sa fa'ailoaina i le BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ma le 60% homology). Sa faia fo'i le BLASTX i luga o mea e le o ni tagata e fa'aogaina le nr ma le RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ma le 60% homology). Sa faia fo'i le BLASTX i luga o mea e le o ni tagata e fa'aogaina le nr ma le RefSeq protein NCBI databases (e value < 1e−10 ma le 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение e <1e.0%) Sa faia fo'i le BLASTX i luga o siama e le o ni siama e fa'aogaina ai le nr ma le RefSeq NCBI protein databases (e value < 1e-10 ma le 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和Ｚ60% 同.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和Ｚ60% 同. BLASTX также выполняли i несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Sa faia fo'i le BLASTX i luga o siama e le o ni siama e fa'aogaina ai le nr ma le RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 ma le 60% homology).O le BLASTN ma le BLASTX vaitaele o mea e le o ni mea e fesoʻotaʻi ma ia lava e fai ma sui o mea e fesoʻotaʻi mulimuli (tagaʻi i le faila faʻaopoopo).
O primers na faʻaaogaina mo le PCR o loʻo lisiina i le Laulau S1. Na faʻaaogaina le Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) e faʻateleina ai genes o le ccfDNA. O tulaga nei o le tali atu na faʻaaogaina: denaturation i le 95°C mo le 3 minute, 95°C mo le 1 minute, seti le vevela o le annealing mo le 1 minute, elongation i le 72°C mo le 1 minute, 35 taamilosaga, ma mulimuli ane 72°C i totonu o le 10 minute. . O oloa PCR na vaevaeina e ala i le electrophoresis i totonu o agarose gels (1.5%) o loʻo i ai le SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanata) i le 95 V.
Sa fa'asusuina mussels (Mytilus spp.) i le 500 ml o le vai o le sami ua fa'a'okeseneina (32 PSU) mo le 24 itula i le 4°C. O le Plasmid DNA o lo'o i ai se fa'aopoopoga o lo'o fa'ailoa mai ai le fa'asologa o le human galectin-7 cDNA (NCBI accession number L07769) sa fa'aopoopoina i le fagu i le maualuga mulimuli o le 190 μg/μl. O mussels na fa'asusuina i lalo o tulaga tutusa e aunoa ma le fa'aopoopoina o le DNA o le vaega fa'atonutonu lea. O le tane fa'atonutonu lona tolu o lo'o i ai le DNA e aunoa ma mussels. Mo le mata'ituina o le lelei o le DNA i le vai o le sami, o fa'ata'ita'iga o le vai o le sami (20 μl; fa'atolu ona fai) na ave mai tane ta'itasi i le taimi ua fa'ailoa mai. Mo le mafai ona su'eina le plasmid DNA, na seleseleina mussels LB i taimi ua fa'ailoa mai ma au'ili'iliina e ala i le qPCR ma le ddPCR. Ona o le maualuga o le masima o le vai o le sami, o aliquots na fa'afefiloi i le vai lelei o le PCR (1:10) a'o le'i faia su'ega PCR uma.
Sa faia le PCR mata'itusi numera (ddPCR) e fa'aaoga ai le BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Kanata). Faaaoga le fa'asologa o le vevela e iloa ai le vevela sili ona lelei (Table S1). Sa faia mata'itusi e fa'aaoga ai se QX200 drop generator (BioRad). Sa faia le ddPCR e pei ona taua i lalo: 95°C mo le 5 minute, 50 ta'amilosaga o le 95°C mo le 30 sekone ma se vevela fa'amafanafana ua tu'uina atu mo le 1 minute ma le 72°C mo le 30 sekone, 4°C mo le 5 minute ma le 90°C i totonu o le 5 minute. O le aofa'i o mata'itusi ma tali lelei (numera o kopi/µl) sa fuaina e fa'aaoga ai se QX200 drop reader (BioRad). O fa'ata'ita'iga e itiiti ifo i le 10,000 mata'itusi sa teena. E le'i faia le puleaina o mamanu i taimi uma e fa'atino ai le ddPCR.
Sa faia le qPCR e faʻaaoga ai le Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ausetalia) ma le LGALS7 primers faʻapitoa. O PCR uma sa faia i le 20 µl e faʻaaoga ai le QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Sa amata le qPCR i le 15 minute o le faʻasusuina i le 95°C sosoo ai ma le 40 taʻamilosaga i le 95°C mo le 10 sekone ma le 60°C mo le 60 sekone ma le tasi le aoina o faʻamatalaga. Sa faia ni piʻo o le faʻafefeteina e faʻaaoga ai fua faʻasolosolo i le 95°C mo le 5 sekone, 65°C mo le 60 sekone, ma le 97°C i le faʻaiʻuga o le qPCR. Sa faia faʻatolu qPCR taʻitasi, vagana ai faʻataʻitaʻiga faʻatonutonu.
Talu ai ona lauiloa mussels i lo latou saoasaoa maualuga o le fa'amamāina, na matou su'esu'eina muamua pe mafai ona latou fa'amamā ma taofia vaega o le DNA o lo'o i totonu o le sami. Sa matou fia iloa fo'i pe fa'aputu nei vaega i totonu o la latou faiga lymphatic e le'i tatala tele. Na matou fo'ia lenei fa'afitauli i fa'ata'ita'iga e ala i le su'esu'eina o le i'uga o vaega o le DNA e mafai ona soloia na fa'aopoopo i totonu o tane mussel lanumoana. Mo le fa'afaigofieina o le su'esu'eina o vaega o le DNA, na matou fa'aaogaina ai le DNA plasmid mai fafo (e le o ia lava) o lo'o i ai le gene galectin-7 a le tagata. O le ddPCR e su'e ai vaega o le plasmid DNA i totonu o le sami ma mussels. O a matou taunu'uga e fa'aalia ai afai o le aofa'i o vaega o le DNA i le sami e tumau pea i le aluga o taimi (e o'o atu i le 7 aso) i le leai o mussels, ona i ai lea o mussels o lenei tulaga e toetoe lava a mou atu atoa i totonu o le 8 itula (Ata 1a,b). O vaega o le DNA mai fafo na faigofie ona iloa i totonu o le 15 minute i totonu o le vai intravalvular ma le hemolymph (Ata 1c). O nei vaega e mafai lava ona iloa e o'o atu i le 4 itula talu ona fa'aalia. O lenei gaioiga fa'amamāina e fa'atatau i vaega o le DNA e tutusa ma le gaioiga fa'amamāina o siama ma limu [31]. O nei taunuuga ua faʻaalia ai e mafai e piliki ona faʻamamā ma faʻaputuina DNA ese i totonu o latou vaega o vai.
O le maualuga fa'atatau o le plasmid DNA i le sami i le i ai (A) pe leai (B) o mussels, fuaina e le ddPCR. I le A, o lo'o fa'aalia ai taunu'uga o ni pasene, fa'atasi ai ma tuaoi o pusa o lo'o fa'atusalia ai le 75th ma le 25th percentiles. O le fa'asologa logarithmic ua fa'aalia i le lanu mumu, ma o le vaega ua valivali i le efuefu o lo'o fa'atusalia ai le 95% o le va o le talitonuga. I le B, o le laina mumu o lo'o fa'atusalia ai le averesi ma o le laina lanumoana o lo'o fa'atusalia ai le 95% o le va o le talitonuga mo le fa'aputuga. C O le fa'aputuga o le plasmid DNA i le hemolymph ma le vai valvular o mussels i taimi eseese pe a uma ona fa'aopoopoina le plasmid DNA. O taunu'uga o lo'o tu'uina atu o ni kopi atoatoa ua iloa/mL (±SE).
Sosoo ai, na matou suʻesuʻeina le amataga o le ccfDNA i mussels na aoina mai moega mussel i luga o Kerguelen Islands, o se vaega mamao o motu e itiiti sona aafiaga faʻatagata. Mo lenei faʻamoemoe, na vavaeʻeseina ma faʻamamāina le cccDNA mai mussel hemolymphs e ala i metotia e masani ona faʻaaogaina e faʻamamā ai le cccDNA o le tagata [32, 33]. Na matou iloa ai o le averesi o le maualuga o le hemolymph ccfDNA i mussels o loʻo i totonu o le micrograms maualalo i le ml hemolymph range (tagai i le Table S2, Faʻamatalaga Faʻaopoopo). O lenei vaega o le maualuga e sili atu le tele nai lo tagata soifua maloloina (nanograms maualalo i le milliliter), ae i tulaga e seasea tupu, i tagata mamaʻi kanesa, e mafai e le maualuga o le ccfDNA ona oʻo atu i le tele o micrograms i le milliliter [34, 35]. O se suʻesuʻega o le tufatufaina o le tele o le hemolymph ccfDNA na faʻaalia ai o nei fasi vaega e matua eseese lava le tele, e amata mai le 1000 bp i le 1000 bp. e oʻo atu i le 5000 bp (Ata 2). Na maua ni taunuuga faapena e ala i le faaaogaina o le silica-based QIAamp Investigator Kit, o se metotia e masani ona faaaogaina i le faasaienisi tau solitulafono e vave vavaeese ai ma faamamā ai le genomic DNA mai faataitaiga o le DNA e maualalo le malosi, e aofia ai le ccfDNA [36].
O le electrophoregram ccfDNA fa'atusa o le hemolymph o mussel. Na aveeseina i le NucleoSnap Plasma Kit (pito i luga) ma le QIAamp DNA Investigator Kit. O le ata B Violin o lo'o fa'aalia ai le tufatufaina o le maualuga o le hemolymph ccfDNA (±SE) i mussels. O laina uliuli ma mumu e fa'atusalia ai le ogatotonu ma le kuata muamua ma le tolu.
E tusa ma le 1% o le ccfDNA i tagata ma primates e maua mai fafo [21, 37]. Ona o le faiga o le tafe toto e le atoatoa ona tatala o bivalves, o le vai o le sami e tele ai siama, ma le tufatufaina o le tele o mussel ccfDNA, na matou manatu ai o le mussel hemolymph ccfDNA atonu o loʻo i ai se vaitaele tele ma eseese o microbial DNA. Mo le tofotofoina o lenei manatu, na matou faʻasologaina le hemolymph ccfDNA mai faʻataʻitaʻiga o Aulacomya atra na aoina mai Kerguelen Islands, ma maua ai le silia ma le 10 miliona faitauga, 97.6% o ia mea na pasia le pulea lelei. Ona faʻavasegaina lea o faitauga e tusa ai ma punaoa a le tagata lava ia ma punaoa e le o ia lava e faʻaaoga ai faʻamaumauga o bivalve BLASTN ma NCBI (Ata S1, Faʻamatalaga Faʻaopoopo).
I tagata soifua, e mafai ona fa'asa'olotoina le DNA o le nucleus ma le mitochondrial i totonu o le toto [38]. Peita'i, i le su'esu'ega o lo'o iai nei, e le'i mafai ona fa'amatalaina auiliili le DNA genomic o le nucleus o mussels, ona o le genome o le A. atra e le'i fa'asologaina pe fa'amatalaina. Peita'i, na mafai ona matou fa'ailoa mai ni vaega o le ccfDNA mai lo matou lava amataga e fa'aaoga ai le faletusi o le bivalve (Ata S2, Fa'amatalaga Fa'aopoopo). Na matou fa'amaonia fo'i le iai o vaega o le DNA mai lo matou lava amataga e ala i le fa'ateleina o le PCR o na genes o le A. atra na fa'asologaina (Ata 3). I se tulaga tutusa, ona o le genome o le mitochondrial o le A. atra o lo'o avanoa i fa'amaumauga a le lautele, e mafai ona maua ni fa'amaoniga mo le iai o vaega o le mitochondrial ccfDNA i le hemolymph o le A. atra. O le iai o vaega o le mitochondrial DNA na fa'amaonia e ala i le fa'ateleina o le PCR (Ata 3).
Sa i ai ni genes eseese o mitochondrial i le hemolymph o le A. atra (togi mumu – numera o le oloa: SRX5705969) ma le M. platensis (togi lanumoana – numera o le oloa: SRX5705968) na fa'ateleina e ala i le PCR. Ata na fetu'una'i mai ia Breton et al., 2011 B Fa'ateleina o le hemolymph supernatant mai le A. atra Teu i luga o le pepa FTA. Faaaoga se punch 3 mm e fa'aopoopo sa'o i le PCR tube o lo'o i ai le PCR mix.
Ona o le tele o mea fa'asusu i le sami, na matou taula'i muamua i le fa'ailoaina o fa'asologa o le DNA o mea fa'asusu i le hemolymph. Mo lenei mea, matou te fa'aogaina ni auala se lua eseese. O le auala muamua na fa'aogaina ai le Kraken2, o se polokalame fa'avasega fa'asologa e fa'avae i luga o le algorithm e mafai ona fa'ailoa ai fa'asologa o mea fa'asusu ma le sa'o e tutusa ma le BLAST ma isi meafaigaluega [28]. E silia ma le 6719 faitauga na fuafuaina e mafua mai i siama, ae 124 ma le 64 e mai archaea ma siama, i le fa'asologa (Ata 4). O vaega sili ona tele o le DNA o siama o Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ma Bacteroidetes (17%) (Ata 4a). O lenei tufatufaina e ogatasi ma su'esu'ega muamua o le microbiome o mussel lanumoana i le sami [39, 40]. O le Gammaproteobacteria o le vasega autu lea o Proteobacteria (44%), e aofia ai le tele o Vibrionales (Ata 4b). O le metotia ddPCR na faʻamaonia ai le i ai o vaega o le Vibrio DNA i le ccfDNA o le A. atra hemolymph (Ata 4c) [41]. Mo nisi faʻamatalaga e uiga i le amataga o siama o le ccfDNA, na faia ai se isi auala (Ata S2, Faʻamatalaga Faʻaopoopo). I lenei tulaga, o faitauga na fefa'atasia'i na tu'ufa'atasia o ni faitauga fa'a-pa'aga ma sa fa'avasegaina o ni mea e tupu mai ia te ia lava (bivalves) po'o ni mea e le o tupu mai ia te ia lava e fa'aaoga ai le BLASTN ma se tau e o le 1e−3 ma se tapula'a ma le >90% homology. I lenei tulaga, o faitauga na fefa'atasia'i na tu'ufa'atasia o ni faitauga fa'a-pa'aga ma sa fa'avasegaina o ni mea e tupu mai ia te ia lava (bivalves) po'o ni mea e le o tupu mai ia te ia lava e fa'aaoga ai le BLASTN ma se tau e o le 1e−3 ma se tapula'a ma le >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированые какдруск моллюски) ae ole чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. I lenei tulaga, o faitauga fefiloi na aoina o ni faitauga fa'apagota ma fa'avasegaina o ni faitauga moni (bivalve) po'o ni faitauga e le'i muamua e fa'aaoga ai le BLASTN ma le tau e o le 1e-3 ma le cutoff ma le >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 众和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 13 blastn 的和和90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстовен моллюски) po'o le leai o se fa'atonuga fa'atasi ai ma le fa'atonuga o le BLASTN ma le 1e-3 ma le fa'atonuga> 90%. I lenei tulaga, o faitauga fefiloi na aoina o ni faitauga fa'a-pea ma fa'avasegaina o ni faitauga lava ia (bivalves) po'o ni faitauga e le'i muamua e fa'aaoga ai le e BLASTN ma tau o le 1e-3 ma se tulaga tutusa e >90%.Talu ai e le'i fa'asologaina le genome o le A. atra, na matou fa'aaogaina le fuafuaga fa'apotopoto de novo o le MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler. E 147,188 contigs ua fa'ailoa mai o ni fa'alagolago (bivalves) o le amataga. Ona fa'apa'ūina lea o nei contigs i e-values ​​​​o le 1e-10 e fa'aaoga ai le BLASTN ma le BLASTX. O lenei fuafuaga na mafai ai ona matou fa'ailoa mai ni fasi vaega e le o ni bivalve e 482 o lo'o iai i le A. atra ccfDNA. E silia ma le afa (57%) o nei fasi DNA na maua mai siama, e tele lava mai gill symbionts, e aofia ai sulfotrophic symbionts, ma mai gill symbionts Solemya velum (Ata 5).
Tele fa'atatau i le tulaga o ituaiga. B Eseesega o siama o phyla autu e lua (Firmicutes ma Proteobacteria). Fa'ateleina fa'atusa o le ddPCR C Vibrio spp. A. Vaega o le gene 16S rRNA (lanumoana) i totonu o atra hemolymphs e tolu.
E 482 le aofa'i o contigs na aoina na iloiloina. Fa'amatalaga lautele o le tufatufaina atu o taxonomic o metagenomic contig annotations (prokaryotes ma eukaryotes). B Fa'asalalauga auiliili o vaega o le DNA o siama na fa'ailoa mai e le BLASTN ma le BLASTX.
O le suʻesuʻega a Kraken2 na faʻaalia ai foʻi o loʻo i ai i le mussel ccfDNA ni vaega o le DNA archaeal, e aofia ai vaega o le DNA o Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ma Thaurmarcheota (11%) (Ata 6a). O le i ai o vaega o le DNA na maua mai Euryarchaeota ma Crenarchaeota, na maua muamua i le nuʻu o siama o mussels Kalefonia, e le tatau ona avea ma mea e ofo ai [42]. E ui lava e masani ona fesootaʻi Euryarchaeota ma tulaga ogaoga, ae ua iloa nei o Euryarchaeota ma Crenarcheota o nisi ia o prokaryotes e sili ona taatele i le siosiomaga cryogenic o le sami [43, 44]. O le i ai o meaola ninii methanogenic i mussels e le o se mea e ofo ai, ona o lipoti talu ai nei o le tele o methane leaks mai le pito i lalo o le Kerguelen Plateau [45] ma le ono mafai ona gaosia le methane microbial na matauina i le talafatai o Kerguelen Islands [46].
Ona liliu atu lea o lo matou mafaufau i faitauga mai siama DNA. I le mea sili matou te iloa, o le suʻesuʻega muamua lea e le o faʻatatau i le siama o mussels. E pei ona faʻamoemoeina, na matou maua ni vaega o le DNA o bacteriophages (Caudovirales) (Ata 6b). Peitaʻi, o le DNA viral e sili ona taatele e sau mai se phylum o nucleocytoviruses, e taʻua foʻi o le nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), lea e sili ona tele le genome nai lo soʻo se siama. I totonu o lenei phylum, o le tele o faʻasologa o le DNA e patino i aiga Mimimidoviridae (58%) ma Poxviridae (21%), o latou talimalo masani e aofia ai vertebrates ma arthropods, ae o se vaega itiiti o nei faʻasologa o le DNA e patino i algae virological ua iloa. E aʻafia ai algae eukaryotic o le sami. O faʻasologa na maua mai foʻi mai le siama Pandora, o le siama tele e sili ona tele le genome nai lo soʻo se ituaiga siama ua iloa. O le mea e malie ai, o le tele o talimalo ua iloa ua aʻafia i le siama, e pei ona fuafuaina e le hemolymph ccfDNA sequencing, sa matua tele lava (Ata S3, Faʻamatalaga Faʻaopoopo). E aofia ai siama e aʻafia ai iniseti e pei o Baculoviridae ma Iridoviridae, faʻapea foʻi ma siama e aʻafia ai amoeba, limu ma vertebrates. Na matou maua foʻi ni faʻasologa e fetaui ma le genome o le Pithovirus sibericum. O Pitoviruses (e taʻua foʻi o "zombie viruses") na muamua faʻaesea mai le permafrost e 30,000 tausaga le matua i Siberia [47]. O lea la, o a matou taunuuga e ogatasi ma lipoti na muamua atu o loʻo faʻaalia ai e le o ituaiga uma o nei siama ua faʻaumatia [48] ma o nei siama atonu o loʻo i ai i siosiomaga mamao o le sami i subarctic.
I le iuga, na matou faia ni suega e vaai pe mafai ona matou maua ni vaega o le DNA mai isi manu e tele sela. E 482 ni mea mai fafo na faailoa mai e le BLASTN ma le BLASTX faatasi ai ma faletusi nt, nr ma RefSeq (genomic ma porotini). O a matou taunuuga e faaalia ai o vaega mai fafo o le ccfDNA o manu e tele sela e sili atu le DNA o ponaivi (Ata 5). Ua maua foi ni vaega o le DNA mai iniseti ma isi ituaiga. O se vaega tele o vaega o le DNA e lei faailoa mai, atonu ona o le le lava o le aofaiga o ituaiga o meaola o le sami i faamaumauga genomic pe a faatusatusa i ituaiga o meaola o le laueleele [49].
I le pepa o loʻo i ai nei, matou te faʻaaogaina le manatu o le LB i mussels, ma finau ai e mafai e le hemolymph ccfDNA shot sequencing ona maua ai se malamalamaaga i le tuufaatasiga o siʻosiʻomaga o le gataifale. Ae maise lava, na matou iloa ai 1) o le mussel hemolymph o loʻo i ai ni faʻaputuga maualuga (tulaga microgram) o ni fasi DNA tetele (~1-5 kb) o loʻo feoaʻi solo; 2) o nei fasi DNA e tutoʻatasi ma e le tutoʻatasi 3) I totonu o punaoa mai fafo o nei fasi DNA, na matou maua ai le DNA o siama, archaeal ma viral, faʻapea foʻi ma le DNA o isi manu e tele sela; 4) O le faʻaputuina o nei fasi ccfDNA mai fafo i le hemolymph e vave ona tupu ma fesoasoani i le gaioiga faʻamama totonu o mussels. I le faʻaiʻuga, o la matou suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai o le manatu o le LB, lea ua faʻaaogaina tele i le matata o vailaʻau faʻafomaʻi, o loʻo faʻailoa mai ai se punaoa mauoa ae leʻi suʻesuʻeina o le malamalama e mafai ona faʻaaogaina e malamalama atili ai i le fegalegaleaiga i le va o ituaiga leoleo ma o latou siosiomaga.
I le faaopoopo atu i primates, ua lipotia mai le vavaeesea o le ccfDNA i mammals, e aofia ai isumu, taifau, pusi, ma solofanua [50, 51, 52]. Peitai, i lo matou iloa, o la matou suʻesuʻega o le muamua lea e lipotia ai le iloa ma le faʻasologa o le ccfDNA i meaola o le sami ma se faiga tatala o le tafe toto. O lenei uiga faʻanatura ma le gafatia e faʻamamā ai mussels atonu, i se vaega, e faʻamatalaina ai uiga eseese o le tele o vaega o le DNA o loʻo feoaʻi pe a faʻatusatusa i isi ituaiga. I tagata, o le tele o vaega o le DNA o loʻo feoaʻi i le toto o ni vaega laiti e amata mai le 150 i le 200 bp. ma le maualuga maualuga o le 167 bp [34, 53]. O se vaega itiiti ae taua o vaega o le DNA e i le va o le 300 ma le 500 bp le tele, ma e tusa ma le 5% e umi atu nai lo le 900 bp. [54]. O le mafuaʻaga o lenei tufatufaina o le tele ona o le puna autū o le ccfDNA i le plasma e tupu ona o le oti o le sela, pe ona o le oti o le sela pe ona o le necrosis o sela hematopoietic o loʻo feoaʻi i tagata soifua maloloina pe ona o le apoptosis o sela o le tumo i tagata mamaʻi kanesa (e taʻua o le DNA o le tumo o loʻo feoaʻi). , ctDNA). O le tufatufaina o le tele o le hemolymph ccfDNA na matou maua i mussels e mai le 1000 i le 5000 bp, o loʻo faʻaalia ai o mussel ccfDNA e iai se amataga ese. O se manatu talafeagai lea, talu ai o mussels e iai se faiga o le vascular e tatala faʻafuaseʻi ma e nonofo i siosiomaga o le sami e iai le maualuga o le DNA genomic microbial. O le mea moni, o a matou faʻataʻitaʻiga i le fale suʻesuʻe e faʻaaoga ai le DNA exogenous ua faʻaalia ai o mussels e faʻaputuina ni fasi DNA i le sami, a itiiti mai pe a mavae ni nai itula e faʻaleagaina pe a uma ona faʻaaogaina sela ma/pe faʻasaʻoloto ma/pe teuina i faʻalapotopotoga eseese. Ona o le seasea o sela (prokaryotic ma eukaryotic), o le faʻaaogaina o vaega intravalvular o le a faʻaitiitia ai le aofaʻi o le ccfDNA mai punaoa lava ia faʻapea foʻi ma punaoa mai fafo. I le iloiloina o le tāua o le puipuiga faanatura o bivalve ma le tele o phagocytes o loʻo feoaʻi solo, matou te toe faʻapea atu ai e oʻo lava i ccfDNA mai fafo e faʻamauoa i phagocytes o loʻo feoaʻi solo e faʻaputuina DNA mai fafo pe a foloina ni meaola ninii ma/poʻo ni otaota o sela. A tuʻufaʻatasia, o a matou taunuuga e faʻaalia ai o le bivalve hemolymph ccfDNA o se nofoaga tulaga ese o faʻamatalaga faʻamolekuli ma faʻamalosia ai lo latou tulaga o se ituaiga leoleo.
O a matou faʻamaumauga e faʻaalia ai o le faʻasologa ma le auʻiliʻiliga o vaega o le hemolymph ccfDNA e maua mai i siama e mafai ona tuʻuina atu ai faʻamatalaga taua e uiga i le flora o siama ma siama o loʻo iai i le siʻosiʻomaga o le gataifale. O metotia o le faʻasologa o fana ua faʻaalia ai faʻasologa o siama commensal A. atra gill lea semanu e misia pe ana faʻaaogaina auala masani o le faʻailoaina o le 16S rRNA, ona o se vaega o le faʻaituau o le faletusi faʻasinomaga. O le mea moni, o la matou faʻaaogaina o faʻamaumauga LB na aoina mai le M. platensis i le vaega lava e tasi o mussel i Kerguelen na faʻaalia ai o le tuufaatasiga o symbionts siama e fesoʻotaʻi ma le gill e tutusa mo ituaiga uma o mussel (Ata S4, Faʻamatalaga Faʻaopoopo). O lenei tutusa o mussels e lua e eseese kenera e ono atagia ai le tuufaatasiga o nuʻu siama i totonu o le malulu, sulfurous, ma le volcanic deposits o Kerguelen [55, 56, 57, 58]. O le maualuga o le maualuga o meaola ninii e faʻaitiitia ai le sulfur ua faʻamatalaina lelei pe a seleseleina mussels mai eria o le talafatai bioturbated [59], e pei o le talafatai o Port-au-France. O le isi avanoa e ono aʻafia ai le flora o mussel commensal e ala i le fesiitaiga faalava [60, 61]. E manaʻomia nisi suʻesuʻega e iloa ai le fesootaʻiga i le va o le siosiomaga o le sami, le fogāeleele o le sami, ma le tuufaatasiga o siama felagolagomaʻi i mussels. O loʻo faʻaauau pea nei suʻesuʻega.
O le umi ma le tele o le hemolymph ccfDNA, lona faigofie ona fa'amamāina, ma le maualuga o le lelei e fa'ataga ai le vave fa'asologa o nisi ia o le tele o fa'amanuiaga o le fa'aaogaina o mussel ccfDNA e iloilo ai le tele o meaola eseese i totonu o si'osi'omaga o le gataifale. O lenei auala e matua aoga lava mo le fa'ailoaina o nu'u viral (viromes) i totonu o se si'osi'omaga tu'uina atu [62, 63]. E le pei o siama, archaea, ma eukaryotes, o genomes viral e le o iai ni genes ua fa'asaoina fa'asolosolo e pei o fa'asologa 16S. O a matou taunu'uga e fa'aalia ai o biopsies vai mai ituaiga fa'ailoga e pei o mussels e mafai ona fa'aaogaina e fa'ailoa ai le tele o vaega o siama ccfDNA e iloa e a'afia ai tagata e masani ona nonofo i si'osi'omaga o le gataifale. E aofia ai siama e iloa e a'afia ai protozoa, arthropods, iniseti, la'au, ma siama siama (e pei o bacteriophages). O se tufatufaga tutusa na maua ina ua matou su'esu'eina le hemolymph ccfDNA virome o mussels lanumoana (M. platensis) na aoina i le vaega lava e tasi o mussel i Kerguelen (Table S2, Fa'amatalaga Fa'aopoopo). O le fa'asologa o le ccfDNA i luga o le fana o se auala fou lea ua maua ai le malosi i le su'esu'eina o le virome o tagata po'o isi ituaiga [21, 37, 64]. O lenei auala e aoga tele mo le su'esu'eina o siama DNA e lua-laina, talu ai e leai se gene e tasi e fa'asaoina i totonu o siama DNA uma e lua-laina, o lo'o fa'atusalia ai le vasega sili ona eseese ma lautele o siama i Baltimore [65]. E ui o le tele o nei siama e le'i fa'avasegaina ma atonu e aofia ai siama mai se vaega e le o iloa atoatoa o le lalolagi o siama [66], na matou iloa ai o virome ma vaega talimalo o mussels A. atra ma M. platensis e pa'ū i le va o ituaiga e lua. e tutusa lava (tagai i le ata S3, fa'amatalaga fa'aopoopo). O lenei tutusa e le o se mea e ofo ai, aua e ono atagia mai ai le leai o se filifiliga i le fa'aaogaina o le DNA o lo'o i totonu o le siosiomaga. O su'esu'ega i le lumana'i e fa'aaoga ai le RNA fa'amamāina o lo'o mana'omia nei e fa'ailoa ai le RNA virome.
I la matou suʻesuʻega, na matou faʻaaogaina se paipa faʻapitoa tele na fetuʻunaʻi mai le galuega a Kowarski ma ana paʻaga [37], o ē na faʻaaogaina se faʻamutaina e lua-laʻasaga o faitauga faʻatasi ma mea e fesoʻotaʻi aʻo leʻi ma ina ua maeʻa le faʻapotopotoina o le ccfDNA moni, ma iʻu ai i se vaega tele o faitauga e leʻi faʻafanua. O le mea lea, e le mafai ona matou faʻateʻaina o nisi o nei faitauga e leʻi faʻafanua atonu o loʻo i ai pea lo latou lava amataga, ona e leai sa matou genome faʻasino mo lenei ituaiga mussel. Na matou faʻaaogaina foʻi lenei paipa ona sa matou popole i chimera i le va o faitauga a le tagata lava ia ma faitauga e le o ia lava ma le umi o faitauga na faia e le Illumina MiSeq PE75. O le isi mafuaʻaga mo le tele o faitauga e leʻi faʻafanua o le tele o siama o le sami, aemaise lava i nofoaga mamao e pei o Kerguelen, e leʻi faʻamatalaina. Na matou faʻaaogaina le Illumina MiSeq PE75, ma le manatu o le umi o vaega o le ccfDNA e tutusa ma le ccfDNA a le tagata. Mo suʻesuʻega i le lumanaʻi, ona o a matou taunuuga o loʻo faʻaalia ai o le hemolymph ccfDNA e umi atu faitauga nai lo tagata ma/poʻo mammals, matou te fautuaina le faʻaaogaina o se faʻavae faʻasologa e sili atu ona talafeagai mo vaega uumi o le ccfDNA. O lenei faiga o le a faigofie ai ona iloa nisi faʻailoga mo suʻesuʻega loloto. O le mauaina o le faʻasologa atoa o le genome nuclear o le A. atra e le o maua i le taimi nei o le a faafaigofieina ai foi le iloa o le ccfDNA mai punaoa lava ia ma punaoa e le o ni punaoa lava ia. Talu ai ona ua taulaʻi la matou suʻesuʻega i le avanoa e faʻaaoga ai le manatu o le biopsy vai i mussels, matou te faʻamoemoe o le a atiaʻe ni meafaigaluega fou ma ni paipa e faʻateleina ai le gafatia o lenei metotia e suʻesuʻe ai le eseesega o siama o mussels. siʻosiʻomaga o le gataifale.
I le avea ai ma se fa'ailoga fa'afoma'i e le afaina ai, o le maualuga o le ccfDNA i le plasma o le tagata e feso'ota'i ma fa'ama'i eseese, fa'aleagaina o a'ano, ma tulaga o le atuatuvale [67,68,69]. O lenei fa'ateleina e feso'ota'i ma le fa'asa'olotoina o vaega o le DNA mai lona lava amataga pe a uma ona fa'aleagaina a'ano. Na matou fa'atalanoaina lenei mataupu e fa'aaoga ai le atuatuvale tele i le vevela, lea na fa'aalia ai mussels mo sina taimi pu'upu'u i le vevela o le 30 °C. Na matou faia lenei su'esu'ega i ituaiga eseese e tolu o mussels i fa'ata'ita'iga tuto'atasi e tolu. Peita'i, matou te le'i mauaina se suiga i le maualuga o le ccfDNA pe a uma le atuatuvale tele i le vevela (tagai i le Ata S5, fa'amatalaga fa'aopoopo). O lenei mea na maua e ono fa'amatalaina ai, i se vaega, le mea moni e fa'apea o mussels e iai se faiga e tatala ai le tafe toto ma fa'aputuina le tele o DNA mai fafo ona o la latou gaioiga maualuga o le fa'amama. I le isi itu, o mussels, e pei o le tele o invertebrates, atonu e sili atu ona tete'e atu i le fa'aleagaina o a'ano e mafua mai i le atuatuvale, ma fa'atapula'aina ai le fa'asa'olotoina o le ccfDNA i totonu o latou hemolymph [70, 71].
I le taimi nei, o le suʻesuʻega o le DNA o le tele o meaola eseese i totonu o siʻosiʻomaga o le vai ua taulaʻi tele i le metabarcoding o le DNA o le siosiomaga (eDNA). Peitaʻi, o lenei metotia e masani ona faʻatapulaʻaina i le suʻesuʻega o le tele o meaola eseese pe a faʻaaogaina primers. O le faʻaaogaina o le shotgun sequencing e aloese ai mai tapulaʻa o le PCR ma le filifiliga faʻaituau o seti primer. O lea la, i se tulaga, o la matou metotia e latalata atu i le metotia faʻasologa maualuga o le eDNA Shotgun na faʻaaogaina talu ai nei, lea e mafai ona faʻasologa saʻo le DNA ua vaeluaina ma iloilo toetoe lava o meaola uma [72, 73]. Peitaʻi, e tele mataupu taua e faʻavasega ai le LB mai metotia masani o le eDNA. O le mea moni, o le eseesega autu i le va o le eDNA ma le LB o le faʻaaogaina lea o mea e faʻamama ai le natura. O le faʻaaogaina o meaola o le sami e pei o sponges ma bivalves (Dresseina spp.) o se faamama masani mo le suʻesuʻeina o le eDNA ua lipotia mai [74, 75]. Peitaʻi, o le suʻesuʻega a Dreissena na faʻaaogaina ai biopsies o aano na maua mai ai le DNA. O le suʻesuʻeina o le ccfDNA mai le LB e le manaʻomia ai le biopsy o aano, meafaigaluega faʻapitoa ma o nisi taimi e taugata ma mea faigaluega e fesoʻotaʻi ma le eDNA poʻo le biopsy o aano. O le mea moni, na matou lipotia talu ai nei e mafai ona teuina ma iloiloina le ccfDNA mai le LB i le lagolago a le FTA e aunoa ma le tausia o se filifili malulu, o se luʻitau tele lea mo suʻesuʻega i nofoaga maotua [76]. O le aveeseina o le ccfDNA mai biopsies vai e faigofie foi ma maua ai le DNA maualuga le lelei mo le shotgun sequencing ma le PCR analysis. O se tulaga lelei tele lea ona o nisi o tapulaʻa faʻapitoa e fesoʻotaʻi ma le auʻiliʻiliga o le eDNA [77]. O le faigofie ma le taugofie o le metotia o le sampler e talafeagai foi mo polokalame mataʻituina mo se taimi umi. I le faʻaopoopoga i lo latou gafatia maualuga e faʻamamā ai, o le isi uiga lauiloa o bivalves o le vailaʻau mucopolysaccharide o latou mucus, lea e faʻalauiloa ai le mitiia o siama [78, 79]. O lenei mea e avea ai bivalves ma se faamama masani lelei mo le faʻailoaina o le tele o meaola ma le aʻafiaga o suiga o le tau i se siʻosiʻomaga vai. E ui o le i ai o vaega o le DNA e maua mai i le talimalo e mafai ona vaʻaia o se tapulaʻa o le metotia pe a faʻatusatusa i le eDNA, o le tau e fesoʻotaʻi ma le i ai o se ccfDNA moni pe a faʻatusatusa i le eDNA e malamalama lelei i le tele o faʻamatalaga o loʻo avanoa mo suʻesuʻega tau soifua maloloina. offset host. E aofia ai le iai o fa'asologa o siama ua tu'ufa'atasia i totonu o le genome o le tagata e talimalo. E taua tele lenei mea mo mussels, ona o le iai o retroviruses leukemic fesiita'i fa'alava i bivalves [80, 81]. O le isi lelei o le LB nai lo le eDNA o le fa'aaogaina lea o le gaioiga phagocytic o sela toto e tafe i le hemolymph, lea e foloina ai meaola ninii (ma a latou genomes). O le Phagocytosis o le galuega autu lea a sela toto i bivalves [82]. Ma le mea mulimuli, o le metotia e fa'aaogaina le gafatia maualuga o le fa'amama o mussels (averesi 1.5 l/h o le vai) ma le tafega e lua aso, lea e fa'ateleina ai le fa'afefiloi o vaega eseese o le vai, ma mafai ai ona pu'eina le heterologous eDNA. [83, 84]. O le mea lea, o le su'esu'ega o mussel ccfDNA o se auala manaia ona o a'afiaga o mea'ai, tamaoaiga, ma le siosiomaga o mussels. E tutusa ma le su'esu'ega o le LB na aoina mai tagata, o lenei metotia e tatala ai fo'i le avanoa e fuaina ai suiga fa'asolopito ma epigenetic i le DNA o le tagata e talimalo e tali atu ai i mea mai fafo. Mo se faʻataʻitaʻiga, e mafai ona mafaufauina tekinolosi faʻasologa o tupulaga lona tolu e faʻatino ai le suʻesuʻega methylation lautele o le genome i le ccfDNA moni e faʻaaoga ai le faʻasologa o nanopore. E tatau ona faʻafaigofieina lenei faiga e le mea moni e faʻapea o le umi o fasi ccfDNA o mussel e fetaui lelei ma faʻavae faʻasologa umi e mafai ai ona suʻesuʻeina le methylation o le DNA lautele mai se faʻasologa e tasi e aunoa ma le manaʻomia o suiga faʻakemikolo.85,86] O se avanoa manaia lenei, aua ua faʻaalia o mamanu methylation o le DNA e atagia ai se tali atu i le atuatuvale o le siosiomaga ma tumau i le tele o augatupulaga. O le mea lea, e mafai ona maua ai se malamalamaaga taua i faiga autu e pulea ai le tali atu pe a uma ona aʻafia i suiga o le tau poʻo mea leaga [87]. Peitaʻi, o le faʻaaogaina o le LB e le o se mea e aunoa ma ni tapulaʻa. E le tau fai atu, e manaʻomia ai le i ai o ituaiga faʻailoga i le siosiomaga. E pei ona taʻua i luga, o le faʻaaogaina o le LB e iloilo ai le tele o meaola o se siosiomaga tuʻuina atu e manaʻomia ai foʻi se paipa bioinformatics faigata e amanaʻia ai le i ai o fasi DNA mai le puna. O le isi faʻafitauli tele o le maua lea o genomes faʻasino mo ituaiga o meaola o le gataifale. E faʻamoemoe o taumafaiga e pei o le Marine Mammal Genomes Project ma le Fish10k project na faʻatuina talu ai nei [88] o le a faʻafaigofieina ai lea auʻiliʻiliga i le lumanaʻi. O le faʻaaogaina o le manatu o le LB i meaola e fafagaina i le sami e fetaui lelei ma alualu i luma lata mai i tekinolosi faʻasologa, ma avea ai ma mea e fetaui lelei mo le atinaʻeina o biomarkers multi-ohm e tuʻuina atu ai faʻamatalaga taua e uiga i le soifua maloloina o nofoaga o le sami e tali atu ai i faʻalavelave tau siʻosiʻomaga.
Ua teuina fa'amaumauga o le fa'asologa o le genome i le NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 i lalo o le Bioprojects SRR8924808.
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