Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Вадкая біяпсія (ВБ) — гэта канцэпцыя, якая хутка набірае папулярнасць у біямедыцынскай галіне. Канцэпцыя ў асноўным заснавана на выяўленні фрагментаў цыркулюючай пазаклеткавай ДНК (ccfDNA), якія ў асноўным вызваляюцца ў выглядзе невялікіх фрагментаў пасля гібелі клетак у розных тканінах. Невялікая частка гэтых фрагментаў паходзіць з чужародных (іншародных) тканін або арганізмаў. У бягучай працы мы ўжылі гэтую канцэпцыю да мідый, вартавога віду, вядомага сваёй высокай фільтрацыйнай здольнасцю марской вады. Мы выкарыстоўваем здольнасць мідый выступаць у якасці натуральных фільтраў для захопу фрагментаў ДНК навакольнага асяроддзя з розных крыніц, каб атрымаць інфармацыю аб біяразнастайнасці марскіх прыбярэжных экасістэм. Нашы вынікі паказваюць, што гемалімфа мідый змяшчае фрагменты ДНК, якія моцна адрозніваюцца па памеры, ад 1 да 5 кб. Секвенаванне з дапамогай стрэльбы паказала, што вялікая колькасць фрагментаў ДНК мае замежнае мікробнае паходжанне. Сярод іх мы знайшлі фрагменты ДНК бактэрый, архей і вірусаў, у тым ліку вірусаў, якія, як вядома, заразляюць розных гаспадароў, якія звычайна сустракаюцца ў прыбярэжных марскіх экасістэмах. У заключэнне, наша даследаванне паказвае, што канцэпцыя LB, ужытая да мідый, уяўляе сабой багатую, але пакуль невывучаную крыніцу ведаў аб мікробнай разнастайнасці ў марскіх прыбярэжных экасістэмах.
Уплыў змены клімату (ЗК) на біяразнастайнасць марскіх экасістэм — гэта хутка развіваецца вобласць даследаванняў. Глабальнае пацяпленне не толькі выклікае значныя фізіялагічныя стрэсы, але і пашырае эвалюцыйныя межы тэрмічнай стабільнасці марскіх арганізмаў, уплываючы на ​​асяроддзе пражывання шэрагу відаў, падштурхоўваючы іх да пошуку больш спрыяльных умоў [1, 2]. Акрамя ўплыву на біяразнастайнасць метазойных жывёл, ЗК парушае далікатны баланс узаемадзеяння гаспадара і мікробаў. Гэты мікробны дысбактэрыёз уяўляе сур'ёзную пагрозу для марскіх экасістэм, бо робіць марскія арганізмы больш успрымальнымі да інфекцыйных патагенаў [3, 4]. Лічыцца, што сульфаты адыгрываюць важную ролю ў масавай гібелі, што з'яўляецца сур'ёзнай праблемай для кіравання глабальнымі марскімі экасістэмамі [5, 6]. Гэта важнае пытанне, улічваючы эканамічны, экалагічны і харчовы ўплыў многіх марскіх відаў. Гэта асабліва актуальна для двухстворкавых малюскаў, якія жывуць у палярных рэгіёнах, дзе наступствы ЗК больш неадкладныя і сур'ёзныя [6, 7]. Фактычна, двухстворкавыя малюскі, такія як Mytilus spp., шырока выкарыстоўваюцца для маніторынгу ўздзеяння ЗК на марскія экасістэмы. Не дзіўна, што для маніторынгу здароўя была распрацавана адносна вялікая колькасць біямаркераў, часта з выкарыстаннем двухузроўневага падыходу, які ўключае функцыянальныя біямаркеры, заснаваныя на ферментатыўнай актыўнасці або клеткавых функцыях, такіх як жыццяздольнасць клетак і фагацытарная актыўнасць [8]. Гэтыя метады таксама ўключаюць вымярэнне канцэнтрацыі спецыфічных паказчыкаў ціску, якія назапашваюцца ў мяккіх тканінах пасля паглынання вялікай колькасці марской вады. Аднак высокая фільтрацыйная здольнасць і напаўадкрытая крывяносная сістэма двухстворкавых малюскаў даюць магчымасць распрацоўваць новыя біямаркеры гемалімфы з выкарыстаннем канцэпцыі вадкаснай біяпсіі (ВБ), простага і мінімальна інвазіўнага падыходу да лячэння пацыентаў. Узоры крыві [9, 10]. Нягледзячы на ​​тое, што ў ВБ чалавека можна знайсці некалькі тыпаў цыркулюючых малекул, гэтая канцэпцыя ў першую чаргу заснавана на аналізе секвенавання ДНК цыркулюючых фрагментаў пазаклеткавай ДНК (ccfDNA) у плазме. Фактычна, прысутнасць цыркулюючай ДНК у плазме чалавека вядома з сярэдзіны 20 стагоддзя [11], але толькі ў апошнія гады з'яўленне высокапрадукцыйных метадаў секвенавання прывяло да клінічнай дыягностыкі на аснове ccfDNA. Прысутнасць гэтых цыркулюючых фрагментаў ДНК часткова абумоўлена пасіўным вызваленнем геномнай ДНК (ядзернай і мітахандрыяльнай) пасля гібелі клеткі. У здаровых людзей канцэнтрацыя ccfDNA звычайна нізкая (<10 нг/мл), але можа павялічвацца ў 5-10 разоў у пацыентаў, якія пакутуюць ад розных паталогій або падвяргаюцца стрэсу, што прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя ccfDNA звычайна нізкая (<10 нг/мл), але можа павялічвацца ў 5-10 разоў у пацыентаў, якія пакутуюць ад розных паталогій або падвяргаюцца стрэсу, што прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя вккДНК ў норме нізкая (<10 нг/мл), але можа павышацца ў 5-10 разоў у хворых з рознай паталогіяй або якія падвяргаюцца стрэсу, які прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя ккДНК звычайна нізкая (<10 нг/мл), але яна можа павялічыцца ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або пры стрэсе, які прыводзіць да пашкоджання тканак.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Канцэнтрацыі ccfDNA звычайна нізкія (<10 нг/мл) у здаровых людзей, але могуць быць павялічаны ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або стрэсам, што прыводзіць да пашкоджання тканін. Канцэнтрацыя ccfDNA звычайна нізкая (<10 нг/мл) у здаровых людзей, але можа павялічвацца ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або стрэсам, што прыводзіць да пашкоджання тканін.Памер фрагментаў ccfDNA моцна вар'іруецца, але звычайна вагаецца ад 150 да 200 пар асноў. [12]. Аналіз уласнай ccfDNA, г.зн. ccfDNA з нармальных або трансфармаваных клетак гаспадара, можа быць выкарыстаны для выяўлення генетычных і эпігенетычных змен, якія прысутнічаюць у ядзерным і/або мітахандрыяльным геноме, тым самым дапамагаючы клініцыстам выбраць спецыфічныя малекулярна-таргетныя метады лячэння [13]. Аднак ccfDNA можа быць атрымана з замежных крыніц, такіх як ccfDNA з клетак плода падчас цяжарнасці або з трансплантаваных органаў [14,15,16,17]. ccfDNA таксама з'яўляецца важнай крыніцай інфармацыі для выяўлення наяўнасці нуклеінавых кіслот інфекцыйнага агента (чужароднага), што дазваляе неінвазіўна выяўляць шырока распаўсюджаныя інфекцыі, якія не ідэнтыфікуюцца пасевамі крыві, пазбягаючы інвазівнай біяпсіі інфікаванай тканіны [18]. Нядаўнія даследаванні сапраўды паказалі, што кроў чалавека змяшчае багатую крыніцу інфармацыі, якую можна выкарыстоўваць для ідэнтыфікацыі вірусных і бактэрыяльных патагенаў, і што каля 1% ccfDNA, якая знаходзіцца ў плазме чалавека, мае замежнае паходжанне [19]. Гэтыя даследаванні паказваюць, што біяразнастайнасць цыркулюючага мікрабіёма арганізма можна ацаніць з дапамогай аналізу ccfDNA. Аднак да нядаўняга часу гэтая канцэпцыя выкарыстоўвалася выключна ў людзей і, у меншай ступені, у іншых пазваночных [20, 21].
У гэтай працы мы выкарыстоўваем патэнцыял LB для аналізу ccfDNA Aulacomya atra, паўднёвага віду, які звычайна сустракаецца на субантарктычных астравах Кергелен, групе астравоў на вяршыні вялікага плато, якое ўтварылася 35 мільёнаў гадоў таму. вывяржэнне вулкана. Выкарыстоўваючы эксперыментальную сістэму in vitro, мы выявілі, што фрагменты ДНК у марской вадзе хутка паглынаюцца мідыямі і трапляюць у гемалімфу. Секвенаванне з дапамогай стрэльбы паказала, што ccfDNA гемалімфы мідый змяшчае фрагменты ДНК уласнага і чужога паходжання, у тым ліку сімбіятычныя бактэрыі і фрагменты ДНК з біёмаў, тыповых для халодных вулканічных марскіх прыбярэжных экасістэм. ccfDNA гемалімфы таксама змяшчае вірусныя паслядоўнасці, атрыманыя ад вірусаў з рознымі дыяпазонамі гаспадароў. Мы таксама знайшлі фрагменты ДНК шматклеткавых жывёл, такіх як касцістыя рыбы, актыніі, водарасці і насякомыя. У заключэнне, наша даследаванне паказвае, што канцэпцыя LB можа быць паспяхова прыменена да марскіх беспазваночных для стварэння багатага геномнага рэпертуару ў марскіх экасістэмах.
Дарослыя асобіны (55-70 мм даўжынёй) Mytilus platensis (M. platensis) і Aulacomya atra (A. atra) былі сабраны з міжпрыліўных скалістых берагоў Порт-о-Франс (049°21.235 пд.ш., 070°13.490 у.д.) астравоў Кергелен у снежні 2018 года. Іншыя дарослыя блакітныя мідыі (Mytilus spp.) былі атрыманы ад камерцыйнага пастаўшчыка (PEI Mussel King Inc., востраў Прынца Эдуарда, Канада) і змешчаны ў аэраваны рэзервуар з кантраляванай тэмпературай (4°C), які змяшчае 10-20 л штучнага расола 32‰ (штучная марская соль Reef Crystal, Instant Ocean, Вірджынія, ЗША). Для кожнага эксперыменту вымяраліся даўжыня і вага асобных ракавін.
Бясплатны пратакол адкрытага доступу для гэтай праграмы даступны ў Інтэрнэце (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Карацей кажучы, гемалімфа LB была сабрана з адводных цягліц, як апісана [22]. Гемалімфу ачысцілі цэнтрыфугаваннем пры 1200×g на працягу 3 хвілін, супернатант замарозілі (-20°C) да выкарыстання. Для вылучэння і ачысткі ксфДНК узоры (1,5-2,0 мл) размарозілі і апрацавалі з выкарыстаннем набору NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. ксфДНК захоўвалі пры тэмпературы -80°C да далейшага аналізу. У некаторых эксперыментах ксфДНК вылучалі і ачышчалі з выкарыстаннем набору QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Таронта, Антарыё, Канада). Ачышчаную ДНК колькасна вызначалі з дапамогай стандартнага аналізу PicoGreen. Размеркаванне фрагментаў ізаляванай ccfDNA аналізавалі з дапамогай капілярнага электрафарэзу з выкарыстаннем біяаналізатара Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Каліфорнія) з выкарыстаннем набору High Sensitivity DNA Kit. Аналіз праводзілі з выкарыстаннем 1 мкл узору ccfDNA ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Для секвенавання фрагментаў ccfDNA гемалімфы, Génome Québec (Манрэаль, Квебек, Канада) падрыхтавалі бібліятэкі дробавых даных з выкарыстаннем набору Illumina DNA Mix з набору Illumina MiSeq PE75. Быў выкарыстаны стандартны адаптар (BioO). Неапрацаваныя файлы дадзеных даступныя ў архіве счытвальных дадзеных NCBI (SRR8924808 і SRR8924809). Якасць базавага счытвання ацэньвалася з дапамогай FastQC [23]. Для адсячэння адаптараў і счытванняў нізкай якасці выкарыстоўваўся Trimmomatic [24]. Счытванні дробавых даных з парнымі канцамі былі аб'яднаны ў больш доўгія адзінкавыя счытванні з мінімальным перакрыццём 20 пар асноў, каб пазбегнуць неадпаведнасцей [25]. Аб'яднаныя чытанні былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксаноміі NCBI для двухстворкавых малюскаў (значэнне e < 1e−3 і 90% гамалогія), а маскіроўка паслядоўнасцей з нізкай складанасцю была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя чытанні былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксаноміі NCBI для двухстворкавых малюскаў (значэнне e < 1e−3 і 90% гамалогія), а маскіроўка паслядоўнасцей з нізкай складанасцю была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя чтения былі анотированы з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значэнне e < 1e-3 і 90% гамалогіі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя прачытаныя дадзеныя былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксанаміі двухстворкавых малюскаў NCBI (значэнне e < 1e-3 і 90% гамалогія), а маскіроўка паслядоўнасцей з нізкай складанасцю была выканана з дапамогай DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пыл [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Аб'яднаныя чтения былі анотированы з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем таксономической базы дадзеных двухствораных моллюсков NCBI (пазначэнне <1e-3 і 90% гамалогіі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя паказанні былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем таксанамічнай базы дадзеных двухстворкавых малюскаў NCBI (значэнне e <1e-3 і 90% гамалогія), а маскіроўка паслядоўнасцей з нізкай складанасцю была выканана з дапамогай DUST [26].Счытванні былі падзелены на дзве групы: звязаныя з паслядоўнасцямі двухстворкавых малюскаў (тут яны называюцца самасчытваннямі) і не звязаныя (несамасчытванні). Дзве групы былі асобна сабраны з выкарыстаннем MEGAHIT для стварэння кантыгаў [27]. Тым часам таксанамічнае размеркаванне счытванняў чужародных мікрабіёмаў было класіфікавана з выкарыстаннем Kraken2 [28] і графічна прадстаўлена кругавой дыяграмай Krona на Galaxy [29, 30]. Аптымальныя kmers былі вызначаны як kmers-59 з нашых папярэдніх эксперыментаў. Затым уласныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны шляхам выраўноўвання з BLASTN (база дадзеных двухстворкавых малюскаў NCBI, значэнне e < 1e−10 і 60% гамалогія) для канчатковай анатацыі. Затым уласныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны шляхам выраўноўвання з BLASTN (база дадзеных двухстворкавых малюскаў NCBI, значэнне e < 1e−10 і 60% гамалогія) для канчатковай анатацыі. Затым уласныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных двухствораных малюскаў NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%) для канчатковай анатацыі. Затым самакантыгі былі ідэнтыфікаваны шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных двухстворкавых малюскаў NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогія) для канчатковай анатацыі.然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затым былі ідэнтыфікаваныя ўласныя кантыгі для канчатковай анатацыі шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных NCBI для двухтворных малюскаў, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Затым самакантыгі былі ідэнтыфікаваны для канчатковай анатацыі шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных двухстворкавых малюскаў NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогія). Паралельна, несапраўдныя групавыя кантыгі былі анатаваны з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e < 1e−10 і 60% гамалогія). Паралельна, несапраўдныя групавыя кантыгі былі анатаваны з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e < 1e−10 і 60% гамалогія). Паралельна чужародныя групавыя кантыгі былі анатаваныя з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Паралельна кантыгі замежных груп былі анатаваны з дапамогай BLASTN (база дадзеных NT NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Паралельна кантыгі, якія не адносяцца да ўласнай групы, былі анотированы з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Паралельна, не-свабодныя групавыя кантыгі былі анатаваны з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогія). BLASTX таксама быў праведзены на несапраўдных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных NCBI па бялках nr і RefSeq (значэнне e < 1e−10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама быў праведзены на несапраўдных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных NCBI па бялках nr і RefSeq (значэнне e < 1e−10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама быў праведзены на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем базы дадзеных белка nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама быў праведзены на не-сваіх кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных бялкоў NCBI nr і RefSeq (значэнне e < 1e-10 і 60% гамалогія).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX таксама выконваў на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем базы дадзеных белка nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама быў праведзены на не-сваіх кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных бялкоў nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і 60% гамалогія).Пулы несамакантыгаў BLASTN і BLASTX прадстаўляюць канчатковыя кантыгі (гл. Дадатковы файл).
Праймеры, якія выкарыстоўваліся для ПЦР, пералічаны ў табліцы S1. Для ампліфікацыі мэтавых генаў ccfДНК выкарыстоўвалася Taq ДНК-палімераза (Bio Basic Canada, Маркхэм, Антарыё). Выкарыстоўваліся наступныя ўмовы рэакцыі: дэнатурацыя пры 95°C на працягу 3 хвілін, 95°C на працягу 1 хвіліны, усталяваная тэмпература адпалу на працягу 1 хвіліны, падаўжэнне пры 72°C на працягу 1 хвіліны, 35 цыклаў і, нарэшце, 72°C на працягу 10 хвілін. Прадукты ПЦР падзеленыя электрафарэзам у агарозных гелях (1,5%), якія змяшчаюць SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Берлінгтан, Антарыё, Канада) пры 95 В.
Мідыі (Mytilus spp.) акліматызавалі ў 500 мл насычанай кіслародам марской вады (32 PSU) на працягу 24 гадзін пры тэмпературы 4°C. Плазмідную ДНК, якая змяшчае ўстаўку, якая кадуе паслядоўнасць кДНК галектыну-7 чалавека (нумар рэгістрацыі NCBI L07769), дадавалі ў флакон у канчатковай канцэнтрацыі 190 мкг/мкл. Мідыі, інкубаваныя ў тых жа ўмовах без дадання ДНК, служылі кантролем. Трэці кантрольны рэзервуар утрымліваў ДНК без мідый. Для кантролю якасці ДНК у марской вадзе з кожнага рэзервуара ў пазначаны час бралі ўзоры марской вады (20 мкл; тры паўторы). Для адсочвання плазміднай ДНК мідыі LB збіралі ў пазначаны час і аналізавалі з дапамогай кПЛР і ддПЛР. З-за высокага ўтрымання солі ў марской вадзе аліквоты разводзілі ў вадзе якасці для ПЦР (1:10) перад усімі ПЦР-аналізамі.
Лічбавая кропельная ПЦР (ддПЦР) была праведзена з выкарыстаннем пратакола BioRad QX200 (Місісага, Антарыё, Канада). Для вызначэння аптымальнай тэмпературы выкарыстоўвайце тэмпературны профіль (табліца S1). Кроплі былі атрыманы з дапамогай генератара кропель QX200 (BioRad). ддПЦР праводзілася наступным чынам: 95°C на працягу 5 хвілін, 50 цыклаў па 95°C на працягу 30 секунд і зададзенай тэмпературы адпалу на працягу 1 хвіліны і 72°C на працягу 30 секунд, 4°C на працягу 5 хвілін і 90°C на працягу 5 хвілін. Колькасць кропель і станоўчых рэакцый (колькасць копій/мкл) вымяраліся з дапамогай счытвальніка кропель QX200 (BioRad). Узоры з менш чым 10 000 кропель былі адхілены. Кантроль па шаблоне не праводзіўся кожны раз пры запуску ддПЦР.
ПЛР праводзілі з выкарыстаннем Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сіднэй, Аўстралія) і спецыфічных праймераў LGALS7. Усе колькасныя ПЛР праводзілі ў 20 мкл з выкарыстаннем набору QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). ПЛР пачыналі з 15-хвіліннай інкубацыі пры 95°C, а затым 40 цыклаў пры 95°C на працягу 10 секунд і пры 60°C на працягу 60 секунд з адным зборам дадзеных. Крывыя плаўлення былі пабудаваныя з выкарыстаннем паслядоўных вымярэнняў пры 95°C на працягу 5 секунд, 65°C на працягу 60 секунд і 97°C у канцы ПЛР. Кожная ПЛР праводзілася ў трох паўторах, за выключэннем кантрольных узораў.
Паколькі мідыі вядомыя сваёй высокай хуткасцю фільтрацыі, мы спачатку даследавалі, ці могуць яны фільтраваць і ўтрымліваць фрагменты ДНК, якія прысутнічаюць у марской вадзе. Нас таксама цікавіла, ці назапашваюцца гэтыя фрагменты ў іх напаўадкрытай лімфатычнай сістэме. Мы вырашылі гэтае пытанне эксперыментальна, прасачыўшы лёс растваральных фрагментаў ДНК, дададзеных у акварыумы з блакітнымі мідыямі. Каб палегчыць адсочванне фрагментаў ДНК, мы выкарыстоўвалі чужую (не ўласную) плазмідную ДНК, якая змяшчае ген галектыну-7 чалавека. ddPCR адсочвае фрагменты плазміднай ДНК у марской вадзе і мідыях. Нашы вынікі паказваюць, што калі колькасць фрагментаў ДНК у марской вадзе заставалася адносна пастаяннай на працягу часу (да 7 дзён) пры адсутнасці мідый, то ў прысутнасці мідый гэты ўзровень амаль цалкам знікаў на працягу 8 гадзін (мал. 1a,b). Фрагменты экзагеннай ДНК лёгка выяўляліся на працягу 15 хвілін ва ўнутрыклапаннай вадкасці і гемалімфе (мал. 1c). Гэтыя фрагменты можна было выявіць да 4 гадзін пасля ўздзеяння. Гэтая фільтруючая актыўнасць у дачыненні да фрагментаў ДНК параўнальная з фільтруючай актыўнасцю бактэрый і водарасцяў [31]. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што мідыі могуць фільтраваць і назапашваць чужародную ДНК у сваіх вадкіх адсеках.
Адносныя канцэнтрацыі плазміднай ДНК у марской вадзе ў прысутнасці (А) або адсутнасці (В) мідый, вымераныя з дапамогай ddPCR. У А вынікі прадстаўлены ў працэнтах, прычым межы квадратаў прадстаўляюць 75-ы і 25-ы перцэнтылі. Падабраная лагарыфмічная крывая паказана чырвоным колерам, а плошча, зацененая шэрым колерам, прадстаўляе 95% даверны інтэрвал. У B чырвоная лінія прадстаўляе сярэдняе значэнне, а сіняя лінія — 95% даверны інтэрвал для канцэнтрацыі. C Назапашванне плазміднай ДНК у гемалімфе і клапаннай вадкасці мідый у розны час пасля дадання плазміднай ДНК. Вынікі прадстаўлены ў выглядзе абсалютнай колькасці выяўленых копій/мл (±стандартная памылка).
Далей мы даследавалі паходжанне ccfDNA ў мідыях, сабраных з мідыевых залежаў на астравах Кергелен, аддаленай групе астравоў з абмежаваным антрапагенным уплывам. Для гэтай мэты cccDNA з гемалімф мідый была выдзелена і ачышчана метадамі, якія звычайна выкарыстоўваюцца для ачысткі cccDNA чалавека [32, 33]. Мы выявілі, што сярэднія канцэнтрацыі ccfDNA гемалімфы ў мідыях знаходзяцца ў нізкім дыяпазоне мікраграмаў на мл гемалімфы (гл. Табліцу S2, Дадатковая інфармацыя). Гэты дыяпазон канцэнтрацый значна большы, чым у здаровых людзей (нізкія нанаграмы на мілілітр), але ў рэдкіх выпадках, у хворых на рак, узровень ccfDNA можа дасягаць некалькіх мікраграмаў на мілілітр [34, 35]. Аналіз размеркавання памераў ccfDNA гемалімфы паказаў, што гэтыя фрагменты значна адрозніваюцца па памеры, ад 1000 пар асноў да 5000 пар асноў (мал. 2). Падобныя вынікі былі атрыманы з выкарыстаннем набору QIAamp Investigator Kit на аснове дыяксіду крэмнію, метаду, які шырока выкарыстоўваецца ў судовай навуцы для хуткага вылучэння і ачысткі геномнай ДНК з узораў ДНК з нізкай канцэнтрацыяй, у тым ліку ccfDNA [36].
Тыповая электрафарэграма ccfDNA гемалімфы мідый. Экстрагавана з дапамогай набору NucleoSnap Plasma Kit (уверсе) і набору QIAamp DNA Investigator Kit. B Дыяграма скрыпкі, якая паказвае размеркаванне канцэнтрацый ccfDNA гемалімфы (±стандартная памылка) у мідыях. Чорная і чырвоная лініі прадстаўляюць медыяну і першы і трэці квартылі адпаведна.
Прыкладна 1% ДНК ccfDNA ў людзей і прыматаў мае замежную крыніцу [21, 37]. Улічваючы напаўадкрытую крывяносную сістэму двухстворкавых малюскаў, багатую мікробамі марскую ваду і размеркаванне памераў ДНК ccfDNA мідый, мы выказалі гіпотэзу, што ДНК ccfDNA гемалімфы мідый можа ўтрымліваць багаты і разнастайны пул мікробнай ДНК. Каб праверыць гэтую гіпотэзу, мы секвенавалі ДНК ccfDNA гемалімфы з узораў Aulacomya atra, сабраных на астравах Кергелен, што дало больш за 10 мільёнаў счытванняў, 97,6% з якіх прайшлі кантроль якасці. Затым счытванні былі класіфікаваны ў адпаведнасці з уласнымі і чужымі крыніцамі з выкарыстаннем баз дадзеных двухстворкавых малюскаў BLASTN і NCBI (мал. S1, дадатковая інфармацыя).
У арганізме чалавека ў кроў можа трапляць як ядзерная, так і мітахандрыяльная ДНК [38]. Аднак у дадзеным даследаванні не было магчымасці падрабязна апісаць ядзерную геномную ДНК мідый, улічваючы, што геном A. atra не быў секвенаваны або апісаны. Тым не менш, мы змаглі ідэнтыфікаваць шэраг фрагментаў ccfDNA нашага ўласнага паходжання, выкарыстоўваючы бібліятэку двухстворкавых малюскаў (мал. S2, дадатковая інфармацыя). Мы таксама пацвердзілі наяўнасць фрагментаў ДНК нашага ўласнага паходжання шляхам накіраванай ПЛР-ампліфікацыі тых генаў A. atra, якія былі секвенаваны (мал. 3). Аналагічна, улічваючы, што мітахандрыяльны геном A. atra даступны ў публічных базах дадзеных, можна знайсці доказы наяўнасці фрагментаў мітахандрыяльнай ccfDNA ў гемалімфе A. atra. Наяўнасць фрагментаў мітахандрыяльнай ДНК была пацверджана шляхам ПЛР-ампліфікацыі (мал. 3).
Розныя мітахандрыяльныя гены прысутнічалі ў гемалімфе A. atra (чырвоныя кропкі – інвентарны нумар: SRX5705969) і M. platensis (сінія кропкі – інвентарны нумар: SRX5705968), ампліфікаванай з дапамогай ПЦР. Малюнак адаптаваны з Breton et al., 2011 B Ампліфікацыя супернатанта гемалімфы з A. atra. Захоўваецца на паперы FTA. Выкарыстоўвайце 3-міліметровы прабойнік для дадання непасрэдна ў ПЦР-прабірку, якая змяшчае ПЦР-сумесь.
Улічваючы багатае ўтрыманне мікробаў у марской вадзе, мы спачатку засяродзіліся на характарыстыцы мікробных паслядоўнасцей ДНК у гемалімфе. Для гэтага мы выкарысталі дзве розныя стратэгіі. Першая стратэгія выкарыстоўвала Kraken2, праграму класіфікацыі паслядоўнасцей на аснове алгарытмаў, якая можа ідэнтыфікаваць мікробныя паслядоўнасці з дакладнасцю, параўнальнай з BLAST і іншымі інструментамі [28]. Больш за 6719 прачытанняў былі вызначаны як бактэрыяльныя, у той час як 124 і 64 былі ад архей і вірусаў адпаведна (мал. 4). Найбольш распаўсюджанымі фрагментамі бактэрыяльнай ДНК былі Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) і Bacteroidetes (17%) (мал. 4a). Гэта размеркаванне адпавядае папярэднім даследаванням мікрабіёма марской блакітнай мідыі [39, 40]. Гамапратэабактэрыі былі асноўным класам Proteobacteria (44%), у тым ліку многія Vibrionales (мал. 4b). Метад ddPCR пацвердзіў наяўнасць фрагментаў ДНК Vibrio ў ccfDNA гемалімфы A. atra (мал. 4c) [41]. Каб атрымаць больш інфармацыі пра бактэрыяльнае паходжанне ccfDNA, быў выкарыстаны дадатковы падыход (мал. S2, дадатковая інфармацыя). У гэтым выпадку перакрываючыяся чытанні былі сабраны як чытанні парных канцоў і класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя малюскі) або неўласнага паходжання з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e−3 і парога з гамалогіяй >90%. У гэтым выпадку перакрываючыяся чытанні былі сабраны як чытанні парных канцоў і класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя малюскі) або неўласнага паходжання з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e−3 і парога з гамалогіяй >90%. У гэтым выпадку перакрываючыя чтения былі сабраны як чтения з парнымі канцамі і былі класіфікаваны як уласныя (двутворчатые моллюски) або чужыя па паходжанні з выкарыстаннем BLASTN і значэнняў e 1e-3 і ацэнкі з гамалогіяй> 90%. У гэтым выпадку перакрываючыяся счытванні былі сабраны як парныя счытванні і класіфікаваны як натыўныя (двухстворкавыя) або неарыгінальныя з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e-3 і парога з гамалогіяй >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 У гэтым выпадку перакрываючыя чтения былі сабраны як чтения з парнымі канцамі і класіфікаваны як уласныя (двустворчатые моллюски) або неасаблівыя па паходжанні з выкарыстаннем значэнняў e BLASTN і 1e-3 і парога гамалогіі> 90%. У гэтым выпадку перакрываючыяся чытанні былі сабраны як парныя чытанні і класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя малюскі) або неарыгінальныя з выкарыстаннем значэнняў e BLASTN і 1e-3 ​​і парога гамалогіі >90%.Паколькі геном A. atra яшчэ не быў секвенаваны, мы выкарысталі стратэгію de novo зборкі асемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Усяго было ідэнтыфікавана 147 188 кантыгаў як залежныя (двухстворкавыя) паходжанні. Затым гэтыя кантыгі былі раскладзены з e-значэннямі 1e-10 з выкарыстаннем BLASTN і BLASTX. Гэтая стратэгія дазволіла нам ідэнтыфікаваць 482 недвухстворкавыя фрагменты, якія прысутнічаюць у ccfDNA A. atra. Больш за палову (57%) гэтых фрагментаў ДНК былі атрыманы з бактэрый, галоўным чынам з жаберных сімбіёнтаў, у тым ліку сульфатрофных сімбіёнтаў, і з жаберных сімбіёнтаў Solemya velum (мал. 5).
Адносная колькасць на ўзроўні тыпу. B Мікробная разнастайнасць двух асноўных тыпаў (Firmicutes і Proteobacteria). Тыповая ампліфікацыя ddPCR C Vibrio spp. A. Фрагменты гена 16S рРНК (сіні) у трох атрагемалімфах.
Усяго было прааналізавана 482 сабраныя кантыгі. Агульны профіль таксанамічнага размеркавання метагеномных кантыгавых анатацый (пракарыёты і эўкарыёты). B Падрабязнае размеркаванне фрагментаў бактэрыяльнай ДНК, ідэнтыфікаваных з дапамогай BLASTN і BLASTX.
Аналіз Kraken2 таксама паказаў, што ccfDNA мідый утрымлівае фрагменты архейнай ДНК, у тым ліку фрагменты ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) і Thaurmarcheota (11%) (мал. 6a). Прысутнасць фрагментаў ДНК, атрыманых ад Euryarchaeota і Crenarchaeota, якія раней былі знойдзены ў мікробнай супольнасці каліфарнійскіх мідый, не павінна выклікаць нечаканасці [42]. Нягледзячы на ​​тое, што Euryarchaeota часта асацыюецца з экстрэмальнымі ўмовамі, цяпер прызнана, што як Euryarchaeota, так і Crenarcheota з'яўляюцца аднымі з найбольш распаўсюджаных пракарыёт у марскім крыягенным асяроддзі [43, 44]. Прысутнасць метанагенных мікраарганізмаў у мідыях не дзіўная, улічваючы нядаўнія паведамленні аб масавых уцечках метану з донных уцечак на плато Кергелен [45] і магчымай мікробнай вытворчасці метану, якая назіралася ля ўзбярэжжа астравоў Кергелен [46].
Затым наша ўвага пераключылася на паказанні ДНК-вірусаў. Наколькі нам вядома, гэта першае пазацэлевае даследаванне ўтрымання вірусаў у мідыях. Як і чакалася, мы выявілі фрагменты ДНК бактэрыяфагаў (Caudovirales) (мал. 6b). Аднак найбольш распаўсюджаная вірусная ДНК паходзіць з тыпу нуклеацытавірусаў, таксама вядомага як ядзерна-цытаплазматычны вялікі ДНК-вірус (NCLDV), які мае найбольшы геном сярод усіх вірусаў. У гэтым тыпе большасць паслядоўнасцей ДНК належаць да сямействаў Mimimidoviridae (58%) і Poxviridae (21%), натуральнымі гаспадарамі якіх з'яўляюцца пазваночныя і членістаногія, у той час як невялікая частка гэтых паслядоўнасцей ДНК належыць да вядомых вірусалагічных водарасцяў. Заразіць марскія эўкарыятычныя водарасці. Паслядоўнасці таксама былі атрыманы з віруса Пандора, гіганцкага віруса з найбольшым памерам геному сярод усіх вядомых вірусных родаў. Цікава, што дыяпазон гаспадароў, вядомых як інфікаваныя вірусам, вызначаны секвенаваннем ccfDNA гемалімфы, быў адносна вялікім (малюнак S3, дадатковая інфармацыя). Ён уключае вірусы, якія заразляюць такіх насякомых, як Baculoviridae і Iridoviridae, а таксама вірусы, якія заразляюць амёб, водарасці і пазваночных. Мы таксама знайшлі паслядоўнасці, якія адпавядаюць геному Pithovirus sibericum. Пітавірусы (таксама вядомыя як «зомбі-вірусы») былі ўпершыню выдзелены з 30 000-гадовай вечнай мерзлаты ў Сібіры [47]. Такім чынам, нашы вынікі адпавядаюць папярэднім паведамленням, якія паказваюць, што не ўсе сучасныя віды гэтых вірусаў вымерлі [48] і што гэтыя вірусы могуць прысутнічаць у аддаленых субарктычных марскіх экасістэмах.
Нарэшце, мы праверылі, ці можам мы знайсці фрагменты ДНК іншых шматклеткавых жывёл. Усяго 482 чужародныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны з дапамогай BLASTN і BLASTX з бібліятэкамі nt, nr і RefSeq (геномнымі і бялковымі). Нашы вынікі паказваюць, што сярод чужародных фрагментаў ccfDNA шматклеткавых жывёл пераважае ДНК касцяных костак (мал. 5). Таксама былі знойдзены фрагменты ДНК насякомых і іншых відаў. Адносна вялікая частка фрагментаў ДНК не была ідэнтыфікавана, магчыма, з-за недастатковай прадстаўленасці вялікай колькасці марскіх відаў у геномных базах дадзеных у параўнанні з наземнымі відамі [49].
У гэтай працы мы ўжываем канцэпцыю LB да мідый, сцвярджаючы, што секвенаванне ccfDNA гемалімфы з дапамогай здымкі можа даць уяўленне аб складзе марскіх прыбярэжных экасістэм. У прыватнасці, мы выявілі, што 1) гемалімфа мідый змяшчае адносна высокія канцэнтрацыі (на ўзроўні мікраграмаў) адносна вялікіх (~1-5 кб) цыркулюючых фрагментаў ДНК; 2) гэтыя фрагменты ДНК з'яўляюцца як незалежнымі, так і незалежнымі; 3) сярод замежных крыніц гэтых фрагментаў ДНК мы выявілі бактэрыяльную, архейную і вірусную ДНК, а таксама ДНК іншых шматклеткавых жывёл; 4) назапашванне гэтых чужародных фрагментаў ccfDNA ў гемалімфе адбываецца хутка і спрыяе ўнутранай фільтруючай актыўнасці мідый. У заключэнне, наша даследаванне паказвае, што канцэпцыя LB, якая да гэтага часу ўжывалася ў асноўным у галіне біямедыцыны, кадуе багатую, але невывучаную крыніцу ведаў, якую можна выкарыстоўваць для лепшага разумення ўзаемадзеяння паміж вартавымі відамі і іх навакольным асяроддзем.
Акрамя прыматаў, вылучэнне ccfDNA было апісана ў млекакормячых, у тым ліку мышэй, сабак, катоў і коней [50, 51, 52]. Аднак, наколькі нам вядома, наша даследаванне з'яўляецца першым, у якім паведамляецца пра выяўленне і секвенаванне ccfDNA ў марскіх відаў з адкрытай сістэмай кровазвароту. Гэтая анатомічная асаблівасць і фільтруючая здольнасць мідый могуць, прынамсі часткова, растлумачыць розныя памерныя характарыстыкі цыркулюючых фрагментаў ДНК у параўнанні з іншымі відамі. У людзей большасць фрагментаў ДНК, якія цыркулююць у крыві, уяўляюць сабой невялікія фрагменты памерам ад 150 да 200 пар асноў з максімальным пікам 167 пар асноў [34, 53]. Невялікая, але значная частка фрагментаў ДНК мае памер ад 300 да 500 пар асноў, а каля 5% маюць даўжыню больш за 900 пар асноў [54]. Прычына такога размеркавання памераў заключаецца ў тым, што асноўная крыніца ccfDNA ў плазме ўзнікае ў выніку гібелі клетак, альбо з-за гібелі клетак, альбо з-за некрозу цыркулюючых гематапаэтычных клетак у здаровых людзей, альбо з-за апоптозу пухлінных клетак у хворых на рак (вядома як цыркулюючая пухлінная ДНК). , ctDNA). Размеркаванне памераў ccfDNA гемалімфы, якое мы выявілі ў мідыях, вагалася ад 1000 да 5000 пар асноў, што сведчыць аб тым, што ccfDNA мідый мае іншае паходжанне. Гэта лагічная гіпотэза, паколькі мідыі маюць напаўадкрытую сасудзістую сістэму і жывуць у марскім водным асяроддзі, якое змяшчае высокія канцэнтрацыі мікробнай геномнай ДНК. Фактычна, нашы лабараторныя эксперыменты з выкарыстаннем экзагеннай ДНК паказалі, што мідыі назапашваюць фрагменты ДНК у марской вадзе, прынамсі, праз некалькі гадзін яны раскладаюцца пасля паглынання клеткамі і/або вызваляюцца і/або захоўваюцца ў розных арганізацыях. Улічваючы рэдкасць клетак (як пракарыятычных, так і эўкарыятычных), выкарыстанне ўнутрыклапанных адсекаў зменшыць колькасць ccfDNA з уласных крыніц, а таксама з замежных крыніц. Улічваючы важнасць прыроджанага імунітэту двухстворкавых малюскаў і вялікую колькасць цыркулюючых фагацытаў, мы выказалі гіпотэзу, што нават чужая ccfDNA ўзбагачаецца цыркулюючымі фагацытамі, якія назапашваюць чужародную ДНК пры паглынанні мікраарганізмаў і/або клетачных рэшткаў. У цэлым, нашы вынікі паказваюць, што ccfDNA гемалімфы двухстворкавых малюскаў з'яўляецца унікальным сховішчам малекулярнай інфармацыі і пацвярджае іх статус як вартавога віду.
Нашы дадзеныя паказваюць, што секвенаванне і аналіз фрагментаў ccfDNA гемалімфы, атрыманых з бактэрый, можа даць ключавую інфармацыю аб бактэрыяльнай флоры гаспадара і бактэрыях, якія прысутнічаюць у навакольнай марской экасістэме. Метады стрэл-секвенавання выявілі паслядоўнасці каменсальных бактэрый A. atra gill, якія былі б прапушчаны, калі б выкарыстоўваліся звычайныя метады ідэнтыфікацыі 16S рРНК, часткова з-за прадузятасці даведачнай бібліятэкі. Фактычна, выкарыстанне намі дадзеных LB, сабраных з M. platensis у тым жа пласце мідый у Кергелене, паказала, што склад бактэрыяльных сімбіёнтаў, звязаных з жабрамі, быў аднолькавым для абодвух відаў мідый (мал. S4, дадатковая інфармацыя). Гэта падабенства двух генетычна розных мідый можа адлюстроўваць склад бактэрыяльных супольнасцей у халодных, серных і вулканічных адкладах Кергелена [55, 56, 57, 58]. Больш высокія ўзроўні мікраарганізмаў, якія рэдукуюць серу, былі добра апісаны пры зборы мідый з біятурбаваных прыбярэжных раёнаў [59], такіх як узбярэжжа Порт-о-Франс. Іншая магчымасць заключаецца ў тым, што флора мідый-сімбіётаў можа пацярпець ад гарызантальнай перадачы [60, 61]. Патрэбныя дадатковыя даследаванні, каб вызначыць карэляцыю паміж марскім асяроддзем, паверхняй марскога дна і складам сімбіятычных бактэрый у мідыях. Гэтыя даследаванні ў цяперашні час працягваюцца.
Даўжыня і канцэнтрацыя ccfDNA гемалімфы, лёгкасць яе ачысткі і высокая якасць, якая дазваляе хуткае секвенаванне метадам «дробяга стрэльбы», з'яўляюцца аднымі з шматлікіх пераваг выкарыстання ccfDNA мідый для ацэнкі біяразнастайнасці ў марскіх прыбярэжных экасістэмах. Гэты падыход асабліва эфектыўны для характарыстыкі вірусных супольнасцей (віромаў) у дадзенай экасістэме [62, 63]. У адрозненне ад бактэрый, архей і эўкарыёт, вірусныя геномы не ўтрымліваюць філагенетычна кансерватыўных генаў, такіх як 16S-паслядоўнасці. Нашы вынікі паказваюць, што вадкія біяпсіі відаў-індыкатараў, такіх як мідыі, могуць быць выкарыстаны для ідэнтыфікацыі адносна вялікай колькасці фрагментаў віруса ccfDNA, якія, як вядома, інфікуюць гаспадароў, якія звычайна насяляюць прыбярэжныя марскія экасістэмы. Гэта ўключае вірусы, якія, як вядома, інфікуюць найпростых, членістаногіх, насякомых, расліны і бактэрыяльныя вірусы (напрыклад, бактэрыяфагі). Падобнае размеркаванне было выяўлена, калі мы даследавалі віром ccfDNA гемалімфы блакітных мідый (M. platensis), сабраных у тым жа пласце мідый у Кергелене (табліца S2, дадатковая інфармацыя). Дробажное секвенаванне ccfDNA сапраўды з'яўляецца новым падыходам, які набірае абароты ў вывучэнні вірома чалавека або іншых відаў [21, 37, 64]. Гэты падыход асабліва карысны для вывучэння двухланцуговых ДНК-вірусаў, паколькі ні адзін ген не захаваны сярод усіх двухланцуговых ДНК-вірусаў, якія прадстаўляюць найбольш разнастайны і шырокі клас вірусаў у Балтымары [65]. Нягледзячы на ​​тое, што большасць гэтых вірусаў застаюцца некласіфікаванымі і могуць уключаць вірусы з цалкам невядомай часткі віруснага свету [66], мы выявілі, што віромы і дыяпазоны гаспадароў мідый A. atra і M. platensis знаходзяцца паміж гэтымі двума відамі падобным чынам (гл. малюнак S3, дадатковая інфармацыя). Гэта падабенства не дзіўна, бо можа адлюстроўваць адсутнасць селектыўнасці ў паглынанні ДНК, якая прысутнічае ў навакольным асяроддзі. У цяперашні час неабходныя будучыя даследаванні з выкарыстаннем ачышчанай РНК для характарыстыкі РНК-вірома.
У нашым даследаванні мы выкарыстоўвалі вельмі строгі канвеер, адаптаваны з працы Коварскага і калег [37], якія выкарыстоўвалі двухэтапнае выдаленне аб'яднаных чытанняў і кантыгаў да і пасля зборкі натыўнай ccfDNA, што прывяло да высокай долі неадлюстраваных чытанняў. Такім чынам, мы не можам выключаць, што некаторыя з гэтых неадлюстраваных чытанняў усё яшчэ могуць мець сваё ўласнае паходжанне, галоўным чынам таму, што ў нас няма эталоннага геному для гэтага віду мідый. Мы таксама выкарыстоўвалі гэты канвеер, таму што нас турбавалі хімеры паміж уласнымі і чужымі чытаннямі і даўжыні чытанняў, згенераваныя Illumina MiSeq PE75. Яшчэ адна прычына большасці неадлюстраваных чытанняў заключаецца ў тым, што значная частка марскіх мікробаў, асабліва ў аддаленых раёнах, такіх як Кергелен, не была анатавана. Мы выкарыстоўвалі Illumina MiSeq PE75, мяркуючы, што даўжыня фрагментаў ccfDNA падобная да даўжыні ccfDNA чалавека. Для будучых даследаванняў, улічваючы нашы вынікі, якія паказваюць, што ccfDNA гемалімфы мае больш доўгія чытанні, чым людзі і/або млекакормячыя, мы рэкамендуем выкарыстоўваць платформу секвенавання, больш прыдатную для больш доўгіх фрагментаў ccfDNA. Гэтая практыка значна спрасціць вызначэнне большай колькасці паказанняў для больш глыбокага аналізу. Атрыманне недаступнай у цяперашні час поўнай паслядоўнасці ядзернага геному A. atra таксама значна палегчыць адрозненні ccfDNA ад уласных і чужых крыніц. Улічваючы, што нашы даследаванні былі сканцэнтраваны на магчымасці прымянення канцэпцыі вадкаснай біяпсіі да мідый, мы спадзяемся, што па меры выкарыстання гэтай канцэпцыі ў будучых даследаваннях будуць распрацаваны новыя інструменты і канвееры для павелічэння патэнцыялу гэтага метаду для вывучэння мікробнай разнастайнасці мідый. марская экасістэма.
Як неінвазіўны клінічны біямаркер, павышаны ўзровень ccfDNA ў плазме крыві чалавека асацыюецца з рознымі захворваннямі, пашкоджаннем тканін і стрэсавымі станамі [67, 68, 69]. Гэта павелічэнне звязана з вызваленнем фрагментаў ДНК уласнага паходжання пасля пашкоджання тканін. Мы вырашылі гэтую праблему з дапамогай вострага цеплавога стрэсу, пры якім мідыі ненадоўга падвяргаліся ўздзеянню тэмпературы 30 °C. Мы правялі гэты аналіз на трох розных тыпах мідый у трох незалежных эксперыментах. Аднак мы не выявілі ніякіх зменаў узроўняў ccfDNA пасля вострага цеплавога стрэсу (гл. малюнак S5, дадатковая інфармацыя). Гэта адкрыццё можа растлумачыць, прынамсі часткова, той факт, што мідыі маюць напаўадкрытую крывяносную сістэму і назапашваюць вялікую колькасць чужароднай ДНК з-за сваёй высокай фільтруючай актыўнасці. З іншага боку, мідыі, як і многія беспазваночныя, могуць быць больш устойлівымі да пашкоджання тканін, выкліканага стрэсам, тым самым абмяжоўваючы вызваленне ccfDNA ў іх гемалімфе [70, 71].
Да сённяшняга дня аналіз ДНК-біяразнастайнасці ў водных экасістэмах у асноўным сканцэнтраваны на метабаркадаванні ДНК навакольнага асяроддзя (eDNA). Аднак гэты метад звычайна абмежаваны ў аналізе біяразнастайнасці, калі выкарыстоўваюцца праймеры. Выкарыстанне секвенавання "дробавік" дазваляе абыйсці абмежаванні ПЛР і прадузятага выбару набораў праймераў. Такім чынам, у пэўным сэнсе наш метад бліжэй да нядаўна выкарыстанага высокапрадукцыйнага метаду секвенавання eDNA "дробавік", які здольны непасрэдна секвенаваць фрагментаваную ДНК і аналізаваць практычна ўсе арганізмы [72, 73]. Аднак існуе шэраг фундаментальных праблем, якія адрозніваюць LB ад стандартных метадаў eDNA. Вядома, галоўнае адрозненне паміж eDNA і LB - гэта выкарыстанне натуральных фільтраў-гаспадароў. Паведамлялася пра выкарыстанне марскіх відаў, такіх як губкі і двухстворкавыя малюскі (Dresseina spp.), у якасці натуральнага фільтра для вывучэння eDNA [74, 75]. Аднак у даследаванні Дрэйсэны выкарыстоўваліся біяпсіі тканін, з якіх была выдзелена ДНК. Аналіз ccfDNA з LB не патрабуе біяпсіі тканін, спецыялізаванага і часам дарагога абсталявання і лагістыкі, звязаных з eDNA або біяпсіяй тканін. Насамрэч, нядаўна мы паведамілі, што ccfDNA з LB можна захоўваць і аналізаваць з падтрымкай FTA без падтрымання халоднага ланцуга, што з'яўляецца сур'ёзнай праблемай для даследаванняў у аддаленых раёнах [76]. Экстракцыя ccfDNA з вадкіх біяптатаў таксама простая і забяспечвае высакаякасную ДНК для секвенавання з дробавым секвенаваннем і ПЛР-аналізу. Гэта вялікая перавага, улічваючы некаторыя тэхнічныя абмежаванні, звязаныя з аналізам eDNA [77]. Прастата і нізкі кошт метаду адбору проб таксама асабліва падыходзяць для доўгатэрміновых праграм маніторынгу. Акрамя іх высокай фільтруючай здольнасці, яшчэ адной добра вядомай асаблівасцю двухстворкавых малюскаў з'яўляецца хімічны мукапаліцукрыдны склад іх слізі, які спрыяе паглынанню вірусаў [78, 79]. Гэта робіць двухстворкавых малюскаў ідэальным натуральным фільтрам для характарыстыкі біяразнастайнасці і ўплыву змены клімату ў дадзенай воднай экасістэме. Нягледзячы на ​​тое, што наяўнасць фрагментаў ДНК, атрыманых ад гаспадара, можна разглядаць як абмежаванне метаду ў параўнанні з eDNA, кошт, звязаны з наяўнасцю такой натыўнай ccfDNA ў параўнанні з eDNA, адначасова зразумелы з-за вялікай колькасці інфармацыі, даступнай для даследаванняў здароўя. кампенсацыя гаспадара. Гэта ўключае ў сябе наяўнасць вірусных паслядоўнасцей, інтэграваных у геном гаспадара. Гэта асабліва важна для мідый, улічваючы наяўнасць гарызантальна перадаваных лейкемічных рэтравірусаў у двухстворкавых малюсках [80, 81]. Яшчэ адна перавага LB перад eDNA заключаецца ў тым, што ён выкарыстоўвае фагацытарную актыўнасць цыркулюючых клетак крыві ў гемалімфе, якія паглынаюць мікраарганізмы (і іх геномы). Фагацытоз - асноўная функцыя клетак крыві ў двухстворкавых малюсках [82]. Нарэшце, метад выкарыстоўвае высокую фільтруючую здольнасць мідый (у сярэднім 1,5 л/г марской вады) і двухдзённую цыркуляцыю, што павялічвае змешванне розных слаёў марской вады, дазваляючы захопліваць гетэралагічную eDNA. [83, 84]. Такім чынам, аналіз ccfDNA мідый - гэта цікавы напрамак, улічваючы харчовы, эканамічны і экалагічны ўплыў мідый. Падобна аналізу LB, сабранага ў людзей, гэты метад таксама адкрывае магчымасць вымярэння генетычных і эпігенетычных змен у ДНК гаспадара ў адказ на экзагенныя рэчывы. Напрыклад, можна разгледзець тэхналогіі секвенавання трэцяга пакалення для правядзення аналізу метылявання ДНК па ўсім геноме ў натыўнай ccfDNA з выкарыстаннем нанапорнага секвенавання. Гэты працэс павінен быць палегчаны тым фактам, што даўжыня фрагментаў ccfDNA мідый ідэальна сумяшчальная з платформамі доўгага чытання секвенавання, якія дазваляюць праводзіць аналіз метылявання ДНК па ўсім геноме з аднаго прабегу секвенавання без неабходнасці хімічных трансфармацый.85,86] Гэта цікавая магчымасць, бо было паказана, што патэрны метылявання ДНК адлюстроўваюць рэакцыю на стрэс навакольнага асяроддзя і захоўваюцца на працягу многіх пакаленняў. Такім чынам, гэта можа даць каштоўную інфармацыю аб асноўных механізмах, якія кіруюць рэакцыяй пасля ўздзеяння змены клімату або забруджвальных рэчываў [87]. Аднак выкарыстанне LB не без абмежаванняў. Само сабой зразумела, што гэта патрабуе наяўнасці відаў-індыкатараў у экасістэме. Як ужо згадвалася вышэй, выкарыстанне LB для ацэнкі біяразнастайнасці дадзенай экасістэмы таксама патрабуе строгага біяінфарматычнага канвеера, які ўлічвае наяўнасць фрагментаў ДНК з крыніцы. Яшчэ адной сур'ёзнай праблемай з'яўляецца наяўнасць эталонных геномаў для марскіх відаў. Ёсць надзея, што такія ініцыятывы, як праект «Геномы марскіх млекакормячых» і нядаўна створаны праект «Fish10k» [88], паспрыяюць такому аналізу ў будучыні. Ужыванне канцэпцыі LB да марскіх арганізмаў, якія сілкуюцца фільтратарам, таксама сумяшчальна з найноўшымі дасягненнямі ў тэхналогіі секвенавання, што робіць яе добра прыдатнай для распрацоўкі шматомных біямаркераў, якія даюць важную інфармацыю пра здароўе марскіх асяроддзяў пражывання ў адказ на стрэс навакольнага асяроддзя.
Дадзеныя секвенавання геному былі размешчаны ў архіве чытання паслядоўнасцей NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 у раздзеле Bioprojects SRR8924808.
Брайерлі А.С., Кінгсфард М.Дж. Уплыў змены клімату на марское жыццё і экасістэмы. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Гісі Э., Манеа Э., Мазарыс А.Д., Фрашэці С., Альманіду В., Бевілаква С. і інш. Разгледзьце сукупны ўплыў змены клімату і іншых мясцовых стрэсавых фактараў на марское асяроддзе. агульная навуковая тэматыка. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P і інш. ). Навука першага сакавіка. 2020; 7:48.
Серонт Л., Нікастра К.Р., Зардзі Г.І., Гобервіль Э. Зніжэнне цеплавой устойлівасці пры паўтаральных умовах цеплавога стрэсу тлумачыць высокую летнюю смяротнасць блакітных мідый. Навуковы даклад 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сепельскі А.М., Нусле С., Сервантэс-Ёшыда К., Хван Дж.Л., Хубер Э.Р. і інш. Нядаўнія змены ў частаце, прычынах і маштабах гібелі жывёл. Працы Нацыянальнай акадэміі навук ЗША. 2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена І., Мугеці Д., Чэруці Ф., Хасейні С. і інш. Множныя неспецыфічныя для відаў узбуджальнікі маглі быць прычынай масавай гібелі Pinna nobilis. жыццё. 2020;10:238.
Брэдлі М., Коўтс С. Дж., Джэнкінс Э., О'Хара Т. М. Патэнцыйны ўплыў змены клімату на арктычныя зоанозныя захворванні. Міжнародны часопіс Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Бейер Дж., Грын Н. У., Брукс С., Алан І. Дж., Руус А., Гомес Т. і інш. Блакітныя мідыі (Mytilus edulis spp.) як сігнальныя арганізмы ў маніторынгу забруджвання прыбярэжнай зоны: агляд. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сіравенья Г., Марсоні С., Сіена С., Бардэлі А. Інтэграцыя вадкаснай біяпсіі ў лячэнне раку. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Дж. К. М., Масі К., Гарсія-Карбачо Дж., Мульер Ф., Брэнтан Дж. Д., Кальдас К. і інш. Паспяванне вадкай біяпсіі: дазваляе цыркуляваць пухліннай ДНК. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандэль П., Метэіс П. Нуклеінавыя кіслоты ў плазме чалавека. Пратаколы пасяджэнняў даччыных кампаній Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А. Дж., Унгерэр У., Холдэнрыдэр С. Новая роля бясклетачнай ДНК як малекулярнага маркера для лячэння раку. Колькасная ацэнка біямалярнага аналізу. 2019;17:100087.
Ігнатыядзіс М., Следж Г.В., Джэфры С.С. Вадкая біяпсія ўваходзіць у клініку — праблемы ўкаранення і будучыя выклікі. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW і інш. Фэтальная ДНК прысутнічае ў плазме і сыроватцы крыві маці. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррай М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стывенсан Д.К., Квейк С.Р. Вывучэнне плыні цяжарнасці і яе ўскладненняў з выкарыстаннем цыркулюючай пазаклеткавай РНК у крыві жанчын падчас цяжарнасці. Дапедыятрыя. 2020;8:605219.
Олерых М., Шэрвуд К., Кіоўн П., Шютц Э., Бек Дж., Стэгбаўэр Дж. і інш. Вадкая біяпсія: для выяўлення алогенных паражэнняў у трансплантаванай нырцы ​​выкарыстоўваецца донарская ДНК без клетак. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Інавацыі ў прэнатальнай дыягностыцы: секвенаванне геному плазмы маці. Ганна, доктар медыцынскіх навук. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D і інш. Хуткае выяўленне патагенаў з дапамогай метагеномнага секвенавання наступнага пакалення інфікаваных біялагічных вадкасцей. Nat Medicine. 2021;27:115-24.